CN105647950A - 一种提高维生素b12产量重组菌的构建方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高维生素B12产量重组菌的构建方法及其应用，本发明提供的方法，为1)或2)：1)所示的方法，包括如下步骤：将至少如下18个酶的编码基因或如下18个酶的编码基因中任意一个或多个的组合共同导入目的菌A中，得到重组菌A；2)所示的方法，包括如下步骤：将至少如下13个酶的编码基因或如下13个酶的编码基因中任意一个或多个的组合共同导入目的菌B中，得到重组菌B。本发明将13或18种维生素B12合成所需要的基因导入宿主菌中，通过摇瓶实验可以检测到各种重组菌中维生素B12的产量均得到了各种不同程度的提高，各种重组菌维生素B12的产量范围为44mg/L-400mg/L。

Description

一种提高维生素B12产量重组菌的构建方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种提高维生素B12产量重组菌的构建方法及其应用。

背景技术

利用代谢工程技术改造微生物已成为一种行之有效的方法来生产化学产品。维生素B12,又称钴胺素(cyanocobalamin)，是一种含有钴的咕啉类有机化合物,分子式C₆₃H₈₈CoN₁₄O₁₄P。维生素B12是人体组织代谢过程中所必需的维生素,是人和其它哺乳动物维持生长和促进红细胞生长的重要因子,在临床上用于治疗恶性贫血和恢复造血功能等。由于维生素B12的结构极为复杂,其化学合成高度繁琐昂贵,从肝脏等动物组织提取的效率和效益也十分低下,所以只能通过微生物发酵法来实现商业化生产。但是由于其代谢途径复杂，因此至今没有报道能对维生素B12的整个代谢途径进行调控。

发明内容

本发明的一个目的是提供构建重组菌的方法。

本发明提供一种构建重组菌的方法，为1)或2)：

1)所示的方法，包括如下步骤：将至少如下18个酶的编码基因或如下18个酶的编码基因中任意一个或多个的组合共同导入目的菌A中，得到重组菌A；

所述18个酶的编码基因为：前咕啉3B合成酶的编码基因(cobG基因)、前咕啉3B甲基转移酶的编码基因(cobJ基因)、前咕啉4甲基转移酶的编码基因(cobM基因)、前咕啉6A合成酶的编码基因(cobF基因)、前咕啉6A还原酶的编码基因(cobK基因)、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因(cobL基因)、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因(cobH基因)、钴啉酸a,c-二酰胺合成酶的编码基因(cobB基因)、钴离子螯合酶N的编码基因(cobN基因)、钴离子螯合酶S的编码基因(cobS基因)、钴离子螯合酶T的编码基因(cobT基因)、二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的编码基因(cobR基因)、5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因(hem1基因)、氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因(hemB基因)、胆色素原脱氨酶的编码基因(hemC基因)、尿卟啉原合成酶的编码基因(hemD基因)、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因(cobA基因)和前咕啉2甲基转移酶的编码基因(cobI基因)；

所述目的菌A为不表达如下5个基因的菌：氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素原脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因和前咕啉2甲基转移酶的编码基因；

2)所示的方法，包括如下步骤：将至少如下13个酶的编码基因或如下13个酶的编码基因中任意一个或多个的组合共同导入目的菌B中，得到重组菌B；

所述13个酶的编码基因为：前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、钴啉酸a,c-二酰胺合成酶的编码基因、钴离子螯合酶N的编码基因、钴离子螯合酶S的编码基因、钴离子螯合酶T的编码基因、二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的编码基因和5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因；

所述目的菌B为表达如下5个基因的菌：氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素原脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因和前咕啉2甲基转移酶的编码基因。

上述方法中，

所述前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、钴啉酸a,c-二酰胺合成酶的编码基因、钴离子螯合酶N的编码基因、钴离子螯合酶S的编码基因、钴离子螯合酶T的编码基因和二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的编码基因共12个基因通过重组表达载体甲导入所述目的菌A或所述目的菌B中；

所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因通过重组表达载体乙导入所述目的菌A中或通过重组表达载体丙导入所述目的菌B；

所述氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素原脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因和前咕啉2甲基转移酶的编码基因共5个基因通过重组表达载体丁导入所述目的菌A中。

所述重组表达载体甲(pVB12)为将含有所述12个基因的DNA分子插入表达载体(命名为甲，为穿梭载体pRS424)，得到重组载体；所述插入方式为同源重组；

其中同源重组上游同源臂为序列1自5’末端第1-19位核苷酸，同源重组下游同源臂为序列1自5’末端第17565-17604位核苷酸。

所述含有所述12个基因的DNA分子包括由所述前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶的编码基因组成的融合DNA片段融合DNA片段甲、驱动所述融合DNA片段甲表达的T7启动子、由前咕啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因的DNA片段组成的融合DNA片段乙、驱动所述融合DNA片段乙表达的T7启动子、由钴啉酸a,c-二酰胺合成酶的编码基因、所述前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、所述钴离子螯合酶N的编码基因组成的融合DNA片段丙、驱动所述融合DNA片段丙表达的gltA启动子、由所述钴离子螯合酶S的编码基因、所述钴离子螯合酶T的编码基因和所述二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的编码基因组成的融合DNA片段丁、驱动所述融合DNA片段丁表达的gltA启动子；

所述重组表达载体乙(pLTTC402)为将所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因插入表达载体(命名为乙，为pET28a)中得到的载体；

所述重组表达载体丙(pLTTC405)为重组表达载体乙基因组上的KanR基因替换为CmR基因，且将所述T7RNA聚合酶基因插入所述重组表达载体乙中，得到的载体；

所述重组表达载体丁(pUKBCDAI)为将含有所述5个基因的DNA分子插入表达载体(命名为丁，为pUKFRT)中得到的重组载体。

上述方法中，

所述含有所述12个基因的DNA分子的核苷酸序列具体为序列1；

所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2；

所述含有所述5个基因的DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列3。

上述方法中，

所述目的菌A为大肠杆菌、大肠杆菌突变菌、嗜盐单胞菌、罗氏真养杆菌或气生单胞菌；

所述目的菌B为假单胞菌或粘着剑菌。

上述方法中，

所述大肠杆菌突变菌为将大肠杆菌E.coliBL21DE3基因组上T7RNA聚合酶氨基酸序列第756位的R替换为S，得到的突变菌；

由上述的方法制备的重组菌A或重组菌B也是本发明保护的范围。

上述的重组菌A在制备维生素B12或制备维生素B12的卟啉前体物质中的应用也是本发明保护的范围；

或上述的重组菌B提高维生素B12中的应用也是本发明保护的范围。

本发明另一个目的是提供一种制备维生素B12或维生素B12的卟啉前体物质的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌A；

本发明第三个目的是提供一种制备维生素B12或提高维生素B12的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵上述的重组菌B。

上述发酵条件如下：

将重组菌A接种在LBG维生素B12发酵培养基中，至其初始浓度OD600为0.1，37℃，250rpm(旋转半径为50mm)，摇瓶培养168小时；

将重组菌B接种在工业发酵培养基中，至其初始浓度为OD600为0.1，37℃，250rpm(旋转半径为50mm)，摇瓶培养168小时；

不同目的菌发酵条件不同，具体见实施例。

本发明中使用过宿主在本发明中，所述的编码维生素B12的合成基因如hemB,hemC,hemD,cobA,cobI,cobG,cobJ,cobM,cobF,cobK,cobL,cobH,cob,cobNST,cobR,hem1等，可以是野生的基因，也可以是人工合成的核苷酸序列，编码基因的密码子可以按照不同的宿主的偏好进行优化。

本发明的实验证明，本发明将13种维生素B12合成所需要的基因通过电击转化法、化学转化法或氯化锂转化法导入宿主菌中，通过摇瓶实验可以检测到各种重组菌中维生素B12的产量均得到了各种不同程度的提高，各种重组菌维生素B12的产量范围为44mg/L-400mg/L。

附图说明

图1为葡萄糖转化为维生素B12的转化关系

左边的通路代表细菌自身含有的糖酵解和TCA循环通路；

其中，hem1：5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因；hemB：氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因；hemC：胆色素原脱氨酶的编码基因；hemD：尿卟啉原合成酶的编码基因；cobA：尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因；cobI：前咕啉2甲基转移酶的编码基因；cobG：前咕啉3B合成酶的编码基因；cobJ：前咕啉3B甲基转移酶的编码基因；cobM：前咕啉4甲基转移酶的编码基因；cobF：前咕啉6A合成酶的编码基因；cobK：前咕啉6A还原酶的编码基因；cobL：前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因；cobH:前咕啉8X甲基异位酶的编码基因；cobB：钴啉酸a,c-二酰胺合成酶的编码基因；cobNST：钴离子螯合酶的编码基因；cobR：二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的编码基因cobOQDPVS基因均为细菌自身所有。

图2为重组菌A维生素B12的产量

图3为重组菌B提高维生素B12的产量

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例序列1为与重组载体pRS424同源重组的片段(包含pVB12上的12个基因，T7启动子和gltA启动子)；序列2为优化后的hem1基因序列；序列3为插入克隆载体pUKFRT骨架的DNA序列；序列4为T7RNA聚合酶序列；序列5为Cm抗性基因；序列6为pCDG质粒序列；序列7为pUKFRT序列；序列8为优化后的cobG基因序列；序列9为优化后的cobJ基因序列；序列10为优化后的cobM基因序列；序列11为优化后的cobF基因序列；序列12为优化后的cobK基因序列；序列13为优化后的cobL基因序列；序列14为优化后的cobH基因序列；序列15为优化后的cobB基因序列；序列16为优化后的cobN基因序列；序列17为优化后的cobS基因序列；序列18为优化后的cobT基因序列，序列19为优化后的cobR基因序列；序列20为优化后的hemB基因序列；序列21为优化后的hemC基因序列；序列22为优化后的hemD基因序列；序列23为优化后的cobA基因序列；序列24为优化后的cobI基因序列。

在本发明中，在所述重组菌构建方法中，氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因(hemB基因)、胆色素原脱氨酶的编码基因(hemC基因)、尿卟啉原合成酶的编码基因(hemD基因)、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因(cobA基因)、前咕啉2甲基转移酶的编码基因(cobI基因)这五个基因是以基因组整合的方式插入到了重组菌A的基因组上；前咕啉3B合成酶的编码基因(cobG基因)、前咕啉3B甲基转移酶的编码基因(cobJ基因)、前咕啉4甲基转移酶的编码基因(cobM基因)、前咕啉6A合成酶的编码基因(cobF基因)、前咕啉6A还原酶的编码基因(cobK基因)、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因(cobL基因)、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因(cobH基因)、钴啉酸a,c-二酰胺合成酶的编码基因(cobB基因)、钴离子螯合酶的编码基因(cobNST基因)、二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的编码基因(cobR基因)是以表达载体甲的形式导入所述宿主菌中的。

5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因(hem1基因)是以表达载体乙的形式导入所述宿主菌中的。所述基因5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因(hem1基因)和T7RNA聚合酶的编码基因(T7RNP基因)是以重组表达载体丙的形式导入宿主菌。

进一步，表达载体甲为表达所述cobG基因、所述cobJ基因、所述cobM基因、所述cobF基因、所述cobK基因、所述cobL基因、所述cobH基因、所述cobB基因、所述cobNST基因和所述cobR基因的载体(pVB12载体)。所述表达载体乙为表达所述hem1基因的载体(pLTTC402)。所述表达载体丙为表达所述hem1和T7RNP基因的载体(pLTTC405)

进一步，在重组菌A的制备方法中，宿主菌E.coliBL21DE3基因组上的T7RNA聚合酶进行了一次点突变，将第756位氨基酸R突变成K，因此重组菌A的制备过程中宿主菌为E.coliBL21DE3M.

pUC19：为商用克隆载体，可从北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司购得，产品目录为MVV002。

pET28a：为商用克隆载体，可从北京鹏林生物技术有限责任公司购得，产品目录为65258。

pEasy-Blunt：为商用克隆载体，可从北京全式金生物技术有限公司购得,产品目录分别为CB111-02。

pCP20质粒：该质粒为克隆载体，记载于“DatsenkoKA,WannerBL.One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.PNAS,2000,97:6640-6645.”一文中，公众可从清华大学获得。

pKD46RecA质粒：该质粒上为克隆载体，记载于“LiZJ,ShiZY,JianJ,GuoYY,WuQ,ChenGQ.Productionofpoly(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate)fromunrelatedcarbonsourcesbymetabolicallyengineeredEscherichiacoli.MetabEng,2010：352-359.”一文中，公众可从清华大学获得。

pUK-质粒：该质粒为克隆质粒，记载于“ShiZY(2012)ParallelDNAAssemblybyRecombination.PhDthesis(UniversityofMelbourne,Melbourne)”一文中，公众可从清华大学获得。

pCDG质粒：载体全序列如序列表中序列6所示，公众可从清华大学获得。

pUKFRT质粒：载体全序列如序列表中序列7所示，公众可从清华大学获得。

大肠杆菌E.coliBL21DE3：中国全式金公司产品，产品目录号为CD601-01。

脱氮假单胞菌(P.denitrificans)：中国石家庄制药厂赠予。

所用限制性内切酶购自MBIFermentas公司，提取质粒所用的试剂盒购自北京博迈德科技发展公司，回收DNA片段所用的试剂盒购自美国omega公司，相应的操作步骤按照产品说明书进行；所有培养基如无特别说明均用去离子水配制。

培养基配方：

(1)种子摇瓶培养基

LB培养基：5g/L酵母提取物(购自英国OXID公司，产品目录号LP0021)，10g/L蛋白胨(购自英国OXID公司，产品目录号LP0042)，10g/LNaCl，其余为水。调pH值至7.0-7.2，高压蒸汽灭菌。

(2)LB维生素B12发酵摇瓶培养基

LB维生素B12发酵培养基：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，蔗糖80g/L,甜菜碱25g/L，玉米浆10g/L，1％六水氯化钴溶液12mL/L，1％5,6-DMB溶液9mL/L；pH7.3-7.4。

(3)工业发酵摇瓶培养基

玉米浆(干物)10g/L,甜菜碱25g/L,磷酸氢二铵0.5g/L,蔗糖80g/L,硫酸铵1.0g/L,尿素0.5g/L,七水硫酸镁1.75g/L,1％七水硫酸锌溶液7ml/L,1％六水氯化钴溶液12mL/L,1％5,6-DMB溶液9mL/L；pH7.3-7.4。

在实际培养过程中，可向上述培养基中再添加一定浓度的抗生素以维持质粒的稳定性，如100μg/mL氨苄青霉素，34μg/mL氯霉素。

实施例1、提高维生素B12产量的重组菌A的制备

一、重组表达载体pVB12、pLTTC402和pUKBCDAI的构建

1、重组表达载体pVB12的构建

重组表达载体pVB12为将序列表中序列1所示的DNA分子与穿梭载体pRS424同源重组，得到的重组载体；其中同源重组上游同源臂为序列1自5’末端第1-19位核苷酸，同源重组下游同源臂为序列1自5’末端第17565-17604位核苷酸，

序列表中序列1所示的DNA分子包括T7启动子、gltA启动子和如下12个基因：cobG基因、cobJ基因、cobM基因、cobF基因、cobK基因、cobL基因、cobH基因、cobB基因、cobN基因、cobS基因、cobT基因和cobR基因，其中T7启动子为序列表中序列1自5’末端第45-64位核苷酸，gltA启动子为序列表中序列1自5’末端第6196-6903位核苷酸，cobG基因为序列表中序列1自5’末端第94-1475位核苷酸，cobJ基因为序列表中序列1自5’末端第3319-4083位核苷酸，cobM基因为序列表中序列1自5’末端第5370-6131位核苷酸，cobF基因为序列表中序列1自5’末端第1496-2281位核苷酸，cobK基因为序列表中序列1自5’末端第2304-3047位核苷酸，cobL基因为序列表中序列1自5’末端第4106-5347位核苷酸，cobH基因为序列表中序列1自5’末端第8516-9148位核苷酸，cobB基因为序列表中序列1自5’末端第7189-8493位核苷酸，cobN基因为序列表中序列1自5’末端第9169-12996位核苷酸，cobS基因为序列表中序列1自5’末端第14048-15046位核苷酸，cobT基因为序列表中序列1自5’末端第15094-16989位核苷酸，cobR基因为序列表中序列1自5’末端第17038-17559位核苷酸。

具体构建过程如下：

1)、12个基因的密码子优化和合成

在NCBI网站上提取12个基因的基因序列，这些基因的NCBIgeneID分别是cobG(GI:151172)、cobJ(GI:151175)、cobM(GI:151178)、cobF(GI:151171)、cobK(GI:151176)、cobL(GI:151177)、cobH(GI:151173)、cobB(GI:151147)、cobNST(GI:151154，151168,151169)、cobR(GI:1196420).然后用常用密码子优化网站Opitimizer(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER)根据大肠杆菌的密码子偏好进行了核苷酸序列优化，优化后得到的序列可见序列表中8-19.在优化后的基因序列前添加核糖体结合序列进行修饰(AGGAGGTAAAAAA，这12个基因的核糖体结合序列都位于质粒上，并没有插入到基因组上)最后得到的序列送往上海青蓝公司进行合成，每单个基因合成在青蓝公司的通用载体pUC57上。

2)、克隆载体pUC19GFK的构建

以合成的质粒pUC57cobG,pUC57cobF和pUC57cobK为模板，使用下表1中的引物，用phusion酶进行PCR反应扩增目的基因cobG,cobF和cobK,并在引物两端设计引物酶切位点DraIII.以pUC19(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司，产品目录为MVV002，构建过程中PCR引物上引入T7启动子)为模板，使用下表中的pUC19F和pUC19R为引物，用phusion酶进行PCR反应扩增载体骨架pUC19，并在一侧引入T7启动子和酶切位点DraIII.构建过程中所用引物如表1所示。

表1为克隆载体pUC19GFK的构建引物

上表中单下划线标注的是酶切位点，双下划线标注的是T7启动子序列。

PCR反应体系(20μL体系)：模版DNA0.4μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；pfubuffer2.0μL；phusion酶0.2μL；dNTP1.5μL；ddH₂O补足至20μL。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

PCR反应条件：先98℃预变性5min；再98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1Kb/30sec，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

用DraIII酶切上述PCR反应得到的cobG,cobF,cobK和pUC19骨架片段，得到酶切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌E.coliTrans1-T1中，得到转化子，提取转化子的质粒，测序，结果为cobG,cobF,cobK3个基因成功的连接到了克隆载体pUC19上，得到重组载体pUC19GFK。

经过测序，重组载体pUC19GFK为将序列1自5’末端第81-3047位核苷酸(为含有cobG基因、cobF基因、cobK基因的DNA片段)插入克隆载体pUC19的DraIII酶切位点得到的载体。

3)克隆载体pUKJLM的构建

以合成的质粒pUC57cobJ,pUC57cobL和pUC57cobM为模板，使用下表2中的引物，用phusion酶进行PCR反应扩增目的基因cobL,cobL和cobM并在引物两端设计引物酶切位点DraIII.以pUK为模板，使用下表中的pUKF和pUCKR为引物，用phusion酶进行PCR反应扩增载体骨架pUC19,并在一侧引入T7启动子和酶切位点DraIII.构建过程所用的引物均列在表2中。

表2为克隆载体pUKJLM构建所需引物

上表中单下划线标注的是酶切位点，双下划线标注的是T7启动子序列。

PCR反应体系(20μL体系)：模版DNA0.4μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；pfubuffer2.0μL；phusion酶0.2μL；dNTP1.5μL；ddH₂O补足至20μL。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

PCR反应条件：先98℃预变性5min；再98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1Kb/30sec，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

用DraIII酶切上述PCR反应得到的cobJ,cobL,cobM和pUK骨架片段，得到酶切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌E.coliTrans1-T1中，得到转化子，提取转化子的质粒，经过测序，质粒为将序列1自5’末端第3306-6131位核苷酸(cobJ基因、cobL基因、cobM基因的DN片段)插入克隆载体pUK(该质粒为克隆质粒，记载于“ShiZY.ParallelDNAAssemblybyRecombination.PhDthesis.2012.UniversityofMelbourne,Melbourne”一文中，公众可从清华大学获得,构建过程中PCR引物上引入T7启动子)的DraIII酶切位点得到的载体，命名为重组载体pUKJLM。

4)、克隆载体pCDBHN的构建

以合成的质粒pUC57cobB,pUC57cobH和pUC57cobN为模板，使用下表中的引物，用phusion酶进行PCR反应扩增目的基因cobB,cobH和cobN,并在引物两端设计引物酶切位点DraIII.以pCDG为模板，使用下表中的pCDGF和pCDGR为引物，用phusion酶进行PCR反应扩增载体骨架pCDG,pCDG的骨架上含有gltA启动子。构建过程所需引物均列在表3中

表3.为克隆载体pCDBHN构建所需引物

上表中单下划线标注的是酶切位点。

PCR反应体系(20μL体系)：模版DNA0.4μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；pfubuffer2.0μL；phusion酶0.2μL；dNTP1.5μL；ddH₂O补足至20μL。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

PCR反应条件：先98℃预变性5分钟；再98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1Kb/30sec，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

用DraIII酶切上述PCR反应得到的cobB,cobH,cobN和pUK骨架片段，得到酶切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌E.coliTrans1-T1中，得到转化子，提取转化子的质粒，经过测序，质粒为将序列1自5’末端第7176-12996位核苷酸(含cobB基因、cobH基因、cobN基因的DNA片段)插入克隆载体pCDG(本实验室构建见序列6，骨架带有gltA启动子)的DraIII酶切位点得到的载体，命名为重组载体pCDBHN。

5)克隆载体pEasyGSTR的构建

以合成的质粒pUC57cobR,pUC57cobS和pUC57cobT为模板，使用下表中的引物，用phusion酶进行PCR反应扩增目的基因cobR,cobS和cobT,并在引物两端设计引物酶切位点DraIII.以pCDG为模板，使用下表中的gltAF和gltAR为引物，用phusion酶进行PCR反应扩增gltA启动子,以pEASY-Blulnt为模板，使用下表中的pEasyF和pEasyR为引物，用phusion酶进行PCR反应扩增pEASY-Blulnt的载体骨架。构建过程所需引物均列在表4中

表4克隆载体pEasyGSTR构建所需引物

上表中单下划线标注的是酶切位点。

PCR反应体系(20μL体系)：模版DNA0.4μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；pfubuffer2.0μL；phusion酶0.2μL；dNTP1.5μL；ddH₂O补足至20μL。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

PCR反应条件：先98℃预变性5min；再98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1Kb/30sec，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

用DraIII酶切上述PCR反应得到的gltA启动子，cobS,cobT,cobR和pEasy-Blulnt骨架片段，得到酶切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌E.coliTrans1-T1中，得到转化子，提取转化子的质粒，经过测序，质粒为将序列1自5’末端第13977-17559位核苷酸(为含gltA启动子、cobS基因、cobT基因和cobR基因的DNA片段)插入克隆载体pEASY-Blulnt(北京鹏林生物技术有限责任公司，产品目录分别为CB111-02)的DraIII酶切位点(确认)得到的载体，命名为重组载体pEasyGSTR。

6)、重组表达载体pVB12的构建

以构建成功的四个克隆载体pUC19GFK，pUKJLM，pCDBHN和pEasyGSTR为模板，用表5所示的引物，利用phusion聚合酶克隆得到T7-GFK,T7-JLM,gltA-BHN和gltA-STR四个DNA大片段；以酵母中的穿梭载体pRS424(普如汀生物技术有限公司,Biovector-168625)为模板，用下表中的pRS424F和pRS424R为引物，利用phusion聚合酶克隆得到酵母的穿梭载体pRS424的骨架。构建过程中所使用的引物均列在表5中。

表5为重组表达载体pVB12构建所需引物

将T7-GFK、T7-JLM、gltA-BHN、gltA-STR和穿梭载体pRS424骨架转入到酵母细胞中，利用酵母细胞自己的同源重组机制，连接成最后的重组表达载体pVB12。

二、重组表达载体pLTTC402的构建

1)、hem1基因的密码子优化和合成

在NCBI网站上提取来源于酵母菌的hem1基因的基因序列，基因的NCBIgeneID是851818。然后用常用密码子优化网站Opitimizer(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER)根据大肠杆菌的密码子偏好进行了核苷酸序列优化，优化后得到的序列可见序列表中2，得到的序列送往上海青蓝公司进行合成，基因合成在青蓝公司的通用载体pUC57上。

2)、重组表达载体pLTTC402的构建

以合成的质粒pUChem1CO为模板，使用下表中的引物，用phusion酶进行PCR反应扩增目的基因hem1，并在引物两端设计引物酶切位点BamHI和HindIII。构建过程中所使用的引物列在表6中。

表6.为重组表达载体pLTTC402构建所需引物

上表中单下划线标注的是酶切位点。

PCR反应体系(20μL体系)：模版DNA0.4μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；pfubuffer2.0μL；phusion酶0.2μL；dNTP1.5μL；ddH₂O补足至20μL。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

PCR反应条件：先98℃预变性5分钟；再98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1Kb/30sec，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

用BamHI和HindIII酶切上述PCR反应得到的hem1CO片段，用同样的酶切位点酶切载体pET28a，得到酶切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌E.coliTrans1-T1中，得到转化子，提取转化子的质粒。

经过测序，质粒为将序列2所示的hem1基因插入表达载体pET28a的BamHI和HindIII酶切位点间得到的载体，命名为重组表达载体pLTTC402。

三、工程菌E.coliBL21DE3MBCDAI的构建

工程菌E.coliBL21DE3MBCDAI为将大肠杆菌E.coliBL21DE3基因组上T7RNA聚合酶氨基酸序列第756位的R替换为S，且将hemB，hemC,hemD,cobA,cobI这5个基因整合在大肠杆菌E.coliBL21DE3的基因组上得到的重组菌。

具体构建方法如下：

1、重组整合载体pUKBCDAI的构建

重组整合载体pUKBCDAI为将序列表中序列3所示的DNA分子插入克隆载体pUKFRT骨架的DraIII酶切位点间，得到重组载体。

序列3所示的DNA分子包括hemB基因、hemC基因、hemD基因、cobA基因、cobI基因，其中，hemB基因的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第700-1674位核苷酸，hemC基因的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第1697-2641位核苷酸，hemD基因的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第2667-3455位核苷酸，cobA基因的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第4243-5085位核苷酸，cobI基因的核苷酸序列为序列表中序列3自5’末端第5111-5848位核苷酸。

1)、五个基因的密码子优化和合成

在NCBI网站上提取5个基因的基因序列，这些基因的NCBIgeneID分别是hemB(GI:936972)、hemC(GI:937488)、hemD(GI:938324)、cobA(GI:151146)、cobI(GI:151174)。然后用常用密码子优化网站Opitimizer(http://genomes.urv.es/OPTIMIZER)根据大肠杆菌的密码子偏好进行了核苷酸序列优化.优化后的序列见序列表20-24.在优化后的基因序列前添加核糖体结合序列进行修饰(AGGAGGTAAAAAA)最后得到的序列送往上海青蓝公司进行合成，每单个基因合成在青蓝公司的通用载体pUC57上。

2)、重组整合载体pUKBCDAI的构建

以合成的质粒pUC57hemB,pUC57hemC,pUC57hemD,pUC57cobA和pUC57cobI为模板，使用下表中的引物，用phusion酶进行PCR反应扩增目的基因hemB,hemC,hemD,cobA和cobI.并在引物两端设计引物酶切位点DraIII。以pUKFRT为模板，使用下表中的pUKFRTF和pUKFRTR为引物，用phusion酶进行PCR反应扩增的pUKFRT载体骨架。构建过程所需引物均列在表7中。

表7为重组整合载体pUKBCDAI构建所需引物

上表中单下划线标注的是酶切位点。

PCR反应体系(20μL体系)：模版DNA0.4μL；上游引物0.5μL；下游引物0.5μL；pfubuffer2.0μL；phusion酶0.2μL；dNTP1.5μL；ddH₂O补足至20μL。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

PCR反应条件：先98℃预变性5分钟；再98℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1Kb/30sec，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

用DraIII酶切上述PCR反应得到的hemB，hemC,hemD,cobA,cobI和pUKFRT骨架片段，得到酶切产物，然后使用fermentas的T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌E.coliTrans1-T1中，得到转化子，提取转化子的质粒。

经过测序，质粒为将序列表中序列3所示的DNA分子插入克隆载体pUKFRT(该载体的核苷酸序列见序列7)骨架上，得到重组整合载体，命名为pUKBCDAI。

2、E.coliBL21DE3基因组上T7RNA聚合酶突变体E.coliBL21DE3M的构建

将上述一构建成功的重组表达载体pVB12和pLTTC402转入宿主菌E.coliBL21DE3时，发现由于蛋白表达压力的原因，导致细胞不能在含有氨苄和氯霉的抗生素平板上生长。

因此为了降低细胞内蛋白的表达活力，将E.coliBL21DE3基因组上T7RNA聚合酶进行了一个氨基酸的点突变(756R变为756S，突变前的酶的核苷酸序列为序列表中序列4，将序列4自5’末端第2766位核苷酸C突变为A。)。突变方法为利用带有一个突变位点的寡聚核苷酸进行同源重组，利用双抗平板上的生长表型作为筛选标记筛选突变体。

进行突变的寡聚核苷酸序列为：

tattcagacgcgcttgaacctgatgttcctcggtcagttcagcttacagcctaccattaacaccaacaaagatagcgaga

具体方法为：

1)将辅助质粒pKD46RecA(该质粒为克隆载体，记载于“DatsenkoKA,WannerBL.One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.PNAS,2000,97:6640-6645.”一文中，公众可从清华大学获得)。可提高寡聚核苷酸的重组效率)转入到大肠杆菌E.coliBL21DE3中；

2)将E.coliBL21DE3(pKD46RecA)制备感受态，将突变用的80bp寡聚核苷酸转入到感受态中，进行基因组上的突变；

3)将得到的重组菌进行培养3-4代，培养过程中不加抗生素，目的是使之前转入的质粒pKD46RecA逐渐丢失；

4)将丢失质粒的重组菌重新制作感受态，并且转入质粒pVB12和pLTTC402，在双抗平板上进行筛选；

5)对双抗平板上长出的阳性克隆进行测序验证，看其基因组上的T7RNA聚合酶是否发生突变。

通过上面所述步骤，成功得到了大肠杆菌突变体E.coliBL21DE3M，E.coliBL21DE3M为将大肠杆菌E.coliBL21DE3基因组上T7RNA聚合酶的第756位的R突变变为S，具体将序列4自5’末端第2766位核苷酸C突变为A，序列4为T7RNA聚合酶编码基因。

3、工程菌E.coliBL21DE3MBCDAI的获得

工程菌E.coliBL21DE3MBCDAI为将hemB，hemC,hemD,cobA,cobI这5个基因通过上述1获得的重组整合质粒pUKBCDAI导入上述2获得的大肠杆菌突变体E.coliBL21DE3M，并整合到该突变体基因组上，得到的重组菌，

整合的方法为FRT重组方法(One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.PNAS,2000,97:6640-6645.)

具体如下：

1).E.coliBL21DE3MFRT的构建

FRT重组方法要求基因组上和质粒上均含有一个FRT重组序列，因此需要将大肠杆菌的基因组上插入一个FRT重组序列，插入位点为大肠杆菌基因组上的glpX位点。具体方法为：

A.将E.coliBL21DE3M制作原始菌感受态，转入质粒pKD46(温度敏感型，30度培养)；Amp培养基筛选；

B.PCR同源片段扩增：以pKD13(该质粒为克隆载体，记载于“DatsenkoKA,WannerBL.One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.PNAS,2000,97:6640-6645.”一文中，公众可从清华大学获得)为模板，使用引物FRTF和FRTR为引物扩增得到重组PCR片段；

FRTF:ACGCGCGATGGCGTGGGAAGAACACGACGAATAATGTAAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC

FRTR:CAGTCCCGAAGGACTGGAAGGCTCAATCGATCAAATCAACTGTCAAACATGAGAATTAA

C.将E.coliBL21DE3M(pKD46)感受态制备，50ul的感受态细胞转入10-100ngPCR产物。电转条件：使用BioRad的电转仪，1mm电击杯，1.8kV放电，放电时间4-5秒。转化细胞全部涂卡那抗性平板(浓度25ug/L)；一般能长出10-20个克隆；

D.挑取多个单克隆(尽量选择大克隆)，点Kan抗性平板保存，同时做菌落PCR验证，验证引物为FRTP1F和FRTP1R

E.FRTP1F:CGCTGGAGTCTATTGCTTATC

F.FRTP1R:GGACGGTGACCAGGTAAAAC

G.得到单一的一条1.4kb的DNA条带的即为阳性克隆；

H.37度，无抗培养基液体培养过夜(丢失质粒pKD46)；

I.制作感受态，电转化质粒pCP20，涂Amp培养基，30度培养；

J.挑取单克隆，点无抗性平板，Amp负筛，Kan负筛；

K.PCR验证，PCR引物仍为FRTP1F和FRTP1R得到单一的一条124bp的DNA条带的即为阳性克隆E.coliBL21DE3MFRT。

2).E.coliBL21DE3MBCDAI的构建

将E.coliBL21DE3MFRT制作原始菌感受态,电转化质粒pCP20，涂Amp培养基，30度培养.将培养得到的菌株E.coliBL21DE3MFRT(pCP20)制备感受态，电转入上述1获得的整合质粒pUKBCDAI，涂卡那平板，37度培养24小时，挑取单克隆进行PCR验证，PCR验证的引物如下表8。

表8.E.coliBL21DE3MBCDAI构建所需引物

能够得到5条单一的975,945,789,843和738bp条带的即为阳性克隆目的菌E.coliBL21DE3MBCDAI。

四、重组菌AE.coliBL21DE3MBCDAI(pVB12,pLTTC402)的构建及鉴定

1).重组工程菌的转化

将步骤一构建的重组表达载体pVB12和步骤二构建的重组表达载体pLTTC402(两种质粒的摩尔比为1：1)用化学转化法转入到上述三构建的目的菌E.coliBL21DE3MBCDAI中，得到重组菌A。

2).重组工程菌的分子鉴定

重组菌A涂布于LB-Amp-Cm的固体培养平板上，在37℃静置培养48小时，挑取在固体平板上长出的单克隆接种到LB-Amp-Cm液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12小时，得到重组菌A菌液，提取质粒，采用PCR进行分子鉴定。以提取质粒为模板，以cobGF/cobGR和hem1F/hem1R为验证引物。

cobGF：5’-ATGACCGACCTGATGACCT-3’；

cobGR：5’-CTAACCCTGTTCGAACGCC-3’；

hem1F:5’-ATGCAGCGTTCTATCTT-3’；

hem1R:5’-TTACTGTTTGATACCAG-3’

PCR反应体系(10μL体系)：质粒DNA0.2μL；上游引物0.25μL；下游引物0.25μL；pfubuffer1.0μL；pfu酶0.1μL；dNTP0.75μL；ddH₂O补足至10μL。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

PCR反应条件：先94℃预变性10分钟；再94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分20秒，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

结果显示以cobGF/cobGR为引物时，PCR产物中有且只有一条987bps大小的条带，即验证了包含基因CobG的pVB12质粒的存在。以hem1F/hem1R为验证引物，PCR产物中有且只有一条1647bps大小的条带，即验证了包含基因hem1的pLTTC402质粒的存在。

这说明重组表达载体pVB12和pLTTC402被成功转入到菌中。

将上述鉴定阳性的重组菌A命名为E.coliBL21DE3MBCDAI(pVB12,pLTTC402)

实施例2、重组工程菌A生产维生素B12的卟啉前体物质

1、重组工程菌的发酵培养

将实施例1制备的重组工程菌AE.coliBL21DE3MBCDAI(pVB12,pLTTC402)用LB培养基，在37℃，200rpm过夜(12h)培养；然后按5％接种量(v/v)，接种至50mLLBG维生素B12发酵培养基(溶剂为水，溶质及其浓度为：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，蔗糖80g/L，甜菜碱25g/L，玉米浆10g/L，1％六水氯化钴溶液12mL/L，1％5,6-DMB溶液9mL/L；pH7.3-7.4)中，至其初始浓度OD600为0.1，37℃，250rpm(旋转半径为50mm)，摇瓶培养168小时，收集发酵液。每个菌种设置三组平行。

2、发酵产物的检测

运用液相色谱仪(LC，LC-2013，SHIMADZU)对步骤一发酵培养过的重组菌中聚合物进行初步定性和定量分析。

1)、工作原理

被检测样品中不同形式的VB12在强光(1000-1500Lux)照射下转化为亚硫酸钴胺，经过高效液相色谱柱分离，所得吸收峰面积与VB12标样峰成正比

2)、液相样品准备：

摇匀发酵液后立即用移液管量取25.0ml发酵液至50ml的量瓶中，向其中加入2.0ml8％的偏重亚硫酸钠水溶液和2.0ml冰乙酸，摇匀后于90℃下水浴30分钟；冷却后再向其中加入2.0ml8％的偏重亚硫酸钠水溶液，以水定容至刻度，摇匀后使用滤纸过滤，取续滤液约20ml至直径小于10mm的无色透明玻璃试管中，于照度15000～20000Lux下光照30分钟待用，取20微升注入高效液相色谱仪。

3)、液相检测维生素B12的方法：

流动相——0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液：乙腈＝83:17；pH为3.5。

流速为1.0mL/min。

检测波长：550nm。

色谱柱：迪马——ODS-3，inersil，4.6×250mm。

4)、标准样品准备：

精密称定已知含量和水分的氰钴胺对照品适量，以水制成浓度约为100μg/mL的溶液。取20微升注入高效液相色谱仪，记录色谱峰的面积。

5)、计算公式

C_样品＝A_样品*C_标样*稀释倍数/A_标样*1.1

C_样品-样品中维生素B12的浓度(ug/ml)

C_标样-氰钴胺标准品溶液的浓度(ug/ml)

A_标样-标准品液相色谱峰面积

A_样品-样品中亚硫酸钴胺色谱峰面积

因为测定使用的标样为氰钴胺，而检测的位置为亚硫酸钴胺，1.1为实验的校正因子。

6)、结果显示：

发酵液中的腺苷维生素B12与8％的偏重亚硫酸钠水溶液在光照反应下会生成较稳定的亚硫钴维生素B12，在液相检测中，发现在亚硫钴出峰的位置检测到了有峰出现。

在实验过程中还发现了含有pVB12质粒的重组菌对重金属钴离子的耐受性大大提高，重金属钴离子是维生素B12结构组成的必要成分，但是一般的二价金属钴离子会对细胞具有毒性，而pVB12质粒上的cobR基因(二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶)可以将二价的钴还原为一价钴，从而降低钴离子的毒性，使得重组菌的细胞干重显著提高，具体结果见图2所示。另外在重组菌A的发酵液中检测到了维生素B12的卟啉前体物质(卟啉前体物质在液相检测上与亚硫酸钴胺的出峰位置相近，而且均具有550nm的紫外吸收峰，因此卟啉前体物质的计算方式可以按照亚硫酸钴胺来进行计算)，其含量为20mg/L.

实施例3、可提高维生素B12产量的重组工程菌B的构建以及验证过程

一、重组表达载体pLTTC405的构建

重组表达载体pLTTC405为将重组表达载体pLTTC402上的KanR基因替换为CmR基因，且将T7RNA聚合酶基因插入重组表达载体pLTTC402的AsiSI和ClaI酶切位点间得到的载体。

1).使用Gibson连接方法，替换表达载体pLTTC402上的KanR基因为CmR基因(序列5)。

以质粒p15A为模板，使用下表中的引物CAT-GF和CAT-GR，用High-Fidelity2XMasterMix酶进行PCR反应扩增目的基因CmR。构建过程中所使用的引物列在下表9中。

表9.重组表达载体pLTTC405构建所需引物

PCR反应体系(20μL体系)：模版DNA0.1μL；上游引物0.4μL；下游引物0.4μL；High-Fidelity2XMasterMix酶10μL；ddH2O补足至20μL。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

PCR反应条件：先98℃预变性30秒；再98℃变性10秒，60.7℃退火30秒，72℃延伸1Kb/30sec，30次循环；然后72℃后延伸2分钟。

用AsiSI和ClaI酶切位点酶切载体pLTTC4，得到酶切产物，然后加入扩增好的CmR片段，使用NEB的GibsonMasterMix进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌E.coliTrans1-T1中，得到转化子，提取转化子的质粒，测序，结果为CmR片段基因成功的连接到了载体pLTTC402上，得到中间载体pLTTC402-CmR。

2).使用Gibson连接方法，将T7RNA聚合酶基因连接到上一步构建的载体上。

以E.coliBL21DE3基因组为模板，使用下表中的引物T7pF和T7pR，用High-Fidelity2XMasterMix酶进行PCR反应扩增3652bp目的基因T7RNA聚合酶基因(序列4)。构建过程中所使用的引物列在下表10中。

用DraIII和NsiI酶切位点酶切上述1)制备的中间载体pLTTC402-CmR，得到酶切产物，然后加入扩增好的T7RNA聚合酶基因片段，使用NEB的GibsonMasterMix进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌E.coliTrans1-T1中，得到转化子，提取转化子的质粒，测序，结果为T7RNA聚合酶基因成功的连接到了上一步构建的载体上。

表10.重组表达载体pLTTC405构建所需引物2

PCR反应体系(20μL体系)：模版DNA0.1μL；上游引物0.4μL；下游引物0.4μL；High-Fidelity2XMasterMix酶10μL；ddH2O补足至20μL。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

PCR反应条件：先98℃预变性30秒；再98℃变性10秒，61.0℃退火30秒，72℃延伸1Kb/30sec，30次循环；然后72℃后延伸2分钟。

二、重组工程菌的构建

将实施例1的步骤一制备的重组表达载体pVB12和步骤二构建的pLTTC405(两种质粒的摩尔比为1：1)用电转化法转入到假单胞菌P.denitrificans中，得到重组菌B。

将重组菌B涂布于LB-Amp-Cm的固体培养平板上，在37℃静置培养48小时，挑取在固体平板上长出的单克隆接种到LB-Amp-Cm液体培养基中，在37℃、200rpm下摇床培养12小时，得到重组菌B。

从重组菌B提取质粒，采用PCR进行分子鉴定。以提取质粒为模板，以hemBF/hemBR和cobGF/cobGR为验证引物。

cobGF：5’-ATGACCGACCTGATGACCT-3’；

cobGR：5’-CTAACCCTGTTCGAACGCC-3’；

hem1F：5’-ATGCAGCGTTCTATCTT-3’；

hem1R：5’-TTACTGTTTGATACCAG-3’

PCR反应体系(10μL体系)：质粒DNA0.2μL；上游引物0.25μL；下游引物0.25μL；pfubuffer1.0μL；pfu酶0.1μL；dNTP0.75μL；ddH₂O补足至10μL。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。PCR扩增体系配制时，DNA聚合酶最后加入。

PCR反应条件：先94℃预变性10分钟；再94℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分20秒，30次循环；然后72℃后延伸10分钟。

结果显示以cobGF/cobGR为引物时，PCR产物中有且只有一条987bps大小的条带，即验证了包含基因CobG的pVB12质粒的存在。以hem1F/hem1R为验证引物，PCR产物中有且只有一条1647bps大小的条带，即验证了包含基因hem1的pLTTC405质粒的存在。这说明重组表达载体pVB12和pLTTC405被成功转入到菌中。

将上述鉴定阳性的重组菌B命名为P.denitrificans(pVB12,pLTTC405)。

实施例4、用重组工程菌B生产维生素B12

1、重组工程菌B的发酵培养

重组工程菌BP.denitrificans(pVB12,pLTTC405)用工业发酵培养基，在37℃，200rpm过夜(12h)培养；然后按5％接种量(v/v)，接种至50mL维生素B12工业发酵培养基(溶剂为水，溶质及其浓度为：玉米浆(干物)10g/L,甜菜碱25g/L,磷酸氢二铵0.5g/L,蔗糖80g/L,硫酸铵1.0g/L,尿素0.5g/L,七水硫酸镁1.75g/L，1％七水硫酸锌溶液7mL/L,1％六水氯化钴溶液12mL/L，1％5,6-DMB溶液9mL/L；pH7.3-7.4)中，至其初始浓度为OD600为0.1，37℃，250rpm(旋转半径为50mm)，摇瓶培养168小时，得到发酵液。每个菌种设置三组平行。

2、发酵产物的检测

运用液相色谱仪(LC，LC-2013，SHIMADZU)对步骤一发酵培养过的重组菌中聚合物进行初步定性和定量分析。

1)、工作原理

被检测样品中不同形式的VB12在强光(1000-1500Lux)照射下转化为亚硫酸钴胺，经过高效液相色谱柱分离，所得吸收峰面积与VB12标样峰成正比

2)、液相样品准备：

摇匀发酵液后立即用移液管量取25.0ml发酵液至50ml的量瓶中，向其中加入2.0ml8％的偏重亚硫酸钠水溶液和2.0ml冰乙酸，摇匀后于90℃下水浴30分钟；冷却后再向其中加入2.0ml8％的偏重亚硫酸钠水溶液，以水定容至刻度，摇匀后使用滤纸过滤，取续滤液约20ml至直径小于10mm的无色透明玻璃试管中，于照度15000～20000Lux下光照30分钟待用，取20微升注入高效液相色谱仪。

3)、液相检测维生素B12的方法：

流动相——0.05mol/L的磷酸二氢钾溶液：乙腈＝83:17；pH为3.5。

流速为1.0mL/min。

检测波长：550nm。

色谱柱：迪马——ODS-3，inersil，4.6×250mm。

4)、标准样品准备：

精密称定已知含量和水分的氰钴胺对照品适量，以水制成浓度约为100μg/mL的溶液。取20微升注入高效液相色谱仪，记录色谱峰的面积。

5)、计算公式

C_样品＝A_样品*C_标样*稀释倍数/A_标样*1.1

C_样品-样品中维生素B12的浓度(ug/ml)

C_标样-氰钴胺标准品溶液的浓度(ug/ml)

A_标样-标准品液相色谱峰面积

A_样品-样品中亚硫酸钴胺色谱峰面积

因为测定使用的标样为氰钴胺，而检测的位置为亚硫酸钴胺，1.1为实验的校正因子。

6)、结果显示：

发酵液中的腺苷维生素B12与8％的偏重亚硫酸钠水溶液在光照反应下会生成较稳定的亚硫钴维生素B12，在液相检测中，发现在亚硫钴出峰的位置检测到了有峰出现。重组菌BP.denitrificans(pVB12,pLTTC405)中维生素B12(计算的是亚硫钴维生素B12)的含量(58.6mg/L)相比野生型P.denitrificans有很大的提高，具体结果见图3。

之前的专利经报道(F.Blanche,B.Cameron,J.Crouzet,etal.～PoulencBiochimie.Euratent,0516647B1,1998)通过过表达以质粒作为载体过表达cobF-cobM基因簇可以将脱氧假单胞菌的产量提高30％，将重组菌P.denitrificans(pVB12,pLTTC405)与专利报道的表达cobF-cobM基因簇的菌株进行比较发现重组菌P.denitrificans(pVB12,pLTTC405)中的VB12产量提高2倍。

实施例5、多种重组工程菌(pVB12,pLTTC402/pLTTC405)的构建

采用如实施例1中的方法，将实施例1步骤一构建的重组表达载体pVB12,pLTTC402/pLTTC405用化学转化法或电转化方法分别转入到假单胞菌(Pseudomonasspp.)、嗜盐单胞菌(Halomonasspp.)、罗氏真养杆菌(Ralstoniaeutropha)、气生单胞菌(Aeromonasspp.)、粘着剑菌(Ensiferspp.)等，对于基因组上含有T7RNA聚合酶基因的菌株，转入的质粒为pVB12和pLTTC402，对于基因组上不含有T7RNA聚合酶基因的菌株，转入的质粒为pVB12和pLTTC405.对所得重组工程菌，采用常规方法进行发酵培养，然后通过如实施例2的方法进行液相色谱的方法均可检测出维生素B12的合成。

维生素B12的发酵生产受培养条件如：培养基成分、培养温度、培养湿度、摇瓶转速、培养方式(摇瓶培养或者发酵罐培养)和补料方式影响很大，所以仅列出产量最高时的发酵条件

假单胞菌(Pseudomonasspp.)转入pVB12和pLTTC405，得到重组菌，维生素B12产量为40-400mg/L；

发酵条件：

培养基(工业发酵培养基)成分：玉米浆(干物)10g/L,甜菜碱25g/L,磷酸氢二铵0.5g/L,蔗糖80g/L,硫酸铵1.0g/L,尿素0.5g/L,七水硫酸镁1.75g/L，1％七水硫酸锌溶液7mL/L,1％六水氯化钴溶液12mL/L，1％5,6-DMB溶液9mL/L；pH7.3-7.4)。

培养温度：30℃

培养湿度：40％

培养方式：发酵罐培养

补料方式：

补料成分：甜菜碱53g/L,蔗糖210g/L,1％六水氯化钴溶液19.6mL/L，1％5,6-DMB溶液14.3mL/L；在72h,96h,120h,144进行补料，每次2ml。

嗜盐单胞菌(Halomonasspp.)转入pVB12和pLTTC405，得到重组菌，维生素B12产量为40-300mg/L；

发酵条件：

培养基(工业发酵培养基)成分：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠60g/L，蔗糖80g/L，甜菜碱25g/L，玉米浆10g/L，1％六水氯化钴溶液12mL/L，1％5,6-DMB溶液9mL/L；pH7.3-7.4。

培养温度：37℃

培养湿度：40％

培养方式：发酵罐培养

补料方式：

补料成分：甜菜碱53g/L,蔗糖210g/L,1％六水氯化钴溶液19.6mL/L，1％5,6-DMB溶液14.3mL/L；在72h,96h,120h,144进行补料，每次2ml。

罗氏真养杆菌(Ralstoniaeutropha)转入pVB12和pLTTC405，得到重组菌，维生素B12产量为50-200mg/L；

发酵条件：

培养基(工业发酵培养基)成分：：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，蔗糖80g/L，甜菜碱25g/L，玉米浆10g/L，1％六水氯化钴溶液12mL/L，1％5,6-DMB溶液9mL/L；pH7.3-7.4。

培养温度：30℃

培养湿度：40％

培养方式：发酵罐培养

补料方式：

补料成分：甜菜碱53g/L,蔗糖210g/L,1％六水氯化钴溶液19.6mL/L，1％5,6-DMB溶液14.3mL/L；在72h,96h,120h,144进行补料，每次2ml。

气生单胞菌(Aeromonasspp.)转入pVB12和pLTTC405，得到重组菌，维生素B12产量为40-200mg/L；

发酵条件：

培养基(工业发酵培养基)成分：：酵母提取物5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，蔗糖80g/L，甜菜碱25g/L，玉米浆10g/L，1％六水氯化钴溶液12mL/L，1％5,6-DMB溶液9mL/L；pH7.3-7.4。

培养温度：30℃

培养湿度：40％

培养方式：发酵罐培养

补料方式：

补料成分：甜菜碱53g/L,蔗糖210g/L,1％六水氯化钴溶液19.6mL/L，1％5,6-DMB溶液14.3mL/L；在72h,96h,120h,144进行补料，每次2ml。

结果各种重组菌中维生素B12的产量范围为40mg/L-400mg/L。

粘着剑菌(Ensiferspp.)转入pVB12和pLTTC405，得到重组菌，维生素B12产量为40-400mg/L；

发酵条件：

培养基(工业发酵培养基)成分：玉米浆(干物)10g/L,甜菜碱25g/L,磷酸氢二铵0.5g/L,蔗糖80g/L,硫酸铵1.0g/L,尿素0.5g/L,七水硫酸镁1.75g/L，1％七水硫酸锌溶液7mL/L,1％六水氯化钴溶液12mL/L，1％5,6-DMB溶液9mL/L；pH7.3-7.4)。

培养温度：30℃

培养湿度：40％

培养方式：发酵罐培养

补料方式：

补料成分：甜菜碱53g/L,蔗糖210g/L,1％六水氯化钴溶液19.6mL/L，1％5,6-DMB溶液14.3mL/L；在72h,96h,120h,144进行补料，每次2ml。

Claims (9)

1.一种构建重组菌的方法，为1)或2)：

1)所示的方法，包括如下步骤：将至少如下18个酶的编码基因或如下18个酶的编码基因中任意一个或多个的组合共同导入目的菌A中，得到重组菌A；

所述18个酶的编码基因为：前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、钴啉酸a,c-二酰胺合成酶的编码基因、钴离子螯合酶N的编码基因、钴离子螯合酶S的编码基因、钴离子螯合酶T的编码基因、二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的编码基因、5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因、氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素原脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因和前咕啉2甲基转移酶的编码基因；

所述目的菌A为不表达如下5个基因的菌：氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素原脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因和前咕啉2甲基转移酶的编码基因；

2)所示的方法，包括如下步骤：将至少如下13个酶的编码基因或如下13个酶的编码基因中任意一个或多个的组合共同的导入目的菌B中，得到重组菌B；

所述13个酶的编码基因为：前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、钴啉酸a,c-二酰胺合成酶的编码基因、钴离子螯合酶N的编码基因、钴离子螯合酶S的编码基因、钴离子螯合酶T的编码基因、二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的编码基因和5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、钴啉酸a,c-二酰胺合成酶的编码基因、钴离子螯合酶N的编码基因、钴离子螯合酶S的编码基因、钴离子螯合酶T的编码基因和二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的编码基因共12个基因通过重组表达载体甲导入所述目的菌A或所述目的菌B中；

所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因通过重组表达载体乙导入所述目的菌A中或通过重组表达载体丙导入所述目的菌B；

所述氨基乙酰丙酸脱氢酶的编码基因、胆色素原脱氨酶的编码基因、尿卟啉原合成酶的编码基因、尿卟啉原III甲基转移酶的编码基因和前咕啉2甲基转移酶的编码基因共5个基因通过重组表达载体丁导入所述目的菌A中。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体甲为将含有所述12个基因的DNA分子插入表达载体，得到重组载体；所述插入方式为同源重组；

所述含有所述12个基因的DNA分子包括由所述前咕啉3B合成酶的编码基因、前咕啉6A合成酶的编码基因、前咕啉6A还原酶的编码基因组成的融合DNA片段融合DNA片段甲、驱动所述融合DNA片段甲表达的T7启动子、由前咕啉3B甲基转移酶的编码基因、前咕啉6Y甲基转移酶的编码基因、前咕啉4甲基转移酶的编码基因的DNA片段组成的融合DNA片段乙、驱动所述融合DNA片段乙表达的T7启动子、由钴啉酸a,c-二酰胺合成酶的编码基因、所述前咕啉8X甲基异位酶的编码基因、所述钴离子螯合酶N的编码基因组成的融合DNA片段丙、驱动所述融合DNA片段丙表达的gltA启动子、由所述钴离子螯合酶S的编码基因、所述钴离子螯合酶T的编码基因和所述二价钴啉酸a,c-二酰胺还原酶的编码基因组成的融合DNA片段丁、驱动所述融合DNA片段丁表达的gltA启动子；

所述重组表达载体乙为将所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因插入表达载体中得到的载体；

所述重组表达载体丙为重组表达载体乙基因组上的KanR基因替换为CmR基因，且将所述T7RNA聚合酶基因插入所述重组表达载体乙中，得到的载体；

所述重组表达载体丁为将含有所述5个基因的DNA分子插入表达载体中得到的重组载体。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：

所述含有所述12个基因的DNA分子的核苷酸序列具体为序列1；

所述5-氨基乙酰丙酸合成酶的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列2；

所述含有所述5个基因的DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列3。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述目的菌A为大肠杆菌、大肠杆菌突变菌、嗜盐单胞菌、罗氏真养杆菌或气生单胞菌；

所述目的菌B为假单胞菌或粘着剑菌。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：

所述大肠杆菌突变菌为将大肠杆菌E.coliBL21DE3基因组上T7RNA聚合酶氨基酸序列第756位的R替换为S，得到的突变菌。

7.由权利要求1-6中任一所述的方法制备的重组菌A或重组菌B。

8.权利要求7所述的重组菌A在制备维生素B12或制备维生素B12的卟啉前体物质中的应用；

或权利要求7所述的重组菌B提高维生素B12中的应用。

9.一种制备维生素B12或维生素B12的卟啉前体物质的方法，包括如下步骤：发酵权利要求7所述的重组菌A；

或一种制备维生素B12或提高维生素B12的方法，包括如下步骤：发酵权利要求7所述的重组菌B。