ES2599644T3 - Un proceso para la identificación y preparación de una omega-transaminasa (R)-específica - Google Patents
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Abstract
Un proceso para la preparación de una amina quiral ópticamente activa, que comprende hacer reaccionar al menos un receptor de amino con al menos un donante de amino con una ω-transaminasa (R)-selectiva preparada mediante un método que comprende las siguientes etapas: a) proporcionar al menos una secuencia de biomolécula de consulta de al menos una ω-transaminasa (R)- selectiva y al menos un banco de biomoléculas, b) realizar la búsqueda en el banco de biomoléculas con la secuencia de biomolécula de consulta para identificar un grupo de primeras secuencias de biomoléculas diana, en donde las primeras secuencias de biomoléculas diana tienen un grado de identidad de secuencia de al menos el 20% con respecto a la secuencia de biomolécula de consulta, calculado a nivel de aminoácidos, c) seleccionar en el grupo de primeras secuencias de biomoléculas diana un grupo de segundas secuencias de biomoléculas diana, que no comprenda, a nivel dprocesoe aminoácidos, al menos una de las siguientes estructuras de aminoácido c1) a c3) con c1) en la posición 95 a 97 una secuencia de aminoácidos Tyr Xa1 Xa2, siendo Xa1 un aminoácido Ile, Val, Leu, Met, Phe, y siendo Xa2 un aminoácido Arg o Lys, o c2) en la posición 97 a 99 una secuencia de aminoácidos Tyr Xaa Gln, siendo Xaa un aminoácido y en la región de la posición 105 a 111 una secuencia de aminoácidos Arg Xaa Xa3, siendo Xa3 un aminoácido, que preferiblemente es His, o c3) en la posición 38 Thr, en la posición 97 Lys y en la posición 107 a 109 una secuencia de aminoácidos Arg Xa4 Xa5, siendo Xa4 un aminoácido, que preferiblemente es Gly, y siendo Xa5 un aminoácido, que preferiblemente es Tyr y que comprende c4) en la posición 95 un aminoácido distinto de Tyr, Arg, Lys, o en la posición 95 Tyr, pero en la posición 97 no Arg o Lys, y c5) en la posición 40 no Lys o Arg, y c6) en la región de la posición 161 a 165 al menos Lys para identificar un grupo de segundas secuencias de biomoléculas diana, y d) proporcionar una biomolécula que tenga la segunda secuencia de biomolécula diana identificada en la etapa c) y que sea, o que codifique al menos parcialmente, una proteína con la actividad de una ω-transaminasa (R)- selectiva, y obtener la amina quiral ópticamente activa.
Description
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En una realización preferida también es posible que la biomolécula sea una molécula de DNA y la secuencia de biomolécula sea una secuencia de DNA. Por consiguiente, en una realización preferida, el banco de biomoléculas es un banco, en particular una base de datos, que reúne información de diversas secuencias de polinucleótidos, en particular secuencias de DNA.
En una realización preferida, la presente invención usa un proceso acorde a lo anterior, en donde el banco de biomoléculas es una base de datos de biomoléculas y la base de datos de biomoléculas se usa para realizar la búsqueda de la etapa b) con un programa de alineamiento de secuencia de biomolécula, en particular BLAST. En una realización preferida se prevé que si el banco de biomoléculas es una base de datos de biomoléculas, la base de datos de biomoléculas se usa para realizar la búsqueda de la etapa b) con una secuencia de aminoácidos, si la base de datos de biomoléculas es una base de datos de secuencias de aminoácidos, o con una secuencia de DNA, si la base de datos de biomoléculas es una base de datos de secuencias de DNA.
La invención prevé en la etapa d) proporcionar finalmente una biomolécula, preferiblemente una molécula de DNA o una molécula de secuencia de aminoácido, es decir, una proteína, tanto mediante síntesis desde cero de la transaminasa como mediante aislamiento a partir de los polinucleótidos de un banco genético que codifican la transaminasa deseada con la ayuda de cebadores, estando definidos en base a las segundas secuencias de biomoléculas. Los polinucleótidos obtenidos, en particular moléculas de secuencia de DNA, se usan para ser sobreexpresadas en las condiciones apropiadas en un medio de cultivo apropiado para expresar la transaminasa deseada.
Se puede proporcionar un proceso para realizar el escrutinio y la identificación de una ω-transaminasa (R)-selectiva, que comprende las etapas a) a c) identificadas anteriormente, en particular proporcionando al menos una secuencia de biomolécula de consulta de al menos una ω-transaminasa (R)-selectiva y al menos un banco de biomoléculas, realizar una búsqueda en el banco de biomoléculas con la secuencia de biomolécula de consulta para identificar un grupo de primeras secuencias de biomolécula diana, en donde las primeras secuencias de biomoléculas tienen un grado de identidad de secuencia de al menos un 20%, preferiblemente un 25%, preferiblemente un 32% con respecto a la secuencia de biomolécula de consulta, calculado a nivel de aminoácidos, seleccionar, en el grupo de primeras secuencias de biomolécula, secuencias de biomoléculas que no comprendan, a nivel de aminoácido, ninguna de las estructuras de secuencia c1) a c3), siendo c1) en la posición 95 a 97 una secuencia de aminoácidos Tyr Xa1 Xa2, siendo Xa1 un aminoácido Ile, Val, Leu, Met, Phe, y siendo Xa2 un aminoácido Arg o Lys, o c2) siendo la posición 97 a 99 una secuencia de aminoácidos Tyr Xaa Gln, siendo Xaa un aminoácido y en la región de la posición 105 a 111, preferiblemente 107 a 109, una secuencia de aminoácidos Arg Xaa Xa3, siendo Xa3 preferiblemente un aminoácido, preferiblemente His, o c3) siendo la posición 38 Thr, en la posición 97 Lys y en la posición 107 a 109 una secuencia de aminoácidos Arg Xa4 Xa5, siendo Xa4 un aminoácido, que preferiblemente es Gly, y siendo Xa5 un aminoácido, que preferiblemente es Tyr, y que no comprende las estructuras de secuencia c4), c5) y c6), siendo c4) a nivel de aminoácidos en la posición 95 diferente de Tyr, Arg, Lys, o en la posición 95 Tyr, pero en la posición 97 no Arg o Lys, y siendo c5) en la posición 40 Lys o Arg, y siendo c6) en la región 161 a 165, preferiblemente en la posición 163, Lys para identificar un grupo de segundas secuencias de biomolécula, que son secuencias de biomolécula de una ω-TA (R)-selectiva.
En una realización preferida adicional de la presente invención, las presentes enseñanzas proporcionan ωtransaminasas (R)-selectivas que pueden obtenerse de acuerdo a los procesos de preparación de la presente invención. En particular, la presente invención proporciona proteínas y secuencias de DNA, en particular moléculas de DNA, que codifican dicha proteína a partir de Mesorhizobium loti y Aspergillus terreus, tal como se identifica en la SEQ ID NO: 1 y 2 correspondientes a Mesorhizobium loti, y 3 y 4 correspondientes a Aspergillus terreus. La presente invención proporciona en particular y en la realización más preferida la enseñanza de que las ω-transaminasas (R)selectivas obtenidas y preparadas según la presente invención, por ejemplo las identificadas en la SEQ ID NO: 1 y 3, pueden usarse en una reacción de transaminación, en particular pueden usarse en un proceso para la preparación de una amina quiral ópticamente activa, preferiblemente un (R)-enantiómero de una amina quiral, que comprende hacer reaccionar al menos un aceptor de amino y al menos un donante de amino con la ω-transaminasa (R)selectiva según la presente invención, en particular de SEQ ID NO: 1 ó 3, y obtener la amina quiral ópticamente activa. En una realización preferida, el proceso para la preparación de una amina quiral ópticamente activa es una síntesis asimétrica que usa un compuesto que contiene un grupo ceto, preferiblemente una cetona y un donante de amino. En otra realización preferida, el método de preparación usa una reacción de resolución cinética. Teniendo como eductos el donante de amino, que preferiblemente es una mezcla de aminas racémicas, y un aceptor de amino, preferiblemente cetonas.
En la realización preferida de la presente invención según la cual se sintetiza una amina quiral ópticamente activa usando una ω-transaminasa (R)-selectiva de la presente invención en una síntesis asimétrica que parte de cetonas, el grado de conversión preferido a la amina quiral ópticamente activa deseada, es decir al (R)-enantiómero, es de al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 99%, 99,5% y lo más preferiblemente 100%.
En otra realización preferida según la cual se usa la ω-transaminasa (R)-selectiva de la presente invención en una reacción de resolución cinética que parte de aminas racémicas, el grado de conversión preferido a la amina quiral ópticamente activa, preferiblemente el (S)-enantiómero, es de al menos 30, 40, 45, 46, 47, 48, 49, en particular 50%.
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- Nº
- Organismos fuente % de identidad con Nº ident. gen/ Nº ident. proteína (base de datos NCBI
- AS-ω-TA SEQ ID NO: 7
- MA-ω-TA SEQ ID NO: 5
- 9
- Mycobacterium vanbaalenii PYR-1 50 91 120405468
- 10
- Mesorhizobium loti MAFF303099 38 37 13471580
- 11
- Mesorhizobium loti 35 37 20804076
- 12
- Roseobacter sp. MED193 37 37 86137542
- 13
- Marinomonas sp. MED121 36 34 87122653
- 14
- Rhizobium etli CIAT 652 33 32 190895112
- 15
- Rhodoferax ferrireducens T118 38 36 89899273
- 16
- Jannaschia sp. CCS1 37 32 89053613
- 17
- Labrenzia alexandrii DFL-11 42 36 EEE43073
- 18
- Burkholderia sp. 383 32 32 78059900
- 19
- Burkholderia cenocepacia HI2424 36 33 ABK12047
- 20
- Alpha proteobacterium HTCC2255 36 34 ZP_01448442
- 21
- Gamma proteobacterium 27 26
- Proteobacteria alfa
- 49 100 SEQ ID 5
- Proteobacteria gamma
- 100 49 SEQ ID 7
AS: Aspergillus sp., MA: Mycobacterium aurum
Ejemplo 2 – Preparación y análisis de las transaminasas de Aspergillus terreus, Mycobacterium vanbaalenii y Mesorhizobium loti
2.1. La ω-TA de Mycobacterium vanbaalenii, entrada 9 de la Tabla 1 (SEQ ID NO: 49 y 50), de Aspergillus terreus,
5 entrada 1 de la Tabla 1 (SEQ ID NO: 3 y 4), y de Mesorhizobium loti, entrada 11 de la Tabla 1 (SEQ ID NO: 1 y 2), han sido obtenidas y usadas en forma adaptada a utilización de codón (para E. coli) para expresar las enzimas en Escherichia coli. La transaminasa de Mycobacterium vanbaalenii se denomina en adelante Mva-TA, la transaminasa de Aspergillus terreus Ate-TA y la de Mesorhizobium loti Mlo-TA.
2.2. Acetofenoensayo
10 La Mva-TA y la Ate-TA convirtieron (R)-α-MBA al menos 100 veces más rápido que el (S)-enantiómero en un acetofenoensayo con amina 2,5 mM y piruvato 2,5 mM a pH 7,5 y 30ºC.
Ensayo: se monitorizó el aumento de absorción de la acetofenona formada durante la reacción a 245 nm.
La Mlo-TA no convirtió ni la (R)-ni la (S)-α-MBA.
A continuación, se han evaluado aminas adicionales en presencia de piruvato o α-cetoglutarato como aceptores de 15 amino (amina 10 mM, piruvato 10 mM, PLP 0,1 mM, tampón de fosfato pH 7,5, incubación 24 h a 30ºC, análisis mediante cromatografía de capa fina).
Se pudo observar conversión para 2-aminoheptano, 2-aminopentano, 1,3-dimetilbutilamina y 4-fenil-2-aminobutano. Asimismo, se pudo detectar una conversión mínima de isopropilamina.
No se pudo detectar conversión con otros donantes de amino tales como D-alanina, L-valina, γ-aminobutirato, 20 etilamina, bencilamina, putrescina, 2-amino-3-metilbutano y 3,3-dimetil-2-aminobutano.
De este modo, se demostró que las tres proteínas son ω-TA.
En particular, usando como sustratos (R)-y (S)-2-aminohexano, solo el enantiómero (R) fue convertido significativamente. Por tanto, también la Mlo-TA es una ω-TA (R)-selectiva. No se observó actividad DATA (Daminoácido transaminasa) o BCAT (aminotransferasa de cadena ramificada) en ninguna de las tres proteínas.
25 2.3. Ensayo de conductividad.
Asimismo, se usaron 1-N-boc-3-aminopirrolidina (B3AP), 1-N-boc-3-aminopiperidina (B3APi) y 1-Cbz-3aminopiperidina (C3APi) como sustratos para determinar las actividades relativas de dichas sustancias contra el sustrato modelo α-MBA.
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-lavar con un 5% de ciclo dextrina altamente sulfatada (HSαCD o HSγCD), 1 minuto, 0,69 bar (10 psi) -inyección: 5-10 s, 0,069 bar (1 psi) -sumergir en agua -separación: voltaje 10 ó 15 kV -detección: MPPA, C3AP y C3APi a 200 nm; B3AP, B3APi a 190 nm
Condiciones de separación:
Tabla 3
- Segmento de separación [cm]
- Selector quiral Tiempo de migración [min] Voltaje durante la separación
- S-Amin
- R-Amin
- MPPA
- 10 HSγCD 2,4 2,8 15 kV
- B3AP
- 10 HSγCD 4,55 6,1 15 kV
- B3Api
- 20 HSγCD 12,0 12,4 15 kV
- C3AP
- 20 HSαCD 10,2 11,3 10 kV
- C3APi
- 20 HSαCD 6,8 7,2 15 kV
Ejemplo 4 – Preparación y análisis de todas las transaminasas identificadas en la Tabla 1.
4.1. Expresión y purificación de las transaminasas
Los marcos de lectura abiertos optimizados para codón que codifican las proteínas con los números de entrada 1, 2, 3, 4, 8, 9, 11, 13, 14, 15, 17, 18 y 21 de la Tabla 1 fueron insertados en pGASTON entre los sitios de restricción NdeI y BamHI usando una estrategia de clonación independiente de ligación. Los ORF optimizados para codón que codifican todas las demás proteínas fueron ordenados ya subclonados en pET-22b. Se cultivaron cepas de E. coli BL21 (DE3) transformadas en 400 mL de medio LB suplementado con ampicilina (100 µg/mL). Las células fueron incubadas inicialmente a 37ºC en un agitador giratorio hasta que la DO600 alcanzó 0,7. A continuación las células fueron inducidas mediante la adición de rhamnosa 0,2% (pGASTON) o IPTG 0,1 mM (pET-22b), respectivamente, y al mismo tiempo la temperatura de incubación se redujo a 20ºC. Tras la inducción, se continuó con la incubación durante otras 20 h. Para seguir la expresión se extrajeron alícuotas a diversos tiempos tras la inducción.
La partícula de células (~3 g de peso húmedo) se lavó dos veces con tampón de fosfato (pH 7,5, 50 mM), que contenía PLP 0,1 mM a 4ºC. Tras disrupción (prensa francesa) la suspensión celular fue centrifugada (4000 × g, 30 min) y el sobrenadante resultante se hizo pasar a través de un filtro de 0,5 µm antes del análisis cromatográfico. La cromatografía se llevó a cabo usando un Purificador ÄKTA (GE Healthcare). El extracto celular filtrado se aplicó a una columna de 5 mL de IMAC SepharoseTM 6 Fast Flow (GE Healthcare). La columna se lavó con un caudal de 5 mL min-1 con un volumen de 10 columnas de tampón de fosfato 50 mM, pH 7,5, que contenía NaCl 300 mM, PLP 0,1 mM e imidazol 30 mM (para evitar unión inespecífica) y la actividad ATA se eluyó con 10 volúmenes de columna de tampón de fosfato (pH 7,5, 50 mM), que contenía NaCl 300 mM, PLP 0,1 mM e imidazol 300 mM (caudal de 5 mL min-1). Las fracciones que contenían actividad se agruparon y se desalinizaron mediante cromatografía en gel con un tampón de Tricina 20 mM, pH 7,5, que contenía PLP 0,01 mM. Las enzimas purificadas fueron almacenadas a 4ºC.
La cantidad de cada proteína purificada a partir de aproximadamente 3 g de células (peso húmedo) se muestra a continuación en la Tabla 4.
Tabla 4
- Entrada
- Fuente de enzimas Rendimiento de proteína tras purificación [mg]
- 1
- Aspergillus terreus 8,6
- 2
- Penicillium chrysogenum 26,2
- 3
- Aspergillus niger -
- 4
- Aspergillus oryzae 20,6
- 5
- Aspergillus fumigatus 14,8
- 6
- Neosartorya fischeri 23,3
16
- Entrada
- Fuente de enzimas Rendimiento de proteína tras purificación [mg]
- 7
- Gibberella zeae 4,8
- 8
- Hyphomonas neptunium 6,5
- 9
- Mycobacterium vanbaalenii 8,9
- 10
- Mesorhizobium loti MAFF303099 6,9
- 11
- Mesorhizobium loti 5,3
- 12
- Roseobacter sp. 27,5
- 13
- Marinomonas sp. 23,7
- 14
- Rhizobium etli 6,5
- 15
- Rhodoferax ferrireducens 7,5
- 16
- Jannaschia sp. 24,8
- 17
- Labrenzia alexandrii 12,5
- 18
- Burkholderia sp. 41,6
- 19
- Burkholderia cenocepacia -
- 20
- Proteobacteria alfa -
- 21
- Proteobacteria gamma 2,6
4.2. Caracterización de la especificidad de sustrato de ω-TA (R)-selectiva
Para determinar la actividad hacia α-metilbencil amina (α-MBA) en el escrutinio inicial de las proteínas expresadas, se usó un ensayo basado en acetofenona: se hizo reaccionar una disolución de (R)-ó (S)-α-MBA 2,5 mM y piruvato
5 en presencia de la enzima purificada y se correlacionó el incremento de la absorbancia a 245 nm con la formación de acetofenona. Las conversiones de las aminas 2-aminohexano, 4-fenil-2-aminobutano y 1-N-Boc-3aminopirrolidina fueron monitorizadas mediante un ensayo de conductividad: se hizo reaccionar una disolución que contenía la amina 10 mM y piruvato en presencia de la amina transaminasa purificada y se relacionó el descenso de la conductividad con la conversión del sustrato.
10 Para investigar la actividad DATA y BCAT se midió el descenso de NADH espectrofotométricamente a 340 nm usando ensayos acoplados de deshidrogenasa: se hizo reaccionar una disolución de ácido α-cetoglutárico 5 mM y D-alanina en presencia de la transaminasa purificada, 1 U/mL de lactato deshidrogenasa y NADH 0,5 mM para medir la actividad DATA. Se usó una disolución que contenía ácido 3-metil-2-oxobutírico 5 mM y L-glutamato, cloruro amónico 10 mM, 1 U/mL de glutamato deshidrogenasa y NADH 0,5 mM para medir la actividad BCAT.
15 Todas las reacciones se llevaron a cabo en tampón de Tricina 20 mM, pH 7,5, que contenía PLP 0,01 mM. Se ajustó el pH del tampón con 1,8-diazabiciclo[5.4.0]undec-7-eno.
Los resultados se muestran a continuación en la Tabla 5.
Tabla 5: Actividades específicas para varias sustancias.
- Sustratos
- piruvato 1 piruvato 2 piruvato 3 piruvato 4 2KG D-Ala MOB L-Glu
- Entrada
- R S R S R S R S
- 1
- 15,2 <0,001 2,91 <0,001 9,7 <0,001 0,031 <0,001 <0,001 0,003
- 2
- 1,3 <0,001 1,1 0,044 5,6 <0,001 0,264 <0,001 <0,001 <0,001
- 3
- -a) - - - - - - - - -
- 4
- 3,7 0,001 1,4 0,023 5,2 0,002 0,051 0,002 <0,001 <0,001
- 5
- 4,1 <0,001 2,4 <0,001 4,5 <0,001 0,009 <0,001 <0,001 0,005
- 6
- 4,5 <0,001 7,4 <0,001 6,0 <0,001 0,013 <0,001 <0,001 0,005
- 7
- 18,6 <0,001 19,6 <0,001 8,2 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,016
- 8
- 3,6 <0,001 3,2 0,225 20,7 <0,001 0,163 <0,001 <0,001 0,012
- 9
- 4,7 <0,001 5,6 <0,001 2,6 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,003
- 10
- 0,011 <0,001 0,003 <0,001 0,010 <0,001 0,001 <0,001 0,004 0,004
- 11
- 0,013 <0,001 0,124 <0,001 0,002 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,005
- 12
- 0,003 <0,001 0,001 <0,001 0,001 <0,001 0,001 <0,001 0,003 0,002
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- Sustratos
- piruvato 1 piruvato 2 piruvato 3 piruvato 4 2KG D-Ala MOB L-Glu
- Entrada
- R S R S R S R S
- 13
- 0,002 <0,001 0,020 <0,001 0,003 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,003
- 14
- 0,867 <0,001 0,012 <0,001 0,260 <0,001 <0,001 <0,001 0,020 0,016
- 15
- 0,056 <0,001 0,001 <0,001 0,307 <0,001 <0,001 <0,001 0,010 0,098
- 16
- 0,059 0,007 0,071 0,002 0,370 0,068 0,022 <0,001 0,062 0,020
- 17
- 0,060 0,003 0,073 0,001 0,120 0,027 0,205 0,002 0,063 0,023
- 18
- 0,017 <0,001 0,002 <0,001 1,1 0,007 <0,001 <0,001 <0,001 0,001
- 19
- -a) - - - - - - - - -
- 20
- - - - - - - - - - -
- 21
- 0,028 <0,001 0,610 0,004 0,034 <0,001 <0,001 <0,001 <0,001 0,031
1 – aminohexano, 2 – α-MBA, 3 – 4-fenil-2-aminobutano, 4 – 1-N-Boc-3-aminopirrolidina, 2KG – 2-cetoglutarato, D-Ala – D-alanina, L-Glu – L-glutamato, MOB – ácido 3-metil-2-oxobutírico. El número de entrada corresponde a la Tabla 1. Todas las medidas se realizaron al menos por duplicado. La desviación de las medidas individuales
5 respecto al valor medio fue < 10 %.
a) La medida no fue posible debido a que el rendimiento de proteína durante la expresión fue muy bajo/la proteína era inestable durante la purificación.
4.3. Síntesis asimétrica de (R)-aminas 1-4 (ver leyenda de la Tabla 5 anterior) con ω-Tas de Aspergillus Terreus, Mesorhizobium loti y Mycobacterium vanbaalenii
10 Las síntesis asimétricas se realizaron a 30ºC durante 24 horas en tampón de fosfato sódico (100 mM, pH 7) que contenía monohidrato de piridoxal-5’-fosfato PLP (1 mM) y NAD+ (1 mM) en tubos Eppendorf de 1,5 mL.
La mezcla de reacción contenía cetona 50 mM, L-alanina (5 equivalentes, 250 mM), lactato deshidrogenasa de corazón bovino (90 U), glucosa (150 mM) y glucosa deshidrogenasa (15 U). Se expresó ω-TA de Aspergillus terreus, 15 Mesorhizobium loti y Mycobacterium vanbaalenii (entrada 1, 11 y 9 de la Tabla 1) en BL21 de E. coli tal como se ha descrito anteriormente, se congelaron en alícuotas y se aplicaron directamente como biocatalizadores de célula completa sin purificación adicional. La conversión se midió mediante detección de las aminas formadas (1, cromatografía de gases (CG); 2-4 electroforesis capilar (EC)). El análisis quiral de 2-4 se llevó a cabo usando EC como se ha descrito anteriormente. El valor de exceso enantiomérico (% ee) para 1 se analizó mediante CG. Tras la 20 extracción de la amina con acetato de etilo, se realizó una derivatización a trifluoroacetamida añadiendo un exceso de 20 a 1 de anhídrido de ácido trifluoroacético. Tras purgar con nitrógeno para eliminar el exceso de anhídrido y el ácido trifluoroacético residual, el compuesto derivatizado se disolvió en acetato de etilo (50 µL) y la línea base se separó usando un Shimadzu GC14A que fue equipado con una columna de Heptakis-(2,3-di-O-acetil-6-O-tercbutildimetilsilil)-β-ciclodextrina (25 m x 0,25 mm). Los tiempos de retención fueron 16,0 minutos ((S)-1) y 16,2
25 minutos ((S)-2) con un gradiente de temperatura en el horno de 80 ºC/10 min // 20 ºC // 180 ºC/10 min.
Los resultados se presentan a continuación en la Tabla 6.
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