CN109896980A - 一种西格列汀中间体的生物合成方法 - Google Patents
一种西格列汀中间体的生物合成方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种西格列汀中间体的生物合成方法，即以4‑(2,4,5‑三氟苯甲基)尿嘧啶为底物在酶的作用下，经一锅法制备，或，4‑(2,4,5‑三氟苯甲基)尿嘧啶经酶法先制备得到(R)‑3‑氨基甲酰氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁酸，经分离后，再在水解酶或酸的作用下制备得到(R)‑3‑氨基‑4‑(2,4,5‑三氟苯基)丁酸，
Description
技术领域
本发明涉及医药中间体的制备方法，具体涉及一种西格列汀中间体的生物合成方法。
背景技术
西格列汀化学名为7-[1-氧代-(3R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁基]-3-三氟甲基-5,6,7,8-四氢-1,2,4-三唑[4,3-a]吡嗪，是一种二肽基肽酶-IV(DPP-IV)抑制剂类的口服抗高血糖药。DPP-IV是一种使糖依赖性胰岛素释放肽(GIP)和胰高血糖样肽1(GLP-1)都失活的酶，DPP-IV的抑制代表一种治疗和预防也被称为非胰岛素依赖型糖尿病(DIDDM)的2型糖尿病的新途径。西格列汀还对食欲有影响，因为其减缓胃动力并引起饱腹感。这种食欲下降能够有助于患者减轻体重，这对患有糖尿病的患者也是有益的效果。
西格列汀分子式中存在一个R构型的手性碳原子，药物的手性纯度直接影响药物的吸收和疗效，因此，提供一种制备纯的单一构型的方法具有重要作用。
美国专利US8097724中，公开了bacillus genus protease菌株获得的水解酶方法制备R构型西格列汀中间体的方法，可用反应式表示如下：
然而更多的现有技术中，公开的是用化学的方法制备西格列汀和其类似物。如在专利US6699871中涉及制备中间体(3R)-3-[N-(叔-丁氧基羰基)氨基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸和3-三氟甲基-5,6,7,8-四氢-[1,2,4]三唑并[4,3-a]吡嗪，随后通过他们的结合来获得Boc保护的西格列汀碱，再使用甲醇氢氯化物对其脱保护获得西格列汀盐酸盐。然而，中间体(3R)-3-[N-(叔-丁氧基羰基)氨基]-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的纯化和合成分别需要使用制备型手性HPLC和制备型HPLC，它们在工业规模上是非常昂贵和不方便的技术。此外，该方法涉及使用有毒有害的试剂重氮甲烷。
申请号为CN200910148240.5中公开了用樟脑磺酸或者酒石酸拆分消旋体来获得R构型西格列汀，但是其拆分的方法不仅过程复杂，需要用到大量有机溶剂，而且S构型西格列汀无法重新利用，导致原料浪费，成本高，不利于工业化生产。
中国专利CN200480007313.4和CN200580010669.8均公开了通过烯胺中间体经不对称氢化还原得到西格列汀。其合成的关键在于烯胺中间体的不对称氢化还原。但是所用的金属铑或者铱、二茂铁基双膦配体的价格都十分昂贵，且氢化反应时间较长，不适合放大生产。
另外，BASF SE在2010年9月15日申请的专利WO2011032990公开了含4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶通式化合物在从Agrobacterium，Arthrobacter，Pseudomonas和Vigna的生物体尤其是Vigna angularis获得的乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶作用下得到含(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸前体的通式化合物，
但没有提供(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的具体实施例和得到的EE值。从WO2011032990说明书公开的内容来看，当公开的取代基R1为苄基时，得到的产物的EE值为0，没有选择性。
在上述已有的合成西格列汀中间体的化学合成方法和酶法的基础上，本发明人研发得到了另一种西格列汀中间体的合成方法。本发明的方法原料利用率高、成本低、反应条件温和。能够获得EE值非常高的R构型中间体，是一条适于工业化生产的路线。
发明内容
本发明所要解决的问题就是要使用温和的反应条件，在成本低的前提下，获得光学纯度高的产物。为此，本发明提供了一种西格列汀中间体的生物合成方法，其能提高原料利用率、降低生产成本，获得高光学纯度产物。本发明的制备工艺是一条适合工业化生产的工艺。
为了达到本发明的技术目的，本发明提供的技术方案如下：
首先，本发明提供了一种通式III化合物
其中，R1，R2相同或不同的为氢，直链或支链的低取代烷基，芳基，杂芳基，烷氧基，酰基，醛基，苄基，取代苄基。
优选地，本发明提供了下述III-1化合物
X为卤素。
更优选地，本发明提供了如下结构的西格列汀中间体(R)-3-氨基甲酰氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸
第二，本发明提供了通式III化合物的生物合成方法，由通式IV的底物经酶法制备：
其中，R1，R2相同或不同的为氢，直链或支链的低取代烷基，芳基，杂芳基，烷氧基，酰基，醛基，苄基，取代苄基。
使用的酶为海因水解酶和海因消旋酶的混合物。
优选地，上述生物合成方法如下：
X为卤素。
更优选地，本发明提供了上述西格列汀中间体(R)-3-氨基甲酰氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的生物合成方法，由4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶在海因水解酶和海因消旋酶的混合作用下反应得到：
第三，本发明提供了一种通式II化合物的生物合成方法，其特征在于，由通式Ⅲ化合物在水解酶或酸的作用下经水解反应制备：
或，由通式IV的底物经酶法先制备得到式Ⅲ化合物，分离或不分离，继续在水解酶的作用下或酸的作用下制备：
其中，R1，R2相同或不同的为氢，直链或支链的低取代烷基，芳基，杂芳基，烷氧基，酰基，醛基，苄基，取代苄基。
酶法步骤使用的酶为海因水解酶和海因消旋酶的混合物。
水解步骤所用水解酶为N-甲酰基-D-氨基酸水解酶；所用酸为无机酸或有机酸，优选盐酸。
上述通式II和III化合物生物合成过程中所述的海因水解酶为来源于Rhodococcus rhodochrous，Jannaschia sp,Sinorhizobium meliloti,Arthrobacterpolychromogenes,Agrobacterium tumefaciens，Escherichia coli等；所述海因消旋酶为来源于Achromobacter obae，Sinorhizobium meliloti，Agrobacterium fabrum，Agrobacterium tumefaciens，Sinorhizobium meliloti，microbacterium liquefaciens，Arthrobacter aurescens,Escherichia coli等；所述N-甲酰基D氨基酸水解酶为来源于Brevundimonas diminuta，Flavobacterium sp.Pyrococcus horikoshii，Thermococcuslitoralis，Aspergillus melleus，Alcaligenesfaecalis，Pyrococcus horikoshii，micrococcus agilis，Escherichia coli等。
所述海因水解酶、海因消旋酶和N-甲酰基D氨基酸水解酶为基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉、固定化酶或固定化细胞。
优选，上述生物合成方法可在溶剂存在下进行。
所述溶剂为缓冲溶液与有机溶剂组成的混合溶剂。
其中，缓冲溶液与溶剂的体积比为15:100-5，优选为100:10。
所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种或多种。
有机溶剂选自DMSO、乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、DMF、TBME、二氯甲烷、乙酸乙烯酯中的一种或几种。
所述反应体系中pH值控制为6-9，优选为6.5。
第四，本发明提供了一种西格列汀中间体化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的生物合成方法，由4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶经酶法先制备得到(R)-3-氨基甲酰氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸，经分离后，再在水解酶或酸的作用下制备得到(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸：
或，由4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶在酶的作用下经一锅法制备：
上述一锅法所用的酶为海因水解酶、海因消旋酶和N-甲酰基-D-氨基酸水解酶的混合物。优选浓度比控制为0.8-1.5g/L︰0.8-2g/L︰1g/L。
另外，本发明提供了式IV底物的制备方法，由外消旋的式V化合物与尿素反应得到：
其中，R1，R2相同或不同的为氢，直链或支链的低取代烷基，芳基，杂芳基，烷氧基，酰基，醛基，苄基，取代苄基。
优选R1为卤取代苄基，R2为氢。
更优选地，本发明提供了西格列汀中间体生物合成方法所用底物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶的制备反应式如下：
本发明在生物转化过程中利用HPLC-MS和HPLC进行监控，直至底物完全利用。
本发明的优点主要体现在如下几方面：
其一，本发明工艺流程简单，成本低，反应条件温和，对设备无特殊要求，可为一锅法制备，适用于工业化生产；
其二，本发明底物利用率高；
其三，本发明催化剂为三种酶共同作用，专一高效，催化效果好，用量少，环境友好。
其四，本发明的三种酶相比于专利申请WO2011032990中的乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶在催化底物上能获得更高的EE值，是更加具备优势的酶。
其五，本发明的三种酶未有从US8097724中获得任何技术启示，是与US8097724不同的酶，作为的官能团亦不相同。
附图说明
图1为4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶的H-NMR图；
图2为本发明实施例1制备的化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的液相图；
图3为标准品化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的液相图；
图4为本发明实施例7制备的式Ⅲ化合物(R)-3-氨基甲酰氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的质谱图。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种西格列汀中间体的生物合成方法进行详细说明。需要理解的是，这些实施例描述只是为进一步详细说明本发明的特征，而不是对本发明范围或本发明权利要求范围的限制。
酶的制备过程如下：
1、海因水解酶的基因工程菌全细胞的制备
海因水解酶的基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Rhodococcusrhodochrous的海因水解酶的基因序列，进行人工设计，将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组海因水解酶的重组海因水解酶基因工程菌。
将重组海因水解酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Rhodococcusrhodochrous的海因水解酶的基因工程菌全细胞。
2、海因消旋酶的基因工程菌全细胞的制备
海因消旋酶的基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Achromobacter obae的海因消旋酶的基因序列，进行人工设计，将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组海因消旋酶的重组海因消旋酶基因工程菌。
将重组海因消旋酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Achromobacter obae的海因消旋酶的基因工程菌全细胞。
3、N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌全细胞的制备
N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Brevundimonas diminuta的N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因序列，进行人工设计，将该序列通过全基因合成，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coliBL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组N-甲酰基D氨基酸水解酶的重组N-甲酰基D氨基酸水解酶基因工程菌。
将重组N-甲酰基D氨基酸水解酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Brevundimonas diminuta的N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌全细胞。
底物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶制备：
将3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸(3.5g，15mmol)和尿素(1.6g，27mmol)溶于乙酸(6.5ml)中，加热回流14小时以上，然后加入3.2ml浓盐酸，继续回流半小时。液相监测，反应完后加入20ml水稀释，冷却析晶。固体过滤，冰水洗，干燥，得到产物即为4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶(2.1313g，8.26mmol)，收率为55.07％。反应式如下：
实施例1：
西格列汀中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的生物合成方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的式Ⅳ化合物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶为底物，溶剂为270ml的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)和30ml的DMSO组成的混合溶剂，以50g/L的来源于Rhodococcusrhodochrous的海因水解酶的基因工程菌全细胞、50g/L的来源于Achromobacter obae的海因消旋酶的基因工程菌全细胞和50g/L的来源于Brevundimonas diminuta的N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌全细胞为催化剂，控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为15.6h，得到含有式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液，收率为97.1％。
步骤2：对含有西格列汀中间体式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液进行纯化，纯化后，西格列汀中间体晶体纯度达到99.7％，光学纯度为99.8％。
反应式如下：
实施例2：
步骤1：反应在500mL摇瓶中进行，反应体系控制为200mL，以20g的式Ⅳ化合物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶为底物，溶剂为184ml的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液和16ml的DMSO组成的混合溶剂，以40g/L的来源于Rhodococcus rhodochrous的海因水解酶的基因工程菌全细胞、75g/L的来源于Achromobacter obae的海因消旋酶的基因工程菌全细胞和50g/L的来源于Brevundimonas diminuta的N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌全细胞为催化剂，控制转化体系的pH值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min，转化时间为19.4h，得到含有式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液，收率为96.5％。
步骤2：对含有西格列汀中间体式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液进行纯化，纯化后，西格列汀中间体晶体纯度达到99.5％，光学纯度为99.6％。
实施例3：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的式Ⅳ化合物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶为底物，溶剂为264ml的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液和36ml的乙酸乙酯组成的混合溶剂，以50g/L的来源于Rhodococcus rhodochrous的海因水解酶的基因工程菌全细胞、100g/L的来源于Achromobacter obae的海因消旋酶的基因工程菌全细胞和50g/L的来源于Brevundimonas diminuta的N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌全细胞为催化剂，控制转化体系的pH值为5，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为150r/min，转化时间为21.4h，得到含有式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液，收率为95.9％。
步骤2：对含有西格列汀中间体式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液进行纯化，纯化后，西格列汀中间体晶体纯度达到99.3％，光学纯度为99.5％。
实施例4：
步骤1：反应在5L烧杯中进行，反应体系控制为2L，以200g的式Ⅳ化合物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶为底物，溶剂为1700ml的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液缓冲溶液和300ml的CH2Cl2组成的混合溶剂，以75g/L的来源于Rhodococcus rhodochrous的海因水解酶的基因工程菌全细胞、50g/L的来源于Achromobacter obae的海因消旋酶的基因工程菌全细胞和50g/L的来源于Brevundimonas diminuta，Flavobacterium sp.Pyrococcushorikoshii，Thermococcus litoralis，Aspergillus melleus，Alcaligenesfaecalis，Pyrococcus horikoshii，micrococcus agilis，Escherichia coli等的N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌全细胞为催化剂，控制转化体系的pH值为6，控制转化体系的温度为35℃；机械搅拌转速控制为200r/min，转化时间为19.8h，得到含有式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液，收率为95.3％。
步骤2：对含有西格列汀中间体式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液进行纯化，纯化后，西格列汀中间体晶体纯度达到99.7％，光学纯度为99.6％。
实施例5：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的式Ⅳ化合物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶为底物，溶剂为285ml的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)和15ml的DMSO组成的混合溶剂，以75g/L的来源于Rhodococcusrhodochrous的海因水解酶的基因工程菌全细胞、40g/L的来源于Achromobacter obae的海因消旋酶的基因工程菌全细胞和50g/L的来源于Brevundimonas diminuta的N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌全细胞为催化剂，控制转化体系的pH值为7，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为22.3h，得到含有式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液，收率为96.3％。
步骤2：对含有西格列汀中间体式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液进行纯化，纯化后，西格列汀中间体晶体纯度达到99.4％，光学纯度为99.7％。
实施例6：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的式Ⅳ化合物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶为底物，溶剂为282ml的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)和18ml的DMSO组成的混合溶剂，以75g/L的来源于Rhodococcusrhodochrous的海因水解酶的基因工程菌全细胞、75g/L的来源于Achromobacter obae的海因消旋酶的基因工程菌全细胞和50g/L的来源于Brevundimonas diminuta的N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌全细胞为催化剂，控制转化体系的pH值为7，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为19.7h，得到含有式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液，收率为96.7％。
步骤2：对含有西格列汀中间体式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液进行纯化，纯化后，西格列汀中间体晶体纯度达到99.7％，光学纯度为99.6％。
实施例7：
西格列汀中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的生物合成方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的式Ⅳ化合物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶为底物，溶剂为270ml的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)和30ml的DMSO组成的混合溶剂，以50g/L的来源于Rhodococcusrhodochrous的海因水解酶的基因工程菌全细胞、50g/L的来源于Achromobacter obae的海因消旋酶的基因工程菌全细胞为催化剂，控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为15.6h，得到含有式Ⅲ化合物(R)-3-氨基甲酰氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液；
1H NMR(400MHz，CDCl3)：δ12.18(s，1H)，6.79(m，1H)，6.61(m，1H)，6.01(s，1H)，5.45(s，2H)，4.30(m，1H)，2.93(m，2H)，2.58(m，2H)。
MS(ESI)：m/z 275.15[M+H]+。
步骤2：将步骤1所得的含有式Ⅲ化合物(R)-3-氨基甲酰氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液中加入50g/L的来源于Brevundimonas diminuta的N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌全细胞，反应8h，得到含有式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液，收率为96.5％。
步骤3：对含有西格列汀中间体式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液进行纯化，纯化后，西格列汀中间体式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸晶体纯度达到99.7％，光学纯度为99.8％。
反应式如下：
实施例8：
西格列汀中间体(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的生物合成方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的式Ⅳ化合物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶为底物，溶剂为270ml的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)和30ml的DMF组成的混合溶剂，以50g/L的来源于Jannaschia sp的海因水解酶的基因工程菌全细胞、50g/L的来源于Sinorhizobium meliloti的海因消旋酶的基因工程菌全细胞和50g/L的来源于，Flavobacterium sp的N-甲酰基D氨基酸水解酶的基因工程菌全细胞为催化剂，控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，转化时间为16h，得到含有式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液，收率为86.2％。
步骤2：对含有西格列汀中间体式Ⅱ化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的转化液进行纯化，纯化后，西格列汀中间体晶体纯度达到99.6％，光学纯度为99.5％。
对比实施例：
按专利WO2011032990中实施例2的方法制备乙内酰胺酶，反应在1L摇瓶中进行，反应体系控制为300mL，以30g的式Ⅳ化合物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶为底物，溶剂为270ml的MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)和30ml的DMSO组成的混合溶剂，以150g/L所制备乙内酰胺酶为催化剂，控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为37℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到转化液。
转化时间为22h，所制备的西格列汀中间体的收率为81.8％。
对含有西格列汀中间体的转化液进行纯化，纯化后，光学纯度为0。
由此可见，专利WO2011032990中实施例2的方法制备的乙内酰胺酶对本发明的底物4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶没有选择性。
Claims (18)
1.一种通式III化合物，结构式如下：
其中，R1，R2相同或不同的为氢，直链或支链的低取代烷基，芳基，杂芳基，烷氧基，酰基，醛基，苄基，取代苄基。
2.根据权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述R1为卤取代苄基，R2为氢。
3.根据权利要求2所述的化合物，其特征在于，所述化合物为(R)-3-氨基甲酰氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸，
4.一种通式II化合物的生物合成方法，其特征在于，由通式Ⅲ化合物在水解酶或酸的作用下经水解反应制备，
其中，R1，R2相同或不同的为氢，直链或支链的低取代烷基，芳基，杂芳基，烷氧基，酰基，醛基，苄基，取代苄基。
5.一种通式Ⅲ化合物的生物合成方法，其特征在于，由通式IV的底物经酶法制备得到
其中，R1，R2的定义与权利要求4中的相同。
6.一种通式II化合物的生物合成方法，其特征在于，由通式IV的底物经酶法先制备得到式Ⅲ化合物，选择性分离后继续在水解酶的作用下或酸的作用下制备，
其中，R1，R2的定义与权利要求4中的相同。
7.一种西格列汀中间体化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的生物合成方法，其特征在于，由4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶在酶的作用下，经一锅法制备，
8.一种西格列汀中间体化合物(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸的生物合成方法，其特征在于，4-(2,4,5-三氟苯甲基)尿嘧啶经酶法先制备得到(R)-3-氨基甲酰氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸，经分离后，再在水解酶或酸的作用下制备得到(R)-3-氨基-4-(2,4,5-三氟苯基)丁酸，
9.根据权利要求4,6或8所述的生物合成方法，其特征在于，所述水解反应中使用的水解酶为N-甲酰基-D-氨基酸水解酶，所述酸为无机酸或有机酸。
10.根据权利要求5,6,7或8所述的生物合成方法，其特征在于，所述单步酶法中使用的酶为海因水解酶和海因消旋酶的混合物。
11.根据权利要求6,7所述的生物合成方法，其特征在于，所述一锅法中的酶法，所使用的酶为海因水解酶、海因消旋酶和N-甲酰基-D-氨基酸水解酶的混合物。
12.根据权利要求11所述生物合成方法，其特征在于，所述海因水解酶来源于Rhodococcus rhodochrous，Jannaschia sp,Sinorhizobium meliloti,Arthrobacterpolychromogenes,Agrobacterium tumefaciens，Escherichia coli中的一种；所述海因消旋酶来源于Achromobacter obae，Agrobacterium fabrum，microbacteriumliquefaciens，Arthrobacter aurescens,Escherichia coli中的一种；所述N-甲酰基-D-氨基酸水解酶来源于Brevundimonas diminuta，Flavobacterium sp.Pyrococcushorikoshii，Thermococcus litoralis，Aspergillus melleus，Alcaligenesfaecalis，Pyrococcus horikoshii，micrococcus agilis中的一种。
13.根据权利要求11所述生物合成方法，其特征在于，所使用的酶为基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉或固定化酶或固定化细胞。
14.根据权利要求5,6,7或8所述的生物合成方法，其特征在于，所述反应在溶剂存在条件下进行。
15.根据权利要求14所述生物合成方法，其特征在于，所述溶剂为缓冲溶液与有机溶剂组成的混合溶剂。
16.根据权利要求15所述生物合成方法，其特征在于，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液或MOPS缓冲溶液中的一种或多种。
17.根据权利要求15所述生物合成方法，其特征在于，所述有机溶剂选自DMSO、乙酸乙酯、乙酸丁酯、异丙醇、DMF、TBME、二氯甲烷、乙酸乙烯酯中的一种或两种及以上混合。
18.根据权利要求5或6所述生物合成方法，其特征在于，所述底物IV化合物由外消旋的式V化合物与尿素反应制备，
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|---|---|---|---|---|
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06261787A (ja) * | 1993-03-10 | 1994-09-20 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 光学活性β−アミノ酸の製造法 |
| CN1190406A (zh) * | 1995-07-11 | 1998-08-12 | 德古萨股份公司 | 肽及n－氨基甲酰基－保护的肽的制备方法 |
| CN1616414A (zh) * | 2004-09-22 | 2005-05-18 | 南开大学 | DL－β－氨基丁酸衍生物及其制备方法和应用 |
| EP2270009A1 (en) * | 2009-06-30 | 2011-01-05 | Dipharma Francis S.r.l. | Process for the preparation of sitagliptin |
| CN102782128A (zh) * | 2009-09-15 | 2012-11-14 | 巴斯夫欧洲公司 | β-氨基酸的制备 |
| CN106811492A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-06-09 | 长兴制药股份有限公司 | 一种拉科酰胺的制备方法 |
-
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH06261787A (ja) * | 1993-03-10 | 1994-09-20 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | 光学活性β−アミノ酸の製造法 |
| CN1190406A (zh) * | 1995-07-11 | 1998-08-12 | 德古萨股份公司 | 肽及n－氨基甲酰基－保护的肽的制备方法 |
| CN1616414A (zh) * | 2004-09-22 | 2005-05-18 | 南开大学 | DL－β－氨基丁酸衍生物及其制备方法和应用 |
| EP2270009A1 (en) * | 2009-06-30 | 2011-01-05 | Dipharma Francis S.r.l. | Process for the preparation of sitagliptin |
| CN102782128A (zh) * | 2009-09-15 | 2012-11-14 | 巴斯夫欧洲公司 | β-氨基酸的制备 |
| CN106811492A (zh) * | 2017-01-18 | 2017-06-09 | 长兴制药股份有限公司 | 一种拉科酰胺的制备方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| MAEVE O’NEILL ET AL: "Enzyme-Catalyzed Enantioselective Hydrolysis of Dihydrouracils as a Route to Enantiomerically Pure β-Amino Acids", 《ACS CATAL.》 * |
| MARTINEZ-GOMEZ ANA ISABEL ET AL: "New biocatalytic route for the production of enantioenriched β-alanine derivatives starting from 5- and 6-monosubstituted dihydrouracils", 《PROCESS BIOCHEMISTRY》 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112175929A (zh) * | 2020-10-10 | 2021-01-05 | 山西大学 | 一种重组海因消旋酶工程菌及其构建方法和用途 |
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| Publication number | Publication date |
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