CN112094830B

CN112094830B - 转氨酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN112094830B
Application number: CN202011020098.9A
Authority: CN
Inventors: 洪浩; 詹姆斯·盖吉; 卢江平; 徐幸福; 于文燕; 黄鑫; 马玉磊; 程逸冰
Original assignee: Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd
Current assignee: Kailaiying Pharmaceutical (Jiangsu) Co.,Ltd.; Asymchem Life Science Tianjin Co Ltd
Priority date: 2017-11-15
Filing date: 2017-11-15
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2037-11-15
Also published as: CN112094830A; CN108048419A; CN108048419B

Abstract

本发明公开了一种转氨酶突变体及其应用。该转氨酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示氨基酸序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点选自F89、K193、P243、V234、I262、Q280、V379、R416、A417及C418中的一个或多个。具有上述至少一个突变位点的转氨酶突变体，其酶活性和/或稳定性大大提高。

Description

转氨酶突变体及其应用

本申请是基于申请日为2017年11月15日、申请号为201711131103.1、发明名称为“转氨酶突变体及其应用”专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及酶工程领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。

背景技术

酶作为生物催化剂，在生物体内能充分发挥其高效和高特异性的特点。但是在工业应用中，却普遍存在无法适应工业生产条件以及对非天然底物的催化能力低等问题。定点突变和饱和突变技术是酶分子进行改造的有效手段。

定点突变(site-directed mutagenesis或site-specific mutagenesis)是指在目的DNA片段的指定位点上引入特定的碱基对的方法。通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，常用于研究某个(些)氨基酸残基对蛋白质结构和功能的影响。在酶的理性设计中，采用定点突变方法可筛选得到催化活性、底物特异性和/或稳定性提高的突变酶。

饱和突变是通过对目的蛋白的编码基因进行改造，短时间内获取靶位点氨基酸分别被其它19种氨基酸替代的突变体的一种方法。此方法不仅是蛋白质定向改造的强有力工具，而且是蛋白质结构－功能关系研究的重要手段。饱和突变往往能获得比单点突变更为理想的进化体。而对于定点突变方法不能解决的这些问题，恰恰是饱和突变方法所擅长的独特之处。

ω－转氨酶(ω－TA)属于转移酶类，同其他的转氨酶类一样，催化一个氨基与酮基互换的过程。ω－转氨酶以酮类化合物为原料，通过立体选择性地转氨基作用，可以高效生产手性胺，受到众多研究人员关注和重视。

3-氨基吡咯烷衍生物及其光学异构体是一种手性胺化合物，是合成大量手性药物或农业化学品的关键中间体。(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷是重要的具有光学活性的3-氨基吡咯烷衍生物。J.M.C1992,35,1764报道的以(R)-1-苄基-3-吡咯烷醇为起始原料，用五步反应制得(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷，其ee值为96％，合成路线如下：

该合成路线的起始原料价格较高，且合成工艺中使用了有害试剂叠氮化钠，对操作设备及人员安全、三废处理等要求较高，对环境的污染较大。但目前报道的利用生物酶生物催化不对称合成手性(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷的方法极少。

尽管目前也有报道，转氨酶可以作为生物催化剂，一步还原酮底物，制备高光学纯度的(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷。与传统化学方法相比，生物转化法的反应条件温和，避免了强氧化剂、强还原剂以及危险试剂的使用，条件温和，对环境污染小。

但是该生物转化法在工业生产的应用中，依然存在一些问题需要进一步解决，该方法中酶催化活性不够高效，其反应体系总体积为40-60ml/g底物，反应体系体积大，导致了生产批次和生产成本的增加，并且导致后处理过程中有机溶剂的用量大，会增加反应后处理的难度，给环境带来较大的负担。另外现有技术中多数以D-丙氨酸或L-丙氨酸或其盐做为氨基供体，在反应体系中还需要加入葡萄糖和GDH，甲酸铵和FDH等偶联辅酶体系。

因此，仍需要对现有的生物转化法进行改进，以提高转氨酶的催化特性，减少反应体系总体积，降低生产成本，减少环境污染。

发明内容

本发明旨在提供一种转氨酶突变体及其应用，以提高其催化活性。

为了实现上述目的，根据本申请的一个方面，提供了一种转氨酶突变体，转氨酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示序列发生突变的氨基酸序列，突变的氨基酸位点选自F89、K193、P243、V234、I262、Q280、V379、R416、A417及C418中的一个或多个。

进一步地，突变的氨基酸位点发生的突变包括如下任意一种或多种：P243E、F89Y/W、K193E、V234I、I262V、Q280K、V379L/M/T、R416A/C/H/Q/T/S、A417S及C418A/Q/S，其中，“/”表示“或”。

进一步地，突变包括如下任意一种组合包括：V379L/M/T+F89Y/W、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S、V379L/M/T+A417S、V379L/M/T+C418A/Q/S、V379L/M/T+P243E、V379L/M/T+K193E、V379L/M/T+V234I、V379L/M/T+I262V、V379L/M/T+Q280K、R416A/C/H/Q/T/S+A417S、R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S、R416A/C/H/Q/T/S+F89Y/W、R416A/C/H/Q/T/S+A417S+F89Y/W、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+F89Y/W、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+A417S、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+K193E、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+V234I、V379L/M/T+C418A/Q/S+F89Y/W、V379L/M/T+C418A/Q/S+P243E、V379L/M/T+C418A/Q/S+I262V、V379L/M/T+A417S+Q280K、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+F89Y/W、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+Q280K、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+F89Y/W+Q280K、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+F89Y/W+Q280K+I262V、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+F89Y/W+Q280K+A417S以及V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+F89Y/W+Q280K+I262V+V234I。

为了实现上述目的，根据本申请的第二个方面，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述任一种转氨酶突变体。

根据本申请的第三个方面，提供了一种重组质粒，该重组质粒连接有上述DNA分子。

进一步地，重组质粒为pET-21b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。

根据本申请的第四个方面，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。

进一步地，宿主细胞为原核细胞或真核细胞；优选地，真核细胞为酵母细胞；优选地，宿主细胞为感受态细胞，进一步优选感受态细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌W3110。

根据本申请的第四个方面，提供了一种生产手性胺的方法，该方法包括采用转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体。

进一步地，酮类化合物为

其中，R1和R2各自独立地为为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C6～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R1和R2与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，C6～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，酮类化合物为

转氨基反应产物为

优选的，氨基供体为异丙胺或异丙胺盐。

应用本发明的技术方案，通过利用定点突变和/或饱和突变的方法对ω-转氨酶进行改进，获得了高催化效率和/或高稳定性的ω-转氨酶突变体。本申请所获得的部分ω-转氨酶突变体，在(S)-1-苄氧羰基-3-氨基杂环化合物(特别是(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷和(S)-1-苄氧羰基-3-氨基氨基哌啶)合成中，酶的用量降低为0.3wt～0.5wt，反应体积降为10V-20V，大大提高了酶的利用率和反应斧的利用率，降低酶液生产批次及物料的使用量，有效减少了后处理中的有机溶剂的使用量，使得后处理的难度和三废的排放量降低，缩减人工成本。而且，所获得的高光学纯度的(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷和(S)-1-苄氧羰基-3-氨基哌啶，使该化合物的工业生产成本得到大幅度降低，使得该酶在工业生产中具有更好的应用价值。

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

名称解释：

催化活性：是指每单位容积(或质量)催化剂在单位时间内转化原料反应物的数量。在本发明中，转氨酶的催化活性高低与本发明中所述反应原料的转化率呈正相关。

进化：用突变或重组等手段去创建分子的多样性，然后对这多样性进行筛选，获得具有新功能的基因或DNA。本发明中，通过突变或重组等手段对野生型转氨酶进行改造，以获得性能提高的转氨酶。

野生型：是指从大自然中获得的，未经人工诱变或未改造过的。本发明中，野生型ω-转氨酶，是指从Genebank中筛选获得的一种天然的，未经人工改造的基因序列编码的转氨酶。

固定化酶：是指在一定的空间范围内其催化作用，并能反复和连续使用的酶。通常酶催化反应都是在水溶液中进行的，而固定化酶是将水溶性酶用物理或化学方法处理，使之成为不溶于水的，但仍具有酶活性的状态。酶固定化之后，一般稳定性增加，易从反应体系中分离，易于控制，能多次使用，便于运输和储存，有利于自动化生产，但活性降低，使用范围减小。

固定化细胞：是用于获得细胞的酶和代谢产物的一种方法，是在固定化酶的基础上发展起来的。固定化细胞指固定在不溶性载体上，在一定的空间范围进行生命活动的细胞。由于固定化细胞能进行正常的生长、繁殖和新陈代谢，所以又称固定化活细胞或固定化增殖细胞。

本发明中，所涉及到的1wt均指转化1g主原料需要1g转氨酶突变体重组湿细胞。

本发明中，所涉及的1V等于反应体系的体积/底物的质量。

利用定点突变和/或饱和突变的方法改造转氨酶，提高其催化活性、底物特异性和/或稳定性，有助于解决现有技术中如酶液用量较大、反应体系大、生产成本高等问题。本发明的主要目的在于利用酶分子改造方法对ω-转氨酶进行改进，获得高催化效率和/或高稳定性的ω-转氨酶突变体，以解决现有技术中的不足，提高其工业生产的应用价值。

本发明以来源于紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)的野生型ω-转氨酶基因为出发基因，由于该野生型基因编码的转氨酶(具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列)本身活性相对较高，利用3wt野生型转氨酶菌泥，反应基本上可转化完成。而以该催化活性相对较高的野生型的转氨酶为基础，进行酶分子进化改造，来获得催化活性进一步提高的转氨酶是比较困难的。因此本发明做了36个位点的定点突变，饱和突变筛选了1500个突变菌株，才获得下述催化活性和/或稳定性提高的ω-转氨酶突变体。

使ω-转氨酶突变体催化活性和/或稳定性提高的突变的氨基酸位点选自F89、K193、P243、V234、I262、Q280、V379、R416、A417及C418中的一个或多个。其中，使催化活性提高的位点选自：F89、K193、P243、V234、I262、Q280、V379、R416、A417和C418，这些点位于酶催化中心附近，可能与底物进入或结合相关。

上述转氨酶，通过选择以SEQ ID NO:1为基础序列，并通过基因工程手段改造得到包含单个或多个氨基酸残基改变的突变体，其催化活性和/或稳定性显著提高。

在上述位点发生突变的基础上，发明人通过将这些位点突变成不同的氨基酸并检测其转氨酶活性的变化，发现当这些氨基酸位点突变为如下中的任意一种或几种的组合之后，转氨酶的活性和/或稳定性进一步得到提高。突变包括如下任意一个或几个：P243E、F89Y/W、K193E、V234I、I262V、Q280K、V379L/M/T、R416A/C/H/Q/T/S、A417S及C418A/Q/S，其中，“/”表示“或”。

本发明人将上述这些对催化活性和/或稳定性有正向作用的位点进行多点组合突变，通过定向筛选的方法获得了催化特性进一步提高的ω-转氨酶突变体，该突变体与野生型ω-转氨酶相比催化活性和/或稳定性显著提高。

在一种更优选的实施例中，上述突变包括如下任意一种组合：V379L/M/T+F89Y/W、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S、V379L/M/T+A417S、V379L/M/T+C418A/Q/S、V379L/M/T+P243E、V379L/M/T+K193E、V379L/M/T+V234I、V379L/M/T+I262V、V379L/M/T+Q280K、R416A/C/H/Q/T/S+A417S、R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S、R416A/C/H/Q/T/S+F89Y/W、R416A/C/H/Q/T/S+A417S+F89Y/W、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+F89Y/W、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+A417S、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+K193E、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+V234I、V379L/M/T+C418A/Q/S+F89Y/W、V379L/M/T+C418A/Q/S+P243E、V379L/M/T+C418A/Q/S+I262V、V379L/M/T+A417S+Q280K、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+F89Y/W、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+Q280K、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+F89Y/W+Q280K、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+F89Y/W+Q280K+I262V、V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+F89Y/W+Q280K+A417S以及V379L/M/T+R416A/C/H/Q/T/S+C418A/Q/S+F89Y/W+Q280K+I262V+V234I，但不限于此。

上述突变体及其组合的具体筛选过程如下：

利用36对定点突变引物对36个位点进行定点突变(F22V、F22A、F22L、L59V、L59A、W60F、C61S、C61A、F88V、F89W、F89Y、Y153F、Y153M、Y153V、A231G、R416K、R416C、R416A、A417H、C418Q、F320V、P94E、S101K、P243E、Q280K、Q346S、P354A、F397A、W60L、T87A、V234M、V234I、I262V、T321A、V379L、V379M)。并利用9个饱和突变引物对9个位点进行饱和突变(W60、T321、V379、F89、Y153、A231、Y322、R416、A417、C418)，其中定点突变引物利用QuikChange Primer Design网页设计得到的引物序列用于本实验，饱和突变引物序列见下表1，通过全质粒PCR获得完整的线性片段，将上述PCR产物经DpnⅠ消化除去出发基因的母本模版后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜。定点突变采用基因测序确定突变位点，饱和突变通过高通量筛选后再基因测序确定突变位点。

表1：饱和突变引物：

(一)采用如下方法进行高通量筛选

1、96孔板诱导表达：挑取单克隆接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在25℃下进行诱导表达过夜。

2、酶液制备方法：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200μl酶解溶液(溶菌酶2mg/mL，多黏菌素1mg/mL，pH＝7.0)，37℃保温破碎2h。酶解后的细胞破碎液4000rpm离心10min，取上清得到粗酶液。

3、按照表2所示的体系，通过酶标仪进行活性初筛。

表2：

体系	加入量
		N-Cbz-吡咯烷酮(9.26mg/ml DMSO)	48μl
对硝基苯乙胺(8.11mg/ml)	36μl
		PLP(0.2mg/ml)	12μl
磷酸盐缓冲液pH7.0	48μl
		酶液	96μl

按如上表2所示体系将除酶液以外的其它组分在96浅孔板中混匀，于430nm进行本底检测，然后分别向各孔中加入已经制备好的突变体酶液96μL，并立即将混合体系置于40℃、200rpm摇床反应，30～40min后用酶标仪检测OD₄₃₀的吸光值变化。

酶活计算公式：酶活(u/mL)＝(ΔA×60×V₁)/(6.22×t×V₂)

ΔA：反应过程中的吸光光度值变化量；

V₁：反应体系的总体积；

6.22：消光系数；

t：ΔA的检测时间；

V₂：加入的酶液体积。

通过与野生型转氨酶的酶活对比，筛选出活性较高的突变株，进行复筛和基因测序。

(二)转氨酶突变体的复筛

将上述初筛酶活高于野生型转氨酶的突变体接种于500ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在25℃下进行诱导表达。诱导16h后，6000g离心10min收集菌体。菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液，用于活性检测。

(1)以N-Cbz-3-吡咯烷酮为底物检验转氨酶突变体的反应活性。采用如下体系：

将0.2g N-Cbz-3-吡咯烷酮底物溶于0.5ml DMSO中混匀，加4.3M的异丙胺盐酸盐1.25ml,0.01g/ml的PLP 0.2ml,0.3～3wt的重组粗酶，用100mM磷酸盐缓冲液pH7.0补足反应体系20～30V，调pH7.0,30℃恒温摇床200rpm反应。3h，16h取体系200μL，加入400μL甲醇混匀，12000rpm离心3分钟，取200μL上清液加入800μL甲醇混匀，送HPLC检测转化率。确定催化活性提高的突变体。

部分检测结果见表3。

表3：

从表3中可以看出，转氨酶的反应速度较快，在3h和过夜16h的转化效果基本一致，转化率相差不超过10％，但为了方便取样操作，之后实验采用过夜反应。本发明中的部分ω-转氨酶突变体，在(S)-1-苄氧羰基-3-氨基杂环化合物(特别是(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷)合成中，酶的用量进一步降低为0.3-0.5wt，反应体积为20V，所获得的(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷的ee值大于99％，这大大提高了酶的利用率，使该化合物的工业生产成本得到大幅度降低。

此外，采用对(S)-1-苄氧羰基-3-氨基哌啶合成的反应条件及部分反应结果见表4。

表4：

从表4中可以看出，本发明中的部分ω-转氨酶突变体，在(S)-1-苄氧羰基-3-氨基哌啶合成中，酶的用量降低为0.5wt，反应体积降为10V，转化率提高8％～30％，ee值＞98％。这大大提高了酶和反应釜的利用率，有效的降低酶液生产批次及物料的使用量，缩减了生产成本。

(2)以N-Cbz-3-吡咯烷酮为底物检验转氨酶突变体的耐受性。采用如下体系：

将0.2g N-Cbz-3-吡咯烷酮底物溶于0.5ml DMSO中混匀，加4.3M的异丙胺盐酸盐1.25ml,0.01g/ml的PLP 0.2ml,经30℃，pH9.5，50％DMSO处理1h的重组粗酶0.5～2wt，用100mM NaHCO₃补足反应体系20～30V，调pH7.0,30℃恒温摇床200rpm反应过夜。16h取体系200μL，加入400μL甲醇混匀，12000rpm离心3分钟，取200μL上清液加入800μL甲醇混匀，送HPLC检测转化率。确定稳定性提高的突变体。部分结果见表5。

表5：

转氨酶	酶液处理条件	相对残余活力
			野生型	30℃，pH9.5，50％DMSO处理1h	21.84％
V379T+R416A	30℃，pH9.5，50％DMSO处理1h	62.14％
			V379T+R416A+C418A	30℃，pH9.5，50％DMSO处理1h	27.13％
V379T+R416A+C418S	30℃，pH9.5，50％DMSO处理1h	58.05％

酶长时间处于高温、强酸、强碱、有机溶剂等极端条件下会失去活性，残余酶活性就是在高温、强酸、强碱或有机溶剂等环境下，还保持活性的酶的总活性。相对残余活力是指经高温、碱性、有机溶剂等极端条件适量处理后的酶液测定的酶活力，与未经过极端环境下处理的酶液在最适条件下的酶活力的百分比。在相同的处理条件下，相对残余活力高，说明该酶在此条件下的稳定越高。

从表5中可以看出，在相同的极端条件下，突变体的相对残余活力比野生型转氨酶的高两倍至3倍。因此，本发明中获得ω-转氨酶突变体的稳定性得到了很大的提高，这为后续的固定化及连续流反应创造较好的前提条件。

综上可知，本发明通过定向筛选的方法获得的ω-转氨酶突变体催化活性和/或稳定性有很大的提高，使得其在转氨反应中的酶用量降低，反应体系缩减，尤其是以廉价的异丙胺为氨基供体，催化合成(S)-1-苄氧羰基-3-氨基哌啶和(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷的反应。

在本发明的第二种典型的实施方式中，提供了一种DNA分子，该DNA分子编码上述任一种ω-转氨酶突变体。编码的上述转氨酶突变体具有催化活性和/或稳定性显著提高的优势。

在本发明的第三种典型的实施方式中，提供了一种重组质粒，重组质粒连接有上述DNA分子。

上述重组质粒中，任何能够用于表达上述转氨酶突变体的DNA分子的重组质粒均适用于本发明。在本发明的优选实施例中，重组质粒选自如下之一：pET-21b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18或pUC-19。

在本发明的第四种典型的实施方式中，提供了一种宿主细胞，该宿主细胞含有上述任一种重组质粒。具体的宿主细胞为原核细胞或真核细胞，优选真核细胞为酵母细胞。更优选地，上述宿主细胞为感受态细胞，进一步优选感受态细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌W3110。

在本发明的第五种典型的实施方式中，提供了一种生产手性胺的方法，包括采用转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，其中，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体。

酮类化合物为

其中，R₁和R₂各自独立地为为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C6～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R₁和R₂与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，C6～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代，优选地，酮类化合物为

转氨基反应产物为

优选的，氨基供体为异丙胺或异丙胺盐。

利用这些催化活性和/或稳定性得到了显著提高的转氨酶突变体，可使得(S)-1-苄氧羰基-3-氨基杂环化合物合成中的酶的用量和反应体积得到大幅度的降低，大大的降低了生产批次和生成成本，使得该酶在工业生产中具有更好的应用价值。本发明采用廉价的氨基供体(如异丙胺及其盐酸盐)进行反应，反应中可以不需要偶联辅酶体系，反应物料种类少，操作较简单。

利用本发明上述转氨酶突变作为催化剂制备(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷或(S)-1-苄氧羰基-3-氨基哌啶等(S)-1-苄氧羰基-3-氨基杂环化合物的过程中，由于酶的催化活性和/或稳定性显著提高，因而酶的用量明显降低，反应体积缩减到10-20ml/g底物，明显比现有技术中的反应体积小。在此基础上，上述反应的温度、时间以及pH值可以在现有的反应条件基础上进行合理调整优化得到。采用本申请优选的反应条件，反应效率更高。

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1

利用QuikChange Primer Design网页设计的36对定点突变引物和表1所示的9个饱和突变引物，通过全质粒PCR获得完整的线性片段，将上述PCR产物经DpnⅠ消化除去出发基因的母本模版后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜。饱和突变通过高通量筛选。具体对上述突变体采用如下方法进行高通量筛选：

(1)96孔板诱导表达：挑取单克隆接种于含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在25℃下进行诱导表达过夜。

(2)酶液制备方法：96孔板离心去掉上清培养基，每孔加入200μl酶解溶液(溶菌酶2mg/mL，多黏菌素1mg/mL，pH7.0)，37℃保温破碎2h。酶解后的细胞破碎液4000rpm离心10min，取上清得到粗酶液。

实施例2：转氨酶突变体对N-Cbz-3-吡咯烷酮底物的活性检验

将上述酶活高于野生型转氨酶的突变体接种于500ml含100μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在25℃下进行诱导表达。诱导16h后，6000g离心10min收集菌体。菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液，用于活性检测。

将0.2g N-Cbz-3-吡咯烷酮底物溶于0.5ml DMSO中混匀，加4.3M的异丙胺盐酸盐1.25ml,0.01g/ml的PLP 0.2ml,0.3～2wt的重组粗酶，用100mM磷酸盐缓冲液pH7.0补足反应体系20～30V，调pH7.0,30℃恒温摇床200rpm反应过夜。16h取体系200μL，加入400μL甲醇混匀，12000rpm离心3分钟，上清液送HPLC检测转化率。确定催化活性提高的突变体。

催化活性提高的突变体结果见表6。

表6：

“1”表示3wt酮还原酶粗酶，反应体系30V时，16h转化率＞93％；“+”表示1wt酮还原酶粗酶，反应体系30V时，16h转化率大于93％；“++”表示1wt酮还原酶粗酶，反应体系20V时，16h转化率＞93％；“+++”表示0.5wt酮还原酶粗酶，反应体系20V时，16h转化率＞93％；“++++”表示0.3wt～0.5wt酮还原酶粗酶，反应体系20V时，16h转化率为94％-100％。

实施例3：

将突变体编号为1到21，33到43和54诱导表达的33个转氨酶用于(S)-1-苄氧羰基-3-氨基哌啶合成反应的筛选，采用如下反应体系：0.2g N-BOC-哌啶酮底物溶于0.3ml DMSO中混匀，4.3M的异丙胺盐酸盐698ul，2mg PLP，0.5～3wt的重组粗酶，用100mM磷酸盐缓冲液pH7.0补足反应体系10～16V，调pH7.0，30℃，200rpm反应过夜。经反应筛选，活性相对较好的菌种反应结果见表7。除表7以外的剩余21个转氨酶突变体的催化活性与野生型转氨酶活性相比未见增加。

表7：

实施例4：以N-Cbz-3-哌啶酮为底物检验转氨酶突变体的耐受性

转氨酶粗酶0.5wt用30℃，pH9.5，50％DMSO处理1h后，用于如下反应：将0.2g N-Cbz-3-哌啶酮底物溶于0.3ml DMSO中混匀，加4.3M的异丙胺盐酸盐698ul,0.01g/ml的PLP0.2ml，用100mM NaHCO₃补足反应体系11V，调pH9.5,30℃恒温摇床200rpm反应过夜。16h取体系200μL，加入400μL甲醇混匀，12000rpm离心3分钟，上清液送HPLC检测转化率。具体结果见表8。

表8：

从表8中可以看出，在相同的处理条件下，与野生型转氨酶相比，部分的转氨酶突变体的稳定性更高。

实施例5：

4个转氨酶粗酶0.5wt用30℃，pH9.5，50％～60％DMSO处理1h后，用于如下反应：将0.2g N-Cbz-3-哌啶酮底物溶于0.3ml DMSO中混匀，加4.3M的异丙胺盐酸盐698ul,0.01g/ml的PLP 0.2ml，用100mM NaHCO₃补足反应体系2ml，调pH9.5,30℃恒温摇床200rpm反应过夜。16h取体系200μL，加入400μL甲醇混匀，12000rpm离心3分钟，上清液送HPLC检测转化率，结果见表9。

表9：

实施例6：转氨酶突变体在制备(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷合成中的应用

其反应方程式如下：

反应体系如下：1g N-Cbz-3-吡咯烷酮底物溶于2.5ml DMSO中混匀，加4.3M的异丙胺盐酸盐6.25ml,0.01g/ml的PLP(磷酸吡哆醛)1ml,0.3～0.5wt的V379T+R416A+C418A+F89Y重组粗酶，用100mM磷酸盐缓冲液pH7.0补足反应体系20V，调pH7.0,30℃恒温摇床200rpm反应。HPLC检测，16h转化率为96.38％，反应结束后，体系调碱性，加入甲叔醚进行萃取3次，合并萃取有机相后加入硫酸镁进行干燥，旋转蒸发至干，收率80～86％，ee值为＞99％。

实施例7：转氨酶突变体在制备(S)-1-苄氧羰基-3-氨基哌啶合成中的应用

其反应方程式如下：

反应体系如下：2g N-BOC-哌啶酮底物溶于3ml DMSO中混匀，4.3M的异丙胺盐酸盐6.98ml，20mg PLP(磷酸吡哆醛)，0.5wt的V379T+R416A+C418S+F89Y重组粗酶，用100mM磷酸盐缓冲液pH7.0补足反应体系10V，调pH7.0，30℃，200rpm反应过夜。HPLC检测，16h转化率为98.3％，反应结束后，体系调碱性，加入甲叔醚进行萃取3次，合并萃取有机相后加入硫酸镁进行干燥，旋转蒸发至干，收率＞90％，ee值99％。

从以上的描述中可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：

本申请所获得的部分ω-转氨酶突变体，在(S)-1-苄氧羰基-3-氨基杂环化合物(特别是(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷和(S)-1-苄氧羰基-3-氨基氨基哌啶)合成中，酶的用量降低为0.3wt～0.5wt，反应体积降为10V-20V，大大提高了酶的利用率和反应斧的利用率，降低酶液生产批次及物料的使用量，有效减少了后处理中的有机溶剂的使用量，使得后处理的难度和三废的排放量降低，缩减人工成本。而且，所获得高光学纯度的(S)-1-苄氧羰基-3-氨基吡咯烷和(S)-1-苄氧羰基-3-氨基哌啶，使该化合物的工业生产成本得到大幅度降低，使得该酶在工业生产中具有更好的应用价值。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 凯莱英生命科学技术（天津）有限公司

<120> 转氨酶突变体及其应用

<130> PN142111KLY

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 459

<212> PRT

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

<400> 1

Met Gln Lys Gln Arg Thr Thr Ser Gln Trp Arg Glu Leu Asp Ala Ala

1 5 10 15

His His Leu His Pro Phe Thr Asp Thr Ala Ser Leu Asn Gln Ala Gly

20 25 30

Ala Arg Val Met Thr Arg Gly Glu Gly Val Tyr Leu Trp Asp Ser Glu

35 40 45

Gly Asn Lys Ile Ile Asp Gly Met Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val

50 55 60

Gly Tyr Gly Arg Lys Asp Phe Ala Glu Ala Ala Arg Arg Gln Met Glu

65 70 75 80

Glu Leu Pro Phe Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr Thr His Pro Ala Val

85 90 95

Val Glu Leu Ser Ser Leu Leu Ala Glu Val Thr Pro Ala Gly Phe Asp

100 105 110

Arg Val Phe Tyr Thr Asn Ser Gly Ser Glu Ser Val Asp Thr Met Ile

115 120 125

Arg Met Val Arg Arg Tyr Trp Asp Val Gln Gly Lys Pro Glu Lys Lys

130 135 140

Thr Leu Ile Gly Arg Trp Asn Gly Tyr His Gly Ser Thr Ile Gly Gly

145 150 155 160

Ala Ser Leu Gly Gly Met Lys Tyr Met His Glu Gln Gly Asp Leu Pro

165 170 175

Ile Pro Gly Met Ala His Ile Glu Gln Pro Trp Trp Tyr Lys His Gly

180 185 190

Lys Asp Met Thr Pro Asp Glu Phe Gly Val Val Ala Ala Arg Trp Leu

195 200 205

Glu Glu Lys Ile Leu Glu Ile Gly Ala Asp Lys Val Ala Ala Phe Val

210 215 220

Gly Glu Pro Ile Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val Pro Pro Ala Thr

225 230 235 240

Tyr Trp Pro Glu Ile Glu Arg Ile Cys Arg Lys Tyr Asp Val Leu Leu

245 250 255

Val Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr Gly Glu Trp Phe

260 265 270

Gly His Gln His Phe Gly Phe Gln Pro Asp Leu Phe Thr Ala Ala Lys

275 280 285

Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Leu Pro Ile Gly Ala Val Phe Val Gly Lys

290 295 300

Arg Val Ala Glu Gly Leu Ile Ala Gly Gly Asp Phe Asn His Gly Phe

305 310 315 320

Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Cys Ala Ala Val Ala His Ala Asn Val

325 330 335

Ala Ala Leu Arg Asp Glu Gly Ile Val Gln Arg Val Lys Asp Asp Ile

340 345 350

Gly Pro Tyr Met Gln Lys Arg Trp Arg Glu Thr Phe Ser Arg Phe Glu

355 360 365

His Val Asp Asp Val Arg Gly Val Gly Met Val Gln Ala Phe Thr Leu

370 375 380

Val Lys Asn Lys Ala Lys Arg Glu Leu Phe Pro Asp Phe Gly Glu Ile

385 390 395 400

Gly Thr Leu Cys Arg Asp Ile Phe Phe Arg Asn Asn Leu Ile Met Arg

405 410 415

Ala Cys Gly Asp His Ile Val Ser Ala Pro Pro Leu Val Met Thr Arg

420 425 430

Ala Glu Val Asp Glu Met Leu Ala Val Ala Glu Arg Cys Leu Glu Glu

435 440 445

Phe Glu Gln Thr Leu Lys Ala Arg Gly Leu Ala

450 455

<210> 2

<211> 40

<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(20)

<223> n is a, c, g, or t

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<223> k is g, or t

<400> 2

ccgttctaca ataccttcnn kaaaaccacc cacccagctg 40

<210> 3

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

<220>

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<223> m is a or c

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<223> n is a,t, g or c

<400> 3

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<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<223> k is g or t

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<210> 5

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<212> DNA

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<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

ccaccaatag tgctgccgtg mnngccgttc caacggccaa tc 42

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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ggtgagccga tccagggtnn kggtggtgtt atcgttccgc 40

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

gcggaacgat aacaccaccm nnaccctgga tcggctcacc 40

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<223> m is a,or c

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

<220>

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<223> m is a,or c

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<221> misc_feature

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<223> n is a, c, g, or t

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<210> 12

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<223> n is a, c, g, or t

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<223> k is g, or t

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<222> (24)..(25)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 13

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<211> 42

<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<223> n is a, c, g, or t

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<223> k is g, or t

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

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<400> 18

cagactgggt gaccagaata mnnaaaaccg tggttgaagt cacc 44

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<212> DNA

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<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (24)..(24)

<223> k is g, or t

<400> 19

ggtgacttca accacggttt tnnktattct ggtcacccag tctg 44

<210> 20

<211> 35

<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> m is a,or c

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(18)

<223> n is a, c, g, t or u

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> n is a, c, g, t or u

<400> 20

ccagcgtgaa cgcctgmnnc ataccaacac cgcgc 35

<210> 21

<211> 35

<212> DNA

<213> 紫色杆菌(Chromobacterium violaceum)

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(18)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (19)..(19)

<223> k is g, or t

<400> 21

gcgcggtgtt ggtatgnnkc aggcgttcac gctgg 35

Claims

1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体的氨基酸序列是SEQ ID NO：1所示序列发生突变的氨基酸序列，所述突变的氨基酸位点选自如下任意一种：R416A、R416C、R416H、R416Q、R416T、R416S、R416T+F89Y、R416A+A417S、R416A+C418A、R416A+C418S及R416T+A417S+F89Y。

2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的转氨酶突变体。

3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒连接有权利要求2所述的DNA分子。

4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET-21b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4或3所述的重组质粒。

6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为原核细胞或真核细胞。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞为酵母细胞。

8.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为感受态细胞。

9.根据权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述感受态细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌W3110。

10.一种生产手性胺的方法，包括采用转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，其特征在于，所述转氨酶为权利要求1所述的转氨酶突变体。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为

其中，R₁和R₂各自独立地为C1～C8烷基、C5～C10环烷基、C6～C10芳基或C5～C10杂芳基，或者R₁和R₂与羰基上的碳共同形成C5～C10杂环基、C5～C10碳环基或C5～C10杂芳基，所述C5～C10杂环基和C5～C10杂芳基中的杂原子各自独立地选自氮、氧和硫中的至少一种，所述C6～C10芳基中的芳基、C5～C10杂芳基中的杂芳基、C5～C10碳环基中的碳环基或C5～C10杂环基中的杂环基各自独立地未被取代或被卤素、烷氧基或烷基中的至少一个基团所取代。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为

转氨基反应产物为

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述氨基供体为异丙胺或异丙胺盐。