JPWO2010024445A1 - 光学活性なアミン誘導体を製造するための方法 - Google Patents

Abstract

イミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物の培養物、菌体またはその処理物を作用させ、生成する光学活性なアミン誘導体を回収することにより、光学活性なアミン誘導体が製造される。本発明によって得られる光学活性なアミン誘導体は、医薬の合成原料として有用である。本発明によって、たとえば下記式(IV)で示される光学活性な化合物を製造することができる。式（ＩＶ）（式中、Ｒ基は炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは１〜４の整数を表す）

Description

本発明は、イミン誘導体を立体選択的に還元することによって各種医薬品の原料あるいは合成中間体として利用されている光学活性なアミン誘導体を製造する方法に関する。

イミン誘導体の立体選択還元による光学活性なアミン誘導体の製造方法としては、次のような報告を除いてほとんど知られていない。
−非特許文献1；Tetrahedron Asymmetry, 19, 93,96（2008）−
キャンディダ・パラプシロシスによるＮ−フェニル−１−フェニルエチルアミン誘導体の還元
ただし、これらの公知技術においては、Ｎ−ベンジリデンベンジルアミンの還元生成物がキラルな構造ではないため、反応の立体選択性は不明である。また、Ｎ−（（Ｅ）−Ｎ−（１−フェニルエチリデン）アニリン誘導体のキャンディダ・パラプシロシスによる還元反応は極めて弱いため、工業的な利用には適さない。また、該イミン還元反応を行う酵素の実態は全く不明である。

また、２−メチルピロリジンの製法としては、次のような方法が知られている。
−非特許文献２；Acta. Pharm. Suec., 1978, 15, 255-263−
２−メチル−１−ピロリンを水素化ホウ素ナトリウムによって還元し、ラセミ２−メチルピロリジンとした後、酒石酸を用いた光学分割により、キラル−２−メチルピロリジンを得る方法
−非特許文献３；J. Org. Chem., 1989, 54, 209-216−
Ｌ−プロリンから誘導されるＬ−プロリノールの水酸基を塩化チオニルでクロロ基に変換し、窒素原子をベンジルオキシカルボニル基により保護した後、水素化トリブチル錫を用いてラジカル的に還元することにより、（Ｒ）−１−ベンジルオキシカルボニル−２−メチルピロリジンを製造し、さらに脱保護する方法

−特許文献１；ＷＯ２００５／０７３３８８号公報−
光学活性１，４−ペンダンジオールをジスルホナートとした後、アミンと反応させて環化し、２−メチルピロリジンを得る方法
しかし、いずれの方法にも、次のような問題点が伴う。
−工程が長い
−危険な水素化試薬を使用する
−分割方法によって得るため収率が５０％を超えない

Tetrahedron Asymmetry, 19, 93,96（2008） Acta. Pharm. Suec., 1978, 15, 255-263 J. Org. Chem., 1989, 54, 209-216

ＷＯ２００５／０７３３８８号公報

本発明の課題は、イミン誘導体から光学活性なアミン誘導体を製造するための方法を提供することである。更に本発明は、イミン誘導体を基質として光学活性なアミン誘導体を生成することができる微生物、あるいは酵素の提供を課題とする。更に本発明は、目的とする性状を備えた該酵素をコードするＤＮＡを単離し、組換え体として得ることを課題とする。加えて、組換え体による光学活性アミン誘導体の製造方法の提供をも課題とするものである。

本発明者らは、このような高度な要求を満足する方法を鋭意検討した。そして微生物の有する立体選択的な還元能力を利用して、イミン誘導体を立体選択的に還元することにより、光学活性なアミン誘導体を生成させうることを見出した。

既に述べたように、イミン誘導体を立体選択的に還元する生合成に関与する酵素は知られている。しかし公知の酵素はいずれも代謝に関与する酵素である。そのため医薬品の中間体などの製造に応用した場合には、工業的な生産に求められる基質特異性や活性は期待できない。特に２−メチル−１−ピロリンなどの環状アルキルイミン誘導体を還元して、光学活性環状アルキルアミン誘導体を得る方法は、まったく知られていなかった。

したがって、医薬品の中間体などの製造に好適な基質特異性や触媒活性を備えた微生物が見出されたことは、非常に意外な成果であった。更に驚くべきことに、微生物が有する立体選択的なイミンの還元能力は、十分に高く、工業的な利用に際し問題の無いレベルであった。たとえば、ストレプトマイセス・エスピー ＧＦ３５４６（Streptomyces sp. GF3546）は前記の課題を解決するための有用な性質を備えた微生物であることが見出された。更に本発明者らは、ＧＦ３５４６を大量培養し、無細胞抽出液を調製した後、次の工程を経てイミン還元酵素を高度に精製することに成功した。
−Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた疎水クロマトグラフィー、および
−ＭｏｎｏＱを用いたイオン交換クロマトグラフィー
更に、イミン還元酵素をコードするＤＮＡを単離し、当該酵素を高発現する組換え菌を造成し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、以下の光学活性アミンの製造方法を提供する。あるいは本発明は、当該方法に有用な微生物、あるいはイミン還元酵素、当該酵素をコードするＤＮＡを含むポリヌクレオチド、当該酵素の製造方法に関する。
〔１〕次の（１）〜（５）に示す理化学的性状を有するイミン還元酵素；
（１）作用：還元型ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略す）依存的に、２−メチル−１−ピロリンを還元し、（Ｓ）−２−メチルピロリジンを生成する。ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ＋と略す）依存的に、（Ｓ）−２−メチルピロリジンを酸化し、２−メチル−１−ピロリンを生成する；、および
（２）補酵素依存性：還元反応の補酵素としてＮＡＤＰＨを利用する。酸化反応の補酵素としてＮＡＤＰ＋を利用する。
（３）至適ｐＨ：還元反応は７．４〜８．０、酸化反応は１０．５
（４）至適温度：還元反応は３５〜４５℃
（５）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）が約３０，５００、ゲルろ過による分子量が約８１，５００。
〔２〕〔１〕の（１）および（２）に示す理化学的性状を有し、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、イミン還元酵素。
（ａ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔３〕式（I）で示されるイミン誘導体に、〔１〕又は〔２〕に記載のイミン還元酵素、当該イミン還元酵素を生産する微生物、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＳ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
式（Ｉ）

式（ＩＩ）

（式中、Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１〜３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１〜３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
〔４〕
式（Ｉ）で示されるイミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物の培養物、菌体、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＳ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
式（Ｉ）

式（ＩＩ）

（式中Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１〜３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１〜３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
〔５〕
式（Ｉ）の化合物が下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体であり、式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＶ）で表されるアミン誘導体である〔１〕に記載の方法。
式（ＩＩＩ）

式（ＩＶ）

（式中Ｒ基は炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）
〔６〕
式（ＩＩＩ）の化合物が２−メチル−１−ピロリンであり、式（ＩＶ）で表される化合物が、２−メチルピロリジンである〔５〕に記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法
〔７〕
微生物が、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物であることを特徴とする〔４〕から〔６〕のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
〔８〕
微生物が、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）であることを特徴とする〔４〕から〔６〕のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
〔９〕
微生物が、ストレプトマイセス・エスピー NITE P-593（Streptomyces sp. NITE P-593）であることを特徴とする〔４〕から〔６〕のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
〔１０〕
〔１〕の（１）および（２）に示す理化学的性状を有するイミン還元酵素をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
（ａ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
（ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
（ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
（ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
〔１１〕
〔１０〕に記載されたポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
〔１２〕
更に、ＮＡＤＰ＋を補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、〔１１〕に記載された組換えベクター。
〔１３〕
脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である、〔１２〕に記載のベクター。
〔１４〕
グルコース脱水素酵素がバシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）に由来する、〔１２〕に記載の組換えベクター。
〔１５〕
〔１０〕に記載されたポリヌクレオチド、または〔１２〕に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
〔１６〕
〔１５〕に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、〔１０〕に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の製造方法。

本発明により、微生物の還元能を使用したイミンの立体選択的還元により、（Ｓ）体光学活性アミンを効率的に製造する方法が提供された。また、該反応を担うイミン還元酵素が提供された。さらに、イミン還元酵素をコードするＤＮＡを単離し、当該酵素を高発現する組換え菌が提供された。本発明の方法は、安価に合成可能なイミン誘導体を基質とし、微生物の高い立体選択性を利用して、光学活性アミンが合成できるため、工業的に有利である。本発明は、特に、（Ｓ）−２−メチルピロリジンの製造に有用である。（Ｓ）−２−メチルピロリジンは、医薬品を合成するための中間体として有用な化合物である。本発明によって、当該化合物を微生物や酵素の作用によって簡便にかつ効率的に製造することが可能となった。

ストレプトマイセス sp. GF3546の１６Ｓ−ｒＤＮＡの塩基配列（配列番号：１）に基づいて作成した分子系統樹を示す図である。 ストレプトマイセス sp. GF 3546による２−メチル−１−ピロリン（２−ＭＰＮ）の還元反応の結果を示すグラフである。縦軸は（Ｓ）−２−メチルピロリジンの製造量（ｍＭ）を示し、横軸は反応時間（時間）を示す。 ストレプトマイセス sp. GF3546由来のイミン還元酵素の至適ｐＨ（還元反応）を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、最も高い活性が見られた活性値を１００とする相対活性（％）を、横軸は酵素反応液のｐＨを示す。 ストレプトマイセス sp. GF3546由来のイミン還元酵素の至適ｐＨ（酸化反応）を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、最も高い活性が見られた活性値を１００とする相対活性（％）を、横軸は酵素反応液のｐＨを示す。 ストレプトマイセス sp. GF3546由来のイミン還元酵素の至適温度（還元反応）を検討した結果を示すグラフである。縦軸は、最も高い活性が見られた活性値を１００とする相対活性（％）を、横軸は酵素反応液の温度（℃）を示す。 ストレプトマイセス sp. GF3546由来のイミン還元酵素遺伝子が挿入されたプラスミド（ｐＳＵＳ２ＭＰ１）の構築の過程を示した図である。 ストレプトマイセス sp. GF3546由来のイミン還元酵素遺伝子と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子が挿入されたプラスミド（ｐＳＧ−Ｓ２ＭＰ）の構築の過程を示した図である。

本発明は、前記式（Ｉ）で示されるイミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元しうる能力を有する微生物の培養物、菌体およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＳ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法に関する。
式（Ｉ）

式（ＩＩ）

（式中、Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１〜３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１〜３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）。

本発明において、環状イミン化合物は式（Ｉ）の化合物として好ましい。本発明において、環状イミン化合物は、たとえば下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体を含む。
式（ＩＩＩ）

（式中、Ｒ基は炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）。

上記式（ＩＩＩ）の化合物を基質として用いた場合、光学活性アミン誘導体として式（ＩＶ）に示される化合物を得ることができる。当該化合物は、本発明によって製造することができる好ましい光学活性アミン誘導体である。
式（ＩＶ）

（式中、Ｒ基は炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）。

本発明における好ましい化合物は、前記式（ＩＩＩ）において、たとえばＲがメチル基、エチル基、あるいはプロピル基であり、ｎが２〜３の化合物である。より具体的には、本発明における好ましいイミン誘導体として次の化合物を示すことができる。
２−メチル−１−ピロリン
２−メチル−１−ピペリデイン
２−エチル−１−ピロリン
２−エチル−１−ピペリデイン

これらの化合物を基質として、それぞれ以下の光学活性アミン誘導体を製造することができる。
２−メチル−１−ピロリン → （Ｓ）−２−メチルピロリジン
２−メチル−１−ピペリデイン → （Ｓ）−２−メチルピペリジン
２−エチル−１−ピロリン → （Ｓ）−２−エチルピロリジン
２−エチル−１−ピペリデイン → （Ｓ）−２−エチルピペリジン

本発明において、イミン誘導体を立体選択的に還元しうる能力とは、前記式（Ｉ）望ましくは式（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を基質として、Ｓ体のアミン誘導体を生成する能力を言う。本発明の微生物は、Ｓ体のアミン誘導体を生成しうる微生物であれば、任意の微生物を用いることができる。本発明に用いる微生物は、たとえば以下に示すような属に属する微生物について、Ｓ体のアミン誘導体を生成する能力を比較することにより得ることができる。

たとえば、化合物（Ｉ）望ましくは化合物（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を含む培地中で被験微生物を培養し、その培養物中に生成した光学活性アミン誘導体の光学純度を測定する。その結果、光学活性な（Ｓ）−アミン誘導体の生成が確認できれば、当該微生物を本発明に用いることができる。

あるいは予め培地中で増殖させた被験微生物を集菌し、適当な緩衝液中に懸濁させる。更に化合物（Ｉ）望ましくは化合物（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体と接触、反応させて、この緩衝液中に生成される光学活性アミン誘導体の光学純度を測定する。光学活性なアミン誘導体の生成が確認できれば、当該微生物を本発明に用いることができる。このとき、被験微生物の培養時に、培地中に化合物（Ｉ）望ましくは化合物（ＩＩＩ）を加えておけば、この化合物を還元するための酵素の誘導が期待できる。更に反応時に還元エネルギー源を加えておけば、より効果的な生成物の蓄積が期待できる。還元エネルギー源としては、通常、グルコースなどを用いることができる。

例えば、微生物を必要に応じて２−メチル−１−ピロリンを含む適当な培地で培養し、得られた微生物菌体を、１０ｍＭ ２−メチル−１−ピロリン、２５ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、及び必要に応じてグルコースを含む反応液に懸濁し、２５℃で２４時間振盪し、生成物をＴＬＣもしくはＨＰＬＣにより分析することにより、微生物の２−メチル−１−ピロリン還元能を確認することができる。
ＴＬＣの条件としては、例えば、Silica gel 60 F254 プレートを用い、１−ブタノール／酢酸／水＝２／１／１の展開液で展開し、ニンヒドリンにより呈色する方法が挙げられる。

生成したアミン誘導体の光学純度は、例えば以下の方法により測定することができる。
被検サンプル５０μＬに以下の成分を添加して、４０℃、１時間反応することにより生成したアミンをＧＩＴＣ化し、ＨＰＬＣにより分離し定量する。
２ｍｇ／ｍＬ トリエチルアミン ５０μＬ、および
８ｍｇ／ｍＬ ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ） １００μＬ

ＨＰＬＣの条件としては、例えば、以下のような条件を用いることができる。
−ＨＰＬＣカラム：和光純薬株式会社製 Wakosil II 5C18（4.6mmx150mm）
−溶離液：１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）：メタノール＝５５：４５
−流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
−検出：２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収
上記条件下で、（Ｒ）−２−メチルピロリジンは２６．３分に、（Ｓ）−２−メチルピロリジン誘導体は２４．９分に溶出される。

光学純度の高い生成物を得るには、より選択性の高い微生物を用いることが有利であることは言うまでも無い。具体的には、その立体選択性は、たとえば６０％、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の、光学活性なＳ体のアミン誘導体を生成しうる微生物を用いることができる。

本発明における「光学活性なアミン誘導体」とは、ある光学異性体が別の光学異性体より多く含まれるアミン誘導体を言う。本発明において、好ましい光学活性なアミン誘導体は、たとえば６０％、通常７０％以上、好ましくは８０％以上、更に好ましくは９０％以上の光学純度（enantiomeric excess；ｅｅ）を有する。光学活性なアミン誘導体の光学純度は、たとえば光学分割カラムなどを用いて確認することができる。本発明の「光学異性体」は、一般的に「光学活性体」および「鏡像異性体」（enantiomeric）と呼ばれる場合もある。

たとえばストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物は、前記式（Ｉ）で示されるイミン誘導体を還元し、Ｓ体のアミン誘導体を生成する。
さらに具体的には、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物として、次の微生物を示すことができる。この微生物は、本発明において高い光学純度の（Ｓ）アミン誘導体を生成する好ましい微生物である。
ストレプトマイセス・エスピーＧＦ３５４６（Streptomyces sp. GF3546）

上記の微生物は、次のとおり寄託されている（受託日；２００８年６月２４日）。
（１）寄託機関名：独立行政法人製品評価技術基盤機構
（２）連絡先：〒２９２−０８１８千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）識別のための表示および受託番号：
ストレプトマイセス・エスピーＧＦ３５４６（Streptomyces sp. GF3546）；受託番号 NITE P-593

さらにこれらの微生物は、ブダペスト条約に基づく国際寄託に、次のとおり移管されている。
（１）国際寄託当局：独立行政法人製品評価技術基盤機構特許微生物寄託センター
（２）住所：〒２９２−０８１８ 千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８
（３）識別の表示および受託番号
ストレプトマイセス・エスピー GF3546（Streptomyces sp. GF3546）
；受託番号 NITE BP-593 （移管日２００９年８月４日）

本発明において、前記式（Ｉ）あるいは（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を立体選択的に還元する能力を有する微生物は、これらの寄託菌株のみならず、種々の微生物資源(microbiological resource)からも見出すことができる。微生物資源には、自然環境から単離される微生物群、微生物寄託機関に保存された微生物菌株などが含まれる。中でも、ストレプトマイセス属に属する微生物は、本発明において、前記式（Ｉ）あるいは（ＩＩＩ）で示されるイミン誘導体を立体選択的に還元する能力を有する微生物として好ましい。したがって、たとえば、微生物寄託機関に保存されたストレプトマイセス属微生物を対象として、先に述べたような選択方法によって、目的の作用を有する微生物を選択することができる。寄託された微生物は、たとえば次のような寄託機関から分譲を受けることができる。
生物遺伝資源センター (NBRC)
理化学研究所 (JCM)
東京農業大学菌株保存室 (IAM)
American Type Culture Collection (ATCC)
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen (DSM)

あるいはリボソーマルＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の塩基配列情報に基づいて、本発明に利用しうる微生物を選択することもできる。一般にｒＤＮＡの塩基配列情報は、生物間の遺伝学的な近さを表す指標として有用であることが広く知られている。特に１６Ｓ ｒＲＮＡをコードするＤＮＡ（以下、「１６Ｓ ｒＤＮＡ」と記載する）は、微生物の遺伝的な同一性あるいは類似性を決定するためのツールとして活用されている。
１６Ｓ ｒＲＮＡは、全生物に存在しており、生物間で構造の違いは見られるが、アライメント可能な程度に配列が保存されている。１６Ｓ ｒＲＮＡの生物間水平伝播の頻度は低いので、分類に使用する方法が汎用されている。
具体的には、小サブユニットリボソームＲＮＡ（ＳＳＵ ｒＲＮＡ）は、タンパク質合成の場であるリボソームを構成する核酸分子の１つである。その塩基配列の長さは、多少の違いはあるものの、細菌からヒトまで起源は同じものと見なされている。したがって、ｒＲＮＡの塩基配列は進化的保存性が高く、生物の系統解析において最も頻繁に利用されている（Microbiol. Rev., 58, 1-9 (1994)）。原核生物におけるＳＳＵ ｒＲＮＡ は約１５００塩基の１６Ｓ ｒＲＮＡである。原核生物の分類と同定に１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を利用する系統分類が一般に用いられている（ASM News, 65, 752-757 (1999)、生物工学実験書ｐ１１３日本生物工学会編、培風館）。
現在の放線菌の分類体系は、１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の類似性に基づいて構成されている（Stackebrandt, et al. (1997) Int. J. Syst. Bacteriol., 47, 479-491）。菌株の同定においても、属レベルだけではなく種レベルにおいても１６Ｓ ｒＤＮＡ塩基配列の相同性に基づく同定が、細菌系統分類学の主流となっている（「放線菌の分類と同定」（日本放線菌学会）ｐ１９）。

本発明者らが見出した上記の菌株は、１６Ｓ ｒＤＮＡ中に配列番号：１に示す塩基配列を含んでいた。塩基配列情報データベースを対象として、これらの塩基配列情報を検索すれば、既に１６Ｓ ｒＤＮＡが決定された微生物の中から、その１６Ｓ ｒＤＮＡ中に同一性の高い塩基配列を含む菌株を見つけ出すことができる。たとえばDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）などの公共データベースサービス機関では、１６Ｓ ｒＲＮＡ（Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ）の塩基配列情報を対象とする検索サービスが提供されている。こうして見出された微生物のうち、特にストレプトマイセス属に属する微生物を選択することによって、本発明に利用しうる微生物とすることができる。必要に応じ、こうして選択された微生物のイミン誘導体に対する作用を予め確認することもできる。

これら微生物は、醗酵学の分野で公知の方法に従って培養することができる。培地としては炭素源、窒素源、無機物およびその他の栄養素を適量含有する培地ならば、合成培地または天然培地のいずれでも使用することができる。培地は、液体培地または固体培地を使用することができる。
具体的には、炭素源として、次に示すような一般的な炭素源より、使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
糖類： 天然炭水化物：
グルコース、 澱粉、
フルクトース、 澱粉加水分解物、
マルトース、 糖蜜、
ガラクトース、 廃糖蜜、
麦、
とうもろこしなど
アルコール類： 有機酸類：
グリセロール、 酢酸、
メタノール、 グルコン酸、
エタノールなど ピルビン酸、
ケトグルタル酸、
クエン酸など
炭化水素類：
ノルマルパラフィンなど
脂肪類：
パーム核油、
大豆油、
オリーブ油など

窒素源としては、次に示すような一般的な窒素源の中から、使用する微生物の資化性を考慮して、適宜一種または二種以上選択して使用する。
有機窒素化合物：
肉エキス、 ペプトン、 酵母エキス、
大豆加水分解物、 ミルクカゼイン、 カザミノ酸、
各種アミノ酸、 コーンスティープリカー、
その他の動物、植物、微生物の加水分解物など
無機窒素化合物：
アンモニア、 硝酸アンモニウム、 硫酸アンモニウム、
塩化ナトリウムなどのアンモニウム塩、
硝酸ナトリウムなどの硝酸塩、尿素など

また、微生物のイミン誘導体の立体選択的還元能力を高めるために、誘導物質を用いることができる。誘導物質としては、イミン誘導体を、使用する微生物に応じて使用することができる。
さらに、無機塩として微量のマグネシウム、マンガン、カリウム、カルシウム、ナトリウム、銅、亜鉛などのリン酸塩、塩酸塩、硝酸塩、酢酸塩等より適宜一種または二種以上を選択して使用することができる。また、必要に応じて植物油、界面活性剤、シリコンなどの消泡剤を培養液中に添加してもよい。

培養は前記培地成分を含有する液体培地中で通常の培養方法を用いて行うことができる。たとえば次のような培養方法を利用することができる。
振とう培養 (shaking culture)
通気攪拌培養 (aeration-agitation culture)
連続培養 (continuous culture)
流加培養(feeding culture, fed batch culture)

培養条件は、微生物の種類、培養の種類、培養方法により適宜選択することができる。利用する菌株が増殖し、イミン誘導体の立体選択的還元能力を有しうる条件であれば特に制限はない。一般的な培養条件として次のような条件を示すことができる。
培養開始時のｐＨを４から１０、好ましくは６から８に調節
１５から７０℃、好ましくは２０から４０℃の温度条件下で培養
培養時間はイミン誘導体の還元能力を有する菌体が得ることができれば特に制限されない。通常は１日から１４日、好ましくは１日から７日培養する。

本発明において、微生物菌体の処理物とは、菌体を目的とする酵素活性が維持される条件で処理したものを意味する。酵素活性の維持とは、生菌体で得られる酵素活性の一般的には２０％以上、通常３０％以上、好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上の活性を維持することを言う。生菌体とその処理物の酵素活性は、生菌体の酵素活性と、同量の生菌体から得られた処理物の酵素活性を比較することによって定量的に比較することができる。本発明における処理物は、生菌体よりも高い酵素活性を有する場合もある。

このような処理物を得る方法としては、凍結乾燥、有機溶媒による脱水乾燥、菌体の自己消化、酵素活性画分の抽出、超音波処理などを利用することができる。このような処理方法によって、例えば、凍結乾燥菌体、アセトン乾燥菌体、菌体自己消化物、菌体抽出物、菌体磨砕物、菌体の超音波処理物等を得ることができる。

これらの処理は、単独で、あるいは複数の処理を重複して適用することもできる。たとえば適当な培養液で微生物を培養後、菌体を破砕して、遠心分離等により無細胞抽出液を調製することができる。菌体は、機械的な破砕、超音波、高圧処理、酵素消化、自己消化などにより破砕することができる。無細胞抽出液は本発明における菌体の処理物に含まれる。

更に本発明においては、当該菌体から当該反応を触媒する酵素を部分精製したものや完全に精製したものなどを得ることができる。すなわち本発明は、本発明によって提供されたイミン還元酵素活性を有する微生物の菌体から精製することができるイミン還元酵素に関する。本発明のイミン還元酵素は、次の（１）〜（２）に示す理化学的性状を有する。
（１）作用：ＮＡＤＰＨ依存的に、２−メチル−１−ピロリンを還元し、（Ｓ）−２−メチルピロリジンを生成する。ＮＡＤＰ＋依存的に、（Ｓ）−２−メチルピロリジンを酸化し、２−メチル−１−ピロリンを生成する；、および
（２）補酵素依存性：還元反応の補酵素としてＮＡＤＰＨを利用する。酸化反応の補酵素としてＮＡＤＰ＋を利用する。

本発明者らが見出したイミン還元酵素は、好ましい態様において、前記性状（１）〜（２）に加えて、更に次の理化学的性状を有する。このようなイミン還元酵素は、たとえばストレプトマイセス・エスピーＧＦ３５４６から得ることができる。
（３）至適ｐＨ：還元反応は７．４〜８．０、酸化反応は１０．５
（４）至適温度：還元反応は３５〜４５℃
（５）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）が約３０，５００、ゲルろ過による分子量が約８１，５００。

本発明のイミン還元酵素は、上記微生物、あるいはその無細胞抽出液などから精製することができる。具体的には、次のような精製工程を適宜組み合わせることによって、無細胞抽出液から実質的に純粋なイミン還元酵素を得ることができる。
硫安、アセトンなどを用いた溶解度による分割、
イオン交換クロマトグラフィー、
疎水クロマトグラフィー、
２’，５’−ＡＤＰセファロースやブルーもしくはレッドセファロースなどを用いたアフィニティクロマトグラフィー、
ゲル濾過

例えば、微生物を集菌後、次のような精製工程を経て、本発明のイミン還元酵素を実質的な純粋な酵素として単離することができる。
超音波あるいはガラスビーズによる菌体の破砕と無細胞抽出液の調製、
Ｐｈｅｎｙｌ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを用いた疎水クロマトグラフィー、および
ＭｏｎｏＱを用いたイオン交換クロマトクロマトグラフィーによるイミン還元酵素活性分画の単離

本発明において、「実質的に純粋」とは、当該酵素が、当該酵素以外の生物学的な高分子化合物や化学物質を実質的に含まないことを言う。当該酵素以外の生物学的な高分子化合物とは、たとえば菌体や培養液に由来するタンパク、糖類、脂質、核酸類が含まれる。本発明における実質的に純粋な酵素は、少なくとも７５％以上、通常８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、更に好ましくは９５％以上、あるいは９９％以上の純度を有する。酵素の純度を決定する方法は公知である。たとえば、各種のクロマトグラフィーや、ポリアクリルアミドゲル電気泳動などによって蛋白質の純度を決定する方法が周知である。

あるいは本発明によって、上記理化学的性状（１）（２）を有する単離されたイミン還元酵素が提供される。本発明において、単離されたイミン還元酵素とは、それが存在する天然の環境から分離されて存在していることを意味する。したがって、菌体から分離されたイミン還元酵素は、本発明における単離されたイミン還元酵素に含まれる。

本発明における実質的に純粋なイミン還元酵素、あるいは単離されたイミン還元酵素は、精製、あるいは単離された後に、酵素組成物とすることもできる。たとえば、精製、あるいは単離されたイミン還元酵素を適当な担体と配合することによって、本発明のイミン還元酵素を含む酵素組成物を調製することができる。担体としては、アルブミンなどの不活性蛋白質、ショ糖などの糖類あるいは糖アルコールなどを利用することができる。酵素組成物は、液状であることもできるし、乾燥状態であることもできる。酵素と担体を含む水溶液を凍結乾燥することによって得られる酵素組成物は、本発明における好ましい組成物の一つである。

本発明のイミン還元酵素は、以下の方法によりその活性を定量することができる。すなわち、次の組成の反応液中（１ｍＬ）で、３０℃で反応を行い、ＮＡＤＰＨの減少に由来する３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。
１０ｍＭ ２−メチル−１−ピロリン、
１００ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）、
０．１ｍＭ ＮＡＤＰＨ及び
酵素
１Ｕは、上記条件下、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とした。

本発明は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。本発明のイミン還元酵素のホモログとは、配列番号：３に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、たとえば１００以下、通常５０以下、好ましくは３０以下、より好ましくは１５以下、更に好ましくは１０以下、あるいは５以下のアミノ酸残基の変異は許容される。

本発明は、イミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドおよびそのホモログに関する。本発明において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡやＲＮＡ等の天然のポリヌクレオチドに加え、人工的なヌクレオチド誘導体を含む人工的な分子であることもできる。また本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡ−ＲＮＡのキメラ分子であることもできる。本発明のイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば配列番号：２に示す塩基配列を含む。配列番号：２に示す塩基配列は、配列番号：３に示すアミノ酸配列を含むタンパク質をコードしており、このアミノ酸配列を含むタンパク質は、本発明によるイミン還元酵素の好ましい態様を構成する。

本発明のイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドのホモログとは、配列番号：３に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列を含み、かつ、前記理化学的性質（１）〜（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。当業者であれば、配列番号：２に記載のポリヌクレオチドに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991)）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりポリヌクレオチドのホモログを得ることが可能である。

また、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドであって、かつ、前記理化学的性質（１）〜（２）を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドも含む。ストリンジェントな条件でハイブリダイズできるポリヌクレオチドとは、配列番号：２に記載中の任意の少なくとも２０個、好ましくは少なくとも３０個、たとえば４０、６０または１００個の連続した配列を一つまたは複数選択したＤＮＡをプローブＤＮＡとし、たとえばECL direct nucleic acid labeling and detection system （ＧＥヘルスケア社製）を用いて、マニュアルに記載の条件（wash:42℃、0.5xSSCを含むprimary wash buffer)においてハイブリダイズするポリヌクレオチドを指す。

さらに、本発明におけるポリヌクレオチドのホモログは、配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上の同一性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。タンパク質の同一性検索は、たとえばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を基にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。

本発明は、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質に関する。本発明はまた、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質のホモログを含む。本発明のイミン還元酵素のホモログとは、配列番号：３に記載のアミノ酸配列に１もしくは複数のアミノ酸が欠失、置換、挿入および／または付加されたアミノ酸配列からなり、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等なタンパク質を意味する。本発明において、配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と機能的に同等とは、当該タンパク質が前記（１）〜（２）に示した物理化学的性状を有することを意味する。当業者であれば、配列番号：２記載のＤＮＡに部位特異的変異導入法（Nucleic Acid Res. 10,pp.6487 (1982) , Methods in Enzymol.100,pp.448 (1983), Molecular Cloning 2ndEdt., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989) , PCR A Practical Approach IRL Press pp.200 (1991)）などを用いて、適宜置換、欠失、挿入、および／または付加変異を導入することによりイミン還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。そのイミン還元酵素のホモログをコードするポリヌクレオチドを宿主に導入して発現させることにより、配列番号：３に記載のイミン還元酵素のホモログを得ることが可能である。

さらに、本発明のイミン還元酵素のホモログとは、配列番号：３に示されるアミノ酸配列と少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは９０％以上の同一性を有するタンパク質をいう。タンパク質の同一性検索は、たとえばＳＷＩＳＳ−ＰＲＯＴ、ＰＩＲ、ＤＡＤなどのタンパク質のアミノ酸配列に関するデータベースやＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、あるいはＧｅｎｅ−ＢａｎｋなどのＤＮＡ配列に関するデータベース、ＤＮＡ配列を基にした予想アミノ酸配列に関するデータベースなどを対象に、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなどのプログラムを利用して、例えば、インターネットを通じて行うことができる。

本発明のイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドは、たとえば、以下のような方法によって単離することができる。

配列番号：２に記載の塩基配列を基にＰＣＲ用のプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡもしくは、ｃＤＮＡライブラリーを鋳型としてＰＣＲを行うことにより本発明のＤＮＡを得ることができる。

さらに、得られたＤＮＡ断片をプローブとして、酵素生産株の染色体ＤＮＡの制限酵素消化物をファージ、プラスミドなどに導入し、大腸菌を形質転換して得られたライブラリーやｃＤＮＡライブラリーを利用して、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーションなどにより、本発明のポリヌクレオチドを得ることができる。

また、ＰＣＲにより得られたＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、得られた配列から、既知のＤＮＡの外側に伸長させるためのＰＣＲプライマーを設計し、酵素生産株の染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で消化後、自己環化反応によりＤＮＡを鋳型として逆ＰＣＲを行うことにより（Genetics 120, 621-623 (1988)）、また、ＲＡＣＥ法（Rapid Amplification of cDNA End、「ＰＣＲ実験マニュアル」ｐ２５−３３、ＨＢＪ出版局）などにより本発明のポリヌクレオチドを得ることも可能である。

なお本発明のポリヌクレオチドには、以上のような方法によってクローニングされたゲノムＤＮＡ、あるいはｃＤＮＡの他、合成によって得られたＤＮＡが含まれる。
このようにして単離された、本発明によるイミン還元酵素をコードするポリヌクレオチドを公知の発現ベクターに挿入することにより、イミン還元酵素発現ベクターが提供される。

また、この発現ベクターで形質転換した形質転換体を培養することにより、本発明のイミン還元酵素を組換え体から得ることができる。

本発明においてイミン還元酵素を発現させるために、形質転換の対象となる微生物は、イミン還元酵素を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えベクターにより形質転換され、イミン還元酵素活性を発現することができる生物であれば特に制限はない。利用可能な微生物としては、たとえば以下のような微生物を示すことができる。

エシェリヒア（Escherichia）属
バチルス（Bacillus）属
シュードモナス（Pseudomonas）属
セラチア（Serratia）属
ブレビバクテリウム（Brevibacterium）属
コリネバクテリイウム（Corynebacterium）属
ストレプトコッカス（Streptococcus）属
ラクトバチルス（Lactobacillus）属など宿主ベクター系の開発されている細菌
ロドコッカス（Rhodococcus）属
ストレプトマイセス（Streptomyces）属など宿主ベクター系の開発されている放線菌
サッカロマイセス（Saccharomyces）属
クライベロマイセス（Kluyveromyces）属
シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属
チゴサッカロマイセス（Zygosaccharomyces）属
ヤロウイア（Yarrowia）属
トリコスポロン（Trichosporon）属
ロドスポリジウム（Rhodosporidium）属
ピキア（Pichia）属
キャンディダ（Candida）属などの宿主ベクター系の開発されている酵母
ノイロスポラ（Neurospora）属
アスペルギルス（Aspergillus）属
セファロスポリウム（Cephalosporium）属
トリコデルマ（Trichoderma）属などの宿主ベクター系の開発されているカビ

形質転換体の作製のための手順および宿主に適合した組み換えベクターの構築は、分子生物学、生物工学、遺伝子工学の分野において慣用されている技術に準じて行うことができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、モレキュラー・クローニング、Cold Spring Harbor Laboratories）。微生物中などにおいて、本発明のＮＡＤＰＨを電子供与体とするイミン還元酵素遺伝子を発現させるためには、まず微生物中において安定に存在するプラスミドベクターやファージベクター中にこのＤＮＡを導入し、その遺伝情報を転写・翻訳させる必要がある。

そのためには、転写・翻訳を制御するユニットにあたるプロモーターを本発明のＤＮＡ鎖の５’−側上流に、より好ましくはターミネーターを３’−側下流に、それぞれ組み込めばよい。このプロモーター、ターミネーターとしては、宿主として利用する微生物中において機能することが知られているプロモーター、ターミネーターを用いる必要がある。これら各種微生物において利用可能なベクター、プロモーター、ターミネーターなどに関して「微生物学基礎講座８遺伝子工学・共立出版」、特に酵母に関しては、Adv. Biochem. Eng. 43, 75-102 (1990)、Yeast 8, 423-488 (1992)、などに詳細に記述されている。

例えば、エシェリヒア属、特に大腸菌エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）においては、プラスミドベクターとして、ｐＢＲ、ｐＵＣ系プラスミドを利用でき、ｌａｃ（β−ガラクトシダーゼ）、ｔｒｐ（トリプトファンオペロン）、ｔａｃ、ｔｒｃ（ｌａｃ、ｔｒｐの融合）、λファージＰＬ、ＰＲなどに由来するプロモーターなどが利用できる。また、ターミネーターとしては、ｔｒｐＡ由来、ファージ由来、ｒｒｎＢリボソーマルＲＮＡ由来のターミネーターなどを用いることができる。これらの中で、市販のｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）のマルチクローニングサイトを一部改変したベクターｐＳＥ４２０Ｄ（特開２０００−１８９１７０に記載）が好適に利用できる。

バチルス属においては、ベクターとしてｐＵＢ１１０系プラスミド、ｐＣ１９４系プラスミドなどが利用可能であり、染色体にインテグレートすることもできる。また、プロモーター、ターミネーターとしてａｐｒ（アルカリプロテアーゼ）、ｎｐｒ（中性プロテアーゼ）、ａｍｙ（α−アミラーゼ）などが利用できる。

シュードモナス属においては、シュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）、シュードモナス・セパシア（Pseudomonas cepacia）などで宿主ベクター系が開発されている。トルエン化合物の分解に関与するプラスミドＴＯＬプラスミドを基本にした広宿主域ベクター（ＲＳＦ１０１０などに由来する自律的複製に必要な遺伝子を含む）ｐＫＴ２４０などが利用可能であり、プロモーター、ターミネーターとして、リパーゼ（特開平５−２８４９７３）遺伝子などが利用できる。

ブレビバクテリウム属特に、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム（Brevibacterium lactofermentum）においては、ｐＡＪ４３（Gene 39, 281 (1985)）などのプラスミドベクターが利用可能である。プロモーター、ターミネーターとしては、大腸菌で使用されているプロモーター、ターミネーターがそのまま利用可能である。

コリネバクテリウム属、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）においては、ｐＣＳ１１（特開昭５７−１８３７９９）、ｐＣＢ１０１（Mol. Gen. Genet. 196, 175 (1984)などのプラスミドベクターが利用可能である。

ストレプトコッカス（Streptococcus）属においては、ｐＨＶ１３０１（FEMS Microbiol. Lett. 26, 239 (1985)、ｐＧＫ１（Appl. Environ. Microbiol. 50, 94 (1985)）などがプラスミドベクターとして利用可能である。

ラクトバチルス（Lactobacillus）属においては、ストレプトコッカス属用に開発されたｐＡＭβ１（J. Bacteriol. 137, 614 (1979)）などが利用可能であり、プロモーターとして大腸菌で利用されているものが利用可能である。

ロドコッカス（Rhodococcus）属においては、ロドコッカス・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）から単離されたプラスミドベクターが使用可能である（J. Gen. Microbiol. 138,1003 (1992)）。

ストレプトマイセス（Streptomyces）属においては、ＨｏｐｗｏｏｄらのGenetic Manipulation of Streptomyces: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratories (1985)に記載の方法に従って、プラスミドを構築することができる。特に、ストレプトマイセス・リビダンス（Streptomyces lividans）においては、ｐＩＪ４８６（Mol. Gen. Genet. 203, 468-478, 1986）、ｐＫＣ１０６４（Gene 103,97-99 (1991)）、ｐＵＷＬ−ＫＳ（Gene 165,149-150 (1995)）が使用できる。また、ストレプトマイセス・バージニア（Streptomyces virginiae）においても、同様のプラスミドを使用することができる（Actinomycetol. 11, 46-53 (1997)）。

サッカロマイセス（Saccharomyces）属、特にサッカロマイセス・セレビジアエ（Saccharomyces cerevisiae）においては、ＹＲｐ系、ＹＥｐ系、ＹＣｐ系、ＹＩｐ系プラスミドが利用可能であり、染色体内に多コピー存在するリボソームＤＮＡとの相同組み換えを利用したインテグレーションベクター（ＥＰ５３７４５６など）は、多コピーで遺伝子を導入でき、かつ安定に遺伝子を保持できるため極めて有用である。また、ＡＤＨ（アルコール脱水素酵素）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）、ＰＨＯ（酸性フォスファターゼ）、ＧＡＬ（β−ガラクトシダーゼ）、ＰＧＫ（ホスホグリセレートキナーゼ）、ＥＮＯ（エノラーゼ）などのプロモーター、ターミネーターが利用可能である。

クライベロマイセス属、特にクライベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）においては、サッカロマイセス・セレビジアエ由来２μｍ系プラスミド、ｐＫＤ１系プラスミド（J. Bacteriol. 145, 382-390 (1981)）、キラー活性に関与するｐＧＫｌ１由来プラスミド、クライベロマイセス属における自律増殖遺伝子ＫＡＲＳ系プラスミド、リボソームＤＮＡなどとの相同組み換えにより染色体中にインテグレート可能なベクタープラスミド（ＥＰ ５３７４５６など）などが利用可能である。また、ＡＤＨ、ＰＧＫなどに由来するプロモーター、ターミネーターが利用可能である。

シゾサッカロマイセス（Schizosaccharomyces）属においては、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＲＳ（自律複製に関与する遺伝子）及びサッカロマイセス・セレビジアエ由来の栄養要求性を相補する選択マーカーを含むプラスミドベクターが利用可能である（Mol. Cell. Biol. 6, 80 (1986)）。また、シゾサッカロマイセス・ポンベ由来のＡＤＨプロモーターなどが利用できる（EMBO J. 6, 729 (1987)）。特に、ｐＡＵＲ２２４は、タカラバイオから市販されており容易に利用できる。

チゴサッカロマイセス属（Zygosaccharomyces）においては、チゴサッカロマイセス・ロウキシ（Zygosaccharomyces rouxii）由来のｐＳＢ３（Nucleic Acids Res. 13, 4267 (1985)）などに由来するプラスミドベクターが利用可能であり、サッカロマイセス・セレビジアエ由来ＰＨＯ５プロモーターや、チゴサッカロマイセス・ロウキシ由来ＧＡＰ−Ｚｒ（グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素）のプロモーター（Agri. Biol. Chem. 54, 2521 (1990)）などが利用可能である。

ピキア（Pichia）属においては、ピキア・アンガスタ（旧名：ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha））において宿主ベクター系が開発されている。ベクターとしては、ピキア・アンガスタ由来自律複製に関与する遺伝子（ＨＡＲＳ１、ＨＡＲＳ２）も利用可能であるが、比較的不安定であるため、染色体への多コピーインテグレーションが有効である（Yeast 7, 431-443 (1991)）。また、メタノールなどで誘導されるＡＯＸ（アルコールオキシダーゼ）、ＦＤＨ（ギ酸脱水素酵素）のプロモーターなどが利用可能である。また、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）などにピキア由来自律複製に関与する遺伝子（ＰＡＲＳ１、ＰＡＲＳ２）などを利用した宿主ベクター系が開発されており（Mol. Cell. Biol. 5, 3376 (1985)）、高濃度培養とメタノールで誘導可能なＡＯＸなど強いプロモーターが利用できる（Nucleic Acids Res. 15, 3859 (1987)）。

キャンディダ（Candida）属においては、キャンディダ・マルトーサ（Candida maltosa)、キャンディダ・アルビカンス(Candida albicans）、キャンディダ・トロピカリス（Candida tropicalis）、キャンディダ・ウチルス（Candida utilis）などにおいて宿主ベクター系が開発されている。キャンディダ・マルトーサにおいてはキャンディダ・マルトーサ由来ＡＲＳがクローニングされ（Agri. Biol. Chem. 51, 51, 1587 (1987)）、これを利用したベクターが開発されている。また、キャンディダ・ウチルスにおいては、染色体インテグレートタイプのベクターは強力なプロモーターが開発されている（特開平０８−１７３１７０）。

アスペルギルス（Aspergillus）属においては、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリジー（Aspergillus oryzae）などがカビの中で最もよく研究されており、プラスミドや染色体へのインテグレーションが利用可能であり、菌体外プロテアーゼやアミラーゼ由来のプロモーターが利用可能である（Trends in Biotechnology 7, 283-287 (1989)）。

トリコデルマ（Trichoderma）属においては、トリコデルマ・リーゼイ（Trichoderma reesei）を利用したホストベクター系が開発され、菌体外セルラーゼ遺伝子由来プロモーターなどが利用できる（Biotechnology 7, 596-603 (1989)）。

また、微生物以外でも、植物、動物において様々な宿主・ベクター系が開発されており、特に蚕を用いた昆虫（Nature 315, 592-594 (1985)）や菜種、トウモロコシ、ジャガイモなどの植物中に大量に異種タンパク質を発現させる系が開発されており、好適に利用できる。

本発明において使用するイミン還元酵素生産能を有する微生物は、イミン還元酵素生産能を有するストレプトマイセス属に属するすべての菌株、突然変異株、変種、遺伝子操作技術の利用により作成された本発明の酵素生産能を獲得した形質転換株を含む。

本発明の光学活性アミン誘導体の製造方法は、式（Ｉ）あるいは式（ＩＩＩ）で示される基質化合物を立体選択的に還元する能力を有するイミン還元酵素活性を有する酵素活性物質を、この酵素活性物質によって当該基質化合物の還元が可能な条件下で当該基質化合物に接触させる工程を含む。本発明において、酵素活性物質（enzymatic active materials）とは、式（Ｉ）あるいは式（ＩＩＩ）で示される基質化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物に由来する物質であって、その能力が維持された物質を意味する。具体的には、たとえば次のような要素は、イミン還元酵素活性を維持する限り、本発明における酵素活性物質に含まれる。
i) 式（Ｉ）あるいは式（ＩＩＩ）で示される基質化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物
ii) i)の微生物菌体の培養物
iii) i)の微生物菌体の処理物

本発明において、微生物は、培養物であることもできるし、菌体であることもできる。培養物は、微生物の生存と増殖を支持する培地とともに当該微生物が存在する状態を言う。たとえば微生物を含む液体培地は、培養物である。一方、本発明においては、微生物そのものを指す用語として「菌体」（microbial cell）を用いる。菌体は、培養物から回収された微生物細胞を指す。たとえば遠心分離によって液体培地から微生物の菌体を回収することができる。培養物から回収された菌体を洗浄することによって、菌体表面の培地成分を除くこともできる。

本発明において酵素活性物質は、そのまま、あるいは固定化して基質化合物と接触させることができる。微生物菌体あるいはその処理物を固定化するための種々の方法が公知である。たとえば、以下のような方法が微生物やその処理物の固定化方法として公知である。
ポリアクリルアミド法
含硫多糖ゲル法（κ−カラギーナンゲル法など）
アルギン酸ゲル法
寒天ゲル法
イオン交換樹脂法
あるいは、限外濾過膜等を用いたメンブレンバイオリアクター中で、微生物、その処理物、を基質化合物と接触させて反応させることもできる。

本発明における微生物による立体選択的なイミンの還元反応は、微生物を酵素が誘導される適切な前記培養条件において培養を行い、得られた培養液、あるいは培養液から採取した菌体や該菌体処理物に反応基質であるイミン誘導体を加えて、インキュベートすることにより行うことができる。また、前記微生物の培養開始時、もしくは、培養途中に基質となるイミン誘導体を添加して、培養しながらイミンの立体選択的還元反応を行うこともできる。

本発明における微生物による立体選択的還元方法は、微生物を酵素が誘導される適切な前記培養条件において培養を行い、得られた培養液、あるいは培養液から採取した菌体や該菌体処理物に反応基質を加えて、立体選択的還元反応を行うことができる。また、前記培養条件と同じｐＨ、温度範囲で、１日から７日間、培養と並行しても行うことができる。
反応条件としては、たとえば以下の条件を示すことができる。
ｐＨ４．０から９．０、好ましくはｐＨ６．０から８．０、
温度１５から５０℃、好ましくは２０から４０℃、
反応時間は、４時間から７日間接触させる。
一般に、微生物の培養と反応とを、別に行った方が、培地中の不純物の反応系への持ち込みを最小限に抑えることができる。その結果、反応後の生成物の精製において、有利な結果を生むことが期待できる。

また酵素的還元反応においては、還元エネルギー源として、糖類などの存在下で反応を行うことにより、さらに効率的な反応が期待できる。還元エネルギー源として添加する化合物は、反応基質であるイミン誘導体量に応じて添加することができる。より具体的には、次のような還元エネルギー源を利用することができる。
糖類：グルコース、グルコース−６−リン酸、スクロースなど
有機酸：リンゴ酸、クエン酸、ギ酸など
アミノ酸：アラニン、グルタミン酸、リジンなど
アルコール：エタノール、イソプロパノールなど
その他、亜リン酸など無機化合物を還元エネルギー源として利用できる場合もある。

本発明における還元反応は、水素供与体の存在下で進行する。したがって、本発明における基質化合物の還元が可能な条件は、水素供与体の存在下で、基質化合物と酵素活性物質とをインキュベートすることによって提供することができる。本発明における還元反応を助けるものであれば、任意の水素供与体を利用することができる。本発明における好ましい水素供与体は、ＮＡＤＰＨあるいはＮＡＤＨである。本発明者らが単離に成功したストレプトマイセス・エスピーＧＦ３５４６に由来するイミン還元酵素、およびそのホモログ、あるいは酵素活性物質を利用する場合には、ＮＡＤＰＨを利用するのが好ましい。

上記還元反応に付随してＮＡＤＰＨから生成するＮＡＤＰ＋のＮＡＤＰＨへの再生は、微生物の持つＮＡＤＰ＋還元能（解糖系、メチロトローフのＣ１化合物資化経路など）を用いて行うことができる。これらＮＡＤＰ＋還元能は、反応系にグルコースやエタノール、などを添加することにより増強することが可能である。また、ＮＡＤＰ＋からＮＡＤＰＨを生成する能力を有する微生物やその処理物、酵素を反応系に添加することによっても行うことができる。たとえば、グルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などを含む微生物、その処理物、ならびに部分精製もしくは精製酵素を用いてＮＡＤＰＨの再生を行うことができる。これらのＮＡＤＰＨ再生に必要な反応を構成する成分は、本発明による光学活性アミンの製造のための反応系に添加する、固定化したものを添加する、あるいはＮＡＤＰＨの交換が可能な膜を介して接触させることができる。

また、本発明のＤＮＡを含む組換えベクターで形質転換した微生物の生菌体を前記光学活性アミンの製造方法に利用する場合には、ＮＡＤＰＨ再生のための付加的な反応系を不要とできる場合がある。すなわち、ＮＡＤＰＨ再生活性の高い微生物を用いることにより、形質転換体を用いた還元反応において、ＮＡＤＰＨ再生用の酵素を添加することなく効率的な反応が行える。さらに、ＮＡＤＰＨ再生に利用可能なグルコース脱水素酵素、アルコール脱水素酵素、アミノ酸脱水素酵素、有機酸脱水素酵素（リンゴ酸脱水素酵素など）などの遺伝子を、本発明のイミン還元酵素をコードするＤＮＡと同時に宿主に導入することによって、より効率的なＮＡＤＰＨ再生酵素とイミン還元酵素の同時発現、イミン還元反応を行うことも可能である。これらの２つもしくはそれ以上の遺伝子の宿主への導入には、不和合性を避けるために複製起源のことなる複数のベクターに別々に遺伝子を導入した組換えベクターにより宿主を形質転換する方法や、単一のベクターに両遺伝子を導入する方法、両方、もしくは、片方の遺伝子を染色体中に導入する方法などを利用することができる。

単一のベクター中に複数の遺伝子を導入する場合には、プロモーター、ターミネーターなど発現制御に関わる領域をそれぞれの遺伝子に連結する方法やラクトースオペロンのような複数のシストロンを含むオペロンとして発現させることも可能である。
例えば、ＮＡＤＰＨ再生用酵素として、バシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）やサーモプラズマ・アシドフィラム（Thermoplasma acidophilum）に由来するグルコース脱水素酵素が利用可能であり、具体的には、イミン還元酵素とバシラス・サブチリス由来のグルコース脱水素酵素の遺伝子を導入した組換えベクターであるｐＳＧ−Ｓ２ＭＰなどが好適に利用される。

アミン誘導体の分解に伴って、反応液のｐＨに変化が見られる場合には、適当な酸、アルカリを用いてｐＨを一定範囲に調節することで、さらに良好な反応性を維持して、反応を継続することもできる。

本発明において生菌体を使用した場合、反応液中に界面活性剤を添加しておけば反応時間の短縮を期待できる場合がある。この目的に用いられる界面活性剤としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるものであれば特に制限はなく、臭化セチルピリミジウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、トリトンＸ−１００、パライソオクチルフェニルエーテル、トゥイーン８０、スパン６０等があげられ、反応液に対して、０．０００１〜１％程度使用することが好ましい。
また、反応液中に有機溶媒を添加することによっても、同様の効果を期待でき場合がある。この目的に用いられる界面活性剤としては、生菌体の細胞壁の透過性をあげるものであれば特に制限はなく、トルエン、キシレンなどの有機溶媒があげられ、反応液に対して、０．０００１〜１％程度使用することが好ましい。
また、反応液に添加せずとも、菌体を集菌後、界面活性剤および有機溶媒を含む水もしくはバッファーで前処理することにより、細胞壁の透過性を上げた菌体を用いてもよい。

本発明における反応基質であるイミン誘導体は、目的とする生成物を効率的に生成できるように、適切な濃度で用いることができる。イミン誘導体は、菌体および当該反応を触媒する酵素に対して毒性を有することがあり、必ずしも高濃度反応が効率的な生産に結びつかないことがあり、注意を要する。イミン誘導体の反応液中における濃度として、たとえば０．０５から５０％ｗ／ｖ、好ましくは０．１から１０％ｗ／ｖを示すことができる。イミン誘導体は、一括（バッチ法）、分割添加（フェドバッチ法）あるいは連続添加（フィード法）等の任意の方法で添加することができる。更に、基質となるイミンを添加せず、イミンの原料となるケトンとアミンを反応液に添加し、反応液中でイミンを生成させ、基質として供給することもできる。

添加されるイミン誘導体は、不活性ガス雰囲気下で扱うことによって、着色が抑制され、製品品質の向上が期待できる。このような効果を期待して、反応液を不活性ガス雰囲気下で原料を反応液に添加することもできる。更に酵素反応をも不活性化ガス雰囲気下で行うことによって、着色を防ぐことができる。ここで使用する不活性ガスとしては、たとえば窒素、アルゴン、ヘリウムなどが使用できる。特に窒素は、容易に入手することができる不活性ガスである。あるいは、アルゴンは空気よりも比重が大きいため、容易に拡散しない。したがって、開放作業においても、不活性化ガス雰囲気下環境を維持できることから、操作上有利である。

本発明は、基質化合物と酵素活性物質との接触によって得られた光学活性アミン誘導体を回収する工程を含む。具体的には、イミン誘導体の立体選択的還元により、光学活性なアミン誘導体は、各種クロマトグラフィーや結晶化などを組み合わせることにより、反応液から単離することができる。
反応液中に蓄積された光学活性アミン誘導体は、たとえば次のような溶媒で抽出することができる。
酢酸エチル、
酢酸ブチル、
トルエン、
キシレン、
ヘキサン、
ヘプタン、
メチルイソブチルケトン、
メチル−ｔ−ブチルエーテル、
ハロゲン系などの有機溶媒

そして抽出されたアミン誘導体は、以下のようなクロマトグラフィーによって更に精製することができる。精製に先立って、必要に応じて、酸やアルカリによる洗浄、脱水剤による脱水などの処理を組み合わせることもできる。
イオン交換クロマトグラフィー、
吸着クロマトグラフィー

たとえば、反応液から遠心分離によって、菌体などの不溶性物質を除去した後、アルカリ条件下で溶媒抽出後、減圧濃縮することにより、光学活性アミン誘導体を採取することができる。
菌体などの不溶性物質を除去した液を、アミン誘導体を吸着できるイオン交換樹脂などに吸着させ、アンモニア水や水酸化ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウムメタノール溶液、水酸化ナトリウムエタノール溶液などのアルカリで溶出させれば、簡便に高濃度溶液を得ることができる。
また、菌体などの不溶性物質を除去した液を、アミン誘導体を吸着できるイオン交換樹脂などに吸着させ、アンモニア水や水酸化ナトリウム水溶液、水酸化ナトリウムメタノール溶液、水酸化ナトリウムエタノール溶液などのアルカリで溶出させれば、簡便に高濃度溶液を得ることができる。
また、溶媒抽出後、塩酸で塩酸塩化することにより、光学活性アミン誘導体を結晶として採取することができる。回収率を高めるために、溶媒を減圧濃縮しておいてもよく、あるいは溶媒を結晶性のよい溶媒に置換しておくこともできる。
また、回収率を高めるために、溶媒を減圧濃縮することもできるあるいは溶媒を結晶性のよい溶媒に置換しておくこともできる。

あるいは、光学活性アミン誘導体を、酸との塩の結晶として採取することにより、その光学純度を高めることができる場合がある。溶媒抽出後、塩酸で塩酸塩化することにより、光学活性アミン誘導体を結晶として採取することができる。塩を精製する酸としては、塩酸、硫酸などの鉱酸、あるいはマンデル酸、クエン酸、酒石酸などの有機酸を利用することができる。こうして得られたアミン誘導体の塩を、強酸あるいは強アルカリに溶解した後、適当なアルカリもしくは酸で、ｐＨを中性付近とし、中和晶析することで、容易に他の不純物と分離することができる。アミン誘導体の塩を溶解する強酸性水溶液には、たとえば塩酸、硫酸などの鉱酸を利用することができる。また、強アルカリ性水溶液には、ＮａＯＨ水溶液やアンモニア水を利用することができる。

また、加熱下水溶液とし、冷却し、再結晶することで容易に他の不純物と分離することができる。
更に得られた結晶を少量の水に溶解し、適当な展開相で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーを行うことで更に高度に精製することができる。シリカゲルゲルクロマトグラフィーの展開相には、たとえばブタノール、酢酸、あるいはそれらと水の混合溶剤などを利用することができる。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。

以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。
また、表中菌株の株名の示すＧＦとは、国立大学法人岐阜大学保存菌株であることを示す。
［実施例１］（スクリーニング）
酵母エキス ４ｇ／Ｌ、麦芽エキス １０ｇ／Ｌ、グルコース ４ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・７水和物 ５ｍｇ／Ｌ、２−メチル−１−ピロリン １ｇ／ＬからなるｐＨ７．３に調製した液体培地を、１８ｍｍφ試験管に４ｍＬずつ分注し、オートクレーブ中１２１℃、１５分間加熱滅菌した。ここに、下表１に示す菌株を一白金耳接種し、２８℃、２〜６日間、振とう培養した。

得られた培養液から遠心分離によって集菌し、２−メチル−１−ピロリン １０ｍＭを含む２５ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を加え、２５℃、２４ｈｒ振とう反応させ、遠心分離によって菌を除いた後、シリカゲルを使用したＴＬＣ（展開液 １−ブタノール：酢酸：水＝２：１：１）で分析を行った。検出は、ニンヒドリンスプレーを噴霧することで行った。
さらに反応が進行しているものについては、上清５０μＬに、２ｍｇ／ｍＬトリエチルアミン水溶液 ５０μＬを加え、さらに８ｍｇ／ｍＬ２，３，４，６−テトラ−ｏ−アセチルグルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ）水溶液 １００μＬを加え、４０℃で１時間保持することで、ＧＩＴＣ化したものを液体クロマトグラフィーにより分析することで、光学純度の測定を行った。和光純薬株式会社製Ｃ１８カラム（Wakosil II 5C18, 4.6mm x 150mm）を用い、１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）：メタノール＝５５：４５の溶離液を流速１ｍＬ／ｍｉｎで通じ、２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収を検出することで測定した。
分析結果を表１に示す。その結果、光学活性な２−メチルピロリジンが生成していることが確認できた。

［実施例２］ＧＦ３５４６の同定
ＧＦ３５４６の微生物学的特徴は、表２にまとめたとおりである。

１６Ｓ−ｒＤＮＡの解析によりＧＦ３５４６を同定した。１６Ｓ−ｒＤＮＡの塩基配列は、MicroSeq Full Gene 16S rDNA PCR/Sequencing kit（ＡＢＩ製）により解析した。解析操作はキットの指示書に従った。得られた塩基配列を配列番号：１に示した。配列番号：１の塩基配列を元に、アポロンＤＢ（株式会社テクノスルガ、商品名）を用いて、Ｂｌａｓｔ検索を行った結果、次の菌株の１６Ｓ−ｒＤＮＡ配列にそれぞれ９８．６％の同一性を示した。
Streptomyces pulveraceus NBRC3855
Streptomyces gelaticus NBRC12866
Streptomyces sannanensis NBRC14239

得られた結果を元に分子系統樹を作成した結果を図１に示した。クラスター解析の結果、ＧＦ３５４６をストレプトマイセス・エスピー(Streptomyces sp.)と同定した。

［実施例３］ＧＦ３５４６による（Ｓ）−２−メチルピロリジンの合成
酵母エキス ２０ｇ／Ｌ、肉エキス ３０ｇ／Ｌ、ＮＺアミン １０ｇ／Ｌ、グルコース ２０ｇ／Ｌ、硫酸第二鉄・７水和物 １ｍｇ／Ｌ、塩化マンガン・４水和物 １ｍｇ／Ｌ、硫酸亜鉛・７水和物 １ｍｇ／ＬからなるｐＨ７．３に調製した液体培地を、振とうフラスコに４０ｍＬずつ分注し、オートクレーブ中１２１℃、１５分間加熱滅菌した。ここに、Streptomyces sp. GF 3546を一白金耳接種し、２８℃、７２時間、振とう培養した。
得られた培養液からろ過によって菌体を集め、２−メチル−１−ピロリン ３０ｍＭ、グルコース２％を含む１００ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ７．０）を加え、２５℃で振とう反応させた。
適宜、反応後、実施例１に従い、ＧＩＴＣ化した後、ＨＰＬＣで分析を行った。結果を、図２に示す。７２ｈｒ反応後、２７．５ｍＭの（Ｓ）−２−メチルピロリジンが、９７％ｅｅの選択性で生じていることが確認できた。光学純度の測定方法は以下のとおりである。

反応液５０μＬに以下の成分を添加して、４０℃、１時間反応することにより生成したアミンをＧＩＴＣ化し、ＨＰＬＣにより分離し定量した。
２ｍｇ／ｍＬトリエチルアミン ５０μＬおよび
８ｍｇ／ｍＬ２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルイソチオシアネート（ＧＩＴＣ） １００μＬ

ＨＰＬＣの条件は、以下のとおりである。
−ＨＰＬＣカラム：和光純薬株式会社製 Wakosil II 5C18 (4.6mm x 150 mm)
−溶離液：１０ｍＭリン酸バッファー（ｐＨ２．５）：メタノール＝５５：４５
−流速：１ｍＬ／ｍｉｎ
−検出：２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収
上記条件下で、（Ｒ）−２−メチルピロリジンは２６．３分に、（Ｓ）−２−メチルピロリジンは２４．９分に溶出された。各溶出フラクションの２５４ｎｍにおけるＵＶ吸収に基づいて光学純度を決定した。

［実施例４］ＧＦ３５４６からイミン還元酵素の精製
実施例３の方法によりＧＦ３５４６株を培養し、ろ過により菌体を調製した。得られた湿菌体を１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２ｍＭフェニルメタンスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）で澱懸し、ビードビーター（Ｂｉｏｓｐｅｃ社製）により破砕後、遠心分離により菌体残渣を除去し、無細胞抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を添加し、遠心分離により除核酸した上清を得た。その上清に硫酸アンモニウムを３０％飽和になるまで添加し、３０％飽和の硫酸アンモニウムを含む標準緩衝液（１０ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、１ｍＭ ＤＴＴ、５％グリセロール）で平衡化したPhenylSepharose HP 26/10に添加し、硫酸アンモニウム濃度を３０％飽和→０％の勾配溶出を行った。イミン還元活性は、勾配溶出部分に観察され、溶出したピーク部分を回収し、限外濾過により濃縮した。なお、イミン還元活性は、以下の方法にて測定した。

−イミン還元活性の標準測定方法−
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、０．２ｍＭ ＮＡＤＰＨ、１０ｍＭ ２−メチル−１−ピロリン及び酵素を含む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの減少にともなう３４０ｎｍの吸光度の減少を測定する。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの減少を触媒する酵素量とした。

濃縮した酵素液を標準緩衝液に対して透析した後、同緩衝液で平衡化したＭｏｎｏＱ １６／１０に添加し、０Ｍ→０．５Ｍ塩化ナトリウムの勾配溶出を行った。溶出した活性画分の内、最も比活性が高かった画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した結果、単一バンドであった。精製酵素の比活性は１２０ｍＵ／ｍｇであった。精製の要約を表３に示す。

表３：ＧＦ３５４６株からのイミン還元酵素の精製

［実施例５］イミン還元酵素による（Ｓ）−２−メチルピロリジンの合成
１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液ｐＨ７．０、４０ｍＭ ＮＡＤＰＨ、２０ｍＭ ２−メチル−１−ピロリンおよび実施例４で得られた酵素を含む反応液中で、２５℃で終夜反応させた。生成した２−メチルピロリジンは、実施例３にしたがって定量および光学純度の測定を行った。その結果、本酵素によって生成した２−メチルピロリジンは、９２．７％ｅｅのＳ体であった。また、反応収率は７７．５％であった。

［実施例６］イミン還元酵素の分子量測定
実施例４で得られた酵素のサブユニットの分子量をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより求めた結果、約３０，５００であった。また、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００のゲルろ過カラムを用いて分子量を測定したところ、約８１，５００であった。

［実施例７］イミン還元酵素の至適ｐＨ
リン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−塩化カリウム−水酸化カリウム緩衝液を用いてｐＨを変化させて、実施例３で得られた酵素の２−メチル−１−ピロリンの還元活性および（Ｓ）−２−メチルピロリジンの酸化活性を調べ、最大活性を１００とした相対活性で表し、図３、図４に示した。還元反応の至適ｐＨは７．４〜８．０、酸化反応の至適ｐＨは１０．５であった。なお、（Ｓ）−２−メチルピロリジンの酸化活性は以下の標準測定方法のｐＨだけを変化させて測定した。

−（Ｓ）−２−メチルピロリジン酸化活性の標準測定方法−
１００ｍＭグリシン−塩化カリウム−水酸化カリウム緩衝液 １０．５、２．５ｍＭＮＡＤＰ＋、１０ｍＭ （Ｓ）−２−メチルピロリジン及び酵素を含む反応液中３０℃で反応させ、ＮＡＤＰＨの増加にともなう３４０ｎｍの吸光度の増加を測定する。１Ｕは、１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨの増加を触媒する酵素量とした。

［実施例８］イミン還元酵素の至適温度
実施例４で得られた酵素をイミン還元標準反応条件のうち温度だけを変化させて、２−メチル−１−ピロリンの還元活性を測定し、最大活性を１００とした相対活性で表し、図５に示した。最大活性の８０％以上を示したのは３５℃〜４５℃であった。

［実施例９］イミン還元酵素の基質特異性
実施例４で得られた酵素を種々のイミン化合物と反応させ、その還元反応の活性を２−メチル−１−ピロリンの還元を１００とした相対活性で表し、表４に示した。
表４：イミン還元酵素の基質特異性

［実施例１０］イミン還元酵素の部分アミノ酸配列
実施例９で得られた酵素を用いて、プロテインシーケンサーによりＮ末端アミノ酸配列を解析した。アミノ酸配列を配列番号：４に示した。また、ＳＤＳ−ＰＡＧＥのゲルより、イミン還元酵素を含むゲル断片を切り出し、２回洗浄後、トリプシンを用いて、３５℃で終夜イン・ゲル・ダイジェションを行った。消化したペプチドを逆相ＨＰＬＣ （東ソー製TSK gel ODS-80-Ts、 2.0mm × 250mm）を用い、０．１％トリフルオロ酢酸中でアセトニトリルのグラジエント溶出によりペプチドを分離し、分取した。

分取したペプチドピーク１種をＴ６１とし、プロテインシーケンサー（Hewlett Packard G1005A Protein Sequencer System）によりアミノ酸配列の解析を行った。Ｔ６１のアミノ酸配列を配列番号：５で示した。

［実施例１１］Streptomyces sp. GF 3546からの染色体ＤＮＡの精製
実施例３の方法によりＧＦ３５４６を培養し、菌体を調製した。菌体からの染色体ＤＮＡの精製は、J.Dairy Sci. , 75 , 1186-1191(1992)に記載の方法により行った。

［実施例１２］イミン還元酵素遺伝子のコア領域のクローニング
Ｎ末端、Ｔ６１のアミノ酸配列を元にそれぞれセンスプライマー、アンチセンスプライマーを合成した。それぞれの塩基配列を配列番号：６および配列番号：７に示した。
プライマー各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ １０ｎｍｏｌ、Streptomyces sp. GF 3546由来染色体ＤＮＡ ５０ｎｇ、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝液（タカラバイオ製）、５％ＤＭＳＯ、Ｅｘ−Ｔａｑ １Ｕ（タカラバイオ製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９４℃、３０秒）、アニール（４５℃、３０秒）、伸長（７０℃、１分５秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ製）を用いて行った。
ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、９００ｂｐあたりに特異的と思われるバンドが検出できた。このＤＮＡ断片の塩基配列を解析し、決定されたコア領域の塩基配列を配列番号：８として示した。

［実施例１３］ イミン還元酵素遺伝子のコア領域周辺の塩基配列の解析
Streptomyces sp. GF 3546由来染色体ＤＮＡを制限酵素ＳａｃIで消化し、Ｔ４リガーゼを用いて１６℃で終夜セルフ・ライゲーション反応により、各断片を環化させた。次に、配列番号：９および配列番号：１０に示したプライマーを各１００ｐｍｏｌ、環化ＤＮＡを２５ｎｇ、Ｅｘ−Ｔａｑ用緩衝液（タカラバイオ製）、５％ＤＭＳＯ、Ｅｘ−Ｔａｑ １Ｕ（タカラバイオ製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９５℃、３０秒）、アニール（５５℃、３０秒）、伸長（７２℃、７分）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ製）を用いて行った。ＰＣＲ反応液の一部をアガロースゲル電気泳動により解析した結果、約２，０００ｂｐのＤＮＡ断片が検出できた。このＤＮＡ断片の塩基配列を解析した結果、イミン還元酵素遺伝子のＯＲＦ配列を決定することができた。決定したＤＮＡ配列は配列番号：２に、予想されるアミノ酸配列を配列番号：３に示した。

［実施例１４］イミン還元酵素遺伝子のクローニング
イミン還元酵素の構造遺伝子配列を基にＯＲＦのみをクローニングするために配列番号：１１（ＳｓＳＩＲ−ＡＴＧ１）および配列番号：１２（ＳｓＳＩＲ−ＴＡＡ１）に示したプライマーを合成した。プライマーを各５０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ １０ｎｍｏｌ、Streptomyces sp. GF 3546由来染色体ＤＮＡ ５０ｎｇ、Pfu Turbo-DNA Polymerase用緩衝液（STRATAGENE製）、５％ＤＭＳＯ、Pfu Turbo-DNA Polymerase １．９Ｕ（STRATAGENE製）を含む５０μＬの反応液を用い、変性（９８℃、３０秒）、アニール（６０℃、１分）、伸長（７２℃、１分１０秒）を３０サイクル、GeneAmp PCR System 9700（アプライド・バイオシステムズ製）を用いて行った。
得られたＤＮＡ断片をGFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア製）により精製して回収した。ＤＮＡ断片を制限酵素ＢｓｐＨI、ＸｂａIで２重消化し、アガロースゲル電気泳動を行い、目的とするバンドの部分を切り出し、GFX PCR DNA and Gel Band Purification Kit（ＧＥヘルスケア製）により精製した。
得られたＤＮＡ断片を、ＮｃｏI、ＸｂａIで２重消化したｐＳＥ４２０Ｄ（Invitrogen製のプラスミドベクターｐＳＥ４２０のマルチクローニングサイトを改変したプラスミド、特開２０００−１８９１７０）とTakara Ligation Kitを用いて、ライゲーションし、大腸菌ＪＭ１０９株を形質転換した。
形質転換株を、アンピシリンを含むＬＢ培地で生育させ、生育した形質転換体からプラスミドを抽出し、イミン還元酵素遺伝子が挿入されている事が確認できたプラスミドをｐＳＵＳ２ＭＰ１とした。プラスミド構築の過程を図６に示した。

［実施例１５］組換えイミン還元酵素の活性評価
イミン還元酵素を発現するプラスミドｐＳＵＳ２ＭＰ１で形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収した。また該遺伝子を含まない大腸菌ＪＭ１０９をＬＢ培地で終夜培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧ添加後さらに４時間培養した菌体を同様に破砕して、菌体抽出液を回収した。
それぞれの菌体抽出液を用いて２−メチル−１−ピロリンに対するイミン還元活性を測定した。結果を表５に示した。活性測定の方法は実施例４と同様とした。

［実施例１６］イミン還元酵素と枯草菌由来のグルコース脱水素酵素を共発現するプラスミドｐＳＧ−Ｓ２ＭＰの構築
実施例１４と同様にしてＰＣＲを行い、増幅したイミン還元酵素を含むＤＮＡ断片をＢｓｐＨI、ＸｂａIで２重消化した。次に、枯草菌由来のグルコース脱水素酵素遺伝子を発現するプラスミドｐＳＥ−ＢＳＧ１（特開２０００−１８９１７０）をＮｃｏI、ＸｂａIの２つの制限酵素で二重消化し、イミン還元酵素遺伝子を含むＤＮＡ断片とTakara Ligation Kitを用いてライゲーションし、イミン還元酵素とグルコース脱水素酵素を同時に発現可能なプラスミドであるｐＳＧ−Ｓ２ＭＰを得た。プラスミド構築の過程を図７に示した。

［実施例１７］イミン還元酵素とグルコース脱水素酵素の大腸菌による同時発現
ｐＳＧ−Ｓ２ＭＰで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株を、アンピシリンを含む液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、１ｍＭ ＤＴＴを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁し、密閉式超音波破砕装置ＵＣＤ−２００ＴＭ（コスモバイオ製）を用いて菌体を破砕した。菌体破砕液を遠心分離し、その上清を菌体抽出液として回収し、２−メチル−１−ピロリンに対するイミン還元活性とグルコース脱水素活性を測定した。結果を表５に示した。なお、グルコース脱水素活性の測定は、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）、２．５ｍＭ ＮＡＤＰ＋、１００ｍＭグルコースおよび菌体抽出液を含む反応液中で、３０℃で行った。１Ｕは、上記反応条件において１分間に１μｍｏｌのＮＡＤＰＨ生成を触媒する酵素量とした。

［実施例１８］組換え大腸菌による（Ｓ）−２−メチルピロリジンの製造
ｐＳＧ−Ｓ２ＭＰで形質転換された大腸菌ＪＭ１０９株をアンピシリンを含む５ｍＬの液体ＬＢ培地で終夜３０℃培養し、０．１ｍＭ ＩＰＴＧを加え、さらに４時間培養を行った。
菌体を遠心分離により集菌した後、５０ｍＭ２−メチル−１−ピロリン、１００ｍＭグルコースを含む１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）１ｍＬに懸濁し、終夜２５℃で振とう反応を行った。反応後、生成した２−メチルピロリジンの光学純度、及び、反応液中における２−メチル−１−ピロリンと２−メチルピロリジンの濃度を実施例８と同様にして分析した。その結果、生成した（Ｓ）−２−メチルピロリジンの光学純度は９２．０％ｅｅであった。

本発明は、微生物の還元能を使用した立体選択的還元により、光学活性なアミン誘導体を効率的に製造する方法を提供する。本発明の方法は、高い立体選択性を期待できるので、工業的にも有利である。本発明によって製造される光学活性なアミン誘導体は、光学活性な医薬の合成原料として有用である。たとえば、（Ｓ）−２−メチルピロリジンは、医薬品原料として有用な化合物である。

Claims (16)

1. 次の（１）〜（５）に示す理化学的性状を有するイミン還元酵素；
   （１）作用：還元型ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰＨと略す）依存的に、２−メチル−１−ピロリンを還元し、（Ｓ）−２−メチルピロリジンを生成する。ニコチナミドアデニンジヌクレオチドリン酸（以下、ＮＡＤＰ＋と略す）依存的に、（Ｓ）−２−メチルピロリジンを酸化し、２−メチル−１−ピロリンを生成する；、および
   （２）補酵素依存性：還元反応の補酵素としてＮＡＤＰＨを利用する。酸化反応の補酵素としてＮＡＤＰ＋を利用する。
   （３）至適ｐＨ：還元反応は７．４〜８．０、酸化反応は１０．５
   （４）至適温度：還元反応は３５〜４５℃
   （５）分子量：ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（以下、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと略す）が約３０，５００、ゲルろ過による分子量が約８１，５００。
2. 請求項１の（１）および（２）に示す理化学的性状を有し、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチドによりコードされる、イミン還元酵素。
   （ａ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
   （ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   （ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
   （ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
   （ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
3. 式（I）で示されるイミン誘導体に、請求項１又は２に記載のイミン還元酵素、当該イミン還元酵素を生産する微生物、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＳ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
   式（Ｉ）
   

   

   式（ＩＩ）
   

   

   （式中、Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１〜３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１〜３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
4. 式（Ｉ）で示されるイミン誘導体に、当該化合物を立体選択的に還元する能力を有する微生物の培養物、菌体、およびその処理物からなる群から選択される、少なくとも一つの酵素活性物質を接触させる工程と、式（ＩＩ）で示される光学活性なＳ体のアミン誘導体を回収する工程を含む、光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
   式（Ｉ）
   

   

   式（ＩＩ）
   

   

   （式中Ｒ１、Ｒ２基は炭素数１〜３個のアルキル基を、Ｒ３基は、炭素数１〜３個のアルキル基もしくは水素を表し、Ｒ１とＲ３は環を巻いていてもよい）
5. 式（Ｉ）の化合物が下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン誘導体であり、式（ＩＩ）の化合物が式（ＩＶ）で表されるアミン誘導体である請求項４に記載の方法。
   式（ＩＩＩ）
   

   

   式（ＩＶ）
   

   

   （式中Ｒ基は炭素数１〜３個のアルキル基を、ｎは、１〜４の整数を表す）
6. 式（ＩＩＩ）の化合物が２−メチル−１−ピロリンであり、式（ＩＶ）で表される化合物が、２−メチルピロリジンである請求項５に記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法
7. 微生物が、ストレプトマイセス（Streptomyces）属に属する微生物であることを特徴とする請求項４から６のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
8. 微生物が、ストレプトマイセス・エスピー（Streptomyces sp.）であることを特徴とする請求項４から６のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
9. 微生物が、ストレプトマイセス・エスピー NITE P-593（Streptomyces sp. NITE P-593）であることを特徴とする請求項４から６のいずれかに記載の光学活性なＳ体のアミン誘導体の製造方法。
10. 請求項１の（１）および（２）に示す理化学的性状を有するイミン還元酵素をコードする、下記（ａ）から（ｅ）のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
    （ａ）配列番号：２に記載された塩基配列を含むポリヌクレオチド、
    （ｂ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （ｃ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列において、１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド、
    （ｄ）配列番号：２に記載された塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド、
    （ｅ）配列番号：３に記載のアミノ酸配列と８０％以上の同一性を有するアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド。
11. 請求項１０に記載されたポリヌクレオチドが挿入された組換えベクター。
12. 更に、ＮＡＤＰ＋を補酵素とする酸化還元反応を触媒することができる脱水素酵素をコードするポリヌクレオチドが挿入された、請求項１１に記載された組換えベクター。
13. 脱水素酵素がグルコース脱水素酵素である、請求項１２に記載のベクター。
14. グルコース脱水素酵素がバシラス・サブチルス（Bacillus subtilis）に由来する、請求項１２に記載の組換えベクター。
15. 請求項１０に記載されたポリヌクレオチド、または請求項１２に記載のベクターを発現可能に保持した形質転換体。
16. 請求項１５に記載の形質転換体を培養し、発現産物を回収する工程を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質の製造方法。

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