CN102782128A - β-氨基酸的制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及应用乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶从任选取代的二氢尿嘧啶生物催化、对映选择性生产β-氨基酸前体的方法，从所述前体生产β-氨基酸的方法，乙内酰脲酶及其在所述生物催化生产β-氨基酸前体或β-氨基酸的方法中的用途，以及获得所述乙内酰脲酶的方法。

Description

β-氨基酸的制备
发明领域
本发明涉及应用乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶从任选取代的二氢尿嘧啶生物催化生产β-氨基酸前体的方法、从所述前体生产β-氨基酸的方法、乙内酰脲酶及其在所述生物催化生产β-氨基酸前体或β-氨基酸的方法中的用途、以及获得所述乙内酰脲酶的方法。
背景技术
对映体纯的β-氨基酸是用于具有很广泛的生物活性的新治疗剂的有价值的构建模块。尽管已经开发了制备它们的许多生物催化途径，但尚未出现是可普遍适用的一种方法。类似地，几乎没有开发β-氨基酸的化学催化途径，多数需要化学计算量的手性助剂。
二氢嘧啶酶和乙内酰脲酶是生物催化合成氨基酸或它们前体的可能候选物。Gaebler和Keltch在20世纪20年代首次报道了乙内酰脲酶裂解活性(Gaebler，O.H.；Keltch，A.K.On the metabolism of hydantoins andhydantoic acid，1926；Vol.70)。Eadie等在20世纪50年代首次提出微生物乙内酰脲酶与动物二氢嘧啶酶是同一的(Eadie，G.；Bernheim，F.；Bernheim，M.Journal of Biological Chemistry 181：449-458，1949)。分离自小牛肝脏和植物的二氢嘧啶酶催化二氢尿嘧啶和二氢胸腺嘧啶分别水解为N-氨基甲酰基-β-丙氨酸和N-氨基甲酰基-2-甲基-β-丙氨酸。这些酶还将(R)-5-单取代的乙内酰脲裂解为(R)-N-氨基甲酰基-氨基酸。最近的文献一般提议来自微生物来源的D-乙内酰脲酶可被认为是动物二氢嘧啶酶的对应物，其中Nonaka及其同事提出了这两种酶之间的进化关系(Hamajima，N.；Matsuda，K.；Sakata，S.；Tamaki，N.；Sasaki，M.；Nonaka，M.Gene180：157-163，1996)。Syldatk等推断二氢嘧啶酶和乙内酰脲酶并不必然是相同的酶(Syldatk，C.；May，O.；Altenbuchner，J.；Mattes，R.；Siemann，M.Applied Microbiology and Biotechnology 51：293-309，1999)。根据它们的特异性，通常使用乙内酰脲酶不同的立体选择性将它们分类为D-、L-或非特异性的(Ogawa，J.；Shimizu，S.Journal of Molecular Catalysis B：Enzymatic 2：163-176，1997)。
术语经常替换使用(尤其是在较早期的杂志中)的这一事实使得由乙内酰脲酶和二氢嘧啶酶命名系统所产生的问题进一步恶化。酰胺水解酶也称为环酰胺酶[E.C.3.5.2]，其为超过14种酶的一组酶，它们均作用于环酰胺环上，并含有许多高度保守区域和不变氨基酸区域(Kim，G.J.；Cheon，Y.H.；Kim，H.S.Biotechnology and Bioengineering 1998，61，1-13)。这一组包含了羧甲基乙内酰脲酶[E.C.3.5.2.4]、尿囊素酶[E.C.3.5.2.5]、1-甲基乙内酰脲酶[E.C.3.5.2.14]和羧乙基-乙内酰脲酶，所有的这些在技术上都是乙内酰脲酶，因为它们的底物是天然存在的乙内酰脲衍生物。
落入更宽的环酰胺酶组的其他酶包括二氢乳清酸酶[E.C.3.5.2.3]和二氢嘧啶酶[E.C.3.5.2.2]，后者通常称为D-乙内酰脲酶，因为其能够水解(R)-5-单取代的乙内酰脲衍生物。当N-氨基甲酰基-氨基酸被假设为前生命肽的原始合成元时，这一蛋白超家族最可能是在史前地球上进化的。
乙内酰脲酶用于将5-取代的乙内酰脲(R)-1和(S)-1的外消旋混合物对映选择性地水解为它们相应的N-氨基甲酰基衍生物(R)-2和(S)-2的用途已得到了确立(参考以下流程1)，并描述在文献中(Morin，Enzyme Microb.Technol.15：208-214，1993；Fan和Lee，Biochemical Engineering J.8：157-164，2001；Arcuri等，J.Molecular Catalysis B 21：107-111，2003；Arcuri等，Amino Acids 19：477-482，2000)。其已发展至这样的阶段，其中商业方法已应用这一技术规模地运行用于生产特定D-(R)-氨基酸(R)-3。这些方法的关键方面是未反应的对映体(S)-1的原位外消旋与(R)-2的氨甲酰水解酶催化水解，其导致了动态动力学拆分(DKR)反应。
流程1
Figure BDA00001633830200031
当酶比转化另一对映体更快地转化一种对映体时，发生动力学拆分。然而，这一类型的反应的最大产率仅为50％，并且需要将产物从原料中分离。在动态动力学拆分中，使对映体外消旋化，从而使得(R)-和(S)-对映体形成化学平衡，并容易地相互转化。当更快反应的对映体转化为相应产物时，由于外消旋作用，其被再次补充，由此使得产率高达100％。
与外消旋5-取代的乙内酰脲的对映选择性水解相反，对6-取代的二氢尿嘧啶(+/-)-4(参见流程2)对映选择性水解为它们相应的N-氨基甲酰基衍生物(R或S)-5(从而作为生产β-氨基酸(R或S)-6的途径)的可能性受到的关注极少。Syldatk等在1998年(May，O.；Siemann，M.；Pietzsch，M.；Kiess，M.；Mattes，R.；Syldatk，C.J.Biotechnol.61：1-13，1998)报道了来自金黄节杆菌(Arthrobacter aurescens)的乙内酰脲酶用于水解二氢尿嘧啶((+/-)-4，其中R代表H)的用途，并且随后在2003年在海报中描述了这一乙内酰脲酶可用于拆分6-苯基二氢尿嘧啶(6-PDHU，(+/-)-4，其中R代表苯基)，但是观察到相对于5-苯基乙内酰脲(分别为(R)-1和(S)-1，其中在流程1中R代表Ph)的很差的对映选择性和低反应速率。
流程2
日本专利申请JP06261787报道了应用恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)IFO 12996水解6-PDHU的达51％的对映体过量率；应用含6-烷基取代基的底物获得更好的选择性(达93％的对映体过量)。显然，需要改进的生物催化生产β-氨基酸前体或β-氨基酸的方法。
发明简述
在第一个方面，本发明的目的是通过立体特异性地、尤其是对映选择性地生物催化生产β-氨基酸前体的方法而得以解决的，所述方法包括：
在至少一种催化乙内酰脲和/或二氢嘧啶环水解裂解的酶，尤其是选自乙内酰脲酶和二氢嘧啶酶的酶，更特别是乙内酰脲酶，特别是对待转化化合物的特定立体异构体具有优先选择性的酶的存在下；以及任选地在至少一种具有使所述式(1)化合物的立体异构体相互转化之能力的酶存在下，
使立体异构纯形式的、例如作为(R)-或(S)-异构体或作为立体异构体的混合物例如作为外消旋混合物的至少一种通式(I)的底物反应
其中R1和R2彼此独立地选自：
氢；
直链或支链的、任选取代的低级烷基；
直链或支链的、任选取代的低级烯基；
任选取代的环烷基；
单环或多环的、任选取代的芳基；
单环或多环的、任选取代的杂芳基；
直链或支链的、任选取代的烷氧基；
氨基；
直链或支链的、任选取代的烷基氨基；
直链或支链的、任选取代的烷硫基；
直链或支链的、任选取代的酰基；
羧基；或
醛基；
或所述化合物的盐，例如酸加成盐，
从而产生通式(II)的β-氨基酸前体
Figure BDA00001633830200051
其中R1和R2如上面所定义；
所述方法的特征在于所述催化乙内酰脲和/或二氢嘧啶环水解裂解的酶，尤其是乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶，获自赤豆(Vigna angularis)和/或包含至少一个与以下部分序列至少之一具有约60-100％同一性的部分序列：
Figure BDA00001633830200061
例如包含至少一个与部分序列SEQ ID NO：5和7至少之一具有60％至100％同一性的部分序列。
根据一个实施方案，所述方法还包括将所述式(2)的β-氨基酸前体转化为相应的式(III)β-氨基酸的另外的步骤：
Figure BDA00001633830200062
其中，R1和R2具有与之前定义的相同的含义。
根据另一实施方案，β-氨基酸前体的转化在酸性pH下、优选在亚硝酸的存在下、或在氨甲酰水解酶的存在下进行。
根据另一实施方案，所述至少一种乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶(尤其是根据E.C.3.5.2.2的酶)是可从土壤杆菌属(Agrobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和豇豆属(Vigna)的生物体获得的酶，尤其是可从赤豆(Vigna angularis)获得的酶。
根据另一实施方案，在通式(I)至(III)中R2是H且R1不同于H。
根据另一实施方案，在通式(I)至(III)中R2是H且R1是任选取代的芳基。
特别是，其中仅R2是H，且R1不同于H的式(II)和(III)以及式(I)的化合物优选作为立体异构纯形式或立体异构过量(尤其是具有超过93％、优选95-99％、或超过99％的ee-值)的(S)-异构体存在。
根据另一实施方案，所述反应在Tris-缓冲的或硼酸盐缓冲的反应混合物中进行，优选在Tris-缓冲的反应混合物中进行。
根据另一实施方案，所述反应在约7.0至约11.0的pH下、优选在约7.5至约10.0的pH下以及尤其优选在约7.5至约8.0的pH下进行。
根据另一实施方案，所述反应在约1％至约20％二甲基亚砜的存在下，优选在约10％二甲基亚砜的存在下进行。
根据另一实施方案，所述反应在约30℃至约60℃、优选约30℃至约50℃以及尤其是约40℃至约50℃范围内的温度下进行。
根据另一实施方案，所述反应进行约1小时至约25小时、优选约3小时至约10小时、尤其是约4小时至约5小时。
根据另一实施方案，所述至少一种底物选自二氢尿嘧啶，其为在5-位或在6-位单取代的，尤其是6-苯基二氢尿嘧啶、6-(4-氟-苯基)-二氢尿嘧啶、6-(4-氯-苯基)-二氢尿嘧啶、5-甲基二氢尿嘧啶和6-甲基二氢尿嘧啶。
本发明的另一方面涉及通过根据本发明的方法获得的β-氨基酸前体或β-氨基酸用于制备水解稳定的肽、药物活性剂，尤其是抗生素、抗癌剂、抗血栓形成剂、抗真菌剂杀虫剂、驱虫剂、非肽整联蛋白拮抗剂、生物碱和/或细胞毒剂的用途。
本发明的另一方面涉及包含至少一个与以下部分序列至少之一(例如部分序列SEQ ID NO：5和7至少之一)具有约60-100％同一性的部分序列的乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶用于本发明方法的用途：
本发明的另一方面涉及基本上纯的乙内酰脲酶，该乙内酰脲酶含有以下部分序列至少之一，其包含至少一个与以下部分序列至少之一(例如部分序列SEQ ID NO：5和7至少之一)具有约60-100％例如100％同一性的部分序列：
Figure BDA00001633830200081
本发明的另一方面涉及基本上纯的乙内酰脲酶，其通过从天然或重组表达所述酶活性的生物体制备细胞材料的粗提取物，并使所述粗提取物进行以下相继的纯化步骤而获得：
a)离子交换色谱
b)疏水色谱
c)凝胶过滤
d)亲和色谱
e)阴离子交换
f)凝胶过滤
本发明的其它方面涉及基本上纯的乙内酰脲酶，其包含SEQ ID NO：1至5和7至少之一，和/或根据前述方法分离得到。优选地，乙内酰脲酶从土壤杆菌属、节杆菌属、假单胞菌属和豇豆属的生物体尤其是赤豆获得。
另一方面涉及乙内酰脲酶，其包含SEQ ID NO：1至5和7至少之一，从赤豆获得，尤其是通过基本上包含任意顺序的上述纯化步骤的方法获得，根据前述方法分离得到，并且在SDS PAGE之后，尤其是在还原条件下，显示出在55±10、55±5或55±2或约55kD处的蛋白质条带。
本发明的另一方面涉及前述乙内酰脲酶用于生物催化生产根据本发明的β-氨基酸前体或β-氨基酸的方法的用途。
前述乙内酰脲酶尤其可以是来自土壤杆菌属、节杆菌属、假单胞菌属和豇豆属的生物体尤其是赤豆的乙内酰脲酶。
本发明的另一方面涉及任何前述乙内酰脲酶用于本发明方法的用途。
附图简述
以下更详细地描述本发明，其中可参考以下附图。
图1显示了从赤豆纯化的乙内酰脲酶的SDS PAGE凝胶。
图2显示了合成外消旋6-取代的二氢尿嘧啶的两种示例性方法。
图3显示了通过阴离子交换色谱(DEAE柱)分离N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸(NCBPA)、6-苯基二氢尿嘧啶(6-PDHU)和酶。
图4显示了乙内酰脲酶催化水解6-PDHU后的反相手性HPLC的结果。
图5显示了6-PDHU转化为N-氨基甲酰基衍生物(NCBPA)的随时间的转化率以及相应对映体过量率。
图6显示了N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸在乙内酰脲酶存在或不存在下的环化。
图7显示了在无乙内酰脲酶的Tris缓冲液中6-DPHU化学水解的pH依赖性。
图8显示了乙内酰脲酶介导的6-DPHU酶转化的pH依赖性。
图9显示了乙内酰脲酶在不同的pH值/缓冲液组合中随时间的转化率。
图10显示了由来自赤豆的D-乙内酰脲酶(Sigma)催化的反应。
图11显示了有机共溶剂对乙内酰脲酶催化的6-PDHU转化的影响。
图12显示了不同的乙内酰脲酶浓度对产物形成和对映体过量的影响。
图13显示了在25mL反应中NCBPA的产生。
图14显示了在25mL反应中S-NCBPA的对映体过量。
发明详述
A.定义
在本发明上下文中，“催化乙内酰脲和/或二氢嘧啶环水解裂解的酶”必须显示出催化至少一种式(I)化合物水解裂解形成式(II)化合物的能力，其中所述乙内酰脲和/或二氢嘧啶环如取代的乙内酰脲和/或取代的二氢嘧啶环，例如5-苯基乙内酰脲和6-苯基二氢尿嘧啶。特别地，此种酶也可称作乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶，其中其天然底物为乙内酰脲环的酶优选称为乙内酰脲酶，以及其天然底物为二氢尿嘧啶环的酶优选称为二氢嘧啶酶。
在本发明上下文中，二氢嘧啶酶被表征为能够水解二氢嘧啶，以及另外地能够水解乙内酰脲(如式IV所示)和能够拆分如流程3所示的(±)-5-单取代的乙内酰脲的酶。
Figure BDA00001633830200101
流程3
Figure BDA00001633830200102
相反，乙内酰脲酶通常几乎不显示对二氢嘧啶的水解活性，但可水解乙内酰脲和(±)-5-单取代的乙内酰脲。用于水解乙内酰脲或二氢尿嘧啶、并因此用于进一步限定可用于本发明的酶的适当测试法例如描述于实施例1中。
术语“约”表示所述值的±25％尤其是±15％、±10％、±5％或±4％或±3％或±2％或±1％的可能变动。
在本发明的上下文中，对映选择性意指S-对映体的对映体过量“ee”为至少50％、优选至少80％、更优选至少90％以及尤其是超过93％、特别是至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％，其中所述S-对映体的对映体过量“ee”以百分比(％)表示并且如下那样基于S-对映体和R-对映体的各自浓度计算：
ee(％)＝[(S-对映体-R-对映体)/(S-对映体+R-对映体)]x100
如本文所使用的那样，“基本上纯的”蛋白质或酶意指所期望的纯化蛋白质基本上没有(例如，超过90、92、93、94、95、96、97、98、99或99.9％(干重)组成所述蛋白质)污染的细胞成分，如通过聚丙烯酰胺-十二烷基硫酸钠凝胶电泳(SDS-PAGE)后的单一条带所证实。术语“基本上纯的”还意欲描述这样的分子，即其为本领域技术人员使用的一种或多种纯度或均一性特征而言均匀的。例如，基本上纯的蛋白质将显示出诸如以下参数的在标准实验偏差范围内的恒定和可重复的特征：分子量、色谱迁移、氨基酸组成、氨基酸序列、封闭或未封闭的N端、HPLC洗脱图、生物活性以及其它此类参数。然而，该术语不意味着排除所述蛋白质与其它化合物的人工或合成混合物。此外，该术语还不意味着排除任选地从重组宿主分离的所述蛋白的融合蛋白。
B.用于本发明方法的底物
根据通式(1)的底物的基团R1和/或R2可选自直链或支链的低级烷基，其任选地可在一个或多个位置上被取代。基团R1和R2尤其可以是包括含有1至10个碳原子、尤其是2至6个碳原子的直链或支链烷基的基团，诸如甲基、乙基、异丙基或正丙基、仲丁基或叔丁基、正戊基、2-甲基-丁基、正己基、庚基、辛基、壬基、癸基。支链烷基的实例包括异丙基、异丁基、异戊基、2，2-二甲基丙基、异己基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基、2，3-二甲基丁基、异庚基、2-乙基丁基、3-甲基己基、2，2-二甲基戊基、2，3-二甲基戊基、2，4-二甲基戊基、2，2，3-三甲基丁基、异辛基、3-甲基庚基、4-甲基庚基、2，2-二甲基己基、2，4-二甲基己基、2，5-二甲基己基、2，2，3-三甲基戊基、2，2，4-三甲基戊基、2，2，5-三甲基戊基和异壬基。
根据通式(1)的底物的基团R1和/或R2还可选自直链或支链的低级烯基，其任选地可在一个或多个位置上被取代。实例包括低级烷基的不饱和类似物，其在碳链的任何可能的位置上包含一个或多个碳-碳双键。实例是乙烯基、烯丙基(2-丙烯基)、丁-1-烯基、顺-丁-2-烯基、反-丁-2-烯基、戊-1-烯基、顺-戊-2-烯基、反-戊-2-烯基、2-甲基-丁-1-烯基、2-甲基-丁-2-烯基、3-甲基-丁-1-烯基、己-1-烯基、作为顺-或反异构体的己-2-烯基、己-3-烯基、2-甲基-戊-1-烯基、2-甲基-戊-2-烯基、3-甲基-戊-2-烯基、4-甲基-戊-1-烯基、4-甲基-戊-2-烯基、2-乙基-丁-1-烯基、2，3-二甲基-丁-1-烯基、2，3-二甲基-丁-2-烯基、3，3-二甲基-丁-1-烯基。
根据通式(1)的底物的基团R1和/或R2还可选自环烷基，其包含具有环形碳骨架的化合物，尤其是具有3至10个碳原子的环形碳骨架的化合物，即环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基。还包括的是环烷基的单或多不饱和类似物，诸如环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基以及环庚二烯基。环烷基或它们的但或多不饱和类似物可在一个或多个位置上被取代。根据通式(1)的底物的基团R1和/或R2还可选自单或多环芳基，其可在一个或多个位置上被取代。芳基的实例是单或多环(尤其是二环)芳香基团、尤其是苯基或通过任何环碳原子键合的萘基，例如1-萘基和2-萘基。
根据通式(1)的底物的基团R1和/或R2还可选自单或多环杂芳基，其可在一个或多个位置上被取代。杂芳基例如可衍生自吡咯烷、四氢呋喃、四氢噻吩、哌啶、四氢吡喃、四氢噻喃、吡啶、吗啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、
Figure BDA00001633830200121
唑、噻唑、吡喃、嘧啶、哒嗪和吡嗪。二环基团的实例是前述芳基或杂芳基、或它们各自的衍生物与其它芳基、杂芳基或它们各自的衍生物的缩合物，诸如衍生自cumarole、吲哚、喹啉、嘌呤和萘的基团。单或多环杂芳基可在一个或多个位置上被取代，并且可通过任何环原子、优选通过环碳原子与通式(1)中的相应碳原子连接。合适基团的实例包括2-噻吩基、3-噻吩基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、4-甲基-2-噻吩基、3-乙基-2-噻吩基、2-甲基-3-噻吩基、4-丙基-3-噻吩基、5-正丁基-2-噻吩基、4-甲基-3-噻吩基、3-甲基-2-噻吩基、3-氯-2-噻吩基、4-溴-3-噻吩基、2-碘-3-噻吩基、5-碘-3-噻吩基、4-氟-2-噻吩基、2-溴-3-噻吩基以及4-氯-2-噻吩基。
根据通式(1)的底物的基团R1和/或R2还可选自直链或支链烷氧基，其任选地可在一个或多个位置上被取代。在这一情况下，通式(1)的化合物通过氧原子与根据前述定义的任一基团(例如直链或支链的、任选取代的低级烷基；直链或支链的、任选取代的低级烯基；任选取代的环烷基；单或多环的、任选取代的芳基(其也称为芳氧基)；单或多环的、或任选取代的杂芳基)连接。烷氧基的实例是甲氧基(-O-CH3)、乙氧基(-O-C2H5)、以及通式-O-CnH2n+1的基团，其中n优选是1至10的整数。
根据通式(1)的底物的基团R1和/或R2还可选自氨基、和直链或支链烷基氨基，其任选地可在一个或多个位置上被取代。在这一情况下，通式(1)化合物通过氮原子连接，所述氮原子本身与两个氢原子连接(伯胺、氨基)、与一个氢原子和一个有机基团相连(仲胺、-NHR1)、或与两个有机基团相连(叔胺、-NR1R2)，其中彼此相互独立的有机基团R1和R2可选自根据前述定义的以下任何基团：直链或支链的、任选取代的低级烷基；直链或支链的、任选取代的低级烯基；任选取代的环烷基；单或多环的、任选取代的芳基；单或多环的、或任选取代的杂芳基。氨基的实例是伯氨基(-NH2)。仲氨基的实例是甲基氨基(-NH-CH3)、乙基氨基(-NH-C2H5)、以及通式-NH-CnH2n+1的基团，其中n优选是1至10的整数。叔氨基的实例是二甲基氨基(-N(CH3)2)、二乙基氨基(-N(CH2CH3)2)、二丙基氨基(-N(CH2CH2CH3)2)、二丁基氨基(-N(CH2CH2CH2CH3)2)、甲基乙基氨基、甲基丙基氨基等。
根据通式(1)的底物的基团R1和/或R2还可选自直链或支链的烷硫基，其任选地可在一个或多个位置上被取代。在这一情况下，通式(1)的化合物通过硫原子与根据前述定义的任一基团(例如直链或支链的、任选取代的低级烷基；直链或支链的、任选取代的低级烯基；任选取代的环烷基；单或多环的、任选取代的芳基(其也可称为芳硫基)；单或多环的、或任选取代的杂芳基)连接。烷硫基的实例是甲硫基(-S-CH3)、乙硫基(-S-C2H5)、以及通式-S-CnH2n+1的基团，其中n优选是1至10的整数。
根据通式(1)的底物的基团R1和/或R2还可选自直链或支链的酰基，其任选地可在一个或多个位置上被取代。酰基具有通式-C-C(O)-R，其中R可以是如本文定义的任何烷基、芳基或杂芳基。当R是氢或OH时，-C(O)-R分别是醛基或羧基。
前述基团可任选地在一个或多个位置上被取代。碳原子上的氢原子例如可彼此独立地被以下化合物或基团取代：其它碳化合物，诸如直链或支链的低级烷基或烯基，环烷基，芳基或杂芳基，卤素诸如氟、氯、溴和碘，或者杂原子或含有杂原子的化合物。含有杂原子的化合物的实例是-OH、-SH、-NO2、-NO3、-NH2、-SO3、-SO4基团、烷氧基和NR3R4，其中R3和R4彼此独立地表示H、甲基或乙基。
在本发明方法的特别的实施方案中，R2是H。在另一优选的实施方案中，R2是H，且R1是伴随地选自H、甲基、任选取代的芳基，尤其是任选取代的单环芳基。优选的实例是苯基、单或多取代的苯基，其中所述取代基彼此独立地可选自例如卤素、甲基、乙基、-OH、-NH2、-NO2和-SO3H。取代的苯基例如可以是2-F-C6H4、3-F-C6H4、4-F-C6H4、2-Cl-C6H4、3-Cl-C6H4、4-Cl-C6H4、2，3-F-C6H3、2，4-F-C6H3、2，5-F-C6H3、2，3-Cl-C6H3、2，4-Cl-C6H3、2，5-Cl-C6H3等。
在其它特别的实施方案中，R2是H，且R1选自H、-CH3、-CH2CH2CH2NH-C(NH)NH2、-CH2CONH2、-CH2COOH、-CH2SH、-CH2CH2CONH2、-CH2CH2COOH、其中C3H3N2表示咪唑基团的-CH2(C3H3N2)、-CH(CH3)CH2CH3、-CH2CH(CH3)2、-CH2CH2CH2CH2NH2、-CH2CH2SCH3、-CH2(C6H5)、-CH2OH、-CH(OH)CH3、其中C8H6N表示吲哚基的-CH2(C8H6N)、-CH2(C6H4)OH、-CH(CH3)2、-CH2-SeH、-CH2-CH2-SeCH3(硒代甲硫氨酸(Selenomethionin))、-(C6H5)、对-F-C6H4以及对-Cl-C6H4。
C.方法条件
在生产β-氨基酸前体的方法期间所存在的选自乙内酰脲酶和二氢嘧啶酶的至少一种酶可存在于天然或重组产生该酶的活细胞中、收获的细胞中、死细胞中、透化的细胞中、粗细胞提取物中、纯化的提取物中，或以基本上纯或完全纯的形式存在。所述至少一种酶可存在于溶液中，或可以是固定在载体上的酶。一种或多种酶可同时以溶解和固定化的形式存在。
根据本发明的方法可在常规反应器中进行，所述反应器是本领域公知的，并可以以不同规模例如从实验室规模(数毫升至数十升的反应体积)至工业规模(数升至数千立方米的反应体积)进行。如果乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶以被无活性、任选透化的细胞包被的形式、以高度或低度纯化的细胞提取物形式或以纯化形式使用时，可使用化学反应器。该化学反应器通常允许控制所述至少一种酶的量、至少一种底物的量、pH、温度和反应介质的循环。当所述至少一种酶存在于活细胞中时，所述方法将为发酵。在这一情况下，生物催化生产将在生物反应器(发酵器)中进行，在所述生物反应器中可控制对活细胞的适当生存条件所需的参数(例如，具有营养物的培养基、温度、通气、存在或不存在氧或其它气体、抗生素等)。本领域技术人员熟知化学反应器或生物反应器，例如，熟知将化学或生物技术方法从实验室规模升级至工业规模的步骤、或优化方法参数的步骤，这也己广泛地描述在文献中(对于生物技术方法，例如参见：Crueger und Crueger，Biotechnologie-Lehrbuch der angewandten Mikrobiologie，2.Ed.，R.Oldenbourg Verlag，München，Wien，1984)。
含有至少一种乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶的细胞可通过物理或机械方法诸如超声或射频脉冲、弗氏细胞压碎(French presses)透化，或通过化学方法诸如低渗介质、分解酶和存在于培养基中的去污剂透化，或通过此类方法的组合透化。去污剂的实例是毛地黄皂苷、正十二烷基麦芽糖苷、辛基糖苷、
Figure BDA00001633830200151
X-100、
Figure BDA00001633830200152
20、脱氧胆酸盐、CHAPS(3-[(3-胆酰氨基丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)、
Figure BDA00001633830200153
P40(乙基苯酚聚(乙二醇醚)等。若所述至少一种酶是固定化的，则其与惰性载体相连。合适的载体材料是本领域公知的，并且例如公开于EP-A-1149849、EP-A-1069183和DE-OS 100193773，以及本文引用的参考文献中(这些所有的文献均就载体材料而言被特别地包括在本文中)。合适载体材料的实例是粘土、粘土矿物诸如高岭石、硅藻土(diatomeceous erth)、珍珠岩、硅石、矾土、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉、阴离子交换材料、合成的聚合物，诸如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚醛树脂、聚氨基甲酸酯，以及聚烯烃诸如聚乙烯和聚丙烯。对于制备载体连接的酶，所述载体材料通常以精细粉末的形式使用，其中多孔形式是优选的。载体材料的粒径通常不超过5mm、尤其2mm。在所述至少一种酶以全细胞制备物存在时，所述全细胞制备物可作为游离或固定化形式存在。合适的载体材料例如是藻酸钙或角叉菜胶。酶以及细胞可通过戊二醛直接连接。许多固定方法是本领域公知的(例如，J.Lalonde和A.Margolin，“Immobilization of Enzymes”，在K.Drauz und H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，Vol.III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中)
D.酶
在生物催化生产β-氨基酸前体、尤其是生物催化对映选择性生产β-氨基酸前体的方法中使用的至少一种酶选自乙内酰脲酶和二氢嘧啶酶，优选可从赤豆获得的任何乙内酰脲酶或任何二氢嘧啶酶。在生物催化生产β-氨基酸前体的过程中，可存在一种或多种乙内酰脲酶、一种或多种二氢嘧啶酶、或其任意组合。优选地，存在至少一种乙内酰脲酶。所述至少一种酶优选地是对映选择性的酶，优选D-二氢嘧啶酶和/或D-乙内酰脲酶。特别地，所述酶是D-乙内酰脲酶。所述至少一种酶优选能够通过水解(±)-6-单取代的二氢尿嘧啶从而产生相应的(S)-N-氨基甲酰基-β-氨基酸，例如从(±)-6-苯基二氢尿嘧啶产生(S)-N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸。
如果所述至少一种酶需要纯化，则可使用本领域技术人员公知的常规方法。破坏细胞后，可通过离心或过滤获得粗提取物，尤其是用于从细胞碎片、膜片段或细胞残骸中分离蛋白质。另外的或备选的纯化步骤包括凝胶过滤、离子交换色谱法(例如，采用Q-Sepharose)、疏水色谱法、反相色谱法、超滤、结晶、盐析、渗析、非变性凝胶电泳、免疫沉淀、亲和色谱法等等。适当的方法例如描述于Cooper，F.G.，BiochemischeArbeitsmethoden，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York，或Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin。根据优选的实施方案，所述至少一种酶以至少部分纯化的形式或基本上纯化的形式存在。在本发明的上下文中，如果作为酶来源使用的细胞或生物体中通常存在的其它蛋白质不能在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)后通过考马斯染色清晰地检测到，但在银染色后依然能在SDSPAGE凝胶上分辨出条带时，所述酶是基本上纯的形式。如果在SDS PAGE及随后的银染色后，不能或仅微弱地分辨出其它蛋白质的条带，则酶以完全纯的形式存在。乙内酰脲酶的分离已在文献中得以描述(例如，Morin，Enzyme Microb.Technol.15：208-214，1993；Fan和Lee，BiochemicalEngineering J.8：157-164，2001)。优选的提取方法包括至少三个、尤其是至少四个、至少五个、或所有以下步骤，优选以以下顺序进行：
a)离子交换色谱(例如应用Q-Sepharose FF-色谱柱)
b)疏水色谱(例如，应用苯基琼脂糖柱)
c)凝胶过滤(例如应用Superdex Prep Grade 200凝胶过滤柱)
d)亲和色谱(例如应用Blue HiTrap 5ml亲和色谱柱)
e)阴离子交换色谱(例如应用Mono Q HR 5/5阴离子交换柱)，以及
f)凝胶过滤(例如应用Superose 6制备级凝胶过滤柱)
至少一种乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶的合适来源是微生物和高等生物体，诸如细菌和古细菌(archeabacteria)、酵母、真菌、植物和动物、真菌、酵母、细菌和古细菌(archaebaceria)。细菌的实例是食酸菌属(Acidovorax)(例如，燕麦食酸菌(A.avenae))；土壤杆菌属(Agrobacterium)(例如，放射形土壤杆菌(A.radiobacter)、根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)、A.sp IP I-671、根癌土壤杆菌RU-OR以及根癌土壤杆菌NRRL B 11291)；节杆菌属(Arthrobacter)(例如，成晶节杆菌(A.crystallopoietes)AM2)、橙单胞菌属(Aurantimonas)(例如，A.sp.SI85-9A1)；布鲁氏菌属(Brucella)(例如，犬布鲁氏杆菌(B.canis)、B.ceti，绵羊布鲁氏杆菌(B.ovis)、B.pinnipedialis、猪布鲁氏杆菌(B.suis))；伯克霍尔德氏菌属(Burckholderia)(例如，B.sp.H160、B.phymatum、B.phytofirmans)；Dickeya(例如，D.dadantii)；Jannaschia(例如，J.sp.CCS1)；中间根瘤菌属(Mesorhizobium)(例如，M.loti)；Oceanicola(例如，O.batsensis)；苍白杆菌属(Ochrobactrum)(例如，O.intermedium、O.sp.G21，人苍白杆菌(O.anthropi))；Polaromonas(例如，P.naphthalenivorans)；Reinekea(例如，R.sp.MED297)；根瘤菌属(Rhizobium)(例如，豌豆根瘤菌(R.leguminosarum))；Verminephrobacter(例如，V.eiseniae)；红细菌属(Rhodobacter)(例如，类球红细菌(R.sphaeroides))；弧菌属(Vibrio)(例如，霍乱弧菌(V.cholerae))；Fulvimarina(例如，F.pelagi)。简单后生动物的实例是丝盘虫(Trichoplax adherens)，以及低等和高等植物的实例是拟南芥属(Arabidopsis)(例如，拟南芥(A.thaliana))；短根瘤菌属(Bradyrhizobium)(例如，B.sp.ORS278；慢生型大豆根瘤菌(B.japonicum)、B.sp.BTAi1)；衣藻属(Chlamydomonas)(例如，莱菌衣藻(C.reinhardtii))；大豆属(Glycine)(大豆(Glycine max))；苜蓿属(Medicago)(M.trunculata)；稻属(Oryza)(例如，稻(O.sativa))；立碗藓属(Physcomitrella)(例如，小立碗藓(P.patens))；云杉属(Picea)(例如，北美云杉(P.sitchensis))；杨属(Populus)(例如，毛果杨(P.trichocarpa))；蓖麻属(Ricinus)(例如，蓖麻(R.communis))；高粱属(Sorghum)(例如，高粱(S.bicolor))；葡萄属(Vitis)(例如，葡萄(V.vinifera))；玉蜀黍属(Zea)(例如，玉米(Zea mays))。动物的实例是原鸡属(Gallus)(例如，原鸡(G.gallus))；智人(Homo sapiens)；猕猴属(Macaca)(例如，猕猴(M.mulatta))；黑猩猩属(Pan)(例如，黑猩猩(P.troglodytes))以及非洲爪蟾属(Xenopus)(例如，有爪蟾蜍(X.laevis)、非洲爪蟾(X.tropicalis))。
所述至少一种乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶的尤其优选的来源是豇豆(Vigna)属(尤其是赤豆)、土壤杆菌属、节杆菌属和假单胞菌属(尤其是根据当前分类法的Burckholderia)。来自赤豆的乙内酰脲酶可从Sigma-Aldrich(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO，USA)商购得到。
尤其优选是乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶，其包含至少一个与以下部分序列至少之一具有60-100％同一性的部分序列：
Figure BDA00001633830200191
与SEQ ID NO：1-5或7任一个的同一性程度可以是至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％或至少90％。特别是，与SEQ ID NO：1-5或7任一个的同一性程度可以是至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％。特别是，SEQ ID NO：1-5或7任一个可与包含在乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶中的序列同一(100％同一性)。任何给定蛋白的乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶特征可通过本说明书描述的乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶测试法容易地测定。
除了存在于生物体或微生物或其提取物中的乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶之外，或作为其替代，可使用这些乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶的功能等价物。
功能等价物是突变体，其在至少一个位置上与天然氨基酸序列不同，但仍然保持乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶的至少部分酶活性。功能等价物可包含一个或多个、例如1-20、1-15或1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸添加、替换、删除和/或颠换，其可发生在任何序列位置，只要它们不会完全破坏催化活性。功能等价物还可以是具有改变的底物和/或产物转化速度、改变的底物和/或产物亲和力、和/或改变的特定底物选择性的酶(例如，接受具有更大的或更疏水的基团R1和/或R2的底物的功能等价物)。具有至少部分保持酶活性的高可能性的取代的非限制性实例如下所列：
Figure BDA00001633830200201
功能等价物还包括成熟乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶蛋白的前体，及其盐。盐包括羧基的盐和氨基的酸加成盐。羧基的盐可根据本领域公知的方法制得，并且包括无机盐，诸如钠、钙、氨、铁和锌盐，以及与有机碱诸如胺(例如三乙醇胺)、精氨酸、赖氨酸、哌啶等形成的盐。酸加成盐包括与矿物酸诸如盐酸或硫酸形成的盐，以及与有机酸诸如乙酸和草酸形成的盐。
功能等价物还可通过在一个或多个氨基酸侧链或N-或C-端修饰天然存在的乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶而得到。此类衍生物例如可包括羧基的脂肪族酯、可通过与氨或伯胺或仲胺反应而得到的羧基的酰胺、可通过与酰基反应而得到的游离胺基团的N-酰基衍生物、或可通过与酰基反应而得到的游离羟基的O-酰基衍生物。还包括在内的是通过与天然模式不同的糖基化模式能够得到的功能等价物(例如，人工糖基化或脱糖基化后)。
功能等价物还包括从其它生物体或微生物获得的酶，以及所述酶的天然存在的变体。
功能等价物还包括具有乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶的期望活性的单结构域或序列基序。
此外，功能等价物还可以是融合蛋白，其包含天然存在的序列或其功能等价物以及在N-端或C-端连接(linkage)的至少一种功能上不同的序列，其不会破坏所述蛋白的乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶活性。此类功能上不同的序列的非限制性实例是信号肽(例如，引导所述融合蛋白分泌的)、酶(例如，用于添加其它的酶活性的)或免疫球蛋白的部分(例如，用于固定所述融合蛋白的)。
功能等价物还包括天然存在的蛋白的同源物。与天然存在的氨基酸序列相比，所述同源物具有至少60％的同源性，优选至少75％，以及尤其是至少85％，诸如90％、95％或99％的同源性(如通过Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad，Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448的算法计算)。给定多肽的“％同源性”尤其是指相对于所提及的酶或酶亚基总长而言的氨基酸残基的同一性百分比。
功能等价物还可通过本领域公知的方法制得。用于修饰基因并由此修饰由这些基因编码的蛋白的方法很早即是已知的，诸如其中特异性地改变基因的一个或多个核苷酸的定向诱变(Trower MK(Hrsg.)1996；In vitromutagenesis protocols.Humana Press，New Jersey)，允许在基因的任何位置改变或添加任何氨基酸的密码子的饱和诱变(Kegler-Ebo DM，DocktorCM，DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res 22：1593；Barettino D，FeigenbutzM，Valcárel R，Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22：541；Barik S(1995)Mol Biotechnol 3：1)，其中核苷酸序列被不能无错工作的DNA聚合酶突变的错误倾向聚合酶链式反应(错误倾向PCR)(Eckert KA，KunkelTA(1990)Nucleic Acids Res 18：3739)；在诱变菌株中基因传代，其中观察到升高的突变率，例如由于DNA修复机制的缺陷而导致(Greener A，Callahan M，Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesis techniqueusing an E.coli mutator strain.在Trower MK(Hrsg.)In vitro mutagenesisprotocols.Humana Press，New Jersey中)；或DNA改组(DNA shuffling)，其中首先形成近相关基因库并消化，随后将所述获得的片段用作聚合酶链式反应的模板，其中通过重复的链分离和退火而得到全长嵌合基因(Stemmer WPC(1994)Nature 370：389；Stemmer WPC(1994)Proc NatlAcad Sci USA 91：10747)。
取决于所使用的方法，本领域技术人员可将纯随机的或更定向的突变引入到基因或非编码区(其可能与表达调控相关)中，并随后产生基因库。所需的方法是本领域技术人员公知的，并且例如描述于Sambrook undRussell，分子克隆(Molecular Cloning)，第3版，Cold Spring HarborLaboratory Press 2001。
当应用所谓的“定向进化”(尤其是如在以下文献中描述的：Reetz MT和Jaeger K-E(1999)，Topics Curr Chem 200：31；Zhao H，Moore JC，Volkov AA，Arnold FH(1999)，Methods for optimizing industrial enzymesby directed evolution，Demain AL，Davies JE(Hrsg.)Manual of industrialmicrobiology and biotechnology.American Society for Microbiology)时，可以以定向(与纯随机相反)方法以及大规模地产生功能等价物。在第一个步骤中，例如通过应用前述方法，产生相应蛋白(诸如内酰脲和/或二氢嘧啶酶)的基因库。以合适的方式例如通过细菌或噬菌体展示系统表达所述基因库。此外，通过选择合适的表达载体从而控制蛋白质在宿主中的定位的方法是本领域公知的。蛋白质可细胞内定位于细胞质中、通过添加膜锚定子而定位在膜中、或通过添加含有信号肽酶识别序列的信号肽而细胞外定位。在随后的第二步骤中，选择或筛选表达具有期望特征的蛋白的克隆。如果使用选择方法，则表达具有期望特征的蛋白的克隆将存活，因为这些蛋白将促进或确保宿主细胞的存活(例如，允许应用特定底物或在特定温度下生长的酶)。如果使用筛选方法，则所有克隆将存活。应用适当的测试法对表达具有期望特征的蛋白的克隆进行鉴定，所述方法可由本领域技术人员容易地设计出来。例如，当筛查具有特定结合特征的蛋白质时，可筛选与用于期望结合能力的底物包被的表面的结合来筛选宿主细胞。表达此蛋白的宿主细胞可通过所表达的蛋白与所述底物结合，然而表达非功能性蛋白的宿主细胞则不能。当筛选具有特定催化特征的功能等价物时，可在含底物的培养基中或在含底物的琼脂板上培养宿主细胞。功能等价物的存在例如可通过由所述功能等价物修饰所述底物之后的颜色变化而指示(如果需要的话，则在裂解宿主细胞之后，以便于使得所述功能等价物与含底物的培养基接触)。乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶的功能等价物可通过含有具感兴趣的取代的二氢尿嘧啶的培养基来筛选。
在上下文中，可使用自动系统(例如，用于微量滴定板的移液机器人、筛选机器人、用于鉴定琼脂板上的克隆的图像处理系统)，以允许高通量筛选。对表达功能等价物(其具有极大地或至少部分地相应于期望特征的特征)的宿主细胞的各基因进行一轮或多轮突变。可以以交互的方法重复突变和选择或筛选的步骤，直到功能等价物具有满意程度的期望特征。
通过应用迭代方法，可能以定向方式筛选具有期望特征的蛋白，尽管通过插入多个突变至蛋白序列中，更可能是丧失功能，而不是改进特定特征(诸如酶的转化率)或获得新特征(诸如接受新底物类型)。当实施迭代方法时，基于参考蛋白、诸如野生蛋白(例如，特定的乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶)的核苷酸序列产生具有突变的基因文库。在这一上下文中，所选择的核苷酸水平上的突变率将导致在相应翻译的肽或蛋白质中相对低数量的氨基酸突变，例如1至3个氨基酸。随后针对期望特征(例如，对于一种或多种底物更高的催化活性，扩展的或改变的底物范围，在升高的或改变的温度或pH值、或在特定溶剂存在下升高的稳定性)筛选得到的肽或蛋白质。基于具有此类期望特征(其可能仅以低程度显现)的蛋白质或肽的序列，产生第二基因文库，并且再次引入低的突变率。随后针对期望的特征筛选翻译的蛋白质。产生突变基因文库和筛选在所述文库基础上表达的肽或蛋白的循环可重复认为需要的次数。每一循环选择低突变率将预防这样的情形，即由于积累了太多的突变而导致几乎所有的蛋白均是没有功能的。低突变率(以及伴随的低或缓慢的期望特征显现)可由反复地突变(可能产生功能等价物)和选择(期望的功能等价物)而得到弥补，由此产生有用突变的积累，并且最终提供高比率的具有期望的、改进特征的成功蛋白。通过对具有改进特征的功能等价物的序列分析，可获得序列信息，其确定肽或蛋白中对期望特征重要的序列位置或序列区。产生具有期望特征的蛋白的实例描述于Zhao和Arnold，Protein Engineering 12：47-53(1999)或May等，NatureBiotechnology 18：317-320(2000)中，从该实例中其它引入突变的方法也将是显而易见的。
功能等价物还可通过从上述蛋白之下的核酸序列衍生的核酸序列得到。除非另外指出，衍生自原始核酸的核酸序列是指与所述原始核酸相比具有至少80％或至少90％尤其是约91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核酸序列。100％同一性是指两个核酸序列的核苷酸在核酸序列全长上是同一的，尤其是通过应用Infomax(USA)的Vector NTI Suite 7.1软件和Clustal方法比较两个核酸序列而确定的同一性。
衍生的核酸(单链或双链DNA或RNA序列，诸如cDNA或mRNA)可从核苷酸构建模块通过本领域公知的方法而化学合成，例如通过缩合核苷酸构建模块或寡聚物而合成。例如，可通过亚磷酰胺(phosphoamidite)方法(Voet，Voet，第2版，Wiley Press，New York，p.896-897)进行化学合成。合成的寡核苷酸的退火以及应用DNA聚合酶的Klenow片段填补空缺、连接反应以及一般的克隆方法是本领域公知的，并且例如描述于Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A laboratory manual)，ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989中。
衍生的核酸可在数据库中鉴定，或从基因库或生物体中分离。特别地，可应用相应于SEQ ID NO：1-5或7肽序列的核酸序列作为杂交探针或作为聚合酶链式反应(PCR)的引物而分离衍生的核酸。所述探针或引物通常包含这样的核苷酸序列区，所述核苷酸序列区在严格条件下与可能的衍生核酸序列的正义链或反义链的至少12、优选至少25、诸如约40、约40或约75个连续的核苷酸杂交。可能的衍生核酸序列可能存在于基因库中，靶生物体的细胞材料中，例如细胞(优选透化的细胞)或其提取的细胞成分(优选至少部分纯化的核酸)中，其中所述靶生物体是待检测衍生核酸的存在的生物体。细胞材料可在琼脂糖凝胶上分离，并转移至膜上，用于在标准条件下进行Northern印迹或Southern印迹杂交，以检测与所使用的探针结合的核酸片段的存在，或可备选地作为PCR反应中引物的模板，其中所述探针或引物可衍生自SEQ ID NO：1-5或7的任意肽序列之下的核酸序列。可根据本领域公知的方法(例如，Sambrook等，1989)分离在印迹膜上或凝胶上的杂交核酸条带，或在PCR反应中的杂交模板核酸(其可应用衍生自原始核酸的正向或反向引物、或随机引物扩增)，并将其克隆至合适的载体中，随后测序或用作在甚至更严格条件下的杂交探针，以分离含有来自基因库或细胞材料的较长或优选全长基因的核酸片段。
杂交的标准条件依赖于各核酸而不同，并且通常包括42℃至58℃的温度、在0.1xSSC至5xSSC(其中1xSSC相应于0.15M NaCl、14mM柠檬酸钠，pH 7.2)的水缓冲溶液中，或还存在50％甲酰胺，诸如在含有50％甲酰胺的5xSSC中、42℃。DNA:DNA杂合物的杂交条件优选包括0.1xSSC，以及约20℃至约45℃的温度，尤其是30℃至45℃。DNA:RNA杂合物的杂交条件优选包括0.1xSSC，以及约30℃至约55℃的温度，尤其是45℃至55℃。前述温度是对于在不含甲酰胺的SSC缓冲液中，含约100个核苷酸以及50％G+C含量的核酸杂交的示例性温度。DNA杂交的实验条件以及分子生物学的其它技术在教科书或分子生物学实验手册中得以描述(例如，Sambrook等，1989，Ausubel等(编辑)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York，1985；Hames和Higgins(编辑)，Nucleic Acid Hybridisation：A Practical Approach，IRL Press atOxford University Press，Oxford，1985；Brown(编辑)，Essential MoelcularBiolgoy：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford，1991))，并可通过本领域公知的公式，考虑进诸如核酸长度、杂合物类型以及G+C含量的参数，由本领域技术人员计算得到。例如在Northern印迹中的严格条件的实例包括使用含0.1％SDS的0.1xSSC(20xSSC：3M NaCl，0.3M柠檬酸钠，pH 7.0)，以及50℃至70℃、优选60℃至65℃的温度洗脱非特异性结合的探针或寡核苷酸。严格条件的选择和改变是本领域公知的，并且描述于文献当中(例如，Sambrook等，1989)
可根据本领域已知的方法分离衍生的核酸。分离的核酸分子应当理解为基本上从包含衍生序列的其它核酸分子中分离出来的核酸分子。分离的核酸分子优选基本上没有非核酸细胞材料或培养基，或当通过化学合成生产时，基本上没有化学前体或其它化学物质。
可将衍生的核酸引入表达构建物中，任选在通过限制性酶切割或与连接子连接之后。在所述表达构建物中，衍生的核酸与控制从所述核酸序列中表达相应多肽或蛋白序列的调控元件有效连接，所述核酸序列是有用的乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶的编码序列。表达构建物优选包含在衍生核酸上游的启动子，以及在其下游的终止子序列，以及任选的其它调控元件。有效连接应当理解为启动子、编码序列、终止子和任选的其它调控元件以下述方式相继的排列，所述方式允许前述调控元件的每一个就编码序列的表达而言发挥适当的功能。有效连接的元件的实例包括靶序列、增强子、多腺苷酸信号等。其它有用的元件包括可选择标记、扩增信号、复制起始点等。有用的调控元件是本领域已知的，并且例如描述于Goeddel，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)中。除了人造调控元件或序列之外，或作为其替代，可存在乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶结构基因上游的天然调控序列。可通过遗传修饰将天然调控关闭，或将其调节至更低或更高表达。同样地，还可通过仅保留天然调控元件而不插入人造元件，从而基因构建物还可具有更简单的构造。可以这样的方式突变天然调控元件，即使得不发生调控，并且基因表达更低或优选地升高。在基因构建物中乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶的结构基因可作为单或多拷贝存在，任选地作为混合拷贝存在，即乙内酰脲酶和二氢嘧啶酶同时存在。
有用的启动子的实例是cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-、T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、SP6-、λ-PR-或λ-PL-启动子，其优选在革兰氏阴性细菌中使用；以及启动子amy和SPO2，或酵母启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH。可任选地使用可诱导的启动子，诸如可通过温度或化学化合物诱导的启动子(例如，金属硫蛋白(metallothioenin)启动子)，从而使得在细胞增殖并积累了适当细胞密度后诱导乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶表达。同样地，可使用人工启动子。
优选将重组表达构建物插入适当的载体中，例如质粒中，然后将载体引入适当的宿主细胞中。载体是本领域公知的，并且例如描述于Pouwels等(编辑)，Cloning Vectors，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中。除了质粒之外，载体还可以是本领域已知的所有其它载体，诸如噬菌体，病毒，例如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒，转座子，IS元件，噬粒、粘粒以及直链或环状DNA。载体可以是在宿主中自动复制的，或可以是在整合至染色体后染色体复制的。非融合蛋白表达载体的实例是pTrc(Amann等，(1988)Gene 69：301-315)和pET 11d(Studier等，GeneExpression Technology：Methods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，Kalifornien(1990)60-89)。酵母表达载体，例如在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达的实例是pYepSec1(Baldari等，(1987)Embo J.6：229-234)、pMFa(Kurjan和Herskowitz(1982)Cell 30：933-943)、pJRY88(Schultz等(1987)Gene 54：113-123)以及pYES2(InvitrogenCorporation，San Diego，CA)。在真菌、尤其是丝状真菌中有用的载体和构建载体的方法描述于van den Hondel，C.A.M.J.J.& Punt，P.J.(1991)“Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi，in：Applied Molecular Genetics of Fungi，J.F.Peberdy等，Hrsg.，S.1-28，Cambridge University Press：Cambridge中。用于在昆虫细胞(诸如Sf9细胞)中表达蛋白的杆状病毒载体的实例包括pAc系列(Smith等，(1983)Mol.Cell Biol..3：2156-2165)和pVL系列(Lucklow和Summers(1989)Virology 170：31-39)，哺乳动物细胞载体的实例包括pCDM8(Seed，B.(1987)Nature 329：840)和pMT2PC(Kaufman等(1987)EMBO J.6：187-195)。用于原核和真核细胞中的其它表达系统描述于Sambrook，Fritsch，和Maniatis，分子克隆：实验室手册(Molecular cloning：ALaboratory Manual)，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989的第16和17章中。
应用前述载体，可产生用至少一种这些载体转化的并表达可用于本发明方法的乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶的重组生物体。重组构建物可在引入适当的宿主系统后表达。对于引入，可使用本领域已知的方法，诸如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、化学转化、逆转录病毒转化等。合适的方法例如描述于Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等编辑，Wiley Interscience，New York 1997，oder Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual).2.Aufl.，Cold SpringHarbor Laboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1989。
合适的宿主生物体或宿主细胞是允许表达编码乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶的核酸、或其衍生的核酸的那些。宿主细胞包括细菌、真菌、酵母、植物或动物细胞。细菌的实例是以下那些：埃希氏杆菌属(Escherichia)，wie z.B.大肠杆菌(Escherichia coli)；链霉菌属(Streptomyces)；芽孢杆菌属(Bacillus)；假单胞菌属(Pseudomonas)；或伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)。真核微生物的实例是酿酒酵母、曲霉属(Aspergillus)、来自动物或植物的更高等的真核细胞，例如Sf9-、CHO-或HEK293，其中更高等真核生命形式诸如动物或植物的单细胞或聚集的细胞在本文中也可称为微生物。
成功转化的细胞的选择可基于包含在相应载体或表达盒中的标记基因。标记基因的实例包括抗生素抗性基因，或催化颜色形成反应的酶的基因，所述酶引起转化细胞的染色或荧光。所述细胞可通过自动细胞分选进行选择。携带抗生素抗性基因例如G418或潮霉素的抗性基因的成功转化的细胞可通过含有抗生素的培养基或琼脂板进行选择。在细胞表面表达的标记蛋白可用于通过亲和色谱进行选择。
细胞如上述章节C所描述的那样培养，并且可能分泌乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶至培养基中(由此允许细胞生长或生存，并且同时从至少一种通式(1)的底物生物催化生产β-氨基酸前体)。在乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶不分泌至培养基中时，可在生长和/或诱导乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶表达后，透化细胞，以启动β-氨基酸前体的生物催化生产。备选地，可在生长和诱导乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶表达后收获细胞，用于部分地或完全纯化乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶，由此可将纯化的乙内酰脲酶或二氢嘧啶酶用于β-氨基酸前体的生物催化生产。
E.其它方法步骤
在获得β-氨基酸前体或β-氨基酸的方法期间，一种或多种其它的酶可任选地存在于反应期间。这些酶催化通式(I)的二氢尿嘧啶底物的D-和L-对映体之间的转化。合适的酶的实例包括二氢尿嘧啶脱氢酶(例如，来自哺乳动物来源)、二氢尿嘧啶氧化酶(胶红类酵母菌(Rhodotorula glutinis))以及烯酮(enoate)还原酶(老黄酶)。
通过本发明方法生产的通式(II)的β-氨基酸前体(β-氨基酸氨基甲酰基衍生物)可被裂解为相应的β-氨基酸以及N-氨基甲酰基部分，并且同时保留在反应混合物中。备选地，可从含有通式(I)底物、以及至少一种乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶的反应混合物中分离β-氨基酸前体，并将其裂解产生β-氨基酸。所述裂解可以以化学或酶方法进行。化学裂解可通过在酸性pH(例如1.0)下添加等摩尔量的NaNO2至通式(II)的β-氨基酸前体中而实现(例如如Fan和Lee，Biochemical Engineering Journal 8：157-164，2001描述的)。酸性pH例如可用硫酸实现。所述裂解反应可在低温下进行，例如在冰上进行。如果以化学方法完成通式(II)的β-氨基酸前体的裂解，优选与从通式(I)底物产生所述β-氨基酸前体的酶反应分离地进行这一反应。所述裂解可在酶转化完成或进行至平衡后进行(时间上分离)，或在移除含有β-氨基酸前体的反应介质后在不同的反应容器中进行(空间分离)。作为这一批次方法的替代，可如下进行连续生产：使含有通式(I)底物分子的反应介质与固定化的酶(乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶)接触，所述固定化的酶由此保持在反应容器中，而可分离耗尽了底物的反应介质，用于裂解β-氨基酸前体，并同时以新鲜反应介质替换。可通过诸如氨甲酰水解酶(例如E.C.3.5.1.77或E.C.3.5.1.87)或β-脲基丙酸酶(例如E.C.3.5.1.6)的酶进行酶裂解。所述酶可从供应商处获得(例如，Jülich Chiral Solutions，Jülich，Germany的氨甲酰水解酶)
F.pH值和缓冲系统
根据本发明的将通式(1)的底物转化为通式(2)的β-氨基酸前体的方法优选在约7.0至11.0、优选约7.5至10.0的pH下进行。特别是，所述pH范围是7.5至8.5，更特别是约7.5至8.0。尤其优选的pH值是约7.5、7.6、7.7、7.8、7.9和8.0。
可使用适于前述pH值或pH范围的任何缓冲剂，例如磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液和Tris缓冲液。在7.5至9.0的pH范围内，Tris缓冲液是优选的，而磷酸盐缓冲液在6.0至8.0的pH范围内有用。尤其优选的是Tris缓冲的反应溶液。可根据所使用的底物浓度确定缓冲液浓度，并且优选在1mM至200mM的范围内，例如1mM至100mM、1mM至50mM。特别是，缓冲液浓度可以是2mM至25mM或3mM至10mM，诸如5mM。
G.反应温度和持续时间
生物催化通式(I)的底物转化的方法可在所使用的乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶耐受的任何温度下进行。所述温度通常与拥有所述酶或用作它们提取来源的生物体或微生物的最佳生长温度相关，但可由本领域技术人员容易地确定。一般地，所述方法可在30℃至60℃的温度下、尤其是在40℃至50℃的温度下进行。反应温度的实例是约30℃、约35℃、约37℃、约40℃、约45℃、约50℃、约55℃和约60℃。
可一直进行所述方法直到达到通式(I)的底物和通式(2)的β-氨基酸前体之间的平衡，但可更早地停止。通常的处理时间是1分钟至25小时，尤其是10分钟至6小时。优选的反应时间是1小时至4小时，尤其是1.5小时至3.5小时。
H.反应介质中的其它成分
为增加具有实质上疏水的R1和/或R2的底物的溶解性，可在反应介质中包括一种或多种有机共溶剂。
或者，可在包含水相和非水相的双相系统中进行所述反应。用于非水相的合适溶剂的实例是脂肪族烃，优选包含5至8个碳原子的，诸如戊烷、环戊烷、己烷、环己烷、庚烷、辛烷或环辛烷；卤化的脂肪族烃，优选包含1至2个碳原子的，诸如二氯甲烷、氯仿、四氯甲烷、二氯乙烷；芳香烃，诸如苯、甲苯、二甲苯、氯苯或二氯苯；脂肪族非环状或环状的醚，优选包含4至8个碳原子的，诸如二乙醚、甲基叔丁基醚、乙基叔丁醚、二丙醚、二异丙醚、四氢呋喃；或酯，诸如乙酸乙酯或乙酸正丁酯；或酮，诸如甲基异丁酮或二
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烷；或其混合物。
在特别的实施方案中，所述反应介质是含有有机共溶剂的水性反应介质，尤其是作为单相系统。合适共溶剂的实例是丁-2-醇、甲基叔丁基醚(MTBE)和二甲亚砜(DMSO)。如果使用MTBE，则低于水性介质中饱和(约12vol.-％)的浓度是优选的，例如约6％、约5％、约4％、约3％、约2％、约1％或低于1％。MTBE可在高达水性介质中的饱和浓度使用(约6vol.-％)，而DSMO可在高达约2vol.-％的浓度使用，用于提高底物的溶解度而基本上不干扰所述方法的产率。
I.N-氨基甲酰基β-氨基酸或β-氨基酸的回收
从反应介质中分离氨基酸和N-氨基甲酰基氨基酸的方法是本领域已知的，并且包括诸如凝胶过滤、HPLC、反相色谱和离子交换色谱的技术。离子交换色谱，尤其是阴离子交换色谱是优选的方法。合适的离子交换基质包括强阴离子交换剂(例如，基于季铵的Q Sepharose)和弱阴离子交换剂(例如，基于二乙基氨基乙基的DEAE Sepharose)。优选方法的实例是应用DEAE柱的阴离子交换色谱，或用有机溶剂萃取，应用乙酸乙酯萃取底物，随后通过2-丁醇萃取来自生物转化的产物。
本发明将通过以下实施例详细地显示，所述实施例用于阐释本发明，但不意图限制本发明。
实施例
化学实验
应用包被有0.2mm厚硅胶60F254的具有塑料背衬的板(Mackerey-Nagel)进行TLC。应用U.V.光(254nm)或高锰酸盐浸泡使板显影。除非另外指出，化学品购自Sigma-Aldrich、Acros或Fluka。所有试剂均是标准实验室级和无水溶剂，并且除非另外指出，则如提供的那样使用。1H-NMR和13C-NMR在Bruker AC300或AC400波谱仪上记录。使用了以下缩写：δ，化学位移；bs，宽单峰；d，双峰；dd，双二重峰；J，偶合常数；m，多重峰；q，四重峰；qui，五重峰；s，单峰；sep，七重峰。化学位移(δ)以百万分之一(ppm)报告，以及偶合常数(J)以Hz报告。残余质子溶剂DMSO-d6(δH 2.50，qui)用作1H NMR谱中的内标，并且应用具宽带去偶的DMSO-d6(δC 39.5，sep)参考13C NMR位移。
生物转化实验
除非另外指出，所有实验均以5mM规模进行，即在15mL Falcon管中、在5mL tris缓冲液(0.1M pH 7.5)中的6-PDHU(4.75mg)，和1U可商购的来自赤豆的乙内酰脲酶(35mg，获自Sigma，St.Louis，USA)，在热混合仪(Falcon)中以750rpm及50℃的温度温育。
应用“1单位/反应”进行生物转化，其中1单位定义为每分钟催化从乙内酰脲形成1μmol N-氨基甲酰基-甘氨酸的量。
实施例1：水解5-取代的乙内酰脲或6-苯基二氢尿嘧啶的测试法
为确定乙内酰脲酶活性，将D-乙内酰脲酶(10.5mg)加入到溶解于硼酸盐缓冲液(1.5mL，0.1M，pH 9.0)中的5-苯基乙内酰脲(1.32mg)中。在Eppendorf“Themomixer comfort”(40℃，1400rpm)中温育所述生物转化。在给定的时间点，获取混合物的等分试样(100μL)，并通过变性所述酶而终止反应，通过添加TCA(12％w/v，175μL)沉淀可溶解蛋白。离心后，收集上清液，通过HPLC分析，其中使用以下参数：
柱子：Agilent Zorbax XBD-C184.6mmx50mm，3.5μm。
条件：25℃，1ml/min H2O∶乙腈，85∶15(+0.1％TFA)
保留时间：5-苯基乙内酰脲(3.6)、N-氨基甲酰基-α-苯基甘氨酸(2.7)。通过用怀疑具有此类活性的酶替换D-乙内酰脲酶，所述测试法可用于测定所述酶的乙内酰脲酶活性。
为测定二氢嘧啶酶活性，将D-乙内酰脲酶(10.5mg)加入到溶解于Tris缓冲液(300μL，0.1M，pH 7.5)中的6-苯基二氢尿嘧啶(1.14mg)中。在Eppendorf“Themomixer comfort”(40℃，1400rpm)中温育所述生物转化。在给定的时间点，获取混合物的等分试样(100μL)，并通过变性所述酶(95℃，5分钟)而终止反应，通过添加甲醇(300μL)沉淀可溶解蛋白。离心后，收集上清液，通过HPLC分析，其中使用以下参数：
c-18rpHPLC：等度流动相，25℃，H2O∶ACN，90∶10+0.1％TFA
保留时间：6-苯基二氢尿嘧啶(12.6)，N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸(NCBPA，4，9.6)TCA(4.3)DMSO(1.6)
Astec Chirobiotic T柱，25cmx4.6mm，5μm：等度流动相，5℃，20mM乙酸铵(pH 6.5)∶MeOH，70∶30
保留时间：6PDHU(15.9，27.5)，NCBPA(7.8，6.8)
实施例2：从赤豆分离乙内酰脲酶
如下从赤豆中分离具有乙内酰脲酶活性的蛋白。
2.1.豆提取
应用常规的混合器将885g赤豆(从保健食品店获得)与干冰一起研磨为两份等分试样。往获得的豆粉中加入4L提取缓冲液(20mM Tris，10mM抗坏血酸，10mM赖氨酸，pH 7.5)中，在4℃搅拌所述混悬液过夜，过滤通过丝网，并离心。获得2500mL具有9.5mg/ml蛋白浓度的粗提取物，并储存于-20℃下，直到进行随后的色谱步骤(应用来自Amersham Pharmacia或GE Healthare的色谱柱)。
2.2.离子交换色谱(Q-Sepharose Fast Flow)
用200mM Tris/HCl(pH 7.5)洗涤Q-Sepharose FF-色谱柱(直径：5cm；长度：21cm)，用运行缓冲液A(20mM Tris/HCl，1mM抗坏血酸，1mM L-赖氨酸＊HCl，pH 7.5)平衡，并上样粗提取物(5g总蛋白)。应从运行缓冲液A至运行缓冲液B(20mM Tris/HCl，750mM NaCl，1mM抗坏血酸，1mM L-赖氨酸＊HCl，pH 7.5)的线性梯度，并收集活性级分(fraction)。
应用Ehrlich试剂，如下测定级分的活性：
将50mL蛋白样品与50μL 5-乙内酰脲(100mM，在100mM硼酸盐缓冲液中，pH 9)在室温下温育10-60分钟(取决于酶含量)。通过添加150μL12％三氯醋酸(TCA)从而完全沉淀样品中存在的蛋白，并通过离心移除。往200μL上清液中加入50μL 4-(二甲基氨基)-苯甲醛(10％，在6M HCl中)，并在450nm光度测定。
2.3.疏水色谱(苯基琼脂糖速流)
使用5cm直径和21cm长的苯基琼脂糖柱。通过添加水将离子交换色谱中收集的活性级分(280ml)稀释至500ml，加入67g(NH4)2SO4以得到25％的饱和度，将得到的混合物施加至柱中。以15mL/min的流速加入运行缓冲液A(20mM Tris，用(NH4)2SO425％饱和，1mM赖氨酸，1mM抗坏血酸，pH 7.5；也用作洗涤缓冲液)。通过添加两个柱体积的运行缓冲液B(20mM Tris，1mM赖氨酸，1mM抗坏血酸，pH 7.5)将柱介质线性地改变为运行缓冲液B，然后添加两个柱体积的运行缓冲液B用于洗脱。对于随后的冲洗，使用缓冲液C(10mM Tris/HCl，pH 7.5，10％2-丙醇)。收集具有最高吸收的活性级分，其中所述吸收通过应用Ehrlich试剂的乙内酰脲酶测试法测定。
2.4.分子筛色谱(Superdex Prep Grade 200凝胶过滤)
对于接下来的纯化步骤，以4ml/min的流速操作Superdex 200柱(直径：2.6cm，长度：60cm)。向从疏水色谱中获得的收集的活性级分中加入70.2g(NH4)2SO4，得到80％的饱和度，离心(20min，12.000rpm)得到的混合物，得到沉淀。将得到的沉淀溶解于10mL等度运行缓冲液(20mMTris/HCl，pH 7.5)，施加至柱上。
2.5.Blue HiTrap 5mL亲和色谱
用缓冲液A(20mM Tris/HCl，pH 7.5)平衡Blue HiTrap 5mL亲和色谱柱。将来自分子筛色谱的收集的活性级分(通过应用Ehrlich试剂的乙内酰脲酶测试法所测定[请确认])上样，用5个柱体积的缓冲液B(20mMTris/HCl，500mM NaCl，pH 7.5)以及随后用2个柱体积的缓冲液C(20mMTris/HCl，pH 7.5，500mM NaCl，1mM NAD，1mM NADP)等度地操作所述柱。这一亲和色谱步骤通过使其结合至柱上而移除葡萄糖脱氢酶(对于葡萄糖和NAD/NADP不显示活性)。
2.6.阴离子交换色谱(Mono Q HR 5/5)
以1mL/分钟的流速将来自之前亲和色谱的流出液上样至Mono Q柱(直径：0.5cm)。施加从运行缓冲液A(20mM Tris/HCl，pH 7.5)至运行缓冲液B(20mM Tris/HCl，750mM NaCl，pH 7.5)的线性梯度。基于它们各自的活性和在蛋白质凝胶上条带的存在收集级分。
2.7.Superose 6制备级(prep grade)125ml凝胶过滤
将来自前述阴离子交换色谱的收集的活性级分浓缩至1ml的体积(应用10kD分子量截断值的centriprep装置)，并以1mL/min的流速上样至Superose柱上。将20mM Tris/HCl(pH 7.5)用作运行缓冲液。
将来自上述各纯化步骤的等分试样上样至凝胶上，并进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS PAGE)。用考马斯蓝染色得到的凝胶，并显示于图1中，其中从左至右的泳道对应于：
1)分子量标准品(来自BioRad的Precision Plus蛋白质标记，分别相应于10、15、20、25、37、50、75、100、150和250kD)
2)纯化之前的无细胞提取物
3)Q-Sepharose FF阴离子交换级分
4)苯基琼脂糖FF HIC级分
5)Superdex Prep Grade 200凝胶过滤级分
6)Blue HiTrap 5ml亲和色谱级分
7)Mono Q HR 5/5阴离子交换级分
8)Superose 6制备级125ml凝胶过滤级分
9)分子量标准品(如泳道1中的)
10)独立制备物(相应于Mono Q HR阴离子交换级分)
获得具有约55kD分子量的部分纯化的蛋白质(图1上面的箭头指示的)。约35kD的第二种蛋白质(图1下面的箭头指示的)是葡萄糖脱氢酶。
用氯仿/甲醇沉淀来自Superose 6制备级凝胶过滤的收集的级分，向沉淀加入500μL甲酸(70％)。加入1-2BrCN结晶，以实现溴化氰(bromo cyan)裂解。牛血清白蛋白(BSA，2mg/ml)溶液用作裂解对照。在室温下将两种溶液温育2-3小时后，通过氮气流移除甲酸和溴化氰。将残余物溶解于含有1％巯基乙醇的麦黄酮凝胶样品缓冲液中，并在95℃温育5分钟。将获得的样品上样至麦黄酮凝胶(10-20％梯度)上，并印迹至PVDF膜上。通过染色鉴定印迹上的肽片段，并进行N端测序。
鉴定了以下可能的肽序列：
Figure BDA00001633830200361
得到的部分序列与来自大豆(Glycine max)、Genbank登录号为ACU20291(SEQ ID NO：6)、称为D-乙内酰脲酶的序列具有高度同源性，由此确认了所分离的蛋白的乙内酰脲酶性质。SEQ ID NO：6如下所示，同源的区域用下划线显示：
mqfsitsqflhifsltifiiitsslsqssqfcdagteipsskllikggtvvnaqhhqiadvyvedgiivavnpnimvgddvtvidatgkyvmpggidphthldmdvgftatvddffsgqaaalaggttmhidfviplngsltagfedyekkakkscmdygfhmvitkwdetvsremelmvkekginsfkffmaykgilmindelllegfkkckslgavamvhaengdavyegqrkmielgitgpeghalsr pavlegeatarairladfvntplyvvhvmsidameeiakarkagqrvigepiasglaldeswlwhpdfeiaakyvmsppirkrghdkalqaalstgvlqlvgtdhcafnstqkargiddfrkmpngvngieermhlvwdimvesgqisvtdyvritstecakifniyprkgavlpgsdadiiilnpnssfemsakshhsrldtnvyegrrgkgkievtiaggrvvwennelkvtpgtgryiqmppfsylfdgldkkdaiylnslqapvkrakas
实施例3：可商购的乙内酰脲酶和分离的乙内酰脲酶之间的活性比较
比较了从Sigma获得的乙内酰脲酶和实施例2中分离的乙内酰脲酶的活性。
为确定和比较Sigma酶和纯化的乙内酰脲酶(BP)的比活性，将分别在50mM Tris HCl pH 7.5中的5mM乙内酰脲、5-苯基乙内酰脲或6-苯基二氢尿嘧啶与不同量的酶在40℃温育30分钟。
通过添加浓HCl终止反应，然后通过HPLC测量。
下表1显示了Sigma酶和实施例2中分离的酶的比活性。两种酶均显示出针对5-苯基乙内酰脲的最高活性，其后为乙内酰脲。
表1：
  底物  来自Sigma的酶  来自实施例2的酶
  乙内酰脲  217  425
  5-苯基乙内酰脲  261  557
  6-苯基二氢尿嘧啶  6  72
实施例4：外消旋6-取代的二氢尿嘧啶的合成(一般流程)
通过两种备选途径(图2)之一制备所需的6-取代的二氢尿嘧啶底物4a-i。在方法A(Cabaleiro，M.C.，Journal of Chemical Research 7：318-320，2000)中，在190℃将尿素与合适的肉桂酸衍生物7一起加热2-4h，随后重结晶产物，以～45％的产率产生4a-i。方法B包括用氰酸钾处理相应的外消旋β-氨基酸，随后加热环化，从而以高产率得到4a-i。已知方法B在无外消旋化的情况下进行，通过应用对映体纯的(S)-6a作为起始原料，其还可用于制备对映体纯的(S)-4a和(S)-5a。
实施例5：外消旋6-取代的二氢尿嘧啶或前体分子的合成(个别的合成)
a)下式(±)-6-苯基二氢尿嘧啶的合成
Figure BDA00001633830200381
将反式肉桂酸(10.00g，67.5mmol)和尿素(20.25g，337.5mmo))的混合物在30分钟期间加热至210℃。这导致形成了均匀的黄色液体。在所述反应进行的每一小时，加入另外的尿素(2.03g，33.8mmol)。搅拌4小时后，加入沸水(80mL)，并使反应混合物在95℃再搅拌1小时。通过热过滤从反应混合物移除残余固体后，通过过滤分离形成的白色沉淀，从而得到白色固体(6.0g，产率＝46％)。Rf 0.3(EtOAc)；δH(400MHz，DMSO-d6)2.61(1H，dd，J＝6.8，16.1，CH2)，2.83(1H，dd，J＝5.8，16.1，CH2)，4.64-4.70(1H，m，CHPh)，7.27-7.41(5H，m，Ph)，8.01(1H，bs，CHNHCO)，10.18(1H，br.s，CONHC O)；δC(100MHz，DEPT，DMSO-d6)38.6(CH2)，50.4(CHPh)，126.4(Ph)，128.0(Ph)，129.0(Ph)，141.5(CPh)，154.2(NHCONH)，170.2(NHCOCH2)；Rt 9.6和14.8分钟(chirobiotic T，醋酸铵缓冲液pH 5.5∶甲醇7∶3，1mL/分钟)。
b)下式的反式肉桂酸甲酯的合成
Figure BDA00001633830200391
向反式肉桂酸(500mg，3.4mmol)的甲醇(5mL)溶液中加入浓硫酸(100μL)。用微波(300W，200℃)辐射10分钟后，在真空中移除溶剂。将白色固体沉淀溶解于乙酸乙酯(10mL)中，用碳酸氢钠(5mL)和盐水(5mL)洗涤有机层两次，然后在真空中移除溶剂，得到白色结晶固体(468mg，86％).δH(400MHz，DMSO-d6)3.73(3H，s，CH3)，6.65(1H，d，J＝16.1，CHCHPh)，7.40-7.46(3H，m，Ph)，7.67(2H，d，J＝16.1，CHCHPh)，7.70-7.76(2H，m，Ph)。
c)下式的氢化肉桂酰氟的合成
Figure BDA00001633830200392
在N2气氛下向搅拌的反式肉桂酸(500mg，3.4mmol)在无水DCM(5ml)中的室温溶液中，加入二甲基氨基三氟化硫(0.31ml，2.4mmol)。搅拌2小时后，加入冰冷的水(5ml)。分离有机层，并用DCM(5ml)萃取水层。用冰冷的水(5ml)洗涤合并的DCM层两次，干燥(MgSO4)，在真空中移除溶剂，得到棕色油状物(451mg，88％)，其无需进一步纯化即可用于随后的反应。δH(400MHz，DMSO-d6)：6.78(1H，dd，J＝8.0，16.1CHC(O)F)，7.45-7.55(3H，m Ph)，7.81-7.86(1H，m，Ph)，7.97(1H，d，J＝16.0，CHPh).δC(100MHz，DEPT，DMSO-d6)112.6(CHCHPc)，129.4(Ph)，129.6(Ph)，132.3(Ph)，133.5(Ph)，152.2(CHPh)，159.1(C(O)F)。
d)下式(±)-3-氟-6-苯基二氢尿嘧啶的合成
Figure BDA00001633830200401
将对-氟-反式肉桂酸(1.00g，6.67mmol)和尿素(2.00g，33.5mmol)的混合物在30分钟加热至210℃。这导致形成了均匀的黄色液体。在所述反应进行的每一小时，加入另外的尿素(0.40g，6.67mmol)。搅拌4小时后，加入沸水(20mL)，并使反应混合物在95℃再搅拌1小时。通过热过滤从反应混合物移除残余固体后，通过过滤分离形成的白色沉淀，从而得到黄色固体(0.75g，产率＝60％)。δH(400MHz，DMSO-d6)2.61(1H，dd，J＝6.8，16.4，CH2)，2.84(1H，dd，J＝5.8，16.4，CH2)，4.64-4.70(1H，m，CHPh)，7.27-7.42(4H，m，Ph)，8.02(1H，bs，CHNHCO)，10.19(1H，br.s，CONHCO)；δC(100MHz，DEPT，DMSO-d6)38.2(CH2)，50.0(CHPh)，126.0(Ph)，127.6(Ph)，128.5(Ph)，141.1(Ph)，153.8(NHCONH)，169.7(NHCOCH2)；Rt10.5和15.1分钟(chirobiotic T，醋酸铵缓冲液pH 5.5∶甲醇7∶3，1.0mL/分钟)。
e)下式的(±)-3-溴-6-苯基二氢尿嘧啶的合成
Figure BDA00001633830200402
将间-溴-反式肉桂酸(0.80g，3.5mmol)和尿素(1.26g，21mmol)的混合物加热至210℃。这导致形成了均匀的黄色液体。在所述反应进行的每一小时，加入另外的尿素(0.25g，4.2mmol)。搅拌4小时后，加入沸水(20mL)，并使反应混合物在95℃再搅拌1小时。通过热过滤从反应混合物移除残余固体后，通过过滤分离形成的白色沉淀，从而得到黄色固体(0.30g，产率＝32％)。δH(400MHz，DMSO-d6)2.66(1H，dd，J＝6.8，17.4，CH2)，2.84(1H，dd，J＝5.6，16.3，CH2)，4.64-4.74(1H，m，CHPh)，7.29-7.59(4H，m，Ph)，8.04(1H，br.s，CHNHCO)，10.23(1H，br.s，CONHCO)；δC(100MHz，DEPT，DMSO-d6)37.8(CH2)，49.5(CHPh)，121.1(Ph)，125.2(Ph)，129.0(Ph)，130.5(Ph)，130.8(Ph)，143.9(Ph)，153.7(NHCONH)，169.6(NHCOCH2)；Rt 16.3和25.1分钟(chirobiotic T，醋酸铵缓冲液pH 5.5∶甲醇7∶3，1.0mL/分钟)。
f)(±)-N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸的合成
向搅拌的(±)-β-苯丙氨酸(0.80g，4.85mmol)在热水(20mL)中的溶液中加入氰酸钾(0.60g，7.40mmol)的水(2mL)溶液。在90℃搅拌1小时后，使反应混合物冷却至室温，然后应用浓盐酸酸化(pH＞1)。静置后，形成白色沉淀，将其通过过滤分离并从沸水中重结晶，得到白色结晶固体(0.71g，71％)。δH(400MHz，DMSO-d6)2.63(2H，CH2CO2H)，5.00(1H，dd，J＝7.2，8.7，CHNH)，5.56(2H，s，NH2)，6.57(1H，d，8.7，CHNH)，7.18-7.34(5H，m，Ph)；δC(100MHz，DEPT，DMSO-d6)41.4(CH2)，50.0(CHPh)，126.3(Ph)，126.7(Ph)，128.1(Ph)，143.4(Ph)，157.8(NHCONH)，172.0(NHCOCH2)；Rt 3.1和3.4分钟(chirobiotic T，醋酸铵缓冲液pH 5.5∶甲醇7∶3，1.0mL/分钟)。
g)下式的(R)-N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸的合成
Figure BDA00001633830200421
向搅拌的(R)-β-苯丙氨酸(0.4g，2.43mmol)在热水(10mL)中的溶液中加入氰酸钾(0.3g，3.70mmol)的水(1mL)溶液。在90℃搅拌1小时后，使反应混合物冷却至室温，然后应用浓盐酸将其酸化(pH＞1)。静置后，形成白色沉淀，将其通过过滤分离并从沸水中重结晶，得到白色结晶固体(0.30g，60％)。δH和δC分析与(±)-46相同；Rt 3.4分钟(chirobiotic T，醋酸铵缓冲液pH 5.5∶甲醇7∶3，1.0mL/分钟)。
h)从(±)-N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸合成(±)-6-苯基二氢尿嘧啶(下式)
Figure BDA00001633830200422
在135℃将(±)-N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸(100mg，0.48mmol)在浓盐酸(5mL)中的溶液搅拌4小时。此期间之后，反应混合物的体积减少了75％，使反应混合物冷却至室温。静置后，形成白色沉淀，将其通过过滤分离，得到白色结晶固体(50mg，55％)，分析与(±)-45相同。
i)下式的(S)-6-苯基二氢尿嘧啶的合成
Figure BDA00001633830200431
向搅拌的(S)-β-苯丙氨酸(100mg，0.60mmol)在热水(2mL)中的溶液中加入氰酸钾(75mg，0.93mmol)的水(0.5mL)溶液。在90℃搅拌1小时后，加入浓盐酸(2mL)，并在135℃搅拌所述反应2小时。该时间之后，混合物的体积减少了75％，使其冷却至室温。静置后，形成白色沉淀，将其通过过滤分离，得到白色结晶固体(55mg，48％)。δH和δC分析与(±)-45相同；Rt 9.6分钟(chirobiotic T，醋酸铵缓冲液pH 5.5∶甲醇7∶3，1mL/分钟)。
实施例6：乙内酰脲酶反应的浸提物和产物的分离
在微点样管(Eppendorf)中测试了6-PDHU和NCBPA与Q Sepharose及DEAE Sepharose的结合。用水(3x1mL)洗涤1mL Q Sepharose或DEAESepharose(可商业获得的在乙醇中的悬浮液)，然后加入含有2.5mMNCBPA和2.5mM 6-PDHU的溶液(1mL)，涡旋振荡所述微点样管，然后移出上清液的等分试样。通过rpHPLC测定上清液中的NCBPA和6PDHU百分比，并显示于表2中。
表2：
Figure BDA00001633830200432
与两种树脂的结合是迅速的，其中Q比DEAE结合更少的N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸和更多的6-苯基二氢尿嘧啶，使得DEAE对于分离而言是更有用的阴离子交换树脂。
实施例7：手性反相HPLC
对于手性rpHPLC，使用了以下柱子、缓冲液和运行条件：
Astec ChirobioticTM T 25cmx4.6mm，5μm(Sigma-Aldrich，St.Louis，USA)
醋酸铵缓冲液(pH 5.5)∶甲醇，70∶30，25℃，0.5mL/分钟
实施例8：通过DEAE色谱分离酶、底物和产物
从倒置的注射器制备柱子，用玻璃棉堵塞，并填充以用10个柱体积的dH2O洗涤过的DEAE(4mL)。用200mM醋酸铵缓冲液(pH 4)平衡后，将NCBPA(2.5mM)、6PDHU(2.5mM)和酶(7mg/mL)在H2O中的合成混合物施加至柱上，并通过rpHPLC(6PDHU/NCBPA检测)和Bradford测试法(酶检测)分析流出物。将所有6PDHU从柱子上洗涤后，应用200mM醋酸铵(pH 8.17)从柱子上洗脱NCBPA。结果显示于图3中(其中，正方形表示6-PDHU，菱形表示NCBPA，以及三角形表示酶，6-PDHU和NCBPA以mM表示，酶以mg/L表示)。在pH 4下，NCBPA和6PDHU之间存在清楚的分离，使得NCBPA的回收率为90％。
实施例9：乙内酰脲酶催化的外消旋6-取代的二氢尿嘧啶的水解
最初，作为模型系统研究乙内酰脲酶(获自Sigma，St.Louis，USA)催化的(±)-6-PDHU(外消旋6-苯基二氢尿嘧啶)(图2中的4a：R＝Ph)水解。在Tris缓冲液[pH 7.5]中以5mM的底物浓度进行反应，并通过如实施例7所描述的反相手性HPLC监测，其允许同时测定反应中的转化程度，以及未反应的二氢尿嘧啶4a和N-氨基甲酰基衍生物5(参见图4，以及流程2)的对映体过量。记录了以下观察：
(i)发现乙内酰脲酶对6-PDHU(4a)的(S)-对映体具有高度选择性，E值＞100。产物(S)-N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸[(S)-NCBPA]和未反应底物(R)-6-DPHU的绝对构型通过与可信样品的比较而指定；
(ii)尽管观察到高的(S)-对映选择性，但转化未进行至50％，即使在很长的反应时间之后也如此。所有反应均给出6-PDHU∶(S)-NCBPA＝51∶49的平衡浓度。在整个观察期间，(S)-NCBPA的对映体过量超过96％。图5显示了从小反应器中的25mL反应得到的结果，其中菱形表示NCBPA的浓度[mM]，正方形表示6-DPHU的浓度[mM]，以及叉号表示对映体过量[％]。
(iii)发现逆反应(即N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸的环化)具有相对于水解而言的可察觉的速率，并且也是高度(S)-选择性的，没有可察觉的(R)-对映体的环化。图6显示了(+/-)-、(S)-和(R)-NCBPA在有和没有酶的情况下的转化，其中由实线连接的实心或空心的菱形分别代表+/-NCBPA(没有酶)或+/-NCBPA(有酶)；由实线连接的实心或空心的正方形分别代表(S)-NCBPA(没有酶)或(S)-NCBPA(有酶)；以及实线连接的实心或空心的三角形分别代表(R)-NCBPA(没有酶)或(R)-NCBPA(有酶)。
实施例10：6-PDHU化学水解的pH依赖性
在不同pH值的Tris换缓冲液中在50℃将6-PDHU温育24小时。6-PDHU的可察觉的背景水解强pH和缓冲液依赖性地发生。在pH 7的Tris缓冲液中，观察到0.5％的背景水解。在pH 9，背景水解占约20％(图7)。
实施例11：乙内酰脲酶活性的pH依赖性
将6-PDHU在各种pH值的磷酸盐缓冲液(0.1M，磷酸二氢钾和磷酸氢二钾，将体积调节至合适的pH)或Tris缓冲液中温育达8h(应用7g/L的来自Sigma的D-乙内酰脲酶)。在约pH 7.5至约pH 9.0的范围内观察到最高的转化率(图8，其中正方形表示磷酸盐缓冲液，以及菱形表示Tris缓冲液)。
在其它实验中，测定了在各种pH值的磷酸盐或Tris缓冲液中随时间的转化率。将5mM 6-PHDU在磷酸盐缓冲液(pH 6.0，7.0，7.5，8.0)和Tris缓冲液(pH 7.5)中温育22小时。结果显示于图9(其中菱形、正方形、三角形和叉号分别表示pH 6、pH 7、pH 7.5或pH 8的磷酸盐缓冲液，以及圆点表示pH 7.5的Tris缓冲液)和表3(ee＝对映体过量[％])中。
表3：
  缓冲液   pH  ee
  磷酸盐   6.00  ＞99.90
  磷酸盐   7.00  ＞99.90
  磷酸盐   7.50  96.62
  磷酸盐   8.00  92.73
  Tris   7.50  ＞99.90
尽管在磷酸盐缓冲液中在pH 6.00下，转化以期望底物的高对映体过量进行，但与在7.00至8.00的pH值下的转化率相比，转换率明显更低。
实施例12：赤豆乙内酰脲酶的底物特异性
如实施例4所描述的那样合成各种底物，并进行乙内酰脲酶催化的转化[Tris缓冲液(pH 7.5，0.1M，1.0mL)、D-乙内酰脲酶(Sigma，7g/L)、底物(预溶解于缓冲液中的5mM溶液，但芳香取代基(4a，4b，4c)除外，在芳香取代基的情况下，将底物溶解于100微升DMSO中并添加至900微升缓冲液中)]。反应显示于图10，结果显示于表4，其中E-值如下定义：
E值＝(ln(1-[产物]＊(1+ee)))/(ln(1-[产物]＊(1-ee)))
表4：
Figure BDA00001633830200461
Figure BDA00001633830200471
实施例13：乙内酰脲酶催化的转化的有机共溶剂的影响
在含有2％DMSO的缓冲液中，以及饱和有MTBE(约5vol.-％)或丁-2-醇(约15vol.-％)的缓冲液中以5mL规模进行5mM 6-PDHU的生物转化。结果显示于图11中，其中菱形表示缓冲液，正方形表示含有2％DMSO的缓冲液，三角形表示含有MTBE的缓冲液，以及叉号表示含有丁-2-醇的缓冲液。DMSO和MTBE均没有明显影响所述转化，而丁-2-醇在所使用的浓度下减少了NCBPA的量。
实施例14：酶量对转化和对映体过量的影响
在5mL Tris缓冲液(pH 7.5)的总反应体积中进行3个平行反应设置，每一个均含有5mM 6-PDHU，温度为50℃。在一个反应中，使用的通常的酶量(7g/L)，而在其它设置中分别含有0.25当量(1.75g/L)和4当量(28g/L)。在不同的时间点测定N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸(NCBPA)的产量和S-对映体的对映体过量。结果显示于图12，其中垂直线、斜线和水平线填充的柱子分别代表存在0.25、1或4当量酶的情况下所获得的NCBPA浓度，并且其中菱形、正方形和三角形分别代表存在0.25、1或4当量酶的情况下相应的对映体过量。
实施例15：乙内酰脲酶催化的反应的升级(Upscaling)
在三个独立进行的生物转化中，在25ml缓冲液(Tris缓冲液pH 7.5)的总反应体积以及在175mg乙内酰脲酶的存在下，在50℃温育20mM6-PDHU。在添加6-PDHU后调节缓冲液的pH，并通过自动滴定NaOH从而在反应期间保持pH恒定。在不同的时间点获取试样，用于测定NCBPA浓度和S-对映体的对映体过量。结果分别显示于图13和图14中。在图13中，菱形、正方形和三角形分别表示反应器运行1、反应器运行2和反应器运行3。在图14中，菱形、正方形和三角形分别表示反应器运行1、反应器运行2和反应器运行3中观察到的对映体过量率，并且其中实线、虚线和点线分别表示反应器运行1、反应器运行2和反应器运行3中观察到的对映体过量率的最佳拟合曲线。
SEQ ID NO的概述
SEQ ID NO：1-从分离的乙内酰脲酶中获得的肽序列
SEQ ID NO：2-从分离的乙内酰脲酶中获得的肽序列
SEQ ID NO：3-从分离的乙内酰脲酶中获得的肽序列
SEQ ID NO：4-从分离的乙内酰脲酶中获得的肽序列
SEQ ID NO：5-从分离的乙内酰脲酶中获得的肽序列
SEQ ID NO：6-大豆的乙内酰脲酶，作为参考序列
SEQ ID NO：7-从分离的乙内酰脲酶中获得的部分肽序列
缩写
NCBPA-N-氨基甲酰基-β-苯丙氨酸
6PDHU-6-苯基二氢尿嘧啶
Figure IDA00001633830700011
Figure IDA00001633830700021
Figure IDA00001633830700031
Figure IDA00001633830700041
Figure IDA00001633830700051
Figure IDA00001633830700061

Claims (16)

1.生物催化生产β-氨基酸前体的方法，其包括：使至少一种通式(I)的底物在至少一种催化乙内酰脲和/或二氢嘧啶环水解裂解的酶的存在下反应，
Figure FDA00001633830100011
其中R1和R2彼此独立地选自：
氢；
直链或支链的、任选取代的低级烷基；
直链或支链的、任选取代的低级烯基；
任选取代的环烷基；
单环或多环的、任选取代的芳基；
单环或多环的、任选取代的杂芳基；
直链或支链的、任选取代的烷氧基；
氨基；
直链或支链的、任选取代的烷基氨基；
直链或支链的、任选取代的烷硫基；
直链或支链的、任选取代的酰基；
羧基；或
醛基；
所述底物以立体异构纯的形式或作为立体异构体的混合物存在，其中所述立体异构纯的形式或立体异构体的混合物可以任选地是盐，从而产生了通式(II)的β-氨基酸前体
Figure FDA00001633830100021
其中R1和R2如上面所定义，
所述方法的特征在于：在所述方法中应用的至少一种酶获自赤豆(Vigna angularis)和/或包含至少一个与以下部分序列至少之一具有60％-100％同一性的部分序列：
ITGPEGQRLAGP             (SEQ ID NO：7)
EEIARARKSGQRVIGEPVAS     (SEQ ID NO：5)。
2.根据权利要求1的方法，其还包括将所述式(II)的β-氨基酸前体转化为相应的式(III)的β-氨基酸：
Figure FDA00001633830100022
其中，R1和R2具有与权利要求1中定义的相同的含义。
3.根据权利要求2的方法，其中所述β-氨基酸前体的转化在酸性pH下进行，或在氨甲酰水解酶存在下进行。
4.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述至少一种乙内酰脲酶和/或二氢嘧啶酶是可从土壤杆菌属(Agrobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和豇豆属(Vigna)的生物体尤其是赤豆(Vigna angularis)获得的酶。
5.根据前述任一项权利要求的方法，其中R1是H且R2是任选取代的芳基。
6.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述反应在Tris-缓冲的或硼酸盐缓冲的反应混合物中进行，优选在Tris-缓冲的反应混合物中进行。
7.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述反应在约7.0至约11.0的pH下、优选在约7.5至约10.0的pH下、以及尤其优选在约7.5至约8.0的pH下进行。
8.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述反应在约1％至约20％二甲基亚砜存在下、优选在约10％二甲基亚砜存在下进行。
9.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述反应在约30℃至约60℃、优选约30℃至约50℃、以及尤其约40℃至50℃范围内的温度下进行。
10.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述反应进行约1小时至约25小时、优选约3小时至约10小时、以及尤其约4小时至约5小时。
11.根据前述任一项权利要求的方法，其中所述至少一种底物选自在5-位或在6-位单取代的二氢尿嘧啶，尤其是6-苯基二氢尿嘧啶、4-氟-6苯基-二氢尿嘧啶、3-溴-6-苯基-二氢尿嘧啶、5-甲基二氢尿嘧啶和6-甲基二氢尿嘧啶。
12.可通过权利要求1-10任一项获得的β-氨基酸前体或β-氨基酸，或可通过根据权利要求2-10任一项的方法获得的β-氨基酸用于生产水解稳定的肽、药物活性剂，尤其是抗生素、抗癌剂、抗血栓形成剂、抗真菌 杀虫剂、驱虫剂、非肽整联蛋白拮抗剂、生物碱和/或细胞毒剂的用途。
13.乙内酰脲酶，其含有至少一个以下的部分序列：
ITGPEGQRLAGP           (SEQ ID NO：7)
EEIARARKSGQRVIGEPVAS   (SEQ ID NO：5)
14.乙内酰脲酶，其通过从生物体制备细胞材料的粗提取物，并使所述粗提取物进行以下相继的纯化步骤而获得：
a)离子交换色谱
b)疏水色谱
c)凝胶过滤
d)亲和色谱
e)阴离子交换
f)凝胶过滤。
15.根据权利要求13或14的乙内酰脲酶，其从土壤杆菌属(Agrobacterium)、节杆菌属(Arthrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)和豇豆属(Vigna)的生物体尤其是赤豆(Vigna angularis)获得。
16.根据权利要求13-15中任一项的乙内酰脲酶用于根据权利要求1-11任一项的方法的用途。
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