CN114277010A

CN114277010A - 转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用

Info

Publication number: CN114277010A
Application number: CN202111599938.6A
Authority: CN
Inventors: 郑晨抗; 李�杰; 丁一巍; 张波琨; 叶家捷; 孙丰来; 朱景仰
Original assignee: Shanghai SynTheAll Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai STA Pharmaceutical R&D Ltd
Current assignee: Shanghai SynTheAll Pharmaceutical Co Ltd; Shanghai STA Pharmaceutical R&D Ltd
Priority date: 2021-12-24
Filing date: 2021-12-24
Publication date: 2022-04-05

Abstract

本发明公开了转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用。本发明的转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有第65位、第318位、第399位、第419位、第426位、第465位和第466位突变中的一种或多种，所述突变为氨基酸残基的增加、缺失或取代。本发明还公开了编码所述转氨酶的核酸分子、包含所述核酸分子的核酸构建体、重组载体和宿主细胞。本发明还公开了一种酶制剂，所述酶制剂含有本发明所述转氨酶。本发明还公开了使用所述转氨酶制备手性胺的方法。在工业化制备光学纯手性胺的生产过程中，本发明提供的酶具有底物特异性、对映体选择性和转化率高等优点。本发明提供的光学纯手性胺的制备方法具有高的反应效率、立体选择性以及收率。

Description

转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用

技术领域

本发明属于生化领域，涉及转氨酶及其应用，尤其是在生物催化制备光学纯手性胺的应用。

背景技术

光学纯手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体。目前，超过70％的药物及其衍生物的合成都是以手性胺作为中间体。下式II所示的为(S)4-溴-α-甲基苄胺即为一种非常重要的手性胺，应用于很多医药中间体的合成。

目前，制备(S)4-溴-α-甲基苄胺的方法主要有化学法和生物催化法。化学法的常规流程如下所示，通常以对溴苯乙酮为原料，在甲酸胺的催化作用下生成(S)4-溴-α-甲基苄胺。其中，在NH₃/甲醇(15-25％)中加入5-10当量的甲酸胺，温度为60-85℃时，(S)4-溴-α-甲基苄胺对映体选择性最佳，但从经济和环保角度出发不适合工业化大规模生产(Kadyrov R,Riermeier T H.Angew.Chem.Int.Ed.2003,42.)。

生物酶催化法通常利用转氨酶，通过动力学拆分消旋胺，或者通过酮的不对称合成生成手性胺。与传统的化学合成方法相比，酶法具有反应效率高、立体选择性好、反应条件温和、低能耗、环境友好等优点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是现有技术中的酶对未应用于工业的底物存在底物特异性低、对映体选择性差和/或转化率低等问题，从而提供一种能以高的反应效率、立体选择性以及收率来制备光学纯手性胺的试剂和方法。

为解决上述技术问题，本发明第一方面提供一种转氨酶，所述转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有第65位、第318位、第399位、第419位、第426位、第465位和第466位突变中的一种或多种，所述突变为氨基酸残基的增加、缺失或取代，其余位置上的氨基酸残基与SEQ ID NO:1相同。

在一个或多个实施方案中，所述突变选自下述组：第65位、第318位、第399位、第419位和第426位的取代突变和第465位和/或第466位的缺失突变，优选所述突变选自下述组：W65F、E318T、E399Y、R419V和I426V。

在本发明的优选实施方案中，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或如SEQID NO:3所示。

为解决上述技术问题，本发明第二方面提供一种核酸分子，其多核苷酸序列选自：

(1)编码本发明任一实施方案所述的转氨酶的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。

在本发明的优选实施方案中，所述多核苷酸序列如SEQ ID NO:6或如SEQ ID NO:7所示的多核苷酸序列或其互补序列。

为解决上述技术问题，本发明第三方面提供一种核酸构建体，其含有本发明任一实施方案所述的核酸分子；优选地，所述核酸构建体为表达盒。

为解决上述技术问题，本发明第四方面提供一种重组载体，其含有本发明任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建体；优选地，所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。

为解决上述技术问题，本发明第五方面提供一种宿主细胞，其含有本发明任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建体或重组载体，和/或，其表达本发明任一实施方案所述的转氨酶；所述宿主细胞为本领域常规，优选地，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。

为解决上述技术问题，本发明第六方面提供一种酶制剂，所述酶制剂含有本发明任一实施方案所述的转氨酶。

为解决上述技术问题，本发明第七方面提供下式I所示的手性胺的制备方法：

其中，所述方法包括，在助溶剂和任选的辅酶的存在下，使用来自鲁杰氏菌属(Ruegeria arenilitoris sp)的转氨酶或与其氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的转氨酶或本文任一实施方案所述的转氨酶突变体或其酶制剂催化氨基供体与下式III所示的底物反应，从而制备得到式I所示的手性胺：

其中，式I和III中，R₁为卤代芳烃，R₂为C_1-4烷基；

可供反应的底物包括对溴苯乙酮、对氯苯乙酮、对氰基苯乙酮、对乙酰基安息香甲酯、间氟苯乙酮等。

在本发明的优选实施方案中，式I化合物为(S)4-溴-α-甲基苄胺，式III化合物为对溴苯乙酮。

在一个或多个实施方案中，所述鲁杰氏菌属(Ruegeria arenilitoris sp)的转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的转氨酶为NCBI登陆号为3HMU_A或WP_011049154.1的转氨酶。

在一个或多个实施方案中，所述助溶剂可为本领域常规，所述助溶剂选自：二甲亚砜、醇类溶剂和甲苯。所述醇类溶剂可为异丙醇。

在一个或多个实施方案中，所述氨基供体可为本领域常规，所述氨基供体选自：芳香胺、脂肪胺和氨基酸。所述芳香胺可为苯乙胺。所述氨基酸可为丙氨酸和/或天冬氨酸。

在本发明的优选实施方案中，所述脂肪胺为碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺，优选为异丙胺。

在一个或多个实施方案中，转氨酶的用量是反应体系中底物重量的1-50％，如10-40％或15-30％。

在一个或多个实施方案中，反应体系中含有辅酶，辅酶的用量为底物重量的0.1-5.0％，优选1-3％；优选的辅酶为5-磷酸吡哆醛(PLP)。本领域技术人员已知，磷酸吡哆醛是转胺反应的通用辅酶，在转胺反应里，PLP和PMP(磷酸吡哆胺)相互转化，均可作为本发明的辅酶。

在一个或多个实施方案中，反应体系中，氨基供体的用量为底物重量的200％-500％，如300％。

在一个或多个实施方案中，反应体系pH 6-10，优选为7-9，更优选为8-9，最优选为8.1-8.3。

在一个或多个实施方案中，反应温度为10-50℃，优选为20-45℃，更优选为40℃。

在一个或多个实施方案中，反应时间为0.1-120小时，例如0.5-72小时或10-42小时。

在一个或多个实施方案中，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜；氨基供体为脂肪胺，优选为异丙胺；转氨酶为来自鲁杰氏菌属(Ruegeria arenilitoris sp)的转氨酶，优选为本文任一实施方案所述的转氨酶；式I化合物为(S)4-溴-α-甲基苄胺；式III化合物为对溴苯乙酮。

在一个或多个实施方案中，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜；氨基供体为异丙胺；转氨酶为氨基酸序列如SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的转氨酶；式I化合物为(S)4-溴-α-甲基苄胺；式III化合物为对溴苯乙酮。

本发明还提供来自鲁杰氏菌属(Ruegeria arenilitoris sp)的转氨酶或其酶制剂和/或本文任一实施方案所述的转氨酶或含其的酶制剂在提高制备光学纯手性胺的转化率中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：在工业化制备光学纯手性胺的生产过程中，本发明提供的酶具有底物特异性、对映体选择性和转化率高等优点。此外，本发明提供的酶能够耐受更苛刻的条件，例如更高的反应温度或反应pH值。本发明提供的光学纯手性胺的制备方法具有高的反应效率、立体选择性以及收率。

附图说明

图1是实施例1的方法转化后的(S)4-溴-α-甲基苄胺的高效液相色谱法图谱。t＝5.575处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

图2是实施例2的方法转化后的(S)4-溴-α-甲基苄胺的超临界液相色谱法图谱。t＝1.081处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

图3是实施例3的方法转化后的(S)4-溴-α-甲基苄胺的高效液相色谱法图谱。t＝5.502处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

图4是实施例4的方法转化后的(S)4-溴-α-甲基苄胺的超临界液相色谱法图谱。t＝1.071处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

图5是实施例5的方法转化后的(S)4-溴-α-甲基苄胺的高效液相色谱法图谱。t＝5.148处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

图6是实施例6的方法转化后的(S)4-溴-α-甲基苄胺的高效液相色谱法图谱。t＝4.67处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

图7是实施例7的方法转化后的(S)4-溴-α-甲基苄胺的高效液相色谱法图谱。t＝4.67处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

图8是实施例8的方法转化后的(S)4-溴-α-甲基苄胺的超临界液相色谱法图谱。t＝1.069处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

具体实施方式

应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

本发明发现，利用本发明所述的转氨酶可以以非常高的转化率和手性纯度制备得到具有下式I所示的手性胺：

式中，R₁为卤代芳烃，R₂为C_1-4烷基。

本文中，卤代芳烃指被卤素取代的芳烃，其中，卤素可包括F、Cl、Br和I。本文中，C_1-4烷基包括直链和支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基等。卤代芳烃的例子包括但不限于侧链卤代芳烃或芳环卤代芳烃。

在特别优选的实施方案中，本发明所述的手性胺为下式II所示的(S)4-溴-α-甲基苄胺：

本发明中，转氨酶优选为来自鲁杰氏菌属(Ruegeria arenilitoris sp)的转氨酶。示例性的来自鲁杰氏菌属的转氨酶包括具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的转氨酶。本发明的转氨酶还包括SEQ ID NO:1的突变体，如其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％，更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列相同性的转氨酶。所述序列相同性可采用本领域常用的软件如BLAST(来自NCBI)以软件默认参数计算得到。

在一些实施方案中，本发明转氨酶的突变体为对SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸突变所得的保留了SEQ ID NO:1所具备的转氨酶活性(尤其是具备本文所述的制备手性胺的功能)的由SEQ ID NO:1衍生得到的突变体。所述一个或多个氨基酸突变包括20个以内、优选15个以内、更优选10个以内、更优选8个以内、更优选5个以内、更优选3个以内的氨基酸突变，如氨基酸残基的取代、插入或缺失。优选的突变是取代突变或缺失突变。

本发明中，示例性的转氨酶突变体包括但不限于登陆号为3HMU_A或WP_011049154.1的转氨酶。

在一些实施方案中，本发明特别优选的转氨酶突变体包括在SEQ ID NO:1的第65位、第318位、第399位、第419位、第426位、第465位和第466位中的一个或多个关键位置上发生了突变所得到的突变体。优选的突变是取代突变或缺失突变。在一些实施方案中，取代是保守性取代。在一些实施方案中，第65位上的取代为野生型的W被取代为非极性氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，或者被取代为芳香族氨基酸，如酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸；优选被取代为苯丙氨酸。在一些实施方案中，第318位的取代为野生型的E被取代为极性不带电荷的氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，优选被取代为天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸或苏氨酸，更优选被取代为苏氨酸。在一些实施方案中，第399位的取代为野生型的E被取代为极性不带电荷的氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，或者被取代为芳香族氨基酸，如酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸；优选被取代为酪氨酸。在一些实施方案中，第419位上的取代为野生型的R被取代为非极性氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸，或者被取代为脂肪族非极性氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；优选被取代为缬氨酸。在一些实施方案中，第426位上的取代为野生型的I被取代为非极性氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸，或者被取代为脂肪族非极性氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；优选被取代为缬氨酸。

在优选的实施方案中，所述突变选自以下组：W65F、E318T、E399Y、R419V和I426V。

在进一步优选的实施方案中，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或如SEQ ID NO:3所示。

本发明也包括核酸分子，其多核苷酸序列为本发明所述转氨酶突变体的编码序列或其互补序列。在一些实施方案中，所述核酸分子的多核苷酸序列如如SEQ ID NO:6或如SEQ ID NO:7所示。

本发明还包括核酸构建体，其含有本发明所述的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸构建体为表达盒。表达盒内除所述核酸分子外，还可含有转录终止序列和启动子。启动子可以是本领域周知的各种启动子，只要其适于在期望的宿主中表达本发明的转氨酶即可。本领域技术人员可根据所用的宿主细胞选择适当的启动子，构建本发明的表达盒以及下文所述的重组载体。

本发明还包括重组载体。该重组载体可含有本文任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建体。该重组载体可以是重组克隆载体或重组真核表达载体。重组载体中可含有其它调节元件，包括但不限于增强子、多克隆位点、转录终止子、抗性基因等。可根据不同目的选择具有所需调节元件的相应的载体骨架，将本发明的核酸分子或核酸构建体克隆入所述骨架中，从而构建得到本发明的重组载体。

可采用本领域周知的方法制备核酸分子、构建核酸构建体和重组载体，并采用常规的方法表达，从而制备得到本文所述的转氨酶。

在一些实施方案中，本发明还提供宿主细胞，其含有本文任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建体和/或重组载体，或其表达本文任一实施方案所述的转氨酶。本领域已知的任何适用于表达目标蛋白的宿主均可用于本发明，示例性的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。

本发明制备手性胺的方法包括含辅酶和氨基供体的反应体系中使用本发明的转氨酶将下式III所示的底物中的羰基还原为手性氨基的步骤：

式中，R₁和R₂如前文所述。

转氨酶的用量可以是反应体系中底物重量的1-50％，如10-40％或15-30％。

辅酶可以是本领域常规与转氨酶结合使用的各类辅酶，如5-磷酸吡哆醛(PLP)。辅酶的用量可以是常规用量，例如，可以是反应体系中底物重量的0.1-5.0％，优选1-3％。

反应体系中的氨基供体可以是本领域常用用来制备手性胺的各类氨基供体，包括但不限于芳香胺，如苯乙胺，脂肪胺，如碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺，如异丙胺，氨基酸，如丙氨酸(如L-丙氨酸)和天冬氨酸(如L-天冬氨酸)等。通常，反应体系中，氨基供体的用量可根据常规的反应容易确定。通常，根据氨基供体种类的不同，氨基供体的用量可为底物重量的200％-500％，如300％。

本发明中，反应体系为缓冲盐水溶液体系。通过缓冲液来对反应体系的pH进行控制。常用的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、三乙醇胺-异丙胺缓冲液等。优选地，反应体系pH 6-10，优选为7-9，更优选为8-9。在一些实施方式中，反应体系的pH为8.1-8.3。

反应体系中还可含有助溶剂。手性胺制备中常用的助溶剂都可用于本发明。通常，助溶剂为有机溶剂，例如，选自：二甲亚砜、甲苯和醇类溶剂。所述醇类溶剂包括但不限于异丙醇。较佳地，所述助溶剂选自二甲亚砜和异丙醇。所使用的助溶剂应当与水可混溶，以进一步增加底物的溶解性。

本发明的催化反应的反应温度可为10-50℃，优选为20-45℃，更优选为40℃。在一些实施方案中，反应温度为室温，即25±3℃。反应时间可视反应物的量确定，通常可为0.1-120小时，例如0.5-72小时或10-42小时。

本发明发现，当选用特定的助溶剂和氨基供体时，使用来自鲁杰氏菌属(Ruegeriaarenilitoris sp)的转氨酶(尤其是SEQ ID NO:1所示的转氨酶)催化底物的羰基还原反应为氨基时，相较于使用其它助溶剂和氨基供体，也能取得显著较高转化率。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明制备所述式I所示的手性胺的方法包括，在助溶剂的存在下使用SEQ ID NO:1所示的转氨酶催化氨基供体与对溴苯乙酮之间的反应；其中，所述助溶剂为醇类溶剂，优选为异丙醇；所述氨基供体为脂肪胺，如碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺，更优选为异丙胺。在一些实施方案中，所述氨基供体为芳香胺，如苯乙胺(如R-苯乙胺)，所述溶剂为二甲亚砜。在优选的实施方案中，本发明制备所述式I所示的手性胺的方法包括，在二甲亚砜的存在下使用SEQ ID NO:1所示的转氨酶催化异丙胺与式III所示底物之间的反应。优选地，所述反应的反应体系中还含有辅酶，如磷酸吡哆醛。优选地，所述手性胺为(S)4-溴-α-甲基苄胺，所述底物为对溴苯乙酮。

本发明还发现，当使用本发明的转氨酶突变体，尤其是本文所述的在SEQ ID NO:1的第65位、第318位、第399位、第419位、第426位、第465位和第466位中的一个或多个关键位置上发生了突变所得到的突变体制备式I的手性胺时，对底物的识别能力更高。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明制备所述式I所示的手性胺的方法包括，在助溶剂的存在下使用本文任一实施方案所述的转氨酶突变体催化氨基供体与底物之间的反应。优选的助溶剂为二甲亚砜，优选的氨基供体为脂肪胺，如异丙胺。优选地，所述反应的反应体系中还含有辅酶，如磷酸吡哆醛。在特别优选的实施方案中，所述转氨酶突变体为氨基酸序列如SEQID NO:2或如SEQ ID NO:3所示的转氨酶。优选地，手性胺为(S)4-溴-α-甲基苄胺，所述底物为对溴苯乙酮。

本发明也包括前文所述的转氨酶突变体、其编码序列(核酸分子)、核酸构建体、重组载体以及宿主细胞。

在一些实施方案中，本发明提供一种酶制品，其含有本发明任一实施方案所述的转氨酶突变体。在一些实施方案中，所述酶制品为冻干粉末。在一些实施方案中，所述酶制品为含有所述转氨酶突变体的缓冲液。优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，pH为6-10，优选为7-9，更优选为8-9，更优选为8.1-8.3。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。

本发明还提供前文任一实施方案所述的转氨酶突变体、其编码序列(核酸分子)、核酸构建体、重组载体以及宿主细胞在制备用于制备所述式I所示的手性胺的试剂中的应用。在一些实施方案中，所述试剂为本文任一实施方案所述的酶制品。

下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

制备例

用SEQ ID NO:1(编码序列如SEQ ID NO:5所示)的序列为母本，采用滚轮PCR，迭代饱和突变，和/或组合突变等策略对其进行定向进化改造，然后将突变体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布在带有50μg/ml的卡那霉素的LB琼脂平板上，放置在37℃培养箱中静止培养18小时。将转化的平板上的突变体用牙签挑选到96孔板中，于37℃、220rpm摇床中培养过夜。从一级板的孔洞中吸取50微升菌液接入二级版的相应孔洞中，于37℃、220rpm培养2-3h后，加入终浓度为0.2mM IPTG，30℃培养20小时得到相应的突变体进行高通量筛选。结合HPLC和SFC检测复筛，鉴别获活性和稳性的显著提高的突变体进行基因测序。测序结果如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示，其编码序列如SEQ IDNO:6、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明。实施例中所用到的方法、材料和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法，以及可从市售途径获得的材料和试剂。

在本发明的实施例中共使用了两种检测方法：HPLC和SFC。

其中，HPLC检测更适用于生产应用，分析时间较长，可检测各种副产物、杂质等，能够最终确认酶的转化率。

SFC检测更适用于酶筛选，分析时间较短，快速反映出反应的转化率和手性，用于对比酶的选择性以及酶活，在运用于突变体酶的酶活对比方面优势明显。本发明所用HPLC参数和SFC参数如下：

HPLC参数：

仪器：岛津LC-20A

色谱柱：Xbridge C18

流动相：包含0.05％TFA(三氟乙酸)in H₂O:0.05％TFA(三氟乙酸)in ACN 85:15

流速：1mL/min

波长：230nm

SFC参数：

缓冲液配制：

I80X缓冲液：称取27.8g三水合磷酸氢二钾以及10.6g磷酸二氢钾倒入2L玻璃瓶中。量取纯化水1.3L置于瓶中，室温搅拌，直至固体溶解。量取异丙胺171mL置于瓶中，保持温度在20-30℃，加入35％HCl，调节pH＝8.0。加入纯化水定容至2L。

I95X缓冲液：称取27.8g三水合磷酸氢二钾以及10.6g磷酸二氢钾倒入2L玻璃瓶中。量取纯化水1.3L置于瓶中，室温搅拌，直至固体溶解。量取异丙胺176mL置于瓶中，保持温度在20-30℃，加入35％HCl，调节pH＝9.5。加入纯化水定容至2L。

I80X缓冲液与I95X缓冲液的差异在于pH的不同，用更高的pH，是为了给反应增加环境压力，评估筛选出的酶能否耐住更高的pH，在此基础上可以进一步进化，便于在更苛刻的条件下可以筛出转化率更高的点。

实施例1

配制反应缓冲液：量取纯化水350mL置于1000mL夹套瓶中，加入2.78g三水合磷酸氢二钾以及1.06g磷酸二氢钾，搅拌至完全溶解。量取异丙胺135mL加入瓶中，再加入52mL85％磷酸，pH控制在8.1-8.3，保持温度在20-30℃，搅拌至固体完全溶解。

向瓶中加入0.25g磷酸吡哆醛(PLP)，并缓慢加入4.0g转氨酶(氨基酸序列如SEQID NO:1所示)冻干粉。将80mL二甲亚砜(DMSO)与20g的对溴苯乙酮混合，直至溶液澄清，将溶液加入到瓶中。在40℃反应48小时后，加入1g酶和25mg磷酸吡哆醛(PLP)(10mL反应缓冲液溶解)，之后每间隔12小时加一次(共计加2次)。

反应72小时后，经HPLC检测，转化率为91.9％。如图1和表1显示，t＝5.575处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

表1

Chl 230nm 4nm

峰	组分名	保留时间	峰面积	峰面积％	峰高	分辨率	拖尾因子	理论塔板数
									1	SM1	5.575	5802358	91.921	557269	0.0	1.8	44241.520
2	SM0	7.838	509942	8.079	127357	11.4	1.4	432677.097
									合计			6312300	100.000	684626

实施例2

在8mL反应瓶中加入5.9mL I80X缓冲液，再加入10mg转氨酶(氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示)冻干粉和2.4mg磷酸吡哆醛(PLP)，搅拌充分后，加入120mg的对溴苯乙酮与360μL二甲亚砜(DMSO)，控制反应在温度为45℃，1000rpm摇床震荡18小时，使其充分反应。

待反应结束后，经SFC检测，转化率为55％，ee值＞99％。如图2和表2显示，t＝1.081处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

表2

	峰名	保留时间(RT)	峰面积	％峰面积	峰高
						1	SM	0.934	114935	44.13	99059
2	Product	1.081	145504	55.87	38417

实施例3

配制反应缓冲液：量取720mL纯化水加入到2000mL的夹套瓶中，加入6.95g三水合磷酸氢二钾和2.65g磷酸二氢钾，搅拌至固体完全溶解。加入214mL异丙胺和89mL 85％磷酸，pH控制在8.1-8.3，保持温度在20-25℃。

向瓶中加入1.0g磷酸吡哆醛(PLP)，并向瓶中缓慢加入5.0g转氨酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)冻干粉，温度控制在20-25℃，搅拌直至固体溶解。将50g的对溴苯乙酮溶于150mL二甲亚砜(DMSO)，用时4个小时将溶液缓慢滴加到瓶中。温度保持在40℃，氮气流搅拌38小时。

反应38小时后，经HPLC检测，转化率为92.1％。如图3和表3显示，t＝5.502处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

表3

Chl 230nm 4nm

峰	保留时间	峰面积	峰面积％	峰高	分辨率	拖尾因子
							1	5.502	13246564	92.051	800601	0.00	1.94
2	7.858	1143931	7.949	318129	9.29	1.34
							合计		14390495	100.000	1118730

实施例4

在8mL反应瓶中加入2mL I95X缓冲液，再加入0.6mg转氨酶(氨基酸序列如SEQ IDNO:3所示)冻干粉和0.92mg磷酸吡哆醛(PLP)，搅拌充分后，加入46mg的对溴苯乙酮与138μL二甲亚砜(DMSO)，控制反应在温度为50℃，1000rpm摇床震荡20小时，使其充分反应。

待反应结束后，经SFC检测，转化率为66.4％，ee值＞99％。如图4和表4显示，t＝1.071处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

表4

	峰名	保留时间(RT)	峰面积	％峰面积	峰高
						1	SM	0.946	166203	33.6222	150183
2	Product	1.071	328121	66.3778	72787

实施例5

配制反应缓冲液：量取750mL纯化水加入到2000mL的夹套瓶中，加入344mL异丙胺和135mL 85％磷酸，pH控制在9.4-9.6，温度控制在44-46℃。

向瓶中加入0.1g磷酸吡哆醛(PLP)，并向瓶中缓慢加入1.0g转氨酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)冻干粉，温度控制在20-25℃，搅拌直至固体溶解。将50g的对溴苯乙酮溶于150mL二甲亚砜(DMSO)，升温至37-45℃，将对溴苯乙酮与二甲亚砜(DMSO)混合溶液缓慢滴加到瓶中。温度保持在45℃，氮气流搅拌42小时。

反应42小时后，经HPLC检测，转化率为82％。如图5和表5显示，t＝5.148处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

表5

Chl 230nm 4nm

峰	保留时间	峰面积	峰面积％	峰高	分辨率	拖尾因子
							1	5.148	4965030	82.857	970514	0.00	1.57
2	6.986	1027276	17.143	249514	13.40	1.42
							合计		5992306	100.000	1220028

实施例6

配制反应缓冲液：量取15mL纯化水加入到40mL的玻璃瓶中，加入6.85mL异丙胺和2.5mL 85％磷酸，pH控制在9.4-9.6，温度控制在44-46℃。

向瓶中加入0.02g磷酸吡哆醛(PLP)，并向瓶中缓慢加入200mg转氨酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)冻干粉，温度控制在20-25℃，搅拌直至固体溶解。将1.0g的对溴苯乙酮溶于3mL二甲亚砜(DMSO)，升温至37-45℃，将对溴苯乙酮与二甲亚砜(DMSO)混合溶液缓慢滴加到瓶中。温度保持在45℃，搅拌2小时。

反应2小时，经HPLC检测，转化率为50.49％，如图6和表6显示，t＝4.67处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

表6

Chl 230nm 4nm

峰	保留时间	峰面积	峰面积％	峰高	分辨率	拖尾因子
							1	4.675	1611150	50.490	404958	0.00	1.61
2	6.990	1579902	49.510	512078	21.58	1.40
							合计		3191052	100.000	917036

实施例7

向瓶中加入0.02g磷酸吡哆醛(PLP)，并向瓶中缓慢加入200mg转氨酶(氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示)冻干粉，温度控制在20-25℃，搅拌直至固体溶解。将1.0g的对溴苯乙酮溶于3mL二甲亚砜(DMSO)，升温至37-45℃，将对溴苯乙酮与二甲亚砜(DMSO)混合溶液缓慢滴加到瓶中。温度保持在45℃，搅拌2小时。

反应2小时后，经HPLC检测，转化率为61.92％，如图7和表7显示，t＝4.67处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

表7

Chl 230nm 4nm

峰	保留时间	峰面积	峰面积％	峰高	分辨率	拖尾因子
							1	4.671	1968553	61.919	462957	0.00	1.66
2	7.000	1210709	38.081	396606	21.09	1.40
							合计		3179262	100.000	859563

实施例8

在8mL反应瓶中加入2mL I95X缓冲液，再加入0.6mg转氨酶(氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示)冻干粉和0.92mg磷酸吡哆醛(PLP)，搅拌充分后，加入46mg的对溴苯乙酮与138μL二甲亚砜(DMSO)，控制反应在温度为50℃，1000rpm摇床震荡20小时，使其充分反应。

待反应结束后，经SFC检测，转化率为5.30％，ee值＞99％。如图8和表8显示，t＝1.069处峰为目标化合物(S)4-溴-α-甲基苄胺。

表8

	峰名	保留时间(RT)	峰面积	％峰面积	峰高
						1	SM	0.960	353633	94.70	328035
2	Product	1.069	19790	5.30	4593

实施例结果分析：

以上实施例中，实施例1、3、5的实验条件是可供大批量生产成本最低的反应条件，可作为放大生产实验小试的模拟数据。比对这三个实施例，最为突出的差异是酶用量的不同(在该化合物生产中，酶占大部分的成本)。

计算这三个实施例中单位酶量的转化量，序列为SEQ ID NO:1的酶粉1g可以生产3.06g产品，序列为SEQ ID NO:2的酶粉1g可以生产9.1g产品，序列为SEQ ID NO:3的酶粉1g可以生产41g产品。以上数据充分证明序列为SEQ ID NO:3的酶对底物的识别能力和转化能力远远优于序列为SEQ ID NO:1和序列为SEQ ID NO:2的酶。

实施例6和实施例7更直观地表现序列为SEQ ID NO:2和序列为SEQ ID NO:3二者的区别，即在相同的反应条件下，序列为SEQ ID NO:3的酶的转化率高于序列为SEQ ID NO:2的酶的转化率。

实施例2、4和8是酶筛选时使用的反应条件，通过比对实施例2和实施例4，可以看出序列为SEQ ID NO:3的酶转化率高于序列为SEQ ID NO:2的酶的转化率，并且序列为SEQID NO:3的酶相比于序列为SEQ ID NO:2的酶能够耐受更高的反应温度和反应pH值，即序列为SEQ ID NO:3的酶能够耐受更苛刻的条件。

综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海合全药物研发有限公司

上海合全药业股份有限公司

<120> 转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用

<130> P21018747C

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 野生型转氨酶

<400> 1

Met Ser Leu Ala Thr Ile Thr Asn His Met Pro Thr Ala Glu Leu Gln

1 5 10 15

Ala Leu Asp Ala Ala His His Leu His Pro Phe Ser Ala Asn Asn Ala

20 25 30

Leu Gly Glu Glu Gly Thr Arg Val Ile Thr Arg Ala Arg Gly Val Trp

35 40 45

Leu Asn Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu

50 55 60

Trp Cys Val Asn Ile Gly Tyr Gly Arg Asp Glu Leu Ala Glu Val Ala

65 70 75 80

Ala Arg Gln Met Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Ala Ile Ala Leu Ala Gln Lys Leu Ala Glu Leu Ala

100 105 110

Pro Gly Asp Leu Asn His Val Phe Phe Ala Gly Gly Gly Ser Glu Ala

115 120 125

Asn Asp Thr Asn Ile Arg Met Val Arg Thr Tyr Trp Gln Asn Lys Gly

130 135 140

Gln Pro Glu Lys Thr Val Ile Ile Ser Arg Lys Asn Ala Tyr His Gly

145 150 155 160

Ser Thr Val Ala Ser Ser Ala Leu Gly Gly Met Ala Gly Met His Ala

165 170 175

Gln Ser Gly Leu Ile Pro Asp Val His His Ile Asn Gln Pro Asn Trp

180 185 190

Trp Ala Glu Gly Gly Asp Met Asp Pro Glu Glu Phe Gly Leu Ala Arg

195 200 205

Ala Arg Glu Leu Glu Glu Ala Ile Leu Glu Leu Gly Glu Asn Arg Val

210 215 220

Ala Ala Phe Ile Ala Glu Pro Val Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val

225 230 235 240

Ala Pro Asp Ser Tyr Trp Pro Glu Ile Gln Arg Ile Cys Asp Lys Tyr

245 250 255

Asp Ile Leu Leu Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr

260 265 270

Gly Asn Trp Phe Gly Thr Gln Thr Met Gly Ile Arg Pro His Ile Met

275 280 285

Thr Ile Ala Lys Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Ala Pro Ile Gly Gly Ser

290 295 300

Ile Val Cys Asp Glu Val Ala His Val Ile Gly Lys Asp Glu Phe Asn

305 310 315 320

His Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu

325 330 335

Glu Asn Leu Arg Ile Leu Glu Glu Glu Asn Ile Leu Asp His Val Arg

340 345 350

Asn Val Ala Ala Pro Tyr Leu Lys Glu Lys Trp Glu Ala Leu Thr Asp

355 360 365

His Pro Leu Val Gly Glu Ala Lys Ile Val Gly Met Met Ala Ser Ile

370 375 380

Ala Leu Thr Pro Asn Lys Ala Ser Arg Ala Lys Phe Ala Ser Glu Pro

385 390 395 400

Gly Thr Ile Gly Tyr Ile Cys Arg Glu Arg Cys Phe Ala Asn Asn Leu

405 410 415

Ile Met Arg His Val Gly Asp Arg Met Ile Ile Ser Pro Pro Leu Val

420 425 430

Ile Thr Pro Ala Glu Ile Asp Glu Met Phe Val Arg Ile Arg Lys Ser

435 440 445

Leu Asp Glu Ala Gln Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly Leu Met Lys Ser

450 455 460

Glu Gly

465

<210> 2

<211> 466

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 转氨酶突变体

<400> 2

Met Ser Leu Ala Thr Ile Thr Asn His Met Pro Thr Ala Glu Leu Gln

1 5 10 15

Ala Leu Asp Ala Ala His His Leu His Pro Phe Ser Ala Asn Asn Ala

20 25 30

Leu Gly Glu Glu Gly Thr Arg Val Ile Thr Arg Ala Arg Gly Val Trp

35 40 45

Leu Asn Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu

50 55 60

Phe Cys Val Asn Ile Gly Tyr Gly Arg Asp Glu Leu Ala Glu Val Ala

65 70 75 80

Ala Arg Gln Met Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Ala Ile Ala Leu Ala Gln Lys Leu Ala Glu Leu Ala

100 105 110

Pro Gly Asp Leu Asn His Val Phe Phe Ala Gly Gly Gly Ser Glu Ala

115 120 125

Asn Asp Thr Asn Ile Arg Met Val Arg Thr Tyr Trp Gln Asn Lys Gly

130 135 140

Gln Pro Glu Lys Thr Val Ile Ile Ser Arg Lys Asn Ala Tyr His Gly

145 150 155 160

Ser Thr Val Ala Ser Ser Ala Leu Gly Gly Met Ala Gly Met His Ala

165 170 175

Gln Ser Gly Leu Ile Pro Asp Val His His Ile Asn Gln Pro Asn Trp

180 185 190

Trp Ala Glu Gly Gly Asp Met Asp Pro Glu Glu Phe Gly Leu Ala Arg

195 200 205

Ala Arg Glu Leu Glu Glu Ala Ile Leu Glu Leu Gly Glu Asn Arg Val

210 215 220

Ala Ala Phe Ile Ala Glu Pro Val Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val

225 230 235 240

Ala Pro Asp Ser Tyr Trp Pro Glu Ile Gln Arg Ile Cys Asp Lys Tyr

245 250 255

Asp Ile Leu Leu Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr

260 265 270

Gly Asn Trp Phe Gly Thr Gln Thr Met Gly Ile Arg Pro His Ile Met

275 280 285

Thr Ile Ala Lys Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Ala Pro Ile Gly Gly Ser

290 295 300

Ile Val Cys Asp Glu Val Ala His Val Ile Gly Lys Asp Glu Phe Asn

305 310 315 320

His Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu

325 330 335

Glu Asn Leu Arg Ile Leu Glu Glu Glu Asn Ile Leu Asp His Val Arg

340 345 350

Asn Val Ala Ala Pro Tyr Leu Lys Glu Lys Trp Glu Ala Leu Thr Asp

355 360 365

His Pro Leu Val Gly Glu Ala Lys Ile Val Gly Met Met Ala Ser Ile

370 375 380

Ala Leu Thr Pro Asn Lys Ala Ser Arg Ala Lys Phe Ala Ser Glu Pro

385 390 395 400

Gly Thr Ile Gly Tyr Ile Cys Arg Glu Arg Cys Phe Ala Asn Asn Leu

405 410 415

Ile Met Arg His Val Gly Asp Arg Met Ile Ile Ser Pro Pro Leu Val

420 425 430

Ile Thr Pro Ala Glu Ile Asp Glu Met Phe Val Arg Ile Arg Lys Ser

435 440 445

Leu Asp Glu Ala Gln Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly Leu Met Lys Ser

450 455 460

Glu Gly

465

<210> 3

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 转氨酶突变体

<400> 3

Met Ser Leu Ala Thr Ile Thr Asn His Met Pro Thr Ala Glu Leu Gln

1 5 10 15

Ala Leu Asp Ala Ala His His Leu His Pro Phe Ser Ala Asn Asn Ala

20 25 30

Leu Gly Glu Glu Gly Thr Arg Val Ile Thr Arg Ala Arg Gly Val Trp

35 40 45

Leu Asn Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu

50 55 60

Phe Cys Val Asn Ile Gly Tyr Gly Arg Asp Glu Leu Ala Glu Val Ala

65 70 75 80

Ala Arg Gln Met Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Ala Ile Ala Leu Ala Gln Lys Leu Ala Glu Leu Ala

100 105 110

Pro Gly Asp Leu Asn His Val Phe Phe Ala Gly Gly Gly Ser Glu Ala

115 120 125

Asn Asp Thr Asn Ile Arg Met Val Arg Thr Tyr Trp Gln Asn Lys Gly

130 135 140

Gln Pro Glu Lys Thr Val Ile Ile Ser Arg Lys Asn Ala Tyr His Gly

145 150 155 160

Ser Thr Val Ala Ser Ser Ala Leu Gly Gly Met Ala Gly Met His Ala

165 170 175

Gln Ser Gly Leu Ile Pro Asp Val His His Ile Asn Gln Pro Asn Trp

180 185 190

Trp Ala Glu Gly Gly Asp Met Asp Pro Glu Glu Phe Gly Leu Ala Arg

195 200 205

Ala Arg Glu Leu Glu Glu Ala Ile Leu Glu Leu Gly Glu Asn Arg Val

210 215 220

Ala Ala Phe Ile Ala Glu Pro Val Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val

225 230 235 240

Ala Pro Asp Ser Tyr Trp Pro Glu Ile Gln Arg Ile Cys Asp Lys Tyr

245 250 255

Asp Ile Leu Leu Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr

260 265 270

Gly Asn Trp Phe Gly Thr Gln Thr Met Gly Ile Arg Pro His Ile Met

275 280 285

Thr Ile Ala Lys Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Ala Pro Ile Gly Gly Ser

290 295 300

Ile Val Cys Asp Glu Val Ala His Val Ile Gly Lys Asp Thr Phe Asn

305 310 315 320

His Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu

325 330 335

Glu Asn Leu Arg Ile Leu Glu Glu Glu Asn Ile Leu Asp His Val Arg

340 345 350

Asn Val Ala Ala Pro Tyr Leu Lys Glu Lys Trp Glu Ala Leu Thr Asp

355 360 365

His Pro Leu Val Gly Glu Ala Lys Ile Val Gly Met Met Ala Ser Ile

370 375 380

Ala Leu Thr Pro Asn Lys Ala Ser Arg Ala Lys Phe Ala Ser Tyr Pro

385 390 395 400

Gly Thr Ile Gly Tyr Ile Cys Arg Glu Arg Cys Phe Ala Asn Asn Leu

405 410 415

Ile Met Val His Val Gly Asp Arg Met Val Ile Ser Pro Pro Leu Val

420 425 430

Ile Thr Pro Ala Glu Ile Asp Glu Met Phe Val Arg Ile Arg Lys Ser

435 440 445

Leu Asp Glu Ala Gln Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly Leu Met Lys Ser

450 455 460

<210> 4

<211> 464

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 转氨酶突变体

<400> 4

Met Ser Leu Ala Thr Ile Thr Asn His Met Pro Thr Ala Glu Leu Gln

1 5 10 15

Ala Leu Asp Ala Ala His His Leu His Pro Phe Ser Ala Asn Asn Ala

20 25 30

Leu Gly Glu Glu Gly Thr Arg Val Ile Thr Arg Ala Arg Gly Val Trp

35 40 45

Leu Asn Asp Ser Glu Gly Glu Glu Ile Leu Asp Ala Met Ala Gly Leu

50 55 60

Phe Cys Val Asn Ile Gly Tyr Gly Arg Asp Glu Leu Ala Glu Val Ala

65 70 75 80

Ala Arg Gln Met Arg Glu Leu Pro Tyr Tyr Asn Thr Phe Phe Lys Thr

85 90 95

Thr His Val Pro Ala Ile Ala Leu Ala Gln Lys Leu Ala Glu Leu Ala

100 105 110

Pro Gly Asp Leu Asn His Val Phe Phe Ala Gly Gly Gly Ser Glu Ala

115 120 125

Asn Asp Thr Asn Ile Arg Met Val Arg Thr Tyr Trp Gln Asn Lys Gly

130 135 140

Gln Pro Glu Lys Thr Val Ile Ile Ser Arg Lys Asn Ala Tyr His Gly

145 150 155 160

Ser Thr Val Ala Ser Ser Ala Leu Gly Gly Met Ala Gly Met His Ala

165 170 175

Gln Ser Gly Leu Ile Pro Asp Val His His Ile Asn Gln Pro Asn Trp

180 185 190

Trp Ala Glu Gly Gly Asp Met Asp Pro Glu Glu Phe Gly Leu Ala Arg

195 200 205

Ala Arg Glu Leu Glu Glu Ala Ile Leu Glu Leu Gly Glu Asn Arg Val

210 215 220

Ala Ala Phe Ile Ala Glu Pro Val Gln Gly Ala Gly Gly Val Ile Val

225 230 235 240

Ala Pro Asp Ser Tyr Trp Pro Glu Ile Gln Arg Ile Cys Asp Lys Tyr

245 250 255

Asp Ile Leu Leu Ile Ala Asp Glu Val Ile Cys Gly Phe Gly Arg Thr

260 265 270

Gly Asn Trp Phe Gly Thr Gln Thr Met Gly Ile Arg Pro His Ile Met

275 280 285

Thr Ile Ala Lys Gly Leu Ser Ser Gly Tyr Ala Pro Ile Gly Gly Ser

290 295 300

Ile Val Cys Asp Glu Val Ala His Val Ile Gly Lys Asp Thr Phe Asn

305 310 315 320

His Gly Tyr Thr Tyr Ser Gly His Pro Val Ala Ala Ala Val Ala Leu

325 330 335

Glu Asn Leu Arg Ile Leu Glu Glu Glu Asn Ile Leu Asp His Val Arg

340 345 350

Asn Val Ala Ala Pro Tyr Leu Lys Glu Lys Trp Glu Ala Leu Thr Asp

355 360 365

His Pro Leu Val Gly Glu Ala Lys Ile Val Gly Met Met Ala Ser Ile

370 375 380

Ala Leu Thr Pro Asn Lys Ala Ser Arg Ala Lys Phe Ala Ser Tyr Pro

385 390 395 400

Gly Thr Ile Gly Tyr Ile Cys Arg Glu Arg Cys Phe Ala Asn Asn Leu

405 410 415

Ile Met Val His Ser Gly Asp Arg Met Val Ile Ser Pro Pro Leu Val

420 425 430

Ile Thr Pro Ala Glu Ile Asp Glu Met Phe Val Arg Ile Arg Lys Ser

435 440 445

Leu Asp Glu Ala Gln Ala Glu Ile Glu Lys Gln Gly Leu Met Lys Ser

450 455 460

<210> 5

<211> 1401

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 野生型转氨酶的编码序列

<400> 5

atgtccctgg caactatcac caaccacatg ccgactgcgg agctgcaggc tctggatgcg 60

gctcaccatc tgcacccgtt ctctgcgaac aacgcactgg gtgaggaggg tacgcgtgtg 120

attacccgtg ctcgtggcgt gtggctgaac gactcagaag gcgaggagat tctggacgct 180

atggcaggcc tgtggtgcgt taacatcggt tatggtcgtg atgaactggc tgaggttgcg 240

gctcgtcaga tgcgcgaact gccttactac aataccttct tcaaaaccac tcatgtacca 300

gcaatcgctc tggcccagaa actggctgaa ctggctccgg gcgatctgaa ccatgtattc 360

tttgcgggcg gcggttccga agcaaacgac accaatatcc gaatggttcg tacttactgg 420

cagaacaaag gccagccgga aaaaactgta atcatctctc gtaaaaacgc ttatcacggc 480

agcactgtag cgtcttccgc gctgggcggt atggccggta tgcacgcgca gagcggtctg 540

atcccggacg tgcaccatat caaccagccg aattggtggg cagagggtgg tgacatggac 600

ccagaagagt tcggtctggc tcgtgcgcgt gagctggagg aggctatctt agaactgggt 660

gaaaaccgtg tggccgcatt tatcgccgag ccagtacagg gtgctggtgg cgttatcgta 720

gccccggact cctactggcc ggaaatccag cgaatttgtg acaagtacga tatcctgctg 780

atcgccgatg aagtcatttg cggtttcggt cgtaccggta attggttcgg tacgcagacg 840

atgggtatcc gcccgcacat catgaccatc gcaaaaggtc tgtccagcgg ctacgctccg 900

attggtggtt ctatcgtctg tgatgaagtc gcgcacgtga tcggcaaaga tgagttcaat 960

catggttaca cctatagcgg tcacccggtt gctgcggcgg tcgccttgga gaacctgcgt 1020

atcctggaag aagaaaatat tctggatcac gtacgtaacg tggcggcccc gtatctgaaa 1080

gaaaaatggg aagcgctgac tgaccatccg cttgtgggtg aagctaaaat cgtcggcatg 1140

atggcctcta tcgctctgac gccgaacaaa gcaagccgcg cgaaattcgc atccgaaccg 1200

ggcaccatcg gttacatctg tcgtgaacgc tgtttcgcta acaatctgat catgcgtcac 1260

gttggcgacc gcatgattat ctccccgcca cttgtcatca ccccggcgga aatcgatgaa 1320

atgtttgtac gcattcgcaa aagcctggac gaggcgcagg cggagattga gaaacagggt 1380

ctgatgaaat ccgaaggttg a 1401

<210> 6

<211> 1401

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 转氨酶突变体的编码序列

<400> 6

atgtccctgg caactatcac caaccacatg ccgactgcgg agctgcaggc tctggatgcg 60

gctcaccatc tgcacccgtt ctctgcgaac aacgcactgg gtgaggaggg tacgcgtgtg 120

attacccgtg ctcgtggcgt gtggctgaac gactcagaag gcgaggagat tctggacgct 180

atggcaggcc tgttttgcgt taacatcggt tatggtcgtg atgaactggc tgaggttgcg 240

gctcgtcaga tgcgcgaact gccttactac aataccttct tcaaaaccac tcatgtacca 300

gcaatcgctc tggcccagaa actggctgaa ctggctccgg gcgatctgaa ccatgtattc 360

tttgcgggcg gcggttccga agcaaacgac accaatatcc gaatggttcg tacttactgg 420

cagaacaaag gccagccgga aaaaactgta atcatctctc gtaaaaacgc ttatcacggc 480

agcactgtag cgtcttccgc gctgggcggt atggccggta tgcacgcgca gagcggtctg 540

atcccggacg tgcaccatat caaccagccg aattggtggg cagagggtgg tgacatggac 600

ccagaagagt tcggtctggc tcgtgcgcgt gagctggagg aggctatctt agaactgggt 660

gaaaaccgtg tggccgcatt tatcgccgag ccagtacagg gtgctggtgg cgttatcgta 720

gccccggact cctactggcc ggaaatccag cgaatttgtg acaagtacga tatcctgctg 780

atcgccgatg aagtcatttg cggtttcggt cgtaccggta attggttcgg tacgcagacg 840

atgggtatcc gcccgcacat catgaccatc gcaaaaggtc tgtccagcgg ctacgctccg 900

attggtggtt ctatcgtctg tgatgaagtc gcgcacgtga tcggcaaaga tgagttcaat 960

catggttaca cctatagcgg tcacccggtt gctgcggcgg tcgccttgga gaacctgcgt 1020

atcctggaag aagaaaatat tctggatcac gtacgtaacg tggcggcccc gtatctgaaa 1080

gaaaaatggg aagcgctgac tgaccatccg cttgtgggtg aagctaaaat cgtcggcatg 1140

atggcctcta tcgctctgac gccgaacaaa gcaagccgcg cgaaattcgc atccgaaccg 1200

ggcaccatcg gttacatctg tcgtgaacgc tgtttcgcta acaatctgat catgcgtcac 1260

gttggcgacc gcatgattat ctccccgcca cttgtcatca ccccggcgga aatcgatgaa 1320

atgtttgtac gcattcgcaa aagcctggac gaggcgcagg cggagattga gaaacagggt 1380

ctgatgaaat ccgaaggttg a 1401

<210> 7

<211> 1395

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 转氨酶突变体的编码序列

<400> 7

atgtccctgg caactatcac caaccacatg ccgactgcgg agctgcaggc tctggatgcg 60

gctcaccatc tgcacccgtt ctctgcgaac aacgcactgg gtgaggaggg tacgcgtgtg 120

attacccgtg ctcgtggcgt gtggctgaac gactcagaag gcgaggagat tctggacgct 180

atggcaggcc tgttttgcgt taacatcggt tatggtcgtg atgaactggc tgaggttgcg 240

gctcgtcaga tgcgcgaact gccttactac aataccttct tcaaaaccac tcatgtacca 300

gcaatcgctc tggcccagaa actggctgaa ctggctccgg gcgatctgaa ccatgtattc 360

tttgcgggcg gcggttccga agcaaacgac accaatatcc gaatggttcg tacttactgg 420

cagaacaaag gccagccgga aaaaactgta atcatctctc gtaaaaacgc ttatcacggc 480

agcactgtag cgtcctccgc gctgggcggt atggccggta tgcacgcgca gagcggtctg 540

atcccggacg tgcaccatat caaccagccg aattggtggg cagagggtgg tgacatggac 600

ccagaagagt tcggtctggc tcgtgcgcgt gagctggagg aggctatctt agaactgggt 660

gaaaaccgtg tggccgcatt tatcgccgag ccagtacagg gtgctggtgg cgttatcgta 720

gccccggact cctactggcc ggaaatccag cgaatttgtg acaagtacga tatcctgctg 780

atcgccgatg aagtcatttg cggtttcggt cgtaccggta attggttcgg tacgcagacg 840

atgggtatcc gcccgcacat catgaccatc gcaaaaggtc tgtccagcgg ctacgctccg 900

attggtggtt ctatcgtctg tgatgaagtc gcgcacgtga tcggcaaaga tacgttcaat 960

catggttaca cctatagcgg tcacccggtt gctgcggcgg tcgccttgga gaacctgcgt 1020

atcctggaag aagaaaatat tctggatcac gtacgtaacg tggcggcccc gtatctgaaa 1080

gaaaaatggg aagcgctgac tgaccatccg cttgtgggtg aagctaaaat cgtcggcatg 1140

atggcctcta tcgctctgac gccgaacaaa gcaagccgcg cgaaattcgc atcctatccg 1200

ggcaccatcg gttacatctg tcgtgaacgc tgtttcgcta acaatctgat catggttcac 1260

gttggcgacc gcatggttat ctccccgcca cttgtcatca ccccggcgga aatcgatgaa 1320

atgtttgtac gcattcgcaa aagcctggac gaggcgcagg cggagattga gaaacagggt 1380

ctgatgaaat cctga 1395

<210> 8

<211> 1395

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 转氨酶突变体的编码序列

<400> 8

atgtccctgg caactatcac caaccacatg ccgactgcgg agctgcaggc tctggatgcg 60

gctcaccatc tgcacccgtt ctctgcgaac aacgcactgg gtgaggaggg tacgcgtgtg 120

attacccgtg ctcgtggcgt gtggctgaac gactcagaag gcgaggagat tctggacgct 180

atggcaggcc tgttttgcgt taacatcggt tatggtcgtg atgaactggc tgaggttgcg 240

gctcgtcaga tgcgcgaact gccttactac aataccttct tcaaaaccac tcatgtacca 300

gcaatcgctc tggcccagaa actggctgaa ctggctccgg gcgatctgaa ccatgtattc 360

tttgcgggcg gcggttccga agcaaacgac accaatatcc gaatggttcg tacttactgg 420

cagaacaaag gccagccgga aaaaactgta atcatctctc gtaaaaacgc ttatcacggc 480

agcactgtag cgtcctccgc gctgggcggt atggccggta tgcacgcgca gagcggtctg 540

atcccggacg tgcaccatat caaccagccg aattggtggg cagagggtgg tgacatggac 600

ccagaagagt tcggtctggc tcgtgcgcgt gagctggagg aggctatctt agaactgggt 660

gaaaaccgtg tggccgcatt tatcgccgag ccagtacagg gtgctggtgg cgttatcgta 720

gccccggact cctactggcc ggaaatccag cgaatttgtg acaagtacga tatcctgctg 780

atcgccgatg aagtcatttg cggtttcggt cgtaccggta attggttcgg tacgcagacg 840

atgggtatcc gcccgcacat catgaccatc gcaaaaggtc tgtccagcgg ctacgctccg 900

attggtggtt ctatcgtctg tgatgaagtc gcgcacgtga tcggcaaaga tacgttcaat 960

catggttaca cctatagcgg tcacccggtt gctgcggcgg tcgccttgga gaacctgcgt 1020

atcctggaag aagaaaatat tctggatcac gtacgtaacg tggcggcccc gtatctgaaa 1080

gaaaaatggg aagcgctgac tgaccatccg cttgtgggtg aagctaaaat cgtcggcatg 1140

atggcctcta tcgctctgac gccgaacaaa gcaagccgcg cgaaattcgc atcctatccg 1200

ggcaccatcg gttacatctg tcgtgaacgc tgtttcgcta acaatctgat catggttcac 1260

agtggcgacc gcatggttat ctccccgcca cttgtcatca ccccggcgga aatcgatgaa 1320

atgtttgtac gcattcgcaa aagcctggac gaggcgcagg cggagattga gaaacagggt 1380

ctgatgaaat cctga 1395

Claims

1.一种转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1相比，具有第65位、第318位、第399位、第419位、第426位、第465位和第466位突变中的一种或多种，所述突变为氨基酸残基的增加、缺失或取代。

2.如权利要求1所述的转氨酶，其特征在于，所述突变选自下述组：第65位、第318位、第399位、第419位、第426位的取代突变和第465位和/或第466位的缺失突变；优选所述取代突变选自以下组：W65F、E318T、E399Y、R419V和I426V。

3.如权利要求2所述的转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2或如SEQ ID NO:3所示。

4.一种核酸分子，其多核苷酸序列选自：

(1)编码权利要求1-3中任一项所述的转氨酶的多核苷酸序列；和

(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列；

优选地，(1)所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO:6或如SEQ ID NO:7所示。

5.一种核酸构建体，其含有权利要求4所述的核酸分子；优选地，所述核酸构建体为表达盒。

6.一种重组载体，其含有权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的核酸构建体；优选地，所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。

7.一种宿主细胞，其含有权利要求4所述的核酸分子、权利要求5所述的核酸构建体或权利要求6所述的重组载体，和/或，其表达权利要求1-3中任一项所述的转氨酶。

8.一种酶制剂，所述酶制剂含有权利要求1-3中任一项所述的转氨酶。

9.下式I所示的手性胺的制备方法：

(I)

其中，所述方法包括，在助溶剂和任选的辅酶的存在下，使用来自鲁杰氏菌属(Ruegeria arenilitoris sp)的转氨酶或与其氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的转氨酶或权利要求1-3中任一项所述的转氨酶或权利要求8所述的酶制剂催化氨基供体与下式III所示的底物反应，从而制备得到式I所示的手性胺：

其中，式I和III中，R₁为卤代芳烃，R₂为C_1-4烷基；

优选地，式I化合物为(S)4-溴-α-甲基苄胺，式III化合物为对溴苯乙酮。

10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述鲁杰氏菌属(Ruegeria arenilitorissp)的转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少99％的序列同一性的转氨酶为NCBI登陆号为3HMU_A或WP_011049154.1的转氨酶。

11.如权利要求9所述的方法，其特征在于，

所述助溶剂为二甲亚砜；和/或，所述氨基供体为脂肪胺；

优选地，所述脂肪胺为碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺，如异丙胺。

12.如权利要求9所述的方法，其特征在于，

转氨酶的用量是反应体系中底物重量的1-50％，如10-40％或15-30％；

反应体系中含有辅酶，辅酶的用量为底物重量的0.1-5.0％，优选1-3％；所述辅酶优选5-磷酸吡哆醛(PLP)；

反应体系中，氨基供体的用量为底物重量的200％-500％，优选300％；

反应体系pH 6-10，优选为7-9，更优选为8-9，最优选为8.1～8.3；

反应温度为10-50℃，优选为20-45℃，更优选为40℃；

反应时间为0.1-120小时，例如0.5-72小时或10-42小时。

13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜；氨基供体为异丙胺；转氨酶为鲁杰氏菌属(Ruegeria arenilitoris sp)的转氨酶，优选为权利要求1-3中任一项所述的转氨酶；式I化合物为(S)4-溴-α-甲基苄胺；式III化合物为对溴苯乙酮；

较佳地，所述转氨酶为氨基酸序列如SEQ ID NO:2或如SEQ ID NO:3所示的转氨酶。

14.来自鲁杰氏菌属(Ruegeria arenilitoris sp)的转氨酶和/或权利要求1-3中任一项所述的转氨酶或含其的酶制剂在制备光学纯手性胺中的应用。