CN116987687A - 卤醇脱卤酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了卤醇脱卤酶突变体及其合成一系列手性β‑硝基醇的应用。所述的卤醇脱卤酶突变体是以来源于Acidimicrobiia bacterium的野生型卤醇脱卤酶(编码基因序列为SEQ ID No：1，氨基酸序列为SEQ ID No:2)为亲本酶进行2‑4个氨基酸位点组合突变而获得。所述的卤醇脱卤酶突变体可应用于催化环氧化物与亚硝酸盐发生立体选择性硝化反应，合成一系列手性β‑硝基醇，其可作为关键手性中间体制备许多β‑阻断剂类药物。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程和酶工程领域，具体的说，涉及利用基因突变和蛋白质改造技术制备高立体选择性的卤醇脱卤酶突变体，以及所获得卤醇脱卤酶突变体作为高效生物催化剂应用于一系列手性β-硝基醇的制备。
背景技术
手性β-硝基醇是一类重要的手性医药中间体，如其可用于洛尔类药物和性外激素的合成。除此之外，手性β-硝基同时含有羟基和硝基，可以发生α-卤化、O-烷基化、Mitsunobu反应、迈克尔加成和环加成等其他衍生化反应，合成种类更加多样的手性含氮化合物。目前，手性β-硝基醇主要是通过不对称Henry反应策略来制备，以醛和硝基烷烃作为合成原料，如CN102892505,CN102600897,CN106795542,CN110878024,CN111285769。该路线反应条件苛刻，需使用昂贵的金属催化剂，且硝基烷烃是一种易燃易爆的原料。另外，通过消旋β-硝基醇动力学拆分或者α-硝基酮不对称还原方法也可制备手性β-硝基醇(Angew.Chem.Int.Ed.2011,50,8979-8981；Green Chem.2011,13,2359-2361；Org.Biomol.Chem.2021,19,322-337；Angew.Chem.Int.Ed.2006,45,3454-3456)，但这些方法均需使用硝基官能化的原料，这些原料需要通过复杂的反应来合成。
环氧化物是一类廉价易得的原料，可通过烯烃环氧化制备。通过对环氧化物直接硝化可以合成β-硝基醇是一种简单经济的技术路线(Synlett 2001,2001,1411-1414；Russ.J.Org.Chem+.2017,53,846-852；Iran.J.Chem.Chem.Eng.2019,38,61-68)，但该反应的立体选择性和区域选择性控制较困难，目前还未有能实现环氧化物立体和区域选择性硝化的有效合成方法。
手性β-硝基醇类化合物II是合成一些列手性洛尔类药物及其类似物的重要手性砌块，可以由环氧化合物I立体选择性硝化制备。因此，针对手性β-硝基醇II的合成，开发高效、绿色和简便的制备工艺，对于发展药物绿色制造技术，以及新型洛尔类药物的研发具有重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种卤醇脱卤酶突变体以及含有该突变体的生物催化剂获得手性β-硝基醇的应用。本发明以来源于Acidimicrobiia bacterium的野生型卤醇脱卤酶(编码基因序列为SEQ ID No：1，氨基酸序列为SEQ ID No:2)为亲本酶，通过分子改造的方法筛选获得立体选择性翻转的卤醇脱卤酶突变体。
具体的，卤醇脱卤酶突变体，其特征在于：它是由SEQ ID NO:2氨基酸序列进行如下任意一种2-4个氨基酸组合突变而得到：
(1)第142位苏氨酸突变为丝氨酸，且第184位天冬酰胺突变为苯丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:4，对应的基因序列为SEQ ID NO:3；
(2)第142位苏氨酸突变为丝氨酸，且第184位天冬酰胺突变为色氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:6，对应的基因序列为SEQ ID NO:5；
(3)第142位苏氨酸突变为丝氨酸，且第184位天冬酰胺突变为络氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:8，对应的基因序列为SEQ ID NO:7；
(4)第92位缬氨酸突变为亮氨酸，第142位苏氨酸突变为丝氨酸，且第184位天冬酰胺突变为苯丙氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:10，对应的基因序列为SEQ IDNO:9；
(5)第92位缬氨酸突变为脯氨酸，第142位苏氨酸突变为甘氨酸，第183位苏氨酸突变为络氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:12，对应的基因序列为SEQ ID NO:11；
(6)第92位缬氨酸突变为脯氨酸，第142位苏氨酸突变为甘氨酸，第183位苏氨酸突变为络氨酸，且第191位苯丙氨酸突变为缬氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:14，对应的基因序列为SEQ ID NO:13；
(7)第92位缬氨酸突变为脯氨酸，第142位苏氨酸突变为甘氨酸，第183位苏氨酸突变为络氨酸，且第191位苯丙氨酸突变为色氨酸，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:16，对应的基因序列为SEQ ID NO:15；
(8)第92位缬氨酸突变为脯氨酸，第142位苏氨酸突变为甘氨酸，第183位苏氨酸突变为络氨酸，且第191位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，得到突变体氨基酸序列为SEQ ID NO:18，对应的基因序列为SEQ ID NO:17。
本发明以含来源于Acidimicrobiia bacterium菌株的野生型卤醇脱卤酶基因的表达质粒为模板，设计并合成对应的PCR引物，利用点饱和突变技术，构建突变文库，结合筛选方法，获得立体选择性改良和翻转的优良卤醇脱卤酶突变体。
本发明所述的卤醇脱卤酶突变体可以工程菌湿细胞或冷冻干燥获得的干细胞形式使用。如果需要，也可以以破碎酶液、部分纯化或完全纯化的酶的形式使用，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的卤醇脱卤酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式的固化酶。
通过将含有卤醇脱卤酶突变体基因的质粒转化到适当的宿主细胞，经培养、诱导表达、筛选出具有高活性的阳性重组菌。在本发明卤醇脱卤酶突变体制备方法中，可以用pET-28(+)作为载体，以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主细胞。在本发明制备的卤醇脱卤酶突变体的方法中，所获得的卤醇脱卤酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞内表达，也可以采用本领域已知的任何其他适当方法实现在原核细胞或真核细胞表达。
本发明还提供了通过构建基因工程菌来表达这些卤醇脱卤酶突变体。当卤醇脱卤酶突变体氨基酸序列已知时，本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化子。这些基因、表达盒、质粒和转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程方法构建获得。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种高立体选择性的卤醇脱卤酶突变体，并提供以该卤醇脱卤酶突变体为生物催化剂，合成手性β-硝基醇化合物II的新工艺。该酶催化技术路线以廉价的亚硝酸盐为硝化试剂，反应条件温和，，安全性高，环境友好，选择性高，催化剂廉价易得，分离纯化简便。
附图说明
图1：以卤醇脱卤酶催化环氧化物I合成手性β-硝基醇化合物II的技术路线。
图2：卤醇脱卤酶突变体HHDHRM2合成手性β-硝基醇化合物II(R)-NPO2的核磁共振氢谱谱图。
图3：卤醇脱卤酶突变体HHDHRM2合成手性β-硝基醇化合物II(R)-NPO2的核磁共振碳谱谱图。
图4：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM1合成手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO2的核磁共振氢谱谱图。
图5：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM1合成手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO2的核磁共振碳谱谱图。
图6：卤醇脱卤酶突变体HHDHRM2合成手性β-硝基醇化合物II(R)-NPO2的光学纯度手性液相分析谱图。
图7：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM1合成手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO2的光学纯度手性液相分析谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明：
在本申请文本中所用的氨基酸三字母或单字母表达方式，采用IUPAC规定的氨基酸代码(Eur.J.Biochem.,138:9-37，1984)，如表1所示。
表1：氨基酸缩写及中英文对照表
| A | Ala | Alanine | 丙氨酸 |
| C | Cys | Cysteine | 半胱氨酸 |
| D | Asp | Aspartic acid | 天冬氨酸 |
| E | Glu | Glutamic acid | 谷氨酸 |
| F | Phe | Phenylalanine | 苯丙氨酸 |
| G | Gly | Glycine | 甘氨酸 |
| H | His | Histidine | 组氨酸 |
| I | Ile | Isoleucine | 异亮氨酸 |
| K | Lys | Lysine | 赖氨酸 |
| L | Leu | Leucine | 亮氨酸 |
| M | Met | Methionine | 甲硫氨酸 |
| N | Asn | Asparagine | 天冬酰胺 |
| P | Pro | Proline | 脯氨酸 |
| Q | Gln | Glutamine | 谷氨酰胺 |
| R | Arg | Arginine | 精氨酸 |
| S | Ser | Serine | 丝氨酸 |
| T | Thr | Threonine | 苏氨酸 |
| V | Val | Valine | 缬氨酸 |
| W | Trp | Tryptophan | 色氨酸 |
| Y | Tyr | Tyrosine | 酪氨酸 |
实施例中的分子生物学实验包括宿主感受态细胞的制备、质粒的构建、基因的酶切和连接、质粒转化、PCR基因扩增等实验技术，主要参考《分子克隆实验指南》(第三版)进行，必要时可以通过简单预实验确定详细可行的实验条件；本文所涉及的分子克隆相关试剂、质粒、宿主细胞均通过商业化公司获得。
本申请文本中所用的术语“亲本”系指来源于放射形土壤杆菌(Acidimicrobiiabacterium)，其核苷酸序列如序列SEQ ID No:1所示，氨基酸序列如SEQ ID No:2所示。本申请文本中所用的术语“卤醇脱卤酶突变体”是指一种以SEQ ID No:2所示氨基酸序列为参考序列，将SEQ ID No.2所示氨基酸序列进行2-4个氨基酸组合突变。具体酶编号，酶的类型及其对应的氨基酸和编码基因序列如表2所示。
表2：卤醇脱卤酶及其对应的氨基酸序列和编码基因碱基序列
| 卤醇脱卤酶编号 | 酶的类型 | 氨基酸序列 | 基因碱基序列 |
| HHDHWT | 野生型 | SEQ ID NO:2 | SEQ ID NO:1 |
| HHDHRM1 | 突变体 | SEQ ID NO:4 | SEQ ID NO:3 |
| HHDHRM2 | 突变体 | SEQ ID NO:6 | SEQ ID NO:5 |
| HHDHRM3 | 突变体 | SEQ ID NO:8 | SEQ ID NO:7 |
| HHDHRM4 | 突变体 | SEQ ID NO:10 | SEQ ID NO:9 |
| HHDHSM1 | 突变体 | SEQ ID NO:11 | SEQ ID NO:12 |
| HHDHSM2 | 突变体 | SEQ ID NO:13 | SEQ ID NO:14 |
| HHDHSM3 | 突变体 | SEQ ID NO:15 | SEQ ID NO:16 |
| HHDHSM4 | 突变体 | SEQ ID NO:17 | SEQ ID NO:18 |
本发明还提供一种利用所述卤醇脱卤酶突变体催化环氧化物I立体选择性硝化制备手性β-硝基醇化合物II的应用，反应过程如图1所示。所述的合成应用为：以含卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体或湿菌体经冷冻干燥获得的干细胞(经超声破碎获得的酶液)作为催化剂，以消旋环氧化物I为底物，以亚硝酸钠(NaNO2)为硝化试剂，以pH 6.5，100mM的磷酸盐缓冲液为反应介质，在10℃，250rpm条件下进行反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得对应的手性β-硝基醇化合物II。
实施例1：卤醇脱卤酶的突变与筛选
根据基因序列设计热点氨基酸T142、N184、T83、V92和F191的定点饱和突变引物：
T142-F(CTGGTTATGACCAGCGCANNKGCAGCAC)，
T42-R(GCTCGGACGTGCTGCMNNTGCG)；
T183-F(GGTTAATGCAGTTGGCNNKAACTTTATGG)，
T183-R(CGGAAAATCCATAAAGTTMNNGCCAACTG)；
N184-F(GGTTAATGCAGTTGGCACCNNKTTTATGG)，
N184-R(CGGAAAATCCATAAAMNNGGTGCCAACTG)；
V92-F(GCGGTCGTNNKGTGACCGGTAAATTTCTG)，
V92-R(CGGTCACMNNACGACCGCTAAATGCTG)；
F191-F(CCGGAANNKCTGCGTGCAAGCGGTGCAAATGATC)，
F191-R(GCACCGCTTGCACGCAGMNNTTCCGGAAAATCC)。
提取含有亲本卤醇脱卤酶基因的质粒作为DNA模板，以上述引物进行PCR扩增。PCR体系(50μL)：5×Plusbuffer试剂10μL，100μM浓度前后引物各2μL，模板质粒2μL，dNTP试剂4μL，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μL，去离子水29.5μL。PCR程序：第一步，95℃/5min；第二步，98℃/10s,60℃/5s,72℃/6min,共30个循环；第三步72℃/20min。PCR产物用DpnI消化后直接通过热击(42℃，90s)方法转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经复苏培养(37℃，1h)后，均匀涂布于含有硫酸卡那霉素抗生素的LB固体培养基上，在37℃条件下培养过夜。挑取单克隆菌落，进行发酵培养、诱导，获得含卤醇脱卤酶突变体的细胞，以此作为生物催化剂，考察其催化环氧化物I(R,S)-PGE1合成手性β-硝基醇化合物II NPO1的产率和光学纯度。反应条件：底物(R,S)-PGE1浓度为50mM,亚硝酸钠浓度为25MM，反应溶剂为pH 6.5，100mM的磷酸盐缓冲液，反应温度10℃。反应结束后，用乙酸乙酯等体积萃取后，通过手性高效液相色谱分析对应的手性β-硝基醇化合物NPO1的产率和光学纯度。将立体选择性提升及立体选择性翻转优良的突变体送去基因测序，获得优良卤醇脱卤酶突变体的准确突变信息及氨基酸序列。经过多轮突变与筛选获得可制备(R)-NPO1和(S)-NPO1手性β-硝基醇化合物的突变体，具体反应情况如表3所示。
表3：卤醇脱卤酶突变体合成手性β-硝基醇化合物NPO1
实施例2：卤醇脱卤酶突变体全细胞生物催化剂的制备
将含有卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌接种至含有终浓度为50μg/L硫酸卡那霉素的LB(酵母粉5g/L,蛋白胨12g/L,氯化钠10g/L)液体培养基中，37℃、250rpm培养8h；培养液以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的TB(酵母粉24g/L,蛋白胨12g/L,and甘油5g/L)液体培养基中，37℃、250rpm振荡培养2.5h左右，至菌液OD600＝0.6～0.8后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃、250rpm诱导培养12-14h，取诱导培养后的菌液于4℃、8000rpm离心3min，收集湿菌体，获得含有卤醇脱卤酶突变体蛋白的重组全细胞，用于后续生物催化反应。
实施例3：卤醇脱卤酶突变体HHDHRM4全细胞催化合成手性β-硝基醇(R)-NPO1
向250mL规格的三角烧瓶中加入50mL含有卤醇脱卤酶突变体HHDHRM4重组细胞(5cdw/L)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)，同时加入终浓度为50mM的化合物(R,S)-PGE1和25mM的亚硝酸钠。三角瓶在10℃和250rpm条件下搅拌反应2h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去菌体。分离的上清液用50mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤得到滤液，再经减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离，最后通过减压蒸馏得到手性β-硝基醇化合物II(R)-NPO1，淡黄色油状物，分离产率为41％，[α]D 25＝+22.68(c＝1.00,CH3OH)。光学纯度经手性HPLC分析，色谱柱Chiralpak IH,流动相为正己烷：异丙醇88：12,流速0.8ml/min,检测波长210nm,(R)-NPO1的保留时间为20.4min,(S)-NPO1的保留时间为26.7min，结果显示分离得到的β-硝基醇化合物II(R)-NPO1的ee值为>99％(R)。NMR表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36–7.27(m,2H),7.01(t,J＝7.4Hz,1H),6.90(d,J＝7.8Hz,2H),4.75–4.66(m,1H),4.66–4.56(m,2H),4.09–4.00(m,2H),3.22(s,1H).13CNMR(100MHz,CDCl3)δ157.8,129.7,121.8,114.5,78.0,68.3,67.4.
实施例4：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4全细胞催化合成手性β-硝基醇(S)-NPO1
向250mL规格的三角烧瓶中加入50mL含有卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4重组细胞(10cdw/L)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)，同时加入终浓度为50mM的环氧化物I(R,S)-PGE1和25mM的亚硝酸钠。三角瓶在10℃和250rpm条件下搅拌反应21h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去菌体。分离的上清液用50mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤得到滤液，再经减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离，最后通过减压蒸馏得到手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO1，淡黄色油状物，分离产率为42％，[α]D 25＝-22.58(c＝1.00,CH3OH)。光学纯度经手性HPLC分析，色谱柱Chiralpak IH,流动相为正己烷：异丙醇88：12,流速0.8ml/min,检测波长210nm,(S)-NPO1的保留时间为20.4min,(S)-NPO1的保留时间为26.7min，结果显示分离得到的β-硝基醇化合物II(S)-NPO1的ee值为95％(S)。NMR表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.36–7.27(m,2H),7.01(t,J＝7.4Hz,1H),6.90(d,J＝7.9Hz,2H),4.75–4.66(m,1H),4.66–4.57(m,2H),4.10–4.01(m,2H),3.18(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ157.8,129.7,121.8,114.5,78.0,68.3,67.4.
实施例5：卤醇脱卤酶突变体HHDHRM2全细胞催化合成手性β-硝基醇化合物II(R)-NPO2
向250mL规格的三角烧瓶中加入50mL含有卤醇脱卤酶突变体HHDHRM2重组细胞(5cdw/L)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)，同时加入终浓度为50mM的环氧化物I(R,S)-PGE2和25mM的亚硝酸钠。三角瓶在10℃和250rpm条件下搅拌反应4h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去菌体。分离的上清液用50mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤得到滤液，再经减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离，最后通过减压蒸馏得到手性β-硝基醇化合物II(R)-NPO2，淡黄色油状物，分离产率为31％，[α]D 25＝+9.09(c＝1.00,CH2Cl2)。光学纯度经手性HPLC分析，色谱柱Chiralpak IH,流动相为正己烷：异丙醇88：12,流速0.8ml/min,检测波长210nm,(R)-NPO2的保留时间为13.2min,(S)-NPO2的保留时间为14.7min，结果如图6所示，显示分离得到的β-硝基醇化合物II(R)-NPO2的ee值为93％(R)。NMR表征数据如图2及图3所示：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.07(t,J＝7.9Hz,1H),6.84(d,J＝7.5Hz,1H),6.69(d,J＝8.2Hz,1H),4.80–4.72(m,1H),4.72–4.60(m,2H),4.14–4.02(m,2H),2.88(s,1H),2.28(s,3H),2.15(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ155.7,138.5,126.1,125.3,123.5,109.1,78.2,68.8,67.7,20.2,11.9.
实施例6：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM1全细胞催化合成手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO2
向250mL规格的三角烧瓶中加入50mL含有卤醇脱卤酶突变体HHDHSM1重组细胞(10cdw/L)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)，同时加入终浓度为50mM的环氧化物I(R,S)-PGE2和25mM的亚硝酸钠。三角瓶在10℃和250rpm条件下搅拌反应2h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去菌体。分离的上清液用50mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤得到滤液，再经减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离，最后通过减压蒸馏得到手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO2，淡黄色油状物，分离产率为35％，[α]D 25＝-23.68(c＝1.00,CH2Cl2)。光学纯度经手性HPLC分析，色谱柱Chiralpak IH,流动相为正己烷：异丙醇88：12,流速0.8ml/min,检测波长210nm,(R)-NPO2的保留时间为13.2min,(S)-NPO2的保留时间为14.7min，结果如图7所示，显示分离得到的β-硝基醇化合物II(S)-NPO2的ee值为90％(S)。NMR表征数据如图4及图5所示：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.07(t,J＝7.9Hz,1H),6.84(d,J＝7.6Hz,1H),6.69(d,J＝8.2Hz,1H),4.80–4.72(m,1H),4.72–4.61(m,2H),4.14–4.03(m,2H),2.88(s,1H),2.28(s,3H),2.15(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ155.7,138.5,126.1,125.3,123.5,109.1,78.2,68.8,67.7,20.2,11.9.
实施例7：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM1全细胞催化合成手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO3
向250mL规格的三角烧瓶中加入50mL含有卤醇脱卤酶突变体HHDHSM1重组细胞(20cdw/L)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)，同时加入终浓度为50mM的环氧化物I(R,S)-PGE3和25mM的亚硝酸钠。三角瓶在10℃和250rpm条件下搅拌反应6.5h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去菌体。分离的上清液用50mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤得到滤液，再经减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离，最后通过减压蒸馏得到手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO3，淡黄色油状物，分离产率为35％，[α]D 25＝-21.98(c＝1.00,CH2Cl2)。光学纯度经手性HPLC分析，色谱柱Chiralpak IH,流动相为正己烷：异丙醇88：12,流速0.8ml/min,检测波长210nm,(R)-NPO3的保留时间为22.7min,(S)-NPO3的保留时间为25.1min，结果显示分离得到的β-硝基醇化合物II(S)-NPO3的ee值为94％(S)。NMR表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.20–8.13(m,1H),7.86–7.80(m,1H),7.56–7.47(m,3H),7.38(t,J＝8.0Hz,1H),6.81(d,J＝7.6Hz,1H),4.92–4.84(m,2H),4.83–4.71(m,2H),4.26(qd,J＝9.7,5.1Hz,2H),2.99(s,1H).13CNMR(100MHz,CDCl3)δ153.5,134.6,127.8,126.8,125.81,125.78,125.3,121.6,121.5,105.1,78.2,68.7,67.6.
实施例8：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4全细胞催化合成手性β-硝基醇(S)-NPO4
向250mL规格的三角烧瓶中加入50 mL含有卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4重组细胞(20cdw/L)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)，同时加入终浓度为50mM的环氧化物I(R,S)-PGE4和25mM的亚硝酸钠。三角瓶在10℃和250rpm条件下搅拌反应22h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去菌体。分离的上清液用50mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤得到滤液，再经减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离，最后通过减压蒸馏得到手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO4，淡黄色油状物，分离产率为37％，[α]D 25＝-15.89(c＝1.00,CH3OH)。光学纯度经手性HPLC分析，色谱柱Chiralpak IH,流动相为正己烷：异丙醇88：12,流速0.8ml/min,检测波长210nm,(R)-NPO4的保留时间为22.0min,(S)-NPO4的保留时间为27.4min，结果显示分离得到的β-硝基醇化合物II(S)-NPO4的ee值为97％(S)。NMR表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.06–6.99(m,1H),6.97–6.88(m,3H),4.73–4.63(m,3H),4.16–4.05(m,2H),3.86(s,3H),3.49(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ150.1,147.5,123.4,121.2,116.4,112.1,77.9,71.3,67.6,55.9.
实施例9：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4全细胞催化合成手性β-硝基醇(S)-NPO5
向250mL规格的三角烧瓶中加入50mL含有卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4重组细胞(10cdw/L)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)，同时加入终浓度为50mM的环氧化物I(R,S)-PGE5和25mM的亚硝酸钠。三角瓶在10℃和250rpm条件下搅拌反应27h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去菌体。分离的上清液用50mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤得到滤液，再经减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离，最后通过减压蒸馏得到手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO5，淡黄色油状物，分离产率为37％，[α]D 25＝-29.28(c＝1.00,CH2Cl2)。光学纯度经手性HPLC分析，色谱柱Chiralpak IH,流动相为正己烷：异丙醇88：12,流速0.8ml/min,检测波长210nm,(S)-NPO5的保留时间为13.1min,(S)-NPO5的保留时间为15.1min，结果显示分离得到的β-硝基醇化合物II(S)-NPO5的ee值为>99％(S)。NMR表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.25–7.15(m,2H),6.97(t,J＝7.4Hz,1H),6.83(d,J＝8.1Hz,1H),6.04–5.92(m,1H),5.05(ddd,J＝18.8,13.6,1.5Hz,2H),4.79–4.69(m,1H),4.68–4.58(m,2H),4.15–4.05(m,2H),3.39(d,J＝6.1Hz,2H),2.94(s,1H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ155.7,137.3,130.7,128.4,127.8,121.8,115.6,111.3,78.1,68.4,67.6,34.9.
实施例10：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4全细胞催化合成手性β-硝基醇(S)-NPO6
向250mL规格的三角烧瓶中加入50mL含有卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4重组细胞(20cdw/L)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)，同时加入终浓度为50mM的环氧化物I(R,S)-PGE6和25mM的亚硝酸钠。三角瓶在10℃和250rpm条件下搅拌反应27h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去菌体。分离的上清液用50mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤得到滤液，再经减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离，最后通过减压蒸馏得到手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO6，淡黄色油状物，分离产率为41％，[α]D 25＝-21.88(c＝1.00,CH2Cl2)。光学纯度经手性HPLC分析，色谱柱Chiralpak IH,流动相为正己烷：异丙醇88：12,流速0.8ml/min,检测波长210nm,(S)-NPO6的保留时间为12.1min,(S)-NPO6的保留时间为14.3min，结果显示分离得到的β-硝基醇化合物II(S)-NPO6的ee值为95％(S)。NMR表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.19(t,J＝7.8Hz,1H),6.83(d,J＝7.5Hz,1H),6.75–6.68(m,2H),4.76–4.68(m,1H),4.68–4.60(m,2H),4.12–4.03(m,2H),2.91(s,1H),2.34(s,3H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ157.9,140.0,129.5,122.8,115.4,111.4,78.0,68.3,67.5,21.6.
实施例11：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4全细胞催化合成手性β-硝基醇(S)-NPO7
向250mL规格的三角烧瓶中加入50mL含有卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4重组细胞(20gcdw/L)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)，同时加入终浓度为50mM的环氧化物I(R,S)-PGE7和25mM的亚硝酸钠。三角瓶在10℃和250rpm条件下搅拌反应28h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去菌体。分离的上清液用50mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤得到滤液，再经减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离，最后通过减压蒸馏得到手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO7，淡黄色油状物，分离产率为41％，[α]D 25＝-19.59(c＝1.00,CH2Cl2)。光学纯度经手性HPLC分析，色谱柱Chiralpak IH,流动相为正己烷：异丙醇88：12,流速0.8ml/min,检测波长210nm,(R)-NPO7的保留时间为18.6min,(S)-NPO7的保留时间为23.0min，结果显示分离得到的β-硝基醇化合物II(S)-NPO7的ee值为96％(S)。NMR表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.15(d,J＝8.4Hz,2H),6.83(d,J＝8.5Hz,2H),4.64(dt,J＝13.3,7.6Hz,3H),4.10–3.98(m,2H),3.57(t,J＝7.0Hz,2H),3.35(s,3H),3.10(s,1H),2.83(t,J＝7.0Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ156.4,132.4,130.1,114.5,78.1,73.8,68.5,67.4,58.8,35.3.
实施例12：卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4全细胞催化合成手性β-硝基醇(S)-NPO8
向250mL规格的三角烧瓶中加入50mL含有卤醇脱卤酶突变体HHDHSM4重组细胞(10cdw/L)的磷酸盐缓冲液(100mM，pH 6.5)，同时加入终浓度为50mM的环氧化物I(R,S)-PGE8和25mM的亚硝酸钠。三角瓶在10℃和250rpm条件下搅拌反应34h。将反应液离心10min(4℃、8000rpm)，除去菌体。分离的上清液用50mL乙酸乙酯萃取三次，将萃取的有机相分离后合并。有机相经无水硫酸钠干燥后，过滤得到滤液，再经减压蒸馏进行浓缩。浓缩液通过硅胶柱色谱进行分离，最后通过减压蒸馏得到手性β-硝基醇化合物II(S)-NPO8，淡黄色油状物，分离产率为39％，[α]D 25＝-7.69(c＝1.00,CH3OH)。光学纯度经手性HPLC分析，色谱柱Chiralpak IH,流动相为正己烷：异丙醇88：12,流速0.8ml/min,检测波长210nm,(S)-NPO8的保留时间为37.7min,(S)-NPO8的保留时间为47.9min，结果显示分离得到的β-硝基醇化合物II(S)-NPO8的ee值为97％(S)。NMR表征数据：1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.13(d,J＝8.5Hz,2H),6.82(d,J＝8.5Hz,2H),4.75–4.68(m,1H),4.68–4.58(m,2H),4.12–4.01(m,2H),3.66(s,3H),2.90(t,J＝7.7Hz,2H),2.60(t,J＝7.7Hz,2H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ173.5,156.4,134.0,129.6,114.7,78.0,68.5,67.5,51.8,36.0,30.2。
Claims (5)
1.卤醇脱卤酶突变体，其特征在于：所述卤醇脱卤酶突变体的氨基酸序列如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20中的任意一种所示。
2.卤醇脱卤酶突变体，其特征在于：所述卤醇脱卤酶突变体由SEQ ID NO:2氨基酸序列进行如下任意2-4个氨基酸组合突变而得到，
(1)第142位苏氨酸突变为丝氨酸，且第184位天冬酰胺突变为苯丙氨酸，得到所述SEQID NO:4的突变体氨基酸序列；
(2)第142位苏氨酸突变为丝氨酸，且第184位天冬酰胺突变为色氨酸，得到所述SEQ IDNO:6的突变体氨基酸序列；
(3)第142位苏氨酸突变为丝氨酸，且第184位天冬酰胺突变为络氨酸，得到所述SEQ IDNO:8的突变体氨基酸序列；
(4)第92位缬氨酸突变为亮氨酸，第142位苏氨酸突变为丝氨酸，且第184位天冬酰胺突变为苯丙氨酸，得到所述SEQ ID NO:10的突变体氨基酸序列；
(5)第92位缬氨酸突变为脯氨酸，第142位苏氨酸突变为甘氨酸，第183位苏氨酸突变为络氨酸，得到所述SEQ ID NO:12的突变体氨基酸序列；
(6)第92位缬氨酸突变为脯氨酸，第142位苏氨酸突变为甘氨酸，第183位苏氨酸突变为络氨酸，且第191位苯丙氨酸突变为缬氨酸，得到所述SEQ ID NO:14的突变体氨基酸序列；
(7)第92位缬氨酸突变为脯氨酸，第142位苏氨酸突变为甘氨酸，第183位苏氨酸突变为络氨酸，且第191位苯丙氨酸突变为色氨酸，得到所述SEQ ID NO:16的突变体氨基酸序列；
(8)第92位缬氨酸突变为脯氨酸，第142位苏氨酸突变为甘氨酸，第183位苏氨酸突变为络氨酸，且第191位苯丙氨酸突变为天冬酰胺，得到所述SEQ ID NO:18的突变体氨基酸序列。
3.卤醇脱卤酶突变体基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌为宿主细胞表达权利要求2所述的任一种卤醇脱卤酶突变体所获得的重组菌。
4.一类生物催化剂，其特征在于：所述生物催化剂为通过权利要求3所述的酶基因工程菌发酵获得的含酶突变体的重组大肠杆菌整细胞或细胞裂解液。
5.如权利要求4所述的一类生物催化剂的应用，其特征在于：所述的一类生物催化剂用于催化环氧化物与亚硝酸盐发生立体选择性硝化反应合成手性β-硝基醇。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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