CN102317450A - 用于制备度洛西汀(duloxetine)醇之改良生物催化剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新型苯乙醇脱氢酶突变体,其制备方法;编码此突变体的核酸序列、包含此序列的表达盒、载体及重组微生物;使用此突变体进行生物催化合成经取代的光学活性醇的方法及所述突变体的用途;且特别涉及制备度洛西汀醇或度洛西汀的方法,其包含由该突变体所催化的生物催化合成步骤。
Description
本发明涉及新型苯乙醇脱氢酶突变体,其制备方法;编码其之核酸序列、包含这些序列之表达盒、载体及重组微生物;使用这些突变体生物催化合成经取代的光学活性醇的方法;且具体涉及制备度洛西汀(duloxetine)醇或度洛西汀的方法,其包含由这些突变体所催化的生物催化合成步骤。
背景技术
流程1:通过度洛西汀醇制备度洛西汀
可借助于脱氢酶(参见WO2005/033094)制备所产生的中间物(TACA)(2)。举例而言,来自固氮弧菌属物种(Azoarcus sp.)(新名脱氮β变形菌(Aromatoleum aromaticum))(参见等人,Biochemistry,第45卷,第1期,2006)的苯乙醇脱氢酶EbN1将氯酮3-氯-1-(噻吩基-2-基)-丙-1-酮(1)还原为相应氯醇(1S)-3-氯-1-(噻吩基-2-基)-丙-1-醇(2),类似于麦尔外因-彭道夫还原反应(Meerwein-Ponndorf reduction)。对此,脱氢酶需要辅因子烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH),其产生必需之还原等效物。此昂贵辅因子可借助于第二“牺牲醇”(例如,2-丙醇或2-丁醇)再生,期间形成相应的酮(例如,丙酮或2-丁酮)。相对较长链的醇在此处为酶所偏好,但亦昂贵得多。因此,2-丁醇用作牺牲醇(参见流程2)(也参见WO2006/072465)。
流程2:借助于“牺牲醇”使辅因子NADH再生
可用于表达的野生型酶EbN1及表达系统描述于WO2005/108590及WO2006/094945中。
发明内容
本发明目标之一为增加可用于制备度洛西汀的生物催化剂的活性。
具体而言,目标为提供改良TAC(1)酶促还原为TACA(2)的生物催化剂。此处所获的改良可在于:
-较高反应速率
-较高产物产率
-较低的产物抑制的易感性
-辅因子再生的改良
-其组合。
令人惊讶地,此目标通过提供上述来自固氮弧菌属物种之苯基醇脱氢酶EbN1的特殊突变体而达到。
具体而言,以上目标令人惊讶地以两种不同方式达成。根据第一解决途径,编码生物催化剂的基因序列通过易错聚合酶链反应(易错PCR)偶然突变并因此产生许多变体,自这些变异体可选出改良型突变体。这些变体又再次突变以便进一步改良(定向进化)。
附图说明
图1展示苯乙醇脱氢酶EbN1的编码核酸序列(A)及氨基酸序列(B);
图2展示EbN1的一个单体的条带模型;
图3以图解方式展示各种突变体的克隆策略;
图4展示在于各情况下10mM TA、TAA或TACA存在下抑制苯乙醇脱氢酶EbN1的实验结果以及在无抑制物质下对照组批次的结果。以全细胞进行实验;在各情况下测试25或50μl细胞悬浮液;
图5A说明在TACA存在及不存在下,通过类型Y151X的各种突变体,以2-丁醇使辅因子再生的能力。
图5B说明在TACA存在及不存在下,通过类型T192X的各种突变体,以2-丁醇使辅因子再生的能力。
图6A展示与参考(LU11558)相比,在无辅因子再生的TAC测试中类型T192X的各种突变体的活性;
图6B展示与参考(LU11558)相比,在有辅因子再生的TAC测试中类型T192X的各种突变体的活性;
图6C展示与参考(LU11558)相比,在TACA测试中类型T192X的各种突变体的活性;
图7A展示与参考(LU11558)相比,在无辅因子再生的TAC测试中类型Y151X的各种突变体的酶促活性;
图7B展示与参考(LU11558)相比,在有辅因子再生的TAC测试中类型Y151X的各种突变体的酶促活性;
图7C展示与参考(LU11558)相比,在TACA测试中类型Y151X的各种突变体的活性;
图8A说明在TAC存在及不存在下,通过类型Y151A-T192X的突变体,以2-丁醇使辅因子再生;
图8B说明与对照组(Y151A)相比,在有辅因子再生的TAC测试中类型Y151A-T192X的突变体的活性;
图9说明在各种反应混合物中借助于突变体Y151A所获TACA的产率,在各情况下与参考相比且作为不同TAC浓度(在图9A中400mM且在图9B中600mM)的函数;
图10以电脑动态模型说明在野生型酶EbN1(合成A)中或在突变体Y151A(合成B)中的底物结合(TA)。下图在各情况下描述来自底物结合袋的放大部分;
图11展示来自EbN1的活性中心的一部分的电脑模拟绘图;此处,突出两亲性螺旋、环2、底物及辅因子(NADH)的排列;
图12说明定点诱变的克隆策略;及
图13A及图13B说明本发明的各种点突变的活性测试的结果。
发明详述
1.一般术语的定义
“苯乙醇脱氢酶”(EC No.1.1.1)一般为催化NADH依赖性的、立体特异性的苯乙酮还原为S-1-苯乙醇的酶。在本发明的上下文中“苯乙醇脱氢酶”或“具有苯乙醇脱氢酶活性的酶”尤其催化由式I的酮起始的通式II的光学活性醇的酶促合成,且尤其催化3-氯-1-(噻吩基-2-基)-丙-1-酮与(1S)-3-氯-1-(噻吩基-2-基)-丙-1-醇之间的立体特异性平衡反应。
由于酶促反应的可逆性,因而本发明涉及两种反应方向(亦即形成还原等效物或消耗还原等效物)的本文所述的酶促反应。
“苯乙醇脱氢酶”的“功能突变体”包含下文所定义的这些酶的“功能等效物”。
术语“生物催化过程”指在本发明的“苯乙醇脱氢酶”或具有“苯乙醇脱氢酶活性”的酶的催化活性存在下进行的任何过程,亦即在粗的或纯的、溶解、分散或固定的酶的存在下或在具有或表达该酶活性的整个微生物细胞存在下的过程。生物催化过程因此包含酶促过程及微生物过程。
术语“立体特异性”指具有至少一个不对称中心的根据本发明所制备的化合物的数种可能立体异构体中的一种以高“对映异构体过量”或高“对映异构体纯度”由本发明的酶的作用产生,诸如至少90%ee,具体而言至少95%ee,或至少98%ee,或至少99%ee。ee%值是根据下式计算:
ee%=[XA-XB]/[XA+XB]*100,
其中XA及XB分别为对映异构体A或B的摩尔浓度的分数。
此外,本文中使用以下缩写:
TAC=3-氯-1-噻吩-2-基-丙-1-酮
TACA=3-氯-1-噻吩-2-基-丙-1-醇
TA=1-噻吩-2-基-丙烯酮
TAA=1-噻吩-2-基-丙-2-烯-1-醇
“低级醇”具体而言为单醇且根据本发明包含低级烷基。此尤其为C1-C8烷基,特别是C1-C6烷基,其为支链或特别是直链且具有1至8个,具体而言1、2、3、4、5或6个碳原子。实例为C1-C4烷基,诸如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、2-丁基、异丁基或叔丁基;及另外具有大于4个碳原子的基团,诸如戊基、1-甲基丁基、2-甲基丁基、3-甲基丁基、2,2-二甲基丙基、1-乙基丙基、1,1-二甲基丙基、1,2-二甲基丙基、1-甲基戊基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、4-甲基戊基、正己基、1,1-二甲基丁基、1,2-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基及3,3-二甲基丁基。
“环”(Cyc)包含单环或多环,饱和或不饱和,碳环或杂环,芳族或非芳族,任选地单取代或多取代的环。
碳环及杂环基团Cyc的实例尤其为具有多达4个(,例如0、1或2个)选自O、N及S的相同或不同环杂原子的单环或双环基团,较佳优选为单环基团。
这些碳环或杂环尤其包含3至12个,较佳优选4、5或6个环碳原子。可提及的实例为环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、其单不饱和或多不饱和类似物,诸如环丁烯基、环戊烯基、环戊二烯基、环己烯基、环庚烯基、环己二烯基、环庚二烯基及苯基;及具有1至4个选自O、N及S的杂原子的5至7员元饱和或单不饱和或多不饱和杂环基。具体而言,提及衍生自以下的杂环基:吡咯啶酮吡咯烷酮、四氢呋喃、哌啶、吗啉、吡咯、呋喃、噻吩、吡唑、咪唑、噁唑、噻唑、吡啶、哌喃、嘧啶、哒嗪及吡嗪。
亦提及双环基团,其中上述碳环或杂环的一者一个已与另一杂环或碳环稠合,诸如衍生自苯并呋喃、吲哚、喹啉及萘的基团。
另一优选组Cyc基团为芳基。“芳基”为单环或多环(优选单环或双环),任选地经取代的芳族基团,特别是通过任何所需环位置结合的苯基或萘基,诸如1-萘基或2-萘基。
此处的基团Cyc可通过任何所需环位置结合,优选通过环碳原子结合。
合适Cyc基团的实例为苯基、萘基、2-噻吩基、3-噻吩基;2-呋喃基、3-呋喃基;2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基;2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基;4-甲基-2-噻吩基、3-乙基-2-噻吩基、2-甲基-3-噻吩基、4-丙基-3-噻吩基、5-正丁基-2-噻吩基、4-甲基-3-噻吩基、3-甲基-2-噻吩基;3-氯-2-噻吩基、4-溴-3-噻吩基、2-碘-3-噻吩基、5-碘-3-噻吩基、4-氟-2-噻吩基、2-溴-3-噻吩基及4-氯-2-噻吩基。
基团Cyc亦可经一或多次取代,诸如经单取代或二取代。取代基优选位于环碳原子上。合适取代基的实例为卤素、低级烷基、低级烯基、低级烷氧基、-OH、-SH、-NO2或NR2R3,其中R2及R3彼此独立地为H、甲基或乙基。
“卤素”为氟、氯、溴或碘,具体而言为氟或氯。
“低级烷基”优选为具有2至8个,特别是2至6个碳原子的直链或支链烷基,诸如乙基、异丙基或正丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基、正戊基或2-甲基丁基、正己基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2-乙基丁基。
“低级烷氧基”优选为上述低级烷基的相应的氧封端的类似物。
“低级烯基”为具有2至8个,特别是2至6个碳原子的上述烷基的单不饱和或多不饱和(优选单不饱和)类似物,其中双键可在碳链上的任何所需位置处。
2.本发明的优选实施方案
本发明首先提供衍生自来自固氮弧菌属物种且具有根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列的苯乙醇脱氢酶EbN1的功能性苯乙醇脱氢酶突变体。
具体而言,本发明涉及衍生自来自固氮弧菌属物种且具有根据SEQ IDNO:2的氨基酸序列的苯乙醇脱氢酶EbN1的功能性苯乙醇脱氢酶突变体,其中这些突变体在至少一个选自以下的序列区域中具有至少一个突变:
(1)序列区域142至153(亦称为环2)及
(2)序列区域190至211(亦称为螺旋αFG1)。
特别地,本发明涉及在另一选自以下的序列区域中另外具有至少另一个突变的功能性苯乙醇脱氢酶突变体:
(3)序列区域93至96(亦称为环1)
(4)序列区域241至249(C末端)
(5)序列区域138至141(结合袋(binding pocket)的亲水性区域,亦称为环2)及
(6)Cys61和/或Cys83。
此外,本发明涉及衍生自来自固氮弧菌属物种且具有根据SEQ IDNO:2的氨基酸序列的苯乙醇脱氢酶EbN1的功能性苯乙醇脱氢酶突变体,其中该突变体选自表1中所列的突变体。
特别地,提及至少一个下列基团得到突变的突变体:
T192、L197、M200、F201、L204、M246、L139、T140、T142、L146、I148、Y151、C61、C83、L186,相应氨基酸被任何所需其他天然氨基酸置换。
具体而言,本发明的突变体选自包含至少一个下列突变的突变体:
a)单一突变:
Y151XA,其中XA=A、R、N、E、Q、G、H、I、L、M、T或V;
T192XB,其中XB=A、E、G、I、P、S、W、V或L;
b)多点突变:
Y151XA T192XB,其中XA及XB具有上文所给出的含义。
具体而言,本发明提供特征在于至少一个下列经修饰的部分序列的突变体:
(部分序列1)142-TTYWX1KX2EAX3T-153(经修饰的环2)及
(部分序列2)190-ATX4EASAX5SAX6X7DVX8PNMLQAI-211(经修饰的螺旋αFG1),
其中X1至X8彼此独立地为任何所需氨基酸基团,其中基团X1至X3及X4至X8中的至少一者不为根据SEQ ID NO:2的天然酶的天然氨基酸基团,具体而言其中
X1为L或经I、V、A、M、F或H取代。
X2为I或经L、V、A、M、F或H取代。
X3为Y或经A、R、N、E、Q、G、H、I、L、M、T或V取代;
或其中
X4为T或经A、E、G、I、P、S、W、V或L取代。
X5为L或经I、V、A、M、F或H取代。
X6为M或经Y、W、E、V、S、R、Q、K、I、H、G、F、E或D取代。
X7为F或经G、K、T、Y、M、W或R取代。
X8为L或经I、V、A、M、F或H取代。
具体而言,本发明亦涉及所具有的酶促活性仍为具有SEQ ID NO:2的脱氢酶的酶促活性至少约50%的突变体,诸如具有50至100%或100%以上,例如>100至1000%的酶促活性的突变体,在各情况下使用诸如TAC或TACA的参考底物在标准条件下测定(比较如下,涉及测定苯乙醇脱氢酶活性的细节)。
具体而言,本发明亦提供与SEQ ID NO:2具有至少约70%,例如70至99.9%、75至99.9%、80至99.9%、85至99.9%、90至99.9%或95至99.9%的序列同一性的突变体。
具体而言,本发明亦提供的突变体除至少一个在上文定义的区域(1)至(6)中的突变之外,在这些区域外的多达25%氨基酸基团与SEQ ID NO:2相比通过添加、缺失、插入、取代、倒位或其组合而被修饰。
具体而言,本发明提供的突变体在辅因子NAD+或NADH存在下催化3-氯-1-(噻吩基-2-基)-丙-1-酮(1)与(1S)-3-氯-1-(噻吩基-2-基)-丙-1-醇(2)之间的立体特异性平衡反应。
本发明进一步提供编码本文中所定义的突变体的核酸序列。
本发明进一步提供包含与至少一种调节性核酸序列功能性连接的至少一种本文中所定义的核酸序列的表达盒。
本发明进一步提供包含至少一种本文中所定义的表达盒的载体。
本发明进一步提供包含至少一种本文中所定义的核酸、一种本文中所定义的表达盒或一种本文中所定义的载体的重组微生物。
本发明进一步提供制造本文中所定义的苯乙醇脱氢酶突变体的方法,其包含培养本文中所定义的重组微生物,表达编码突变体的核酸序列及任选地分离表达产物。
本发明进一步提供微生物/酶促合成在各情况下呈立体异构纯形式或立体异构体的混合物形式的式(II)的经取代光学活性醇的方法,
其中
Cyc为单环或多环、饱和或不饱和的碳环或杂环,且任选地单取代或多取代的环,
该方法包含任选地添加诸如具体的NADH的还原等效物,在本文中所定义的苯乙醇脱氢酶突变体存在下,生物催化(微生物/酶促)还原式(I)的酮。
具体而言,还提供的下述方法,其中反应在还原等效物再生的条件下,使用诸如(特别是)C1至C6单醇的低级醇作为牺牲醇而进行。
使用本发明的制备方法,特别是式(I)的那些化合物在当Cyc为杂环基,特别是噻吩基时反应。
具体而言,还提供获得式(II)的基本上为对映异构纯的醇,特别是(S)-对映异构体的方法。
具体而言,还提供的方法为其中突变体以分离形式使用且藉此任选地固定化于固相支撑物上;或表达于任选地固定化于固相支撑物上的微生物细胞中。诸如聚合支撑材料(诸如珠粒或膜)的合适固相支撑物为生物转化及酶反应器技术领域的技术人员所知。
具体而言,亦提供制备度洛西汀的方法,其包含
a)使用如本文中所定义的生物催化方法将3-氯-1-(噻吩基-2-基)-丙-1-酮(1)微生物/酶促还原为(1S)-3-氯-1-(噻吩基-2-基)-丙-1-醇(2)
b)通过甲胺化反应化学转化醇(2)以获得度洛西汀醇(3)
及最终
c)通过插入萘基使度洛西汀醇(3)化学转化以获得度洛西汀(4)。
此外,本发明提供微生物/酶促合成式(I)的经取代的酮的方法,
其中
Cyc为单环或多环、饱和或不饱和、碳环或杂环、芳族或非芳族、任选地单取代或多取代环,
该方法包含任选地添加诸如(特别是)NAD+的氧化等效物,在本文中所定义的苯乙醇脱氢酶突变体存在下,微生物/酶促氧化在各情况下呈立体异构纯形式或立体异构体的混合物形式的式(II)的醇。
具体而言,使用C1至C6单烷酮作为牺牲酮,在氧化等效物再生的条件下进行反应。
所用酶突变体在此处可以分离形式使用,例如,任选地固定化于固相支撑物上,或表达于任选地固定化于固相支撑物上的微生物细胞中。
最终,本发明提供本文中所定义的酶突变体在制备度洛西汀醇和/或度洛西汀中的用途。
3.本发明的其他实施方案
3.1蛋白质
本发明不限于具有苯乙醇脱氢酶活性的特定公开的蛋白质及酶,且也扩展至其功能等效物。
在本发明的上下文中,具体公开的酶的“功能等效物”或类似物为不同于所具体公开的酶但也具有所需生物活性,例如苯乙醇脱氢酶活性的多肽。
因此,在本发明的上下文中,举例而言,“功能等效物”应理解为指在用于“苯乙醇脱氢酶活性”的测试中,具有比包含本文中所定义的氨基酸序列的酶的活性低或高至少1%,具体而言至少约5至10%,诸如至少10%或至少20%,诸如至少50%或75%或90%的酶。此外,功能等效物优选在pH 4至11之间稳定且最佳pH值在pH 5至10的范围内,诸如,特别是6.5至9.5或7至8或约7.5,且最佳温度在15℃至80℃或20℃至70℃的范围内,例如约30至60℃或约35至45℃,诸如约40℃。
在本发明的上下文中,可借助于各种已知测试证明“苯乙醇脱氢酶活性”。不欲受限于此,可提及在如实施例部分(参见测试1)、2)或3)的描述)中所定义的标准条件下,使用诸如TAC或TACA的参考底物,或在4升反应器中进行生物转化(完全反应TAC→TACA,借助于异丙醇或2-丁醇使辅因子再生)的测试。
根据本发明,“功能等效物”也特别地理解为在上述氨基酸序列的至少一个序列位置中与明确提及的氨基酸相比为不同氨基酸但具有上述一种生物活性的“突变体”。“功能等效物”因此包括可通过一或多种氨基酸添加、取代、缺失和/或倒位获得的突变体,这些修饰可能出现在任何序列位置处,只要其产生具有根据本发明的特性谱的突变体。尤其若突变体与未经修饰多肽之间的反应性模式在性质上一致,即,例如相同底物以不同速率转化,则也存在功能等效物。合适氨基酸取代的实例概括于下表中:
原始基团 | 取代的实例 |
Ala | Ser |
Arg | Lys |
Asn | Gln;His |
Asp | Glu |
Cys | Ser |
Gln | Asn |
Glu | Asp |
Gly | Pro |
His | Asn;Gln |
Ile | Leu;Val |
Leu | Ile;Val |
Lys | Arg;Gln;Glu |
Met | Leu;Ile |
Phe | Met;Leu;Tyr |
Ser | Thr |
Thr | Ser |
Trp | Tyr |
Tyr | Trp;Phe |
Val | Ile;Leu |
具有上述意义的“功能等效物”也为所述多肽的“前体”以及多肽的“功能衍生物”及“盐”。
此处,“前体”为有或无所需生物活性的多肽的天然或合成前体。
表述“盐”应理解为本发明的蛋白质分子中的羧基的盐以及氨基的酸加成盐。羧基的盐可以本身已知的方式制备且包含无机盐,例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐及锌盐,以及与有机碱,例如胺类(诸如三乙醇胺、精胺酸、赖氨酸、哌啶及其类似物)形成的盐。本发明同样提供酸加成盐,例如与无机酸(诸如盐酸或硫酸),及与有机酸(诸如乙酸及草酸)形成的盐。
借助于已知技术,本发明的多肽的“功能衍生物”可同样在功能性氨基酸侧基上制备或在其N-或C末端上制备。此类型衍生物包含例如羧酸基团的脂族酯、可通过使羧酸基团与氨或一级胺或二级胺反应获得的酰胺;通过游离氨基与酰基反应制备的N-酰基衍生物;或通过游离羟基与酰基反应制备的O-酰基衍生物。
“功能等效物”自然也包含可自其他有机体获得的多肽,以及天然产生的变异体。举例而言,通过序列比较有可能确定同源序列区域的范围且确定根据本发明的特定规定的等效酶。
“功能等效物”同样包含本发明的多肽的片段,优选个别结构域或序列模体,其例如具有所需生物学功能。
此外,“功能等效物”为具有上述多肽序列或源于其的功能等效物之一与至少另一种在功能性N末端或C末端连接的功能不同的异源序列(即不会相互实质上功能性损害融合蛋白部分)的融合蛋白。此类型异源序列的非限制性实例为例如信号肽、组氨酸锚定物(histidine anchor)或酶。
本发明所包括的“功能等效物”也为特定公开的蛋白质的同源物。根据Pearson and Lipman,Proc.Natl.Acad,Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448的算法所计算,这些同源物与一种特定公开的氨基酸序列具有至少60%,优选至少75%,特别优选至少85%,例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同源性(或同一性)。本发明的同源多肽的同源性或同一性百分数具体而言指基于一种本文所特定描述的氨基酸序列的总长度,相同氨基酸基团的百分数。
同一性百分数值也可参考BLAST比对、算法blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)或通过使用如下给出的Clustal设定值来确定。
在可能蛋白质糖基化的情况下,本发明的“功能等效物”包含呈去糖基化形式或糖基化形式以及通过修饰糖基化模式获得的修饰形式的上文所提及类型的蛋白质。
本发明的蛋白质或多肽的同源物可通过诱变,例如通过点突变、延长或缩短蛋白质而制备。
本发明的蛋白质的同源物可通过筛选突变体(诸如截短突变体)的组合文库来鉴别。举例而言,蛋白质变异体的多样化文库可通过在核酸水平上组合诱变,例如通过使合成寡核苷酸的混合物酶促连接而制造。有许多可用于自简并性寡核苷酸序列产生潜在同源物文库的方法。简并性基因序列的化学合成可于DNA自动合成仪中进行,且合成基因可随后连接至合适的表达载体中。使用简并性基因的集合有助于在一种混合物中提供编码所需集合的潜在蛋白质序列的所有序列。合成简并性寡核苷酸的方法为本领域技术人员所知(例如,Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3;Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人,(1984)Science198:1056;Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11:477)。
于在先技术中已知用于筛选组合文库(其已通过点突变或缩短来产生)中的基因产物及用于筛选cDNA文库中具有所选特性的基因产物的若干技术。这些技术可适用于快速筛选已通过本发明的同源物的组合诱变而产生的基因文库。最常用于筛选大基因文库的技术(其形成高通量分析的基础)包含克隆基因文库至可复制表达载体中,以所得载体文库转化合适细胞及在下述条件下表达组合基因,该条件下所需活性的检测有助于使得编码已检测到产物的基因的载体分离。循环整体诱变(Recursive ensemblemutagenesis,REM)(其为一种增加功能性突变体于文库中的出现率的技术)可与鉴别同源物的筛选测试(Arkin and Yourvan(1992)PNAS89:7811-7815;Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)组合使用。
3.2核酸及构建体
3.2.1核酸
本发明也提供编码具有苯乙醇脱氢酶活性的酶的核酸序列。
本发明也涉及与本文所述的特异性序列有某种程度同一性的核酸。
两种核酸之间的“同一性”应理解为核苷酸在各自总核酸长度上的相同性,尤其为借助于来自Informax(USA)的vector NTI suite 7.1软件,使用Clustal方法(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequencealignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989Apr;5(2):151-1),设定下列参数进行比较计算得到的同一性:
多重比对参数:
缺口开放罚分10
缺口扩展罚分10
缺口间隔罚分范围8
缺口间隔罚分关
比对延迟的同一性(identity for alignment delay)%40
残基特异性缺口关
亲水性残基缺口关
转变权重(Transition weighing)0
成对比对参数:
快速算法(FAST algorithm)开
K-元组尺寸(K-tuple size)1
缺口罚分3
窗口尺寸5
最佳对角线的数目5
或者,同一性也可根据Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tadashi,Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D.Multiple sequence alignment with the Clustal series ofprograms.(2003)Nucleic Acids Res 31(13):3497-500,根据因特网网址:http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#及下列参数来确定:
DNA缺口开放罚分15.0
DNA缺口扩展罚分6.66
DNA矩阵一致
蛋白质缺口开放罚分10.0
蛋白质缺口扩展罚分0.2
蛋白质矩阵Gonnet
蛋白质/DNA最终缺口-1
蛋白质/DNA缺口距离4
本文中提及的所有核酸序列(单链及双链DNA及RNA序列,例如cDNA及mRNA)可以本身已知的方式通过自核苷酸构件化学合成,例如通过使双螺旋的个别重迭互补核酸构件片段缩合而制造。寡核苷酸的化学合成可例如根据Phosphoamidite方法(Voet,Voet,第2版,Wiley Press NewYork,第896-897页)以已知方式进行。借助于DNA聚合酶的Klenow片段及连接反应及一般克隆方法进行的合成寡核苷酸的添加及缺口的填补描述于Sambrook等人(1989),Molecular Cloning:A laboratory manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press中。
本发明也提供编码上述多肽及其功能等效物之一的核酸序列(单链及双链DNA及RNA序列,例如cDNA及mRNA),其可例如使用人工核苷酸类似物获得。
本发明提供编码本发明的多肽或蛋白质或其生物活性片段的经分离核酸分子,以及可例如适用作用于鉴别或扩增本发明的编码核酸的杂交探针或引物的核酸片段。
此外,本发明的核酸分子可包含来自基因编码区域的3′-和/或5′-末端的未翻译序列。
本发明进一步包含与特定描述的核苷酸序列或其片段互补的核酸分子。
本发明的核苷酸序列可制造可用于鉴别和/或克隆其他细胞类型及有机体中的同源序列的探针及引物。这些探针或引物通常包含在“严格”条件(参见下文)下与本发明的核酸序列的有义链或相应反义链的至少约12,优选至少约25,诸如约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
“分离的”核酸分子是与存在于核酸的天然来源中的其他核酸分子分离且此外当其通过重组技术制造时可基本上不含其他细胞物质或培养基,或当其以化学方式合成时可基本上不含化学前体或其他化学物质。
本发明的核酸分子可借助于分子生物学的标准技术及本发明所提供的序列信息来分离。例如,可通过使用特定公开的全序列或其片段之一作为杂交探针及标准杂交技术(如例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.andManiatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版,ColdSpring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY,1989中所述)自合适的cDNA文库中分离cDNA。此外,包含所公开序列或其片段之一的核酸分子可通过聚合酶链反应,使用己基于此序列产生的寡核苷酸引物来分离。以此方式扩增的核酸可克隆至合适载体中且可由DNA序列分析来对其特征进行表征。本发明的寡核苷酸也可通过标准合成方法,例如使用DNA自动合成仪来制备。
本发明的核酸序列或其衍生物、这些序列的同源物或部分可例如使用常用杂交方法或PCR技术自其他细菌,例如通过基因组或cDNA文库分离。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。
“杂交”应理解为聚核苷酸或寡核苷酸在标准条件下(然而非互补配偶体之间的非特异性结合在这些条件下并不出现)结合至实际上互补序列的能力。对此,序列可为90-100%互补。能够特异性彼此结合的互补序列的特性使其适用于例如Northern印迹或Southern印迹技术中或适用于PCR或RT-PCR中的引物结合。
就杂交而言,宜使用保守区域的短寡核苷酸。然而,也可能使用本发明的核酸的较长片段或全序列以便杂交。这些标准条件视所用核酸(寡核苷酸、较长片段或全序列)或视用于杂交的核酸DNA或RNA的类型而不同。因此,举例而言,DNA:DNA杂交物的熔融温度比具有相同长度的DNA:RNA杂交物的熔融温度低约10℃。
标准条件应理解为例如视核酸而定介于42与58℃之间的平均温度,在浓度介于0.1与5×SSC(1×SSC=0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH7.2)之间的水性缓冲溶液中或另外在50%甲酰胺存在下,例如,42℃,于5×SSC中,50%甲酰胺。用于DNA:DNA杂交物的杂交条件宜为0.1×SSC及介于约20℃与45℃,优选介于约30℃与45℃之间的温度。就DNA:RNA杂交物而言,杂交条件宜为0.1×SSC及介于30℃与55℃,优选介于约45℃与55℃之间的温度。规定用于杂交的这些温度为具有约100个核苷酸长度及50%G+C含量的核酸在甲酰胺不存在下所计算出的熔融温度值的实例。DNA杂交的实验条件在相关遗传学教科书(例如Sambrook等人,“Molecular Cloning”,Cold Spring Harbor Laboratory,1989)中描述且可由本领域技术人员已知的公式来计算,例如随核酸的长度、杂交物类型或G+C含量而变化。本领域技术人员可在以下教科书中找到更多关于杂交的信息:Ausubel等人(编),1985,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York;Hames and Higgins(编),1985,NucleicAcids Hybridization:A Practical Approach,IRL Press at OxfordUniversity Press,Oxford;Brown(编),1991,Essential Molecular Biology:A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford。
“杂交”可尤其在严格条件下进行。这些杂交条件描述于例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,的Molecular Cloning(ALaboratory Manual),第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,第9.31-9.57页中或描述于Current Protocols Molecular Biology,JohnWiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中。
“严格”杂交条件尤其应理解为指:在42℃下,在由50%甲酰胺、5×SSC(750mM NaCl,75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5×Denhardt溶液、10%硫酸葡聚糖及20g/ml变性剪切鲑鱼精DNA组成的溶液中培育过夜,接着以0.1×SSC在65℃下洗涤滤膜(filter)的步骤。
本发明也提供特定公开或可衍生的核酸序列的衍生物。
因此,本发明的其他核酸序列可例如衍生自SEQ ID NO:1或3且可通过添加、取代、插入或缺失单一或多个核苷酸而与其不同,但仍编码具有所需特性谱的多肽。
本发明也包括那些包含所谓沉默突变或已对应于特殊来源或宿主有机体的密码子使用,与特定提及的序列(如天然产生的变异体,诸如剪接变异体或等位基因变异体)相比而有所改变的核酸序列。
同样提供可通过保守核苷酸取代(即所讨论的氨基酸经相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸置换)获得的序列。
本发明也提供通过序列多态性衍生自特定公开的核酸的分子。由于天然变异,所以这些遗传多态性可存在于群体内的个体之间。这些天然变异通常造成基因的核苷酸序列约1至5%的变化。
具有序列SEQ ID NO:1或3的本发明的核酸序列的衍生物应理解为指例如在所衍生氨基酸水平上在整个序列区域上具有至少60%同源性,优选至少80%同源性,尤其优选至少90%同源性的等位基因变体(就氨基酸水平上的同源性而言,应参考上文关于多肽的陈述)。在序列的部分区域上,同源性可有利地较高。
此外,衍生物也应理解为指本发明的核酸序列的同源物,尤其SEQ IDNO:1及3的同源物,例如真菌或细菌同源物、编码及非编码DNA序列的缩短序列、单链DNA或RNA。
此外,衍生物应理解为指例如具有启动子的融合物。在启动子的功能和/或有效性不受损情况下,在所述核苷酸序列的上游处连接的启动子因至少一个核苷酸交换、至少一个插入、倒位和/或缺失而改变。此外,启动子的有效性可通过改变其序列而提高或其可完全由甚至来自不同物种的有机体的更有效的启动子置换。
3.2.2制造功能性突变体
此外,用于制造本发明的酶的功能性突变体的方法为本领域技术人员所知。
视所用技术而定,本领域技术人员可将完全任意或另外更具目标性的突变插入基因或非编码核酸区域(其对于例如调节表达而言为重要的)中且随后产生基因文库。此所需的分子生物学方法为本领域技术人员所知且描述于例如Sambrook and Russell,Molecular Cloning.第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press 2001中。
改变基因且由此改变由这些基因所编码的蛋白质的方法早已为本领域技术人员所知,例如:
-位点特异性诱变,其中基因的一或多种核苷酸以靶向方式改变(Trower MK(编)1996;In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey);
-饱和诱变,其中可在基因中任何所需位置处改变或添加任何所需氨基酸的密码子(Kegler-Ebo DM,Docktor CM,DiMaio D(1994)NucleicAcids Res 22:1593;Barettino D,Feigenbutz M,Valcárel R,StunnenbergHG(1994)Nucleic Acids Res 22:541;Barik S(1995)Mol Biotechnol 3:1);
-易错聚合酶链反应(易错PCR),其中通过缺陷型DNA聚合酶使核苷酸序列突变(Eckert KA,Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res 18:3739);
-SeSaM方法(序列饱和法),其中由聚合酶防止优选的改变,Schenk等人,Biospektrum,Vol.3,2006,277-279;
-插入基因至突变株中,其中例如由于缺陷型DNA修复机制,所以核苷酸序列突变率增加(Greener A,Callahan M,Jerpseth B(1996)Anefficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain.In:Trower MK(编)In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,NewJersey),或
-DNA改组,其中形成并消化密切相关基因集合且片段用作聚合酶链反应的模板,其中通过重复链分离及再退火,最终产生全长嵌合基因(Stemmer WPC(1994)Nature 370:389;Stemmer WPC(1994)Proc NatlAcad Sci USA 91:10747)。
使用所谓定向进化(尤其描述于Reetz MT and Jaeger K-E(1999),Topics Curr Chem 200:31;Zhao H,Moore JC,Volkov AA,Arnold FH(1999),Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution,Demain AL,Davies JE(编)Manual of industrial microbiology andbiotechnology.American Society for Microbiology中),本领域技术人员可以靶向方式且以工业规模制造功能性突变体。此处,在第一步中,首先产生特定蛋白质的基因文库,其中,例如可能使用上文给出的方法。基因文库系以合适方式例如通过细菌或通过噬菌体展示系统表达。
表达具有基本上对应于所需特性的特性的功能性突变体的宿主有机体的相关基因可经受又一轮突变。突变及选择或筛选的步骤可反复进行直至所存在的功能性突变体具有足够程度的所需特性。由于此反复程序,所以有限量的突变,诸如1至5个突变可逐步进行且其对所讨论酶特性的影响可得以评估及选择。所选突变体可随后以类似方式经受又一突变步骤。因此,待要进行研究的个别突变体的数目可显著减少。
已通过根据SEQ ID NO:2的酶的易错诱变获得的本发明突变体的非限制性实例概括于以下表1中。
表1:通过易错诱变产生的突变体
本发明的结果也给出关于所讨论酶的结构及序列的重要信息,其为以靶向方式产生具有所需改良特性的其他酶所需。具体而言,所谓“热点(hotspots)”可定义为可能适用于通过插入目标突变而改良酶特性的序列片段。
本发明的酶的这些热点区域的非限制性实例为基于SEQ ID NO:2概括如下:
(1)142至153(环2)及
(2)190至211(螺旋αFG1)
(3)93至96(环1)
(4)241至249(C末端)
(5)138至141(结合袋的亲水性区域)及
(6)Cys61和/或Cys 83。
同样可能获得关于可进行区域突变(其多半对酶活性稍有影响且可称为潜在“沉默突变”)的氨基酸序列位置的信息。SEQ ID NO:2的这些突变位置概括于以下表2中:
表2:
Pos | Pos | Pos | Pos | |||||||
1 | Met | 65 | Gln | 103 | Phe | 196 | Ala | |||
2 | Thr | 68 | Asp | 104 | Glu | 198 | Ser | |||
3 | Gln | 70 | Glu | 107 | Lys | 199 | Ala | |||
6 | Lys | 71 | Ala | 108 | Lys | 202 | Asp | |||
7 | Asp | 74 | Lys | 111 | Glu | 203 | Val | |||
47 | Ala | 75 | Gln | 174 | Lys | 206 | Asn | |||
48 | Ala | 77 | Ile | 175 | Asp | 207 | Met | |||
50 | Arg | 78 | Ser | 188 | Arg | 208 | Leu | |||
51 | Asn | 95 | Leu | 192 | Thr | 216 | Val | |||
55 | Arg | 99 | Asp | 193 | Glu | 230 | Asp | |||
60 | Lys | 100 | Glu | 194 | Ala |
3.2.3构建体
此外,本发明提供表达构建体,其包含在调节性核酸序列的遗传控制下的编码本发明的多肽的核酸序列;及包含至少一种这些表达构建体的载体。
根据本发明,“表达单元”应理解为指具有表达活性的核酸,其包含如本文中所定义的启动子且在与待要表达的核酸或基因功能性连接之后,调节此核酸或此基因的表达,由此转录及翻译此核酸或此基因。因此,就此而论,也使用表述“调节性核酸序列”。除启动子之外,可存在其他调节元件,诸如增强子。
根据本发明,“表达盒”或“表达构建体”应理解为指与待表达核酸或待表达基因功能性连接的表达单元。与表达单元相比,表达盒因此不仅包含调节转录及翻译的核酸序列且也包含由于转录及翻译而表达为蛋白质的核酸序列。
在本发明的上下文中,术语“表达”或“过表达”描述在微生物中产生由相应DNA编码的一或多种酶或由相应DNA编码的一或多种酶的细胞间活性的提高。对此,举例而言,可将基因插入有机体中,所存在基因可由另一基因置换,基因的拷贝数可增加,可使用强启动子或可使用编码具有高活性的相应酶的基因,且可任选地合并这些措施。
本发明的这些构建体优选包含特定编码序列的5′-上游的启动子及3′-下游的终止子序列,以及任选地其他常用调节元件,其在各情况下与编码序列有效连接。
根据本发明,“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”应理解为指在与待转录核酸功能性连接时调节此核酸的转录的核酸。
在本文中,“功能性”或“有效”连接应理解为指例如具有启动子活性的核酸之一及待转录核酸序列及任选地其他调节元件(诸如确保核酸转录的核酸序列以及例如终止子)的依序排列,以此方式每一调节元件能够在核酸序列转录期间实现其功能。对此,在化学意义上的直接连接并非绝对必需。遗传控制序列(诸如增强子序列)可对来自其他远距离位置或甚至来自其他DNA分子的目标序列发挥其功能。优选的排列为待转录核酸序列位于启动子序列之后(即在3′末端)以便两个序列共价连接在一起。此处,启动子序列与待转基因表达的核酸序列之间的距离可小于200个碱基对,或小于100个碱基对或小于50个碱基对。
除启动子及终止子之外,其他调节元件的实例为目标序列、增强子、聚腺苷酸化信号、可选择标记物、扩增信号、复制原点及其类似物。合适调节序列描述于例如Goeddel,Gene Expression Technology:Methods inEnzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中。
具体而言,本发明的核酸构建体包含序列SEQ ID NO:1或3或其衍生物及同源物,以及可由此衍生出的核酸序列,其已与一或多个宜于控制(例如增加)基因表达的调节信号有效或功能性连接。
除这些调节序列之外,这些序列的天然调节仍可存在于实际结构基因的上游且任选地可以以关闭天然调节及增加基因表达的方式而被遗传改变。然而,核酸构建体也可在设计上更简单,也即不将额外调节信号插入编码序列的上游且未移除天然启动子连同其调节。除此之外,天然调节序列以不再有任何调节且基因表达增加的方式突变。
优选核酸构建体也宜包含一或多种在先提及的“增强子”序列,其与启动子功能性连接且能够增加核酸序列的表达。诸如其他调节元件或终止子的额外有利序列也可插入DNA序列的3′末端。本发明的核酸可存在于构建体中的一或多个拷贝中。构建体也可包含其他标记物,诸如抗生素抗性或营养缺陷型互补基因,任选地用于对构建体进行选择。
存在的合适启动子调节序列的实例诸如cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、lacIq-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR的启动子中或λ-PL启动子,其宜用于革兰氏阴性细菌。其他有利调节序列存在于例如革兰氏阳性(Gram-positive)启动子amy及SPO2中,酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中。也可能使用人工启动子用于调节。
对于在宿主有机体中表达,宜将核酸构建体插入载体(诸如质粒或噬菌体)中,该载体使得基因在宿主中最佳表达。载体不仅理解为指质粒及噬菌体,也应理解为指本领域技术人员已知的任何其他载体,例如病毒,诸如SV40、CMV、杆状病毒及腺病毒;转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒及线性或环状DNA。这些载体可在宿主有机体中自主复制或可经染色体复制。这些载体构成本发明的另一实施方案。
合适的质粒例如于大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI中,于链霉菌中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361中,于杆菌中的pUB110、pC194或pBD214,于棒状杆菌中的pSA77或pAJ667中,于真菌中的pALS1、pIL2或pBB116,于酵母中的2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23中或于植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。具体的质粒构成可能质粒的较少选择。其他质粒为本领域技术人员所熟知且可见于书籍克隆载体(Pouwels P.H.等人编Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)中。
在载体的另一实施方案中,包含本发明的核酸构建体或本发明的核酸的载体宜也可以线性DNA形式引入微生物中且借助于异源或同源重组整合至宿主有机体的基因组中。此线性DNA可由诸如质粒的线性化载体组成或仅由本发明的核酸构建体或本发明的核酸组成。
对于异源基因在有机体中的最佳表达,宜根据用于有机体中的特定“密码子使用”改变核酸序列。“密码子使用”可易于借助于对来自相关有机体的其他已知基因进行电脑分析加以确定。
本发明的表达盒通过将合适启动子融合至合适编码核苷酸序列且融合至终止子信号或聚腺苷酸化信号而制备。对此,使用通用重组及克隆技术,如例如T.Maniatis,E.F.Fritsch and J.Sambrook,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY(1989)以及T.J.Silhavy,M.L.Berman and L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,ColdSpring Harbor,NY(1984)及Ausubel,F.M.等人,Current Protocols inMolecular Biology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中所描述。
对于在合适宿主有机体中表达,宜将重组核酸构建体或基因构建体插入能够在宿主中最佳表达基因的宿主特异性载体中。载体为本领域技术人员所熟知且可见于例如“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人,编,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中。
3.3微生物
视上下文而定,术语“微生物”可理解为指野生型微生物或基因上经修饰的重组微生物或两者。
借助于本发明的载体,有可能制备例如已经至少转化了一种本发明的载体且可用于制造本发明的多肽的重组微生物。宜将上述本发明的重组构建体引入合适宿主系统中且表达。此处,本领域技术人员已知的例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染及其类似方法的常用克隆及转染方法优选用以引起这些核酸在特定表达系统中的表达。合适系统描述于例如Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel等人,编,WileyInterscience,New York 1997或Sambrook等人Molecular Cloning:ALaboratory Manual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中。
用于本发明的核酸或核酸构建体的合适重组宿主有机体通常为所有原核或真核有机体。所用宿主有机体宜为诸如细菌、真菌或酵母的微生物。宜使用革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌,优选来自肠杆菌科(Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌,尤其优选大肠杆菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡菌属(Nocardia)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia)、沙氏杆菌属(Salmonella)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、梭菌属梭状芽孢杆菌属(Clostridium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。极其优选为大肠杆菌属及种。此外,其他有用细菌可见于α-变形菌(proteobacteria)、β-变形菌或γ-变形菌的群组中。
就此而论,本发明的宿主有机体优选包含至少一种核酸序列、核酸构建体或载体,其编码具有根据本发明中所描述的上述定义的苯乙醇脱氢酶活性的酶。
视宿主有机体而定,本发明的方法中所用有机体以本领域技术人员已知的方式生长或培养。通常,微生物在介于0℃与100℃之间,优选介于10℃且60℃之间的温度下,有氧气存在,于包含主要呈糖形式的碳源、主要呈诸如酵母提取物的有机氮源形式的氮源或诸如硫酸铵的盐、诸如铁、锰及镁盐的痕量元素及任选地存在的维生素的液体培养基中生长。此处,营养液体的pH值可保持在固定值,也即在培养期间调节或不调节。培养可为分批、半分批或连续的。营养物最初可在发酵开始时引入或可半连续或连续加入。
3.4本发明酶的重组制备
本发明进一步提供重组制备本发明的多肽或其功能性、生物活性片段的方法,其包含培养产多肽的微生物,任选地诱导多肽的表达及自培养物分离这些多肽。若需要,也可以此方式以工业规模制造多肽。
根据本发明所制备的微生物可于分批法(分批培养)中或于给料分批法(给料法)中或重复给料分批法(重复给料法)中持续或间断地培养。关于已知培养方法的概述可见于以下教科书中:Chmiel(Bioprozeβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocessing technology 1.Introduction to bioprocessing technology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))或Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen[Bioreactors and peripheral devices](Vieweg Verlag,Braunschweig/Wiesbaden,1994))。
待使用的培养基必须适当地满足特定菌株的需求。不同微生物的培养基的描述可见于美国细菌学协会(American Society for Bacteriology)的手册“Manual of Methods for General Bacteriology”(Washington D.C.,USA,1981)中。
可根据本发明使用的这些培养基通常包含一或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或痕量元素。
优选碳源为糖,诸如单糖、二糖或多糖。非常优选的碳源为例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。也可能通过诸如糖蜜的复合物或其他糖精制的副产物将糖添加至培养基中。有利地也可添加不同碳源的混合物。其他可能碳源为油类及脂肪类,诸如大豆油、葵花子油、花生油及椰子脂;脂肪酸,诸如棕榈酸、硬脂酸或亚麻酸;醇类,诸如甘油、甲醇或乙醇;及有机酸类,诸如乙酸或乳酸。
氮源通常为有机或无机氮化合物或包含这些化合物的材料。氮源的实例包含氨气或铵盐,诸如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵;硝酸盐;尿素;氨基酸或复合氮源,诸如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉汁及其他。氮源可单独或以混合物形式使用。
可存在于培养基中的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜及铁的氯盐、磷酸盐或硫酸盐。
可使用的硫源为无机含硫化合物,诸如硫酸盐、亚硫酸盐、二硫酸盐、四硫化物、硫代硫酸盐、硫化物;以及有机硫化合物,诸如硫醇(mercaptans)及硫醇(thiols)。
可使用的磷源为磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
可将螯合剂添加至培养基中以使金属离子保持于溶液中。尤其合适的螯合剂包含二羟基酚(dihydroxyphenol),诸如儿茶酚或原儿茶酚酯(protocatechuate),或有机酸,诸如柠檬酸。
根据本发明使用的发酵培养基通常也包含其他生长因子,诸如维生素或生长促进剂,其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸盐及吡哆素。生长因子及盐通常源自于复合培养基组分,诸如酵母提取物、糖蜜、玉米浆及其类似物。此外,合适前体可添加至培养基中。培养基化合物的精确组成主要视特定实验而定且对于各特殊情况可单独判断。关于培养基优化的信息可自以下教科书获得:“Applied Microbiol.Physiology,A Practical Approach”(编者P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRL Press(1997)第53-73页,ISBN 0199635773)。诸如标准液1(Merck)或BHI(脑心浸液,DIFCO)及其类似物的生长培养基也可自贸易供应商获取。
通过加热(在1.5巴及121℃下20min)或通过无菌过滤对所有培养基组分杀菌。这些组分可一起杀菌或必要时分别杀菌。所有培养基组分可于培养开始之时存在或可任选地持续或分批添加。
培养物的温度通常介于15℃与45℃,优选25℃至40℃之间且可在实验期间保持恒定或变化。培养基的pH值应在5至8.5的范围内,优选为约7.0。培养物的pH值可在培养期间通过添加诸如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水的碱性化合物或诸如磷酸或硫酸的酸性化合物得以控制。为了控制泡沫,可使用诸如脂肪酸聚乙二醇酯的消泡剂。为保持质粒的稳定性,可添加诸如抗生素的合适选择性物质至培养基中。为保持需氧条件,将氧或含氧气体混合物(例如环境空气)引入培养物中。培养物的温度通常为20℃至45℃。持续培养直至形成最大量的所需产物。此目标通常在10小时至160小时过程中达到。
发酵液随后进行进一步处理。视需要而定,可通过诸如离心、过滤、倾析或这些方法的组合的分离方法自发酵液全部或部分移除生物质或生物质可完全保留于该发酵液中。
若多肽不分泌至培养基中,则这些细胞也可破裂且通过已知蛋白质分离法自裂解物获得产物。细胞可任选地通过高频超声,通过高压,例如在弗氏细胞压碎器(French pressure cell)中,通过渗透分解(osmolysis),在去污剂、分解酶或有机溶剂的作用下,通过匀浆器或通过若干所列方法的组合破裂。
多肽的纯化可使用以下方法达成:已知层析法,诸如分子筛层析(凝胶过滤),诸如Q-琼脂糖层析、离子交换层析及疏水性层析;以及其他常用方法,诸如超滤、结晶、盐析、渗析及非变性凝胶电泳。合适方法描述于例如Cooper,T.G.,Biochemische Arbeitsmethoden[Biochemicalprocedures],Verlag Walter de Gruyter,Berlin,New York or in Scopes,R.,Protein Purification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin中。
为分离重组蛋白质,宜使用载体系统或寡核苷酸,其将cDNA延长特定核苷酸序列长度且因此编码经修饰的多肽或融合蛋白,这些经修饰的多肽或融合蛋白用于例如更简易纯化。此类合适修饰系例如起锚定物作用的所谓的“标签(tag)”,例如称为六聚组氨酸锚定物的修饰,或可由抗体识别为抗原的表位(描述于例如Harlow,E.及Lane,D.,1988,Antibodies:ALaboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press)中)。这些锚定物可用来将蛋白质紧固于诸如聚合物基质的固相支撑物上,固相支撑物可例如用作层析柱中的填充物或可在微量滴定板上或某些其他支撑物上使用。
同时,这些锚定物也可用于识别蛋白质。对于识别蛋白质,另外可能使用常用标记物,诸如萤光染料、酶标记物(其在与底物反应之后形成可检测的反应产物)、或放射性标记物,这些标记物单独使用或与锚定物组合使用以便蛋白质衍生。
对于本发明突变体的表达,可参考WO2005/108590及WO2006/094945(明确地对其进行参考)中对野生型酶EbN1的表达及可用于其的表达系统的描述。
3.5酶固定
本发明的酶可以游离形式或固定化形式用于本文所述的方法中。固定化酶应理解为指已固定于惰性支撑物上的酶。合适支撑物材料及固定化于其上的酶自EP-A-1149849、EP-A-1069183及DE-A100193773以及其中所引用的文献来源已知。就此而言,参考这些说明书的全部公开内容。合适支撑物材料包括例如粘土、粘土矿物、诸如高岭石、硅藻土(diatomerousearth)、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉末、阴离子交换材料、合成聚合物,诸如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚醛树酯、聚氨基甲酸酯及聚烯烃,诸如聚乙烯及聚丙烯。支撑物材料以呈细粉状微粒形式(优选为多孔形式)用于制造经支撑的酶。支撑物材料的粒度通常不超过5mm,具体而言不超过2mm(筛线(sieve line))。类似地,当使用作为全细胞催化剂形式的脱氢酶时,可使用其游离或固定化形式。支撑物材料例如藻酸钙及角叉菜胶。如细胞的酶也可与戊二醛直接交联(交联于CLEA)。相应及其他固定化方法描述于例如J.Lalonde及A.Margolin“Immobilization of Enzymes”,K.Drauz及H.Waldmann,EnzymeCatalysis in Organic Synthesis 2002,第III卷,991-1032,Wiley-VCH,Weinheim中。其他关于用于进行本发明方法的生物转化及生物反应器的信息也可见于例如Rehm等人(编)Biotechology,第2版,第3卷,第17章,VCH,Weinheim中。
现将参考下列非限制性实施例更详细描述本发明。
实验部分
实施例1:饱和诱变
1.1分子模型
参考酶苯乙醇脱氢酶EbN1的晶体结构选择突变(图2)。
由两个环区域及一个螺旋(环1及2及螺旋αFG1,于图2中)确定酶的底物特异性。螺旋αFG1为柔性的且在结合底物之后靠近活性中心。环1上的Tyr 93靠近底物结合袋前部且藉此负责立体选择性。Tyr151属于环2且指向结合袋中。Thr192为柔性螺旋αFG1的一部分且指向底物结合位点的方向。选择这两个位置是因为其影响底物结合而不干扰催化中心中的氨基酸及辅因子NAD(即催化机理)。
1.2饱和诱变
首先,分别在位置Y151X及T192X处进行饱和诱变(即,用所有其他19个氨基酸改变位置Y151与T192,也称作置换(permutation)),随后产生双突变体(Y151A-T192X)。
此举借助于在各情况下于三个聚合酶链反应中的定点诱变进行(参见克隆策略,图3)。此处,将下列寡核苷酸用于扩增DNA:
1)Mke123正向(upper):5’-GTTCATCTTTCCCTGGTTG-3’(SEQID NO:5)
2)Mke124反向(lower):5’-GCTACGGCGTTTCACTTC-3’(SEQID NO:6)
3)Mke798Y151X反向:5’-GTAATGGGTNNNCGCCTCGA-3’(SEQID NO:7)
4)Mke793Y151X正向:5’-TCGAGGCGNNNACCCATTAC-3’(SEQ IDNO:8)
5)Mke796T192X正向:5’-CGGCAACANNNGAAGCGTC-3’(SEQ IDNO:9)
6)Mke797T192X反向:5’-GACGCTTCNNNTGTTGCCGT-3’(SEQID NO:10)
7)Mke951Y151AT192X:5’-GGCAACANNNGAAGCGTC-3’(SEQID NO:11)
8)Mke952Y151AT192X:5’-GACGCTTCN N NTGTTGCC-3’(SEQ IDNO:12)
用于扩增ebn1H基因片段的PCR如下进行:100μl反应混合物,其包含1μl模板(约50ng载体pDHE-ebn1H)、在各情况下1μl寡核苷酸(20ng)、2ul dNTPMix(10mM最终浓度,来自Roche)、1μl Pfu-Ultra DNA聚合酶(1U/ul,来自Stratagene)、10μl 10X Pfu-Ultra缓冲液(Stratagene)及80μl无菌水。
于热循环器(Biometra)上设定下列温度程序:95℃-5min;30个循环:95℃-45sec,50℃-45sec,72℃-45sec;72℃-10min;10℃
1a)PCR寡核苷酸1及3(对于T192X为6)
1b)PCR寡核苷酸2及4(对于T192X为5)
2)PCR寡核苷酸1及2,来自PCR 1a及b的产物作为模板(重迭延长)
使用GFX试剂盒(GE Healthcare)在1.2%琼脂糖凝胶上纯化由此获得的经扩增的ebn1基因。
使用限制酶NdeI及HindIII(Fermentas)裂解经扩增的DNA,将其连接至载体pDHE的多重克隆位点(MCS)上(同样以NdeI-HindIII裂解)且转型转化于XL10超感受态细胞(Stratagene)中。通过这些细胞的小规模制备,获得突变体的质粒DNA。载体pDHE于DE 19848129或WO2005/108590中称为pDHE19.2载体。
1.3细胞培养
载体pDHE-ebn1H-Y151X或pDHE-ebn1H-T192X(及稍后pDHE-ebn1H-Y151A-T192X)首先转化至菌株LU12037(大肠杆菌衍生物TG10 pAgro4 pHSG575(TG10:来自大肠杆菌TG1(Stratagene)的RhaA-衍生物;pAgro4:Takeshita,S;M;M;Masahashi,W;T(1987)Gene 61,63-74;pHSG575:T.Tomoyasu等人(2001),Mol.Microbiol.40(2))中,其共表达伴侣蛋白GroEL/S及laclq抑制子,且铺板于Q-tray培养板上。使用挑取机器人(Qpix)挑取生长菌落且将其接种于微量滴定板(MTP)中具有抗生素(100μM氨苄青霉素、20μM氯霉素及100μM壮观霉素)的CG预培养物(Circular Growth,Gibco)中。在37℃及200rpm下生长5h之后,将细胞手工转移至具有抗生素(参见上文)及相应诱导剂(鼠李糖0.5g/l及IPTG 0.1mM)的LB主培养物中。生长16-18h之后,将细胞用于测试中。
为使细胞破裂,首先离心这些细胞,将上清液撇掉且用粘性膜制备MTP。将MTP完全渍浸于液氮中历时约3秒且随后再次安置于试验架上以解冻。最一致结果在3次快速冷冻和在室温下间隙解冻的更迭情况下获得。
1.4酶抑制
已发现TAC反应产物TACA或在反应期间形成的次要组分抑制反应。底物不完全转化。尽管此处反应为平衡反应,但例如在4小时的后重新添加细胞和/或底物,并无另外反应发生。此外,通过蒸馏移除所得2-丁酮以使平衡尽可能移向产物侧。尽管采用这些措施,但未实现完全转化。
因此,目标在于寻找未必耐受活性更高但主要耐受较大量的产物或次要组分以实现可能的最完全转化且由此产生高时空产率的突变体。
在随后的测试中,TACA以及TA或TAA作为抑制剂受到测试。对此,在0.2ml混合物(MTP)中,将在100ml摇瓶中50μl来自培养物的细胞(LU11558;具有鼠李糖-诱导型pDHE1650衍生物作为过度表达质粒的大肠杆菌TG10+菌株;伴侣蛋白GroEL/S及laclq抑制子共表达;野生型酶EbN1过度表达)、1.75mM NAD及100mM 2-丁醇添加至80mM TrisHCl缓冲液pH 8.0中。每次向其中添加10mM TA、TAA或TACA。接着,在340nm下,于光度计中,测量NADH的形成。图4通过给出特定V最大值(根据时间所得NADH的量)说明对苯乙醇脱氢酶EbN1的抑制。对照组(无抑制剂)由ButOH表征。
如图4中可见,TACA展示最强抑制。因为TA在此波长范围内吸收最强烈,所以此处不能检测到NADH的形成。
因此,在其他测定中添加TACA作为抑制剂。另外,也将TACA作为抑制剂添加至在先已进行的含有2-丁醇及NAD的再生测试中。为了确定合适的TACA浓度,测试细胞及TACA的各种浓度。最初,制备0至30mM的浓度系列,接着制备介于0与10mM之间的浓度系列。基于所获结果(未图示),将10mM的TACA浓度及在各情况下25μl细胞用于其他测试中。
1.5添加及不添加TACA的2-丁醇测试的进程(辅因子再生)
此处,根据氨基酸位置挑取所有克隆的两个微量滴定板(96孔)。微量滴定板完全测序且将值指定给个别突变。
如上所述培养细胞,接着细胞破裂且最终再悬浮于100μl水中。将25μl此细胞悬浮液置于新的微量滴定板中且以水补足至100μl体积。接着添加底物溶液(最终浓度:100mM 2-ButOH、1.75mM NAD、80mM TrisHCl pH8.0,(10mM TACA))且于光度计中,在340nm下测量NADH的形成。来自该测试的结果展示于图5A及5B中。展示V最大值。
图5A及B展示大部分突变体不再能使辅因子再生或仅可极其缓慢地使辅因子再生(丁醇测试,深色条形图)。然而,通过添加TACA至丁醇测试中(淡色条形图),这些突变体可使辅因子再生,且实际上超过对照组(野生型)。此处据推测,代替2-丁醇变为2-丁酮,TACA氧化为TAC。这些突变体与野生型相比耐受较大量TACA。
检测到遗漏突变体(位置T192N、D、Q、H、K、M、F、Y及位置Y151C、F、S),但这些突变体无活性或活性劣于对照组。下列突变体选自实验:Y151A、E、G、H及T192A、G、L、I,以便以更大规模来对其进行测试。
1.6验证阳性突变体
接着大规模地研究由此测试出现的阳性克隆(培养于100ml摇瓶中)。此处,进行三种不同测定:
测试1)添加NADH,将TAC还原为TACA
测试2)完全反应:TAC还原为TACA,借助于异丙醇使辅因子再生
测试3)将TACA氧化为TAC
个别测试的测试条件为:
测试1)通过添加NADH将TAC还原为TACA
798.6 | μl | 去矿物质水 |
50 | μl | 1M NaH2PO4 pH5 |
50 | μl | NADH(100mM于水中的储备溶液) |
1.4 | μl | TAC |
100 | μL | 来自摇瓶的培养物的10倍粗提取浓缩物 |
1000 | μl | 最终体积 |
测试2)完全反应
730 | μl | 去矿物质水 |
50 | μl | 1M NaH2PO4pH5 |
20 | μl | NAD 10mM,于水中 |
100 | μl | 100mM TAC(14μL于1ml异丙醇中) |
100 | μl | 来自摇瓶的培养物的10倍粗提取浓缩物 |
1000 | μl | 最终体积 |
测试3)将TACA氧化为TAC
798.6 | μl | 去矿物质水 |
50 | μl | 1M NaH2PO4pH5 |
50 | μl | NAD(10mM储备溶液) |
1.4 | μl | TACA |
100 | μl | 来自摇瓶的培养物的10倍粗提取浓缩物 |
1000 | μL | 最终体积 |
在上述测试中,测试温度在各情况下为30℃,酶浓度在0.1-10mg/ml之间。
以浓HCl终止样品及借助于HPLC测量样品。
HPLC条件:
滞留时间:TACA=1.283min(230nm)
TAA=0.910min(230nm)
TA=1.168min(260nm)
TAC=1.540min(260nm)
实验结果概括于以下部分中:
1.6.1突变体T192X
图6A展示突变体T192L及T192G与对照组LU11558相比更快速还原TAC。然而,若考虑到完全反应(图6B),则野生型活性最大,因为其他突变体也不能使辅因子再生。
在图6C中,可见突变体T192A与野生型相比可更好地氧化TACA,其中所形成的TAC浓度极低且因此结果在测试期间发生波动。
1.6.2突变体Y151A
在图7A中,可见突变体Y151A及Y151H还原辅因子TAC的速度为野生型(LU11558)的大约4-5倍。然而,若考虑到完全反应,TAC还原为TACA,借助于牺牲醇(此处为2-丙醇)使辅因子再生,则仅突变体Y151A仍有活性(图7B)。总活性稍微低于在对照组情况下的总活性。由于放大结合袋,所以用于反应器中的“较小(small)”异丙醇以及2-丁醇可能不能氧化。与野生型相比,突变体Y151A及Y151H可更好氧化TACA(图7C)。
突变体Y151A以21升规模发酵且用于4升反应器中,其中2-丁醇作为再生剂且也作为溶剂以便使其与野生型相当。
1.6.3第二代:突变体Y151A-T192X
因为突变体Y151A优于野生型,基于此突变体,在位置T192X处进行二次饱和诱变。
2-丁醇的再生测试的结果(其中确定添加及不添加TACA的牺牲醇的再生,也即在光度计中测量NADH的形成)展示于图8A中。
突变体T192I及S结果比对照组(Y151A-T192T)更好。因此以更大规模(在100ml摇瓶中培养)研究这些物质。此外,也以更大规模研究突变体T192A、L及V,因为这些突变体呈现与对照组大致相同的活性。然而,若考虑该五种突变体的完全反应,则对照组活性最高(参见图8B,其中通过HPLC测量TACA的形成,以i-PropOH作为牺牲醇),且因此将单一突变体Y151A用于其他实验中。
1.74升反应器
以21升规模发酵由此筛选出现的活性更高的突变体Y151A若干次。运行一系列标准反应器批次以将其以更大规模与对照组LU11558进行比较。
1.7.1批次:
在装备有搅拌器及冷凝器的可加热4l升反应器中,最初将2升的2-丁醇引入20mM KH2PO4缓冲液pH 5.0中。添加0.2mM NAD(0.5g)及400mM TAC(275g)或600mM(420g)。通过添加全细胞(未经处理发酵器产物)形式的生物催化剂(450ml,7.0g/l BTM),开始反应。一旦将细胞添加至发酵培养基中后,pH值增至6。在40℃及减压(110mbar)下搅拌两相反应混合物。此处,一级单步骤馏出2-ButOH、2-丁酮及水的混合物。同时,添加等量由69%2-丁醇及31%H2O组成的溶液(对应于缺少2-丁酮的馏出物的组成)作为进料。借助于pH值滴定器检验pH值且将其保持恒定介于pH~5.5-6.0之间。每小时采集样品,将其以浓盐酸终止且借助于HPLC(LJ31366)分析。8h之后,排放反应混合物。
1.7.2野生型(LU11558)与突变体Y151A(LU14759)的比较
运行若干次突变体的4升反应器,首先以400mM(约70g/l)TAC,接着以600mM(105g/l),以便看看突变体是否耐受更大量的产物/次要组分。
图9A展示突变体优于野生型平均15-20%。可见,尽管值在各实验之间是波动的(此也视个别发酵反应而定),但差异是显著的。在野生型的情况下平均产率为67%±8%且在突变体的情况下平均产率为86%±7%,这些在各情况下进行不同的发酵。TACA/(TAC+TA)的比率(淡色条形图)在突变体(4.8)情况下比对照组的情况(3.0)也显著更佳,其稍后于甲胺化反应中变得确实明显。
若考虑以600mM TAC运行(图9B),则此处同样突变体产生比对照组更佳的结果。然而,TACA/(TAC+TA)比率显著劣于在400mM运行的情况下的比率。
1.8结果
通过合理设计,已可能找到突变体Y151A(LU14759),其与野生型(LU11558)相比有15%-20%更高的活性且在制备度洛西汀醇的中间物期间耐受更大量的TACA和/或TA。
在一系列4升标准反应器(其反映小规模生产过程)中此结果已得以证实。
因为已用抑制剂TA解析出酶的晶体结构,所以有可能确立酶-底物复合物的可靠模型。由模型明显可见酪氨酸151的OH基团与底物(在此情况下为TA)的丙酮侧链的β碳原子紧密接触且因此形成弱的CH-O氢键(图10A)。由于酪氨酸151突变为丙氨酸,所以此相互作用增强且结合削弱(图10B)。所有其他相互作用保持,指尽管结合袋的尺寸增大但酶的优良选择性不变。此外,产物的ee值为>99.5%。
实施例2:随机诱变
2.1测试开发用于机器人装置
为了处理通过随机诱变而产生的大样本数量,有必要开发一种用于机器人生产线的光度计测定法来代替迄今实验室中的HPLC分析(其中直接检测产物)。
对此,可在340nm下测量还原辅因子NADH的减少,因为在此波长下消光系数为εNAD<<εNADH。最佳NADH浓度为0.02mM。可使用介于1与2mM之间的底物TAC。所用缓冲液为50mM NaH2PO4 pH 5.0,因为TAC还原为TACA的过程优选在稍微酸性条件下进行。表达突变体的细胞直接于微量滴定板(MTP)中培养。对此,使用挑取机器人(Qpix)自琼脂平板挑取克隆且将其接种于具有抗生素(100μM氨苄青霉素、20uM氯霉素及100μM壮观霉素)的LB预培养物中。在37℃及200rpm下生长24h的后,将细胞手工转移至具有抗生素及诱导剂(鼠李糖0.5g/l及IPTG0.1mM)的LB主培养物中。生长16-18h之后,将细胞用于测试中。
初步实验已展示来自培养物的细胞必须在测定之前破裂,否则活性将过低。测试用于使细胞破裂的各种方法,例如在4℃下储存细胞过夜,添加1-丁醇及1,4-丁二醇且以液氮快速冷冻。仅在4℃下储存且以液氮快速冷冻奏效,优选以液氮处理是由于节省时间。出于此目的,首先使生长细胞离心,将上清液撇掉且以粘性膜封闭MTP。将MTP完全渍浸于液氮中历时约3秒且随后再次放下以便解冻。最一致结果在4次快速冷冻和间隔在室温下解冻的情况下获得。
2.2机器人测试的进程
如上所述培养细胞且随后使其破裂。MTP装备有盖子且将其置于机器人装置中15℃下的保温箱中。于Multidrop中,每孔添加100μl水以便接着将细胞再悬浮于Packard中。随后,于Multidrop中,添加底物溶液(最终浓度:2mM TAC、0.2mM NADH、50mM NaH2PO4 pH 5.0)且于光度计中在340nm下确定NADH的减少。
接着以更大规模更充分地研究由此测试出现的阳性克隆。对此,进行三种不同测定。
测试A完全反应:TAC还原为TACA且以异丙醇(50mM NaH2PO4 pH5.0、0.2mM NAD、10mM TAC、10%异丙醇)使NADH再生,测量HPLCLJ31366
测试B于光度计中,以2-丁醇作为再生剂(80mM TrisHCl pH 8.0、100mM 2-丁醇、1.75mM NAD)使NAD再生为NADH
测试C于光度计中,添加NADH(50mM NaH2PO4 pH 5.0、0.2mMNADH、1.4μl TAC纯(10mM))使TAC还原为TACA
来自三种测定结果的比较揭示NAD的再生(也即测试B)反映的结果为完全反应显著优于最初用于机器人测试中的TAC还原为TACA。
初步实验同样指示以2-丁醇使辅因子再生(由此形成NADH)仅在表达生物催化剂的细胞的情况下发生。因此,机器人测试转向检测使用2-丁醇使NADH再生。然而,与此同时,仍测量到TAC还原为TACA,由此NADH减少。
2.3经改良的机器人测试的进程
培养细胞且随后使其破裂。MTP装备有盖子且将其置于机器人装置中15℃下的保温箱中。于Multidrop中,每孔添加100μl水以便随后再悬浮细胞。由此,产生具有20μl/孔(对于测定:辅因子的再生)或70μl/孔(对于测定:TAC的还原)细胞悬浮液的两个子板。添加底物溶液(最终浓度:还原:2mM TAC、0.2mM NADH、50mM NaH2PO4pH 5.0;再生:100mM2-丁醇、1.75mM NAD、80mM TrisHCl pH 8.0)且于光度计中在340nm下确定NADH的形成。
2.4评估机器人测试结果
于机器人筛选中,以光度测定法确定NADH的形成/减少(还原/氧化)。对此,在各情况下经10min确认10个测量值。通过计算自这些值的增加,确定脱氢酶的起始活性。
2.5抑制酶反应
初步实验已展示产物TACA或在反应期间形成的次要组分抑制反应。底物不完全转化。
因此,目标在于寻找不仅耐受活性更高而且耐受更大量的产物或次要组分以实现尽可能完全的转化且由此产生高时空产率的突变体。
出于此原因,于测定中添加TACA。对此,将另外10mM TACA添加至迄今以2-丁醇及NAD进行的再生测试中。
由于有限的生物质量,不可能于机器人筛选中同时进行所有三种测试。因此,省略TAC还原为TACA的反应。以2-丁醇进行的NADH的再生反应保持不变。TAC溶液经用于TACA抑制的底物溶液(100mM 2-丁醇、1.75mM NAD、10mM TACA、80mM TrisHCl pH 8.0)置换。机器人测试的进程保持不变。
因此评估适合于测量TACA抑制。
2.6制备突变体文库:EbN1基因的随机诱变
为了在编码脱氢酶的序列中产生突变,添加MnCl2来进行易错PCR反应(易错聚合酶链反应)。借助于MnCl2,所用Taq-DNA聚合酶的特异性降低,因此,当MnCl2浓度增加时,更多错误核苷酸并入插入且因而产生更多突变。
对于PCR,选出具有克隆裂解位点(NdeI-Hind III)的以下寡核苷酸,其覆盖DNA的最短可能区域以便突变也可出现于起始及末端区域中:
Mke1235’-GTTCATCTTTCCCTGGTTG-3’(SEQ ID NO:13)
Mke1245’-GCTACGGCGTTTCACTTC-3’(SEQ ID NO:14)
Mke1245′-GCTACGGCGTTTCACTTC-3′(SEQ ID NO:14)
批次:
于50μl PCR批次中:50ng具有脱氢酶基因的质粒DNA(pDHE-ebn1H),在各情况下120ng寡核苷酸、GCRich-反应缓冲液1×(Roche)、1/5体积GCRich分离溶液(resolution)(Roche),在各情况下0.2mM dATP、dTTP、dCTP、dGTP、1U Taq DNA聚合酶。
将此批次在95℃下加热5min(DNA初始变性)且随后冷却至85℃。在该温度下,添加各种浓度的MnCl2(自0-mM至1mM,以0.02mM为梯度)。此为必需的以便MnCl2完全溶解。随后使用以下温度程式起始实际PCR:4个循环:95℃历时45秒、54℃历时45秒、72℃历时45秒;接着26个循环:95℃历时45秒、58℃历时45秒、72℃历时45秒;10℃停止。
在琼脂糖凝胶(Gfx试剂盒)上纯化PCR产物且随后以酶NdeI及HindIII(两者均来自NEB)进行限制裂解。在连接至载体pDHE(同样为NdeI/HindIII裂解)中后,在来自Stratagene的XL10超感受态细胞中进行转化。随后通过分析一些克隆的序列来确定最佳MnCl2浓度(每种浓度16个克隆)。就此而论,进一步在可产生1-3个碱基对交换的MnCl2浓度下进行其他研究。对此,首先将连接反应批次转化至XL10感受态细胞中,计算克隆数量且随后自用涂布LB培养基自琼脂平板溶离洗脱所有克隆。在未进一步培育细胞的情况下分离(Promega试剂盒)质粒DNA且将以此方式分离的DNA转化至生产菌株TG10(其也共表达伴随侣蛋白pAgropHSG)中且析出铺板于Q-托盘平板上。此程序为必需的,因为生产菌株TG10+(LU12037)在连接反应期间的转化率极低且需要尽可能多的突变体。
2.7所选突变体
上述表1出示选自机器人测试的克隆的概述。这些克隆源自于已完全测序的验证平板。以更大规模培养这些克隆且首先于Eppendorf中进行测试。然而,此处,大部分突变体的活性与野生型相当。由活性更高的突变体(例如K114T及M200V F201L)进行21升规模发酵反应且于0.5升反应器中进行测试。
在装备有搅拌器及冷凝器的可加热0.5升反应器中,最初将250ml 2-丁醇引入20mM KH2PO4缓冲液pH 5.0中。添加0.2mM NAD(0.1g)及400mM TAC(35g)。通过添加呈全细胞(未经处理发酵器产物)形式的生物催化剂(45ml,5.5g/lBTM),开始反应。一旦将细胞添加至发酵培养基中后,pH值增至6。在40℃及减压下(110毫巴mbar)搅拌两相反应混合物。此处,以单步骤馏出2-ButOH、2-丁酮及水的混合物。同时,添加等量由69%2-丁醇及31%H2O组成的溶液(对应于缺少2-丁酮的馏出物的组成)作为进料。使用pH滴定器检验pH值且将其保持恒定介于pH~5.5-6.0间。每小时采集样品,将其以浓盐酸中止终止且借助于HPLC(LJ31366)分析。8h后,排放反应混合物。
单个步骤的误差分析展示最大误差在于微量滴定板中单个克隆的生长中。此事实并不奇怪,因为微量滴定板中的生长条件(温度、氧气引入等)不能如同于发酵器中一样受到精确控制。甚至同一菌株的不同发酵也波动约10%-15%。此机器人筛选的总误差为约35%。即于此筛选中,仅呈现大于35%的增加的突变体有意义。
实施例3:定点诱变及其他饱和诱变
在其他所选目标位置上进行已受到测试的单一突变(“定点诱变”)或饱和诱变。
3.1选择进行突变的位置
由环1、2及螺旋αFG1形成酶的底物结合袋(参见图2)。大部分突变选自此区域,因为可预期这些氨基酸对底物结合和/或酶的活性具有直接影响。
螺旋在无底物的情况下非常灵活(于晶体中不能见到电子密度)且仅在底物结合后变得固定。将具有底物结合袋的活性中心分成疏水性区域与亲水性区域。疏水性部分主要由两性螺旋αFG1形成,其在底物结合之后,像盖子一样位于底物结合袋上。氨基酸192至204在此区域之内。氨基酸Thr192、Leu197、Met200及Leu204的侧链指向结合袋中而氨基酸Phe201用以稳定该环。具有OH基团的苏氨酸192形成活性中心的疏水性区域与亲水性区域之间的边界。Leu186位于柔性螺旋的起始处且充当铰链以呈现活性中心的开放及关闭状态。甲硫氨酸246位于底物结合袋的末端。底物结合袋的另一侧形成具有氨基酸146至151的环βEαF。此处,所选氨基酸Leu146、11e148及Tyr151的侧链也指向结合袋中。酪氨酸151的末端OH基团属于活性中心的亲水性部分的氢键网的一部分而其余侧链属于疏水性部分。活性中心的主要亲水性下侧形成氨基酸138-142的链,此处氨基酸Leu139、Thr140及Thr142已被突变。因为半胱氨酸一般对氧化反应敏感且可藉此对结构具有不利影响,所以选择两个半胱氨酸62及83来突变。
图11展示来自活性中心的一部分。以紫色标记辅因子,以绿色标记底物(此处为TA),突出突变氨基酸。在上区中,可见两性螺旋αFG1且于下区中可见环βEαF(环2)。
3.2制备目标突变体
首先,对于DNA突变的各别位置,选择对应于所需DNA序列的两个互补寡核苷酸(参见表2)。另外,也选择全基因两侧的两个其他寡核苷酸(Mke123及Mke124,SEQ ID NO:5及6)。定点诱变的克隆策略展示于图12中。
随后进行两次PCR反应,其中每次以侧接于基因的寡核苷酸进行且一个携带所需突变。这些反应获得两个PCR产物,其具有短的互补区域来代替突变。使用此两个PCR产物作为模板,再次使用在先所用的侧翼序列-基因的寡核苷酸进行第二次PCR。此反应获得具有所需突变的完整基因。
以限制酶NdeI及HindIII裂解PCR产物且随后将其连接至pDHE载体上。在成功转化至感受态细胞XL10 Gold(Stratagene)中且随后质粒分离之后,对质粒测序以便确认成功突变。为测定活性,将质粒转化至包含伴侣蛋白质粒pAgro及pHSG(LU12037)的TG10+感受态细胞中。
表2:用于制备单个突变体的寡核苷酸序列
单一突变
突变 | Oligoname | 序列5′->3′ | 序列编号 |
L139A | Mke 579 | CATCATCAACGCGACTTCGA | SEQ ID NO:13 |
Mke 580 | TCGAAGTCGCGTTGATGATG | SEQ ID NO:14 | |
L146M | Mke 606 | CGACATATTGGATGAAGATCGAGG | SEQ ID NO:15 |
Mke 607 | CCTCGATCTTCATCCAATATGTCG | SEQ ID NO:16 | |
I148V | Mke 577 | CATATTGGCTAAAGGTGGAGGCG | SEQ ID NO:17 |
Mke 578 | CGCCTCCACCTTTAGCCAATATG | SEQ ID NO:18 | |
Y151A | Mke 949 | TCGAGGCGGCGACCCATTAC | SEQ ID NO:19 |
Mke 950 | GTAATGGGTCGCCGCCTCGA | SEQ ID NO:20 | |
C62A | Mke 569 | CGTGAAGGCGGATGTCTCG | SEQ ID NO:21 |
Mke 570 | CGAGACATCCGCCTTCACG | SEQ ID NO:22 | |
C62S | Mke 571 | CGTGAAGAGCGATGTCTCG | SEQ ID NO:23 |
Mke 572 | CGAGACATCGCTCTTCACG | SEQ ID NO:24 | |
突变 | Oligoname | 序列5′->3′ | 序列编号 |
C83A | Mke 573 | CCACGTTTGGTCGCGCGGACATCC | SEQ ID NO:25 |
Mke 574 | GGATGTCCGCGCGACCAAACGTGG | SEQ ID NO:26 | |
C83S | Mke 575 | GTTTGGTCGCAGCGACATC | SEQ ID NO:27 |
Mke 576 | GATGTCGCTGCGACCAAAC | SEQ ID NO:28 | |
T140A | Mke 587 | CATCAACCTGGCGTCGACGAC | SEQ ID NO:29 |
Mke 588 | GTCGTCGACGCCAGGTTGATGAT | SEQ ID NO:30 | |
T140S | Mke 589 | CAACCTGAGCTCGACGACATATT | SEQ ID NO:31 |
Mke 590 | AATATGTCGTCGAGCTCAGGTTG | SEQ ID NO:32 | |
T140G | Mke 618 | CATCATCAACCTGGGCTCGACGAC | SEQ ID NO:33 |
Mke 619 | GTCGTCGAGCCCAGGTTGATGATG | SEQ ID NO:34 | |
T142L | Mke 620 | CAACCTGACTTCGCTGACATATTG | SEQ ID NO:35 |
Mke 621 | CAATATGTCAGCGAAGTCAGGTTG | SEQ ID NO:36 | |
T142S | Mke 622 | CAACCTGACTTCGAG CACATATTG | SEQ ID NO:37 |
Mke 623 | CAATATGTGCTCGAAGTCAGGTTG | SEQ ID NO:38 | |
T142A | Mke 626 | CAACCTGACTTCGGCGACATATTG | SEQ ID NO:39 |
Mke 627 | CAATATGTCGCCGAAGTCAGGTTG | SEQ ID NO:40 | |
T142G | Mke 628 | CAACCTGACTTCGGGCACATATTG | SEQ ID NO:41 |
Mke 629 | CAATATGTGCCCGAAGTCAGGTTG | SEQ ID NO:42 | |
L186G | Mke 649 | CGCCGAGCCGCGTCCGCACG | SEQ ID NO:43 |
Mke 650 | CGTGCGGACGCGGCTCGGCG | SEQ ID NO:44 | |
L186A | Mke 651 | CGCCGAGCGCAGTCCGCACG | SEQ ID NO:45 |
Mke 652 | CGTGCGGACTGCGCTCGGCG | SEQ ID NO:46 | |
L197A | Mke 583 | GCGTCCGCGATGTTCGACGTG | SEQ ID NO:47 |
Mke 584 | CGAACATCGCGGACGCTGCAG | SEQ ID NO:48 | |
L197I | Mke 645 | ATTTCCGCGATGTTCGACGTG | SEQ ID NO:49 |
Mke 646 | CGAACATCGCGGAAATTGCAG | SEQ ID NO:50 | |
突变 | Oligoname | 序列5′->3′ | 序列编号 |
L204A | Mke608 | GTTCGACGTGGCGCCAAACATGC | SEQ ID NO:51 |
Mke609 | GCATGTTTGGCGCCACGTCGAAC | SEQ ID NO:52 | |
L204V | Mke610 | GTTCGACGTGGTGCCAAACATGC | SEQ ID NO:53 |
Mke611 | GCATGTTTGGCACCACGTCGAAC | SEQ ID NO:54 | |
M246A | Mke612 | ATGGCGGTGCGGTGAGACACTAA | SEQ ID NO:55 |
Mke613 | TTAGTGTCTCACCGCACCGCCAT | SEQ ID NO:56 | |
M246L | Mke614 | ATGGCGGTATTGTGAGACACTAA | SEQ ID NO:57 |
Mke615 | TTAGTGTCTCACAATACCGCCAT | SEQ ID NO:58 | |
M246V | Mke616 | ATGGCGGTGTGGTGAGACACTAA | SEQ ID NO:59 |
Mke617 | TTAGTGTCTCACCACACCGCCAT | SEQ ID NO:60 |
饱和诱变:
3.3对目标突变体的活性测试
图13A展示来自活性测试的结果,其中添加NADH的TAC至TACA的还原反应以及伴随再生的总反应(深色条形图)如论点2.2中所述进行测试。于图13B中,仅测试伴随再生的总反应。
特别地,突变体L197I呈现三倍于野生型活性的活性。
明确地参考本文中所引用文献来源的公开内容。
Claims (27)
1.一种功能性苯乙醇脱氢酶突变体,其衍生自来自固氮弧菌属物种(Azoarcus sp.)且具有根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列的苯乙醇脱氢酶EbN1。
2.一种功能性苯乙醇脱氢酶突变体,其衍生自来自固氮弧菌属物种且具有根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列的苯乙醇脱氢酶EbN1,其中该突变体选自说明书中表1所列出的突变体。
3.一种功能性苯乙醇脱氢酶突变体,其衍生自来自固氮弧菌属物种且具有根据SEQ ID NO:2的氨基酸序列的苯乙醇脱氢酶EbN1,其中该突变体在至少一个选自以下的序列区域中具有至少一个突变:
(1)142至153(环2)及
(2)190至211(螺旋αFG1)。
4.如权利要求2的突变体,其在另一选自以下的序列区域中另外具有至少另一个突变:
(3)93至96(环1)
(4)241至249(C末端)
(5)138至141(结合袋的亲水性区域)及
(6)Cys61和/或Cys 83。
5.如权利要求3及4中任一项的突变体,其中至少一个下列基团得到突变:
T192、L197、M200、F201、L204、M246、L139、T140、T142、L146、I148、Y151、C61、C83、L186,各个氨基酸经任何所需其他天然氨基酸置换。
6.如权利要求1至4中任一项的突变体,其选自包含至少一个下列突变的突变体:
a)单一突变:
Y151XA,其中XA=A、R、N、E、Q、G、H、I、L、M、T或V;
T192XB,其中XB=A、E、G、I、P、S、W、V或L;
b)多点突变:
Y151XA T192XB,其中XA及XB具有上文给出的含义。
7.如前述任一项权利要求的突变体,其特征在于至少一种下列经修饰的部分序列:
(1)142-TTYWX1KX2EAX3T-153(经修饰的环2)及
(2)190-ATX4EASAX5SAX6X7DVX8PNMLQAI-211(经修饰的螺旋αFG1)
其中X1至X8彼此独立地为任何所需氨基酸基团,其中基团X1至X3及X4至X8中的至少一个不为根据SEQ ID NO:2的天然酶的天然氨基酸基团。
8.如权利要求11的突变体,其中
X1为L或经I、V、A、M、F或H取代
X2为I或经L、V、A、M、F或H取代
X3为Y或经A、R、N、E、Q、G、H、I、L、M、T或V取代;
或其中
X4为T或经A、E、G、I、P、S、W、V或L取代
X5为L或经I、V、A、M、F或H取代
X6为M或经Y、W、E、V、S、R、Q、K、I、H、G、F、E或D取代
X7为F或经G、K、T、Y、M、W或R取代
X8为L或经I、V、A、M、F或H取代。
9.如如前述任一项权利要求的突变体,其仍具有SEQ ID NO:2的脱氢酶的酶促活性的至少约50%。
10.如前述任一项权利要求的突变体,其具有与SEQ ID NO:2至少约70%的序列同一性百分数。
11.如前述任一项权利要求的突变体,其中除至少一个如上所定义的区域(1)至(6)中的突变之外,至多25%的氨基酸基团与SEQ ID NO:2相比通过添加、缺失、插入、取代、倒位或其组合而得到修饰。
12.如前述任一项权利要求的突变体,其在辅因子NAD+或NADH存在下催化3-氯-1-(噻吩基-2-基)-丙-1-酮(1)与(1S)-3-氯-1-(噻吩基-2-基)-丙-1-醇(2)之间的立体特异性平衡反应
13.一种编码如前述任一项权利要求的突变体的核酸序列。
14.一种表达盒,其包含与至少一种调节性核酸序列功能性连接的至少一种如权利要求13的核酸序列。
15.一种载体,其包含至少一种如权利要求14的表达盒。
16.一种重组微生物,其包含如权利要求13的核酸、一种如权利要求14的表达盒或如权利要求15的载体的至少一种。
17.一种制造如权利要求1至12中任一项的突变体的方法,其包含培养如权利要求16的重组微生物,表达编码该突变体的核酸序列及任选地分离该表达产物。
19.如权利要求18的方法,其中该反应在使用C1至C6单醇作为牺牲醇而进行还原等效物再生的条件下发生。
20.如权利要求18及19中任一项的方法,其中Cyc为杂环基,尤其为噻吩基。
21.如权利要求18至20中任一项的方法,其获得式(II)的基本上对映异构性纯的醇,尤其(S)-对映异构体的醇。
22.如权利要求18至21中任一项的方法,其中该突变体以分离形式使用且由此任选地固定化于固相支撑物上;或表达于任选地固定化于固相支撑物上的微生物细胞中。
25.如权利要求24的方法,其中使用C1至C6单烷酮作为牺牲酮,在氧化等效物再生的条件下进行该反应。
26.如权利要求24及25中任一项的方法,其中该突变体以分离形式使用且由此任选地固定化于固相支撑物上;或表达于任选地固定化于固相支撑物上的微生物细胞中。
27.一种如权利要求1至12中任一项的突变体的用途,其用于制备度洛西汀醇和/或度洛西汀。
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