CN102007210B - 12α-羟类固醇脱氢酶,产生及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及12α-羟类固醇脱氢酶、用于编码其的核酸序列、表达盒及载体;包含适当编码核酸序列的重组微生物;产生所述12α-羟类固醇脱氢酶的方法;使用所述酶进行酶促氧化12α-羟类固醇的方法,使用所述酶进行酶还原12-类固酮的方法,使用所述12α-羟类固醇脱氢酶定性或定量确定12-类固酮或12α-羟类固醇的方法;和制备熊去氧胆酸的方法,包括使用所述12α-羟类固醇脱氢酶酶催化胆酸氧化。
Description
本发明涉及新的12α-羟类固醇脱氢酶、用于编码其的核酸序列、表达盒及载体;包含适当编码核酸序列的重组微生物;产生此类12α-羟类固醇脱氢酶的方法;使用此类酶进行酶促氧化12α-羟类固醇的方法,使用此类酶进行酶还原12-类固酮的方法,使用本发明的12α-羟类固醇脱氢酶定性或定量确定12-类固酮或12α-羟类固醇的方法;和制备熊去氧胆酸的方法,包括使用本发明的12α-羟类固醇脱氢酶酶催化胆酸氧化。
发明背景
12α-羟类固醇脱氢酶(12α-HSDH)(E.C.1.1.1.176)是立体特异性合成(例如胆酸氧化)的重要生物催化剂。
Mahony等人(Mahony,D.E.,等人,Appl Environ Microbiol,1977,34(4):p.419-23)和MacDonald等人(MacDonald,I.A.,等人,Journal of Lipid Research,1979,20234-239)描述了对来自于梭菌属细菌P组(Clostridium sp.group P)48-50菌株的12α-HSDH及通过NAD+和NADP+琼脂糖色谱法部分纯化12α-HSDH的研究。
在三种不同从胆酸合成熊去氧胆酸路线的过程中,Sutherland等人使用从梭菌属P组相应制备的包含12α-HSDH的蛋白质提取物。合成路线之一包括酶催化氧化胆酸成12-酮-鹅脱氧胆酸(12-酮-CDCA)(Sutherland,J.D.等人,Prep Biochem,1982,12(4):p.307-21)。来自于梭菌属细菌P组48-50菌株DSM 4029的细胞裂解物在此用作酶制剂。反应需要化学计量的辅因子NADP+。
可通过偶联辅因子再生酶降低对辅因子的需求。为此,现有技术教导,例如使用与包含12α-HSDH的梭菌属P组蛋白质提取物共固定在一起的谷 氨酸脱氢酶(GLDH)(Carrea,G.等人,Biotechnology and Bioengineering,1984,26(5):p.560-563)。GLDH将NADPH重新氧化成NADP+,同时将α-酮戊二酸还原性胺化成谷氨酸。除此之外,也提出醇脱氢酶ADH-Tb、ADH-Lb和ADH-ms用于辅因子再生(Fossati,E.等人,Biotechnol Bioeng,2006,93(6):p.1216-20)。ADH将丙酮转化为2-丙醇,同时使NADP+再生。对于10ml(毫升)规模的反应,不必使用纯化的蛋白质,而在该处使用比活性为12U/mg(单位/微克)的包含12α-HSDH的蛋白质成分,其进一步通过商业制剂(来自于ASA Spezialenzyme,Wolfenbüttel,Germany)富集。
上述所有研究的共同点是12α-HSDH的来源是致病的和厌氧的菌株梭菌属细菌P组48-50菌株。鉴于这一酶在总蛋白中所占的比例小(最多梭菌属细菌总蛋白的1%),一方面使得获得工业上可用量的酶变得困难。另一方面,其工业生产复杂而昂贵,因为整个培养和存储致病的生产菌株必须在有2级危险群(risk group 2,见BioStoffV)微生物操作许可的工厂中进行。
另外,这一生产菌株的致病性使得在药物中间体合成中使用12α-HSDH成问题。根据GMP管理要求,为获得生产过程的许可,酶的来源必须为非致病的。
EP-A-1 731 618中描述了NAD+-依赖性12α-HSDH催化的胆酸氧化,同时辅因子通过乳酸脱氢酶(LDH;将丙酮酸转化为乳酸,同时使NAD+再生)再生。
提出了两阶段纯化策略,该策略基于对来自梭菌属细菌P组48-50菌株的野生型酶的染料柱亲和色谱法和氨基末端氨基酸序列(Braun,M.等人,Eur J Biochem,1991,196(2):p.439-50)。所公布的氨基末端序列是包含29个氨基酸残基的部分序列,其氨基末端如下:Met-Ile-Phe-Asp-Gly-Lys-Val.....。而且,这一研究组没有使用商业上可获得的柱材料用于纯化。
目前,ASA Spezialenzyme(Wolfenbüttel,Germany)上市了来自于梭菌属细菌P组48-50菌株的包含12α-HSDH的提取物。然而,研究显示,由于要使用大量的总蛋白,这一商业制剂的低比活性使得提取和确定 12α-HSDH催化的酶反应的反应产物变得复杂。
因此本发明的目的是使人们获得12α-HSDH(尤其是NADP+-依赖性酶),该12α-HSDH的形式适合商业规模药物活性成分合成的制备用途,例如用于酶催化氧化胆酸成12-酮鹅脱氧胆酸(12-酮-CDCA)。
附图简述
在附图中,
图l显示本发明长版本的12α-HSDH(HSDH_长)的基因和蛋白质序列。
图2显示本发明短版本的12α-HSDH(HSDH_短)的基因和蛋白质序列,以及其与Braun,M.等人在上述引文中所公布的不完整的部分序列的对比。
图3显示已知微生物HSDH和本发明HSDH的多序列比对部分。高保守位点通过“*”标记,可变位点通过“:”标记。微生物羟类固醇脱氢酶(左栏显示相关登录号和来源生物),其功能在蛋白质水平或在密切相关物种中已经进行直向同源研究,与本发明确定的序列HSDH_短(Csp2594)进行比较。已知的HSDH株来源于大肠杆菌(Escherichia coli)(ECOLI)、鼻疽伯克霍尔德氏菌(Burkholderia mallei)(BURM)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)(BACFR)、索氏梭菌(Clostridium sordellii)(CLOSO)、艰难梭菌(Clostridium difficile)(CLOD)、真细菌属物种(Eubacterium sp.)(EUBSP)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(MYCTU)和脱叶链霉菌(Streptomyces exfoliates)(STREX)。
图4显示本发明的12α-HSDH在BL21和RosettaTM(DE3)细胞4或22小时后的表达。12α-HSDH(“长”和“短”)在BL21和RosettaTM(DE3)细胞中表达4或22小时。然后,破坏细胞,使用20μg(微克)蛋白质。将在27kDa(千道尔顿)处发现目标蛋白质(12α-HSDH)。
图5显示在500ml规模制备12K-CDCA中340nm(纳米)的吸收过程。
图6显示用于确认12α-HSDH区域选择性反应体系的薄层色谱图,其 中胆酸(1)和12-酮-鹅脱氧胆酸(2)用作参比;从而反应体系与HSDH_长(3)和HSDH短(4)进行比较。
图7显示12α-HSDH突变体37D12的蛋白质和核酸序列。
图8显示12α-HSDH的同源模型,该12α-HSDH来自于梭菌属细菌DSM 4029并带有结合的NADPH、结合底物和突变位置97(Gln97)。
图9显示12α-HSDH和突变体37D12的活性比较。显示了在胆酸和12-酮鹅脱氧胆酸(总浓度5mM)不同百分比(%转换)的12α-HSDH和突变体37D12的活性。反应以0.25mM NADP+起始。在60秒里确定吸收的变化,在30秒的范围计算活性,其具有最高的线性(野生型0-30秒,37D1230-60秒)。相对HSDH活性参照5mM胆酸(0%转换)(其绝对活性设定为100%)时的活性。显示了N=3时活性测量的平均值和标准误差。
发明简述
令人惊讶地,通过第一次阐明梭菌属P组C48-50菌株中存在的12α-HSDH酶的编码核酸序列和描述其正确和完整的氨基酸序列达到了上述目的。
令人惊讶地发现文献中描述的尤其是氨基末端氨基酸序列与实际氨基末端氨基酸序列不对应,另外发现12α-HSDH以长版本(HSDH长)和氨基末端截短版本(HSDH短)存在。
因为现有技术中没有认识到12α-HSDH酶以不同长度(尤其是具有不同氨基末端)存在,并且现有技术中错误的序列信息阻止了正确的引物合成从而阻止了编码序列的定位和扩增,这使得本发明达到上述目的看起来更加令人惊讶。
而且,除了Braun,M.等人在上述引文中的研究,对属于短链脱氢酶/还原酶的酶所公布的序列进行了更系统的研究,其中,12α-HSDH也属于这类。对于这组酶,Oppermann等人在Chemo-Biological Interactions,2003,143-144,247-253中假定了特征性氨基末端序列基序,即T-G-X3-G-X-G。这一序列基序在1991年公布的12α-HSDH序列(Braun,M. 等人,同上述引文中)中没有发现,因此最初公开的12α-HSDH部分序列信息的可靠性迄今受到本领域技术人员的质疑。
发明详述
1.优选实施方案
本发明的主要主题涉及纯化的(尤其是重组产生的)可从梭菌属细菌获得的12α-羟类固醇脱氢酶(12α-HSDH),其分子量(通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在还原条件下确定)范围在大约26kD以上,尤其是大约26.5以上,如大约27至30kD,并且计算的分子量在大约29kD以上,尤其是大约29.1至29.5kD,如,尤其,对于HSDH长为29.359kD或对于HSDH短为大约27.8。此处分子量细节涉及酶蛋白质亚基的分子量;非限制性地,天然蛋白质由例如4个尤其是大约同等大小的这一类型的亚基组成。
尤其,此类蛋白质可从梭菌属细菌P组48-50菌株(DSM4029)获得。可制备酶,例如比活性的范围在大约10、15、20或25U/mg以上,例如20至100U/mg或25至80U/mg。此处对比活性的确定是在实验部分说明的标准条件下进行。
本发明尤其涉及纯化的,尤其是重组产生的,这一类型的12α-HSDH,其包含至少一种下述氨基酸序列基序:
a)LINN(SEQ ID NO:5)
b)RMGIFD(SEQ ID NO:11)
c)氨基末端序列,选自
(1)MDFIDFKEMGRMGIFDGKVAIITGGGKAKSIGYGIAVAYAK(SEQ IDNO:6)
(2)MDFI DFKEMGRMGI(SEQ ID NO:7)
(3)ITGGGKAKSIGYGIA(SEQ ID NO:8)
(4)IFDGK(SEQ ID NO:9)
(5)GIFDGK(SEQ ID NO:10)
d)FGDPELDI(SEQ ID NO:13)或其衍生序列,例如:GDPELDI,FGDPELD,DPELDI,FGDPEL,GDPEL,DPELD,GDPELD。
此外,本发明的酶的特征在于它们没有TGX3GXG类型的氨基末端(即氨基末端范围在大约1至30个氨基酸残基)序列基序,其中x表示任何所需氨基酸残基。
本发明尤其涉及纯化的,尤其是重组产生的,12α-HSDH,
a)包含SEQ ID NO:2或4的氨基酸序列之一,在每种情况下,从位置+1或+2开始;或
b)包含衍生自a)序列并具有至少60%百分比序列同一性的氨基酸序列;或
c)由编码a)和b)的蛋白质的核酸序列编码;或
d)由SEQ ID NO:1或3的编码核酸序列编码;或由所述序列衍生的调整为所用表达生物采用的相应密码子的序列编码;或
e)由SEQ ID NO:1或3的核酸序列衍生并具有至少60%百分比序列同一性的编码序列编码。
此处可根据常规方法(例如可从 http://slam.bs.jhmi.edu/cgi-bin/gd/gdRevTrans.cgi获得)调整核酸序列的密码子使用。
本发明还涉及带有修饰的共底物利用和/或降低产物抑制的12α-HSDH突变体;尤其是那些衍生自根据上述定义的12α-羟类固醇脱氢酶的突变体,其具有至少一种在序列基序VLTGRNE(SEQ ID NO:12)中修饰共底物利用的突变。此类突变体的非限制性例子包括那些具有在SEQID NO:12中至少一种下述氨基酸替换:G→D;R→A;以及具有至少一种降低产物抑制突变的突变体,该突变位于酶形成底物结合口袋的氨基酸残基区域;例如包括至少对应于SEQ ID NO:4的位置97和/或99(对应于SEQID NO:22的位置98或100)的氨基酸Q的突变;尤其包括对应于SEQ IDNO:4的Q97H(对应于SEQ ID NO:22的Q98H)的突变。
在位置98(相对于SEQ ID NO:22)的其他氨基酸替换包括:A、N、D、 C、E、G、H、M、S、T、V。基于本发明HSDH的同源模型,认为此处的替换导致产物羧基结合的减弱。因此邻位S100(基于SEQ ID NO:22)也被突变成下述氨基酸:A、N、D、C、Q、E、G、H、M、T、V、K。
从而本发明的一组突变体包括位置97或99(根据SEQ ID NO:4)或位置98或100(根据SEQ ID NO:22)的一个或两个突变,其选自:
Q→A、N、D、C、E、G、H、M、S、T、V;
S→A、N、D、C、Q、E、G、H、M、T、V、K。
本发明尤其涉及上述定义的12α-HSDH,可通过异源表达至少一种上面描述的12α-HSDH编码核酸序列获得,尤其涉及那些重组产生的酶,其在非致病微生物中表达,例如在埃希氏菌属的细菌(尤其是大肠杆菌)中表达。
本发明还涉及上述定义的核酸序列;表达盒,其包含在至少一种调节核酸序列遗传控制下的至少一种此类编码核酸序列;载体,其包含至少一种此类表达盒;以及带有至少一种此类核酸序列或表达盒或被至少一种此类载体转化的重组微生物。
另外,本发明涉及产生上述定义的12α-HSDH的方法,其中培养本发明的重组微生物并且将所表达的12α-HSDH从培养物中分离。
本发明还涉及酶促氧化12α-羟类固醇的方法,其中使羟类固醇在本发明的12α-HSDH存在下反应,并且将至少一种所形成的产物任选地从反应体系中分离。此处反应可在有氧(即在氧存在下)或无氧(即基本排除氧),尤其是有氧下进行。
尤其,此处羟类固醇可以是胆酸(CA)或胆酸衍生物,如尤其是盐、酰胺或烷基酯。优选地,使CA或其衍生物反应以产生12-酮鹅脱氧胆酸(12-酮-CDCA)或产生相应衍生物。尤其,此处反应在NADP+或NAD+存在和化学计量消耗下进行。
本发明还涉及酶促还原12-类固酮的方法,其中使类固酮在本发明的12α-HSDH存在下反应,所形成的还原产物任选地从反应体系中分离。此处反应可在有氧或无氧,尤其是有氧下进行。
尤其,此处类固酮是12-酮-CDCA或其衍生物,如尤其是盐、酰胺或烷基酯。此处类固酮或其衍生物被还原为相应的12α-羟类固醇或其衍生物。尤其,此处反应在NADPH或NADH存在下进行。
在上述氧化还原反应的优选实施方案中,所消耗的氧化还原当量可通过电化学或酶再生。适当的酶再生系统已经在开头进行了描述。我们明确地引用这些出版物的公开内容作为参考。适当酶的非限制性例子是谷氨酸脱氢酶、醇脱氢酶和乳酸脱氢酶。电化学再生方法基于例如铑氢化合物(hydridorhodium)氧化还原催化剂,例如在WO-A-01/88172中描述的,在此对其进行引用作为参考。
在上述氧化还原反应又一个实施方案中,这些可在12α-HSDH为固定形式时进行。任选地用于辅因子再生的酶同样可以固定。
本发明还涉及进行上述氧化还原反应,或那些在合成全部方法中的部分反应步骤的生物反应器。
本发明还涉及定性或定量检测12-类固酮或12α-羟类固醇的方法,其中本发明12α-HSDH催化的氧化还原反应的类固醇在氧化还原当量存在下进行,确定氧化还原当量浓度的变化,由此定性或定量确定12-类固酮或12α-羟类固醇的含量。
此外本发明涉及从胆酸(CA)合成熊去氧胆酸(UDCA)的方法,包括至少一个由本发明的12α-HSDH催化的反应步骤。此处这一反应步骤可在有氧或无氧,尤其是有氧下进行。已经描述了三种适当的反应顺序,例如Sutherland等人在上述引文中的描述,在此对其进行引用作为参考。已经描述了下述合成路线1至3(其中UCA表示熊胆酸(ursocholic acid),CDCA表示鹅脱氧胆酸):
第一路线
CA→12-酮-CDCA (通过12α-HSDH酶促进行)
12-酮-CDCA→12-酮-UDCA (通过7α-和7β-HSDH酶促进行)
12-酮-UDCA→UDCA (化学性的,Wolff-Kishner还原)
第二路线
CA→UCA (通过7α-和7β-HSDH酶促进行)
UCA→12-酮-UDCA(通过12α-HSDH酶促进行)
12-酮-UDCA→UDCA (化学性的,Wolff-Kishner还原)
第三路线
CA→12-酮-CDCA (通过12α-HSDH酶促进行)
12-酮-CDCA→12-CDCA (化学性的,Wolff-Kishner还原)
CDCA→UDCA (完全的不同梭菌(Clostridium absonum)细胞)
然而,本发明尤其涉及下述第四路线:
第四路线
这涉及制备式(1)的熊去氧胆酸
其中
R表示烷基、NR1R2、H、碱金属离子或N(R3)4 +,其中R3基相同或不同并且表示H或烷基,
其中
a)式(2)的胆酸(CA)
(其中R具有如上所示的含义,Ra基相同或不同并且表示H或酰基)在本发明的12α-HSDH存在下被氧化成相应式(3)的12-酮鹅脱氧胆酸(12-酮-CDCA)
其中R和Ra具有如上所示的含义,随后
b)式(3)的12-酮-CDCA通过脱氧反应,例如通过Wolff-Kishner还原,从而产生式(4)的鹅脱氧胆酸(CDCA)
其中R和Ra具有如上所示的含义,
c)式(4)的CDCA在位置7化学氧化成式(5)的7-酮石胆酸(KLCA)
其中R和Ra具有如上所示的含义;
d)式(5)的KLCA被还原,如果Ra表示酰基,这一酰基任选地可被去除,
e)任选地进一步纯化反应产物。
此处,如果Ra表示酰基,这一酰基基团任选地在进行反应步骤b)或d)之后去除。
此外,尤其步骤a)的反应可在NAD(P)+存在下进行。
此外,所消耗的NAD(P)+可通过电化学或酶以本身已知的方式再生,和/或所用的酶可以固定形式进行。
2.一般定义
如果没有给出其他细节,术语“12α-HSDH”表示脱氢酶,其能催化至少胆酸立体特异性氧化成12-酮鹅脱氧胆酸,同时使用化学计量的NAD+或NADP+。此处酶可以为天然或重组产生的酶。酶原则上可存在于带有细胞(例如蛋白质)杂质的混合物中,但优选地为纯化形式。
根据本发明“纯化形式”或“纯化的”或“基本纯化的”酶理解为意思是指具有80%以上,优选地90%以上,尤其是95%以上,特别是99%以上(按总蛋白质含量计的%重量)纯度的酶,借助常规蛋白质检测方法确定,例如双缩脲法或根据Lowry等人(参见R.K.Scopes,Protein Purification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin(1982)中的描述)的蛋白检测。此处本发明12α-HSDH酶的比活性在如上所示的范围。
“氧化还原当量”理解为意思是指可用作电子供体或电子受体的低分子量有机化合物,例如烟酰胺衍生物如NAD+和NADH+或其还原形式NADH或NADPH。
特别类型的化合物,例如“胆酸化合物”或“熊去氧胆酸化合物”尤其理解为也意味着基本起始化合物(例如胆酸或熊去氧胆酸)的衍生物。
此类衍生物包括“盐”,例如碱金属盐如化合物的锂、钠和钾盐;也包括铵盐,其中铵盐包括NH4 +盐或那些其中至少一个氢原子可被C1-C6-烷基替换的铵盐。尤其,典型的烷基是C1-C4-烷基,如甲基、乙基、正或异丙基、正、仲或叔丁基,和正戊基和正己基及其单或多分支类似物。
本发明化合物的“烷基酯”尤其是低烷基酯,例如C1-C6-烷基酯。可提及的非限制性例子是甲基、乙基、正或异丙基、正、仲或叔丁基酯,或长链酯,例如正戊基和正己基酯及其单或多分支类似物。
“酰胺”尤其是本发明的酸与氨或一级或二级单胺的反应产物。此类胺是例如单或双-C1-C6-烷基单胺,其中任选地烷基可被另一个,例如羧基、羟基、卤素(如F、Cl、Br、I)、硝基和磺基独立地进一步取代。
本发明的“酰基”尤其是具有2至4个碳原子的非芳香基,例如乙酰基、丙酰基和丁酰基,和具有任选地被取代的单核芳香环的芳香基,其中适当 的取代基,例如选自羟基、卤素(如F、Cl、Br、I)、硝基和C1-C6-烷基,例如苯甲酰基或甲苯酰基。
本发明使用或产生的羟类固醇化合物。如胆酸、甘氨胆酸、牛磺胆酸、熊去氧胆酸、12-酮鹅脱氧胆酸、鹅脱氧胆酸和7-酮石胆酸,可在本发明的方法中使用,或从本发明中以立体异构纯形式或与其他立体异构体混合物的形式获得。然而,优选地,使用或产生的化合物以基本上立体异构纯形式使用和/或分离。
根据本发明“固定”理解为意思是指本发明使用的生物催化剂(例如12α-HSDH)共价或非共价结合至固体载体材料(即基本上在周围液体介质中不溶的材料)。
12α-HSDH的“产物抑制”描述在酶催化的酶反应中形成的产物存在下该酶活性降低。在产生CA反应的情况下,例如因此将观察到12-酮-CDCA的抑制作用。“降低产物抑制”描述本发明的酶突变体与参比系统(例如天然HSDH酶)相比酶活性百分比下降的降低,在每种情况下相对于在0%转换(对应于5mM CA)时确定的100%活性值的酶活性进行确定。这一降低可通过实验部分或图9的附图说明中的描述确定。本发明降低产物抑制也可通过突变体与参比系统剩余活性(在每种情况下在相同百分比转换下确定)的比例表示。从而本发明的突变体可具有1.1至100(例如1.5至20或2至10)倍的活性增加。
3.本发明的其他实施方案
3.1蛋白质
本发明不限于实际公开的具有12α-HSDH活性的蛋白质和/或酶,相反还扩展至其功能性等同物。
在本发明的上下文中,实际公开酶的“功能性等同物”或类似物是还具有所需生物学活性(例如12α-HSDH活性)的与其不同的多肽。
因此,“功能性等同物”理解为意思是指,例如用于12α-HSDH酶活性试验中比包含本文中定义的氨基酸序列的酶具有大约至少1%,例如至少 10%或20%,例如至少50%或75%或90%更高或更低活性的酶。此外,功能性等同物优选地在pH 4至11之间是稳定的,有利地具有最佳pH范围pH 6至10,如尤其是,8.5至9.5,以及最佳温度范围15℃至80℃或20℃至70℃,例如大约45至60℃或大约50至55℃。
也可借助多种已知试验检测12α-HSDH的活性。非限制于此,可提及的是试验使用参比物质(例如胆酸)在如实验部分定义的标准条件下进行。
根据本发明,“功能性等同物”尤其也理解为意思是指“突变体”,其在以上所述氨基酸序列的至少一个序列位置中含有相异于实际所描述氨基酸的氨基酸,不过仍具有前述生物学活性之一。“功能性等同物”因而包含通过一个或多个氨基酸添加、替换、缺失和/或倒位所获得的突变体,其中所述改变可以在任意序列位置中出现,只要它们导致具有本发明特性谱(property profile)的突变体。如果反应性模式在突变体与未改变的多肽之间定性地一致,即例如以不同速率转换相同的底物,则尤其也提供了功能等同性。在下表中总结了适当氨基酸替换的例子。
原始残基 替换的例子
Ala Ser
Arg Lys
Asn Gln;His
Asp Glu
Cys Ser
Gln Asn
Glu Asp
Gly Pro
His Asn;Gln
Ile Leu;Val
Leu Ile;Val
Lys Arg;Gln;Glu
Met Leu;Ile
Phe Met;Leu;Tyr
Ser Thr
Thr Ser
Trp Tyr
Tyr Trp;Phe
Val Ile;Leu
“功能性等同物”在以上意义中也是所述多肽的“前体”,以及所述多肽的“功能性衍生物”和“盐”。
此处“前体”是所述多肽的具有或没有所需生物学活性的天然或合成性前体。
表述“盐”理解为意思是指本发明蛋白质分子羧基的盐以及氨基的酸加成盐。羧基的盐可以按照本身已知方式制备并包含无机盐,例如钠、钙、铵、铁和锌盐,和与有机碱(例如胺如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等)形成的盐。本发明也涉及酸加成盐,例如与无机酸(如氢氯酸或硫酸)形成的盐和与有机酸(如乙酸、草酸)形成的盐。
本发明多肽的“功能性衍生物”也可以在功能性氨基酸侧基团上或其氨基或羧基末端处借助于已知技术产生。此类衍生物包括例如羧酸基脂族酯、通过与氨或伯胺或仲胺反应可获得的羧酸基的酰胺;通过与酰基反应所制备的游离氨基的N-酰基衍生物;或通过与酰基反应所制备的游离羟基的O-酰基衍生物。
“功能性等同物”当然也包含可以从其他生物获得的多肽以及天然存在的变体。例如可以通过序列比较建立同源序列区域的范围,并且可以根据本发明精确的说明确定等同酶。
“功能性等同物”也包含本发明多肽的片段,优选独立结构域或序列基序,它们例如具有所需的生物学功能。
“功能性等同物”还是这样的融合蛋白,所述融合蛋白含有以上所述多肽序列之一或从其中衍生的功能性等同物和处于功能性氨基端或羧基端连接(即融合蛋白诸部分没有相互显著地功能性损坏)的至少一种其他的功 能上不同的异源序列。此类异源序列的非限制性例子例如是信号肽、组氨酸锚状物或酶。
另外,本发明包括的“功能性等同物”是实际公开的蛋白质的同源物。这些同源物与实际公开的氨基酸序列之一相比具有至少60%,优选地至少75%,尤其是至少85%,例如90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同源性(或同一性),根据Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448的算法计算出来。本发明同源多肽的百分比同源性或同一性尤其意指相对于本文实际描述的氨基酸序列之一总长度的相同氨基酸残基的百分比。
也可以通过BLAST比对、算法blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)或使用如下文所示的Clustal设置确定同一性百分比值。
在蛋白质可能糖基化的情况下,本发明的“功能性等同物”包含处于去糖基化和糖基化形式以及可以通过改变糖基化模式获得的修饰形式的上文所述类型蛋白质。
本发明蛋白质或多肽的同源物可以通过诱变例如点突变、延伸或截短所述蛋白质来产生。
本发明蛋白质的同源物可以通过筛选突变体(例如截短型突变体)组合库鉴定。例如可以通过在核酸水平组合诱变(例如通过酶促连接合成性寡核苷酸的混合物)产生蛋白质变体的多样化库。存在可以用于从简并寡核苷酸序列产生潜在同源物库的许多方法。可以在DNA合成仪上实施简并基因序列的化学合成,并且合成性基因可以随后连接至适当的表达载体中。简并基因集合的使用使得在混合物中制备编码所需蛋白质序列集合的全部序列成为可能。合成简并寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如Narang,S.A.(1983)Tetrahedron 39:3;Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人,(1984)Science 198:1056;Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11:477)。
在现有技术中,已知几项技术,它们用于筛选通过点突变或截短法产生的组合库的基因产物和用于筛选cDNA库中具有所选特性的基因产物。 这些技术可以修改以适应于快速筛选通过组合诱变本发明同源物所产生的基因库。最常用于筛选庞大基因库(进行高通量分析)的技术包括在可以复制的表达载体中克隆基因库、用所得载体库转化适当的细胞并在这样的条件下表达组合基因,在所述条件下检测所需的活性有助于编码检测到其产物的基因的载体分离。递归总体诱变(Recursive-ensemble mutagenesis,REM),一项提高库中功能性突变体频率的技术,可以与筛选试验组合使用,旨在鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89:7811-7815;Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3):327-331)。
3.2核酸和构建体
3.2.1核酸
本发明也涉及编码具有12α-HSDH活性的酶的核酸序列。
本发明也涉及与本文中描述的实际序列具有某种“同一性”程度的核酸。
两种核酸之间的“同一性”理解为意思是指在每种情况下所述核酸全长范围内核苷酸的同一性。尤其是借助Informax(USA)公司载体NTI套装7.1软件,使用Clustal方法用以下参数设置(Higgins DG,Sharp PM.Fast and sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer.Comput Appl.Biosci.1989 Apr;5(2):151-1)通过比较计算的同一性:
多重比对参数:
空位开口罚分 10
空位延伸罚分 10
空位分离罚分范围 8
空位分离罚分 关闭
比对延迟的同一性% 40
残基特异性空位 关闭
亲水性残基空位 关闭
过渡权重 0
配对比对参数:
FAST算法 开启
K-tuple大小 1
空位罚分 3
窗口大小 5
最佳对角线数目 5
可替代地,同一性也可以根据Chenna,Ramu,Sugawara,Hideali,Koike,Tadashi,Lopez,Rodrigo,Gibson,Toby J,Higgins,Desmond G,Thompson,Julie D.Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs.(2003)Nucleic Acids Res 31(13):3497-500,根据因特网网址:http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#和以下参数确定:
DNA空位开口罚分 15.0
DNA空位延伸罚分 6.66
DNA矩阵 同一性
蛋白质空位开口罚分 10.0
蛋白质空位延伸罚分 0.2
蛋白质矩阵 Gonnet
蛋白质/DNA ENDGAP -1
蛋白质/DNA GAPDIST 4
本文中提及的全部核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列,例如cDNA和mRNA)可以按照本身已知方式通过化学合成从核苷酸结构单元产生,例如通过各个重叠的互补性双螺旋核酸结构单元的片段缩合法产生。寡核苷酸的化学合成可以例如以已知方式根据过亚磷酰胺(phosphoamidite)方法(Voet,Voet,第二版,Wiley Press New York,pages 896-897)进行。合成性寡核苷酸的添加和借助DNA聚合酶Klenow片段填补缺口和连接反应以及一般克隆方法在Sambrook等人(1989),Molecular Cloning:A laboratory manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述。
本发明也涉及编码以上多肽及其功能性等同物之一的核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列,例如cDNA和mRNA),所述核酸序列可以例 如使用合成核苷酸类似物获得。
本发明既涉及编码本发明多肽和蛋白质或其生物学活性区段的分离的核酸分子,并还涉及可以用作例如鉴定或扩增本发明编码性核酸的杂交探针或引物的核酸片段。
此外本发明的核酸分子可以含有编码基因区3′和/或5′末端的非翻译序列。
本发明还包括与实际描述核苷酸序列互补的核酸分子或其区段。
本发明的核苷酸序列使得产生可以用于鉴定和/或克隆其他细胞类型和生物中同源序列的探针和引物成为可能。此类探针或引物通常包含在“严格”条件(见下文)与本发明核酸序列的有义链或相应反义链的至少大约12个、优选至少大约25个,例如大约40、50或75个连续核苷酸杂交的核苷酸序列区域。
“分离”的核酸分子与该核酸天然来源中存在的其他核酸分子分隔,并且通过重组技术产生时,还可以基本上不含其他细胞物质或培养基,或化学合成时,可以不含化学前体或其他化学品。
本发明的核酸分子可以借助分子生物学标准技术和根据本文提供的序列信息分离。例如可以使用实际公开的完整序列之一或其区段作为杂交探针和(如在例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第二版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中描述的)标准杂交技术从适当的cDNA库分离cDNA。此外,包含所公开序列之一或其区段的核酸分子可以使用基于此类序列制备的寡核苷酸引物,通过聚合酶链反应分离。以此类方式扩增的核酸可以克隆至适当的载体中并通过DNA序列分析加以表征。本发明寡核苷酸也可以通过标准合成方法产生,例如通过自动DNA合成仪产生。
本发明的核酸序列或其衍生物、这些序列的同源物或部分可以例如通过惯用杂交技术或PCR技术从其他细菌分离,例如通过基因组文库或cDNA库。这些DNA序列在标准条件下与本发明的序列杂交。
“杂交”理解为意思是指多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下与近乎互补序列结合的能力,而在这些条件下非互补配偶体之间的非特异性结合被抑制。为此,所述序列可以是90-100%互补的。例如在RNA印迹或DNA印迹技术中或在PCR或RT-PCR的引物结合过程中利用了能够相互特异性结合的互补序列的特性。
为了杂交,有利地使用保守区域的短寡核苷酸。然而,也可能使用本发明核酸的较长片段或完整序列用于杂交。这些标准条件根据所用核酸(寡核苷酸、较长片段或完整序列)或根据何种核酸类型(DNA或RNA)用于杂交而变化。例如DNA:DNA杂合体的解链温度比同样长度的DNA:RNA杂合体的解链温度低大约10℃。
标准条件理解为意思是指,例如对于核酸,浓度0.1至5×SSC(1×SSC=0.15M NaCl,15mM柠檬酸钠,pH 7.2)或额外存在50%甲酰胺的水性缓冲液,42和58℃之间的温度,例如42℃,5×SSC,50%甲酰胺中。有利地,DNA:DNA杂合体的杂交条件是0.1×SSC和在大约20℃至45℃之间、优选在大约30℃至45℃之间的温度。对于DNA:RNA杂合体,杂交条件有利地是0.1×SSC和在大约30℃至55℃之间、优选在大约45℃至55℃之间的温度。所述这些杂交温度举例来说是在甲酰胺不存在下为长度大约100个核苷酸及50%G+C含量的核酸计算的解链温度值。DNA杂交的实验条件在相关遗传学教科书(例如Sambrook等人,″Molecular Cloning″,Cold Spring Harbor Laboratory,1989)中描述,并且可以例如根据核酸的长度、杂合体的类型或G+C含量,根据本领域技术人员已知的公式计算。本领域技术人员可以从以下教科书推出关于杂交的进一步信息:Ausubel等人(编著),1985,Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,New York;Hames和Higgins(编著),1985,Nucleic Acids Hybridization:A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford;Brown(编著),1991,Essential Molecular Biology:A Practical Approach,IRL Press at Oxford University Press,Oxford。
“杂交”尤其可以在严格性条件下实施。此类杂交条件例如在 Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,于:Molecular Cloning(ALaboratory Manual),第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989,第9.31-9.57页中或在Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley & Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6.中描述。
“严格”杂交条件尤其理解为意思是指:在42℃于以下溶液中孵育过夜,随后进行0.1×SSC在65℃洗涤滤膜的步骤,其中所述溶液由50%甲酰胺,5×SSC(750mM NaCl,75mM柠檬酸三钠),50mM磷酸钠(pH 7.6),5×Denhardt溶液,10%硫酸葡聚糖和20g/ml变性剪切鲑精DNA组成。
本发明还涉及实际公开或可衍生的核酸序列的衍生物。
因而,本发明的其他核酸序列例如可以从SEQ ID NO:1或3衍生并且可以因添加、替换、插入或缺失单个或多个核苷酸而与SEQ ID NO:1或3不同,但也编码具有所需特性谱的多肽。
本发明也包括这样的核酸序列,其包含“平端”突变或与实际提及的序列相比经过相应特殊来源或宿主生物的密码子利用修饰,以及其天然存在变体,例如剪接变体或等位基因变体。
本发明也涉及可以通过保守性核苷酸替换(即涉及的氨基酸被具有同样电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸替换)获得的序列。
本发明还涉及因序列多态性从实际公开的核酸衍生的分子。这些基因多态性可以因自然变异存在于群体内部的个体之间。这些天然变异通常在基因的核苷酸序列中导致1-5%差异。
本发明核酸序列SEQ ID NO:1或3的衍生物理解为意思是指例如在衍生的氨基酸水平上在整个序列范围内具有至少60%同源性、优选至少80%同源性、极特别优选至少90%同源性(就氨基酸水平上的同源性而言,可以参考上文对所述多肽的评述)的等位基因变体。有利地,同源性可以在序列的部分区域内较高。
另外,衍生物也应当理解为意思是指本发明核酸序列(尤其是SEQ IDNO:1和3)的同源物,例如真菌或细菌同源物、编码性和非编码性DNA序列的截短序列、单链DNA或RNA。因而,例如SEQ ID NO:7的同源 物在DNA水平在SEQ ID NO:7所示的完整DNA范围内具有至少40%、优选地至少60%、尤其优选至少70%、极特别优选至少80%的同源性。
另外,衍生物理解为意思是指例如具有启动子的融合物。添加至所示核苷酸序列之前的启动子可以因至少一个核苷酸交换、至少一个插入、倒位和/或缺失被修饰,然而,该启动子的功能性或活性未受到不利影响。另外,所述启动子的活性可以因修饰其序列而提高或也可以被异种生物更活跃的启动子完全替换。
此外,产生功能突变体的方法对于本领域技术人员是已知的。
根据所用的技术,本领域技术人员可完全随机或更特异性地将突变引入到基因中,或引入非编码核酸区域(例如其对于表达的调节是重要的),随后制备基因库。为此所需的分子生物学方法是本领域技术人员已知的,并在例如Sambrook和Russell,Molecular Cloning,第三版,Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001中描述。
长期以来本领域技术人员已经熟悉修饰基因和从而修饰它们所编码蛋白质的方法,例如
-定点诱变,其中基因的单个或多个核苷酸被特异性替代(Trower MK(编著)1996;In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,NewJersey),
-饱和诱变,其中任何所需氨基酸的密码子可在基因的任何所需位点替代或添加(Kegler-Ebo DM,Docktor CM,DiMaio D(1994)Nucleic Acids Res 22:1593;Barettino D,Feigenbutz M,Valcárel R,Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22:541;Barik S(1995)Mol Biotechnol 3:1),
-易错聚合酶链反应(error-prone PCR),其中核苷序列通过错误工作的DNA聚合酶而突变(Eckert KA,Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res 18:3739);
-将基因传递到突变菌株,其中,例如由于有缺陷的DNA修复机制出现增加突变率的核苷酸序列(Greener A,Callahan M,Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain. 在:Trower MK(编著)In vitro mutagenesis protocols.Humana Press,New Jersey中),或
-DNA穿梭,其中形成密切相关基因池并消化,片段用作聚合酶链反应的模板,其中通过反复的链分离和重接近最终产生全长的镶嵌基因(Stemmer WPC(1994)Nature 370:389;Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91:10747)。
使用“定向进化”(由其在Reetz MT和Jaeger K-E(1999),Topics Curr Chem 200:31;Zhao H,Moore JC,Volkov AA,Arnold FH(1999),Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution中描述,出自Demain AL,Davies JE(编著)Manual of industrial microbiology and biotechnology,American Society for Microbiology中),本领域技术人员也可以选择性方式产生功能突变体,并且也可大规模产生。此处,在第一步中,首先产生相应蛋白质基因库(例如可以使用上述方法)。该基因库以适当方式表达,例如通过细菌或噬菌体展示系统。
宿主生物表达功能突变体(其具有与所需特性大量对应特性)的相关基因可进行又一轮突变。突变、选择或筛选的步骤可反复重复,只要目前的功能突变体具有足够测量的所需特性。这一重复过程的结果是,有限数量的突变体(如,例如1至5个突变体)可分步进行并获得和筛选其对酶的相关特性的影响。然后选择的突变体可以同样的方式进行进一步的突变步骤。由此需研究的个体突变体的数目将被显著降低。
本发明的结果在关于所涉及的酶的结构和序列方面给出了重要信息,其对于特别是为进一步产生具有所需修饰特性的酶是必需的。尤其是,可定义“热点”,即适合通过引入特异性突变修饰酶特性的潜在序列部分。
本发明HSDH的此类热点区域的非限制性例子总结如下:
35-40,尤其是37-38,(在每种情况下相对于HSDH_短(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
90-105,93-100或96-100,尤其是97和/或98,(在每种情况下相对于HSDH_短(SEQ ID NO:4)的氨基酸序列。
3.2.2构建体
此外,本发明涉及表达构建体,其包含处于调节性核酸序列的遗传控制下的编码本发明多肽的核酸序列;以及包含这些表达构建体至少之一的载体。
根据本发明,“表达单元”理解为意思是指具有表达活性的核酸,该核酸包含如本文中定义的启动子并且与待表达的核酸或基因功能性连接后,调节表达,即此类核酸或此类基因的转录和翻译。因而在此类关系下,它也叫做“调节性核酸序列”。除启动子之外,可以存在其他调节元件,例如增强子。
根据本发明,“表达盒”或“表达构建体”理解为意思是指与待表达的核酸或待表达的基因功能性连接的表达单元。与表达单元不同,表达盒因而不仅包含调节转录和翻译的核酸序列,还包含由于转录和翻译而将表达为蛋白质的核酸序列。
术语“表达”或“过量表达”在本发明上下文中描述微生物中由相应DNA编码的一种或多种酶的胞内活性的产生和提高。为此目的,例如可以在生物中引入基因、由另一种基因替代现存基因、增加基因或诸基因的拷贝数、可使用强启动子或可使用编码具有高活性的相应酶的基因,并且任选地可以组合这些措施。
优选地,本发明的此类构建体包含在各自编码序列5′-上游的启动子和3′-下游的终止子序列,并且任选地还包含惯用调节元件,即在每种情况下它们与编码序列有效地连接。
根据本发明,“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”理解为意思是指与待转录核酸功能性连接的调节其转录的核酸。
在这一关系中,“功能性”或“有效地”连接理解为意思是指例如具有启动子活性的核酸之一和待转录的核酸序列和任选地其他调节元件(例如能够保证核酸转录的核酸序列及例如终止子)依次排列,从而所述每种调节元件可以在该核酸序列的转录中履行其功能。为此目的,化学意义上的直接 连接并非绝对必需的。基因调控序列(例如增强子序列)也能够从更远位置或甚至从其它DNA分子上对靶序列发挥它们的功能。优选这样的排列,其中待转录的核酸序列位于启动子序列之后(即在其3′端),从而这两个序列彼此共价地连接。此处,启动子序列与待转基因方式表达的核酸序列之间的距离可以小于200个碱基对或小于100个碱基对或小于50个碱基对。
除了启动子和终止子之外,可以提及的其他调节元件的例子是靶向序列、增强子、多腺苷酸化信号、选择标记、扩增信号、复制起点等。适当的调节序列例如在Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1990)中描述。
本发明的核酸构建体尤其包含SEQ ID NO:1或3或其衍生物和同源物,以及由此衍生的核酸序列,其中所述的核酸序列有利地与控制(例如增加)基因表达的一种或多种调节信号有效地或功能性地连接。
除这些调控序列之外,这些序列的天然调节序列可以额外地在实际结构基因之前存在,并且任选地可以被基因修饰,从而关闭了天然调节作用并且所述基因的表达增加。然而,核酸构建体也可以具有更简单地构建,即,在编码序列之前不插入任何额外的调节信号并且不移除具有调节作用的天然启动子。与此相反,使天然调节序列突变,从而调节作用不再发生并且基因表达增加。
优选的核酸构建体有利地也含有与启动子功能性连接的一种或多种已经提及的“增强子”序列,其中所述的增强子序列允许核酸序列表达提高。也可以在DNA序列的3′端插入额外的有利序列,如其他调节元件或终止子。本发明核酸可以一个或更多拷贝存在于构建体中。其他标记也可存在于构建体中,如互补抗生素抗性或营养缺陷型的基因,任选地用于对构建体选择。
适当调节序列的例子存在于启动子中,如启动子cos、tac、trp、tet、trp-tet、lpp、lac、lpp-lac、laclq-、T7、T5、T3、gal、trc、ara、rhaP(rhaPBAD)SP6、λ-PR中或λ-PL启动子中,这些有利地用于革兰氏阴性细菌中。其他有利的调节序列存在于例如在革兰氏阳性启动子amy和 SPO2,在酵母或真菌启动子ADC1、MFα、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28和ADH。人工启动子也可以用于调节。
为在宿主生物中表达,将核酸构建体有利地插入到载体中(例如质粒或噬菌体)中,其在该宿主内允许基因的最佳表达。除质粒和噬菌体外,载体也理解为意思是指本领域技术人员已知的全部其他载体,即,例如病毒如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可以在宿主生物中自主复制或随染色体复制。这些载体代表本发明的又一实施方案。
适当的质粒例如是大肠杆菌中的pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI;链霉菌属(Streptomyce)中的pIJ101、pIJ364、pIJ702或pIJ361;芽孢杆菌属(Bacillus)中的pUB110、pC194或pBD214;棒杆菌属(Corynebacterium)中的pSA77或pAJ667;真菌中的pALS1、pIL2或pBB116;酵母中的2αM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23或植物中的pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。提及的质粒是可能质粒的小部分选择。其它质粒是本领域技术人员熟知的并且能从例如书籍Cloning Vectors(编者Pouwels P.H.等人,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985,ISBN 0 444 904018)中得知。
在载体的其他实施方案中,含有本发明核酸构建体或本发明核酸的载体也可以有利地以线性DNA形式引入微生物并通过异源或同源重组整合入宿主生物的基因组。此类线性DNA可以由线性化载体(如质粒)或仅仅本发明的核酸构建体或核酸组成。
为在生物中最佳表达异源基因,有利的是根据生物中所用的特定“密码子利用”修饰核酸序列。该“密码子利用”可以通过计算机分析所涉及生物的其他已知基因容易地确定。
本发明表达盒通过适当启动子与适当的编码性核苷酸序列及终止子或多腺苷酸化信号的融合产生。为此目的,使用如在例如T.Maniatis,E.F. Fritsch和J.Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1989)以及在T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,Experiments with Gene Fusions,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY(1984)并且在Ausubel,F.M.等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene Publishing Assoc.和Wiley Interscience(1987)中描述的惯用重组和克隆技术。
为在适当的宿主生物内表达,将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入宿主特异性载体中,以允许所述基因在宿主中最佳表达。载体是本领域技术人员熟知的并且能从例如“Cloning Vectors”(Pouwels P.H.等人编辑,Elsevier,Amsterdam-New York-Oxford,1985)中得知。
3.3微生物
根据上下文,术语“微生物”可理解为意思是指起始微生物(野生型)或基因修饰的重组微生物或这两者。
借助本发明的载体,可以制备重组微生物,所述重组微生物用例如至少一种本发明载体转化并可以用于产生本发明的多肽。有利地,将以上所述的本发明重组构建体引入适当的宿主系统并表达。此处,优选地使用本领域技术人员已知的常见克隆与转染方法,例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等,旨在使提及的核酸在相应表达系统中表达。适当的系统例如在Current Protocols in Molecular Biology,F.Ausubel等人编著,Wiley Interscience,New York 1997或Sambrook等人Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版,Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY,1989中描述。
本发明可能的核酸或核酸构建体的重组宿主生物原则上为全部原核或真核生物。有利地所用宿主生物是微生物如细菌、真菌或酵母。有利地使用革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌,优选地是肠杆菌科 (Enterobacteriaceae)、假单胞菌科(Pseudomonadaceae)、根瘤菌科(Rhizobiaceae)、链霉菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌,尤其优选地是埃希氏菌属(Escherichia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、诺卡式菌属(Nocardia)、伯霍尔德杆菌属(Burkholderia)、沙门氏菌属(Salmonella)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、梭菌属(Clostridium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。尤其十分优选地是大肠杆菌(Escherichia coli)属和种。此外,有利的细菌在由α-变形菌(alpha-proteobacteria)、β-变形菌(beta-proteobacteria)或γ-变形菌(gamma-proteobacteria)组成的组中找到。
本发明的宿主生物此处优选地含有至少一种本文发明所述的核酸序列、核酸构建体或载体,其编码根据上文定义的具有12α-HSDH活性的酶。
以本领域技术人员已知的方式培养或繁殖本发明方法中所用的生物。微生物一般在液体培养基中在0℃与100℃之间、优选在10℃与60℃之间的温度在通氧气的情况下培育,其中所述液体培养基含有通常为糖形式的碳源、通常为有机氮源(如酵母提取物)形式或盐形式(如硫酸铵)的氮源、微量元素如铁、锰或镁盐并且任选地含有维生素。此处营养液的pH可以保持在固定值上,即在培育期间调节或不调节。可以分批、半分批或连续地进行培育。养分可以在发酵起始引入或可以随后半连续或连续地供应。
3.4UDCA的产生
3.4.1简介
活性物质熊去氧胆酸(UDCA)和相关非对映体鹅脱氧胆酸(CDCA),以及其它物质,已经用于医学治疗胆石病多年。两种化合物的区别仅在于碳原子7上羟基的构型(UDCA:β-构型,CDCA:α-构型)。为了产生商业量的UDCA,迄今已经优选的使用一种方法,其中利用CDCA为原料。而CDCA优选地从胆酸(CA)产生。
3.4.2CDCA的产生
CA(CAS 81-25-4)用作原料生产CDCA(CAS 474-25-9)。经典化学路线1仅仅使用化学工艺步骤。在这种情况下,需要四个步骤将CA转换为CDCA。替代路线2包括酶催化的反应。这一途径从CA至CDCA仅有两个步骤。
3.4.2.1路线1(化学途径)
在这一合成的第一步中,使CA的羧基酯化以产生甲酯(CDCA I,CAS1448-36-8)。随后对位置3和7中的羟基进行位置选择性乙酰化。乙酰化产物,3,7-二-O-乙酰胆酸甲酯(CDCA II,CAS 3749-87-9)获得结晶并分离。在随后的阶段(步骤3),位置12的游离羟基被氧化。3,7-二-O-乙酰基-12-酮胆烷酸甲酯(methyl 3,7-di-O-acetyl-12-ketocholanate,CDCA III,CAS4651-67-6)在第四和最后步骤中经Wolff-Kishner还原脱氧成CDCA。
第一步:酯化
第二步:乙酰化
第三步:氧化
第四步:脱氧
具体地,该方法如下进行:
在阶段1,CA在酸催化下与甲醇酯化产生胆酸甲酯(CDCA I)。随后通过乙酸酐位置选择性乙酰化位置3和7的羟基。有机氮碱和酰化催化剂任选地用于反应中。通过优化反应时间,此处获得最大量的二乙酰化合物 (CDCA II)。产物结晶后分离并干燥。乙酰化条件,尤其是结合乙酸酐、三乙胺和DMAP在EP 0 424 232中描述。乙酰化的选择性决定了以后(中间体)产物CDCA的质量。副产物3-O-单乙酰胆酸甲酯在进一步的合成过程中产生石胆酸。这是有毒的,在终产物UDCA的专题中被限制至低的数值(Ph.Eur.0.1%,USP 0.05%)。在过度乙酰化成3,7,12-三-O-乙酰胆酸甲酯的情况下,此后所得CDCA含有成比例的更多作为杂质的CA。
CDCA II氧化成CDCA III使用次氯酸钠水溶液进行。产物从溶液中沉淀,过滤并干燥。这一程序也描述在EP 0 424 232中。通常,在文献中发现作为替代的还有其他氧化剂,如铬酸。
为了将CDCA III脱氧成CDCA,已知多种Wolff-Kishner还原的变体。在一种方法中,使CDCA III在三甘醇中在200℃与肼和氢氧化钠反应。从反应溶液中通过盐酸酸化沉淀产物,然后过滤并干燥。另一种方法在较低温度下进行,描述于EP 0 424 232中。此处使CDCA III与肼和氢氧化钾在2-丁醇中反应。产物如变体1中一样通过添加盐酸从水中沉淀。
这一方法获得的CDCA具有明确和特定的质量,适合用于后述方法制备药典质量的UDCA。
3.4.2.2路线2(酶途径)
作为专一化学方法的替代,根据本发明,提供酶催化氧化CA至12-酮鹅脱氧胆酸(12-酮-CDCA,CAS 2458-08-4),其然后进一步反应产生CDCA。这一合成途径包含仅两步,因而与纯化学路线相比其实施明显更简单。
第一步:酶促氧化
第二步:脱氧
根据步骤1,胆酸通过12α-HSDH NADP+-依赖性氧化产生12-酮鹅脱氧胆酸(12-酮-CDCA)。这一反应是可逆的。12α-HSDH属于酶类型1.1.1.176并且主要在梭菌属的细菌中发现。NADP+-依赖性(Harris和Hylemon(1978)Biochim Biophys Acta528(1):148-57)和NAD+-依赖性代表都存在(MacDonald等人,1976)Biochim Biophys Acta 450(2):142-53。
唯一已知表达高12α-HSDH活性缺少其它HSDH的微生物是梭菌属细菌P组48-50菌株DSM 4029(MacDonald等人,1979,同上述引文)。因此这一生物迄今被用来产生12α-HSDH,必须通过昂贵的培养基进行高要求的厌氧发酵(MacDonald 1981)Experientia 37(5):451-2。然而,可以用酵母自溶产物替代该培养基(Braun,M.等人,1991,同上述引文)。
根据本发明,酶促氧化优选地通过本发明的12α-HSDH(长或短版本)和通过ADH(例如ADH ms或ADH t)的辅因子再生进行。
步骤2的脱氧是经典的化学Wolff-Kishner还原并与上述CDCA III脱氧类似地进行。这一路线的根本优点是由于酶的选择性不形成石胆酸杂质。
3.4.3.3UDCA的产生
CDCA用作UDCA(CAS 128-13-2)的原料。在第一合成步骤中,CDCA位置7中的羟基被氧化以产生相应的酮。产生7-酮石胆酸(3α-羟基-7-酮胆烷酸,缩写:KLCA,CAS 4651-67-6)。随之在第二步中进行位置7酮基的立体特异性还原。目的是获得具有尽可能高的非对映选择性的UDCA。通常,直接还原后的UDCA仍然含有少量百分比的非对映体CDCA。为达到活性物质UDCA,粗制UDCA必须在第三步中纯化。
第一步:氧化
第二步:还原
KLCA 粗制UDCA
(由UDCA和CDCA组成)
第三步:纯化
粗制UDCA->纯UDCA
CDCA的氧化常规通过次氯酸钠水溶液进行。在文献中,另外发现铬酸氧化可替代之。获得的KLCA为固体,从而在第二步中进一步加工。还原可在醇中通过金属钠进行。产生粗制产物的组成UDCA∶CDCA为大约85∶15。在替代方法中,KLCA通过氢在镍催化剂(兰尼氏镍)上还原,醇(例如脂肪醇)和碱(如叔丁醇钾或氢氧化钾)一块作为溶剂(EP-A-0230085)。另外,通过钾和锂(比钠选择性更高C.Giordano等人,Angew.Chem.1985,97,510)和锌(ES 489661)以及电化学(US 4 547 271)还原也是可能的。
纯化粗制UDCA以产生纯UDCA涉及非对映体盐的分离。通过制备、分离和随后切割UDCA的适当盐进行。下述替代纯化方法在文献中提及:制备、重结晶和切割相应UDCA酯(EP-A-0 386 538),提取(JP 60006699) 和色谱方法(IT 2000MI1177)。
3.5重组产生12α-HSDH
本发明也涉及重组产生本发明的多肽或其功能、生物学活性片段,其中培养产生多肽的微生物,任选地诱导多肽的表达并将它们从培养物中分离。从而如果需要,多肽也可工业规模产生。
本发明产生的微生物可以连续地或在分批工艺(分批培养)或在补料分批或重复补料分批工艺中间歇地培育。将在Chmiel(Bioprozefβtechnik 1.Einführung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocess technology 1.Introduction to bioprocess technology](Gustav Fischer Verlag,Stuttgart,1991))的教科书中或Storhas(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral devices](Vieweg Verlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))的教科书中找到对已知培养方法的总结。
待使用的培养基必须适当地满足相应菌株的要求。在手册美国细菌学会“普通细菌学方法手册(Manual of Methods for General Bacteriology)”(Washington D.C,USA,1981)中含有对用于多种微生物的培养基的描述。
本发明中可使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖,如单糖、二糖或多糖。极好的碳源例如是葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。糖也可以通过复杂化合物如糖蜜或来自糖精炼的其他副产品添加至培养基。添加多种碳源的混合物也可以是有利的。其他可能碳源是油和脂肪,例如大豆油、葵花籽油、花生油或椰子油,脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸、醇如甘油、甲醇或乙醇和有机酸例如乙酸或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或含有这些化合物的物质。示例性氮源包括氨气或铵盐,如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、脲、氨基酸或复杂氮源,如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、 肉浸汁和其他等。氮源可以单独使用或作为混合物使用。
可以在培养基中存在的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
作为硫源,可以使用含硫无机化合物例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物以及有机硫化合物如硫醇和硫羟。
作为磷源,可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠盐。
可以添加螯合剂至培养基,目的在于维持溶液中的金属离子。尤其适当的螯合剂包括二羟基酚,如儿茶酚或原儿茶酸盐或有机酸如柠檬酸。
根据本发明使用的发酵培养基常规地含有其他生长因子,如维生素或生长促进剂,它们包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐经常来自复杂培养基组分,如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外,可以添加适当的前体至培养基。培养基中化合物的精确组成强烈取决于具体实验并且对每种具体情况逐一决定。关于培养基优化的信息可以在教科书“Applied Microbiol.Physiology,A Practical Approach”(P.M.Rhodes,P.F.Stanbury编著,IRL Press(1997),第53-73页,ISBN 0 19 963577 3)中获得。也可以从供应商处获得生长培养基,如标准1(Merck)或BHI(心脑浸液,DIFCO)等。
通过加热(在1.5巴和121℃,20分钟)或通过无菌过滤,将培养基的全部组分消毒除菌。所述组分可以一起消毒除菌或根据需要分别消毒除菌。培养基的全部组分可以在培养起始存在或任选地可以连续地或分批地添加。
培养物的温度通常在15℃和45℃,优选25℃至40℃之间并且在实验期间可以维持恒定或可以变化。培养基的pH应当在5至8.5的范围内,优选地在7.0附近。可以在繁殖期间通过添加碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物如磷酸或硫酸控制繁殖的pH。为控制泡沫形成,可以使用消泡剂例如脂肪酸聚二醇酯。为维持质粒的稳定性,可以将适当的选择作用物质例如抗生素添加至培养基。为维持有氧条件,将 氧或含氧气体混合物例如空气引入培养物。培养物的温度通常为20℃至45℃。持续培养直至最大量的所需产物已经形成。这一目标通常在10小时至160小时内实现。
发酵培养液随后进一步处理。根据需要,生物质可以通过分离方法(例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合)从发酵培养液中完全或部分去除,或完全留在其中。
如果多肽未分泌到培养基中,也可以破坏细胞并将产物从裂解物中根据已知蛋白质分离方法回收。可替代地,细胞可以通过高频超声波、通过高压(例如在弗氏细胞压碎器中)、通过渗透作用、通过去垢剂、裂解酶或有机溶剂的作用、通过匀浆机或通过所提及的几种方法的组合进行破坏。
可使用已知的色谱方法如分子筛色谱法(凝胶过滤法),如Q-琼脂糖色谱法,离子交换色谱法和疏水色谱法和使用其他惯用方法如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳完成多肽的纯化。适当的方法在例如Cooper,F.G.,Biochemische Arbeitsmethoden[Biochemical Working Methods],Verlag Walter de Gruyter,Berlin,New York或在Scopes,R.,Protein Purification,Springer Verlag,New York,Heidelberg,Berlin中描述。
对于重组蛋白质的分离,使用载体系统或寡核苷酸可能是有利的,该载体系统或寡核苷酸通过特异性核苷酸序列延伸cDNA,从而编码修饰的多肽或融合蛋白,其例如用于使纯化更简单。这一类型适当的修饰如作为锚发挥功能的“标签”,如已知的六组氨酸锚定修饰或作为抗原可被抗体识别的表位(例如在Harlow,E.和Lane,D.,1988,Antibodies:A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中描述)的修饰。这些锚可用于将蛋白质附着到固体载体,如聚合物基质,该载体可被填入色谱柱或可用于微量滴定板上或在其它载体上。
同时,这些锚也可用于蛋白质的识别。为识别蛋白质,惯用标记如荧光染料、酶标记(其在与底物反应后形成可检测的反应产物)或放射性标记,也可单独或与锚联合用于衍生蛋白质。
3.6酶固定
在本文描述的方法中,本发明的酶可以游离或固定形式使用。固定的酶理解为意思是指固定到惰性载体的酶。适当的载体材料和固定于其上的酶可从EP-A-1149849、EP-A-1 069 183和DE-A 100193773及其中引用的参考文献中得知。在此完整引用这些说明书的公开内容作为参考。适当的载体材料包括例如粘土、粘土矿物,如高岭石、硅藻土、珍珠岩、硅石、铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉、阴离子交换材料、合成聚合物,如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、酚醛树脂、聚氨基甲酸酯和聚烯烃,如聚乙烯和聚丙烯。为所支持的酶的产生,载体材料通常以精细分割的颗粒形式使用,优选为多孔形式。载体材料的颗粒大小通常在5mm以下,尤其是2mm(分级曲线)以下。类似地,在使用脱氢酶作为全细胞催化剂时,可选择游离或固定形式。载体材料是,例如藻酸钙和角叉藻聚糖。酶以及细胞可以使用戊二醛直接交联(交联至CLEA)。例如在J.Lalonde和A.Margolin “Immobilization of Enzymes”于K.Drauz和H.Waldmann,Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002,Vol.III,991-1032,Wiley-VCH,Weinheim中描述了相应的固定方法和其他固定方法。
实验部分
如果没有给出其他信息,本发明上下文进行的克隆步骤,例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段纯化、转移核酸至硝酸纤维素和尼龙膜、连接DNA片段、转化微生物、繁殖微生物、噬菌体复制和重组DNA序列分析可如Sambrook等人(1989)的上述引文中的描述进行。
A.一般信息
材料:
酶和酶缓冲液从Fermentas,St.Leon-Rot或NEB,Frankfurt获得。
LB培养基:
细菌用胰蛋白胨 10g
酵母提取物 5g
氯化钠 5g
双蒸水 至1000ml
TB培养基:
溶液I:
细菌用胰蛋白胨 12g
酵母提取物 24
无水甘油 4ml
双蒸水 至900ml
溶液II:
磷酸二氢钾 0.17M
磷酸氢钾 0.72M
双蒸水 至100ml
这两种溶液在高压灭菌后组合。
表达载体
为表达12α-HSDH,使用载体pET22b(+)(Novagen,Darmstadt),其含有T7启动子控制下的MCS和转录起始以及T7终止子。表达通过异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导。
为此目的,PCR扩增12α-HSDH编码序列。使用梭菌属细菌P组48-50菌株基因组DNA作为模板和后面更精确描述的引物对获得PCR产物。将PCR产物加入琼脂糖凝胶,分离并从中切除。随后,它们借助于NdeI和BamHI限制性切割并与同样用NdeI和BamHI切割的pET22b(+)载体连接。
微生物
方法
1.12α-HSDH活性确定的标准条件
活性的定义如下:1U的酶相当于室温下(即大约20℃-23℃)每分钟催化磷酸钾缓冲液(50mM,pH 8.0)中5mM胆酸溶液的1μmol反应的酶量。
对于活性确定,790μl磷酸钾缓冲液(50mM,pH 8.0),100μm胆酸(50mM于磷酸钾缓冲液(50mM,pH 8.0)中)和10μl待测酶溶液混合于比色杯中。在反应开始时添加100μl的NADP+(2.5mM),光度计测量确定340nm吸收的增加。室温下确定30秒内的梯度。根据朗伯-比尔定律(Lambert-Beer′s law)确定活性。
2.通过BCA测定确定蛋白质浓度
通过测量20μl蛋白质溶液(例如细胞裂解稀释液或超声波破坏后重悬浮的细胞碎片沉淀物)在分析试剂盒(Bio-Rad,Munich)的200μl BCA溶液(溶液A∶溶液B 50∶1)中562nm的吸收确定溶液的蛋白质浓度。此处,形成二辛可宁甲酸(BCA),其具有蛋白质还原二价铜离子定量产生的单价铜离子(紫色络合物),其在562nm的吸收可通过光度计测量。浓度的确定通过牛血清白蛋白(BSA)校准线进行。
B.基因分离的预实验
所有实验研究的目的是发现改进的获得酶12α-HSDH的路线。为达到这一目的,本发明阐明了编码12α-HSDH的基因序列。
1.1首先,使用简并寡核苷酸引物通过聚合酶链反应(PCR)进行了尝试。使用的寡核苷酸一方面基于公布的12α-HSDH氨基末端氨基酸序列(参 见Braun等人,同上述引文)构建。为保持低简并度,获得以氨基末端甲硫氨酸(仅一个密码子)起始的引物(引物序列未显示)。另一方面,数据库支持的序列比较显示HSDH中存在保守的氨基酸基序“LVNN”。这一区域用于构建反向引物。另外,另一个稍低强度保守序列基序PE(Q)DIAN用于设计简并引物(引物序列未显示)。其它简并寡核苷酸通过免费的程序CODEHOP(Rose,T.M.等人,Nucleic Acids Research,1998,26(7),1628-1635)丢弃。
使用上述简并引物的所有组合没有扩增到所寻找的基因。
1.2在确定12α-HSDH其它肽序列片段的实验中,尝试通过联合两个亲和色谱步骤从梭菌属细菌P组裂解物中纯化酶。Braun等人在上述引文中描述了这一方法,但不能重复出来。
C.编码12α-HSDH序列的分离以及12α-HSDH酶的表征
实施例1:序列同源性研究
为获得12α-HSDH序列,对梭菌属细菌P组48-50菌株DSM 4029的基因组进行了测序。在所有开放读码框(ORF)中搜索已经公开的氨基末端序列和基序“LVNN”都未得到编码12α-HSDH基因的序列。
仅能够通过序列同源性比较鉴定出含有修饰形式的所公布部分序列信息的基因。比较通过TBLASTX(Tatusova和Madden(1999)FEMSMicrobiol Lett 174(2),247-250)在以下条件下进行:
空位开口:5
延伸开口:2
开口×_放弃:50
预期:10.0
字长:11
使用http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi?PAGE=Translations&PROGRAM=tblastx&BLASTPROGRAMS=tblastx&PAGETYPE=BlastSearch&SHOW DEFAULTS=on#i的标准条件;参数可在“Algorithmparameters”下找到。
在发现的基因(SEQ ID NO:3)中,缺失了所公布的部分序列中显示的氨基末端甲硫氨酸;此外,在蛋白质的氨基末端没有发现所公布的部分序列(生物信息预测基因以GLIMMER起始,CBCB,Maryland,USA)。在12α-HSDH中保守基序“LVNN”也被修饰为“LINN”(SEQ ID NO:5)。
基于这些理由,不可能成功实施最初使用的通过简并寡核苷酸阐明序列的方法。为获得简并引物,尤其是甲硫氨酸是被常规使用的,因为其仅由单个碱基三联体编码。同样也未预料到从梭菌属细菌预测的12α-HSDH在保守序列“LVNN”中显示偏差。
图3显示已知微生物HSDH和本发明的HSDH之间的部分多序列比对。
实施例2:12α-HSDH基因的扩增和12α-HSDH的表达
1.扩增
为此使用下述引物:
正向长(长酶版本,NdeI切割位点):
GGTATTCCATATGGATTTTATTGATTTTAAGGAGATG(SEQ ID NO:14)。
正向短(短酶版本,NdeI切割位点):
GGTATTCCATATGATCTTTGACGGAAAGGTCGC(SEQ ID NO:15)。
反向引物(BamH1切割位点)
CGGGATCCCTAGGGGCGCTGACCC(SEQ ID NO:16)。
目标基因使用Pfu聚合酶通过PCR扩增。
使用1μl梭菌属细菌P组48-50菌株DSM 4029的基因组DNA(29.4ng/μl)为模板。使用1μl Pfu聚合酶扩增。使用的缓冲液为Pfu缓冲液(10×含MgSO4)(Fermentas,St.Leon-Rot)。在每种情况下使用1.5μl的正向和反向引物(10μM),2μl三磷酸脱氧核苷酸(20μM)。通过无RNase水调整体系至50μl。反应在Eppendorf热循环仪(thermocycler)中进行。PCR体系最初以95℃起始进行5min以变性DNA。然后,在克隆未知DNA序列中,在95℃进行30s变性后进行30个循环。随后,在每种情况下,体系通过温度梯度冷却到25-45℃30s以保证简并引物退火到目标DNA上(恒定退 火温度为53℃)。在此之上,调整温度为72℃进行90s以进行引物延伸,因为使用的聚合酶在此处有最佳活性。最后,体系在72℃孵育10min,并冷却到4℃直到从仪器中移出。
2.表达
通过聚合酶链反应扩增后,目标基因通过切割位点NdeI和BamHI克隆到表达载体pET22b+,引入到大肠杆菌Rosetta DE3TM和大肠杆菌BL21DE3细胞并表达。这些是非致病菌株,使产生大量酶成为可能(达150000U/l培养物)。
为了表达,5ml LB培养基(含100μg/ml氨苄西林)与大肠杆菌BL21(DE)或RosettaTM克隆(其通过表达载体转化)在180rpm(转每分)37℃保温16小时。用其接种200ml TB培养基(含100μg/ml氨苄西林)并在180rpm 37℃孵育。在OD600为0.6-0.8时通过1mM IPTG诱导12α-HSDH的表达。在不同时间,移出OD600为0.25的1ml细胞悬浮物,在13000rpm离心1min形成沉淀物,并存储在-20℃直至进一步使用。4或22小时后,通过4℃2700g离心10min使细胞形成沉淀物终止表达,然后将其冷冻。
首先在4-10ml磷酸钾缓冲液(50mM,pH 8.0)中重悬浮沉淀物,借助超声波破坏细胞。在每种情况下,细胞在冰浴中并在来自于Branson的超声波破碎机中以强度30%1min处理四次,有2分钟间隔。随后,细胞碎片通过4℃4220g离心1h去除。
图4显示表达本发明的酶(HSDH短和HSDH长)(在每种情况下条带在大约27kDa)4小时和22小时后,细胞裂解物的SDS-PAGE(12.5%强度凝胶,β-巯基乙醇)结果。
蛋白质含量和酶活性通过上述描述确定。
破坏大肠杆菌细胞后获得的酶活性总结于下表中。
由于高表达水平,细胞破坏和离心后的酶制剂的体积和比活性与最初从梭菌属细菌P组48-50菌株获得相比已经显著提高(36 800U/l培养基)。因此与以前描述的方法相比,可省却蛋白质纯化。
在BL21(DE3)细胞总量蛋白质中高比例的目标蛋白质通过下表示显示:
实施例3:从胆酸到12-酮鹅去氧-胆酸的制备合成
表达的酶(短版本)与ADH t(Codexis,Jülich)联合用于制备合成12-酮鹅脱氧胆酸。
为此,500ml胆酸(在磷酸钾缓冲液(50mM,pH 8.0),10%丙酮中,400mM),0.25mM NADP+,2000U来自于大肠杆菌BL21(DE3)的12α-HSDH短(参见上述实施例2),以及为辅因子再生550U的ADH t(来自于Thermoanaerobacter sp.,Codexis,Jülich)混合于1升圆底烧瓶中。反应在室温下进行,同时连续搅拌并回流冷却。27小时后,进一步添加550U的12α-HSDH和138U的ADH t,混合物孵育共117小时。在反应过程中,在340nm确定光吸收,移出1ml样品用于监测反应过程,该反应过程通过100μl盐酸(1M)终止,并蒸发或在乙酸乙酯中提取。吸收过程显示于图5。
反应通过添加发烟盐酸(37%)酸化,直至完全沉淀反应配偶体。移出上清并提取三次(在每种情况下通过50ml乙酸乙酯)。沉淀的胆酸衍生物通 过添加盐酸并加温完全溶解于丙酮中。合并有机相并干燥直至无溶剂。
此处显示产生产物提取物比使用直接来自于梭菌属细菌P组48-50菌株的商业产品(ASA Spezialenzyme)明显更容易。其原因是具有同样HSDH活性的总蛋白质含量明显更低。
实施例4:所表达的酶的表征
对所表达的酶在活性方面进行了表征。显示胆酸至12-酮鹅脱氧胆酸的选择性氧化得到了催化。
参比物质胆酸和12-酮鹅脱氧胆酸以及反应体系的提取物(实施例3)通过玻璃毛细管加入TLC硅胶60F254铝箔(Merck,Darmstadt)。该铝箔尽可能垂直地放置在色谱室,色谱室含有作为洗脱剂的二氯甲烷∶丙酮∶乙酸(浓度)(比例为40∶40∶3)混合物。进行分离直至洗脱液前端几乎达到板上缘。物质的显色通过喷洒磷钼酸喷洒试剂(40mM磷钼酸,95.2%浓度乙酸,4.8%浓度硫酸)以及随后加热进行。
结果显示于图6。
实施例5:涉及NADPH结合的氨基酸残基的定位
通过同源性比较NADH和NADPH-依赖性“短链脱氢酶”(SDR),能够鉴定两条氨基酸侧链,其对辅因子的识别以及可能在将来辅因子辨别是重要的:通过定点诱变(替换基于出版物(Tanaka等人(1996)Biochemistry35(24):7715-30)和(Carugo和Argos(1997)Proteins28(1):10-28)制备),进行G37D和R38L(基于SEQ ID NO:3)的替换。实验根据Stratagene GmbH的QuikChange Site-directed Mutagenesis Kit(定点诱变试剂盒)的实验细节进行。
定点诱变的引物(见下表)基于12α-HSDH基因序列选择从而产生所需的氨基酸交换。此处注意突变(下划线标记)位于引物中心并且两个引物对的熔解温度位于相同范围。使用下述组合:
MBr_QC_HSDH_G37D_正向/MBr_QC_HSDH_G37D_反向,通过 pET22b(+)-HSDH_短和
MBr_QC_HSDH_R38L_正向/MBr_QC_HSDH_R38L_反向,通过pET22b(+)-HSDH_短_G37D。
定点诱变的引物
发现产生的蛋白质变体在有NADPH时不再显示活性。这是鉴定辅因子结合位点重要性的基础。因而由此制备的变体在有NADH时没有显示活性。然而。NADH-依赖性HSDH变体可通过在所描述的位置或其它位置饱和诱变获得。
实施例6:产物抑制突变体37D12的表征
在所研究的12α-HSDH中,将观察到产物12-酮鹅脱氧胆酸对它的抑制,这对方法的反应率有负面影响。为降低12α-HSDH的这一产物抑制,通过易错PCR(error-prone PCR)制备4000突变体的随机12α-HSDH文库。适当的方法原则上是已知并描述例如在:Cadwell,R.C.等人,Randomization of Genes by PCR Mutagenesis;(1992)PCR Methods and Applications,2:28-33,Cold Spring Harbor Laboratory;Arnold,F.H.等人,Current Opinion in Chemical Biology(1999)3:54-59;或Liebeton,K.等人,Chemistry & Biology,(2000),7:709-718中。选择用于易错PCR的目标DNA起始量以便获得每kb 4.5个突变的突变率。将产物连接到pET22b(+)载体中并转化大肠杆菌Nova Blue(DE3)。
在微量滴定板(MTP)中挑选数量大约4000个突变体,其用于接种主要培养物。为了引入,表达和细胞破坏使用深孔MTP。对全部4000个突变 体的细胞裂解物在微量规模和产物存在下进行筛选。此处鉴定了数个突变体,突变体37D12被进一步使用。
图8中可见突变体37D12在12α-HSDH同源模型中的突变。其是谷氨酰胺改变为组氨酸(参见图7的序列),并且位于底物和辅因子结合口袋之间的活性中心区域中。
由于突变体37D12与野生型相比具有修饰的动力学,为进一步分析产物抑制,活性定义为反应起始第一分钟内的30秒时间范围(其可获得最高的线性)用于计算活性。野生型和突变体37D12通过金属亲和色谱法纯化后,再次使用这些条件研究产物抑制。如图9所示,甚至在转换为1%时突变体显示明显的抑制降低。在5%转换,野生型酶显示60%的丧失,与之相比,突变体37D12为20%。在转换为25%时,突变体37D12保留了比野生型高3倍的活性。
纯化后,能够计算突变体的比活性为15.71U/mg,野生型为30.87U/mg。因此突变导致大约50%的活性丧失。
SEQ ID NO的指定:
SEQ ID NO: | 描述 | 类型 |
1 | 12α-HSDH;L | NS |
2 | 12α-HSDH;L | AS |
3 | 12α-HSDH;S | NS |
4 | 12α-HSDH;S | AS |
5 | 12α-HSDH序列基序;L和S | AS |
6 | 氨基末端;L | AS |
7 | 氨基末端;L | AS |
8 | 序列基序;L和S | AS |
9 | 氨基末端序列基序;S | AS |
10 | 氨基末端序列基序;S | AS |
11 | 氨基末端序列基序;L | AS |
12 | 序列基序;L和S | AS |
13 | 羧基末端序列基序;L和S | AS |
14 | PCR引物;L | NS |
15 | PCR引物;S | NS |
16 | PCR引物;L和S | NS |
17 | PCR引物 | NS |
18 | PCR引物 | NS |
19 | PCR引物 | NS |
20 | PCR引物 | NS |
21 | 突变体37D12;S | NS |
22 | 突变体37D12;S | AS |
AS=氨基酸序列
NS=核酸序列
L=长版本
S=短版本
此处明确引用本文中引用的出版物的公开内容作为参考。
Claims (29)
1.12α-羟类固醇脱氢酶,特征在于
a)氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示,或者氨基酸序列如SEQID NO:2所示,其中缺失了SEQ ID NO:2的位置1处的N末端甲硫氨酸;或
b)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示;或
c)由如SEQ ID NO:1或3所示的编码核酸序列编码。
2.12α-羟类固醇脱氢酶突变体,其具有降低的产物抑制,其中所述突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:22所示。
3.权利要求2的12α-羟类固醇脱氢酶突变体,其通过在大肠杆菌中异源表达12α-羟类固醇脱氢酶突变体而获得。
4.编码权利要求1的12α-羟类固醇脱氢酶的核酸序列。
5.编码权利要求2的12α-羟类固醇脱氢酶突变体的核酸序列。
6.表达盒,其包含在至少一种调节核酸序列遗传控制下的权利要求4或5的核酸序列。
7.载体,其包含至少一种权利要求6的表达盒。
8.重组微生物,其带有至少一种权利要求4或5的核酸序列或至少一种权利要求6的表达盒或被至少一种权利要求7的载体转化。
9.产生权利要求1的12α-羟类固醇脱氢酶的方法,其中培养权利要求8的重组微生物并从培养物中分离所表达的12α-羟类固醇脱氢酶。
10.产生权利要求2或3的12α-羟类固醇脱氢酶突变体的方法,其中培养权利要求8的重组微生物并从培养物中分离所表达的12α-羟类固醇脱氢酶突变体。
11.酶促氧化12α-羟类固醇的方法,其中使羟类固醇在根据权利要求1的12α-羟类固醇脱氢酶或在权利要求2至3任一项的12α-羟类固醇脱氢酶突变体存在下反应。
12.权利要求11的方法,其中羟类固醇是胆酸(CA)或胆酸衍生物,所述胆酸衍生物选自盐、酰胺或烷基酯。
13.权利要求12的方法,其中使CA或其衍生物反应以产生12-酮鹅脱氧胆酸(12-酮-CDCA)或产生相应衍生物。
14.权利要求11至13任一项的方法,其中反应在NAD(P)+存在下进行。
15.酶还原12-类固酮的方法,其中使类固酮在根据权利要求1的12α-羟类固醇脱氢酶或在权利要求2至3任一项的12α-羟类固醇脱氢酶突变体存在下反应。
16.权利要求15的方法,其中类固酮是12-酮-CDCA或其衍生物,所述衍生物选自盐、酰胺或烷基酯。
17.权利要求15的方法,其中类固酮被还原成相应的12α-羟类固醇。
18.权利要求16的方法,其中类固酮或其衍生物被还原成相应的12α-羟类固醇或其衍生物。
19.权利要求15至16任一项的方法,其中反应在NAD(P)H存在下进行。
20.权利要求11-13和15-16任一项的方法,其中所消耗的氧化还原当量通过电化学或酶促地再生。
21.权利要求11至13任一项的方法,其中反应以12α-羟类固醇脱氢酶为固定形式进行。
22.定性或定量检测12-类固酮或12α-羟类固醇的方法,其中权利要求1的12α-羟类固醇脱氢酶或权利要求2至3任一项定义的12α-羟类固醇脱氢酶突变体催化的类固醇的氧化还原反应在氧化还原当量存在下进行,确定氧化还原当量的浓度变化,由此定性或定量确定12-类固酮或12α-羟类固醇的含量。
23.制备式(1)熊去氧胆酸(UDCA)的方法
其中
R表示烷基、NR1R2、H、碱金属离子或N(R3)4 +,其中R3基相同或不同并且表示H或烷基,
其中
a)式(2)的胆酸(CA)
其中R表示如上所示的含义,Ra基相同或不同并且表示H或酰基,所述胆酸在权利要求1的12α-羟类固醇脱氢酶或在权利要求2至3任一项定义的12α-羟类固醇脱氢酶突变体存在下被氧化成相应式(3)的12-酮鹅脱氧胆酸(12-酮-CDCA)
其中R和Ra表示如上所示的含义,随后
b)式(3)的12-酮-CDCA通过脱氧反应,以产生式(4)的鹅脱氧胆酸(CDCA)
其中R和Ra具有如上所示的含义,和
c)式(4)的CDCA在位置7化学氧化成式(5)的7-酮石胆酸(KLCA)
其中R和Ra具有如上所示的含义;和
d)式(5)的KLCA被还原。
24.权利要求23的方法,其中,当Ra表示酰基时,此酰基在进行反应步骤b)或d)之后去除。
25.权利要求23或24的方法,其中步骤a)在NAD(P)+存在下进行。
26.权利要求25的方法,其中所消耗的NAD(P)+通过电化学或酶促地再生。
27.权利要求23至24任一项的方法,其中步骤a)以固定形式的12α-羟类固醇脱氢酶进行。
28.权利要求11-13、15-16和22-24中任一项的方法,其中使用权利要求1的12α-羟类固醇脱氢酶或使用权利要求2的12α-羟类固醇脱氢酶突变体,其中该酶或者酶突变体是在大肠杆菌中表达的酶或酶突变体,并且对其使用而无需另外的蛋白质纯化。
29.权利要求28的方法,其中所述大肠杆菌菌株选自大肠杆菌Rosetta(DE3)和大肠杆菌BL21(DE3),其表达权利要求1的12α-羟类固醇脱氢酶或权利要求2的12α-羟类固醇脱氢酶突变体。
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