JP5619400B2 - 酸性ホスファターゼ及びそれをコードする核酸、並びにこれらを利用したリボフラビン−5’−リン酸の製造方法 - Google Patents
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Description
なお、本明細書及び図面において、塩基及びアミノ酸等を略号で表示する場合は、IUPAC−ICB Commission on Biochemical Nomenclatureによるか、あるいは当該分野において慣用的に使用される用語の意味に基づくものである。また、アミノ酸に光学異性体が存在する場合は、特に限らないかぎりL−体を示す。
本発明のタンパク質は、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−5’−リン酸を生成する活性を有し、且つ、以下の理化学的性質を有する酸性ホスファターゼである。
分子量:SDS−PAGEにより30〜31kDa、ゲルろ過法により242kDa
基質に対するKm値:リボフラビン=0.05mM、D−パンテチン=0.49mM、ピロリン酸=1.57mM
至適pH:5.5
至適温度:35℃
本発明の核酸は、配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードすることを特徴とする。
本発明のベクターは、前述した核酸を含有することを特徴とするベクターである。
本発明の5’−FMNの製造法は、リン酸供与体存在下において、リボフラビン又はその塩に上記本発明のタンパク質を作用させて5’−FMNを生成させる工程を備える。さらに、本発明の5’−FMNの製造法は、リン酸供与体存在下において、リボフラビン又はその塩に上記本発明の形質転換体を作用させて5’−FMNを生成させる工程を備える。
ブレブンディモナス ディミヌータ(Brevundimonas diminuta)IAM 12557をペプトン1.0%、酵母エキス0.5%及びNaCl1.0%を含む培地4mLに接種し、30℃で24時間、振盪培養を行った。遠心分離によって得られた菌体をリボフラビン5mg、酸性ピロリン酸ナトリウム12.5mg、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 4.0)0.5mLに懸濁し、30℃で16時間、振盪し反応を行った。反応終了後、反応液を遠心分離して菌体を除去し、5’−FMNを含む溶液を得た。5’−FMNの生成量を、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)により、下記の条件にて測定した。
カラム:Inertsil ODS−3
(粒子径3μm、直径4.6mm×75mm、GLサイエンス社製)
溶離液:CH3CN:50mM NH4H2PO4(pH 6.0)=12:88
流速:2.0ml/min
検出:UV 450nm
温度:40℃
リン酸転移活性を指標として、以下の(1)〜(7)の手順により新規な酸性ホスファターゼを精製した。リン酸転移活性の測定は、リボフラビンを基質として次の条件で行った。0.1%リボフラビン、0.5%ピロリン酸二水素二ナトリウム、0.1M酢酸緩衝液(pH 4.0)、2mM塩化マグネシウム及び酵素液を含む反応液(500μL)で、30℃で30分間、反応を行った。50μLの2N過塩素酸水を添加して反応を停止した後、遠心分離により沈殿を除き、リン酸転移反応により生成した5’−FMNを上記条件のHPLCにより定量した。
LB培地(ポリペプトン1.0%、酵母エキス0.5%、塩化ナトリウム1.0%、pH 7.0)5mLを試験管に入れ、121℃で20分間、加熱滅菌した。これに、Brevundimonas diminuta IAM 12557を接種し、30℃で16時間、振盪培養した。この培養液を、500mL三角フラスコに入れて121℃で20分間、加熱滅菌したLB培地200mLに接種し、30℃で16時間、振盪培養した。
この培養液20Lから遠心分離により回収した湿菌体を10%グリセロール、1mMジチオスレイトール(DTT)、0.2%ポリオキシエチレン(10)オクチルフェニルエーテル(Triton X−100)を含む0.1Mリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)からなる緩衝液A 1100mLに懸濁し、超音波破砕機(19KHz、インソネーター 201M、クボタ社製)により20分間、超音波破砕後、遠心分離により得られた不溶性画分に150mLの緩衝液Aを加え、懸濁した後、遠心分離し、不溶性画分を除き、無細胞抽出液を得た。
(2−2)で得られた無細胞抽出液に終濃度が0.5mMになるようにエチレンジアミン四酢酸二ナトリウム(EDTA)を加え、さらに緩衝液Aを加えて600mLとした後、硫酸アンモニウム99.6gを加え、4℃で30分間、攪拌後、遠心分離し、得られた沈澱画分を10%グリセロール、1mM DTT、0.5mM EDTA及び0.2%Triton X−100を含む10mMリン酸カリウム緩衝液(pH 7.0)からなる緩衝液B 250mLに溶解した。
(2−3)で得られた粗酵素液50mLに1M塩化マグネシウム0.5mLと0.1M ATP(pH 7.0)2.5mLを加え、37℃で1時間、放置した後、緩衝液Bに対して透析を行った後、緩衝液Bで平衡化したDEAE−Toyopearlカラム(直径2.5cm×18cm)に添加し、200mLの緩衝液Bで洗浄後、0mMから500mM塩化ナトリウムの直線濃度勾配(500mL)により溶出した。残りの酵素液についても、同じ操作を5回繰り返した。
(2−4)で得られた粗酵素液50mLを緩衝液Bに対し透析し、緩衝液Bで平衡化したMono Q HR 10/10(GEヘルスケア バイオサイエンス製)に添加し、0mMから300mM塩化ナトリウムの直線濃度勾配(120mL)により溶出した。残りの酵素液についても、同じ操作を5回繰り返した。
(2−5)で溶出した活性画分を緩衝液Bに対し透析し、緩衝液Bで平衡化したMono Q HR 5/5(GEヘルスケア バイオサイエンス製)に添加し、0mMから300mM塩化ナトリウムの直線濃度勾配(30mL)により溶出し、酵素溶液を得た。残りの酵素液についても、同じ操作を5回繰り返した。
(2−6)で得られた酵素活性画分を合わせて、緩衝液Bに対し透析し、緩衝液Bで平衡化したコハク酸をリガンドとしたアフィニティカラムに添加した。カラムの作製はEAH Sepharose 4B(GEヘルスケア バイオサイエンス製)を使用し、添付説明書に従って作製した。溶出は、0mMから300mM塩化ナトリウムの直線濃度勾配(30mL)により溶出した。
(3−1)部分アミノ酸配列の決定
実施例2で得られた精製酵素の部分アミノ酸配列の解析をアプロサイエンス社に委託し、SDS−PAGE分離ゲル片をIn gel digestion法に基づきトリプシンを用いて酵素消化した後、逆相HPLCにより生成ペプチドを分離精製し、Procise 494 HT Protein Sequencing System(Applied Biosystems社製)により配列解析した。
ペプチド1:AKEEFDAAR(配列番号3)
ペプチド2:ADNEIETPGAPR(配列番号4)
Brevundimonas diminuta IAM 12557の培養菌体からMurray and Thomsonの方法(Nucl. Acid Res., 1980年,8巻,pp.4321−4325)に従い、染色体DNAを調製した。
酸性ホスファターゼの内部部分アミノ酸配列(ペプチド1及び2のアミノ酸配列)を基にプライマー1及び2を合成した。
プライマー1:5’−NGCNGCRTCRAAYTCYTC−3’(配列番号5)
プライマー2:5’−GCNGAYAAYGARATHGARAC−3’(配列番号6)
プライマー3:5’−GARATGATHCARACNCCNGC−3’(配列番号7)
プライマー4:5’−GCTCGAACTTGAAGCCAAGG−3’(配列番号8)
プライマー5:5’−GCNGAYCCNGCNTTYCARAC−3’(配列番号9)
次に、染色体DNAをBan IIで消化し、T4 DNA Ligaseでセルフライゲーションした。ライゲーションしたDNAを鋳型とし、TaKaRa EX Taq、プライマー3及び4を用いてPCRを行った。アガロース電気泳動により増幅DNAを確認し、pT7Blue T−Vectorにサブクローニングし、その塩基配列を決定した。この塩基配列を基に新たにプライマー6を合成した。
プライマー6:5’−ACAGCGAAGCTTTAAGGAGGAATAGCCCATGACCACGCCGCGCCTTGCGTCCTC−3’(配列番号10)
プライマー7:5’−CCTACGTCTAGATTTGCACTCACGCCA−3’(配列番号11)
本酵素遺伝子の塩基配列(配列番号1)についてホモロジー検索を、DDBJ(DNA Data Bank of Japan)によるBLAST検索で行った。その結果、本酵素遺伝子の塩基配列(配列番号1)は、以下に示す微生物に由来する遺伝子の塩基配列に対して、それぞれ以下に示す塩基配列相同性(%)を示した。カウロバクター クレスセンタス(Caulobacter crescentus)61.5%、メチロバクテリウム ラジオトレランス(Methylobacterium radiotolerans)61.4%、フェニロバクテリウム ズシネウム(Phenylobacterium zucineum)60.4%、及び、クプリアビダス タイワネンシス(Cupriavidus taiwanensis)60.3%。
実施例3で明らかとなった酸性ホスファターゼをコードするDNA配列に基づいて、以下のPCRプライマー8及び9を作製した。プライマー8にはSph I切断サイトが、プライマー9にはBgl II切断サイトがそれぞれ付与されている。
プライマー8:5’−ATAGCGCATGCCCACGCCGCGCCTTGCGTCCTCTCTCATC−3’(配列番号12)
プライマー9:5’−GCGCCAGATCTGGGCTGGCGAGACAGGGAGGCGGGGCAG−3’(配列番号13)
pUC−ACPを鋳型とし、KOD−PLUS−(東洋紡社製)、プライマー8及び9を使用して添付説明書に従いPCRを行った。PCR産物をSph I及びBgl IIを使用して消化し、pQE−70(キアゲン社製)のSph I及びBgl IIサイトに挿入したプラスミドpACP12557−E1を構築した。
pACP12557−E1をCompetent high JM109(東洋紡社製)を用いて大腸菌JM109に遺伝子導入し、大腸菌JM109/pACP12557−E1を作製した。
大腸菌JM109/pACP12557−E1を100μg/mLのアンピシリンを含むLB培地5mLに接種し、30℃で12時間、振盪培養した。この培養液を0.1mMイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド(IPTG)を含むLB培地200mLに植え継ぎ、30℃で5時間、振盪培養を行った。この培養液を1L調製し、遠心分離した後、沈殿画分に50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 8.0)、300mM塩化ナトリウム及び10mMイミダゾールを含む溶液に懸濁し、氷水中で超音波破砕機(300μA、US−300、日本精機社製)により、10分間、超音波破砕後、遠心分離により得られた沈殿画分に50mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 8.0)、300mM塩化ナトリウム、10mMイミダゾール及び0.2%Triton X−100を含む溶液に懸濁した。遠心分離後、上清をQIAexpress Type ATG Kit(キアゲン社製)を使用し、添付説明書に従い酵素精製を行った。酵素溶液をSDS−PAGEに供した結果、単一のバンドが確認された。また、酵素溶液の活性測定を行った結果、活性収率48.5%で精製できた。精製酵素をACP12557と名付けた。
実施例6で得た精製酵素の酵素学的性質について検討した。リン酸転移活性の測定の為の標準的な反応条件は、以下の通りであった。5mMリボフラビン、112mMピロリン酸二水素二ナトリウム、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.5)及び1.68μg/mL酵素液を含む反応液(500μL)で、30℃で30分間、反応を行った。2N過塩素酸水50μLを添加して反応を停止した後、遠心分離により沈殿を除き、リン酸転移反応により生成した5’−FMNを定量した。尚、上記反応条件にて1分間に1μmolの5’−FMNを生成する酵素量を1unit(U)と定めた。
カラム:Inertsil ODS−3(粒子径3μm、直径4.6mm×75mm、GLサイエンス社製)
溶離液:CH3CN:50mM NH4H2PO4(pH 6.0)=12:88
流速:2.0ml/min
検出:UV 450nm
温度:40℃
ポリリン酸等のリン酸供与体よりリボフラビンやパントテン酸類(パントテン酸、パンテチン、パンテノール、パントテニルエチルエーテル)にリン酸を転移し、リボフラビン−5’−リン酸エステル及びパントテン酸類−4’−リン酸エステル(パントテン酸−4’−リン酸、パンテチン−4’,4’’−ジリン酸、パンテチン−4’−リン酸、パンテノール−4’−リン酸、パントテニルエチルエーテル−4’−リン酸)を生成する。逆にリン酸エステルを加水分解する作用も示す。
各種リン酸供与体をピロリン酸二水素二ナトリウムと同様の反応条件で反応した。結果は、ピロリン酸二水素二ナトリウムをリン酸供与体とした場合を100とした相対活性として表1に示す。
ピリドキシン、ピリドキサール
カラム:Inertsil ODS−3(粒子径3μm、直径4.6mm×75mm、GLサイエンス社製)
溶離液:A;0.1%トリフルオロ酢酸水、B;0.1%トリフルオロ酢酸/アセトニトリル
グラジエント:B;1%→90%
流速:0.5mL/min
検出:280nm
温度:40℃
アスコルビン酸
カラム:Inertsil ODS−3(粒子径3μm、直径4.6mm×150mm、GLサイエンス社製)
溶離液:1mM EDTA(pH 3.0)−0.1Mリン酸二水素カリウム
流速:1.0mL/min
検出:254nm
温度:25℃
ADP、AMP、GDP、GMP
カラム:Inertsil ODS−3(粒子径3μm、直径4.6mm×150mm、GLサイエンス社製)
溶離液:0.1Mリン酸水素二ナトリウム(pH 6.0)
流速:1.0 mL/min
検出:260nm
温度:25℃
D−パンテチン、D−パントテン酸カルシウム、D−パンテノール及びD−パントテニルエチルエーテル
カラム:Inertsil ODS−3(粒子径3μm、直径4.6mm×75mm、GLサイエンス社製)
溶離液:A;0.1%トリフルオロ酢酸水、B;0.1%トリフルオロ酢酸/アセトニトリル
グラジエント:B;1%→90%
流速:1.0mL/min
検出:230nm
温度:50℃
標準反応条件のうちpHを酢酸ナトリム緩衝液(pH 3.0−5.5)、リン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0−8.0)、トリス−塩酸緩衝液(pH 9.0−10.0)を用いてpHを変化させて、リン酸転移活性を測定した。反応の至適pHは5.5付近であった。
グリシン緩衝液(pH 2.0)、酢酸ナトリウム緩衝液(pH 3.0−5.5)、リン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0−8.0)、トリス−塩酸緩衝液(pH 9.0−10.0)、リン酸水素二ナトリウム−水酸化ナトリウム緩衝液(pH 11.0−13.0)の種々の緩衝液で30℃、30分間処理し、残存活性を標準条件の酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.5)を酢酸ナトリウム緩衝液(pH 4.0)に変えて測定した。pH 4.0から11.0では、処理前の85%以上の活性が残存していた。
標準反応条件のうち温度だけを変化させてリン酸転移活性を測定した。反応の至適温度は35℃付近であった。
精製酵素を0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.5)中で種々の温度にて60分間処理し、残存活性を標準反応条件で測定した。40℃以下では、処理前の90%以上の活性が残存していた。
標準反応液に各種金属イオン又は阻害剤を添加して、リン酸転移活性を測定した。結果は、無添加条件を100とした相対活性として以下の表3及び表4に示した。
精製酵素のサブユニットの分子量をSDS−PAGE(12%ポリアクリルアミドゲル)により求めた結果、約31kDaであった。また、Superdex 200 5/10 (GEヘルスケア バイオサイエンス社製)によるゲルろ過クロマトグラフィーで測定した分子量は、約242kDaであった。これらの結果より、本発明の酸性ホスファターゼは、ホモヘキサマーと予想された。
5mMリボフラビン、112mMピロリン酸二水素二ナトリウム、0.1M酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.5)及び0.21μg/mL酵素液を含む反応液(500μL)のリボフラビン濃度を変化させて、30℃で30分間、反応を行い、ミカエリス定数Kmをラインウエーバー・バークのプロットにより得た。得られたKmは0.053mMであった。また、最大速度Vmaxは4.5U/mgであった。さらに、ピロリン酸二水素二ナトリウムの濃度を変化させて、同様にKmを求めた。この場合のKmは1.57mM、Vmaxは4.5U/mgであった。
大腸菌JM109/pACP12557−E1を100μg/mLのアンピシリンを含むLB培地5mLに接種し、37℃で12時間、振盪培養を行った。この培養液を0.1mM IPTGを含むLB培地5mLに植え継ぎ、37℃で14時間、振盪培養を行った。培養液1mLを遠心分離し、得られた菌体に1%リボフラビン、2.5%ピロリン酸二水素二ナトリウム、0.1M酢酸緩衝液(pH 4.0)及び2mM塩化マグネシウムを含む反応液(1mL)で、30℃で1時間、反応した後、2N過塩素酸100μLを加え、反応を停止した。反応生成物はHPLCで検出した。
大腸菌JM109/pACP12557−E1を100μg/mLのアンピシリンを含むLB培地500mLに接種し、37℃で12時間、振盪培養を行った。この培養液を0.1mM IPTGを含むLB培地18Lに植え継ぎ、30℃で24時間、振盪培養を行った。培養液を遠心分離して得られた菌体を50mM酢酸緩衝液(pH 4.0)1.8Lに懸濁し、80%パンテチン(第一三共プロファーマ社製)67.5g(97.4mmol)、ピロリン酸二水素二ナトリウム270g(1.22mol)を加え、30℃で4時間、反応した。反応液は、70℃で10分間、加熱処理後、遠心分離及びメンブランろ過(0.2μm)により菌体を除去し、反応ろ液を得た。反応ろ液1.67Lには、パンテチン−4’,4’’−ジリン酸48g(67.2mmol)及びパンテチン−4’−リン酸が含まれていた。
実施例9で得られた反応ろ液1.67L(パンテチン−4’,4’’−ジリン酸48g含有)を逆相カラムクロマトグラム(Chromatorex ODS−1020T;1kg)に供し、水で溶出することによりパンテチン−4’,4’’−ジリン酸47.6g(収率68.4%)を得た。さらに、20%アセトニトリルで溶出することによりパンテチン−4’−リン酸10.6g(収率17.2%)を得た。なお、パンテチン−4’,4’’−ジリン酸の融点は、160〜170℃(分解)である。
実施例10で得られたパンテチン−4’,4’’−ジリン酸10.3g(14.4mmol)を精製水100mLに溶解し、撹拌下、28%水酸化ナトリウムを滴下し、pH 7.0とし、反応液を濃縮乾固した。残渣をメタノール100mLに溶解し、酢酸エチル1Lを撹拌中に加え、析出した粉末をろ過、酢酸エチルで洗浄し、40℃で6時間、減圧乾燥し、白色粉末のパンテチン−4’,4’’−ジリン酸ジナトリウム10.3g(収率89.0%)を得た。なお、パンテチン−4’,4’’−ジリン酸ジナトリウムの融点は、185〜190℃である。
1H−NMR(D2O) δppm;0.85(6H,s,−CH 3 ),0.99(6H,s,−CH 3 ),2.52(4H,t,J=6.6Hz,−CH 2 −CONH),2.85(4H,t,J=6.3Hz,−CH 2 −S−),3.4−3.8(4H,m,−CH 2 −P−),3.52(8H,t,J=6.4Hz,−CH 2 −NH−),4.10(2H,s,−CH−OH),4.79(2H,s,−OH)
実施例10で得られたパンテチン−4’,4’’−ジリン酸2.10g(2.94mmol)を精製水50mLに溶解し、撹拌下、飽和水酸化カルシウム水を滴下し、pH 7.0とし、反応液を濃縮乾固した。残渣をメタノールに懸濁後、粉末をろ過し、40℃で2時間、減圧乾燥し、白色粉末のパンテチン−4’,4’’−ジリン酸カルシウム2.02g(収率93.5%)を得た。
実施例10で得られたパンテチン−4’,4’’−ジリン酸1.32gを精製水50mLに溶解し、攪拌下、水酸化マグネシウムを添加し、pH 7.0とし、反応液を減圧濃縮した。残渣をメタノールに懸濁後、粉末をろ過し、40℃で6時間、減圧乾燥し、白色粉末のパンテチン−4’,4’’−ジリン酸マグネシウム1.22g(収率86.9%)を得た。
Claims (5)
- リン酸供与体存在下において、パントテン酸類又はその塩に、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−5’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼであるタンパク質を作用させて、パントテン酸類の4’位リン酸エステルを生成させる工程を含む、パントテン酸類の4’位リン酸エステルの製造方法。
- リン酸供与体存在下において、パントテン酸類又はその塩に、配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質を作用させて、パントテン酸類の4’位リン酸エステルを生成させる工程を含む、パントテン酸類の4’位リン酸エステルの製造方法。
- リン酸供与体存在下において、パントテン酸類又はその塩に、配列番号2に記載のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質であり、且つリボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−5’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼであるタンパク質を作用させて、パントテン酸類の4’位リン酸エステルを生成させる工程を含む、パントテン酸類の4’位リン酸エステルの製造方法。
- リン酸供与体存在下において、パントテン酸類又はその塩に、形質転換体を作用させて、パントテン酸類の4’位リン酸エステルを生成させる工程を含む、パントテン酸類の4’位リン酸エステルの製造方法であって、
前記形質転換体は、
1)配列表の配列番号2に記載のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
2)配列表の配列番号1に記載の塩基配列を有する核酸、又は
3)配列表の配列番号1に記載の塩基配列と90%以上の同一性を有し、且つ、リボフラビンとリン酸供与体に作用し、リボフラビン−5’−リン酸を生成する活性を有する酸性ホスファターゼをコードする核酸、
を含有するベクターを保有する形質転換体である、
パントテン酸類の4’位リン酸エステルの製造方法。 - 前記パントテン酸類が、パントテン酸、パンテチン、パンテテイン、パンテテイン−S−スルホン酸、パンテノール及びパントテニルエチルエーテルからなる群より選ばれる請求項1〜4のいずれか一項に記載の製造方法。
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