CN117343920A - 转氨酶、核酸分子、重组表达载体及其应用 - Google Patents
转氨酶、核酸分子、重组表达载体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种转氨酶、核酸分子、重组表达载体及其应用。本申请的转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。本申请的转氨酶相较于现有技术的转氨酶，对底物的选择性高且转化率高。
Description
技术领域
本申请涉及酶工程及生物制药领域，具体涉及一种转氨酶、核酸分子、重组表达载体及其应用。
背景技术
沙库比曲作为合成药物Entresto(LCZ696)的活性药物成分，其含有两个带有甲基和酰胺部分的立体中心，不容易从现有的手性构建块中获得。沙库比曲中的关键手性支架(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸可以通过标准化学方法获得高产量和高对映体和非对映异构体纯度。生物催化转化作为化学方法的替代路线，依赖于转氨酶催化的酮到胺的非对映选择性转氨。
胺转氨酶(ATAs)催化胺和酮(胺供体和酮受体)的分子间交换。转氨酶使用磷酸吡哆醛(PLP)作为辅助因子，其机制涉及氧化脱氨和还原胺化半反应。丙氨酸和异丙胺(i-PrNH2)经常用作胺供体。虽然转氨酶通常表现出高立体选择性，但大多数野生型转氨酶的缺点是它们的底物范围有限，并且通常很难接受酮一侧大于甲基取代基的基团。
发明内容
本申请的目的在于提供一种转氨酶、核酸分子、重组表达载体及其应用，可以解决上述技术问题。
本申请实施例提供一种转氨酶，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与所述SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。
在一些实施例中，所述转氨酶的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生一个或多个点突变得到的氨基酸序列。
在一些实施例中，发生所述点突变的氨基酸包括SEQ ID NO：1中的第17位氨基酸Y、第19位氨基酸F、第57位氨基酸W、第86位氨基酸F、第165位氨基酸Y和第284位氨基酸S中的一个或多个。
在一些实施例中，所述点突变的取代氨基酸包括甲硫氨酸、组氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、色氨酸中的一种或者多种。
在一些实施例中，发生所述点突变的方式为Y17M、F19H、W57A、F86A、F86K、F86N、Y165W和S284A中的一种或者多种。
在一些实施例中，发生所述点突变的方式为以下任一所示组合：
(1)Y17M；
(2)F19H；
(3)W57A；
(4)F86A；
(5)F86K；
(6)F86N；
(7)Y165W；
(8)S284A；
(9)Y17M、F19H；
(10)Y17M、F19H、W57A；
(11)F86N、Y165W；
(12)F86N、Y165W、S284A；
(13)Y17M、F19H、W57A、F86N、Y165W、S284A。
在一些实施例中，所述转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ IDNO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ IDNO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27所示。
本申请实施例进一步提供了一种核酸分子，所述核酸分子包括用于编码所述转氨酶的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述核苷酸序列为下述任一项：
(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(b)所述核苷酸序列与所述SEQ ID NO：2至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性；或
(c)所述核苷酸序列为(a)或(b)中所述核苷酸序列经密码子优化后获得的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28所示。
本申请实施例进一步提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含载体，以及上述的核酸分子。
本申请实施例进一步提供了一种转化体，所述转化体包括表达系统，以及所述的核酸分子或所述的重组表达载体。
本申请实施例进一步提供了一种酶制剂，所述酶制剂包括所述的转氨酶。
本申请实施例进一步提供了一种所述的转氨酶、或所述的核酸分子、或所述的重组表达载体、或所述的转化体、或所述的酶制剂在制备(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸中的应用。
在一些实施例中，所述的应用包括：所述转氨酶或所述酶制剂，或者经由所述核酸分子、所述重组表达载体以及所述转化体中的至少一种生成的转氨酶，在制备(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸中的应用。
本申请实施例进一步提供了一种(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸的制备方法，包括以下步骤：
将(2R)-2-甲基-4-羰基-5-(4-联苯)戊酸作为底物，与磷酸吡哆醛、异丙胺和水混合，以获得混合液；
将所述混合液与所述的转氨酶进行转氨接触以发生酶催化反应，生成(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸。
本申请的有益效果在于：本申请提供了一种转氨酶、核酸分子、重组表达载体及其应用。本申请的转氨酶具有S-选择性，能够催化(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸的生成，相较于现有技术的转氨酶，本申请的转氨酶活性高。本申请利用上述的转氨酶进行酶催化反应，转化率高。
具体实施方式
下面将结合本申请实施例对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。另外，在本申请的描述中，术语“包括”是指“包括但不限于”。用语第一、第二、第三等仅仅作为标示使用，并没有强加数字要求或建立顺序。本申请的各种实施例可以以一个范围的型式存在；应当理解，以一范围型式的描述仅仅是因为方便及简洁，不应理解为对本申请范围的硬性限制；因此，应当认为所述的范围描述已经具体公开所有可能的子范围以及该范围内的单一数值。例如，应当认为从1到6的范围描述已经具体公开子范围，例如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等，以及所数范围内的单一数字，例如1、2、3、4、5及6，此不管范围为何皆适用。另外，每当在本文中指出数值范围，是指包括所指范围内的任何引用的数字(分数或整数)。
在高底物浓度和低酶负载的工业适用条件下，筛选具有S-选择性转氨酶(ATA)在空间位阻苛刻的底物上工作，对于沙库比曲的合成具有重要意义。本申请提供了一种转氨酶，该转氨酶能将前体酮转化为所需(2R，4S)-胺。
在一些实施例中，转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。
本申请的转氨酶能够催化(2R)-2-甲基-4-羰基-5-(4-联苯)戊酸(结构如式I所示)转化为(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸(结构如式Ⅱ所示)，反应式如下所示：
下面实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本申请中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本申请的内容。
除非另有说明，文中涉及的试剂与材料均可商购获得，或本领域技术人员可依据公知常识自行制备。
定义与说明：如本申请所用，“相似性”是指两个氨基酸序列或两个核苷酸序列之间的相关性。
在本申请实施例中，至少具有80％以上相似性可以理解为80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列相似性，对应相似性的数值为整数；也可以进一步理解为80.1％、81.2％、82.3％、83.4％、84.5％、85.6％、86.7％、87.8％、88.9％、89.8％、90.3％、91.7％、92.2％、93.5％、94.8％、95.9％、96.6％、97.5％、98.4％或99.9％，但小于100％的序列相似性，对应相似性的数值为小数。
如本申请所用，氨基酸由单字母或三字母代码表示，具有如下含义：A：Ala(丙氨酸)；R：Arg(精氨酸)；N：Asn(天冬酰胺)；D：Asp(天冬氨酸)；C：Cys(半胱氨酸)；Q：Gln(谷氨酰胺)；E：Glu(谷氨酸)；G：Gly(甘氨酸)；H：His(组氨酸)；I：Ile(异亮氨酸)；L：Leu(亮氨酸)；K：Lys(赖氨酸)；M：Met(甲硫氨酸)；F：Phe(苯丙氨酸)；P：Pro(脯氨酸)；S：Ser(丝氨酸)；T：Thr(苏氨酸)；W：Trp(色氨酸)；Y：Tyr(酪氨酸)；V：Val(缬氨酸)。
如本申请所用，“点突变”是指特定位点氨基酸的取代、缺失或插入。在本申请的实施例中，点突变的方式为特定位点氨基酸的取代。对于氨基酸取代的点突变方式，命名方法为：原始的氨基酸，原始氨基酸的位点，取代氨基酸，例如：(1)Y17M表示在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第17位点处采用甲硫氨酸取代原始的酪氨酸；(2)F19H表示在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第19位点处采用组氨酸取代原始的苯丙氨酸；(3)W57A表示在SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列中第57位点处采用丙氨酸取代原始的色氨酸；(4)F86A表示在SEQID NO：1所示的氨基酸序列中第86位点处采用丙氨酸取代原始的苯丙氨酸；(5)F86K表示在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第86位点处采用赖氨酸取代原始的苯丙氨酸；(6)F86N表示在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第86位点处采用天冬酰胺取代原始的苯丙氨酸；(7)Y165W表示在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第165位点处采用色氨酸取代原始的酪氨酸；(8)S284A表示在SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第284位点处采用丙氨酸取代原始的丝氨酸。
如本申请所用，“核酸分子”是指由多个核苷酸聚合而成的生物大分子化合物，可以是通过聚合酶链式反应(PCR)或通过体外翻译产生的脱氧核糖核酸(DNA)片段、核糖核酸(RNA)片段以及寡核苷酸片段中的任意一种，以及通过连接、切割、内切核酸酶作用或外切核酸酶作用中的任意一种或多种产生的片段，可以是单链的或双链的。在本申请实施例中，核酸分子包括但不限于用于编码转氨酶的核苷酸序列。
如本申请所用，“载体”是指能够运输另一种核酸的核酸分子，例如可以是质粒、病毒、黏粒等，在本申请实施例中，未插入外源基因的pET24a质粒可以作为载体。
如本申请所用，“重组表达载体”是指一种DNA构建体，其含有与合适的控制序列可操作地连接的核酸分子，控制序列能够实现核酸分子在合适的表达系统中表达。在本申请实施例中，重组表达载体是指采用分子生物学技术将外源基因插入至载体上，由此形成的DNA构建体，示例pET24a-WT为重组表达载体。
如本申请所用，“表达系统”是指用于表达外源基因而产生蛋白的一类宿主，表达系统例如可以是真核生物、原核生物、病毒等，其中，作为表达系统的真核生物包括但不限于哺乳动物细胞、酵母、真菌、昆虫细胞和植物细胞，作为表达系统的原核生物包括但不限于芽孢杆菌属、梭菌属、乳酸菌属、链霉菌属、葡萄球菌属、大肠杆菌、假单胞菌属和类芽孢杆菌属。在本申请实施例中，pET24a-WT的表达系统为大肠杆菌(E.coli)。
如本申请所用，“转化体”是指接受了外源遗传物质(如：质粒DNA)而使遗传特性发生变化的宿主。在本申请实施例中，含有转氨酶编码基因的基因工程菌属于转化体。
如本申请所用，“酶制剂”是指从生物(如微生物)中提取的具有生物催化能力的物质，辅以其他成分而制得的功能化产品。在本申请实施例中，酶制剂的活性成分为转氨酶，转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者转氨酶的氨基酸序列为与SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列，该酶制剂能够应用于(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸的生产工艺中。在一些实施例中，酶制剂可包括必要的赋形剂、稳定剂、保护剂等食品或药学上可接受的佐剂和/或辅料。
本申请实施例提供了一种(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸的制备方法，以及经由该制备方法制得的(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸。制备方法包括以下步骤：
(S1)将式(Ⅰ)所示的(2R)-2-甲基-4-羰基-5-(4-联苯)戊酸作为底物，与磷酸吡哆醛、异丙胺和水混合，以获得混合液；以及
(S2)将混合液与转氨酶进行转氨接触以发生酶催化反应，生成式(Ⅱ)所示的(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸。
在一些实施例中，步骤(S1)中将混合液与转氨酶进行转氨接触的方式为：全部的混合液直接与转氨酶相混合。作为示例，酶催化反应的反应体系包括混合液、转氨酶、异丙胺和磷酸吡哆醛。
在整个反应体系中，底物的浓度为0.05mol/L～1mol/L，异丙胺的浓度为0.5mol/L～2mol/L，磷酸吡哆醛的浓度为0.0005mol/L～0.005mol/L；以质量百分比计，溶剂占整个反应体系的75％～90％。反应条件为：pH为8.0～9.0，温度为40℃～60℃。
在一些实施例中，底物的浓度(mol/L)的取值为0.05、0.1、0.2、0.3、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0中的任意值或者任意两值组成的范围。
在一些实施例中，异丙胺或者异丙胺盐酸盐的浓度(mol/L)的取值为0.5、1、1.5、2中的任意值或者任意两值组成的范围。
在一些实施例中，磷酸吡哆醛的浓度(mol/L)的取值为0.0005、0.001、0.002、0.003、0.004、0.005中的任意值或者任意两值组成的范围。
在一些实施例中，反应体系的溶剂为水，溶剂占整个反应体系的质量百分比(％)为75、80、85、90中的任意值或者任意两值组成的范围。
在一些实施例中，本申请的底物的用量与含有转氨酶的全细胞酶液的用量之间的关系为：0.03～0.05mol：6mL～10mL。
在一些实施例中，全细胞酶液中，含有菌体的质量浓度为10wt％～30wt％，如菌体的浓度(wt％)取值为10、15、20、25、30中的任意值或者任意两值组成的范围。
在一些实施例中，本申请的催化反应在搅拌条件下进行，搅拌的速度范围为100rpm～500rpm，如搅拌的速度为100、200、300、400、500中的任意值或者任意两值组成的范围。
在一些实施例中，异丙胺以异丙胺盐酸盐形式存在。本申请中，使用的i-PrNH2是手性的，价格低廉，使用过量来驱动平衡，i-PrNH2可以通过蒸发或还原为异丙醇除去丙酮产物。
在一些实施例中，步骤(S2)中的转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。
在一些实施例中，步骤(S2)中的转氨酶的氨基酸序列是由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列发生一个或多个点突变得到的氨基酸序列。
在一些实施例中，发生点突变的方式为Y17M、F19H、W57A、F86A、F86K、F86N、Y165W、S284A、F19H中的任意一个点突变或者多个点突变的组合。
在本申请的一些实施例中，发生点突变的方式为以下任一所示组合：
(1)Y17M；(2)F19H；(3)W57A；(4)F86A；(5)F86K；(6)F86N；(7)Y165W；(8)S284A；(9)Y17M、F19H；(10)Y17M、F19H、W57A；(11)F86N、Y165W；(12)F86N、Y165W、S284A；(13)Y17M、F19H、W57A、F86N、Y165W、S284A。
实施例1：酶的来源与基因合成
运用基因挖掘技术，从NCBI数据库中挖掘一株转氨酶(TRPD)，氨基酸序列如SEQID No.1所示。依据E.coli密码子偏好性进行密码子优化，以全基因合成的方法合成了转氨酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO.2所示。在核苷酸序列两端加入酶切位点Nde I和BamH I，将该基因克隆至pET24a对应的Nde I和BamH I位点，获得重组表达质粒pET24a-WT。
实施例2：重组工程菌的定向突变库构建
通过在上下游引物的5’端插入、替换、缺失碱基引入突变，以pET24a-WT为DNA模板，利用软件Oligo7设计突变引物。突变引物包含以下突变：Y17M、F19H、W57A、F86A、F86K、F86N、Y165W、S284A。
例如：F19H的引物为：
上游：GCCATACAGAGAATAGGTTTCTGCGC；
下游：CATACCGATATGCCGAGCGTTCATCAG；
以pET24a-WT为DNA模板，加入以上位点的引物，用KOD高保真酶试剂盒反向PCR，获得PCR产物；将PCR产物经DpnI处理后再经T4连接酶连接，最终转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态中，LB固体培养基培养18h，获得突变库。
反向PCR的反应程序为：95℃预变性3min；98℃变性30s，55℃退火30s，68℃延伸3min，28个循环；72℃延伸5min，获得编号3的转氨酶编码基因的核苷酸序列。
通过以上方式，分别制备突变工程菌株，如表1所示，突变菌株包含以下单点和多点突变：(1)Y17M；(2)F19H；(3)W57A；(4)F86A；(5)F86K；(6)F86N；(7)Y165W；(8)S284A；(9)Y17M、D19H；(10)Y17M、D19H、W57A；(11)F86N、Y165W；(12)F86N、Y165W、S284A；(13)Y17M、F19H、W57A、F86N、Y165W、S284A。
实施例3：突变工程菌的诱导表达
(1)培养液的制备
LB液体培养基：按质量百分比计，包含1％ NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，充分混匀后，调节pH至7.0，高压蒸汽灭菌锅121℃灭菌30min。使用前添加终浓度50μg/mL卡那霉素。
自诱导培养基：按质量百分比计，包含1％ NaCl，1％胰蛋白胨，0.5％酵母提取物，0.1mM IPTG，充分混匀后，调节pH至7.0，121℃灭菌30min。
(2)工程菌诱导
将基因工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃，180r/min培养至OD600约0.6～0.8，获得种子菌液；将种子菌液以体积浓度1％接种量接种至新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的自诱导培养基，于30℃培养18h。25℃、8000r/min离心10min，弃上清液，用PB pH7.0清洗两遍，收集湿菌体备用，加水重悬至菌浓20％，用作反应全细胞酶液。
实施例4：突变菌株的反应初筛
产物HPLC检测及转化率计算
样品制备方法：取反应液500μL，加入500μL甲醇，摇匀离心，取上清10μL用流动相稀释100倍，振荡混匀后进样。
液相色谱条件：岛津LC-16，检测波长256nm；
液相方法：甲醇：水：三氟乙酸(TFA)＝65：35：0.001(v:v:v)，色谱柱：DiamonsilC18柱；
温箱温度：30℃，进样量：20μL；
流速：1mL/min，分析时间：27min；
其中，A1为反应液反应后的底物化合物峰面积，A2为反应液反应前的底物化合物峰面积。
实验流程：
水浴锅温度设定为50℃；
取洁净三口烧瓶，加入磁力搅拌转子；
称取底物10g，加入三口烧瓶；
称取PLP(磷酸吡哆醛)0.1g，加入三口烧瓶；
称取62g水，加入三口烧瓶，开搅拌；
向三口烧瓶中加入37mL 5M HCl溶液；
加入12g异丙胺，调节pH至8.5±0.1，用25％(v/v)异丙胺水溶液控制体系pH＝8.5±0.1，保持体系温度50±1℃；
加入10mL酶液，反应24h。
表1转氨酶的编码序列及转化率
实施例5：转氨酶反应的底物浓度优化
水浴锅温度设定为50℃；
取洁净三口烧瓶，加入磁力搅拌转子；
称取底物1.41g、5.64g、10g、14.1g、，分别加入4个三口烧瓶；
称取PLP(磷酸吡哆醛)0.1g，加入三口烧瓶；
称取62g水，加入三口烧瓶，开搅拌；
向三口烧瓶中加入37mL 5M HCl溶液；
加入12g异丙胺，调节pH至8.5±0.1，用25％(v/v)异丙胺水溶液控制体系pH＝8.5±0.1，保持体系温度50±1℃；
加入10mL酶液，反应24h。
表2转氨酶的编码序列及转化率
本实施例中对底物的浓度进行优化，底物浓度在0.005M至1M之间均有反应，在0.2M至0.5M之间反应转化率最优。
实施例6：转氨酶反应的异丙胺优化
实验流程：
水浴锅温度设定为50℃；
取洁净三口烧瓶，加入磁力搅拌转子；
称取底物3.5g，加入三口烧瓶；
称取异丙胺盐酸盐1.91g、2.82g、3.82g、7.65g，加入三口烧瓶；
称取PLP(磷酸吡哆醛)40mg，加入三口烧瓶；
称取34g水，加入三口烧瓶，开搅拌；
用70％(v/v)异丙胺水溶液控制反应体系pH＝8.5±0.1，保持体系温度50℃±2℃；
加入酶液6mL，反应24h。
表3转氨酶的编码序列及转化率
本实施例中对异丙胺盐的浓度进行优化，异丙胺盐酸盐浓度在0.5M至2M之间酶均有反应，异丙胺盐酸盐浓度在0.5M至1M之间反应转化率最优。
实施例7：转氨酶反应的辅酶优化
实验流程：
水浴锅温度设定为50℃；
取洁净三口烧瓶，加入磁力搅拌转子；
称取底物3.5g，加入三口烧瓶；
称取异丙胺盐酸盐2.82g，加入三口烧瓶；
称取PLP(磷酸吡哆醛)5mg、20mg、35mg、50mg，加入三口烧瓶；
称取34g水，加入三口烧瓶，开搅拌；
用70％(v/v)异丙胺水溶液控制反应体系pH＝8.5±0.1，保持体系温度50℃±2℃；
加入酶液6mL，反应24h。
表4转氨酶的编码序列及转化率
本实施例中对辅酶的浓度进行优化，辅酶浓度在0.0005M至0.005M之间酶均有反应，在0.0035M时反应转化率最优。
实施例8：转氨酶的优化工艺
实验流程：
水浴锅温度设定为50℃；
取洁净三口烧瓶，加入磁力搅拌转子；
称取底物3.5g，加入三口烧瓶；
称取异丙胺盐酸盐2.82g，加入三口烧瓶；
称取PLP(磷酸吡哆醛)35mg，加入三口烧瓶；
称取34g水，加入三口烧瓶，开搅拌；
用70％(v/v)异丙胺水溶液控制反应体系pH＝8.5±0.1，保持体系温度50℃±2℃；
加入酶液6mL，反应24h。
表5转氨酶的编码序列及转化率
根据实施例8的结果表明，本申请的转氨酶可稳定的保持对底物的转化率。
实施例9：转氨酶的生产工艺
突变菌株14，氨基酸序列如SEQ ID NO.27所示，经实施例5、实施例6、实施例7的结果表明，其对沙库比曲手性前体的活力最高，为增加沙库比曲中间体产量，扩大酶反应体系。
实验流程：
水浴锅温度设定为50℃；
取洁净三口烧瓶；
称取底物35g，加入三口烧瓶；
称取异丙胺盐酸盐28.2g，加入三口烧瓶；
称取PLP(磷酸吡哆醛)350mg，加入三口烧瓶；
称取340g水，加入三口烧瓶，开机械搅拌；
用70％异丙胺控制反应体系pH＝8.5±0.1，保持体系温度50℃±2℃；
加入酶液60mL，反应24h。
实验结果：
从实施例9的结果可以看出，本申请的转氨酶在扩大反应体系后，转氨酶和底物可以更充分的接触，提高了底物转化率。
在上述实施例中，对各个实施例的描述都各有侧重，某个实施例中没有详述的部分，可以参见其他实施例的相关描述。
以上对本申请实施例所提供的一种转氨酶、核酸分子、重组表达载体及其应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本申请的方法及其核心思想；同时，对于本领域的技术人员，依据本申请的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。
Claims (15)
1.一种转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，或者为与所述SEQ ID NO：1至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列是由SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列发生一个或多个点突变得到的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的转氨酶，其特征在于，发生所述点突变的氨基酸包括SEQ IDNO：1中的第17位氨基酸Y、第19位氨基酸F、第57位氨基酸W、第86位氨基酸F、第165位氨基酸Y和第284位氨基酸S中的一个或多个。
4.根据权利要求2所述的转氨酶，其特征在于，所述点突变的取代氨基酸包括甲硫氨酸、组氨酸、丙氨酸、赖氨酸、天冬酰胺、色氨酸中的一种或者多种。
5.根据权利要求2所述的转氨酶，其特征在于，发生所述点突变的方式为Y17M、F19H、W57A、F86A、F86K、F86N、Y165W和S284A中的一种或者多种。
6.根据权利要求2所述的转氨酶，其特征在于，发生所述点突变的方式为以下任一所示组合：
(1)Y17M；
(2)F19H；
(3)W57A；
(4)F86A；
(5)F86K；
(6)F86N；
(7)Y165W；
(8)S284A；
(9)Y17M、F19H；
(10)Y17M、F19H、W57A；
(11)F86N、Y165W；
(12)F86N、Y165W、S284A；
(13)Y17M、F19H、W57A、F86N、Y165W、S284A。
7.根据权利要求2所述的转氨酶，其特征在于，所述转氨酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：25或SEQ ID NO：27所示。
8.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括用于编码如权利要求1～7中任一项所述转氨酶的核苷酸序列。
9.根据权利要求8所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列为下述任一项：
(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；
(b)所述核苷酸序列与所述SEQ ID NO：2至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％相似性；或
(c)所述核苷酸序列为(a)或(b)中所述核苷酸序列经密码子优化后获得的核苷酸序列。
10.根据权利要求9所述的核酸分子，其特征在于，所述核苷酸序列为SEQ ID NO：4、SEQID NO：6、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26或SEQ ID NO：28所示。
11.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含载体，以及如权利要求8～10中任一项所述的核酸分子。
12.一种转化体，其特征在于，所述转化体包括表达系统，以及如权利要求8～10中任一项所述的核酸分子或如权利要求11所述的重组表达载体。
13.一种酶制剂，其特征在于，所述酶制剂包括如权利要求1～7中任一项中所述的转氨酶。
14.一种如权利要求1～7中任一项所述的转氨酶、或如权利要求8～10中任一项所述的核酸分子、或如权利要求11所述的重组表达载体、或如权利要求12所述的转化体、或如权利要求13所述的酶制剂在制备(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸中的应用。
15.一种(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
将(2R)-2-甲基-4-羰基-5-(4-联苯)戊酸作为底物，与磷酸吡哆醛、异丙胺和水混合，以获得混合液；
将所述混合液与如权利要求1～7中任一项所述的转氨酶进行转氨接触以发生酶催化反应，生成(2R，4S)-5-联苯-4-氨基-2-甲基戊酸。
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