CN116926031A - 一种转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用，包括一种转氨酶，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或所述转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比，具有第67位、第139位、第185位、以及第195位氨基酸突变中的一种或多种，所述突变为氨基酸残基的取代。本发明通过设计生物酶催化法利用转氨酶，通过动力学拆分消旋胺，或者通过酮的不对称合成生成手性胺，与传统的化学合成方法相比，酶法具有反应效率高、立体选择性好、反应条件温和、低能耗、环境友好等优点，通过在工业化制备光学纯手性胺的生产过程中，从而使得本发明提供的光学纯手性胺的制备方法，具有高的反应效率、立体选择性以及收率。

Description

一种转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用
技术领域
本发明涉及生化技术领域，涉及转氨酶的进化变体及其应用，具体为一种转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用。
背景技术
光学纯手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体。目前，超过70％的药物及其衍生物的合成都是以手性胺作为中间体。下式II所示的(2R)-3-苯基戊-2-胺，即为一种非常重要的手性胺，应用于很多医药中间体的合成。
目前，没有制备(2R)-3-苯基戊-2-胺的方法，而关于(2R)-3-苯基戊-2-胺的类似物制备主要有化学法和生物催化法。例如，(R)-1-(3-氟苯基)乙胺的化学法常规流程：通常以消旋的1-(3-氟苯基)乙胺为原料，使用3-甲基-2,4-乙酰基丙酮诱导出手性，然后进行化学拆分提高手性，但总收率小于50％，手性S＝31，从经济和环保角度出发不适合工业化大规模生产。
为此，提出一种转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用，以解决上述背景技术中提出的基于数据库搜索，发现能够转化3－苯基戊-2-酮生成(2R)-3-苯基戊-2-胺的转氨酶，并通过进化的方法显著提高转氨酶的活性。本发明还提供一种能以高的反应效率、立体选择性以及收率来制备光学纯手性胺的试剂和方法，为后续工业化生产的奠定研究基础。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种转氨酶，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或所述转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比，具有第67位、第139位、第185位、以及第195位氨基酸突变中的一种或多种，所述突变为氨基酸残基的取代。
优选的，所述突变选自第67位、第139位、第185位、第195位的取代突变，其余位置上的氨基酸残基与SEQ ID NO:2相同；
所述突变选自以下组：H67R、R139H、R185L和Y195N。
在本发明的优选实施方案中，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
一种核酸分子，所述核酸分子包括用于编码如权利要求1或2所述转氨酶的多核苷酸序列和所述多核苷酸序列的互补序列。
优选的，所述多核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
为解决上述技术问题，本发明第二方面提供一种核酸分子，其多核苷酸序列选自：编码本发明任一实施方案所述的转氨酶的多核苷酸序列和所述多核苷酸序列的互补序列。
在本发明的优选实施方案中，所述多核苷酸序列选自如SEQ ID NO:1或如SEQ IDNO:3或如SEQ ID NO:5所示的多核苷酸序列或其互补序列。
本发明第三方面提供一种核酸构建体，其含有本发明任一实施方案所述的核酸分子，所述核酸构建体为表达盒。
本发明第四方面提供一种重组载体，其含有本发明任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建体，所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。
本发明第五方面提供一种宿主细胞，其含有本发明任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建体或重组载体，和/或，其表达本发明任一实施方案所述的转氨酶；所述宿主细胞为本领域常规，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
本发明第六方面提供一种酶制剂，所述酶制剂含有本发明任一实施方案所述的转氨酶。
本发明第七方面提供所述的转氨酶、或所述核酸分子、或核酸构建体、或重组载体、或如宿主细胞、或酶制剂在制备光学纯手性胺的应用，所述转氨酶或所述酶制剂，或者经由所述核酸分子、所述核酸构建体、所述重组载体、所述宿主细胞以及所述宿主细胞中的至少一种生成的转氨酶，与底物反应，生成得到/>手性胺；
其中，式I和Ⅲ中，R1为C1-4苯基，R2为C1-4烷基，所述式I化合物为(2R)-3-苯基戊-2-胺，式Ⅲ化合物为3-苯基戊-2-酮
其中，所述方法包括，在助溶剂和任选的辅酶的存在下，使用来自放线菌属(Actinomycetia)的转氨酶或与其氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的转氨酶或本文任一实施方案所述的转氨酶突变体或其酶制剂催化氨基供体与下式Ⅲ所示的底物反应，从而制备得到式I所示的手性胺：
其中，式I和Ⅲ中，R1为C1-4苯基，R2为C1-4烷基。
优选地，式I化合物为(2R)-3-苯基戊-2-胺，式Ⅲ化合物为3-苯基戊-2-酮。
在一个或多个实施方案中，所述放线菌属(Actinomycetia)的转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的转氨酶为NCBI登陆号为WP_197037852.1、PZU02549.1和WP_099382634.1的转氨酶。
在一个或多个实施方案中，所述助溶剂可为本领域常规，所述助溶剂选自：二甲亚砜和醇类溶剂。
在一个或多个实施方案中，所述氨基供体可为本领域常规，所述氨基供体选自：脂肪胺。
在本发明的优选实施方案中，所述醇类溶剂为甲醇。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪胺为碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺，优选为异丙胺或仲丁胺。
在一个或多个实施方案中，转氨酶的用量为反应体系中底物重量的1-50％，如10-40％或15-30％；优选15-20％。
在一个或多个实施方案中，反应体系中含有辅酶，辅酶的用量为底物重量的0.1-5.0％，如1-3％；优选2-2.5％；优选的辅酶为5-磷酸吡哆醛(PLP)。
在一个或多个实施方案中，反应体系中，氨基供体的用量为底物重量的600％-1240％。
在一个或多个实施方案中，反应体系的pH6-10，优选为8-10，更优选为8.9-9.1。
在一个或多个实施方案中，反应温度为10℃-50℃，优选为20℃-45℃，更优选为28℃-45℃。
在一个或多个实施方案中，反应时间为0.1-120小时，例如0.5-48小时、10-24小时或16-20小时。
在一个或多个实施方案中，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜或甲醇；氨基供体为脂肪胺，优选为异丙胺或仲丁胺；转氨酶为放线菌属(Actinomycetia)的转氨酶，优选为本文任一实施方案所述的转氨酶；式I化合物为(2R)-3－苯基戊-2-胺；式Ⅲ化合物为3-苯基戊-2-酮。
在一个或多个实施方案中，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜；氨基供体为异丙胺或仲丁胺；转氨酶为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的转氨酶；式I化合物为(2R)-3-苯基戊-2-胺；式Ⅲ化合物为3-苯基戊-2-酮。
在本发明的优选实施方案中，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜；氨基供体为异丙胺或仲丁胺；转氨酶为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的转氨酶；式I化合物为(2R)-3-苯基戊-2-胺；式Ⅲ化合物为3-苯基戊-2-酮。
本发明还提供来自放线菌属(Actinomycetia)的转氨酶或其酶制剂和/或本文任一实施方案所述的转氨酶或含其的酶制剂在提高制备光学纯手性胺的转化率中的应用。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、本发明通过设计生物酶催化法利用转氨酶，通过动力学拆分消旋胺，或者通过酮的不对称合成生成手性胺，与传统的化学合成方法相比，酶法具有反应效率高、立体选择性好、反应条件温和、低能耗、环境友好等优点；
2、本发明通过在工业化制备光学纯手性胺的生产过程中，通过提供的酶具有底物特异性、对映体选择性和转化率高等优点，从而使得本发明提供的光学纯手性胺的制备方法，具有高的反应效率、立体选择性以及收率。
附图说明
图1是实施例1的方法转化后的(2R)-3-苯基戊-2-胺的SFC图谱，其中t＝1.505min&1.711min处峰为目标化合物(2R)-3-苯基戊-2-胺；
图2是实施例2的方法转化后的(2R)-3-苯基戊-2-胺的SFC图谱，其中t＝1.505min&1.711min处峰为目标化合物(2R)-3-苯基戊-2-；
图3是实施例3的方法转化后的(2R)-3-苯基戊-2-胺的SFC图谱，其中t＝1.505min&1.711min处峰为目标化合物(2R)-3-苯基戊-2-胺；
图4是实施例3的方法转化后的(2R)-3-苯基戊-2-胺的SFC图谱，其中t＝1.505min&1.711min处峰为目标化合物(2R)-3-苯基戊-2-胺。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明发现，利用本发明所述的转氨酶可以以非常高的转化率和手性纯度制备得到具有下式I所示的手性胺：
式中，R1为C1-4苯基，R2为C1-4烷基。
本文中，C1-4烷基包括直链和支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基等。
在特别优选的实施方案中，本发明所述的手性胺为下式II所示的(2R)-3-苯基戊-2-胺：
本发明中，转氨酶优选为来自放线菌属(Actinomycetia)的转氨酶。示例性的来自放线菌属的转氨酶包括具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列的转氨酶。本发明的转氨酶还包括SEQ ID NO:2的突变体，如其氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％，更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列相同性的转氨酶。所述序列相同性可采用本领域常用的软件如BLAST(来自NCBI)以软件默认参数计算得到。
在一些实施方案中，本发明转氨酶的突变体为对SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸突变所得地保留了SEQ ID NO:2所具备的转氨酶活性(尤其是具备本文所述的制备手性胺的功能)的由SEQ ID NO:2衍生得到的突变体。所述一个或多个氨基酸突变包括20个以内、优选15个以内、更优选10个以内、更优选8个以内、更优选5个以内、更优选4个以内的氨基酸突变，如氨基酸残基的取代、插入或缺失，优选的突变是取代突变。
本发明中，示例性的转氨酶突变体包括但不限于登陆号为WP_197037852.1、PZU02549.1和WP_099382634.1的转氨酶。
在一些实施方案中，本发明特别优选的转氨酶突变体包括在SEQ ID NO:2的第67位、第139位、第185位和第195位中的一个或多个位置上发生了突变所得到的突变体，该突变体其余位置上的氨基酸残基与SEQ ID NO:2相同。优选的突变是取代突变或缺失突变。
在一些实施方案中，取代是保守性取代。在一些实施方案中，第67位上地取代为野生型的H被取代为碱性氨基酸，如精氨酸、赖氨酸、组氨酸，优选被取代为精氨酸。在一些实施方案中，第139位上地取代为野生型的R被取代为碱性氨基酸，如赖氨酸、精氨酸和组氨酸，优选被取代为精氨酸或组氨酸，更优选被取代为组氨酸。在一些实施方案中，第185位上地取代为野生型的R被取代为疏水性氨基酸，如色氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、脯氨酸和蛋氨酸(甲硫氨酸)；
优选被取代为亮氨酸，第195位上地取代为野生型的Y被取代为酸性氨基酸，如谷氨酸和天冬氨酸；优选被取代为天冬氨酸。
在优选的实施方案中，所述突变选自以下组：H67R、R139H、R185L和Y195N。
本发明也包括核酸分子，其多核苷酸序列为本发明所述转氨酶或其突变体的编码序列和其互补序列。在一些实施方案中，所述核酸分子的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1或如SEQ ID NO:3或如SEQ ID NO:5所示。
本发明还包括核酸构建体，其含有本发明所述的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸构建体为表达盒。表达盒内除所述核酸分子外，还可含有转录终止序列和启动子。启动子可以是本领域周知的各种启动子，只要其适于在期望的宿主中表达本发明的转氨酶即可。本领域技术人员可根据所用的宿主细胞选择适当的启动子，构建本发明的表达盒以及下文所述的重组载体。
本发明还包括重组载体。该重组载体可含有本文任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建体。该重组载体可以是重组克隆载体或重组真核表达载体。重组载体中可含有其他调节元件，包括但不限于增强子、多克隆位点、转录终止子、抗性基因等。可根据不同目的选择具有所需调节元件的相应的载体骨架，将本发明的核酸分子或核酸构建体克隆入所述骨架中，从而构建得到本发明的重组载体。
可采用本领域周知的方法制备核酸分子、构建核酸构建体和重组载体，并采用常规的方法表达，从而制备得到本文所述的转氨酶。
在一些实施方案中，本发明还提供宿主细胞，其含有本文任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建体和/或重组载体，或表达本文任一实施方案所述的转氨酶。本领域已知的任何适用于表达目标蛋白的宿主均可用于本发明，示例性的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
本发明制备手性胺的方法包括含辅酶和氨基供体的反应体系中使用本发明的转氨酶将下式Ⅲ所示的底物中的羰基还原为手性氨基的步骤：
式中，R1和R2如前文所述。
转氨酶的用量可以是反应体系中底物重量的1-50％，如10-40％或15-30％；优选15-20％。
辅酶可以是本领域常规与转氨酶结合使用的各类辅酶，如5－磷酸吡哆醛(PLP)。辅酶的用量可以是常规用量，例如，可以是反应体系中底物重量的0.1-5.0％，如1-3％；优选2-2.5％。
反应体系中的氨基供体可以是本领域常用于制备手性胺的各类氨基供体，包括但不限于芳香胺，如苯乙胺；脂肪胺，如碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺，例如异丙胺；氨基酸，如丙氨酸(如L－丙氨酸)和天冬氨酸(如L-天冬氨酸)等。通常，反应体系中，氨基供体的用量可根据常规的反应容易确定。通常，根据氨基供体种类的不同，氨基供体的用量可为底物重量的600％-1240％。
本发明中，反应体系为缓冲盐水溶液体系。通过缓冲液来对反应体系的pH进行控制。常用的缓冲液包括但不限于硼酸盐缓冲液、三乙醇胺－异丙胺缓冲液等。优选地，反应体系的pH6-10.0，优选为8.0-10.0。在一些实施方式中，反应体系的pH为8.5-10.0。
反应体系中还可含有助溶剂。手性胺制备中常用的助溶剂都可用于本发明。通常，所述助溶剂为有机溶剂，例如，选自：二甲亚砜、甲苯和醇类溶剂。所述醇类溶剂包括但不限于甲醇。较佳地，所述助溶剂选自二甲亚砜和甲醇。所使用的助溶剂应当与水可混溶，以进一步增加底物的溶解性。
本发明的催化反应的反应温度可为10℃-50℃，优选为20℃-45℃，更优选为28℃-45℃。反应时间可视反应物的量确定，通常可为0.1-120小时，例如0.5-48小时、10-24小时或16-92小时。
本发明发现，当选用特定的助溶剂和氨基供体时，使用来自放线菌属(Actinomycetia)的转氨酶(尤其是SEQ ID NO:2所示的转氨酶)催化底物的羰基还原反应为氨基时，相较于使用其他助溶剂和氨基供体，也能取得显著较高转化率。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明制备所述式I所示的手性胺的方法包括，在助溶剂的存在下使用SEQ ID NO:2所示的转氨酶催化氨基供体与3－苯基戊-2-酮之间的反应；其中，所述助溶剂为二甲亚砜；所述氨基供体为脂肪胺，如碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺，更优选为异丙胺或仲丁胺。在一些实施方案中，所述氨基供体为芳香胺，如苯乙胺(如R-苯乙胺)，所述溶剂为二甲亚砜。在优选的实施方案中，本发明制备所述式I所示的手性胺的方法包括，在二甲亚砜的存在下使用SEQ ID NO:2所示的转氨酶催化R-苯乙胺与式Ⅲ所示底物之间的反应，或在甲醇的存在下使用SEQ ID NO:2所示的转氨酶催化异丙胺与式Ⅲ所示底物之间的反应。优选地，所述反应的反应体系中还含有辅酶，如磷酸吡哆醛(PLP)。优选地，所述手性胺为(2R)-3-苯基戊-2-胺，所述底物为3-苯基戊-2-酮。
本发明还发现，当使用本发明的转氨酶突变体，尤其是本文所述的在SEQ ID NO:2的第67位、第139位、第185位和第195位中多个位置上发生了突变所得到的突变体制备式I的手性胺时，其转化率比野生型(SEQ ID NO:2)非常高。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明制备所述式I所示的手性胺的方法包括，在助溶剂的存在下使用本文任一实施方案所述的转氨酶突变体催化氨基供体与底物之间的反应。优选的助溶剂为二甲亚砜，优选的氨基供体为脂肪胺，如异丙胺或仲丁胺。优选地，所述反应的反应体系中还含有辅酶，如磷酸吡哆醛(PLP)。在特别优选的实施方案中，所述转氨酶突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6所示的转氨酶。优选地，所述手性胺为(2R)-3-苯基戊-2-胺，所述底物为3-苯基戊-2-酮。
本发明也包括前文所述的转氨酶突变体、其编码序列(核酸分子)、核酸构建体、重组载体以及宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供一种酶制品，其含有本发明任一实施方案所述的转氨酶突变体。在一些实施方案中，所述酶制品为冻干粉末。在一些实施方案中，所述酶制品为含有所述转氨酶突变体的缓冲液。优选地，所述缓冲液为硼酸盐缓冲液，pH为6-10，优选为7-9，更优选为8-9，更优选为8.5-10.0。在一些实施方案中，所述硼酸盐缓冲液为硼酸钠缓冲液。
本发明还提供前文任一实施方案所述的转氨酶突变体、其编码序列(核酸分子)、核酸构建体、重组载体以及宿主细胞在制备用于制备所述式I所示的手性胺的试剂中的应用。在一些实施方案中，所述试剂为本文任一实施方案所述的酶制品。
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
制备例
用SEQ ID NO:2(编码序列如SEQ ID NO:1所示)的序列为母本，饱和突变对其进行定向进化改造，然后将突变体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布在50微克/ml的卡那霉素的LB琼脂平板上，放置在37℃培养箱中静止培养18h。将转化的平板上的突变体用牙签挑选到96孔板中，于37℃、220rpm摇床中培养过夜。从一级板的孔洞中吸取50微升菌液接入二级板的相应孔洞中，于37℃、220rpm培养2-3h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，25℃培养20h得到相应的突变体进行高通量筛选。结合SFC检测复筛，鉴别获活性和稳性的显著提高的突变体进行基因测序。测序结果如SEQ ID NO:4所示，其编码序列如SEQ IDNO:3所示。
用SEQ ID NO:4(编码序列如SEQ ID NO:3所示)的序列为母本，采用组合突变等策略对其进行定向进化改造，然后将突变体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布在50微克/ml的卡那霉素的LB琼脂平板上，放置在37℃培养箱中静止培养18h。将转化的平板上的突变体用牙签挑选到96孔板中，于37℃、220rpm摇床中培养过夜。从一级板的孔洞中吸取50微升菌液接入二级板的相应孔洞中，于37℃、220rpm培养2-3h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，25℃培养20h得到相应的突变体进行高通量筛选。结合SFC检测复筛，鉴别获活性和稳性的显著提高的突变体进行基因测序。测序结果如SEQ ID NO:6所示，其编码序列如SEQ ID NO:5所示。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明。实施例中所用到的方法、材料和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法，以及可从市售途径获得的材料和试剂。
本发明所用SFC检测的参数如下：
实施例1
配制含有异丙胺的硼酸盐缓冲液(buffer1)：称取32.85g十水硼酸钠Na2B4O710(H2O)和73g异丙胺，加入900mL蒸馏水，室温搅拌，直至固体溶解，用盐酸溶液调节pH至-8.5，加入蒸馏水定容至1L。
细胞裂解液制备(buffer2)：称取20mg溶菌酶和10mg核酸酶到15ml的buffer1，室温搅拌直至完全溶解，定容至20ml。
20mg含氨基酸序列如SEQ ID NO:2的发酵细胞溶于300ul的细胞裂解液(buffer2)，30℃，1000rpm震荡2小时，取200ul细胞裂解液(氨基酸序列如SEQ ID NO:1)200ul和0.02mg“5-磷酸吡哆醛(PLP)”和溶有1mg底物的10ul二甲亚砜(DMSO)，在-45℃，1000rpm震荡18小时，充分反应，加入1.2ml甲醇终止反应，离心取样。
经SFC检测转化率为7.84％，ee值＞99％。如图1显示，谱图中t＝1.505&1.711min处峰为目标化合物(2R)-3－苯基戊-2-胺。
实施例2
配制含有异丙胺的硼酸盐缓冲液(buffer1)：称取32.85g十水硼酸钠Na2B4O710(H2O)和73g异丙胺，加入900mL蒸馏水，室温搅拌，直至固体溶解，用盐酸溶液调节pH至-8.5，加入蒸馏水定容至1L。
细胞裂解液制备(buffer2)：称取20mg溶菌酶和10mg核酸酶到15ml的buffer1，室温搅拌直至完全溶解，定容至20ml。
20mg含氨基酸序列如SEQ ID NO:4的发酵细胞溶于300ul的细胞裂解液(buffer2)，30℃，1000rpm震荡2小时，取200ul细胞裂解液(氨基酸序列如SEQ ID NO:4)200ul和0.02mg“5-磷酸吡哆醛(PLP)”和溶有1mg底物的10ul二甲亚砜(DMSO)，在-45℃，1000rpm震荡18小时，使其充分反应，加入1.2ml甲醇终止反应，离心取样。
经SFC检测转化率为52.79％，ee值＞99％。如图1显示，谱图中t＝1.505&1.711min处峰为目标化合物(2R)-3-苯基戊-2-胺。
实施例3
配制含有异丙胺的硼酸盐缓冲液(buffer1)：称取32.85g十水硼酸钠Na2B4O710(H2O)和73g异丙胺，加入900mL蒸馏水，室温搅拌，直至固体溶解，用盐酸溶液调节pH至-10，加入蒸馏水定容至1L。
细胞裂解液制备(buffer2)：称取20mg溶菌酶和10mg核酸酶到15ml的buffer1，室温搅拌直至完全溶解，定容至20ml。
20mg含氨基酸序列如SEQ ID NO:4的发酵细胞溶于300ul的细胞裂解液(buffer2)，30℃，1000rpm震荡2小时，取50ul细胞裂解液(氨基酸序列如SEQ ID NO:4)200ul和0.02mg“5-磷酸吡哆醛(PLP)”和溶有1mg底物的10ul二甲亚砜(DMSO)，在-45℃，1000rpm震荡18小时，使其充分反应，加入1.2ml甲醇终止反应，离心取样。
经SFC检测转化率为14.94％，ee值＞99％。如图1显示，谱图中t＝1.505&1.711min处峰为目标化合物(2R)-3-苯基戊-2-胺。
实施例4
配制含有异丙胺的硼酸盐缓冲液(buffer1)：称取32.85g十水硼酸钠Na2B4O710(H2O)和73g异丙胺，加入900mL蒸馏水，室温搅拌，直至固体溶解，用盐酸溶液调节pH至-10，加入蒸馏水定容至1L。
细胞裂解液制备(buffer2)：称取20mg溶菌酶和10mg核酸酶到15ml的buffer1，室温搅拌直至完全溶解，定容至20ml。
20mg含氨基酸序列如SEQ ID NO:6的发酵细胞溶于300ul的细胞裂解液(buffer2)，30℃，1000rpm震荡2小时，取50ul细胞裂解液(氨基酸序列如SEQ ID NO:6)200ul和0.02mg“5-磷酸吡哆醛(PLP)”和溶有1mg底物的10ul二甲亚砜(DMSO)，在-45℃，1000rpm震荡18小时，使其充分反应，加入1.2ml甲醇终止反应，离心取样。
经SFC检测转化率为35.28％，ee值＞99％。如图1显示，谱图中t＝1.505&1.711min处峰为目标化合物(2R)-3-苯基戊-2-胺。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
SEQ ID NO:1
ATGGATTATAGCACGAGCAACCTGGTGAGCGTGGCGCCGGGCGCGATTCGCGAACCGACCCCGGCGGGCAGCGTGATTCAGTATAGCGATTATGAACTGGATGAAAGCAGCCCGTTTGCGGGCGGCGCGGCGTGGATTGAAGGCGAATATGTGCCGGCGGCGGAAGCGCGCATTAGCCTGTTTGATACCGGCTTTGGCCATAGCGATCTGACCTATACCGTGGCGCATGTGTGGCATGGCAACATTTTTCGCCTGAAAGATCATATTGATCGCGTGTTTGATGGCGCGCAGAAACTGCGCCTGCAGAGCCCGCTGACCAAAGCGGAAGTGGAAGATATTACCAAACGCTGCGTGAGCCTGAGTCAGCTGCGCGAAAGCTTTGTGAACATTACCATTACCCGCGGCTATGGCGCGCGCAAAGGCGAAAAAGATCTGAGCAAACTGACGAGTCAGATTTATATTTATGCGATTCCGTATCTGTGGGCGTTTCCGCCGGAAGAACAGATTTTTGGCACGAGCGCGATTGTGCCGCGCCATGTGCGCCGCGCGGGCCGCAACACCGTGGATCCGACCGTGAAAAACTATCAGTGGGGCGATCTGACCGCGGCGAGCTTTGAAGCGAAAGATCGCGGCGCGCGCACCGCGATTCTGCTGGATGCGGATAACTGCGTGGCGGAAGGCCCGGGCTTTAACGTGGTGATGGTGAAAGATGGCAAACTGAGCAGCCCGAGCCGCAACGCGCTGCCGGGCATTACCCGCCTGACCGTGATGGAAATGGCGGATGAAATGGGCATTGAATTTACCCTGCGCGATATTACGAGCCGCGAACTGTATGAAGCGGATGAACTGATTGCGGTGACCACCGCGGGCGGCATTACCCCGATTACGAGCCTGGATGGCGAACCGCTGGGCGATGGCACCCCGGGCCCGGTGACCGTGGCGATTCGCGATCGCTTTTGGGCGATGATGGATGAACCGAGCAGCCTGGTGGAAGCGATTGAATATTAA.
SEQ ID NO:2
MDYSTSNLVSVAPGAIREPTPAGSVIQYSDYELDESSPFAGGAAWIEGEYVPAAEARISLFDTGFGHSDLTYTVAHVWHGNIFRLKDHIDRVFDGAQKLRLQSPLTKAEVEDITKRCVSLSQLRESFVNITITRGYGARKGEKDLSKLTSQIYIYAIPYLWAFPPEEQIFGTSAIVPRHVRRAGRNTVDPTVKNYQWGDLTAASFEAKDRGARTAILLDADNCVAEGPGFNVVMVKDGKLSSPSRNALPGITRLTVMEMADEMGIEFTLRDITSRELYEADELIAVTTAGGITPITSLDGEPLGDGTPGPVTVAIRDRFWAMMDEPSSLVEAIEY.
SEQ ID NO:3
ATGGATTATAGCACGAGCAACCTGGTGAGCGTGGCGCCGGGCGCGATTCGCGAACCGACCCCGGCGGGCAGCGTGATTCAGTATAGCGATTATGAACTGGATGAAAGCAGCCCGTTTGCGGGCGGCGCGGCGTGGATTGAAGGCGAATATGTGCCGGCGGCGGAAGCGCGCATTAGCCTGTTTGATACCGGCTTTGGCCATAGCGATCTGACCTATACCGTGGCGCATGTGTGGCATGGCAACATTTTTCGCCTGAAAGATCATATTGATCGCGTGTTTGATGGCGCGCAGAAACTGCGCCTGCAGAGCCCGCTGACCAAAGCGGAAGTGGAAGATATTACCAAACGCTGCGTGAGCCTGAGTCAGCTGCGCGAAAGCTTTGTGAACATTACCATTACCCGCGGCTATGGCGCGCGCAAAGGCGAAAAAGATCTGAGCAAACTGACGAGTCAGATTTATATTTATGCGATTCCGTATCTGTGGGCGTTTCCGCCGGAAGAACAGATTTTTGGCACGAGCGCGATTGTGCCGCGCCATGTGCGCCGCGCGGGCCTTAACACCGTGGATCCGACCGTGAAAAACTATCAGTGGGGCGATCTGACCGCGGCGAGCTTTGAAGCGAAAGATCGCGGCGCGCGCACCGCGATTCTGCTGGATGCGGATAACTGCGTGGCGGAAGGCCCGGGCTTTAACGTGGTGATGGTGAAAGATGGCAAACTGAGCAGCCCGAGCCGCAACGCGCTGCCGGGCATTACCCGCCTGACCGTGATGGAAATGGCGGATGAAATGGGCATTGAATTTACCCTGCGCGATATTACGAGCCGCGAACTGTATGAAGCGGATGAACTGATTGCGGTGACCACCGCGGGCGGCATTACCCCGATTACGAGCCTGGATGGCGAACCGCTGGGCGATGGCACCCCGGGCCCGGTGACCGTGGCGATTCGCGATCGCTTTTGGGCGATGATGGATGAACCGAGCAGCCTGGTGGAAGCGATTGAATATTAA.
SEQ ID NO:4
MDYSTSNLVSVAPGAIREPTPAGSVIQYSDYELDESSPFAGGAAWIEGEYVPAAEARISLFDTGFGHSDLTYTVAHVWHGNIFRLKDHIDRVFDGAQKLRLQSPLTKAEVEDITKRCVSLSQLRESFVNITITRGYGARKGEKDLSKLTSQIYIYAIPYLWAFPPEEQIFGTSAIVPRHVRRAGLNTVDPTVKNYQWGDLTAASFEAKDRGARTAILLDADNCVAEGPGFNVVMVKDGKLSSPSRNALPGITRLTVMEMADEMGIEFTLRDITSRELYEADELIAVTTAGGITPITSLDGEPLGDGTPGPVTVAIRDRFWAMMDEPSSLVEAIEY.
SEQ ID NO:5
ATGGATTATAGCACGAGCAACCTGGTGAGCGTGGCGCCGGGCGCGATTCGCGAACCGACCCCGGCGGGCAGCGTGATTCAGTATAGCGATTATGAACTGGATGAAAGCAGCCCGTTTGCGGGCGGCGCGGCGTGGATTGAAGGCGAATATGTGCCGGCGGCGGAAGCGCGCATTAGCCTGTTTGATACCGGCTTTGGCCGTAGCGATCTGACCTATACCGTGGCGCATGTGTGGCATGGCAACATTTTTCGCCTGAAAGATCATATTGATCGCGTGTTTGATGGCGCGCAGAAACTGCGCCTGCAGAGCCCGCTGACCAAAGCGGAAGTGGAAGATATTACCAAACGCTGCGTGAGCCTGAGTCAGCTGCGCGAAAGCTTTGTGAACATTACCATTACCCGCGGCTATGGCGCGCACAAAGGCGAAAAAGATCTGAGCAAACTGACGAGTCAGATTTATATTTATGCGATTCCGTATCTGTGGGCGTTTCCGCCGGAAGAACAGATTTTTGGCACGAGCGCGATTGTGCCGCGCCATGTTCGCCGCGCGGGCCTTAACACCGTGGATCCGACCGTGAAAAACAATCAGTGGGGCGATCTGACCGCGGCGAGCTTTGAAGCGAAAGATCGCGGCGCGCGCACCGCGATTCTGCTGGATGCGGATAACTGCGTGGCGGAAGGCCCGGGCTTTAACGTGGTGATGGTGAAAGATGGCAAACTGAGCAGCCCGAGCCGCAACGCGCTGCCGGGCATTACCCGCCTGACCGTGATGGAAATGGCGGATGAAATGGGCATTGAATTTACCCTGCGCGATATTACGAGCCGCGAACTGTATGAAGCGGATGAACTGATTGCGGTGACCACCGCGGGCGGCATTACCCCGATTACGAGCCTGGATGGCGAACCGCTGGGCGATGGCACCCCGGGCCCGGTGACCGTGGCGATTCGCGATCGCTTTTGGGCGATGATGGATGAACCGAGCAGCCTGGTGGAAGCGATTGAATATTAA.
SEQ ID NO:6
MDYSTSNLVSVAPGAIREPTPAGSVIQYSDYELDESSPFAGGAAWIEGEYVPAAEARISLFDTGFGRSDLTYTVAHVWHGNIFRLKDHIDRVFDGAQKLRLQSPLTKAEVEDITKRCVSLSQLRESFVNITITRGYGAHKGEKDLSKLTSQIYIYAIPYLWAFPPEEQIFGTSAIVPRHVRRAGLNTVDPTVKNNQWGDLTAASFEAKDRGARTAILLDADNCVAEGPGFNVVMVKDGKLSSPSRNALPGITRLTVMEMADEMGIEFTLRDITSRELYEADELIAVTTAGGITPITSLDGEPLGDGTPGPVTVAIRDRFWAMMDEPSSLVEAIEY。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (12)

1.一种转氨酶，其特征在于：所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，或所述转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2相比，具有第67位、第139位、第185位、以及第195位氨基酸突变中的一种或多种，所述突变为氨基酸残基的取代。
2.根据权利要求1所述的一种转氨酶，其特征在于：所述突变选自第67位、第139位、第185位、第195位的取代突变，其余位置上的氨基酸残基与SEQ ID NO:2相同；
所述突变选自以下组：H67R、R139H、R185L和Y195N。
3.一种核酸分子，其特征在于：所述核酸分子包括用于编码如权利要求1或2所述转氨酶的多核苷酸序列和所述多核苷酸序列的互补序列。
4.根据权利要求3所述的一种核酸分子，其特征在于：所述多核苷酸序列为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5所示的核苷酸序列。
5.一种核酸构建体，其特征在于：所述核酸构建体为表达盒，以及如权利要求3或4所述的核酸分子。
6.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体，以及如权利要求3或4所述的核酸分子和权利要求5所述的核酸构建体。
7.一种宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞含有权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5所述的核酸构建体或权利要求6所述的重组载体，所述宿主细胞表达权利要求1或2中所述的转氨酶。
8.一种酶制剂，其特征在于：所述酶制剂含有权利要求1或2中所述的转氨酶。
9.一种如权利要求1或2中所述的转氨酶、或如权利要求3或4中所述的核酸分子、或如权利要求5所述的核酸构建体、或如权利要求6所述的重组载体、或如权利要求7所述的宿主细胞、或如权利要求8所述的酶制剂在制备光学纯手性胺的应用，其特征在于：所述转氨酶或所述酶制剂，或者经由所述核酸分子、所述核酸构建体、所述重组载体、所述宿主细胞以及所述宿主细胞中的至少一种生成的转氨酶，与底物反应，生成得到手性胺；
其中，式I和Ⅲ中，R1为C1-4苯基，R2为C1-4烷基，所述式I化合物为(2R)-3－苯基戊-2-胺，式Ⅲ化合物为3-苯基戊-2-酮。
10.下式I所示的手性胺的制备方法：
其特征在于：所述制备方法包括以下步骤，在助溶剂和任选的辅酶的存在下，使用来自放线菌属(Actinomycetia)的转氨酶或与其氨基酸序列具有至少90％的序列同一性的转氨酶、或权利要求1或2所述的转氨酶、或如权利要求8所述的酶制剂催化氨基供体与的底物反应，制备得到/>手性胺。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述助溶剂为二甲亚砜或甲醇；所述氨基供体为脂肪胺优选异丙胺或仲丁胺；所述转氨酶为放线菌属(Actinomycetia)的转氨酶。
12.如权利要求10所述的方法，其特征在于：所述转氨酶的用量为反应体系中底物重量的1-50％；
所述反应体系中含有辅酶，所述辅酶的用量为底物重量的0.1-5.0％；所述辅酶为5-磷酸吡哆醛(PLP)；
所述反应体系中，氨基供体的用量为底物重量的600％-1240％；
所述反应体系的pH为6-10，反应温度为10℃-50℃，反应时间为0.1-120小时。
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