CN113881647B - 转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用 - Google Patents
转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用。本发明的转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比在第136位、第282位和第306位中的一个或多个位置上具有取代突变，其余位置上的氨基酸残基与SEQ ID NO:1相同。本发明还提供使用本发明所披露的转氨酶制备手性胺的方法。采用本发明的转氨酶能提高转化率。
Description
技术领域
本发明涉及转氨酶及其应用，尤其是在生物催化制备光学纯手性胺的应用。
背景技术
光学纯手性胺是一类具有重要价值的医药及精细化工中间体。目前，超过70％的药物都是手性胺及其衍生物的合成都是以手性胺作为中间体。下式II所示的(R)-1,1,1-三氟丙胺即为一种非常重要的手性胺，应用于很多医药中间体的合成。
目前，制备(R)-1,1,1-三氟丙胺的方法主要有化学法和生物催化法。化学法的常规流程如下所示，通常以1,1,1-三氟丙酮为原料，使用R-α-苯乙胺诱导出手性，然后进行化学拆分提高手性值到99％，但总收率小于40％，从经济和环保角度出发不适合工业化大规模生产(J.Org.Chem.，1997，62，10，3030-3031；Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters，2013，23，3947-3953)。
生物酶催化法通常利用转氨酶，通过动力学拆分消旋胺，或者通过酮的不对称合成生成手性胺。与传统的化学合成方法相比，酶法具有反应效率高、立体选择性好、反应条件温和、低能耗、环境友好等优点。但是，通常使用的酶底物特异性、对映体选择性和/或转化率对于工业化的生产过程还不够高。
因此，本领域仍然需要一种能以高的反应效率、立体选择性以及收率来制备光学纯手性胺的试剂和方法。
发明内容
本发明第一方面提供一种转氨酶，所述转氨酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列相比在第136位、第282位和第306位中的一个或多个位置上具有取代突变，其余位置上的氨基酸残基与SEQ ID NO:1相同。
在一个或多个实施方案中，所述取代突变选自下述取代突变中的一种或多种：I136W、T282S和V306L。
在一个或多个实施方案中，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明第二方面提供一种核酸分子，其多核苷酸序列选自：
(1)编码本发明任一实施方案所述的转氨酶的多核苷酸序列；和
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
在一个或多个实施方案中，所述多核苷酸序列选自：SEQ ID NO:4所示的多核苷酸序列或其互补序列。
本发明第三方面提供一种核酸构建体，其含有本发明任一实施方案所述的核酸分子；优选地，所述核酸构建体为表达框。
本发明第四方面提供一种重组载体，其含有本发明任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建体；优选地，所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。
本发明第五方面提供一种宿主细胞，其含有本发明任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建体或重组载体，和/或表达本发明任一实施方案所述的转氨酶；优选地，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
本发明第六方面提供一种酶制剂，所述酶制剂含有本发明任一实施方案所述的转氨酶。
本发明第七方面提供下式I所示的手性胺的制备方法：
其中，所述方法包括，在助溶剂和任选的辅酶的存在下，使用来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶或与其氨基酸序列具有至少95％的序列同一性的转氨酶或本文任一实施方案所述的转氨酶突变体或其酶制剂催化氨基供体与下式III所示的底物反应，从而制备得到式I所示的手性胺：
其中，式I和III中，R1为卤代C1-4烷基，R2为C1-4烷基；
优选地，式I化合物为(R)-1,1,1-三氟丙胺，式III化合物为1,1,1-三氟丙酮。
在一个或多个实施方案中，所述节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少97％的序列同一性的转氨酶为NCBI登陆号为3WWH_A、3WWI_A、5FR9_A或3WWJ_A的转氨酶。
在一个或多个实施方案中，所述助溶剂选自：二甲基亚砜，醇类溶剂，甲苯，或其组合。
在一个或多个实施方案中，所述氨基供体选自：芳香胺、脂肪胺、氨基酸、或其组合。
在一个或多个实施方案中，所述醇类溶剂为异丙醇。
在一个或多个实施方案中，所述芳香胺为苯乙胺。
在一个或多个实施方案中，所述脂肪胺为碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺，优选为异丙胺。
在一个或多个实施方案中，所述氨基酸为丙氨酸和/或天冬氨酸。
在一个或多个实施方案中，转氨酶的用量是反应体系中底物重量的1-50％，如10-40％或15-30％。
在一个或多个实施方案中，反应体系中含有辅酶，辅酶的用量为底物重量的0.1-5.0％，优选1-3％；优选的辅酶为5-磷酸吡哆醛。
在一个或多个实施方案中，反应体系中，氨基供体的用量为底物重量的30％到500％，如50％到300％。
在一个或多个实施方案中，反应体系的pH6～10，优选为7～9，更优选为8～9，更优选为8.3～8.6。
在一个或多个实施方案中，反应温度为10℃～50℃，优选为20℃～45℃，更优选为20℃～35℃。
在一个或多个实施方案中，反应时间为0.1～120小时，例如0.5～48小时或10～24小时。
在一个或多个实施方案中，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜或异丙醇；氨基供体为脂肪胺，优选为异丙胺，或芳香胺，优选R-苯乙胺；转氨酶为来自节杆菌属(Arthrobactersp)的转氨酶，更优选为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的转氨酶或其酶制剂；式I化合物为(R)-1,1,1-三氟丙胺；式III化合物为1,1,1-三氟丙酮。
在一个或多个实施方案中，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜；氨基供体为异丙胺或R-苯乙胺；转氨酶为来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶，更优选为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的转氨酶或其酶制剂；式I化合物为(R)-1,1,1-三氟丙胺；式III化合物为1,1,1-三氟丙酮。
在一个或多个实施方案中，所述方法中，助溶剂为异丙醇；氨基供体为脂肪胺，优选为异丙胺；转氨酶为来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶，更优选为氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的转氨酶或其酶制剂；式I化合物为(R)-1,1,1-三氟丙胺；式III化合物为1,1,1-三氟丙酮。
在一个或多个实施方案中，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜；氨基供体为脂肪胺，优选为异丙胺；转氨酶为本文任一实施方案所述的转氨酶突变体或其酶制剂；式I化合物为(R)-1,1,1-三氟丙胺；式III化合物为1,1,1-三氟丙酮。
本发明还提供来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶或其酶制剂和/或本文任一实施方案所述的转氨酶突变体或其酶制剂在提高制备光学纯手性胺时的转化率中的应用。
附图说明
图1是实施例1的方法转化后的(R)-1,1,1-三氟丙胺的高效液相色谱法图谱。t＝5.13处峰为目标化合物(R)-1,1,1-三氟丙胺。
图2是实施例2的方法转化后的(R)-1,1,1-三氟丙胺的高效液相色谱法图谱。t＝5.13处峰为目标化合物(R)-1,1,1-三氟丙胺。
图3是实施例3的方法转化后的(R)-1,1,1-三氟丙胺的高效液相色谱法图谱。t＝7.07处峰为目标化合物(R)-1,1,1-三氟丙胺。
图4是实施例3的方法转化后的(R)-1,1,1-三氟丙胺的高效液相色谱法图谱。t＝5.13处峰为目标化合物(R)-1,1,1-三氟丙胺。
图5是实施例5的方法转化后的(R)-1,1,1-三氟丙胺的高效液相色谱法图谱。t＝5.13处峰为目标化合物(R)-1,1,1-三氟丙胺。
图6显示实施例6获得的ee值为100％。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明发现，利用本发明所述的转氨酶可以以非常高的转化率和手性纯度制备得到具有下式I所示的手性胺：
式中，R1为卤代C1-4烷基，R2为C1-4烷基。
本文中，卤代C1-4烷基指被卤素取代的C1-4烷基，其中，卤素可包括F、Cl、Br和I。本文中，C1-4烷基包括直链和支链烷基，包括但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基和叔丁基等。卤代C1-4烷基的例子包括但不限于三氟甲基、五氟乙基、三氯甲基等。
在特别优选的实施方案中，本发明所述的手性胺为下式II所示的(R)-1,1,1-三氟丙胺：
本发明中，转氨酶优选为来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶。示例性的来自节杆菌属的转氨酶包括具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列的转氨酶。本发明的转氨酶还包括SEQ ID NO:1的突变体，如其氨基酸序列与SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列具有至少70％、优选至少75％、优选至少80％、优选至少85％、优选至少90％，更优选至少95％、更优选至少96％、更优选至少97％、更优选至少98％、更优选至少99％的序列相同性的转氨酶。所述序列相同性可采用本领域常用的软件如BLAST(来自NCBI)以软件默认参数计算得到。
在一些实施方案中，本发明转氨酶的突变体为对SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸突变所得的保留了SEQ ID NO:1所具备的转氨酶活性(尤其是具备本文所述的制备手性胺的功能)的由SEQ ID NO:1衍生得到的突变体。所述一个或多个氨基酸突变包括20个以内、优选15个以内、更优选10个以内、更优选8个以内、更优选5个以内、更优选3个以内的氨基酸突变，如氨基酸残基的取代、插入或缺失。优选的突变是取代。
本发明中，示例性的转氨酶突变体包括但不限于登陆号为3WWH_A、3WWI_A、5FR9_A以及3WWJ_A的转氨酶。
在一些实施方案中，本发明特别优选的转氨酶突变体包括在SEQ ID NO:1第136位、第282位以及第306位中的一个或多个位置上发生了突变所得到的突变体，该突变体其余位置上的氨基酸残基与SEQ ID NO:1相同。优选的突变是取代突变。在一些实施方案中，取代是保守性取代。在一些实施方案中，第136位上的取代为野生型的I被取代为非极性氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸，或者被取代为芳香族氨基酸，如酪氨酸、色氨酸或苯丙氨酸；优选被取代为色氨酸。在一些实施方案中，第282位上的取代为野生型的T被取代为极性不带电荷的氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺，优选被取代为天冬酰胺、谷氨酰胺、色氨酸或苏氨酸，更优选被取代为色氨酸。在一些实施方案中，第306位上的取代为野生型的V被取代为非极性氨基酸，如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸或蛋氨酸，或者被取代为脂肪族非极性氨基酸，如丙氨酸、亮氨酸、缬氨酸或异亮氨酸；优选被取代为亮氨酸。
在优选的实施方案中，所述取代突变为以下取代突变中的一种、任意两种或全部三种：I136W、T282S和V306L。在进一步优选的实施方案中，所述转氨酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明也包括核酸分子，其多核苷酸序列为本发明所述转氨酶突变体的编码序列或其互补序列。在一些实施方案中，所述核酸分子的多核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明还包括核酸构建体，其含有本发明所述的核酸分子。在一些实施方案中，所述核酸构建体为表达框。表达框内除所述核酸分子外，还可含有转录终止序列和启动子。启动子可以是本领域周知的各种启动子，只要其适于在期望的宿主中表达本发明的转氨酶即可。本领域技术人员可根据所用的宿主细胞选择适当的启动子，构建本发明的表达框以及下文所述的重组载体。
本发明还包括重组载体。该重组载体可含有本文任一实施方案所述的核酸分子或核酸构建体。该重组载体可以是重组克隆载体或重组真核表达载体。重组载体中可含有其它调节元件，包括但不限于增强子、多克隆位点、转录终止子、抗性基因等。可根据不同目的选择具有所需调节元件的相应的载体骨架，将本发明的核酸分子或核酸构建体克隆入所述骨架中，从而构建得到本发明的重组载体。
可采用本领域周知的方法制备核酸分子、构建核酸构建体和重组载体，并采用常规的方法表达，从而制备得到本文所述的转氨酶。
在一些实施方案中，本发明还提供宿主细胞，其含有本文任一实施方案所述的核酸分子、核酸构建体和/或重组载体，或表达本文任一实施方案所述的转氨酶。本领域已知的任何适用于表达目标蛋白的宿主均可用于本发明，示例性的宿主细胞包括大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
本发明制备手性胺的方法包括含辅酶和氨基供体的反应体系中使用本发明的转氨酶将下式III所示的底物中的羰基还原为手性氨基的步骤：
式中，R1和R2如前文所述。
转氨酶的用量可以是反应体系中底物重量的1-50％，如10-40％或15-30％。
辅酶可以是本领域常规与转氨酶结合使用的各类辅酶，如5-磷酸吡哆醛(PLP)。辅酶的用量可以是常规用量，例如，可以是反应体系中底物重量的0.1-5.0％，优选1-3％。
反应体系中的氨基供体可以是本领域常用用来制备手性胺的各类氨基供体，包括但不限于芳香胺，如苯乙胺，脂肪胺，如碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺，如异丙胺，氨基酸，如丙氨酸(如L-丙氨酸)和天冬氨酸(如L-天冬氨酸)等。通常，反应体系中，氨基供体的用量可根据常规的反应容易确定。通常，根据氨基供体种类的不同，氨基供体的用量可为底物重量的30％到500％，如50％到300％。
本发明中，反应体系为缓冲盐水溶液体系。通过缓冲液来对反应体系的pH进行控制。常用的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液、三乙醇胺-异丙胺缓冲液等。优选地，反应体系的pH6～10，优选为7～9，更优选为8～9。在一些实施方式中，反应体系的pH为8.3～8.6。
反应体系中还可含有助溶剂。手性胺制备中常用的助溶剂都可用于本发明。通常，助溶剂为有机溶剂，例如选自下组的助溶剂：二甲基亚砜，甲苯，醇类溶剂，或其组合。所述醇类溶剂包括但不限于异丙醇。较佳地，所述助溶剂选自二甲基亚砜和异丙醇。所使用的助溶剂应当与水可混溶，以进一步增加底物的溶解性。
本发明的催化反应的反应温度可为10℃～50℃，优选为20℃～45℃，更优选为20℃～35℃。在一些实施方案中，反应温度为室温，即25±3℃。反应时间可视反应物的量确定，通常可为0.1～120小时，例如0.5～48小时或10～24小时。
本发明发现，当选用特定的助溶剂和氨基供体时，使用来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶(尤其是SEQ ID NO:1所示的转氨酶)催化底物的羰基还原反应为氨基时，相较于使用其它助溶剂和氨基供体，也能取得显著较高转化率。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明制备所述式I所示的手性胺的方法包括，在助溶剂的存在下使用SEQ ID NO:1所示的转氨酶催化氨基供体与1,1,1-三氟丙酮之间的反应；其中，所述助溶剂为醇类溶剂，优选为异丙醇；所述氨基供体为脂肪胺，如碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺，更优选为异丙胺。在一些实施方案中，所述氨基供体为芳香胺，如苯乙胺(如R-苯乙胺)，所述溶剂为二甲亚砜。在优选的实施方案中，本发明制备所述式I所示的手性胺的方法包括，在二甲亚砜的存在下使用SEQ ID NO:1所示的转氨酶催化R-苯乙胺与式III所示底物之间的反应，或在异丙醇的存在下使用SEQ ID NO:1所示的转氨酶催化异丙胺与式III所示底物之间的反应。优选地，所述反应的反应体系中还含有辅酶，如磷酸吡哆醛。优选地，所述手性胺为(R)-1,1,1-三氟丙胺，所述底物为1,1,1-三氟丙酮。
本发明还发现，当使用本发明的转氨酶突变体，尤其是本文所述的在SEQ ID NO:1第136位、第282位以及第306位中的一个或多个位置上发生了突变所得到的突变体制备式I的手性胺时，其转化率非常高。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明制备所述式I所示的手性胺的方法包括，在助溶剂的存在下使用本文任一实施方案所述的转氨酶突变体催化氨基供体与底物之间的反应。优选的助溶剂为二甲亚砜，优选的氨基供体为脂肪胺，如异丙胺。优选地，所述反应的反应体系中还含有辅酶，如磷酸吡哆醛。在特别优选的实施方案中，所述转氨酶突变体为氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的转氨酶。优选地，所述手性胺为(R)-1,1,1-三氟丙胺，所述底物为1,1,1-三氟丙酮。
本发明也包括前文所述的转氨酶突变体、其编码序列(核酸分子)、核酸构建体、重组载体以及宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供一种酶制品，其含有本发明任一实施方案所述的转氨酶突变体。在一些实施方案中，所述酶制品为冻干粉末。在一些实施方案中，所述酶制品为含有所述转氨酶突变体的缓冲液。优选地，所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，pH为6～10，优选为7～9，更优选为8～9，更优选为8.3～8.6。在一些实施方案中，所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。
本发明还提供前文任一实施方案所述的转氨酶突变体、其编码序列(核酸分子)、核酸构建体、重组载体以及宿主细胞在制备用于制备所述式I所示的手性胺的试剂中的应用。在一些实施方案中，所述试剂为本文任一实施方案所述的酶制品。
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
制备例
用SEQ ID NO:1(编码序列如SEQ ID NO:3所示)的序列为母本，采用滚轮PCR，迭代饱和突变，以及组合突变等策略对其进行定向进化改造，然后将突变体转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，并均匀涂布在50微克/ml的卡那霉素的LB琼脂平板上，放置在37℃培养箱中静止培养18h。将转化的平板上的突变体用牙签挑选到96孔板中，于37℃、220rpm摇床中培养过夜。从一级板的孔洞中吸取50微升菌液接入二级版的相应孔洞中，于37℃、220rpm培养2～3h后，加入终浓度为0.2mM的IPTG，30℃培养20h得到相应的突变体进行高通量筛选。结合HPLC和GC检测复筛，鉴别获活性和稳性的显著提高的突变体进行基因测序。测序结果如SEQ ID NO:2所示，其编码序列如SEQ ID NO:4所示。
SEQ ID NO:1，野生型转氨酶
MAFSADTSEIVYTHDTGLDYITYSDYELDPANPLAGGAAWIEGAFVPPSEARISIFDQGYLHSDVTYTVFHVWNGNAFRLDDHIERLFSNAESMRIIPPLTQDEVKEIALELVAKTELREAFVSVSITRGYSSTPGERDITKHRPQVYMYAVPYQWIVPFDRIRDGVHAMVAQSVRRTPRSSIDPQVKNFQWGDLIRAVQETHDRGFEAPLLLDGDGLLAEGSGFNVVVIKDGVVRSPGRAALPGITRKTVLEIAESLGHEAILADITLAELLDADEVLGCTTAGGVWPFVSVDGNPISDGVPGPITQSIIRRYWELNVESSSLLTPVQY；
SEQ ID NO:2，转氨酶突变体
MAFSADTSEIVYTHDTGLDYITYSDYELDPANPLAGGAAWIEGAFVPPSEARISIFDQGYLHSDVTYTVFHVWNGNAFRLDDHIERLFSNAESMRIIPPLTQDEVKEIALELVAKTELREAFVSVSITRGYSSTPWERDITKHRPQVYMYAVPYQWIVPFDRIRDGVHAMVAQSVRRTPRSSIDPQVKNFQWGDLIRAVQETHDRGFEAPLLLDGDGLLAEGSGFNVVVIKDGVVRSPGRAALPGITRKTVLEIAESLGHEAILADITLAELLDADEVLGCSTAGGVWPFVSVDGNPISDGVPGPLTQSIIRRYWELNVESSSLLTPVQY；
SEQ ID NO:3，野生型转氨酶的编码序列
ATGGCTTTCTCTGCTGACACCTCTGAAATCGTTTACACCCACGACACCGGTCTGGACTACATCACCTACTCTGACTACGAACTGGACCCGGCTAACCCGCTGGCTGGTGGTGCTGCTTGGATCGAAGGTGCTTTCGTTCCGCCGTCTGAAGCTCGTATCTCTATCTTCGACCAGGGTTACCTGCACTCTGACGTTACCTACACCGTTTTCCACGTTTGGAACGGTAACGCTTTCCGTCTGGACGACCACATCGAACGTCTGTTCTCTAACGCTGAATCTATGCGTATCATCCCGCCGCTGACCCAGGACGAAGTTAAAGAAATCGCTCTGGAACTGGTTGCTAAAACCGAACTGCGTGAAGCTTTCGTTTCTGTTTCTATCACCCGTGGTTACTCTTCTACCCCGGGTGAACGTGACATCACCAAACACCGTCCGCAGGTTTACATGTACGCTGTTCCGTACCAGTGGATCGTTCCGTTCGACCGTATCCGTGACGGTGTTCACGCTATGGTTGCTCAGTCTGTTCGTCGTACCCCGCGTTCTTCTATCGACCCGCAGGTTAAAAACTTCCAGTGGGGTGACCTGATCCGTGCTGTTCAGGAAACCCACGACCGTGGTTTCGAAGCTCCGCTGCTGCTGGACGGTGACGGTCTGCTGGCTGAAGGTTCTGGTTTCAACGTTGTTGTTATCAAAGACGGTGTTGTTCGTTCTCCGGGTCGTGCTGCTCTGCCGGGTATCACCCGTAAAACCGTTCTGGAAATCGCTGAATCTCTGGGTCACGAAGCTATCCTGGCTGACATCACCCTGGCTGAACTGCTGGACGCTGACGAAGTTCTGGGTTGCACCACCGCTGGTGGTGTTTGGCCGTTCGTTTCTGTTGACGGTAACCCGATCTCTGACGGTGTTCCGGGTCCGATTACCCAGTCTATCATCCGTCGTTACTGGGAACTGAACGTTGAATCTTCTTCTCTGCTGACCCCGGTTCAGTACTAA；
SEQ ID NO:4，转氨酶突变体的编码序列
ATGGCTTTCTCTGCTGACACCTCTGAAATCGTTTACACCCACGACACCGGTCTGGACTACATCACCTACTCTGACTACGAACTGGACCCGGCTAACCCGCTGGCTGGTGGTGCTGCTTGGATCGAAGGTGCTTTCGTTCCGCCGTCTGAAGCTCGTATCTCTATCTTCGACCAGGGTTACCTGCACTCTGACGTTACCTACACCGTTTTCCACGTTTGGAACGGTAACGCTTTCCGTCTGGACGACCACATCGAACGTCTGTTCTCTAACGCTGAATCTATGCGTATCATCCCGCCGCTGACCCAGGACGAAGTTAAAGAAATCGCTCTGGAACTGGTTGCTAAAACCGAACTGCGTGAAGCTTTCGTTTCTGTTTCTATCACCCGTGGTTACTCTTCTACCCCGTGGGAACGTGACATCACCAAACACCGTCCGCAGGTTTACATGTACGCTGTTCCGTACCAGTGGATCGTTCCGTTCGACCGTATCCGTGACGGTGTTCACGCTATGGTTGCTCAGTCTGTTCGTCGTACCCCGCGTTCTTCTATCGACCCGCAGGTTAAAAACTTCCAGTGGGGTGACCTGATCCGTGCTGTTCAGGAAACCCACGACCGTGGTTTCGAAGCTCCGCTGCTGCTGGACGGTGACGGTCTGCTGGCTGAAGGTTCTGGTTTCAACGTTGTTGTTATCAAAGACGGTGTTGTTCGTTCTCCGGGTCGTGCTGCTCTGCCGGGTATCACCCGTAAAACCGTTCTGGAAATCGCTGAATCTCTGGGTCACGAAGCTATCCTGGCTGACATCACCCTGGCTGAACTGCTGGACGCTGACGAAGTTCTGGGTTGCTCCACCGCTGGTGGTGTTTGGCCGTTCGTTTCTGTTGACGGTAACCCGATCTCTGACGGTGTTCCGGGTCCGCTTACCCAGTCTATCATCCGTCGTTACTGGGAACTGAACGTTGAATCTTCTTCTCTGCTGACCCCGGTTCAGTACTAA。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明。实施例中所用到的方法、材料和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法，以及可从市售途径获得的材料和试剂。
实施例1
配制I80X缓冲液：称取27.8g三水合磷酸氢二钾以及10.6g磷酸二氢钾倒入2L玻璃瓶中。量取纯化水1300mL置于瓶中，室温搅拌，直至固体溶解。量取异丙胺171mL置于瓶中，保持温度在20-30℃，加入35％HCl，调节pH＝8.0。加入纯化水定容至2L。
在8mL反应瓶中，加入4mL I80X缓冲液，再加入30mg转氨酶(氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示)冻干粉和2mg磷酸吡哆醛(PLP)，搅拌充分后，加入100mg的1,1,1-三氟丙酮与100mg二甲基亚砜，控制反应温度为30℃，连续搅拌4小时，使其充分反应。
待反应结束后，经GC检测，转化率为21.3％。如图1显示，t＝5.13处峰为目标化合物1,1,1-三氟丙胺。
实施例2
配制I80X缓冲液：称取27.8g三水合磷酸氢二钾以及10.6g磷酸二氢钾倒入2L玻璃瓶中。量取纯化水1300mL置于瓶中，室温搅拌，直至固体溶解。量取异丙胺171mL置于瓶中，保持温度在20-30℃，加入35％HCl，调节pH＝8.0。加入纯化水定容至2L。
在8mL反应瓶中，加入4mL I80X缓冲液，再加入30mg转氨酶(氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示)冻干粉和2mg磷酸吡哆醛(PLP)，搅拌充分后，加入100mg的1,1,1-三氟丙酮与100mg二甲基亚砜，控制反应温度为30℃，连续搅拌4小时，使其充分反应。
待反应结束后，经GC检测，转化率为64.8％。如图2显示，t＝5.13处峰为目标化合物1,1,1-三氟丙胺。
实施例3
配制I80X缓冲液：称取27.8g三水合磷酸氢二钾以及10.6g磷酸二氢钾倒入2L玻璃瓶中。量取纯化水1300mL置于瓶中，室温搅拌，直至固体溶解。量取R-苯乙胺242g置于瓶中，保持温度在20-30℃，加入35％HCl，调节pH＝8.0。加入纯化水定容至2L。
在8mL反应瓶中，加入4mL I80X缓冲液，再加入30mg转氨酶(氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示)冻干粉和2mg磷酸吡哆醛(PLP)搅拌充分后，加入100mg的1,1,1-三氟丙酮与100mg二甲基亚砜，控制反应温度为30℃，连续搅拌4小时，使其充分反应。
待反应结束后，经GC检测，转化率为90.2％。如图3显示，t＝7.07处峰为目标化合物1,1,1-三氟丙胺。
实施例4
配制I80X缓冲液：称取27.8g三水合磷酸氢二钾以及10.6g磷酸二氢钾倒入2L玻璃瓶中。量取纯化水1300mL置于瓶中，室温搅拌，直至固体溶解。量取异丙胺171mL置于瓶中，保持温度在20-30℃，加入35％HCl，调节pH＝8.0。加入纯化水定容至2L。
在8mL反应瓶中，加入4mL I80X缓冲液，再加入30mg转氨酶(氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示)冻干粉和2mg磷酸吡哆醛(PLP)搅拌充分后，加入100mg的1,1,1-三氟丙酮与100mg异丙醇，控制反应温度为30℃，连续搅拌4小时，使其充分反应。
待反应结束后，经GC检测，转化率为66.2％。如图4显示，t＝5.13处峰为目标化合物1,1,1-三氟丙胺。
实施例5
量取纯化水216mL置于500mL夹套瓶中，加入1.56g三水合磷酸氢二钾以及0.6g磷酸二氢钾，搅拌至完全溶解。称取异丙胺6.3g加入瓶中，控制温度在20-30℃用35％盐酸调节pH至8.3-8.6。然后，向瓶中加入0.24g磷酸吡哆醛和2.4g转氨酶(氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示)。将12g的1,1,1-三氟丙酮与12g二甲基亚砜混合后，向瓶中滴加。待滴加完毕后，升温至25℃，反应16小时。如图5所示，经GC检测，转化率为99.9％。如图6所示，ee值为100％。
综上所述，上述各实施例仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明的保护范围内。
序列表
<110> 上海合全药物研发有限公司
上海合全药业股份有限公司
<120> 转氨酶及其在制备光学纯手性胺中的应用
<130> 208629
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Ser Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr
1 5 10 15
Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro
35 40 45
Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Tyr Leu His Ser Asp
50 55 60
Val Thr Tyr Thr Val Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu
65 70 75 80
Asp Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Met Arg Ile
85 90 95
Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu
100 105 110
Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Phe Val Ser Val Ser Ile Thr
115 120 125
Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Gly Glu Arg Asp Ile Thr Lys His Arg
130 135 140
Pro Gln Val Tyr Met Tyr Ala Val Pro Tyr Gln Trp Ile Val Pro Phe
145 150 155 160
Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Ala Met Val Ala Gln Ser Val Arg
165 170 175
Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp
180 185 190
Gly Asp Leu Ile Arg Ala Val Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu
195 200 205
Ala Pro Leu Leu Leu Asp Gly Asp Gly Leu Leu Ala Glu Gly Ser Gly
210 215 220
Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg
225 230 235 240
Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu
245 250 255
Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Leu Ala Glu Leu
260 265 270
Leu Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Thr Thr Ala Gly Gly Val Trp
275 280 285
Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Pro Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly
290 295 300
Pro Ile Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu
305 310 315 320
Ser Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr
325 330
<210> 2
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Ser Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr
1 5 10 15
Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Asn
20 25 30
Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro
35 40 45
Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Tyr Leu His Ser Asp
50 55 60
Val Thr Tyr Thr Val Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu
65 70 75 80
Asp Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Met Arg Ile
85 90 95
Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu
100 105 110
Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Phe Val Ser Val Ser Ile Thr
115 120 125
Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Trp Glu Arg Asp Ile Thr Lys His Arg
130 135 140
Pro Gln Val Tyr Met Tyr Ala Val Pro Tyr Gln Trp Ile Val Pro Phe
145 150 155 160
Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Ala Met Val Ala Gln Ser Val Arg
165 170 175
Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp
180 185 190
Gly Asp Leu Ile Arg Ala Val Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu
195 200 205
Ala Pro Leu Leu Leu Asp Gly Asp Gly Leu Leu Ala Glu Gly Ser Gly
210 215 220
Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg
225 230 235 240
Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu
245 250 255
Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Leu Ala Glu Leu
260 265 270
Leu Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Ser Thr Ala Gly Gly Val Trp
275 280 285
Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Pro Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly
290 295 300
Pro Leu Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu
305 310 315 320
Ser Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr
325 330
<210> 3
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atggctttct ctgctgacac ctctgaaatc gtttacaccc acgacaccgg tctggactac 60
atcacctact ctgactacga actggacccg gctaacccgc tggctggtgg tgctgcttgg 120
atcgaaggtg ctttcgttcc gccgtctgaa gctcgtatct ctatcttcga ccagggttac 180
ctgcactctg acgttaccta caccgttttc cacgtttgga acggtaacgc tttccgtctg 240
gacgaccaca tcgaacgtct gttctctaac gctgaatcta tgcgtatcat cccgccgctg 300
acccaggacg aagttaaaga aatcgctctg gaactggttg ctaaaaccga actgcgtgaa 360
gctttcgttt ctgtttctat cacccgtggt tactcttcta ccccgggtga acgtgacatc 420
accaaacacc gtccgcaggt ttacatgtac gctgttccgt accagtggat cgttccgttc 480
gaccgtatcc gtgacggtgt tcacgctatg gttgctcagt ctgttcgtcg taccccgcgt 540
tcttctatcg acccgcaggt taaaaacttc cagtggggtg acctgatccg tgctgttcag 600
gaaacccacg accgtggttt cgaagctccg ctgctgctgg acggtgacgg tctgctggct 660
gaaggttctg gtttcaacgt tgttgttatc aaagacggtg ttgttcgttc tccgggtcgt 720
gctgctctgc cgggtatcac ccgtaaaacc gttctggaaa tcgctgaatc tctgggtcac 780
gaagctatcc tggctgacat caccctggct gaactgctgg acgctgacga agttctgggt 840
tgcaccaccg ctggtggtgt ttggccgttc gtttctgttg acggtaaccc gatctctgac 900
ggtgttccgg gtccgattac ccagtctatc atccgtcgtt actgggaact gaacgttgaa 960
tcttcttctc tgctgacccc ggttcagtac taa 993
<210> 4
<211> 993
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggctttct ctgctgacac ctctgaaatc gtttacaccc acgacaccgg tctggactac 60
atcacctact ctgactacga actggacccg gctaacccgc tggctggtgg tgctgcttgg 120
atcgaaggtg ctttcgttcc gccgtctgaa gctcgtatct ctatcttcga ccagggttac 180
ctgcactctg acgttaccta caccgttttc cacgtttgga acggtaacgc tttccgtctg 240
gacgaccaca tcgaacgtct gttctctaac gctgaatcta tgcgtatcat cccgccgctg 300
acccaggacg aagttaaaga aatcgctctg gaactggttg ctaaaaccga actgcgtgaa 360
gctttcgttt ctgtttctat cacccgtggt tactcttcta ccccgtggga acgtgacatc 420
accaaacacc gtccgcaggt ttacatgtac gctgttccgt accagtggat cgttccgttc 480
gaccgtatcc gtgacggtgt tcacgctatg gttgctcagt ctgttcgtcg taccccgcgt 540
tcttctatcg acccgcaggt taaaaacttc cagtggggtg acctgatccg tgctgttcag 600
gaaacccacg accgtggttt cgaagctccg ctgctgctgg acggtgacgg tctgctggct 660
gaaggttctg gtttcaacgt tgttgttatc aaagacggtg ttgttcgttc tccgggtcgt 720
gctgctctgc cgggtatcac ccgtaaaacc gttctggaaa tcgctgaatc tctgggtcac 780
gaagctatcc tggctgacat caccctggct gaactgctgg acgctgacga agttctgggt 840
tgctccaccg ctggtggtgt ttggccgttc gtttctgttg acggtaaccc gatctctgac 900
ggtgttccgg gtccgcttac ccagtctatc atccgtcgtt actgggaact gaacgttgaa 960
tcttcttctc tgctgacccc ggttcagtac taa 993
Claims (24)
1.一种转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种核酸分子，其多核苷酸序列选自：
(1)编码权利要求1所述的转氨酶的多核苷酸序列；和
(2)(1)所述多核苷酸序列的互补序列。
3.如权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，(1)所述的多核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
4.一种核酸构建体，其含有权利要求2或3所述的核酸分子。
5.如权利要求4所述的核酸构建体，其特征在于，所述核酸构建体为表达框。
6.一种重组载体，其含有权利要求2或3所述的核酸分子或权利要求4或5所述的核酸构建体。
7.如权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为重组克隆载体或重组表达载体。
8.一种宿主细胞，其含有权利要求2或3所述的核酸分子、权利要求4或5所述的核酸构建体、或权利要求6或7所述的重组载体，和/或表达权利要求1所述的转氨酶。
9.如权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞选自大肠杆菌细胞、昆虫细胞、酵母细胞和哺乳动物细胞。
10.一种酶制剂，所述酶制剂含有权利要求1所述的转氨酶。
11.下式I所示的手性胺的制备方法：
其中，所述制备方法包括，在助溶剂和任选的辅酶的存在下，使用氨基酸序列如SEQ IDNO:1所示的来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的转氨酶、权利要求1所述的转氨酶或权利要求10所述的酶制剂催化氨基供体与下式III所示的底物反应，从而制备得到式I所示的手性胺：
其中，式I和III中，R1为卤代C1-4烷基，R2为C1-4烷基。
12.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，式I化合物为(R)-1,1,1-三氟丙胺，式III化合物为1,1,1-三氟丙酮。
13.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具有以下一项或多项特征：
所述助溶剂选自：二甲基亚砜，醇类溶剂，甲苯，或其组合；和
所述氨基供体选自：芳香胺、脂肪胺、氨基酸或其组合。
14.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，
所述醇类溶剂为异丙醇；
所述芳香胺为苯乙胺；
所述脂肪胺为碳链长度为2-6个碳原子的脂肪胺；
所述氨基酸为丙氨酸和/或天冬氨酸。
15.如权利要求13所述的制备方法，其特征在于，所述脂肪胺为异丙胺。
16.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具有以下一项或多项特征：
转氨酶的用量是反应体系中底物重量的1-50％；
反应体系中含有辅酶，辅酶的用量为底物重量的0.1-5.0％；
反应体系中，氨基供体的用量为底物重量的30％到500％。
17.如权利要求16所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具有以下一项或多项特征：
转氨酶的用量是反应体系中底物重量的10-40％；
反应体系中含有辅酶，辅酶的用量为底物重量的1-3％；
反应体系中含有辅酶，所述辅酶为5-磷酸吡哆醛；
反应体系中，氨基供体的用量为底物重量的50％到300％。
18.如权利要求11所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具有以下一项或多项特征：
反应体系的pH值为6～10；
反应温度为10℃～50℃；
反应时间为0.1～120小时。
19.如权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具有以下一项或多项特征：
反应体系的pH值为7～9；
反应温度为20℃～45℃；
反应时间为0.5～48小时。
20.如权利要求18所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具有以下一项或多项特征：
反应体系的pH值为8～9；
反应温度为20℃～35℃；
反应时间为10～24小时。
21.如权利要求11-20中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法中，助溶剂为二甲亚砜或异丙醇；氨基供体为脂肪胺或芳香胺；转氨酶为来自节杆菌属(Arthrobactersp)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的转氨酶或其酶制剂；式I化合物为(R)-1,1,1-三氟丙胺；式III化合物为1,1,1-三氟丙酮。
22.如权利要求11-20中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法中，助溶剂为二甲亚砜；氨基供体为脂肪胺；转氨酶为权利要求1所述的转氨酶或其酶制剂；式I化合物为(R)-1,1,1-三氟丙胺；式III化合物为1,1,1-三氟丙酮。
23.如权利要求22所述的制备方法，其特征在于，所述氨基供体为异丙胺。
24.来自节杆菌属(Arthrobacter sp)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的转氨酶或其酶制剂和/或权利要求1所述的转氨酶或其酶制剂在提高制备光学纯手性胺时的转化率中的应用。
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