CN112175929A

CN112175929A - 一种重组海因消旋酶工程菌及其构建方法和用途

Info

Publication number: CN112175929A
Application number: CN202011076717.6A
Authority: CN
Inventors: 钮利喜; 杨秀清; 吕利华; 马师师
Original assignee: Shanxi University
Current assignee: Shanxi University
Priority date: 2020-10-10
Filing date: 2020-10-10
Publication date: 2021-01-05

Abstract

一种重组海因消旋酶工程菌及其构建方法和用途，以红球菌R04基因组DNA为模板，用PCR法扩增了编码海因消旋酶的基因；对其基因进行克隆、重组表达，获得一株高活性海因消旋酶基因工程菌；工程菌经发酵后可大量表达高活性重组海因消旋酶；当以D,L‑5′‑异丙基海因为底物利用生物酶法制备D‑缬氨酸时，该工程菌与HC01工程菌共同作用可以将转化速度提高12.12％，转化率可达99.0％以上。该工程菌可用于非天然D‑氨基酸及其衍生物的生物转化，加速D‑氨基酸的转化过程，提高D‑氨基酸转化效率。

Description

一种重组海因消旋酶工程菌及其构建方法和用途

技术领域

本发明属于酶蛋白分子工程领域，主要涉及一种含重组海因消旋酶工程菌的构建、表达及其用途。

技术背景

D-氨基酸及其衍生物广泛应用于医药、食品、农药、化妆品等领域，是合成抗菌和抗病毒药物、杀虫剂以及多肽合成的重要中间物。例如：D-缬氨酸可应用于生产新型广谱抗生素、多肽合成过程的缬氨酸保护剂等。D-缬氨酸杀虫菊酯能抑制昆虫酶系统活性，有效地防治棉花、蔬菜等作物的主要害虫，是一类广谱的很有发展前景的杀虫杀螨剂。在医学科研中，D-缬氨酸是重要的手性药物原料，如由其参与组入的放线菌D是一种抗肿瘤药物，还可以用其合成抗糖尿病及其并发症药物，还可以用来抑制纤维细胞的生长等。虽然D-缬氨酸应用领域的拓展和市场需求仍在扩大，但D-缬氨酸制备研究仍存在天然菌生物转化率低，生产工艺限制等问题，利用人为构建工程菌进行高效率转化，将成为氨基酸研究热点之一。

目前，D-缬氨酸制备方法有生物酶法、外消旋体优先结晶法及外消旋体化学拆分法等。生物酶催化转化的关键是生物催化剂的制备，它可以是微生物细胞，也可以是从微生物细胞中提取的酶。其优点在于立体选择性强，反应条件温和、公害少等，缺点是菌种筛选困难、产物后处理工作量大、酶制剂不易保存等。综合考虑，生物酶法仍不失为一种极有发展前途的方法。目前D-氨基酸类衍生物如D-缬氨酸的生产方式通常选用微生物海因法，D,L-5′-异丙基海因在富含海因消旋酶、D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的微生物的作用下，得到D-缬氨酸(图1)。底物5′-异丙基海因，其自发消旋速率远低于D-海因酶的水解速率，所以海因消旋酶成为整个多酶催化反应的限速酶。因此，对5′-单替代海因消旋的研究已成为由外消旋5′-单替代海因制备D-氨基酸反应动力学中的一个非常重要的组成部分。姚忠等研究了L-海因的消旋过程，对其动力学过程进行了分析表明，L-海因的消旋遵循碳负离子理论，消旋过程符合一级反应动力学过程。目前，关于5′-单替代海因的消旋对制备光学活性氨基酸的影响的文献报道非常少，海因消旋的部分问题也没有被完全揭示。因此，对于自发消旋速率较慢的底物，构建表达高活性重组海因消旋酶的工程菌显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的是通过基因工程方法，构建工程菌高效表达海因消旋酶，用于弥补酶法制备D-氨基酸时底物5′-单替代海因消旋速率低于D-海因酶水解速率的缺陷，降低生产成本。

本发明以红球菌R04(Rhodococcus sp.R04)基因组DNA为模板，用PCR法分离克隆了一种海因消旋酶基因，DNA序列分析表明全长735bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，不含内含子，共编码244个氨基酸残基。将此基因在大肠杆菌表达系统中表达，获得了可以高效表达目的基因的工程菌细胞。

本发明的一种海因消旋酶，它的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的序列。

本发明的一种编码海因消旋酶的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的序列。

本发明利用分子克隆技术，将编码海因消旋酶多核苷酸直接克隆到表达载体—质粒pMAL-s，该质粒含有tac启动子，具有氨苄抗性，所构建pMAL-s-hyu2重组质粒，利用氯化钙法转化原核细胞—E.coli BL21(DE3)，得到工程菌pMAL-s-hyu2/E.coli BL21(DE3)。该工程菌在乳糖的诱导下获得可溶性表达，本发明所述海因消旋酶工程菌可用于制备D-氨基酸。

本发明提供的海因消旋酶的表达方法为：在适合表达海因消旋酶的条件下，培养pMAL-s-hyu2/E.coli BL21(DE3)工程菌，即在37℃培养至OD_600nm为0.6-0.8时，加入乳糖至终浓度为0.2-0.6mmol/L(优选0.4mmol/L)，37℃过夜诱导，这时酶表达量最多，且大部分为可溶性蛋白。

本发明所述海因消旋酶可用于合成D-缬氨酸，若底物为D,L-5′-异丙基海因时，海因消旋酶的酶促反应体系为：将工程菌经发酵所得菌体离心收集，初始酶促反应体系只包含工程菌HC01(可以同时表达D-海因酶和N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶的工程菌)，在底物反应50％左右前一小时加入等体积的pMAL-s-hyu2菌体，于1.5ml EP管内用pH7.5的磷酸钠缓冲液悬菌，底物D,L-5′-异丙基海因浓度为1.8％，对照组只用pH7.5的磷酸钠缓冲液悬菌，封口膜封口，37℃、200r/min反应，反应达50％后开始取样，此后间隔时间取样，测定产物产率达99.0％以上，其所催化反应的速率比自发消旋提升12.12％。

附图说明

图1：海因消旋酶催化5-单替代海因的反应历程示意图

图2：不同来源的海因消旋酶氨基酸序列比对结果

图3：重组大肠杆菌pMAL-s-hyu2/E.coli BL21(DE3)表达海因消旋酶的SDS-PAGE分析Mr：标准分子量；泳道1：pMAL-s/E.coil BL21(DE3)未诱导；泳道2：pMAL-s/E.coilBL21(DE3)诱导；泳道3：pMAL-s-hyu2/E.coil BL21(DE3)未诱导；泳道4：pMAL-s-hyu2/E.coil BL21(DE3)诱导全菌；泳道5：超声破碎上清；泳道7：超声破碎沉淀

图4：工程菌pMAL-s-hyu2/E.coli BL21(DE3)转化D,L-5′-异丙基海因的效率图

实施方式

下面对照附图结合具体实施例，进一步阐述本发明的内容。

实施例1：海因消旋酶基因序列扩增、分析，工程菌的构建

将含有海因消旋酶基因的红球菌R04菌株接种在LB(1％蛋白胨，0.5％酵母粉，1％NaCl，1.5％琼脂)平板上，37℃培养过夜。挑取单菌落悬浮于50μL无菌蒸馏水，于100℃水浴5min，离心后上清作为PCR扩增模板，所用引物序列如下：

FW(hyu2)：5′-TACATATGATGTTCATCAAGGTCGTCAA-3′(含Nde I的酶切位点)；

RV(hyu2)：5′–TAAAGCTTTCACCCGCCCGTCGTGAA-3′(含Hind III的酶切位点)。

PCR扩增反应体系：

反应条件95℃5min，95℃30s，60℃10s，72℃1min，72℃10min，共30个循环，扩增产物经过1％琼脂糖凝胶电泳、胶回收纯化，纯化产物经由限制性内切酶Nde I/Hind III进行双酶切，37℃酶切4h后，酶切产物经1％琼脂糖凝胶电泳、胶回收纯化得到相应的基因酶切片段产物。对载体pMAL-s进行相同的酶切和回收操作，然后用T₄连接酶对两者的回收产物进行连接，体系总体积为10μL，包括外源片段5μL，pMAL-s载体1μL和T₄ DNA连接酶缓冲液1μL，ddH₂O 2.5μL，T₄ DNA连接酶0.5μL，16℃过夜连接，转化于宿主菌株E.coli DH5α，利用菌落PCR筛选阳性克隆，最后对得到的阳性重组子进行双酶切鉴定和序列测定，筛选得到含目的基因的重组子，将得到的重组质粒命名为pMAL-s-hyu2。

结果表明基因全长为735bp多核苷酸片段(SEQ ID No.2)，在NCBI网站用Blast软件进行数据分析，揭示与菌株Rhodococcus基因同源性最高，其中Score最高，E值最低的菌种为Rhodococcus biphenylivorans strain TG9。不同来源海因消旋酶基因序列比对结果见图2。

将pMAL-s-hyu2重组质粒，利用氯化钙法转化原核细胞—E.coli BL21(DE3)，得到工程菌pMAL-s-hyu2/E.coli BL21(DE3)。

实施例2：工程菌pMAL-s-hyu2/E.coil BL21(DE3)的表达

从平板上挑取单菌落接于5mL LB(含100μg/mL Amp)液体培养基中，37℃培养4-5h，取上述预培养菌以2％的接种量转接于新鲜的含抗生素Amp(100μg/mL)的LB培养液，37℃震荡培养至OD_600nm0.6-0.8，加入乳糖(0.4mmol/L)37℃过夜诱导。8000r/min离心收集菌体，利用SDS-PAGE凝胶电泳分析表达产物与表达量(图3)，目的蛋白主要以可溶形式表达。

实施例3：海因消旋酶工程菌与HC01工程菌共同作用过程

培养pMAL-s-hyu2/E.coil BL21(DE3)工程菌与工程菌HC01，收集菌体，初始酶促反应体系只包含工程菌HC01，在底物反应50％左右前一小时，加入等体积的pMAL-s-hyu2/E.coil BL21(DE3)菌体。反应体系为1.5ml EP管内，1.5ml pH＝7.5磷酸钠缓冲液重新悬浮菌体，底物异丙基海因浓度为1.8％，对照组只用pH＝7.5磷酸钠缓冲液重新悬浮菌体，封口膜封口，37℃、200r/min反应。通过其反应速率判断反应进程，在底物转化率达50％前一小时加入等体积的工程菌pMAL-s-hyu2/E.coil BL21(DE3)，底物转化率达50％后开始取样，此后间隔时间取样，测定OD_570nm值，计算产物生成比率。反应体系中加入海因消旋酶工程菌后转化速度提升12.12％(图4)。

实施例4：N-氨甲酰-D-氨基酸酰胺水解酶活性的测定

取按实施例3的反应液，于12000r/min离心10min的条件下收取，取400μL反应液加入等体积2mol/L NaAc缓冲液(pH5.5)，60℃温浴5min后加入400μL茚三酮(58mg还原茚三酮，58mg水合茚三酮溶于5mL乙二醇独甲醚)，60℃震荡反应25min，加入2.4mL65％乙醇，震荡后于室温放置5min后测定OD_570nm数值。在上述条件下，1min内生成1μmol D-缬氨酸所需酶量为一个酶活单位(U)。

序列表

<110> 山西大学

<120> 一种重组海因消旋酶工程菌及其构建方法和用途

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 红球菌R04(Rhodococcus sp. R04)

<400> 1

Met Phe Ile Lys Val Val Asn Pro Asn Thr Thr Trp Ser Met Thr Ala

1 5 10 15

Thr Ile Glu Ala Cys Ala Arg Ala Val Ala Gly Pro Gly Thr Arg Val

20 25 30

Glu Ala Val Ser Pro Thr Met Gly Pro Pro Ser Ile Glu Ser His Tyr

35 40 45

Asp Asp Ala Leu Ala Val Pro Gly Ile Leu Thr Glu Ile Glu Lys Gly

50 55 60

Glu Arg Asp Gly Val Asp Gly Tyr Val Ile Ala Cys Phe Gly Asp Pro

65 70 75 80

Gly Leu Asp Ala Ala Arg Glu Leu Ala Gly Gly Pro Val Val Gly Ile

85 90 95

Ala Glu Ala Ala Met His Thr Ala Ala Val Leu Gly Arg Gly Phe Ser

100 105 110

Val Val Thr Thr Leu Ala Arg Thr Thr Gly Arg Ala Trp Asp Leu Ala

115 120 125

His Arg Tyr Gly Met Arg Asp Ala Cys Arg Gly Val His Ala Cys Asp

130 135 140

Leu Pro Val Leu Ala Leu Asp Ser Glu Pro Asp Ala Arg Lys Ile Val

145 150 155 160

Thr Glu Ala Cys Leu Asp Ala Leu Tyr Glu Asp Gly Ser Asp Ala Ile

165 170 175

Val Leu Gly Cys Ala Gly Met Ala Asp Leu Cys Ala His Ile Ser Ala

180 185 190

Glu Ile Gly Val Pro Val Val Asp Gly Val Ala Ala Ala Thr Leu Thr

195 200 205

Val Gln Ser Leu Val Thr Met Gly Leu Ala Thr Gly Lys Arg Gly Glu

210 215 220

Phe Ala Ala Pro Pro Pro Lys Arg Tyr Ala Gly Leu Leu Asp Gly Phe

225 230 235 240

Thr Thr Gly Gly

<210> 2

<211> 735

<212> DNA

<213> 红球菌R04(Rhodococcus R04)

<400> 2

atgttcatca aggtcgtcaa cccgaacacc acgtggtcga tgaccgccac gatcgaggcg 60

tgtgcccggg ccgtcgcagg tccgggcaca cgcgtcgagg cggtcagccc cacgatggga 120

cctccgtcga tcgagagcca ctacgacgac gcgctcgccg tgccgggcat cctcaccgag 180

atcgagaagg gtgaacgcga cggcgtcgac ggctacgtca tcgcgtgttt cggcgatccc 240

gggctggacg cggcgcgcga gctcgccggc gggcccgtcg tcggcatcgc cgaggccgcc 300

atgcacaccg ccgcggtcct ggggcgcgga ttctccgtcg tcacgacgct ggcccgcacg 360

accggacgcg cgtgggacct cgcgcaccgc tacggcatgc gcgacgcgtg ccggggcgtg 420

cacgcgtgcg acctgccggt gctcgccctc gacagcgaac ccgacgcacg caagatcgtc 480

accgaggcgt gcctcgacgc cctgtacgag gacggttccg acgccatcgt gctcggctgc 540

gccgggatgg ccgacctgtg cgcgcacatc tccgcggaga tcggagtgcc ggtggtggac 600

ggtgtcgcgg ccgcgacgct gaccgtgcag tcgctggtca cgatggggct ggcgaccggc 660

aagcgaggag agttcgcggc tcccccaccg aagcgctatg cgggactgct cgacgggttc 720

acgacgggcg ggtga 735

Claims

1.一种海因消旋酶，特征在于它的氨基酸序列为SEQ ID No.1所示的序列。

2.一种编码权利要求1所述的海因消旋酶的多核苷酸，其核苷酸序列为SEQ ID No.2所示的序列。

3.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2所述的多核苷酸。

4.如权利要求3的载体，它为质粒。

5.如权利要求3的载体，其含有tac启动子。

6.一种工程菌，其特征在于它含有权利要求3所述的载体。

7.如权利要求6所述的工程菌，为原核细胞系统。

8.如权利要求7所述的工程菌，所述原核细胞系统是大肠杆菌BL21(DE3)。

9.一种海因消旋酶的表达方法：在适合表达海因消旋酶的条件下，培养权利要求6所述的工程菌。

10.如权利要求6所述的工程菌在合成D-氨基酸中的用途。