CN110343734A - 一种l-草铵膦化学酶法生产方法 - Google Patents

一种l-草铵膦化学酶法生产方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种L‑草铵膦化学酶法生产方法。本发明通过对来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的野生型酰胺酶基因进行突变并表达，获得了高活力、立体选择性严格的酰胺酶突变体，并利用树脂吸附制备了固定化酰胺酶。利用酰胺酶全细胞或固定化酶不对称催化N‑苯乙酰‑D,L‑草铵膦合成L‑草铵膦合成L‑草铵膦，酶反应后的N‑苯乙酰‑D‑草铵膦经一步加热消旋化可重新生成外消旋N‑苯乙酰‑D,L‑草铵膦，大幅提高了手性拆分的原子利用率，使酰胺酶催化N‑苯乙酰‑D,L‑草铵膦合成L‑草铵膦路线的理论收率达到100％，为L‑草铵膦的高效化学酶法合成奠定了基础。并通过。

Description

一种L-草铵膦化学酶法生产方法
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，特别是涉及一种L-草铵膦化学酶法生产方法。
背景技术
草铵膦是一种广谱、触杀型、灭生型、非残留的含磷氨基酸类除草剂，最早由德国赫斯特(Hoechst)公司于1986年开发上市。由于在分子结构上与谷氨酸高度相似，草铵膦可与谷氨酰胺合成酶(GS)结合，从而使植物体内氮代谢紊乱、必需氨基酸缺乏、氨过量积累，随后叶绿素解体，从而抑制光合作用导致植物最终死亡。自上市以来，因其高效、低毒、广谱和环境兼容性好等优势，草铵膦迅速成为除草甘膦和百草枯外的世界第三大除草剂。同时，草铵膦也是第二大转基因作物耐受除草剂。近年来，随着草甘膦与百草枯市场萎缩和耐除草剂转基因作物(如转基因大豆、玉米等)的大规模开发应用，草铵膦的市场规模正急剧增长。
目前，市售草铵膦均为化学法生产的外消旋草铵膦，由一对具有旋光性的对映异构体混合而成，可分为左旋体(顺式构型D)和右旋体(反式构型L)。其中，只有L-草铵膦具有除草活性。利用L-草铵膦替代外消旋草铵膦，可大幅降低草铵膦的使用量(降低50％)，减轻环境负担、提高资源利用率和降低使用成本。L-草铵膦的合成研究较多，可以分为化学法和生物法。化学法合成L-草铵膦主要有手性辅助剂诱导法、外消旋体拆分法和不对称合成法等，但均面临合成路线复杂，收率低，设备要求高且手性拆分试剂昂贵等问题，难以实现其高效、规模化生产。生物法合成L-草铵膦主要包括蛋白酶法、氨基酸脱氢酶法和转氨酶法等。然而，上述报道的生物法往往具有产物光学纯度低、分离难度大和底物耐受差等缺陷。如转氨酶催化的转氨反应存在两个L-氨基酸和两个α-酮酸的反应平衡，产物的分离难度很大(ZL201610045121.7)。
酰胺酶(酰基水解酶)是制备手性羧酸的重要工具酶，其所具有的高立体选择性、广底物谱等特性使其在动力学拆分外消旋酰胺制备复杂结构手性羧酸及光学纯氨基酸中占有重大优势。如，Variovorax paradoxus的D-酰胺酶以氨基酸酰胺为底物，可合成各种光学纯氨基酸，尤其以DL-叔亮氨酸酰胺、DL-亮氨酸酰胺和DL-缬氨酸酰胺为底物时，产物D-氨基酸的光学纯度可达99％(Adv Synth Catal,2002,344:965–973)。因此，开发L-草铵膦的酰胺酶法生产工艺，构建高立体选择性、高催化活力的酰胺酶或其突变体，对于实现L-草铵膦的绿色、高效规模化生产具有十分重要的意义。
发明内容
本发明经过实验获得了一种酰胺酶突变体，能够应用于催化N-苯乙酰-D,L-草铵膦合成L-草铵膦，立体选择性严格且催化活力高。
一种酰胺酶突变体，由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的酰胺酶基因突变所得，具体突变位点选自以下三种中的一种：(1)M44W；(2)M44W/F54Y；(3)M44W/F54Y/Y177F。优选的，所述酰胺酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ IDNo.6所示。
本发明又提供了编码所述酰胺酶突变体的基因。优选的，所述的基因，基因序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。
本发明又提供了一种包含所述基因的基因工程菌。
在本发明酰胺酶突变体的制备方法中，可以采用任何适当的载体。例如，适当的载体包括但不限于原核表达载体pET28、pET20、pGEX4T1、pTrC99A和pBV220；包括但不限于真核表达载体pPIC9K、pPICZα、pYD1和pYES2/GS；包括但不限于克隆载体pUC18/19和pBluscript-SK。在本发明制备的酰胺酶突变体的方法中，所获得的酰胺酶突变体基因可以在原核细胞或真核细胞胞内表达，也可以采用本领域已知的任何其它适当方法实现在原核细胞或真核细胞胞外表达。本发明制备酰胺酶突变体的方法中，所述载体的宿主细胞为原核生物或真核生物。所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、链霉菌。所述真核细胞包括但不限于毕赤巴斯德酵母、酿酒酵母和黑曲霉。这些突变体能以N-苯乙酰-D,L-草铵膦为底物，在室温和较高温度下高效手性生物催化合成L-草铵膦。
本发明还提供了所述酰胺酶突变体或所述基因工程菌在制备L-草铵膦中的应用。
本发明还提供了一种L-草铵膦的制备方法，包括以下步骤：以N-苯乙酰-D,L-草铵膦作为底物，使用所述酰胺酶突变体进行催化合成L-草铵膦，或使用所述基因工程菌进行共培养催化合成L-草铵膦。所述的酰胺酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是经部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用，还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的酰胺酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式的固化酶。
优选的，所述N-苯乙酰-D,L-草铵膦的制备方法包括以下步骤：(1)D,L-草铵膦使用碱液真空加热脱氨；(2)加入苯乙酰氯在0～5℃下反应生成N-苯乙酰-D,L-草铵膦；(3)降低pH去除杂质苯乙酸；(4)使用有机溶剂萃取除杂；(5)萃取除杂后的水相继续降低pH直到N-苯乙酰-D,L-草铵膦析出，收集析出产物并干燥后获得所述N-苯乙酰-D,L-草铵膦。
优选的，催化合成L-草铵膦后，所述L-草铵膦的纯化方法包括以下步骤：(1)使用离子交换层析分离提取L-草铵膦，填料选用强酸性阳离子树脂；(2)上样吸附后，使用纯水冲洗去杂质；(3)使用氨水作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱产物。所述强酸性阳离子树脂优选为强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂，比如树脂型号001×7。离子交换树脂和L-草铵膦质量比为25～100∶1，优选50∶1。进一步优选的，所述氨水的浓度为1mol/L。洗脱过程中，可以使用0.2g/L茚三酮的乙醇溶液检测L-草铵膦是否流出，若流出开始收集，收集直至茚三酮测定无色为止。
本发明L-草铵膦的制备方法中，通过二氯甲烷萃取酶反应的副产物苯乙酸，进一步通过将反应液调酸将酶反应剩余底物N-苯乙酰-D-草铵膦析出去除(可经过一步消旋化反应重新生成N-苯乙酰-D,L-草铵膦回收利用)，更进一步通过构建离子交换树脂分离L-草铵膦，减压蒸馏浓缩流出液，进而获得草铵膦溶液，该方法分离提纯得到的L-草铵膦溶液中草铵膦的浓度和纯度均较高。此外，本发明中提取方法所用原料廉价易得，且可回收利用，具有显著的工业应用前景。
优选的，使用酰胺酶突变体进行催化合成L-草铵膦时，将酰胺酶突变体制成固定化酶形式。酰胺酶突变体制成固定化酶形式的方法包括以下步骤：利用表达所述酰胺酶突变体的基因工程菌表达所述酰胺酶突变体，然后将表达后的全细胞破碎，离心获取上清液，上清液通过超滤获得酶的浓缩液，取浓缩液添加终浓度为0.5mM的Co2+后，添加与浓缩液等体积且浓度为3.0M的硫酸铵溶液，加入浓缩液1/5质量体积比的LX-1000EP(C)树脂固定6小时，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤三次，滤饼在pH 9.5、100mM的磷酸盐缓冲液中添加100mM的苯乙酸和20％的甘油，25℃保温72小时，保温后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤三次，最后滤饼在pH8.5、3.0M的甘氨酸溶液中，25℃保温24小时，获得固定化酶。
催化反应完成后，对产物进行消旋处理，消旋处理方法为：将苯乙酸加热至170℃，然后加入产物混合，降温至150℃后保温5min，再降温至145℃保持15min后结束反应，获得所述L-草铵膦。
本发明通过对来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的野生型酰胺酶基因进行突变并表达，经筛选获得了高活力、立体选择性严格的酰胺酶突变体，显著提高了在催化N-苯乙酰-D,L-草铵膦合成L-草铵膦中的能力，最高可以达到野生型酰胺酶活性的5.2倍。
本发明利用酰胺酶高立体选择性催化N-苯乙酰-D,L-草铵膦合成L-草铵膦，反应剩余的N-苯乙酰-D-草铵膦可通过加热消旋重新生成外消旋N-苯乙酰-D,L-草铵膦，大幅提高手性拆分的原子利用率，使反应的理论收率达到100％，为L-草铵膦的高效化学酶法合成奠定了基础。
附图说明
图1为D,L-草铵膦酰基取代底物分子式示意图，其中，a～e分别用于合成不同的D,L-草铵膦酰基取代物。
图2为酰胺酶法催化N-苯乙酰-D,L-草铵膦合成L-草铵膦中的反应式示意图。
图3为酶催化底物N-苯乙酰-D,L-草铵膦的液质分析结果图。
图4为酶催化底物N-苯乙酰-D,L-草铵膦的电喷雾质谱检测结果图。
图5为酶催化底物N-苯乙酰-D,L-草铵膦的红外光谱检测结果图。
图6为酶催化产物L-草铵膦衍生化后的液质图。
具体实施方式
实施例1
D,L-草铵膦酰基取代物的合成。
以N-苯乙酰-D,L-草铵膦的合成方法为例：于装有搅拌、温度计的1000mL四口烧瓶中加入4M的NaOH溶液500mL，104.2g 95％草铵膦(0.5mol)搅拌至全部溶解。转移滤液至1L单口烧瓶中。使用旋转蒸发仪将单口烧瓶内真空度提高至0.095MPa以上，升温，脱出反应体系的氨气，当脱去水约50mL时即为终点。并补加50mL水。
将单口瓶内液体转移至四口瓶内，并转移至制冷机，降温至0℃，滴加94.6g 98％苯乙酰氯(0.6mol)，滴加时间为1-1.5小时，控制温度为0-5℃，滴加完毕后，直接补加16gNaOH固体(0.4mol)，降温至0-4℃，继续滴加31.5g 98％苯乙酰氯(0.4mol)，滴加完毕，搅拌1小时反应完毕。
反应完成后，在0-4℃的条件下滴加浓盐酸，控制温度0-4℃，调节至pH 4.0(pH计控制)，调节完毕升温至25±2℃，加入300mL二氯甲烷，搅拌30min，转移反应液至2L分液漏斗中，静置1小时分层。水层转至原四口瓶中，再次加入300mL二氯甲烷，搅拌30min，转移反应液至2L分液漏斗中，静置1小时分层。水层转至原四口烧瓶中，滴加盐酸调节pH 2.5(pH计控制)，低温0℃缓慢搅拌3小时，析出白色粉末状晶体，抽滤，得到滤饼并于50℃烘干。滤液转移至1L单口烧瓶中，改为蒸馏装置，真空0.095MPa以上，升温至50℃脱水，脱水量为滤液重量的一半。脱水完毕后，降温至0℃，滴加盐酸调节pH 2.5，缓慢搅拌3小时，抽滤，得到滤饼并于50℃烘干。分别对所得产物进行了液质分析、电喷雾质谱以及红外光谱检测，检测结果表明，为N-苯乙酰-D,L-草铵膦。底物的结构鉴定结果如下，图谱见图3、图4和图5。
LR-ESI/MS：m/z calcd for C13H17NO5P[M-H]-:298.1；found:297.8；FTIR(KBr)νmax/cm-1:3270.6 3086.5 2926.4 1736.8 1598.0 1560.5 1498.2 1448.4 1346.01311.4 1268.5 1200.3 1175.5 1137.6 1101.4 1050.7 1031.0 967.0 930.9 888.7802.7 774.2 736.7 684.5 542.4 478.5 414.7.。
D,L-草铵膦酰基取代物的合成结果见表1所示。表1中多种D,L-草铵膦酰基取代物的合成中，除D,L-2e制备方法为在反应液脱水后至无水乙醇中重结晶外，其余制备方法同上，当然所使用的取代底物分子各有区别，具体见图1。
表1 D,L-草铵膦酰基取代物合成结果
实施例2
重组酰胺酶Bm-Ami突变体的构建。
以报道的具有高立体选择性的酰胺酶氨基酸序列为探针，根据序列同源性在Genbank中搜索潜在的酰胺酶序列。结合酰胺酶标签序列中的特征结构、保守序列及催化三联体，筛选来源于巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的酰胺酶基因Bm-ami(AF161313.1)进行人工合成。将合成的基因与表达载体pET-28a(Novagen company)连接，构建了含有酰胺酶基因的表达重组质粒pET28-Bm-ami，转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)。经DNA测序证实，确定了该被克隆的亲本酰胺酶的核苷酸序列与NCBI报道的相同。
为了将Bm-Ami第44位点的甲硫氨酸(M)进行定点突变，设计引物M44F和M44R(见表2)，以质粒pET28-Bm-ami为模板，进行全质粒扩增。PCR扩增体系为：5×Buffer 10μl，dNTP(每种2.5mM)2μl，突变引物各0.5μl，质粒pET28-Bm-ami 0.5μl，PrimeSTAR DNA聚合酶0.5μl，补水至50μl。PCR条件为98℃预变性2min，25个循环：98℃10s，65℃10s，72℃6min，最后72℃10min。取PCR产物20μl，加入1μl DpnⅠ，37℃酶切3h后转化感受态细胞E.coli BL21(DE3)，涂布含卡那霉素(50mg/L)的LB平板。挑取单菌落于LB培养基中培养至OD600约为0.6，加入0.1mM IPTG(异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷)，28℃诱导12h。以N-苯乙酰-D,L-草铵膦为底物，以突变前的工程菌细胞为参照，筛选活力提高的阳性克隆。M44W的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。
54位点的饱和突变在M44W基础上进行，操作步骤同上，设计引物F54F和F54R见表2。M44W/F54Y的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示。
177位点的饱和突变在M44W/F54Y基础上进行，操作步骤同上，设计引物Y177F和Y177R见表2。M44W/F54Y/Y177F的核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列为SEQ IDNO.6所示。
表2饱和突变引物
实施例3
亲本酰胺酶和酰胺酶突变体工程菌的活力鉴定。
将出发菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-Bm-ami、突变菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-A381T、E.coli BL21(DE3)/pET28-A381T/L404T和E.coli BL21(DE3)/pET28-A381T/L404T分别接种到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中37℃培养12h，再以1％接种量(v/v)接种到新鲜的含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，培养至菌体浓度OD600约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.1mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，4℃、8000g离心10min，收集含有重组酰胺酶的菌体细胞。
反应体系组成：100mM外消旋N-苯乙酰-D,L-草铵膦，Tris-HCl(pH 8.5，100mM)和一定量的细胞，30℃、150r/min反应0.5h，取1mL至于已加入50μl、6.0M NaOH溶液的EP管中并煮沸10min终止反应。在12000rpm条件下离心10min，取上清液，用HPLC检测。底物N-苯乙酰-D,L-草铵膦HPLC检测条件为：色谱柱：Hypersil ODS2-C18柱(4.6mm×250mm，5μm，Elite，China)；流动相：甲醇：水＝40：60(v/v)(磷酸调pH至2.8)；检测条件：流速0.6mL/min；波长：230nm，进样量5μL；柱温为35℃。产物L-草铵膦HPLC检测条件为：色谱柱为C-18column(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇：0.05mol/L乙酸铵溶液＝10：90)流速为1mL/min，紫外检测波长215nm，柱温35℃。衍生化试剂配制：分别称取等量的衍生化试剂邻苯二甲醛(OPA)与N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)(0.015M)混合，无水乙醇溶解，加入配制好的硼酸缓冲液(20mM pH＝9.8)定容后置于4℃保存。衍生化反应体系：200μl样品溶液(L-草胺膦<2.0g/L)与400μl衍生化试剂常温下混合，振荡5min。酶活定义(1U)：在30℃，pH 8.5条件下，每分钟催化N-苯乙酰-D,L-草胺膦生成1μmol L-草胺膦所需的酶量，即为1个酶活力单位。下表3显示酰胺酶突变体与亲本酰胺酶的比活性之差异。
表3酰胺酶突变体与亲本酰胺酶比活性的比较
酶的名称 氨基酸序列的序列号 比活力(U/g CDW) 相对活力(％)
亲本 SEQ ID NO.2 3.2 100
突变体M44W SEQ ID NO.4 4.84 151.3
突变体M44W/F54Y SEQ ID NO.6 7.56 236.3
突变体M44W/F54Y/Y177F SEQ ID NO.8 16.64 520
实施例4
将实施例3中获得的突变体全细胞破碎，得到的上清液通过0.2μm微滤膜，滤液再通过超滤膜(10KD)，收集浓缩液，浓缩液酶活为470U/mL。取50mL浓缩液添加Co2+至终浓度为0.5mM，与50mL，pH7.0，3.0M的硫酸铵溶液混合，加入10g LX-1000EP(C)树脂，250rpm的转速固定6小时，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤三次，滤饼在pH9.5，100mM的磷酸盐缓冲液中添加100mM的苯乙酸和20％的甘油，25℃保温72小时。保温后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤三次。最后滤饼在pH 8.5，3.0M的甘氨酸溶液中，25℃保温24小时，获得固定化酶。最终测得固定化酶的酶活回收率为40.8％。
实施例5
突变体全细胞在催化N-苯乙酰-D,L-草铵膦合成L-草铵膦中的应用(反应式见图2)。
转化体系组成及转化操作如下：底物N-苯乙酰-D,L-草铵膦添加量为110g/L，突变体湿细胞(见实施例3)添加量为5％(W/V)，反应温度控制在25-40℃，通过反应过程中滴加氨水的方式控制反应液的pH值7.0-8.5(优选8.0)，期间用高效液相色谱检测，直至反应终点；反应结束后转化率>49.9％，e.e.>98％(酶催化产物L-草铵膦衍生化后的液质图见图6)。离心后抽滤，除去大肠杆菌细胞，收集含L-草铵膦、苯乙酸和N-苯乙酰-D-草铵膦的反应液。
实施例6
固定化酶在催化N-苯乙酰-D,L-草铵膦合成L-草铵膦中的应用。
转化体系组成及转化操作如下：底物N-苯乙酰-D,L-草铵膦添加量为110g/L，固定化酶(见实施例4)添加量为底物质量的1/6，反应温度控制在25-40℃，通过反应过程中滴加氨水的方式控制反应液的pH值7.0-8.5(优选8.0)，期间用高效液相色谱检测，直至反应终点；反应结束后转化率>49.9％，e.e.>98％。酶反应结束后抽滤，分离固定化酶，收集含L-草铵膦、苯乙酸和N-苯乙酰-D-草铵膦的反应液。
实施例7
N-苯乙酰-D-草铵膦的回收和消旋化。
将实施例5获得的反应液减压蒸馏，至原体积一半后用浓盐酸调至pH 4.0，加入1/3反应液体积的二氯甲烷，搅拌0.5h后静置分层；取上层水相用浓盐酸调至pH 4.0，重复上述萃取一次；取萃取两次后的水相，用浓盐酸调至pH 2.0，搅拌1h后抽滤，所得滤液即含L-草铵膦的粗提取液，滤饼(N-苯乙酰-D-草铵膦)冲洗后可用于消旋反应。N-苯乙酰-D-草铵膦收率为94％。
在250ml三口烧瓶中加入17g苯乙酸，加热至170℃，然后加入29.6g N-苯乙酰-D-草铵膦，使混合物快速降温至150℃后保温5min，再降温至145℃保持15min后结束反应，反应液冷却后加氨水溶解，再利用二氯甲烷萃取除去苯乙酸，最后调节pH＝2，得到N-苯乙酰-D,L-草铵膦晶体。利用旋光仪进行检测，检测得到旋光度为0，即N-苯乙酰-D-草铵膦完全消旋；利用高效液相色谱对消旋前后样品进行检测，消旋收率为96％。
实施例8
离子交换层析分离提取L-草铵膦。
1)强酸性阳离子树脂(树脂型号001×7)活化方法如表4所示。
表4强酸性阳离子树脂活化方法
2)柱分离
装柱：向柱内注入约2/3柱体积的纯水，将预处理好的强酸性阳离子交换树脂缓慢填入柱子内，填入一定高度，装柱完成。强酸性阳离子交换树脂与吸附草铵膦的关系：强酸性阳离子交换树脂:吸附的草铵膦＝50∶1(质量比)。
L-草铵膦洗脱收集：L-草铵膦上柱完成后，用4倍柱体积的纯水冲洗4h，然后再用2倍柱体积氨水洗脱，当氨水洗脱约1倍柱体积时，用0.2g/L茚三酮的乙醇溶液检测草铵膦是否流出，若流出开始收集，收集直至茚三酮测定无色为止。
L-草铵膦浓缩：收集的L-草铵膦溶液，称重取样，HPLC分析L-草铵膦的含量，用旋蒸脱水至L-草铵膦的含量约为15％～50％。
序列表
<110> 浙江工业大学
<120> 一种L-草铵膦化学酶法生产方法
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2406
<212> DNA
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 1
atgaagatga agtggctaat atcagtcata atcctatttg ttttcatttt tcctcaaaat 60
ctagtttttg ctggggagga taagaatgaa ggggtcaaag tagtacgtga taattttgga 120
gtaccccatt tatacgctaa aaataaaaaa gatttatatg aagcgtatgg atatgttatg 180
gcaaaggatc gactatttca gttggagatg ttccgtcgcg gaaatgaggg gaccgtttca 240
gaaatttttg gagaggatta tctttcaaaa gatgagcaat ccagaagaga tggatatagt 300
aataaagaaa ttaaaaaaat gattgacggt ctggatcgtc agccaaaaga attaatagca 360
aaatttgctg aaggtatttc acgttatgta aatgaagctt taaaagatcc agatgataaa 420
ctttcgaagg agtttcatga atatcagttt ttaccgcaaa aatggacttc aacagatgtt 480
gtccgtgttt atatggtatc catgacgtat tttatggata atcaccagga gttaaaaaac 540
gcagagatac ttgcaaagct agaacatgaa tatgggacag aagtttcccg gaaaatgttt 600
gatgatttag tgtggaaaaa tgatcctagc gctcctacaa gcattgtaag cgaggggaaa 660
ccaaaaaggg aatcgtcatc tcaatccctt caaaaactgt cttcagctgt aatcaaagct 720
tctgaaaaag ttggaaagga aagggagaat tttgtccaat cgtctgaaga acttggatta 780
ccgttaaaga taggcagtaa tgccgccata gtcggttccg agaaatccgc aacaggaaat 840
gctttattat tcagtggacc acaagtaggt tttgttgctc ctggattttt gtacgaggta 900
ggtttgcatg cgccaggttt cgatgtcgaa ggttcaggtt tcataggcta tcctttcatc 960
atgttcggag ccaacaatca ctttgctcta agtgcgacag ctgggtacgg aaatgtaacc 1020
gatatctttg aggaaaaatt gaatacgaaa aactcttccc agtatttata caaagggaag 1080
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acaaataaag tggcttacag taagtcgtgg tctttccgtg gaactgaggc ccaaagcatg 1260
tcggcttaca tgaaagcgaa ttgggcaaaa aacttaaaag aatttgagaa tgcagctagt 1320
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catgtaggaa gatatccagt tagaaacaac aaaattgatg aaagaatccc tacaccagga 1440
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gaatatagtt attattgggg tgaggataat cgagtccaac aatatatcaa tgggatggaa 1620
gcgagaggga aagttacatt agaagatatt aatgaaatta attatacggc aagctttgca 1680
cagcttcgag caaacctctt taaaccgtta ttaattgatg tgttggacaa gaataaatca 1740
accaacggga actacgccta tttaattgaa aaactggaag aatggaataa tctaaaagaa 1800
gacgaaaata aagatggata ttatgatgca gggattgcgg cattctttga tgaatggtgg 1860
aataatctcc atgataaact ctttatggat gaattgggag acttctatgg aataacgaaa 1920
gaaattaccg atcatcgtta tggggcttca ttagcatata aaatattaag caaggaatct 1980
acaaactata aatgggtgaa cgtagaccag gaaaaaataa taatggaaag cacaaatgaa 2040
gtacttgcta aattgcaatc agaaaaaggg ttaaaagcag aaaaatggcg tatgcctata 2100
aaaacgatga cttttggtga aaaatcattg attggtattc cccacgggta tggctcaatg 2160
actccaatta ttgaaatgaa tcgtggaagt gaaaatcatt atattgaaat gactccgaaa 2220
gggccgagtg gctttaacat cacaccacct ggtcaaattg gatttgtaaa aaaagatgga 2280
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agtaag 2406
<210> 2
<211> 802
<212> PRT
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 2
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Phe Pro Gln Asn Leu Val Phe Ala Gly Glu Asp Lys Asn Glu Gly Val
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Lys Val Val Arg Asp Asn Phe Gly Val Pro His Leu Tyr Ala Lys Asn
35 40 45
Lys Lys Asp Leu Tyr Glu Ala Tyr Gly Tyr Val Met Ala Lys Asp Arg
50 55 60
Leu Phe Gln Leu Glu Met Phe Arg Arg Gly Asn Glu Gly Thr Val Ser
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Asp Gly Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Lys Lys Met Ile Asp Gly Leu Asp
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Tyr Val Asn Glu Ala Leu Lys Asp Pro Asp Asp Lys Leu Ser Lys Glu
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Glu Leu Lys Asn Ala Glu Ile Leu Ala Lys Leu Glu His Glu Tyr Gly
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<211> 802
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accaacggga actacgccta tttaattgaa aaactggaag aatggaataa tctaaaagaa 1800
gacgaaaata aagatggata ttatgatgca gggattgcgg cattctttga tgaatggtgg 1860
aataatctcc atgataaact ctttatggat gaattgggag acttctatgg aataacgaaa 1920
gaaattaccg atcatcgtta tggggcttca ttagcatata aaatattaag caaggaatct 1980
acaaactata aatgggtgaa cgtagaccag gaaaaaataa taatggaaag cacaaatgaa 2040
gtacttgcta aattgcaatc agaaaaaggg ttaaaagcag aaaaatggcg tatgcctata 2100
aaaacgatga cttttggtga aaaatcattg attggtattc cccacgggta tggctcaatg 2160
actccaatta ttgaaatgaa tcgtggaagt gaaaatcatt atattgaaat gactccgaaa 2220
gggccgagtg gctttaacat cacaccacct ggtcaaattg gatttgtaaa aaaagatgga 2280
acgataagtg accactatga tgaccaacta gttatgttcg ccgaatggaa attcaagcca 2340
tacttattta acaagaaaga tatttataaa tcagctaaaa atgtaagcgc attaaatatg 2400
agtaag 2406
<210> 6
<211> 802
<212> PRT
<213> 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)
<400> 6
Met Lys Met Lys Trp Leu Ile Ser Val Ile Ile Leu Phe Val Phe Ile
1 5 10 15
Phe Pro Gln Asn Leu Val Phe Ala Gly Glu Asp Lys Asn Glu Gly Val
20 25 30
Lys Val Val Arg Asp Asn Phe Gly Val Pro His Leu Tyr Ala Lys Asn
35 40 45
Lys Lys Asp Leu Tyr Glu Ala Tyr Gly Tyr Val Met Ala Lys Asp Arg
50 55 60
Leu Phe Gln Leu Glu Met Phe Arg Arg Gly Asn Glu Gly Thr Val Ser
65 70 75 80
Glu Ile Phe Gly Glu Asp Tyr Leu Ser Lys Asp Glu Gln Ser Arg Arg
85 90 95
Asp Gly Tyr Ser Asn Lys Glu Ile Lys Lys Met Ile Asp Gly Leu Asp
100 105 110
Arg Gln Pro Lys Glu Leu Ile Ala Lys Phe Ala Glu Gly Ile Ser Arg
115 120 125
Tyr Val Asn Glu Ala Leu Lys Asp Pro Asp Asp Lys Leu Ser Lys Glu
130 135 140
Phe His Glu Tyr Gln Phe Leu Pro Gln Lys Trp Thr Ser Thr Asp Val
145 150 155 160
Val Arg Val Tyr Met Val Ser Met Thr Tyr Phe Met Asp Asn His Gln
165 170 175
Glu Leu Lys Asn Ala Glu Ile Leu Ala Lys Leu Glu His Glu Tyr Gly
180 185 190
Thr Glu Val Ser Arg Lys Met Phe Asp Asp Leu Val Trp Lys Asn Asp
195 200 205
Pro Ser Ala Pro Thr Ser Ile Val Ser Glu Gly Lys Pro Lys Arg Glu
210 215 220
Ser Ser Ser Gln Ser Leu Gln Lys Leu Ser Ser Ala Val Ile Lys Ala
225 230 235 240
Ser Glu Lys Val Gly Lys Glu Arg Glu Asn Phe Val Gln Ser Ser Glu
245 250 255
Glu Leu Gly Leu Pro Leu Lys Ile Gly Ser Asn Ala Ala Ile Val Gly
260 265 270
Ser Glu Lys Ser Ala Thr Gly Asn Ala Leu Leu Phe Ser Gly Pro Gln
275 280 285
Val Gly Phe Val Ala Pro Gly Phe Leu Tyr Glu Val Gly Leu His Ala
290 295 300
Pro Gly Phe Asp Val Glu Gly Ser Gly Phe Ile Gly Tyr Pro Tyr Ile
305 310 315 320
Met Phe Gly Ala Asn Asn His Phe Ala Leu Ser Ala Thr Ala Gly Tyr
325 330 335
Gly Asn Val Thr Asp Ile Phe Glu Glu Lys Leu Asn Thr Lys Asn Ser
340 345 350
Ser Gln Tyr Leu Tyr Lys Gly Lys Trp Arg Asp Met Glu Lys Arg Lys
355 360 365
Glu Ser Phe Thr Val Lys Gly Asp Asn Gly Glu Lys Lys Thr Val Glu
370 375 380
Lys Ile Tyr Tyr Arg Thr Val His Gly Pro Val Ile Ser Arg Asp Glu
385 390 395 400
Thr Asn Lys Val Ala Tyr Ser Lys Ser Trp Ser Phe Arg Gly Thr Glu
405 410 415
Ala Gln Ser Met Ser Ala Tyr Met Lys Ala Asn Trp Ala Lys Asn Leu
420 425 430
Lys Glu Phe Glu Asn Ala Ala Ser Glu Phe Thr Met Ser Leu Asn Trp
435 440 445
Tyr Tyr Ala Asp Lys Lys Gly Asp Ile Ala Tyr Tyr His Val Gly Arg
450 455 460
Tyr Pro Val Arg Asn Asn Lys Ile Asp Glu Arg Ile Pro Thr Pro Gly
465 470 475 480
Thr Gly Glu Tyr Glu Trp Lys Gly Phe Ile Pro Phe Lys Glu Asn Pro
485 490 495
His Val Ile Asn Pro Lys Asn Gly Tyr Val Val Asn Trp Asn Asn Lys
500 505 510
Pro Ser Lys Glu Trp Val Asn Gly Glu Tyr Ser Tyr Tyr Trp Gly Glu
515 520 525
Asp Asn Arg Val Gln Gln Tyr Ile Asn Gly Met Glu Ala Arg Gly Lys
530 535 540
Val Thr Leu Glu Asp Ile Asn Glu Ile Asn Tyr Thr Ala Ser Phe Ala
545 550 555 560
Gln Leu Arg Ala Asn Leu Phe Lys Pro Leu Leu Ile Asp Val Leu Asp
565 570 575
Lys Asn Lys Ser Thr Asn Gly Asn Tyr Ala Tyr Leu Ile Glu Lys Leu
580 585 590
Glu Glu Trp Asn Asn Leu Lys Glu Asp Glu Asn Lys Asp Gly Tyr Tyr
595 600 605
Asp Ala Gly Ile Ala Ala Phe Phe Asp Glu Trp Trp Asn Asn Leu His
610 615 620
Asp Lys Leu Phe Met Asp Glu Leu Gly Asp Phe Tyr Gly Ile Thr Lys
625 630 635 640
Glu Ile Thr Asp His Arg Tyr Gly Ala Ser Leu Ala Tyr Lys Ile Leu
645 650 655
Ser Lys Glu Ser Thr Asn Tyr Lys Trp Val Asn Val Asp Gln Glu Lys
660 665 670
Ile Ile Met Glu Ser Thr Asn Glu Val Leu Ala Lys Leu Gln Ser Glu
675 680 685
Lys Gly Leu Lys Ala Glu Lys Trp Arg Met Pro Ile Lys Thr Met Thr
690 695 700
Phe Gly Glu Lys Ser Leu Ile Gly Ile Pro His Gly Tyr Gly Ser Met
705 710 715 720
Thr Pro Ile Ile Glu Met Asn Arg Gly Ser Glu Asn His Tyr Ile Glu
725 730 735
Met Thr Pro Lys Gly Pro Ser Gly Phe Asn Ile Thr Pro Pro Gly Gln
740 745 750
Ile Gly Phe Val Lys Lys Asp Gly Thr Ile Ser Asp His Tyr Asp Asp
755 760 765
Gln Leu Val Met Phe Ala Glu Trp Lys Phe Lys Pro Tyr Leu Phe Asn
770 775 780
Lys Lys Asp Ile Tyr Lys Ser Ala Lys Asn Val Ser Ala Leu Asn Met
785 790 795 800
Ser Lys
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> y is c or t
<400> 7
gcagctagtg aattyacgat gtctttg 27
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> r is a or g
<400> 8
caaagacatc gtraattcac tagctgc 27
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> y is c or t
<400> 9
ggctatcctt ayatcatgtt cgg 23
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> r is a or g
<400> 10
ccgaacatga trtaaggata gcc 23
<210> 11
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> y is c or t
<400> 11
gccaggtttc gatgtygaag gttcagg 27
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)..(12)
<223> r is a or g
<400> 12
cctgaacctt cracatcgaa acctggc 27

Claims (9)

1.一种L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，包括以下步骤：以N-苯乙酰-D,L-草铵膦作为底物，使用酰胺酶突变体进行催化合成L-草铵膦，或使用能够表达所述酰胺酶突变体的基因工程菌全菌进行共培养催化合成L-草铵膦，
其中，所述酰胺酶突变体由巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的酰胺酶基因突变所得，具体突变位点选自以下三种中的一种：
(1)M44W；
(2)M44W/F54Y；
(3)M44W/F54Y/Y177F。
2.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，所述的酰胺酶突变体，氨基酸序列如SEQ ID No.2、SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示。
3.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，编码所述酰胺酶突变体的基因，基因序列如SEQ ID No.1、SEQ ID No.3或SEQ ID No.5所示。
4.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，所述N-苯乙酰-D,L-草铵膦的制备方法包括以下步骤：
(1)D,L-草铵膦使用碱液真空加热脱氨；
(2)加入苯乙酰氯在0～5℃下反应生成N-苯乙酰-D,L-草铵膦；
(3)降低pH去除杂质苯乙酸；
(4)使用有机溶剂萃取除杂；
(5)萃取除杂后的水相继续降低pH直到N-苯乙酰-D,L-草铵膦析出，收集析出产物并干燥后获得所述N-苯乙酰-D,L-草铵膦。
5.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，催化合成L-草铵膦后，所述L-草铵膦的纯化方法包括以下步骤：
(1)使用离子交换层析分离提取L-草铵膦，填料选用强酸性阳离子树脂；
(2)上样吸附后，使用纯水冲洗去杂质；
(3)使用氨水作为洗脱液进行洗脱，收集洗脱产物。
6.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，所述氨水的浓度为1mol/L。
7.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，使用酰胺酶突变体进行催化合成L-草铵膦时，将酰胺酶突变体制成固定化酶形式。
8.如权利要求7所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，酰胺酶突变体制成固定化酶形式的方法包括以下步骤：利用表达所述酰胺酶突变体的基因工程菌表达所述酰胺酶突变体，然后将表达后的全细胞破碎，离心获取上清液，上清液通过超滤获得酶的浓缩液，取浓缩液添加终浓度为0.5mM的Co2+后，添加与浓缩液等体积且浓度为3.0M的硫酸铵溶液，加入浓缩液1/5质量体积比的LX-1000EP(C)树脂固定6小时，抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤三次，滤饼在pH9.5、100mM的磷酸盐缓冲液中添加100mM的苯乙酸和20％的甘油，25℃保温72小时，保温后抽滤，滤饼用蒸馏水洗涤三次，最后滤饼在pH8.5、3.0M的甘氨酸溶液中，25℃保温24小时，获得固定化酶。
9.如权利要求1所述的L-草铵膦化学酶法生产方法，其特征在于，催化反应完成后，对产物进行消旋处理，消旋处理方法为：将苯乙酸加热至170℃，然后加入产物混合，降温至150℃后保温5min，再降温至145℃保持15min后结束反应，获得所述L-草铵膦。
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