CN115851649A - 转氨酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转氨酶突变体及其应用。其中，该转氨酶突变体是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到，突变至少包括：G292A；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有85％的同源性，更优选具有90％的同源性。本发明的上述转氨酶突变体扩大了酶的底物谱、提高酶对大位阻底物的催化能力；同时增强其稳定性，可在高浓度溶剂和高温度条件下进行催化反应；另外，转氨酶突变体的立体选择性也得到了极大的提高，可以更加高效生产手性胺，降低了生产成本和后期处理难度，适合推广用于手性胺的工业生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种转氨酶突变体及其应用。
背景技术
手性胺是指小分子化合物手性中心含有氨基的一类化合物，是众多医药及农药的关键中间体，在药品生产和工农业生产中越来越受到人们的重视。其中，手性胺是合成神经类药物、心血管药物、抗高血压药物、抗感染药物及疫苗等的重要中间体，目前，40％～50％的手性药物都是手性胺类化合物，高效、便捷合成手性胺化合物是有机合成化学研究的重要方向。例如，糖尿病类治疗药物-西他列汀(Merck公司及Codexis公司)及广谱触杀型除草剂-草铵膦(Bayer公司)都具有手性胺化学模块。
目前，制备手性胺的方法主要有化学法、生物拆分法和生物不对称合成法。其中，化学法合成手性胺往往需要使用昂贵的金属催化剂及特制的溶剂，生产成本较高，对映选择性较低，并会造成一定的环境污染；而酶法制备手性芳香胺具有催化效率高、立体选择性强、反应条件温和、环境友好等特点，符合绿色合成的大趋势，因而成为当前研究的热点。目前用于制备手性芳香胺的酶主要为脂肪酶和转氨酶。相对于生物催化剂(脂肪酶)进行手性拆分法制备高纯度手性胺的最大理论收率只有50％，生物不对称合成法(转氨酶)理论收率高达100％，因此其在生产工业领域有着强大的应用前景，相关研究受到了广泛的重视。其中ω-转氨酶(ω-TAs)具有对映选择性和区域选择性高、底物谱较广以及无需额外添加昂贵的辅酶的优势，成为工业上用于生产手性胺的重要工业酶之一。
转氨酶又称氨基转移酶，属于转移酶类，能够可逆催化酮基与氨基之间的氨基转移反应。当这类酶催化的转氨反应中，底物或产物含有α氨基酸时，就称该酶为α转氨酶，反之则称之为ω转氨酶。α转氨酶的产物一般只是α氨基酸，而ω转氨酶能够氨基化酮酸、醛和酮，且具有立体选择性高、辅因子可再生的特点，因此，ω转氨酶被更广泛地应用于合成医药和农药中间体。但是目前报道的野生ω-TAs中能直接用于制药工业的为数不多，主要受限于酶的不稳定性及不利的反应平衡。
发明内容
本发明旨在提供一种转氨酶突变体及其应用，以提高转氨酶的活性。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体，转氨酶突变体是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到，突变至少包括：G292A；或者转氨酶突变体的氨基酸序列具有发生突变的氨基酸序列中的突变位点，且与发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有85％的同源性，更优选具有90％的同源性，进一步优选具有95％的同源性，再优选具有99％的同源性。
根据本发明的另一方面，提供了一种DNA分子。该DNA分子编码上述任一种转氨酶突变体。
根据本发明的再一方面，提供了一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。
进一步地，重组质粒为pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。
根据本发明的又一方面，提供了一种宿主细胞。该宿主细胞含有上述重组质粒。
进一步地，宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选原核细胞为大肠杆菌BL21-DE3细胞或大肠杆菌Rosetta-DE3细胞；真核细胞为酵母。
根据本发明的再一方面，提供了一种生产手性胺的方法。该方法包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种转氨酶突变体。
进一步地，酮类化合物为
其中，R1为H、未被取代或被卤素任选取代的C1～C10烷基、未被取代或被卤素任选取代C5～C10环烷基、未被取代或被卤素任选取代的C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，R2为H、卤素、未被取代或被卤素、NH3或带Boc、Cbz保护的NH3中至少一个基团所任选取代C1～C10烷基，R3为未被取代或被卤素任选取代的C6-12的芳基、未被取代或被卤素任选取代的C3-6的杂环基；优选的，酮类化合物为
进一步地，氨基供体为异丙胺或丙氨酸，优选为异丙胺。
进一步地，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为7～11，优选为8～10.5，更优选为10.5；优选的，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为25～60℃，进一步优选为30～55℃，更优选为50℃；优选的，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中二甲基亚砜体积浓度为0％～50％。
本发明的上述转氨酶突变体是在SEQ ID NO：1所示的转氨酶的基础上，通过理性设计和定向进化的方式对蛋白进行氨基酸突变及其组合突变获得突变体，以此扩大酶的底物谱、提高酶对大位阻底物的催化能力；同时增强其稳定性，可在高浓度溶剂和高温度条件下进行催化反应，进而此突变体的应用可以提高反应速率，提高酶稳定性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产；另外，转氨酶突变体的立体选择性也得到了极大的提高，可以更加高效生产手性胺，降低了生产成本和后期处理难度，适合推广用于手性胺的工业生产。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
转氨酶是一类以蛋白质为主体的生物催化剂，而在工业生产过程中往往需要在一定的有机溶剂、压力、温度等易使蛋白质变性的条件，因此需要所用的生物催化剂具有较高的耐受性，以适应工业化生产需要。而野生转氨酶一方面催化活性较低、底物谱较窄，且往往其对工业需求条件耐受性较低，从而限制了其广泛应用。
本发明力图通过理性设计和定向进化的方式对蛋白进行氨基酸突变及其组合突变获得突变体，以此扩大酶的底物谱、提高酶对大位阻底物的催化能力；同时增强其稳定性，可在高浓度溶剂和高温度条件下进行催化反应；并且提高结构中(1)手性中心的立体选择性。
酶的理性改造是基于酶的三维分子结构对酶的底物结合部位、辅酶结合部位、表面及其他部位进行改造，以改变酶的催化特性，提高酶活力、选择性等特性。酶的定向进化是一种蛋白质的非理性设计，人为创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制，在体外改造基因，应用易错PCR、DNA改组(DNA shuffling)等技术，结合高效筛选系统获得具有预期特性的新酶。
本发明对本实验室已有的150种天然转氨酶及190种转氨酶突变体进行底物1
的活力筛选，发现只有来源于Sciscionella sp.的转氨酶突变体MTTTEFANREIH(12aa)+G17V+Q40H+T66M+G69Y+H70T+L73A+V77G+A78I+K141S+K142T+R143P+G144Y+Y130M+L148A+L151H+T152R+H153P+L163Q+A165I+R188L+T204S+S207I+F208R+K211H+T290S+A292G+K146R+E145G(Template，其氨基酸序列为SEQ ID 1：MTTTEFANREIH(12aa)MTTTEFANSNLVAVEPVAIREPTPPGSVIQYSEYELDRSHPLAGGVAWIEGEYVPADEARISIFDMGFYTSDATYTGIHVWHGNIFRLEDHLDRLLHGAARLKLETGMSREELAGIAKRCVSLSQLREAMVNITITRGYGSTPYGRDATKHRPQVYVYAIPYQWIFPPEEQIFGTSVIVPRHVRRAGLNTIDPTIKNFQWGDLSAAIREAHDRGARSAVLLDADNCVAEGPGFNVVLVKDGALVSPSRNALPGITRKTVYEIAAAKGIETMLRDVTSSELYEADELMAVSTGGGVTPITSLDGEQVGNGEPGPITVAIRDRFWALMDEPSSLIEAIDY*；对应的，Template碱基序列为SEQ ID NO2：ATGACCACCACCGAGTTTGCCAACAGGGAATTCCAT(12aa)ATGACCACCACCGAGTTTGCCAACAGCAATCTGGTGGCCGTGGAACCGGTTGCAATCCGTGAGCCTACCCCTCCGGGCAGCGTGATTCAGTACAGCGAGTACGAACTGGATCGCAGCCATCCGCTGGCAGGTGGCGTTGCCTGGATTGAAGGCGAGTATGTTCCTGCCGATGAAGCCCGTATCAGCATCTTCGATATGGGCTTTTATACCAGCGATGCGACCTATACCGGGATCCACGTTTGGCACGGCAATATCTTCCGCCTGGAAGACCACCTGGACCGCCTGCTGCATGGTGCCGCACGTCTGAAACTGGAAACCGGTATGAGCCGCGAAGAACTGGCCGGCATTGCCAAGCGTTGTGTTAGCCTGAGCCAGCTGCGCGAAGCCATGGTGAACATCACCATTACCCGCGGCTATGGCAGCACCCCCTACGGAAGGGATGCGACCAAACATAGGCCCCAGGTGTACGTGTATGCCATCCCGTATCAGTGGATCTTCCCTCCGGAGGAACAGATTTTCGGCACCAGCGTGATTGTGCCGCGTCATGTGCGCCGCGCCGGTCTCAATACCATCGACCCGACCATCAAGAACTTTCAGTGGGGTGACCTGTCCGCCGCCATCCGTGAGGCCCATGATCGCGGCGCACGTAGCGCAGTTCTGCTGGATGCCGATAATTGCGTGGCCGAGGGTCCGGGCTTTAATGTGGTTCTGGTGAAGGACGGCGCACTGGTGAGTCCGAGTCGTAACGCACTGCCGGGCATCACCCGCAAAACCGTGTACGAAATCGCAGCAGCCAAAGGCATCGAAACCATGCTGCGCGACGTGACCAGCAGTGAACTGTATGAGGCAGATGAGCTGATGGCCGTGAGCACCGGAGGTGGTGTGACCCCTATTACCAGCCTGGATGGCGAGCAGGTTGGCAACGGTGAGCCGGGCCCGATTACCGTGGCCATTCGTGATCGCTTTTGGGCACTGATGGATGAGCCGAGCAGCCTGATTGAGGCCATTGACTATTAA)可以催化目标底物得到产物，但是催化活性较差。
为了扩大酶的底物谱、提高酶对大位阻底物的催化能力，增强其稳定性，本申请以pET22b为表达载体，通过定点突变、饱和突变、易错PCR以及组合突变等方式在转氨酶上引入突变位点，获得含有突变基因的质粒，以BL21(DE3)为表达菌株，在IPTG的诱导下获得突变体蛋白。然后对突变体进行活性检测，挑选活性提高的突变体。
其中，定点突变：是指通过聚合酶链式反应(PCR)等方法向目的DNA片段(可以是基因组，也可以是质粒)中引入所需变化(通常是表征有利方向的变化)，包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。
利用全质粒PCR引入定点突变的方法简单有效，是目前使用比较多的手段。其原理是，一对包含突变位点的引物(正、反向)，和模版质粒退火后用聚合酶“循环延伸”，所谓的循环延伸是指聚合酶按照模版延伸引物，一圈后回到引物5’端终止，再经过反复加热退火延伸的循环，这个反应区别于滚环扩增，不会形成多个串联拷贝。正反向引物的延伸产物退火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模版质粒来源于常规大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，对Dpn I敏感而被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开，因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆。
上述得将突变质粒转化至大肠杆菌细胞内，在大肠杆菌中过量表达。转氨酶诱导表达最佳条件：25℃，0.1mM IPTG诱导过夜。然后通过超声破碎细胞的方法获得粗酶。
反应验证条件：配置底物母液(底物溶于DMSO中)和PLP母液(10mg 5-磷酸吡哆醛溶于1mL的buffer中)，在10mL反应器中依次加入硼酸buffer、PLP母液、6M异丙胺盐酸盐溶液、底物母液，最后加入酶(20％酶液)，在摇床中200rpm反应，反应结束后在反应体系中加入乙腈，震荡混匀后12000rpm，离心3min，取上清稀释适合的倍数，送HPLC检测活性。
前期通过定点突变和单点饱和突变的理性方式对转氨酶进行初步的改造，用底物1进行活力验证：反应式如下，结果如表1所示。
表1
备注：
1)反应条件A：5wt酶、PLP 2mg、DMSO 20％、IPN 30eq、500V、0.1M Tris-Cl 9.0、37℃、40h；
2)N.D.表示未检测到产品生成，-表示0～1％，+表示1～5％，++表示5～10％，+++表示10～15％，++++表示>15％。
上述结果说明，经过定点突变和定向进化改造的突变体获得了对具有较大空间位阻的底物的催化能力，且活力不断逐步提高。为了进一步提升突变体的催化活力和稳定性，通过饱和突变以及组合突变的方式和定向筛选的方法对突变体的耐受性进行改造。效果验证反应式如下，结果如表2所示。
表2
备注：
1)反应条件B：2wt酶、PLP 4mg、DMSO 30％、IPN 30eq、200V、0.1M硼酸10.0、50℃、16h；
2)反应条件C：0.5wt酶、PLP 4g/L、DMSO 30％、IPN 30eq、100V、0.1M硼酸10.0、50℃、16h；
3)反应条件D：0.5wt酶、PLP 1g/L、DMSO 30％、IPN 30eq、100V、0.1M硼酸10.5、55℃、16h；
4)反应条件E：0.1wt酶、PLP 1g/L、DMSO 50％、IPN 5eq、100V、0.2M硼酸10.5、60℃、16h；
5)N.D.表示未检测到产品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示>90％。
经过上述耐受性改造后的突变体经过底物1的酶活验证，突变体耐高温的稳定性得到显著的提升，Template最适反应温度为37℃，突变体T291A+G292A+T70C、突变体T291A+G292A+T70C+I160G等突变体的最适反应温度提升到50℃，突变体T291A+G292A+T70C+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q、T291A+G292A+T70C+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q+Y158V最适反应温度提升到60℃；同时突变体在溶剂中稳定性也有显著提高，最适反应DMSO浓度由20％提升到50％；而且酶活力也得到不断的逐步提高，突变体T291A+G292A+T70C+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q+Y158V的酶活力相较Template大幅度提高。为了改善突变体的立体选择性，通过饱和突变、组合突变以及易错PCR的进化方式和定向筛选的方法对突变体的选择性进行改造。效果验证反应式如下，结果如表3所示。
表3
“-12aa”表示去掉蛋白前端的12个氨基酸。
备注：
1)转氨酶突变体ee值，ee值＝((CP1+CP)-(CP2+CP3))/(CP+CP1+CP2+CP3)
2)反应条件D：0.5wt酶、PLP 1g/L、DMSO 30％、IPN(异丙胺盐酸盐)30eq、100V、0.1M硼酸10.5、55℃、16h；
3)反应条件F：7wt酶、PLP 1g/L、DMSO 20％、IPN 30eq、500V、0.2M硼酸10.5、60℃、16h；
4)反应条件G：0.1wt酶、PLP 1g/L、DMSO 30％、IPN 10eq、200V、0.2M硼酸10.5、60℃、16h；
5)反应条件H：0.3wt酶、PLP 1g/L、DMSO 30％、IPN 10eq、100V、0.2M硼酸10.5、60℃、16h；
6)反应条件L：0.3wt酶、PLP 1g/L、DMSO 40％、IPN 10eq、100V、0.2M硼酸10.5、60℃、16h；
7)反应条件M：0.3wt酶、PLP 1g/L、DMSO 40％、IPN 10eq、100V、0.2M硼酸10.5、55℃、16h；
8)N.D.表示未检测到产品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示>90％；
9)N.D.表示0，*表示0～10％，**表示10～50％，***表示50～80％，****表示80～90％，*****表示90～95％，******表示>95％。
上述选择性改造后的突变体经过底物1的酶活验证，突变体的选择性在不断逐步改善，突变体T291A+G292A+T70C+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q+Y144L+G77L转氨酶突变体ee值提高至70％以上，突变体T291A+G292A+T70C+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q+Y144L+G77T、T291A+G292A+T70C+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q+Y144L+G77T+L144W-12aa、T291A+G292A+T70C+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q+Y144W+G77T+I165L-12aa转氨酶突变体ee值提高至80％以上，T291A+G292A+T70C+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q+Y144W+G77T+I165L+A292S-12aa、T291A+G292A+T70C+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q+Y144W+G77T+I165L+A292S+S278R-12aa转氨酶突变体ee值提高至90％以上，T291A+G292A+T70C+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q+Y144W+G77T+I165L+A292S+S278R+Y69H+T70G+G160T+T106S-12aa转氨酶突变体ee值提高至95％以上。
通过采用软件对转氨酶(Template)的三维结构进行计算机模拟分析，突变的位点大部分位于活性中心附近(活性中心位点主要包括T70、Y144、A292、Y69、I160等位点)，突变后有可能增强了底物和酶的结合，从而提高了选择性和催化效率。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种转氨酶突变体。该转氨酶突变体的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到，所述突变至少包括：G292A；或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有85％的同源性，更优选具有90％的同源性，进一步优选具有95％的同源性，再优选具有99％的同源性。
本文使用的术语“同源性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同源性的规则、标准。本发明用不同程度同源性限定的序列还必须要同时具有改进的转氨酶对有机溶剂的耐受性。在上述实施方式中，优选转氨酶突变体的氨基酸序列具有以上的同源性并具有或编码具有改进的有机溶剂的耐受性的氨基酸序列。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下获得这样的变体序列。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种DNA分子。该DNA分子编码上述耐有机溶剂的转氨酶突变体。该DNA分子编码的上述转氨酶突变体具有很好的有机溶剂耐受性和高pH耐受性，并且具有高可溶性表达特性以及高活力特性。
本发明的上述DNA分子还可以以“表达盒”的形式存在。“表达盒”是指线性或环状的核酸分子，涵盖了能够指导特定核苷酸序列在恰当宿主细胞中表达的DNA和RNA序列。一般而言，包括与目标核苷酸有效连接的启动子，其任选的是与终止信号和/或其他调控元件有效连接的。表达盒还可以包括核苷酸序列正确翻译所需的序列。编码区通常编码目标蛋白，但在正义或反义方向也编码目标功能RNA，例如反义RNA或非翻译的RNA。包含目标多核苷酸序列的表达盒可以是嵌合的，意指至少一个其组分与其至少一个其他组分是异源的。表达盒还可以是天然存在的，但以用于异源表达的有效重组形成获得的。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种重组质粒。该重组质粒含有上述任一种DNA分子。上述重组质粒中的DNA分子置于重组质粒的适当位置，使得上述DNA分子能够正确地、顺利地复制、转录或表达。
虽然本发明在限定上述DNA分子时所用限定语为“含有”，但其并不意味着可以在DNA序列的两端任意加入与其功能不相关的其他序列。本领域技术人员知晓，为了满足重组操作的要求，需要在DNA序列的两端添加合适的限制性内切酶的酶切位点，或者额外增加启动密码子、终止密码子等，因此，如果用封闭式的表述来限定将不能真实地覆盖这些情形。
本发明中所使用的术语“质粒”包括双链或单链线状或环状形式的任何质粒、粘粒、噬菌体或农杆菌二元核酸分子，优选为重组表达质粒，可以是原核表达质粒也可以是真核表达质粒，但优选原核表达质粒，在某些实施方案中，重组质粒选自pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。更优选，上述重组质粒是pET-22b(+)。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种宿主细胞，宿主细胞含有上述任一种重组质粒。适用于本发明的宿主细胞包括但不仅限于原核细胞或真核细胞。优选原核细胞为真细菌，例如革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌。更优选原核细胞为大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α感受态细胞，真核细胞为酵母。
根据本发明一种典型的实施方式，提供一种生产手性胺的方法。该方法包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，转氨酶为上述任一种耐有机溶剂的转氨酶突变体。由于本发明的上述转氨酶突变体具有扩大的酶底物谱、对大位阻底物的催化能力较高；同时稳定性增强，可在高浓度溶剂和高温度条件下进行催化反应，进而此突变体的应用可以提高反应速率，提高酶稳定性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。
进一步地，酮类化合物为
其中，R1为H、未被取代或被卤素任选取代的C1～C10烷基、未被取代或被卤素任选取代C5～C10环烷基、未被取代或被卤素任选取代的C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，R2为H、卤素、未被取代或被卤素、NH3或带Boc、Cbz保护的NH3中至少一个基团所任选取代C1～C10烷基，R3为未被取代或被卤素任选取代的C6-12的芳基、未被取代或被卤素任选取代的C3-6的杂环基；
优选的，所述酮类化合物为
在本发明一种典型的实施方式中，氨基供体为异丙胺或丙氨酸，优选为异丙胺。
应用本发明的转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为7～10.5，优选为8～10，更优选为9～10，也就是说pH的取值可以任选为7～10.5中的值，例如7、7.5、8、8、8.6、9、10、10.5等。转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为25～60℃，更优选为30～55℃，进一步优选为40～50℃，也就是说温度的取值可以任选为25～60℃中的值，例如30、31、32、35、37、38、39、40、42、45、48、50、51、52、55等。转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中二甲基亚砜体积浓度为0％～50％，例如选10％、15％、18％、20％、30％、35％、38％、40％、42％、48％、49％等。
本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。且下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。
下面将结合实施例进一步说明本发明的有益效果。
实施例1
Template及突变体催化酮化合物生成手性胺，在反应条件M的情况下验活，结果可见Template对底物催化活力很差，而Template突变体具有较好的催化活性，并且突变体T291A+G292A+I160G+S204L+V244S+T134I+M326Q+Y144W+G77T+I165L+A292S+S278R+Y69H+T70G+G160T+T106S-12aa转氨酶突变体ee值提高至90％以上。经过本发明的改造后，Template突变体的获得了对空间位阻较大底物的催化活力，部分突变体活力极大提高，而且突变体的立体选择性也大幅度提高，扩大了底物谱。反应式如下，结果如表4所示。
表4
备注：
1)反应条件M：0.3wt酶、PLP 1g/L、DMSO 40％、IPN 10eq、100V、0.2M硼酸pH＝10.5、55℃、16h；
2)N.D.表示未检测到产品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示>90％。
3)N.D.表示0，*表示0～10％，**表示10～50％，***表示50～80％，****表示80～90％，*****表示90～95％，******表示>95％。
实施例2
Template及突变体催化酮化合物生成手性胺，在反应条件N的情况下验活，结果可见Template对底物无催化活力，而Template突变体具有较好的催化活性。经过本发明的改造后，Template突变体扩大了催化底物谱。反应式如下，结果如表5所示。
表5
备注：
反应条件M：1wt酶、PLP 1g/L、DMSO 20％、IPN 10eq、100V、0.2M硼酸pH＝10.5、50℃、16h；
N.D.表示未检测到产品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示90％～95％，++++++表示>95％。
实施例3
Template及突变体催化酮化合物生成手性胺，在反应条件N的情况下验活，结果可见Template对底物无催化活力，而Template突变体具有较好的催化活性。经过本发明的改造后，Template突变体扩大了催化底物谱。反应式如下，结果如表6所示。
表6
备注：
反应条件M：1wt酶、PLP 1g/L、DMSO 20％、IPN 10eq、100V、0.2M硼酸pH＝10.5、50℃、16h；
N.D.表示未检测到产品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示90％～95％，++++++表示>95％。
实施例4
Template及突变体催化酮化合物生成手性胺，在反应条件N的情况下验活，结果可见Template对底物无催化活力，而Template突变体具有较好的催化活性。经过本发明的改造后，Template突变体扩大了催化底物谱。反应式如下，结果如表7所示。
表7
备注：
反应条件M：1wt酶、PLP 1g/L、DMSO 20％、IPN 10eq、100V、0.2M硼酸pH＝10.5、50℃、16h；
2)N.D.表示未检测到产品生成，-表示0～20％，+表示20～40％，++表示40～60％，+++表示60～80％，++++表示80～90％，+++++表示90～100％。
实施例5
Template及突变体催化酮化合物生成手性胺，在反应条件N的情况下验活，结果可见Template对底物无催化活力，而Template突变体具有较好的催化活性。经过本发明的改造后，Template突变体扩大了催化底物谱。反应式如下，结果如表8所示。
表8
备注：
反应条件M：1wt酶、PLP 1g/L、DMSO 20％、IPN 10eq、100V、0.2M硼酸pH＝10.5、50℃、16h；
2)N.D.表示未检测到产品生成，-表示0～10％，+表示10～20％，++表示20～50％，+++表示50～80％，++++表示80～90％，+++++表示>90％。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本发明的突变体扩大了酶的底物谱、提高了酶对大位阻底物的催化能力；同时增强了其稳定性，可在高浓度溶剂和高温度条件下进行催化反应，进而此突变体的应用可以提高反应速率，提高酶稳定性，减少了酶用量，降低了后处理的难度，使得其能够适合工业化生产。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 凯莱英医药集团（天津）股份有限公司
<120> 转氨酶突变体及其应用
<130> PN186950KLY
<150> CN202210426193.1
<151> 2022-04-21
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 350
<212> PRT
<213> Sciscionella sp.
<400> 1
Met Thr Thr Thr Glu Phe Ala Asn Arg Glu Ile His Met Thr Thr Thr
1 5 10 15
Glu Phe Ala Asn Ser Asn Leu Val Ala Val Glu Pro Val Ala Ile Arg
20 25 30
Glu Pro Thr Pro Pro Gly Ser Val Ile Gln Tyr Ser Glu Tyr Glu Leu
35 40 45
Asp Arg Ser His Pro Leu Ala Gly Gly Val Ala Trp Ile Glu Gly Glu
50 55 60
Tyr Val Pro Ala Asp Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Met Gly Phe
65 70 75 80
Tyr Thr Ser Asp Ala Thr Tyr Thr Gly Ile His Val Trp His Gly Asn
85 90 95
Ile Phe Arg Leu Glu Asp His Leu Asp Arg Leu Leu His Gly Ala Ala
100 105 110
Arg Leu Lys Leu Glu Thr Gly Met Ser Arg Glu Glu Leu Ala Gly Ile
115 120 125
Ala Lys Arg Cys Val Ser Leu Ser Gln Leu Arg Glu Ala Met Val Asn
130 135 140
Ile Thr Ile Thr Arg Gly Tyr Gly Ser Thr Pro Tyr Gly Arg Asp Ala
145 150 155 160
Thr Lys His Arg Pro Gln Val Tyr Val Tyr Ala Ile Pro Tyr Gln Trp
165 170 175
Ile Phe Pro Pro Glu Glu Gln Ile Phe Gly Thr Ser Val Ile Val Pro
180 185 190
Arg His Val Arg Arg Ala Gly Leu Asn Thr Ile Asp Pro Thr Ile Lys
195 200 205
Asn Phe Gln Trp Gly Asp Leu Ser Ala Ala Ile Arg Glu Ala His Asp
210 215 220
Arg Gly Ala Arg Ser Ala Val Leu Leu Asp Ala Asp Asn Cys Val Ala
225 230 235 240
Glu Gly Pro Gly Phe Asn Val Val Leu Val Lys Asp Gly Ala Leu Val
245 250 255
Ser Pro Ser Arg Asn Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Tyr
260 265 270
Glu Ile Ala Ala Ala Lys Gly Ile Glu Thr Met Leu Arg Asp Val Thr
275 280 285
Ser Ser Glu Leu Tyr Glu Ala Asp Glu Leu Met Ala Val Ser Thr Gly
290 295 300
Gly Gly Val Thr Pro Ile Thr Ser Leu Asp Gly Glu Gln Val Gly Asn
305 310 315 320
Gly Glu Pro Gly Pro Ile Thr Val Ala Ile Arg Asp Arg Phe Trp Ala
325 330 335
Leu Met Asp Glu Pro Ser Ser Leu Ile Glu Ala Ile Asp Tyr
340 345 350
<210> 2
<211> 1053
<212> DNA
<213> Sciscionella sp.
<400> 2
atgaccacca ccgagtttgc caacagggaa ttccatatga ccaccaccga gtttgccaac 60
agcaatctgg tggccgtgga accggttgca atccgtgagc ctacccctcc gggcagcgtg 120
attcagtaca gcgagtacga actggatcgc agccatccgc tggcaggtgg cgttgcctgg 180
attgaaggcg agtatgttcc tgccgatgaa gcccgtatca gcatcttcga tatgggcttt 240
tataccagcg atgcgaccta taccgggatc cacgtttggc acggcaatat cttccgcctg 300
gaagaccacc tggaccgcct gctgcatggt gccgcacgtc tgaaactgga aaccggtatg 360
agccgcgaag aactggccgg cattgccaag cgttgtgtta gcctgagcca gctgcgcgaa 420
gccatggtga acatcaccat tacccgcggc tatggcagca ccccctacgg aagggatgcg 480
accaaacata ggccccaggt gtacgtgtat gccatcccgt atcagtggat cttccctccg 540
gaggaacaga ttttcggcac cagcgtgatt gtgccgcgtc atgtgcgccg cgccggtctc 600
aataccatcg acccgaccat caagaacttt cagtggggtg acctgtccgc cgccatccgt 660
gaggcccatg atcgcggcgc acgtagcgca gttctgctgg atgccgataa ttgcgtggcc 720
gagggtccgg gctttaatgt ggttctggtg aaggacggcg cactggtgag tccgagtcgt 780
aacgcactgc cgggcatcac ccgcaaaacc gtgtacgaaa tcgcagcagc caaaggcatc 840
gaaaccatgc tgcgcgacgt gaccagcagt gaactgtatg aggcagatga gctgatggcc 900
gtgagcaccg gaggtggtgt gacccctatt accagcctgg atggcgagca ggttggcaac 960
ggtgagccgg gcccgattac cgtggccatt cgtgatcgct tttgggcact gatggatgag 1020
ccgagcagcc tgattgaggc cattgactat taa 1053
Claims (10)
1.一种转氨酶突变体，其特征在于，所述转氨酶突变体是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生突变得到，所述突变至少包括：G292A；或者所述转氨酶突变体的氨基酸序列具有所述发生突变的氨基酸序列中的所述突变位点，且与所述发生突变的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，优选具有85％的同源性，更优选具有90％的同源性，进一步优选具有95％的同源性，再优选具有99％的同源性。
2.一种DNA分子，其特征在于，所述DNA分子编码权利要求1所述的转氨酶突变体。
3.一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒含有权利要求2所述的DNA分子。
4.根据权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒为pET-22a(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-8、pUC-18或pUC-19。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3或4所述的重组质粒。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括原核细胞或真核细胞；优选所述原核细胞为大肠杆菌BL21-DE3细胞或大肠杆菌Rosetta-DE3细胞；所述真核细胞为酵母。
7.一种生产手性胺的方法，包括转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的步骤，其特征在于，所述转氨酶为权利要求1所述的转氨酶突变体。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述酮类化合物为
其中，R1为H、未被取代或被卤素任选取代的C1～C10烷基、未被取代或被卤素任选取代C5～C10环烷基、未被取代或被卤素任选取代的C5～C10芳基或C5～C10杂芳基，R2为H、卤素、未被取代或被卤素、NH3或带Boc、Cbz保护的NH3中至少一个基团所任选取代C1～C10烷基，R3为未被取代或被卤素任选取代的C6-12的芳基、未被取代或被卤素任选取代的C3-6的杂环基；
优选的，所述酮类化合物为
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述氨基供体为异丙胺或丙氨酸，优选为异丙胺。
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，在转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中，pH为7～11，优选为8～10.5，更优选为10.5；
优选的，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系的温度为25～60℃，进一步优选为30～55℃，更优选为50℃；
优选的，转氨酶对酮类化合物及氨基供体进行催化转氨基反应的反应体系中二甲基亚砜体积浓度为0％～50％。
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