JP6279478B2 - ヒダントイナーゼの突然変異体 - Google Patents
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Description
酵素を使用してアミノ酸を製造する方法は公知である。更に、化学的に廉価に合成された出発材料としての5−置換ヒダントイン化合物の光学活性アミノ酸への非対称的分解に関する方法がある。5−置換ヒダントイン化合物から光学活性アミノ酸を製造するこれらの方法は、製剤調製物、化学工業における製品、食品添加剤などの製造に重要である。
(2)加水分解により前記のN−カルバモイルアミノ酸を各々のアミノ酸に変換することにより、光学活性アミノ酸を形成する反応を触媒するN−カルバモイルアミノ酸ヒドロラーゼと称される酵素。
本発明の対象は、(i)又は(ii):
(i)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号119から選択されるアミノ酸配列、
(ii)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号119のアミノ酸配列中、1〜ψ個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び/又は付加されているアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼにより解決され、その際、ψはψ=75と定義され、及び更にヒダントイナーゼの触媒活性は、配列番号1のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくともζ倍だけ高く、及びζはζ=1.2と定義される。
ψ=70及びζ=1.5、ψ=70及びζ=2、ψ=70及びζ=3、ψ=70及びζ=4、ψ=70及びζ=5、ψ=70及びζ=10、ψ=70及びζ=15、ψ=70及びζ=20、ψ=70及びζ=25、ψ=70及びζ=30、
ψ=60及びζ=1.5、ψ=60及びζ=2、ψ=60及びζ=3、ψ=60及びζ=4、ψ=60及びζ=5、ψ=60及びζ=10、ψ=60及びζ=15、ψ=60及びψ=20、ψ=60及びζ=25、ψ=60及びζ=30、
ψ=50及びζ=1.5、ψ=50及びζ=2、ψ=50及びζ=3、ψ=50及びζ=4、ψ=50及びζ=5、ψ=50及びζ=10、ψ=50及びζ=15、ψ=50及びψ=20、ψ=50及びζ=25、ψ=50及びζ=30、
ψ=40及びζ=1.5、ψ=40及びζ=2、ψ=40及びζ=3、ψ=40及びζ=4、ψ=40及びζ=5、ψ=40及びζ=10、ψ=40及びζ=15、ψ=40及びψ=20、ψ=40及びζ=25、ψ=40及びζ=30、
ψ=30及びζ=1.5、ψ=30及びζ=2、ψ=30及びζ=3、ψ=30及びζ=4、ψ=30及びζ=5、ψ=30及びζ=10、ψ=30及びζ=15、ψ=30及びψ=20、ψ=30及びζ=25、ψ=30及びζ=30、
ψ=20及びζ=1.5、ψ=20及びζ=2、ψ=20及びζ=3、ψ=20及びζ=4、ψ=20及びζ=5、ψ=20及びζ=10、ψ=20及びζ=15、ψ=20及びψ=20、ψ=20及びζ=25、ψ=20及びζ=30、
ψ=10及びζ=1.5、ψ=10及びζ=2、ψ=10及びζ=3、ψ=10及びζ=4、ψ=10及びζ=5、ψ=10及びζ=10、ψ=10及びζ=15、ψ=10及びψ=20、ψ=10及びζ=25、ψ=10及びζ=30、
ψ=9及びζ=1.5、ψ=9及びζ=2、ψ=9及びζ=3、ψ=9及びζ=4、ψ=9及びζ=5、ψ=9及びζ=10、ψ=9及びζ=15、ψ=9及びψ=20、ψ=9及びζ=25、ψ=9及びζ=30、
ψ=8及びζ=1.5、ψ=8及びζ=2、ψ=8及びζ=3、ψ=8及びζ=4、ψ=8及びζ=5、ψ=8及びζ=10、ψ=8及びζ=15、ψ=8及びψ=20、ψ=8及びζ=25、ψ=8及びζ=30、
ψ=7及びζ=1.5、ψ=7及びζ=2、ψ=7及びζ=3、ψ=7及びζ=4、ψ=7及びζ=5、ψ=7及びζ=10、ψ=7及びζ=15、ψ=7及びψ=20、ψ=7及びζ=25、ψ=7及びζ=30、
ψ=6及びζ=1.5、ψ=6及びζ=2、ψ=6及びζ=3、ψ=6及びζ=4、ψ=6及びζ=5、ψ=6及びζ=10、ψ=6及びζ=15、ψ=6及びψ=20、ψ=6及びζ=25、ψ=6及びζ=30、
ψ=5及びζ=1.5、ψ=5及びζ=2、ψ=5及びζ=3、ψ=5及びζ=4、ψ=5及びζ=5、ψ=5及びζ=10、ψ=5及びζ=15、ψ=5及びψ=20、ψ=5及びζ=25、ψ=5及びζ=30、
ψ=4及びζ=1.5、ψ=4及びζ=2、ψ=4及びζ=3、ψ=4及びζ=4、ψ=4及びζ=5、ψ=4及びζ=10、ψ=4及びζ=15、ψ=4及びψ=20、ψ=4及びζ=25、ψ=4及びζ=30、
ψ=3及びζ=1.5、ψ=3及びζ=2、ψ=3及びζ=3、ψ=3及びζ=4、ψ=3及びζ=5、ψ=3及びζ=10、ψ=3及びζ=15、ψ=3及びψ=20、ψ=3及びζ=25、ψ=3及びζ=30、
ψ=2及びζ=1.5、ψ=2及びζ=2、ψ=2及びζ=3、ψ=2及びζ=4、ψ=2及びζ=5、ψ=2及びζ=10、ψ=2及びζ=15、ψ=2及びψ=20、ψ=2及びζ=25、ψ=2及びζ=30、
ψ=1及びζ=1.5、ψ=1及びζ=2、ψ=1及びζ=3、ψ=1及びζ=4、ψ=1及びζ=5、ψ=1及びζ=10、ψ=1及びζ=15、ψ=1及びψ=20、ψ=1及びζ=25、ψ=1及びζ=30。
図1は、プラスミドpAS6−HyuHであり、これは配列番号1のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼを発現する野生型遺伝子hyuHと配列番号4のアミノ酸配列を有するD−カルバモイラーゼを発現する遺伝子を含んでいる。プラスミドマップに示されている略語は、以下の要素から成る:D−Carb.=D−カルバモイラーゼ遺伝子NRRL、Agrobacterium sp.;rhaP=ラムノースプロモーター;hyuH=ヒダントイナーゼDSM9771;rrnB=転写ターミネーター;bla=β−ラクタメーゼ;ori=複製起点ColE1。
本発明に関連して、時折ポリペプチド配列の変異型は、フォーマットAA1XAA2中の元の配列と比較して変異型配列中に存在する各アミノ酸の置換を示すことにより説明される。その際、AA1は元の配列中の位置Xに存在するアミノ酸残基を意味し、及びAA2は、変異体の配列中の位置Xに存在するアミノ酸残基を意味する。
上記のように本発明は、増大した触媒活性、及び任意で、D−5−置換ヒダントイン基質に対して、特にD−トリプトファンヒダントインに対して増大したエナンチオ選択性を有するアルスロバクター種からの配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型ヒダントイナーゼから誘導される新規ヒダントイナーゼを提供する。
(i)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号119から選択されるアミノ酸配列、
(ii)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号84、配列番号85、配列番号86、配列番号87、配列番号88、配列番号89、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号119のアミノ酸配列中、1〜ψ個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び/又は付加されているアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有し、その際、ψはψ=75と定義され、及び更にヒダントイナーゼの触媒活性は、配列番号1のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくともζ倍だけ高く、及びζはζ=1.2と定義される。
ψ=70及びζ=1.5、ψ=70及びζ=2、ψ=70及びζ=3、ψ=70及びζ=4、ψ=70及びζ=5、ψ=70及びζ=10、ψ=70及びζ=15、ψ=70及びζ=20、ψ=70及びζ=25、ψ=70及びζ=30、
ψ=60及びζ=1.5、ψ=60及びζ=2、ψ=60及びζ=3、ψ=60及びζ=4、ψ=60及びζ=5、ψ=60及びζ=10、ψ=60及びζ=15、ψ=60及びψ=20、ψ=60及びζ=25、ψ=60及びζ=30、
ψ=50及びζ=1.5、ψ=50及びζ=2、ψ=50及びζ=3、ψ=50及びζ=4、ψ=50及びζ=5、ψ=50及びζ=10、ψ=50及びζ=15、ψ=50及びψ=20、ψ=50及びζ=25、ψ=50及びζ=30、
ψ=40及びζ=1.5、ψ=40及びζ=2、ψ=40及びζ=3、ψ=40及びζ=4、ψ=40及びζ=5、ψ=40及びζ=10、ψ=40及びζ=15、ψ=40及びψ=20、ψ=40及びζ=25、ψ=40及びζ=30、
ψ=30及びζ=1.5、ψ=30及びζ=2、ψ=30及びζ=3、ψ=30及びζ=4、ψ=30及びζ=5、ψ=30及びζ=10、ψ=30及びζ=15、ψ=30及びψ=20、ψ=30及びζ=25、ψ=30及びζ=30、
ψ=20及びζ=1.5、ψ=20及びζ=2、ψ=20及びζ=3、ψ=20及びζ=4、ψ=20及びζ=5、ψ=20及びζ=10、ψ=20及びζ=15、ψ=20及びψ=20、ψ=20及びζ=25、ψ=20及びζ=30、
ψ=10及びζ=1.5、ψ=10及びζ=2、ψ=10及びζ=3、ψ=10及びζ=4、ψ=10及びζ=5、ψ=10及びζ=10、ψ=10及びζ=15、ψ=10及びψ=20、ψ=10及びζ=25、ψ=10及びζ=30、
ψ=9及びζ=1.5、ψ=9及びζ=2、ψ=9及びζ=3、ψ=9及びζ=4、ψ=9及びζ=5、ψ=9及びζ=10、ψ=9及びζ=15、ψ=9及びψ=20、ψ=9及びζ=25、ψ=9及びζ=30、
ψ=8及びζ=1.5、ψ=8及びζ=2、ψ=8及びζ=3、ψ=8及びζ=4、ψ=8及びζ=5、ψ=8及びζ=10、ψ=8及びζ=15、ψ=8及びψ=20、ψ=8及びζ=25、ψ=8及びζ=30、
ψ=7及びζ=1.5、ψ=7及びζ=2、ψ=7及びζ=3、ψ=7及びζ=4、ψ=7及びζ=5、ψ=7及びζ=10、ψ=7及びζ=15、ψ=7及びψ=20、ψ=7及びζ=25、ψ=7及びζ=30、
ψ=6及びζ=1.5、ψ=6及びζ=2、ψ=6及びζ=3、ψ=6及びζ=4、ψ=6及びζ=5、ψ=6及びζ=10、ψ=6及びζ=15、ψ=6及びψ=20、ψ=6及びζ=25、ψ=6及びζ=30、
ψ=5及びζ=1.5、ψ=5及びζ=2、ψ=5及びζ=3、ψ=5及びζ=4、ψ=5及びζ=5、ψ=5及びζ=10、ψ=5及びζ=15、ψ=5及びψ=20、ψ=5及びζ=25、ψ=5及びζ=30、
ψ=4及びζ=1.5、ψ=4及びζ=2、ψ=4及びζ=3、ψ=4及びζ=4、ψ=4及びζ=5、ψ=4及びζ=10、ψ=4及びζ=15、ψ=4及びψ=20、ψ=4及びζ=25、ψ=4及びζ=30、
ψ=3及びζ=1.5、ψ=3及びζ=2、ψ=3及びζ=3、ψ=3及びζ=4、ψ=3及びζ=5、ψ=3及びζ=10、ψ=3及びζ=15、ψ=3及びψ=20、ψ=3及びζ=25、ψ=3及びζ=30、
ψ=2及びζ=1.5、ψ=2及びζ=2、ψ=2及びζ=3、ψ=2及びζ=4、ψ=2及びζ=5、ψ=2及びζ=10、ψ=2及びζ=15、ψ=2及びψ=20、ψ=2及びζ=25、ψ=2及びζ=30、
ψ=1及びζ=1.5、ψ=1及びζ=2、ψ=1及びζ=3、ψ=1及びζ=4、ψ=1及びζ=5、ψ=1及びζ=10、ψ=1及びζ=15、ψ=1及びψ=20、ψ=1及びζ=25、ψ=4及びζ=30。
X152=アラニン以外の任意のアミノ酸;
X64=任意のアミノ酸残基;
X71=任意のアミノ酸残基;
X72=任意のアミノ酸残基;
X95=任意のアミノ酸残基;
X154=任意のアミノ酸残基;
X181=任意のアミノ酸残基;
X284=任意のアミノ酸残基;
X285=任意のアミノ酸残基;
X398=任意のアミノ酸残基;
X452=任意のアミノ酸残基;
及び更にヒダントイナーゼの触媒活性は、配列番号1のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくとも1.2倍だけ高い。
X152=Cys、Gly、Ser、Thr又はVal;
X64=Ile、Thr又はVal;
X71=Arg、Gln、Asp、Glu、Val、Ser、Tyr又はLeu;
X72=Tyr、His又はAsn;
X95=Ile又はHis;
X154=Val、Ala、Cys、Gly、Ile、Asn又はSer;
X181=Val又はAla;
X284=Val又はPhe;
X285=Ala又はAsp;
X398=Thr又はAla;
X452=His又はLeu。
X152=Cys、Ser又はVal;
X64=Ile、Thr又はVal;
X71=Arg、Gln、Asp、Glu、Val、Ser、Tyr又はLeu;
X72=Tyr、His又はAsn;
X95=Ile又はHis;
X154=Cys、Ile又はSer;
X181=Val又はAla;
X284=Val又はPhe;
X285=Ala又はAsp;
X398=Thr又はAla;
X452=His又はLeu。
X152=Cys、Gly、Ser、Thr又はVal;
X154=Ala、Cys、Gly、Ile、Asn又はSer。
X152=Cys、Ser又はVal;
X154=Cys、Ile又はSer。
X152=Ser;X152=Cys;X152=Val;X152=Gly又はX152=Thr。
X152=Ser;X154=Ile。
X152=Val;X154=Cys。
X152=Cys;X154=Ser。
X152=Ser;X71=Asp;X72=His;X154=Val;X181=Val。
X152=Ser;X71=Asp;X72=Asn;X154=Val;X181=Val。
X152=Ser;X71=Val;X72=Asn;X154=Val;X181=Val。
X152=Cys;X71=Ser;X72=Asn;X154=Ser;X181=Ala。
X152=Ser;X71=Tyr;X72=Asn;X154=Val;X181=Val。
X152=Cys;X71=Leu;X72=Tyr;X154=Ser;X181=Val。
X152=Ser;X71=Tyr;X72=His;X154=Val;X181=Val。
X152=Ser;X64=Ile;X71=Arg;X72=Tyr;X95=Ile;X154=Val;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=Hisに限定されたヒダントイナーゼが提供される。
X152=Cys;X64=Ile;X71=Arg;X72=Tyr;X95=Ile;X154=Val;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Val;X64=Ile;X71=Arg;X72=Tyr;X95=Ile;X154=Val;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Gly;X64=Ile;X71=Arg;X72=Tyr;X95=Ile;X154=Val;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Thr;X64=Ile;X71=Arg;X72=Tyr;X95=Ile;X154=Val;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Ser;X64=Ile;X71=Arg;X72=Tyr;X95=Ile;X154=Ile;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Val;X64=Ile;X71=Arg;X72=Tyr;X95=Ile;X154=Cys;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Cys;X64=Ile;X71=Arg;X72=Tyr;X95=Ile;X154=Ser;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Ser;X64=Ile;X71=Asp;X72=His;X95=Ile;X154=Val;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Ser;X64=Ile;X71=Asp;X72=Asn;X95=Ile;X154=Val;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Ser;X64=Ile;X71=Val;X72=Asn;X95=Ile;X154=Val;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Cys;X64=Ile;X71=Ser;X72=Asn;X95=Ile;X154=Ser;X181=Ala;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Ser;X64=Ile;X71=Tyr;X72=Asn;X95=Ile;X154=Val;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Cys;X64=Ile;X71=Leu;X72=Tyr;X95=Ile;X154=Ser;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
X152=Ser;X64=Ile;X71=Tyr;X72=His;X95=Ile;X154=Val;X181=Val;X284=Val;X285=Ala;X398=Thr;X452=His。
(a)本発明によるヒダントイナーゼのヒダントイナーゼ活性及びカルバモイラーゼ活性及び少なくとも1つの5−置換ヒダントインを反応培地に用意し、任意で前記反応培地にヒダントインラセマーゼ活性を用意する工程、
(b)5−置換ヒダントインを工程(a)で用意された酵素活性により各々のアミノ酸に変換するために反応培地をインキュベートする工程、及び
(c)各々の5−置換ヒダントインの酵素的変換から得られたアミノ酸を反応培地から回収する工程
を含むアミノ酸を製造する方法を提供する。
ヒダントイナーゼ:“ヒダントイナーゼ”又は“ヒダントイナーゼ活性”という用語は、本明細書中では酵素と定義付けられるか、又はヒダントイン、特に5−置換ヒダントインを加水分解する酵素の活性と定義付けられる。ヒダントイナーゼは、5−置換ヒダントインを加水分解して各々のN−カルバモイルアミノ酸を形成する反応を触媒する。特に、本発明によるヒダントイナーゼは、D−5−インドリルメチルヒダントインを加水分解してN−カルバモイル−D−トリプトファンを形成する反応を触媒するか、又はL−5−インドリルメチルヒダントインを加水分解してN−カルバモイル−L−トリプトファンを形成する反応を触媒する。ヒダントイナーゼの1例は、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質である。ヒダントイナーゼ活性の1例は、L−5−メチルチオエチルヒダントイン、L−5−(4−ヒドロキシベンジル)ヒダントイン又はL−5−ベンジルヒダントインのような化合物に対する配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質の触媒活性であり、これは前記ヒダントイナーゼの活性により各々のN−カルバモイルアミノ酸に変換される。
例1:ヒダントイナーゼのクローニング及び発現
配列番号1のアミノ酸配列を有するアルスロバクター種ヒダントイナーゼ(HyuH)をpOM18ベクターに供給した。更なる操作に、HyuH遺伝子の正確な方向でサブクローニングが必要であった。pOM18の二重消化にNdeI及びHindIIIを使用した。ベクターのバックボーン、pAS6由来のcarbA遺伝子(カルバモイラーゼ)及びpOM18由来のHyuH遺伝子は、ゲル抽出PCRであった。3つ全てのゲル抽出生成物をカラム精製(Machery Nagel)し、及びライゲーションを行い、引き続き大腸菌DH5α中で形質転換した。LB−amp中でクローンを一晩成長させ、及びcarbA由来の遺伝子特異的フォワードプライマー及びリバースプライマーを使用して培養PCRを実施し、正確な方向をチェックした。得られたプラスミドpAS6−HyuHは、配列番号1のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現する野生型ヒダントイナーゼ遺伝子及び配列番号4のアミノ酸配列を有するタンパク質を発現するカルバモイラーゼ遺伝子を有していた。所望のクローンのプラスミドを製造し、及び発現と活性のチェックのためpOM21c(ヒダントインラセマーゼを発現するプラスミド)含有のJM109細胞中で形質転換した。発現の分析のために、予備培養物をLB培地(適切な抗生物質を有する)中、37℃で一晩成長させた。予備培養物10μlを誘発培地(LB培地+2mg/mlラムノース)3ml中に添加した。培養物を30℃で20時間成長させた。細胞5μlをSDS PAGE分析に課した。蛍光に基づくスクリーニングアッセイを使用し、酵素活性をチェックした。
野生型アルスロバクター種ヒダントイナーゼ(配列番号1)中の幾つかの位置を突然変異誘発のために決定した。突然変異体ライブラリーを選択したアミノ酸位置で飽和突然変異誘発により製造した。次に、活性を高めるためにハイスループット・スクリーニングアッセイを使用して合理的突然変異体ライブラリーをスクリーニングした。部位飽和には、5つの部位(Y73、I95、V154、P155、H316)及び突然変異誘発には2つの部位(A152G、S153G)を選択した。決定したアミノ酸位置に、5つの部位飽和突然変異誘発と1つの部位特異的突然変異を行った。
野生型ヒダントイナーゼを発現する例1で得られたプラスミド(pAS6−HyuH;図1)を使用して、又は後続の工程では前記ヒダントイナーゼの突然変異体を有するプラスミドを使用して、Phusionポリメラーゼを部位飽和突然変異誘発(ssm)及び部位特異的突然変異誘発(sdm)に適用した。
epPCR突然変異体ライブラリーの作製に、MnCl2を使用してエラープローン条件を生じさせた。MnCl2の濃度を様々に変えること(0.05mM、0.1mM、0.2mM、0.5mM)によりPCRを初めに行った。反応混合物は、プラスミドテンプレート0.3ng/μl(例1で得られた野生型ヒダントイナーゼを発現するプラスミド[pAS6−HyuH;図1]を使用して、又は試験のより後半の工程で、前記の得られたヒダントイナーゼの突然変異体を有するプラスミドを使用して)、1×SeSaM(R)Taqバッファー(SeSaM−Biotech GmbH、ブレーメン、ドイツ)、SeSaM(R)Taqポリメラーゼ1U、dNTPs200μMならびに表1に示されているHyuH_GS_F及びHyuH_Rプライマー250nMをそれぞれ様々なMnCl2の濃度に合わせて有していた。PCRプログラムは、94℃で2分(1サイクル);94℃で30秒間;56℃で30秒間;72℃で50秒間(25サイクル);72℃で5分間(1サイクル)であった。SeSaM(R)プロトコール(Mundhada等、“SeSaM−Tv−II generates a protein sequence space that is unobtainable by epPCR”Chembiochem.2011 Jul 4;12(10):1595〜601)を使用して、トランスバージョンにバイアスが掛かった突然変異体ライブラリーを構築した。PCR産物をカラム精製し、及びクローニング用にMegawhopを課した。PCR反応混合物50μlは、プラスミドテンプレート1ng/μl、1×Phusionバッファー(New England Biolabs社、フランクフルト、ドイツ)、Phusionポリメラーゼ1U、300μM dNTP’sならびにepPCR又はSeSaM(R)からの突然変異したテンプレート5ng/lを有していた。Megawhop用のPCRプログラムは、72℃で3分間(1サイクル);98℃で45秒間(1サイクル);98℃で15秒間;62℃で30秒間;72℃で5分間(25サイクル);72℃で5分間(1サイクル)であった。次にPCRミックスをカラム精製し、かつ一晩Dpnl(10U)消化に課した。タンパク質発現及び引き続く分析のために、pAS6−HyuHの全てのエレメントを有する全長プラスミドを示すPCR産物を化学的コンピテントセルJM109(Promega社、マンハイム、ドイツ)中で形質転換した。
Omnichange用のプロトコールは、配列中の離れた位置での複数の部位飽和突然変異誘発を可能にする。これは4工程で行われ、NNK−コドンとホスホロチオジエステル結合を含むプライマーを用いるPCRによる断片の生成から開始し、次に相補的5’−オーバーハングを生じるための元素状ヨウ素でのDNA切断反応、3番目にDNA−ハイブリダイゼーション及び最後に形質転換及びニック修復が続く。
予備培養及び発現:96ウェルマイクロタイタープレート(MTP)中の適切な抗生物質含有のLB培地100μlをポジティブ及びネガティブコントロールならびに得られたクローンと一緒に爪楊枝を使用して接種した。このプレートを37℃(900rpm)で一晩インキュベートした。スクリーニングプレートを調製するために、96ウェルレプリケーターを使用して、抗生物質2mg/mlラムノース含有の培地200μl/ウェルを有する新たなMTPにクローンを移した。プレートの残りの材料に、50%グリセロール(w/w)100μLを加え、短く混合し、及びプレートを−80℃で貯蔵した。
部位飽和突然変異誘発の実験及び例2によるランダム突然変異誘発ライブラリーから得られた突然変異体ヒダントイナーゼを例3に記載された蛍光アッセイを使用してそれらの活性に関してスクリーニングした。読み取りは、40分と60分の間の解析測定に関する。各々の測定を3回実施した。上記のように、基質としてそれぞれL−5−インドリルメチルヒダントイン(=L−トリプトファンヒダントイン)とD−5−インドリルメチルヒダントイン(=D−トリプトファンヒダントイン)を用いて、突然変異体ヒダントイナーゼをそれらの活性に関してアッセイし、及びそれらの活性を配列番号1のアミノ酸配列を有する野生型ヒダントイナーゼの活性と比較した。
Claims (15)
- 以下の(i)又は(ii):
(i)配列番号6、配列番号8、配列番号9、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号119から選択されるアミノ酸配列、
(ii)配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号73、配列番号74、配列番号75、配列番号76、配列番号77、配列番号78、配列番号79、配列番号80、配列番号81、配列番号82、配列番号83、配列番号90、配列番号91、配列番号92、配列番号93、配列番号94、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99、配列番号100、配列番号101、配列番号102、配列番号103、配列番号104、配列番号105、配列番号106、配列番号107、配列番号108、配列番号109、配列番号110、配列番号111、配列番号112、配列番号113、配列番号114、配列番号115、配列番号116、配列番号117、配列番号118又は配列番号119のアミノ酸配列中、1〜ψ個のアミノ酸残基が置換、欠失、挿入及び/又は付加されているアミノ酸配列
から選択されるアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼであって、
ここでψ=5であり、かつ更に、D−5−インドリルメチルヒダントインを基質としたときのヒダントイナーゼの触媒活性は、配列番号1のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくともζ倍だけ高く、かつ
ζ=1.2以上であり、
アミノ酸残基の置換、欠失、挿入及び/又は付加は、対応するアミノ酸配列において、配列番号1の配列と比較したときに同じアミノ酸残基を有する位置で生じる、前記ヒダントイナーゼ。 - ψは、4、3、2、1から選択される、請求項1に記載のヒダントイナーゼ。
- ζは1.5、2、3、4、5、10、15、20、25又は30から選択される、請求項1に記載のヒダントイナーゼ。
- ヒダントイナーゼは、以下の基質ヒダントイン、5−メチルヒダントイン、5−ベンジルヒダントイン、5−(4−ヒドロキシベンジル)ヒダントイン、5−インドリルメチルヒダントイン、5−(3,4−ジヒドロキシベンジル)ヒダントイン、5−メチルチオエチルヒダントイン、5−イソプロピルヒダントイン、5−イソブチルヒダントイン、5−sec−ブチルヒダントイン、5−(4−アミノブチル)ヒダントイン、5−ヒドロキシメチルヒダントイン、又は非天然アミノ酸に相応する5−置換ヒダントイン化合物、それぞれその誘導体のうち少なくとも1つを各々のカルバモイルアミノ酸に変換し、ここで前記基質の変換に関するヒダントイナーゼの触媒活性は、D−5−インドリルメチルヒダントインの変換に関して、配列番号1のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼの触媒活性よりも少なくとも、上記で定義されたζ倍高い、請求項1から3までのいずれか1項に記載のヒダントイナーゼ。
- D−ヒダントインのエナンチオ選択性は、配列番号1のアミノ酸配列を有するヒダントイナーゼのエナンチオ選択性よりも少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、50倍、100倍、又は150倍高い、請求項1から4までのいずれか1項に記載のヒダントイナーゼ。
- 請求項1から5までのいずれか1項に記載のヒダントイナーゼのいずれかをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項6に記載のポリヌクレオチドを有するベクター。
- 請求項6に記載のポリヌクレオチド、又は請求項7に記載のベクターを有する単離された若しくは形質転換された宿主細胞。
- 以下の:
ヒダントイナーゼ;ヒダントイナーゼとヒダントインラセマーゼ;ヒダントイナーゼとカルバモイラーゼ;又はヒダントイナーゼとヒダントインラセマーゼとカルバモイラーゼ
から選択される酵素活性を少なくとも発現する、請求項8に記載の宿主細胞。 - 以下の工程(a)〜(c):
(a)請求項1から5までのいずれか1項に記載のヒダントイナーゼのヒダントイナーゼ活性、及びカルバモイラーゼ活性、及び少なくとも1つの5−置換ヒダントインを反応培地に用意し、任意で前記反応培地にヒダントインラセマーゼ活性を用意する工程、
(b)5−置換ヒダントインを工程(a)で用意された酵素活性により各々のアミノ酸に変換するために反応培地をインキュベートする工程、及び
(c)各々の5−置換ヒダントインの酵素的変換から得られたアミノ酸を反応培地から回収する工程
を含むアミノ酸を製造する方法。 - 前記5−置換ヒダントインは、D,L−5−置換ヒダントイン、D,L−5−インドリルメチルヒダントイン(=D,L−トリプトファンヒダントイン)、D−5−置換ヒダントイン、D−5−インドリルメチルヒダントン(=D−トリプトファンヒダントイン)から選択される、請求項10に記載の方法。
- 反応培地に用意される前記5−置換ヒダントインは、L−5−置換ヒダントイン又はD,L−5−置換ヒダントインであり、かつ更にヒダントインラセマーゼ活性は、L−5−置換ヒダントイン又はD,L−5−置換ヒダントインをD−5−置換ヒダントインに変換するために工程(a)で反応培地に用意される、請求項10又は11に記載の方法。
- 製造すべきアミノ酸は、D−トリプトファンであり、かつ5−置換ヒダントインは、
D−5−インドリルメチルヒダントイン、L−5−インドリルメチルヒダントイン又はD,L−5−インドリルメチルヒダントインから選択される、請求項10から12までのいずれか1項に記載の方法。 - 反応培地は、部分的に又は全体的に細胞培養培地から成る培地であり、かつヒダントイナーゼ活性は請求項8又は9に記載の宿主細胞により用意され、かつ宿主細胞は前記反応培地中で培養される、請求項12又は13のいずれか1項に記載の方法。
- 反応培地は部分的に又は全体的に細胞培養培地から成る培地であり、かつカルバモイラーゼ活性は、請求項8又は9に記載の宿主細胞又は第二の宿主細胞により用意され、かつ前記宿主細胞は前記反応培地中で培養される、請求項10から14までのいずれか1項に記載の方法。
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