TWI777324B - 經修飾的daao酶及其應用 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及經修飾的D-胺基酸氧化酶(DAAO)。具體而言，本發明的經修飾的DAAO具有催化D草銨膦氧化為PPO的活性。此外，本發明的經修飾的DAAO與SEQ ID NO: 4相比具有提高的催化D草銨膦氧化為PPO的活性和/或提高的穩定性。本發明還涉及編碼本發明的經修飾的DAAO的多核苷酸、表現本發明的經修飾的DAAO的載體和宿主細胞以及使用本發明的經修飾的DAAO和宿主細胞生產L-草銨膦的方法。

Description

經修飾的DAAO酶及其應用
本發明涉及酶工程領域。具體而言，本發明涉及經修飾的D-胺基酸氧化酶(DAAO)及其在生產草銨膦中的應用。
草銨膦(glufosinate，也稱為4-[羥基(甲基)膦醯基]-D,L-高丙胺酸)是世界銷量第二的轉基因作物耐受的除草劑。草銨膦是一種廣譜觸殺型除草劑，通過抑制植物體內的L-穀氨醯胺合成酶的活性，導致植物體內氮代謝紊亂，最終殺死植物。與草甘膦相比，草銨膦具有顯著優勢，如應用範圍廣、見效快、持效期長、更低毒、安全等。因此，草銨膦的銷量增長迅速，在未來一段時間內市場需求巨大，前景非常廣闊。
但是，草銨膦的工藝路線複雜，導致產品生產技術難度高。高昂的價格阻礙其迅速取代草甘膦。目前市售的草銨膦是包含等量的兩種光學異構體的外消旋混合物(D,L-草銨膦)，但其中只有L-構型具有生理活性。因此，通過D,L-草銨膦去消旋化製備對掌性純的L-草銨膦具有重要現實意義，成為近年來合成L-草銨膦的熱門方向。
近年來報導從D,L-草銨膦製備L-草銨膦的方法眾多。傳統的化學修飾拆分法因成本高且不能利用D-型草銨膦而不具備競爭性。目前報導了下列將D-草銨膦轉化成為L-草銨膦的主要代表性技術路線： 1. 將D,L-草銨膦轉化成N-乙醯基草銨膦，再經羧肽酶催化，L型N-乙醯基草銨膦經選擇性水解，獲得L-草銨膦，而D型N-乙醯基草銨膦不水解，可經化學或酶法消旋化後再次迴圈進入水解步驟(參見例如中國專利申請CN108690854A)。該方法的缺點是需多步反應，還有需要將經水解獲得的L-草銨膦與N-乙醯化的受質分離。 2. 將D-草銨膦氧化成2-羰基-4-(羥基甲基膦醯基)丁酸(簡稱PPO)，再對PPO進行還原或轉胺生成L-草銨膦。在大部分文獻中，使用D-胺基酸氧化酶(DAAO)催化將D-草銨膦氧化成PPO，其中通常還需要添加過氧化氫酶(CAT)以移除生成的過氧化氫。PPO可以在鈀碳催化下被甲酸還原生成D,L-草銨膦，利用DAAO的立體選擇性，將D,L-草銨膦逐漸轉化為L-草銨膦(參見，例如，CN105567780A)。這個方案的缺點是鈀碳催化劑用量大，並且浪費反應原料(如氧氣和甲酸銨)。
還可以採用L-胺基酸轉胺酶(L-TA)催化的立體選擇性轉胺反應將PPO轉化成L-草銨膦(參見，例如，US20180030487A1)。這個方案的缺點在於，轉胺步驟是平衡反應，需要提供過量的胺基供體(胺基酸或有機胺)來實現高轉化率(例如提供3倍當量的胺基供體，轉化率90%)，而過量的胺基供體和對應的副產物將嚴重影響後續的分離純化步驟。
此外，可以通過L-胺基酸脫氫酶(L-AADH)催化的立體選擇性還原反應，將PPO轉化為L-草銨膦(參見，例如，CN107502647A、CN109576236A和CN109609582A)。這種方案中，轉化的受質濃度低或損失大。
比較上述方案，採用D-胺基酸氧化酶配合L-胺基酸脫氫酶的方案，具有潛在的成本優勢。但目前報導過的方法中，可以轉化的受質濃度普遍不高，或是損失過大，造成生產成本過高。實現高濃度的D,L-草銨膦去消旋化，成為目前的工藝瓶頸。
阻礙更高濃度的受質轉化的主要因素可能是：重組的DAAO酶穩定性較差而在反應釜的條件下不穩定，反應過程中酶失活。
另一個限制性因素是酶對D-草銨膦的選擇性催化活性。現有技術中對DAAO進行了一些修飾來賦予DAAO對D-草銨膦的活性： •  在US7,939,709中，使用來源於圓紅冬孢酵母(Rhodotorula toruloides ，又名Rhodotorula gracilis ，參見https://www.atcc.org/ products/all/10788.aspx)的DAAO的突變體實現了從D-草銨膦合成PPO的目的。該專利提及的圓紅冬孢酵母DAAO突變體中包含F58K突變，在位置M213取代為H、S、T、C、Q、G、N、和A的突變，以及在位置223和238的突變。Tim Hawks等在2011年發表的文章(D-glufosinate as a male sterility agent for hybrid seed production,Plant Biotechnology Journal , (2011) 9, pp. 301-314)，報導了上述專利的類似內容，採用圓紅冬孢酵母的DAAO，其包含58、213位的突變。 •  在US9,834,802中，使用圓紅冬孢酵母來源的DAAO的突變體配合轉胺酶(TA)實現了從D,L-草銨膦合成L-草銨膦。還描述了該DAAO的位置54、56、58、213和238包含一個或多個突變，並例舉了幾種具體組合方式。 •  在CN109576236A中，基於來自圓紅冬孢酵母的DAAO，也構建了可以氧化D-草銨膦的突變體。所述突變體在胺基酸第52位、第54位、第58位、第213位和第335位進行單突變或多突變。 •  在其他專利申請，如CN105567780A、CN109609582A中也涉及DAAO酶來氧化D-草銨膦，但未註明所用酶的序列。
但是，本領域仍需要提供具有更高的穩定性和/或對D-草銨膦具有更高活性的DAAO。
在第一方面，本發明提供一種經修飾的D-胺基酸氧化酶(DAAO)，與其野生型DAAO相比，包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個位置的胺基酸取代，其中所述經修飾的DAAO具有催化D-草銨膦氧化為PPO的活性。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO包含位置54、56、58和213的胺基酸取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號。較佳地，位置54取代為I、V、T或L，更佳I或V。較佳地，位置56取代為N。較佳地，位置58取代為H或Q，更佳H。較佳地，位置213取代為S或T，更佳S。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含位置210和/或221的胺基酸取代。較佳地，位置210取代為A、G或P，更佳A。較佳地，位置P221取代為R。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO包含位置54、58、213和221的胺基酸取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號。較佳地，位置54取代為V，位置58取代為Q，位置213取代為S，位置221取代為R。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含位置210和/或56的胺基酸取代。較佳地，位置56取代為N，位置210取代為A。
在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO還包含選自2、81、97、193、194、237、265、273、274、300、317、319、337和342的一或多個位置的取代。較佳地，位置2取代為C或S，位置81取代為Y，位置97取代為V，位置193取代為T，位置194取代為V或C，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S或T，位置317取代為Y或W，位置319取代為K，位置337取代為S，位置342取代為S或H。
或者，在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO還包含選自194、237、265、273、274、300、317和319的一或多個位置的取代。較佳地，位置194取代為V或C，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S，位置317取代為Y或W，位置319取代為K。
或者，在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO還包含選自位置2、81、97、193、300、337和342的一或多個位置的取代，其中位置2取代為C或S，位置81取代為Y，位置97取代為V，位置193取代為T，位置300取代為T，位置337取代為S，和位置342取代為S。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO，其與SEQ ID NO: 1相比，包含位置54、58、194和213的胺基酸取代，其中所述經修飾的DAAO具有催化D-草銨膦氧化為PPO的活性。較佳地，位置54取代為I、V、T或L，位置58取代為H或Q，位置194取代為V或C，位置213取代為S或T。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含選自位置56、210、221、237、265、273、274、300、317和319的一或多個位置的胺基酸取代。較佳地，位置56取代為N，位置210取代為A、G或P，位置P221取代為R，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S，位置317取代為Y或W，位置319取代為K。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO，包含SEQ ID NO: 5-86之一的胺基酸序列或由SEQ ID NO: 5-86之一的胺基酸序列組成，或者所述經修飾的DAAO與SEQ ID NO: 5-30和66-76之一相比，在除位置54、56、58、194、210、213、221、237、265、273、274、300、317和319之外的位置包含1-10個胺基酸取代，與SEQ ID NO: 31-57和77-86之一相比，在除位置2、54、56、58、81、97、193、210、213、221、300、337和342之外的位置包含1-10個胺基酸取代，或與SEQ ID NO: 58-65之一相比，在除位置54、56、58、210、213和221之外的位置包含1-10個胺基酸取代，其中所述經修飾的DAAO具有催化D-草銨膦氧化為PPO的活性。
在第二方面，本發明提供編碼本發明的經修飾的DAAO的多核苷酸，以及包含本發明的多核苷酸的載體。
在協力廠商面，本發明提供包含本發明的的經修飾的DAAO、其編碼多核苷酸或包含所述多核苷酸的載體的宿主細胞。
在第四方面，本發明還提供一種生產L-草銨膦的方法，包括使本發明的經修飾的DAAO或本發明的宿主細胞與D-草銨膦接觸。
本發明主要涉及經修飾的DAAO，用於催化D-草銨膦氧化，以生產L-草銨膦。除非另有說明，本文中使用的術語具有本領域技術人員一般理解的含義。 一、經修飾的D-胺基酸氧化酶
如本文所用，術語“D-胺基酸氧化酶”和“DAAO”是指催化D-胺基酸氧化生產酮酸的酶(EC 1.4.3.3)。通常，天然存在的DAAO不能催化D-草銨膦的氧化。因此，本發明提供經修飾的DAAO多肽，其能夠催化D-草銨膦氧化成PPO。較佳地所述經修飾的DAAO多肽具有提高的穩定性和/或提高的催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。
如本文所用，術語“肽”表示通過肽鍵連接的至少兩個胺基酸的鏈。術語“多肽”在本文中可以與屬於“蛋白質”互換使用，是指含有十個或更多個胺基酸殘基的鏈。本文中的所有肽和多肽化學式或序列均是從左至右書寫的，表示從胺基末端至羧基末端的方向。
術語“胺基酸”包括蛋白質中天然存在的胺基酸和非天然胺基酸。蛋白質中天然存在的胺基酸的單字母和三字母命名採用本領域慣用名，可見於Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd, ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)。 胺基酸      單字母      三字母 丙胺酸           A        Ala 精胺酸           R        Arg 天冬醯胺        N        Asn 天冬胺酸        D        Asp 半胱胺酸        C        Cys 穀氨醯胺        Q        Gln 麩胺酸           E        Glu 甘胺酸           G        Gly 組胺酸           H        His 異白胺酸        I         Ile 白胺酸           L        Leu 賴胺酸           K        Lys 甲硫胺酸        M       Met 苯丙胺酸        F        Phe 脯胺酸           P        Pro 絲胺酸           S        Ser 蘇胺酸           T        Thr 色胺酸           W       Trp 酪胺酸           Y        Tyr 纈胺酸           V        Val
如本文所用，術語“修飾”是指對多肽的任何化學修飾，例如胺基酸的取代、缺失、插入和/或添加。
在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個胺基酸取代，其中所述經修飾的DAAO多肽具有催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含位置54、56、58和213的胺基酸取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號。較佳地，位置54取代為I、V、T或L，更佳I或V。較佳地，位置56取代為N。較佳地，位置58取代為H或Q，更佳H。較佳地，位置213取代為S或T，更佳S。在一些較佳的實施方案中，所述經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含以下取代的組合：54V、56N、58H和213S，或54I、56N、58H和213S。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含位置210和/或221的胺基酸取代。較佳地，位置210取代為A、G或P，更佳A。較佳地，位置P221取代為R。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO包含位置54、58、213和221的胺基酸取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號。較佳地，位置54取代為V，位置58取代為Q，位置213取代為S，位置221取代為R。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含位置210和/或56的胺基酸取代。較佳地，位置56取代為N，位置210取代為A。
在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO還包含選自2、81、97、193、194、237、265、273、274、300、317、319、337和342的一或多個位置的取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號，其中所述經修飾的DAAO多肽催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。較佳地，位置2取代為C或S，位置81取代為Y，位置97取代為V，位置193取代為T，位置194取代為V或C，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S或T，位置317取代為Y或W，和位置319取代為K，位置337取代為S，和位置342取代為S或H。
或者，本發明的經修飾的DAAO還包含選自194、237、265、273、274、300、317和319的一或多個位置的取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號，其中所述經修飾的DAAO多肽催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。較佳地，位置194取代為V或C，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S，位置317取代為Y或W，和位置319取代為K。
或者，本發明的經修飾的DAAO還包含選自位置2、81、97、193、300、337和342的一或多個位置的取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號，其中所述經修飾的DAAO多肽催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。較佳地，位置2取代為C或S，位置81取代為Y，位置97取代為V，位置193取代為T，位置300取代為T，位置337取代為S，和位置342取代為S。
在一些實施方案中，與SEQ ID NO: 1相比，本發明的經修飾的DAAO包含位置54、58、194和213的胺基酸取代，其中所述經修飾的DAAO具有催化D-草銨膦氧化為PPO的活性。較佳地，位置54取代為I、V、T或L，位置58取代為H或Q，位置194取代為V或C，位置213取代為S或T。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含選自位置56、210、221、237、265、273、274、300、317和319的一或多個位置的胺基酸取代。較佳地，位置56取代為N，位置210取代為A、G或P，位置P221取代為R，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S，位置317取代為Y或W，位置319取代為K。在一些實施方案中，與SEQ ID NO: 1相比，本發明的經修飾的DAAO還具有一或多個胺基酸的保守取代，或具有一或多個胺基酸的插入或缺失。
在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO與其野生型相比，具有選自如下組合的胺基酸取代(位置參照SEQ ID NO: 2進行編號)： -   54V、58Q、194V、213S； -   54V、58Q、194C、213S； -   54V、58Q、213S、273D； -   54V、58Q、213S、317Y； -   54V、58Q、213S、317W； -   54V、58Q、213S、274E； -   54V、58Q、213S、319K； -   54V、58Q、194C、213S、317Y； -   54V、58Q、194C、213S、265C、317Y； -   54V、58Q、194C、213S、265C、300S、317Y； -   54V、58Q、194C、213T、265C、300S、317Y； -   54V、58Q、194C、213S、210G、265C、300S、317Y； -   54V、58Q、194C、213S、210P、265C、300S、317Y； -   54V、58Q、194C、213S、210A、265C、300S、317Y； -   54V、58Q、194C、213S、221R、265C、300S、317Y； -   54V、58Q、194C、213S、237A、265C、300S、317Y； -   54V、58Q、194C、213S、237V、265C、300S、317Y； -   54V、56N、58Q、194C、213S、265C、300S、317Y； -   54T、56N、58Q、194C、213S、265C、300S、317Y； -   54I、56N、58Q、194C、213S、265C、300S、317Y； -   54V、56N、58H、194C、213S、265C、300S、317Y； -   54L、56N、58Q、194C、213S、265C、300S、317Y； -   54I、56N、58H、194C、213S、265C、300S、317Y； -   54V、56N、58H、194C、213S、237V、265C、300S、317Y； -   54V、56N、58H、194C、213S、210A、237V、265C、300S、317Y； -   54I、56N、58H、194C、213S、210A、221R、265C、300S、317Y； -   54L、56N、58Q； -   54T、56N、58Q； -   54I、56N、58H； -   54V、56N、58H； -   54L、56N、58Q、213S； -   54T、56N、58Q、213S； -   54I、56N、58H、213S； -   54V、56N、58H、213S； -   2C、54V、56N、58H、213S； -   2S、54V、56N、58H、213S； -   54V、56N、58H、81Y、213S； -   54V、56N、58H、97V、213S； -   54V、56N、58H、193T、213S； -   54V、56N、58H、213S、300T； -   54V、56N、58H、213S、337S； -   54V、56N、58H、213S、342S； -   2S、54V、56N、58H、81Y、97V、193T、213S、337S； -   54V、56N、58H、97V、193A、213S、337S、342H； -   2C、54V、56N、58H、81Y、97V、213S、337S； -   2C、54V、56N、58H、81Y、97V、193A、213S、342S； -   54V、56N、58H、97V、193T、213S、337S、342H； -   54V、56N、58H、81Y、97V、193T、213S、337S、342H； -   54V、56N、58H、97V、193T、213S、300T、337S、342H； -   54V、56N、58H、81Y、97V、193T、213S、300T、337S、342H； -   54V、56N、58H、97V、193T、210A、213S、300T、337S、342H； -   54V、56N、58H、97V、193T、213S、221R、300T、337S、342H； -   54V、56N、58H、97V、193T、210A、213S、221R、300T、337S、342H； -   58K、213T； -   54V、56N、58H、210A、213S； -   54V、56N、58H、213S、221R； -   54V、56N、58H、210A、213S、221R； -   54I、56N、58H、210A、213S； -   54I、56N、58H、213S、221R； -   54I、56N、58H、210A、213S、221R； -   54V、58Q、213S； -   54V、58Q、210A、213S； -   54V、58Q、213S、221R；和 -   54V、58Q、210A、213S、221R。
在本文中，在其基礎上進行胺基酸修飾的DAAO多肽稱為起始DAAO。所述起始DAAO可以是野生型DAAO，也可以是野生型DAAO的變體。例如，從SEQ ID NO: 1的多肽開始進行修飾，則相對於經修飾的DAAO，SEQ ID NO: 1的多肽是“起始DAAO”；而如果從SEQ ID NO: 1的變體多肽(例如SEQ ID NO: 4-30)開始進行修飾，則相對於經修飾的DAAO，所述變體多肽是“起始DAAO”。
如本文所用，術語“野生型DAAO”是指天然存在的DAAO。在一些實施方案中，所述野生型DAAO是來自紅酵母屬的DAAO。在一些實施方案中，所述野生型DAAO是SEQ ID NO: 1-3之一。SEQ ID NO: 1是來自圓紅冬孢酵母的DAAO的胺基酸序列(GenBank登錄號：CAJ87425.1)，SEQ ID NO: 2是來自Rhodotorula sp. JG-1b的DAAO的胺基酸序列(GenBank登錄號：KWU45700.1)，且SEQ ID NO: 3是來自Rhodotorula taiwanensis 的推定的DAAO的胺基酸序列(GenBank登錄號：POY70719.1)。
對於本發明，為確定兩個胺基酸序列或兩個核酸序列的相同性百分比，以最佳比較為目的比對序列(例如在第一個胺基酸或核酸序列中可導入缺口，以與第二個胺基酸或核酸序列進行最佳比對)。然後比較在相應胺基酸位置或核苷酸位置的胺基酸殘基或核苷酸。當第一個序列中的位置在第二個序列中相應位置由相同胺基酸殘基或核苷酸佔據時，則這些分子在這個位置是相同的。兩個序列之間的相同性百分比是所述序列共有的相同位置的數量的函數(即相同性百分比=相同位置的數量/位置(即重疊位置)的總數量×100)。較佳地，這兩個序列是相同長度的。
本領域技術人員知曉，可以使用不同的電腦程式確定兩個序列之間的相同性。
“胺基酸相同性百分比”或者“胺基酸序列相同性百分比”是指比較兩個多肽的胺基酸，當最佳比對時，所述兩個多肽具有大約指定的相同胺基酸百分比。例如，“95%的胺基酸相同性”是指比較兩個多肽的胺基酸，當最佳比對時，所述兩個多肽有95%的胺基酸相同。
在一些實施方案中，所述野生型DAAO與SEQ ID NO: 1-3之一具有至少65%，較佳至少70%、75%或80%，更佳至少85%、90%或95%，特佳至少96%、97%、98%或99%的序列相同性。
在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個胺基酸取代，其中所述經修飾的DAAO多肽催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含位置54、56、58和213的胺基酸取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號。較佳地，位置54取代為I、V、T或L，更佳I或V。較佳地，位置56取代為N。較佳地，位置58取代為H或Q，更佳H。較佳地，位置213取代為S或T，更佳S。在一些較佳的實施方案中，所述經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含以下取代：54V、56N、58H和213S，或54I、56N、58H和213S。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含位置210和/或221的胺基酸取代。較佳地，位置210取代為A、G或P，更佳A。較佳地，位置P221取代為R。較佳地，本發明的經修飾的DAAO還包含選自194、237、265、273、274、300、317和319的一或多個位置的取代，其中位置194取代為V或C，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S，位置317取代為Y或W，和位置319取代為K。較佳地，所述野生型DAAO與SEQ ID NO: 1具有至少65%，較佳至少70%、75%或80%，更佳至少85%、90%或95%，特佳至少96%、97%、98%或99%的序列相同性。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO包含位置54、58、213和221的胺基酸取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號。較佳地，位置54取代為V，位置58取代為Q，位置213取代為S，位置221取代為R。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含位置210和/或56的胺基酸取代。較佳地，位置56取代為N，位置210取代為A。較佳地，本發明的經修飾的DAAO還包含選自194、237、265、273、274、300、317和319的一或多個位置的取代，其中位置194取代為V或C，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S，位置317取代為Y或W，和位置319取代為K。較佳地，所述野生型DAAO與SEQ ID NO: 1具有至少65%，較佳至少70%、75%或80%，更佳至少85%、90%或95%，特佳至少96%、97%、98%或99%的序列相同性。
在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個胺基酸取代，其中所述經修飾的DAAO多肽催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含位置54、56、58和213的胺基酸取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號。較佳地，位置54取代為I、V、T或L，更佳I或V。較佳地，位置56取代為N。較佳地，位置58取代為H或Q，更佳H。較佳地，位置213取代為S或T，更佳S。在一些較佳的實施方案中，所述經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含以下取代：54V、56N、58H和213S，或54I、56N、58H和213S。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含位置210和/或221的胺基酸取代。較佳地，位置210取代為A、G或P，更佳A。較佳地，位置P221取代為R。較佳地，本發明的經修飾的DAAO還包含選自位置2、81、97、193、300、337和342的一或多個位置的取代，其中位置2取代為C或S，位置81取代為Y，位置97取代為V，位置193取代為T，位置300取代為T，位置337取代為S，和位置342取代為S。較佳地，所述野生型DAAO與SEQ ID NO: 2具有至少65%，較佳至少70%、75%或80%，更佳至少85%、90%或95%，特佳至少96%、97%、98%或99%的序列相同性。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO包含位置54、58、213和221的胺基酸取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號。較佳地，位置54取代為V，位置58取代為Q，位置213取代為S，位置221取代為R。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含位置210和/或56的胺基酸取代。較佳地，位置56取代為N，位置210取代為A。較佳地，本發明的經修飾的DAAO還包含選自位置2、81、97、193、300、337和342的一或多個位置的取代，其中位置2取代為C或S，位置81取代為Y，位置97取代為V，位置193取代為T，位置300取代為T，位置337取代為S，和位置342取代為S。較佳地，所述野生型DAAO與SEQ ID NO: 2具有至少65%，較佳至少70%、75%或80%，更佳至少85%、90%或95%，特佳至少96%、97%、98%或99%的序列相同性。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO與野生型相比，包含4-20、4-15、4-14、4-13、4-12、4-11、4-10、4-9、4-8、4-7、4-6或4-5個胺基酸取代。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO與野生型相比，包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個胺基酸取代。
在一些實施方案，所述野生型DAAO與SEQ ID NO: 1-3之一的區別在於，具有一或多個胺基酸的取代、缺失、插入和/或添加。在一些實施方案中，所述野生型DAAO與SEQ ID NO: 1-3之一相比，具有一或多個胺基酸的保守取代。在一些實施方案中，所述野生型DAAO與SEQ ID NO: 1-3之一相比，具有一或多個胺基酸的插入或缺失。
在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個胺基酸取代，其中所述經修飾的DAAO多肽催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含位置54、56、58和213的胺基酸取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號，其中所述經修飾的DAAO與SEQ ID NO: 1-3之一具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%的序列相同性。較佳地，位置54取代為I、V、T或L，更佳I或V。較佳地，位置56取代為N。較佳地，位置58取代為H或Q，更佳H。較佳地，位置213取代為S或T，更佳S。在一些較佳的實施方案中，所述經修飾的DAAO多肽與其野生型DAAO相比，包含以下取代的組合：54V、56N、58H和213S，或54I、56N、58H和213S。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含位置210和/或221的胺基酸取代。較佳地，位置210取代為A、G或P，更佳A。較佳地，位置P221取代為R。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO包含位置54、58、213和221的胺基酸取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號，其中所述經修飾的DAAO與SEQ ID NO: 1-3之一具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%的序列相同性。較佳地，位置54取代為V，位置58取代為Q，位置213取代為S，位置221取代為R。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含位置210和/或56的胺基酸取代。較佳地，位置56取代為N，位置210取代為A。
在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO還包含選自2、81、97、193、194、237、265、273、274、300、317、319、337和342的一或多個位置的取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號，其中所述經修飾的DAAO多肽催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。較佳地，位置2取代為C或S，位置81取代為Y，位置97取代為V，位置193取代為T，位置194取代為V或C，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S或T，位置317取代為Y或W，和位置319取代為K，位置337取代為S，和位置342取代為S或H。
或者，本發明的經修飾的DAAO還包含選自194、237、265、273、274、300、317和319的一或多個位置的取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號，其中所述經修飾的DAAO多肽催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。較佳地，位置194取代為V或C，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S，位置317取代為Y或W，和位置319取代為K。
或者，本發明的經修飾的DAAO還包含選自位置2、81、97、193、300、337和342的一或多個位置的取代，所述位置參照SEQ ID NO: 2進行編號，其中所述經修飾的DAAO多肽催化D-草銨膦氧化成PPO的活性。較佳地，位置2取代為C或S，位置81取代為Y，位置97取代為V，位置193取代為T，位置300取代為T，位置337取代為S，和位置342取代為S。
在一些實施方案中，與SEQ ID NO: 1相比，本發明的經修飾的DAAO包含位置54、58、194和213的胺基酸取代，其中所述經修飾的DAAO具有催化D-草銨膦氧化為PPO的活性，其中所述經修飾的DAAO與SEQ ID NO: 1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%或98%的序列相同性。較佳地，位置54取代為I、V、T或L，位置58取代為H或Q，位置194取代為V或C，位置213取代為S或T。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO還包含選自位置56、210、221、237、265、273、274、300、317和319的一或多個位置的胺基酸取代。較佳地，位置56取代為N，位置210取代為A、G或P，位置P221取代為R，位置237取代為V，位置265取代為C，位置273取代為D，位置274取代為E，位置300取代為S，位置317取代為Y或W，位置319取代為K。在一些實施方案中，與SEQ ID NO: 1相比，本發明的經修飾的DAAO還具有一或多個胺基酸的保守取代，或具有一或多個胺基酸的插入或缺失。
術語“保守取代”也稱為由“同源”胺基酸殘基取代，是指其中胺基酸殘基由具有相似側鏈的胺基酸殘基置換的取代，例如，鹼性側鏈的胺基酸(例如賴胺酸、精胺酸和組胺酸)、酸性側鏈的胺基酸(例如天冬胺酸、麩胺酸)、非荷電極性側鏈胺基酸(例如甘胺酸、天冬醯胺、穀氨醯胺、絲胺酸、蘇胺酸、酪胺酸、半胱胺酸)、非極性側鏈胺基酸(例如丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸、甲硫胺酸、色胺酸)、β-分支的側鏈胺基酸(例如蘇胺酸、纈胺酸、異白胺酸)及芳香側鏈胺基酸(例如酪胺酸、苯丙胺酸、色胺酸、組胺酸)。
保守胺基酸取代通常對所得蛋白質的活性的影響最小。這種取代在下文描述。保守取代是用大小、疏水性、電荷、極性、空間特徵、芳香性等相似的胺基酸置換一個胺基酸。當希望精細調節蛋白質的特性時，這種取代通常是保守的。
如本文所用，“同源”胺基酸殘基是指具有相似化學性質的胺基酸殘基，所述化學性質涉及疏水性、電荷、極性、空間特徵、芳香性特徵等。彼此同源的胺基酸的例子包括正電荷的賴胺酸、精胺酸、組胺酸，負電荷的麩胺酸、天冬胺酸，疏水性的甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸、異白胺酸、脯胺酸、苯丙胺酸，極性的絲胺酸、蘇胺酸、半胱胺酸、甲硫胺酸、色胺酸、酪胺酸、天冬醯胺、穀氨醯胺，芳香性的苯丙胺酸、酪胺酸、色胺酸，化學相似側鏈基團的絲胺酸與蘇胺酸，或者穀氨醯胺和天冬醯胺，或者白胺酸和異白胺酸。
蛋白質中胺基酸保守取代的例子包括：Ser取代Ala，Lys取代Arg，Gln或His取代Asn，Glu取代Asp，Ser取代Cys，Asn取代Gln，Asp取代Glu，Pro取代Gly，Asn或Gln取代His，Leu或Val取代Ile，Ile或Val取代Leu，Arg或Gln取代Lys，Leu或Ile取代Met，Met、Leu或Tyr取代Phe，Thr取代Ser，Ser取代Thr，Tyr取代Trp，Trp或Phe取代Tyr，及Ile或Leu取代Val。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO，包含SEQ ID NO: 5-86之一的胺基酸序列或由SEQ ID NO: 5-86之一的胺基酸序列組成，或者所述經修飾的DAAO與SEQ ID NO: 5-30和66-76之一相比，在除位置54、56、58、194、210、213、221、237、265、273、274、300、317和319之外的位置包含1-10個胺基酸取代，與SEQ ID NO: 31-57和77-86之一相比，在除位置2、54、56、58、81、97、193、210、213、221、300、337和342之外的位置包含1-10個胺基酸取代，或與SEQ ID NO: 58-65之一相比，在除位置54、56、58、210、213和221之外的位置包含1-10個胺基酸取代，其中所述經修飾的DAAO具有催化D-草銨膦氧化為PPO的活性。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO與SEQ ID NO: 5-30和66-76之一相比，在除位置54、56、58、194、210、213、221、237、265、273、274、300、317和319之外的位置包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸取代；與SEQ ID NO: 31-57和77-86之一相比，在除位置2、54、56、58、81、97、193、210、213、221、300、337和342之外的位置包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸取代；或與SEQ ID NO: 58-65之一相比，在除位置54、56、58、210、213和221之外的位置包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多個胺基酸取代。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO與SEQ ID NO: 1-3之一具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的序列相同性。
如本文所用，酶的活性指在一定條件下，在單位品質的酶催化的化學反應中，單位時間內受質的減少量或產物的增加量。例如，本發明的經修飾的DAAO的活性，用一定條件下，在單位品質的經修飾的DAAO催化下，單位時間內D-草銨膦減少的量或PPO增加的量來表示。
在本文中，酶的活性也可以指酶的相對活性，以感興趣的酶的活性與催化相同反應的給定的酶的活性的比值表示，如百分比相對活性。
在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO的活性以與SEQ ID NO: 4相比的百分比相對活性表示。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO催化D-草銨膦氧化為PPO的活性是SEQ ID NO: 4的催化D-草銨膦氧化為PPO的活性的至少100%、105%、110%、120%、130%、150%、170%、200%、250%、300%或更高。
提高經修飾的DAAO的穩定性對於應用於工業生產也是有利的。在一些實施方案中，所述穩定性是熱穩定性，指酶在一定溫度(如40-60ºC或更高)溫育一定時間(如10分鐘至1小時)後的保持活性的能力。在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO具有優於SEQ ID NO: 4的多肽的熱穩定性。例如，在43-45ºC溫育20分鐘後，本發明的經修飾的DAAO的活性是SEQ ID NO: 4的多肽的活性的至少100%、105%、110%、120%、130%、150%、170%、200%、250%、300%或更高。或者，本發明的經修飾的DAAO具有更高的T50，其中T50是指在該溫度溫育一小時後，酶的活性下降50%的溫度。在一些實施方案中，本發明的經修飾的DAAO的T50比SEQ ID NO: 4的多肽高約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 ºC或更高。
在一些實施方案中，所述經修飾的DAAO具有優於SEQ ID NO: 4的多肽的熱穩定性，且其催化D-草銨膦氧化為PPO的活性是SEQ ID NO: 4的催化D-草銨膦氧化為PPO的活性的至少100%、105%、110%、120%、130%、150%、170%、200%、250%、300%或更高。 二、編碼經修飾的DAAO的多核苷酸
如本文所用，術語“多核苷酸”或者“核酸分子”包括DNA分子(例如cDNA或基因組DNA)和RNA分子(例如mRNA)及使用核苷酸類似物產生的DNA或RNA的類似物。所述核酸分子可以是單鏈或雙鏈的，較佳雙鏈DNA。所述核酸的合成可以使用核苷酸類似物或衍生物(例如肌苷或硫代磷酸核苷酸)。這種核苷酸可以用於，例如，製備具有改變的鹼基配對能力或者增加的核酸酶抗性的核酸。
本發明還提供編碼本發明的經修飾的DAAO的多核苷酸。因此，在本發明中，術語修飾還包括對編碼本發明的DAAO多肽的多核苷酸的遺傳操作。所述修飾可以是核苷酸的取代、缺失、插入和/或添加。
如本文所用，術語“編碼”是指多核苷酸直接指定其蛋白質產物的胺基酸序列。編碼序列的邊界一般由開放讀框確定，所述開放讀框通常以ATG起始密碼子或另外的起始密碼子如GTG和TTG開始，以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結束。所述編碼序列可以是DNA、cDNA或重組核苷酸序列。
此外，涵蓋本發明的全部或部分核酸序列的核酸分子可以通過聚合酶鏈反應(PCR)分離，所述PCR使用基於所述序列中包含的序列資訊設計合成的寡核苷酸引物。
本發明的多核苷酸可以使用cDNA、mRNA或者基因組DNA作為範本及合適的寡核苷酸引物根據標準PCR擴增技術進行擴增。如此擴增的核酸可以克隆進合適的載體中，並通過DNA序列分析進行表徵。
本發明的多核苷酸可以通過標準的合成技術製備，例如使用自動化DNA合成儀製備。
本發明還涉及本文描述的核酸分子的互補鏈。與其它核苷酸序列互補的核酸分子是與該核苷酸序列充分互補的分子，使得其可以與其他核苷酸序列雜交，從而形成穩定雙鏈體。
如本文所用，術語“雜交”是在給定的嚴格雜交和洗滌條件下，彼此至少大約90%、較佳至少大約95%、更佳至少大約96%、更佳至少98%同源的核苷酸序列通常保持彼此雜交。
本領域技術人員知道各種用於雜交的條件，如嚴格雜交條件和高度嚴格雜交條件。參見，例如，Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；和Ausubel et al. (eds.), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y.。
當然，本發明的多核苷酸不包括僅與poly A序列(如mRNA的3’末端poly(A))或者與互補的一段poly T (或U)殘基雜交的多核苷酸。 三、表現和生產經修飾的DAAO
為表現本發明的經修飾的DAAO，還提供包含本發明的多核苷酸的核酸構建體和載體，如表現載體。
如本文所用，術語“表現”包括多肽生產中包含的任何步驟，包括但不限於轉錄、轉錄後修飾、翻譯、翻譯後修飾和分泌。
術語“核酸構建體”是指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在的基因或者被修飾為含有天然不存在的核酸區段。當所述核酸構建體含有表現本發明編碼序列所需的控制序列時，術語核酸構建體與術語“表現盒”同義。
術語“表現載體”在本文是指線性或環形DNA分子，其包含編碼本發明多肽的多核苷酸，所述多核苷酸與為所述多核苷酸表現而提供的另外的核苷酸，例如，控制序列，可操縱地連接。所述表現載體包括病毒載體或質體載體。
術語“控制序列”在本文是指包括表現編碼本發明多肽的多核苷酸所需或有利的所有元件。各控制序列對於編碼多肽的核苷酸序列可以是天然的或者是外來的，或者彼此是天然或者外來的。這種控制序列包括但不限於前導序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列及轉錄終止子。最低限度，控制序列包括啟動子和轉錄及轉譯終止信號。
例如，所述控制序列可以是合適的啟動子序列，一種由宿主細胞識別以表現編碼本發明多肽的多核苷酸的核苷酸序列。所述啟動子序列含有介導所述多肽的表現的轉錄控制序列。所述啟動子可以是在所選擇的宿主細胞中表現出轉錄活性的任何核苷酸序列，例如，大腸桿菌(Escherichia coli ) lac操縱子。所述啟動子還包括突變的、截短的和雜合的啟動子，並且可以從與宿主細胞同源或異源的編碼胞外或胞內多肽的基因獲得。
術語“可操縱地連接”在本文是指這樣的構型，其中控制序列置於相對於多核苷酸序列的編碼序列的適當位置，由此所述控制序列指導多肽編碼序列的表現。
編碼本發明多肽的多核苷酸可以進行各種操作，以使得多肽表現。在將其插入載體之前，根據表現載體對多核苷酸的操作是可取的或必需的。利用重組DNA方法修飾多核苷酸序列的技術為本領域熟知。
為了鑒定和選擇包含本發明的表現載體的宿主細胞，本發明的載體較佳含有一或多個可選擇標記，其使得可以對轉化、轉染、轉導等的細胞進行簡單的選擇。可選擇標記是一種基因，其產物提供生物殺滅劑或病毒抗性、重金屬抗性、補充營養缺陷型等。例如，細菌的可選擇標記是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者賦予抗生素抗性如氨苄青黴素、卡那黴素、氯黴素或四環素抗性的標記。
本發明的載體可整合進宿主細胞基因組中或者在細胞中不依賴於基因組而自主複製。為了整合進宿主細胞基因組中或者自主複製所需的元件是本領域已知的(參見例如前述Sambrook et al., 1989)。
載體DNA可以通過常規轉化或轉染技術導入原核或真核細胞中。如本文所用，術語“轉化”和“轉染”是指將外源核酸(例如DNA)導入宿主細胞中的各種本領域公認的技術，可見於例如前述Sambrook et al., 1989；Davis et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)及其它實驗室手冊。
本發明還涉及重組宿主細胞，其包含本發明的多核苷酸，所述多核苷酸有利地用於DAAO多肽的重組產生中。包含本發明多核苷酸的載體被導入宿主細胞中，由此所述載體作為染色體整合體或作為自身複製染色體外載體被保留。本領域技術人員知曉表現蛋白質的常規載體和宿主細胞。
在一些實施方案中，本發明的宿主細胞是大腸桿菌細胞，如大腸桿菌BL21(DE3)。在一些實施方案中，所述表現載體是pET-30a(+)。
本發明的經修飾的DAAO可以與非-DAAO多肽(例如異源胺基酸序列)可操縱地連接，形成融合蛋白。例如，在一個實施方案中，所述融合蛋白是GST-DAAO融合蛋白，其中DAAO序列與GST序列的C-末端融合。這種融合蛋白可幫助重組DAAO的純化。在另一實施方案中，所述融合蛋白是在其N末端含有異源信號序列的DAAO蛋白。在某些宿主細胞中(例如哺乳動物和酵母宿主細胞)，可以通過使用異源信號序列增加DAAO的表現和/或分泌。 四、生產L-草銨膦
此外，本發明提供一種製備L-草銨膦的方法，包括使本發明的經修飾的DAAO或宿主細胞與D-草銨膦接觸。
在一些實施方案中，本發明的製備L-草銨膦的方法包括如下步驟： (a) 向反應介質提供本發明的經修飾的DAAO的活性和D-草銨膦，視情況地，向所述反應介質提供過氧化氫酶活性， (b) 溫育所述反應介質以使得D-草銨膦氧化為PPO，及 (c) 對PPO進行還原或轉胺生成L-草銨膦。
在一些實施方案中，使用無細胞催化方法生產L-草銨膦，在步驟(a)中，提供本發明的經修飾的DAAO。在一些實施方案中，可以使用游離或固定化的本發明的修飾的DAAO。過氧化氫酶也可以被固定化。
在一些實施方案中，所述溫育在20-50ºC，較佳25-40ºC，更佳28-35ºC，例如30ºC進行。
在一些實施方案中，所述介質是緩衝液，例如PBS、Tris-HCl緩衝液。在一個實施方案中，所述介質是Tris-HCl緩衝液，例如50mM、pH8.0的Tris-HCl緩衝液。
在一些實施方案中，反應介質是部分或全部由細胞培養基組成的介質，本發明的經修飾的DAAO的活性由本發明的宿主細胞提供，所述宿主細胞在所述反應介質中培養。
在一些實施方案中，所述反應介質是部分或全部由細胞培養基組成的介質，且所述過氧化氫酶活性由本發明的宿主細胞或者由第二種宿主細胞提供，所述宿主細胞在所述反應介質中培養。
在一些實施方案中，將本發明的宿主細胞和/或所述第二宿主細胞在細胞培養基中培養並擴增，然後從細胞培養基分離經擴增的宿主細胞，使用緩衝液或水使生物量重懸浮。在加入所述經擴增的宿主細胞之前、期間或之後在所述緩衝液或水中加入D-草銨膦。
在一些實施方案中，可以使用細菌細胞，例如大腸桿菌細胞。 實施例
通過以下實施例，本領域技術人員會更清楚地理解本發明。應理解，實施例只是用於說明，而非限制本發明的範圍 實施例1、材料和方法
如無特別說明，本發明中使用的實驗方法均為常規方法，基因克隆操作具體可參見前述Sambrook et al., 1989。 i) 試劑：DNA聚合酶(PrimeSTAR Max DNA Polymerase)和DpnI內切酶購自TaKaRa公司，質體提取試劑盒購自Axygen公司，過氧化氫酶購自棗莊全鼎生物科技有限公司，貨號QD-001，D,L-草銨膦購自利爾化學股份有限公司。 ii) 載體和菌株：所使用的表現載體為pET-30a(+)，質體購自Novagen公司，所使用的宿主細胞為大腸桿菌BL21(DE3)，購自天根生化科技(北京)有限公司。 iii) 測序與引物合成由蘇州泓迅生物科技股份有限公司完成。 iv) 定點突變： 設計特異性引物對，在所需突變的胺基酸位置對應鹼基引入所需的取代。用提取的突變前質體(包含野生型DAAO編碼序列，pET-30a(+)骨架)為模版，利用Quickchange技術(Nucleic Acids Research , 2004, 32(14):e115)通過PCR引入突變。PCR擴增結束後，擴增產物用DpnⅠ消化4h去除模版質體。將消化產物轉化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞中，塗布於LB瓊脂培養基(含有50mg/L的卡那黴素)、挑單菌落至LB液體培養基(含有50mg/L的卡那黴素)中培養，測序驗證突變正確性。經驗證的克隆置於-80℃保藏備用。 v) 蛋白表現及粗酶液的製備： 在LB瓊脂培養基上將保藏的克隆活化。然後，將單菌落接種至LB液體培養基(含有50mg/L的卡那黴素)中，37°C震盪溫育12h。將1mL培養物轉接至50mL新鮮的LB液體培養基(含有50mg/L的卡那黴素)中，37°C震盪溫育至OD600達到0.6左右，加入IPTG (終濃度為0.4mM)在25°C溫育16h以誘導蛋白質表現。 溫育後，將培養物以4,000g在4°C離心10min，棄上清，收集大腸桿菌細胞。將收集的大腸桿菌細胞重懸於預冷的15mL pH 7.0的磷酸鹽緩衝液(PBS)中，在4°C超聲破碎大腸桿菌細胞。細胞破碎液以6,000g在4°C離心15min去除沉澱，得到的上清為含重組酶的粗酶液(13g/L)。 vi) 酶活性測定 將D,L-草銨膦溶解於50mM pH＝8的Tris-HCl緩衝液中，溶液中D,L-草銨膦的終濃度為100mM。向上述溶液加入2g/L的粗酶和2g/L的過氧化氫酶。在30°C，於振盪器上持續震盪(400rpm) 2小時，取樣並用OPA柱前衍生化高效液相色譜檢測D-草銨膦的減少量與ee值，從而測定催化反應初始速度。 實施例2、製備和檢測來自圓紅冬孢酵母的DAAO (RtDAAO)的突變體
以RtDAAO (SEQ ID NO: 1)的編碼核酸為範本，根據實施例1的方法製備突變體。所得突變體如表1所示，其中SEQ ID NO: 4的突變體是US 9,834,802中報導的突變體(RtDAAO N54V、F58Q、M213S)。將得到的突變體在45°C溫育20min後根據實施例1描述的方法測量酶活性，結果示於表1，其中相對酶活性是指溫育後，突變體的活性vs. SEQ ID NO: 4的活性的百分比(100-150%表示為“+”，150-200%表述為“++”，大於200%表述為“+++”)。
表1
突變體中的取代 SEQ ID NO: 相對酶活性
N54V、F58Q、A194V、M213S 5 +++
N54V、F58Q、A194C、M213S 6 +++
N54V、F58Q、M213S、E273D 7 ++
N54V、F58Q、M213S、A317Y 8 ++
N54V、F58Q、M213S、A317W 9 +++
N54V、F58Q、M213S、G274E 10 ++
N54V、F58Q、M213S、A319K 11 +
N54V、F58Q、A194C、M213S、A317Y 12 +++
然後在SEQ ID NO: 12的基礎上進一步進行突變，所得突變體如表2所示。測量所的突變體的相對酶活性(不經熱處理，突變體的活性 vs. SEQ ID NO: 4的活性的百分比)。然後，並將所得突變體在一系列溫度(40-60°C)溫育1h，並測量T50 (在該溫度溫育1h，酶活性降低50%)，結果示於表2。
表2
突變體中的取代 SEQ ID NO: T50* 相對酶活性
N54V、F58Q、M213S 4 41-43°C 100%
N54V、F58Q、A194C、M213S、A317Y 12 47-48°C 103%
N54V、F58Q、A194C、M213S、T265C、A317Y 13 49-50°C 124%
N54V、F58Q、A194C、M213S、T265C、V300S、A317Y 14 52-53°C 128%
在SEQ ID NO: 14的基礎上進一步引入胺基酸取代，並檢測突變體的酶活性(不經熱處理)，所得結果示於表3，其中相對酶活性是指，不經熱處理，突變體的活性 vs. SEQ ID NO: 4的活性的百分比(110-120%表示為“+”，120-150%表示為“++”，150-200%表示為“+++”，大於200%表示為“++++”)。
表3
突變體中的取代 SEQ ID NO: 相對酶活性
N54V、F58Q、A194C、M213T、T265C、V300S、A317Y 15 ++
N54V、F58Q、A194C、M213S、R210G、T265C、V300S、A317Y 16 ++
N54V、F58Q、A194C、M213S、R210P、T265C、V300S、A317Y 17 ++
N54V、F58Q、A194C、M213S、R210A、T265C、V300S、A317Y 18 ++
N54V、F58Q、A194C、M213S、P221R、T265C、V300S、A317Y 19 +++
N54V、F58Q、A194C、M213S、T237A、T265C、V300S、A317Y 20 ++
N54V、F58Q、A194C、M213S、T237V、T265C、V300S、A317Y 21 ++
N54V、T56N、F58Q、A194C、M213S、T265C、V300S、A317Y 22 +++
N54T、T56N、F58Q、A194C、M213S、T265C、V300S、A317Y 23 +++
N54I、T56N、F58Q、A194C、M213S、T265C、V300S、A317Y 24 ++++
N54V、T56N、F58H、A194C、M213S、T265C、V300S、A317Y 25 ++++
N54L、T56N、F58Q、A194C、M213S、T265C、V300S、A317Y 26 ++++
N54I、T56N、F58H、A194C、M213S、T265C、V300S、A317Y 27 ++++
N54V、T56N、F58H、A194C、M213S、T237V、T265C、V300S、A317Y 28 ++++
N54V、T56N、F58H、A194C、M213S、R210A、T237V、T265C、V300S、A317Y 29 ++++
N54I、T56N、F58H、A194C、M213S、R210A、P221R、T265C、V300S、A317Y 30 ++++
實施例3、製備和檢測來自Rhodotorula sp. JG-1b的DAAO (RsDAAO)的突變體
以RsDAAO (SEQ ID NO: 2)的編碼核酸為範本，根據實施例1的方法製備突變體，並測量酶活性。所得突變體及其酶活性如表4所示，其中相對酶活性是指，不經熱處理，突變體的活性 vs. SEQ ID NO: 4的活性的百分比(小於70%表述為“--”，70-100%表示為“-”，110-120%表示為“+”，120-150%表示為“++”，150-200%表示為“+++”，大於200%表示為“++++”)，野生型RsDAAO (SEQ ID NO: 2)的活性為0。
表4
突變體中的取代 SEQ ID NO: 相對酶活性
N54L、T56N、F58Q 31 --
N54T、T56N、F58Q 32 --
N54I、T56N、F58H 33 +++
N54V、T56N、F58H 34 ++
N54L、T56N、F58Q、M213S 35 +++
N54T、T56N、F58Q、M213S 36 +++
N54I、T56N、F58H、M213S 37 ++++
N54V、T56N、F58H、M213S 38 ++++
在SEQ ID NO: 38的基礎上進一步引入胺基酸取代，並測量所得突變體的酶活性。所得突變體如表5所示，(不經熱處理)突變體的活性與SEQ ID NO: 38相當。將SEQ ID NO: 38的突變體和進一步引入胺基酸取代所得的突變體在43°C溫育20min，測量經溫育的突變體的活性，結果示於表5，其中相對酶活性是指在43°C溫育20min後，突變體的活性vs. SEQ ID NO: 38的活性的百分比(150-200%表述為“++”，大於200%表述為“+++”)。
表5
突變體中的取代 SEQ ID NO: 相對酶活性
T2C、N54V、T56N、F58H、M213S 39 +++
T2S、N54V、T56N、F58H、M213S 40 ++
N54V、T56N、F58H、F81Y、M213S 41 ++
N54V、T56N、F58H、A97V、M213S 42 +++
N54V、T56N、F58H、E193T、M213S 43 ++
N54V、T56N、F58H、M213S、S300T 44 +++
N54V、T56N、F58H、M213S、A337S 45 +++
N54V、T56N、F58H、M213S、G342S 46 +++
T2S、N54V、T56N、F58H、F81Y、A97V、E193T、M213S、A337S 47 +++
N54V、T56N、F58H、A97V、E193A、M213S、A337S、G342H 48 +++
T2C、N54V、T56N、F58H、F81Y、A97V、M213S、A337S 49 +++
T2C、N54V、T56N、F58H、F81Y、A97V、E193A、M213S、G342S 50 +++
N54V、T56N、F58H、A97V、E193T、M213S、A337S、G342H 51 +++
N54V、T56N、F58H、F81Y、A97V、E193T、M213S、A337S、G342H 52 +++
N54V、T56N、F58H、A97V、E193T、M213S、S300T、A337S、G342H 53 +++
N54V、T56N、F58H、F81Y、A97V、E193T、M213S、S300T、A337S、G342H 54 +++
在SEQ ID NO: 54的基礎上進一步引入胺基酸取代，並測量所得突變體的酶活性。所得突變體及其酶活性如表6所示，其中相對酶活性是指，不經熱處理，突變體的活性 vs. SEQ ID NO: 4的活性的百分比(120-150%表示為“++”，150-200%表示為“+++”，大於200%表示為“++++”)。
表6
突變體中的取代 SEQ ID NO: 相對酶活性
N54V、T56N、F58H、A97V、E193T、R210A、M213S、S300T、A337S、G342H 55 ++++
N54V、T56N、F58H、A97V、E193T、M213S、P221R、S300T、A337S、G342H 56 ++++
N54V、T56N、F58H、A97V、E193T、R210A、M213S、P221R、S300T、A337S、G342H 57 ++++
實施例4、製備和檢測來自Rhodotorula taiwanensis 的DAAO (RtnDAAO)的突變體
以RtnDAAO (SEQ ID NO: 3)的編碼核酸為範本，根據實施例1的方法製備突變體，並測量酶活性。所得突變體及其酶活性如表7所示，其中相對酶活性是指突變體的活性 vs. SEQ ID NO: 4的活性的百分比(小於70%表述為“--”，70-100%表示為“-”，110-120%表示為“+”，120-150%表示為“++”)，野生型RtnDAAO (SEQ ID NO: 3)的活性為0。
表7
突變體中的取代 SEQ ID NO: 相對酶活性
F58K、M213T 58 --
N54L、T56N、F58Q、M213S 59 --
N54T、T56N、F58Q、M213S 60 --
N54I、T56N、F58H、M213S 61 -
N54V、T56N、F58H、M213S 62 +
N54V、T56N、F58H、R210A、M213S 63 ++
N54V、T56N、F58H、M213S、P221R 64 ++
N54V、T56N、F58H、R210A、M213S、P221R 65 ++
實施例5、基於不同的野生型採用各種取代的組合製備突變體
根據以上實施例描述的方法，在野生型RtDAAO和RsDAAO中分別引入多種突變組合製備突變體，並測量酶活性。 基於RtDAAO的突變體及其酶活性如表8所示，其中相對酶活性是指突變體的活性 vs. SEQ ID NO: 4的活性的百分比(110-120%表示為“+”，120-150%表示為“++”，150-200%表示為“+++”，大於200%表示為“++++”)。
表8
突變體中的取代 SEQ ID NO: 相對酶活性
N54V、F58Q、M213S 4
N54I、T56N、F58H、M213S 66 ++++
N54V、T56N、F58H、M213S 67 ++++
N54V、F58Q、R210A、M213S 68 +
N54V、F58Q、M213S、P221R 69 ++++
N54V、F58Q、R210A、M213S、P221R 70 ++++
N54V、T56N、F58H、R210A、M213S 71 ++++
N54V、T56N、F58H、M213S、P221R 72 ++++
N54V、T56N、F58H、R210A、M213S、P221R 73 +++
N54I、T56N、F58H、R210A、M213S 74 ++++
N54I、T56N、F58H、M213S、P221R 75 ++
N54I、T56N、F58H、R210A、M213S、P221R 76 ++++
基於RsDAAO的突變體及其酶活性如表9所示，其中相對酶活性是指突變體的活性 vs. SEQ ID NO: 77的活性的百分比(110-120%表示為“+”，120-150%表示為“++”，150-200%表示為“+++”，大於200%表示為“++++”)。
表9
突變體中的取代 SEQ ID NO: 相對酶活性
N54V、F58Q、M213S 77   
N54I、T56N、F58H、M213S 37 ++++
N54V、T56N、F58H、M213S 38 ++++
N54V、F58Q、R210A、M213S 78 +
N54V、F58Q、M213S、P221R 79 +++
N54V、F58Q、R210A、M213S、P221R 80 ++++
N54V、T56N、F58H、R210A、M213S 81 ++++
N54V、T56N、F58H、M213S、P221R 82 ++++
N54V、T56N、F58H、R210A、M213S、P221R 83 +++
N54I、T56N、F58H、R210A、M213S 84 ++++
N54I、T56N、F58H、M213S、P221R 85 +++
N54I、T56N、F58H、R210A、M213S、P221R 86 ++
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Claims (11)

  1. 一種經修飾的D-胺基酸氧化酶(DAAO)，與其野生型DAAO相比，包含位置54、56、58及213的胺基酸取代，其中該等位置參照SEQ ID NO：2進行編號，其中位置54取代為I、V、T或L，位置56取代為N，位置58取代為H或Q，位置213取代為S或T，且其中該經修飾的DAAO具有催化D-草銨膦氧化為2-羰基-4-(羥基甲基膦醯基)丁酸(PPO)的活性。
  2. 如請求項1的經修飾的DAAO，其中位置54取代為I或V，位置58取代為H，位置213取代為S。
  3. 如請求項1的經修飾的DAAO，其中該經修飾的DAAO還包含位置210及/或221的胺基酸取代，其中位置210取代為A、G或P，位置P221取代為R。
  4. 如請求項2的經修飾的DAAO，其中該經修飾的DAAO還包含位置210及/或221的胺基酸取代，其中位置210取代為A、G或P，位置P221取代為R。
  5. 如請求項3的經修飾的DAAO，其中位置210取代為A。
  6. 如請求項4的經修飾的DAAO，其中位置210取代為A。
  7. 如請求項1的DAAO，包含SEQ ID NO：22-30、35-57、59-67、71-76及81-86之一的胺基酸序列或由SEQ ID NO：22-30、35-57、59-67、71-76及81-86之一的胺基酸序列組成，或者該經修飾的DAAO與SEQ ID NO：22-30、66、67及71-76之一相比，在除位置54、56、58、194、210、213、221、237、265、300及317之外的位置包含1-10個胺基酸取代，與SEQ ID NO：35-57及81-86之一相比，在除位置2、54、56、58、81、97、193、210、213、221、300、337及342之外的位置包含1-10個胺基酸取代，或與SEQ ID NO：59-65之一相比，在除位置54、56、58、210、213及221之外的位置包含1-10個胺基酸取代，其中該經修飾的DAAO具有催化D-草銨膦氧化為PPO的活性。
  8. 一種多核苷酸，編碼如請求項1-7中任一項的經修飾的DAAO。
  9. 一種表現載體，包含如請求項8的多核苷酸。
  10. 一種宿主細胞，包含如請求項1-7中任一項的經修飾的DAAO、如請求項8的多核苷酸或如請求項9的載體。
  11. 一種生產L-草銨膦的方法，包括使如請求項1-7中任一項的經修飾的DAAO或如請求項10的宿主細胞與D-草銨膦接觸。
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