JP7035034B2 - ケノデオキシコール酸のウルソデオキシコール酸への共役自己完結型(self-sufficient)生体内変換および前記方法において適用可能な新規酵素突然変異体 - Google Patents
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Description
)および7-KLCAの濃度(
)は、HPLCによって決定した。
1.一般式(1)、
Rは、アルキル、H、アルカリ金属イオンまたはN(R3)4 +(式中、残基R3は、同一または異なっており、Hまたはアルキルを表す)を表し、または基-CO2Rは、酸アミド基-CONR1R2(式中、R1およびR2は互いに独立に、アルキル残基を表し、Rは、好ましくは、Hを表す)によって置換される]
で示されるUDCA化合物を調製するための共役、好ましくは、自己完結型生体触媒方法であって、
a)7α-HSDHおよび7β-HSDHならびに好ましくは少なくとも触媒量のNAD+およびNADP+から選択される補因子の存在下で、一般式(2)
Rは、基-CO2Rについて上記で定義されるものと同一の意味を有するか、または酸アミド基-CONR1R2によって置換される]
で示されるCDCA化合物を反応させるステップであって、前記7α-HSDHおよび前記7β-HSDHは、NAD+/NADHおよびNADP+/NADPHから選択される同一補因子系を利用する能力を有し、
a1)前記7α-HSDHは、一般式(2)の前記CDCA化合物の、一般式(3)
で示される対応する中間体7-KLCA化合物への酸化を触媒し、
a2)前記7β-HSDHは、反応ステップa1)において形成されるような一般式(3)の前記7-KLCA化合物の、一般式(1)の前記UDCA化合物への還元を、反応ステップa1)において消費された補因子の再生下で触媒するステップと
b)任意選択で、反応生成物をさらに精製するステップと
を含む、方法。
a)前記7α-HSDHが、
(1)大腸菌(Escherichia coli)から単離され、少なくとも、7α-ヒドロキシステロイドの、対応する7-ケトステロイドへの(特に、CDCAの7-KLCAへの)立体特異的な酵素的酸化を触媒する、配列番号37に従うアミノ酸配列を含む7α-HSDHならびに配列番号37に対して、例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または99.5%のような少なくとも80%の配列同一性を有し、NAD+/NADHを利用する能力および少なくとも、7α-ヒドロキシステロイドの、対応する7-ケトステロイドへの(特に、CDCAの7-KLCAへの)立体特異的な酵素的酸化を触媒する能力を保持するその突然変異体ならびに
(2)配列番号34に従うアミノ酸配列を含むクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)7α-HSDHの突然変異体である7α-HSDHであって、突然変異体が、補因子としてのNAD+の消費下で(すなわち、補因子系NAD+/NADHの利用によって)、少なくとも、7α-ヒドロキシステロイドの、対応する7-ケトステロイドへの(特に、CDCAの7-KLCAへの)立体特異的な酵素的酸化を触媒し、前記7α-HSDHが、配列番号34のK16、A37およびR38から選択される位置に少なくとも1つの突然変異を含み、配列番号34に対して、例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または99.5%のような少なくとも80%の配列同一性を示し、突然変異体が、本明細書において以下にさらに定義される7α-HSDH
から選択され
b)前記7β-HSDHが、
(1)配列番号54を有するコリンセラ・アエロファシエンス(Collinsella aerofaciens)7β-HSDHの突然変異体である7β-HSDHであって、突然変異体が、補因子としてのNADHの消費下で(すなわち、補因子系NAD+/NADHの利用によって)、少なくとも、7-ケトステロイドの、対応する7β-ヒドロキシステロイドへの(特に、7-KCLAのUDCAへの)立体特異的な酵素的還元を触媒し、前記7β-HSDHが、配列番号54のT17、G39、R40、R41およびK44から選択される位置に少なくとも1つの突然変異を含み、配列番号54に対して、例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または99.5%のような少なくとも80%の配列同一性を示し、突然変異体が、本明細書において以下にさらに定義される、7β-HSDH
から選択される、前記の実施形態のうち1つのプロセス。
a)前記7α-HSDHが
(1)クロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)から単離され、補因子としてのNADP+の消費下で(すなわち、補因子系NADP+/NADPHの利用によって)、少なくとも、7α-ヒドロキシステロイドの、対応する7-ケトステロイドへの(特に、CDCAの7-KLCAへの)立体特異的な酵素的酸化を触媒する、配列番号34に従うアミノ酸配列を含む7α-HSDHならびに配列番号34に対して、例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または99.5%のような少なくとも80%の配列同一性を有し、NADP+/NADPHを利用する能力および少なくとも、7α-ヒドロキシステロイドの、対応する7-ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒する能力を保持するその突然変異体、
(2)配列番号37を有する大腸菌(Escherichia coli)7α-HSDHの突然変異体である7α-HSDHであって、突然変異体が、補因子としてのNADP+の消費下で(すなわち、補因子系NADP+/NADPHの利用によって)、少なくとも、7α-ヒドロキシステロイドの、対応する7-ケトステロイドへの(特に、CDCAの7-KLCAへの)立体特異的な酵素的酸化を触媒し、前記7α-HSDHが、配列番号37のD42およびI43から選択される位置に少なくとも1つの突然変異を含み、配列番号37に対して、例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または99.5%のような少なくとも80%の配列同一性を示し、突然変異体が、本明細書において以下にさらに定義される、7α-HSDH
から選択され、
b)前記7β-HSDHが、
(1)少なくとも、補因子としてのNADPHの消費下で(すなわち、補因子系NADP+/NADPHの利用によって、7-ケトステロイドの、対応する7β-ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する、配列番号54に従うアミノ酸配列を含み、コリンセラ・アエロファシエンス(Collinsella aerofaciens)から単離される7β-HSDHならびに配列番号54に対して、例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または99.5%のような少なくとも80%の配列同一性を有し、NADP+/NADPHを利用する能力および少なくとも、7-ケトステロイドの、対応する7β-ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する能力を保持する、その突然変異体、
(2)配列番号54を有するコリンセラ・アエロファシエンス(Collinsella aerofaciens)7β-HSDHの突然変異体である7β-HSDHであって、突然変異体が、少なくとも、補因子としてのNADPHの消費下で(すなわち、補因子系NADP+/NADPH)の利用によって)、7-ケトステロイドの、対応する7β-ヒドロキシステロイドヒドロキシステロイドへの(特に、7-KCLAのUDCAへの)立体特異的な酵素的還元を触媒し、前記7β-HSDHが、配列番号54のT17、G39およびR64から選択される位置に少なくとも1の突然変異を含み、配列番号54に対して、例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または99.5%のような少なくとも80%の配列同一性を示し、突然変異体が本明細書において以下にさらに定義される、7β-HSDH、
(3)配列番号56に従うアミノ酸配列を含む7β-HSDHであって、ルミノコッカス・グナバス(Ruminococcus gnavus)から単離され、少なくとも、補因子としてのNADPHの消費下で(すなわち、補因子系NADP+/NADPHの利用によって)、7-ケトステロイドの、対応する7β-ヒドロキシステロイドヒドロキシステロイドへの(特に、7-KCLAのUDCAへの)立体特異的な酵素的還元を触媒する7β-HSDHならびに配列番号56に対して、例えば、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99または99.5%のような少なくとも80%の配列同一性を有し、NADP+/NADPHを利用する能力および少なくとも、7-ケトステロイドの、対応する7β-ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒する能力を保持するその突然変異体
から選択される、実施形態1から3の1つのプロセス。
a)D42X1および/または
b)I43X2
[式中、X1は、アスパラギン酸(D)とは異なるアミノ酸残基、特に、タンパク質原性アミノ酸残基、特に、任意の、比活性増大性および/または基質阻害低減性および/または補因子利用もしくは補因子特異性修飾性、特に、天然アミノ酸を表し、X2は、イソロイシン(I)とは異なるアミノ酸残基、特に、タンパク質原性アミノ酸残基、特に、任意の、比活性増大性および/または基質阻害低減性および/または補因子利用もしくは補因子特異性修飾性、特に、天然アミノ酸を表す]
を含む単一または複数の突然変異から選択される、実施形態6の7α-HSDH。
a)単一突然変異
D42X1および
I43X2ならびに
b)二重突然変異
D42X1/I43 X2
[式中、
X1は、G、AまたはVを表し、
X2は、R、HまたはKを表す]
から選択される、前記の実施形態6および7のいずれか1つに従う7α-HSDH。
このような二重突然変異体の限定されない例として、(D42G/I43R)、(D42G/I43H)、(D42G/I43K)、(D42A/I43R)、(D42A/I43H)、(D42A/I43K)、(D42V/I43R)、(D42V/I43H)、(D42V/I43K)がある。
a)補因子としてNADP+を用いるCDCAの酵素的酸化の間のNADP+に対する増大した比活性(Vmax[U/mg])であって、
非突然変異酵素と比較した場合に、少なくとも1、5または10%、特に、少なくとも1倍、より詳しくは、2~10倍増大される比活性、
b)例えば、NADP(H)に対するより顕著な特異性、NAD(H)に対する低減された、より詳しくは、減少したまたは失われた特異性のような、NADHおよびNADPHに関する修飾された補因子特異性
を示し、
c)特徴a)からb)が個別に、または任意の組合せで存在し得る、実施形態6から8のいずれか1つに従う7α-HSDH。
a)K16X1
b)A37X2
c)R38X3
[式中、X1は、リシン(K)とは異なるアミノ酸残基、特に、タンパク質原性アミノ酸残基、特に、任意の、比活性増大性および/または基質阻害低減性および/または補因子利用もしくは補因子特異性修飾性、特に、天然アミノ酸を表し、
X2は、アラニン(A)とは異なるアミノ酸残基、特に、タンパク質原性アミノ酸残基、特に、任意の、比活性増大性および/または基質阻害低減性および/または補因子利用もしくは補因子特異性修飾性、特に、天然アミノ酸を表し、
X3は、アルギニン(R)とは異なるアミノ酸残基、特に、タンパク質原性アミノ酸残基、特に、任意の、比活性増大性および/または基質阻害低減性および/または補因子利用もしくは補因子特異性修飾性、特に、天然アミノ酸を表す]
を含む単一または複数の突然変異から選択される、実施形態10の7α-HSDH。
a)単一突然変異
K16X1
A37X2
R38X3
および
b)二重突然変異
K16X1/A37X2および
A37X2/R38X3
[式中、X1は、A、GまたはDを表し、
X2は、DまたはEを表し
X3は、Iを表す]
から選択される、前記の実施形態10および11のいずれか1つに従う7α-HSDH。
このような二重突然変異体の限定されない例として、(K16A/A37D)、(K16A/A37E)、(K16G/A37D)、(K16G/A37E) (K16D/A37D)、(K16D/A37E)、(A37D/R38I)および(A37E/R38I)がある。
a)CDCAに対する増大した比活性(Vmax[U/mg])であって、
非突然変異酵素と比較した場合に、少なくとも1、5または10%、特に、少なくとも1倍、より詳しくは、2~10倍増大される比活性、
c)補因子としてNAD+を用いるCDCAの酵素的酸化の間のNAD+に対する増大した比活性(Vmax[U/mg])であって、
非突然変異酵素と比較した場合に、少なくとも1、5または10%、特に、少なくとも1倍、より詳しくは、2~10倍増大される比活性、
d)例えば、NAD(H)に対するより顕著な特異性、NADP(H)に対する低減された、より詳しくは、減少したまたは失われた特異性のような、NAD(H)およびNADP(H)に関する修飾された補因子特異性、
e)例えば、1~200mM、2~150mM、2.5~100mMの範囲のような、例えば、>1mMの範囲のKi値を有するような、少なくとも1種の胆汁酸、特に、CAおよび/またはCDCAおよび/または7-KLCA、特に、CDCAに対する、低減された、または好ましくは、本質的に失われた、より好ましくは、失われた基質阻害
を示し、
f)特徴a)からd)が、個別に、または任意の組合せで存在し得る、
実施形態10から12のいずれか1つに従う7α-HSDH。
-コール酸(CA)
-ケノデオキシコール酸(CDCA)、
-12-ケトケノデオキシコール酸(12-ケト-CDCA)から、好ましくは、酸化可能な前記7α-HSDH突然変異体、その誘導体、特に、酸の塩、アミドまたはアルキルエステルによって選択される、実施形態21のプロセス。
1.使用される一般定義および略語
用語「自己完結型」は、第1の部分還元反応または酸化反応によって消費される補因子が、それぞれ第2の部分酸化反応または還元反応によって本質的に完全に再生される共役酵素的還元反応を示す。
ee%=[XA-XB]/[XA+XB]*100
[式中、XAおよびXBは、それぞれ、エナンチオマーAおよびBのモル分率を表す]。
2.1 一般
本発明は、7β-HSDHまたは7α-HSDH活性を有する具体的に開示されるタンパク質または酵素(配列番号34、37 40、44、47、54および56のような)またはその突然変異体に限定されず、むしろその機能的等価物にも拡張する。
2.2.1 野生型コリンセラ・アエロファシエンス(Collinsella aerofaciens)7β-HSDHおよび機能的等価物
本発明は、本明細書によって明確に参照される、本出願人の国際特許出願WO2011/064404に記載されるように、コリンセラ・アエロファシエンス(Collinsella aerofaciens)ATCC25986由来の7β-HSDH野生型の使用をさらに含む。
a)分子量(SDS-ゲル電気泳動):約28~32kDa、特に、約29~31kDaまたは約30kDa、
b)分子量(非変性条件における、特にSDSを有さないなどのゲル濾過):約53~60kDa、特に、約55~57kDa、例えば、56.1kDa。これは、コリンセラ・アエロファシエンス(Collinsella aerofaciens)DSM3979由来の7β-HSDHの二量体性を証明する、
c)7-ケト-LCAの7-カルボニル基の、7β-ヒドロキシル基への立体選択的還元、
d)pH8.5~10.5、特に、9~10の範囲のUDCAの酸化のための最適pH、
e)pH3.5~6.5、特に、pH4~6の範囲のDHCAおよび7-ケト-LCAの還元のための最適pH、
f)以下の表の各々の場合に具体的に示される値付近の±20%、特に、±10%、±5%、±3%、±2%または±1%の範囲の、そこに記載されている基質/補因子のうち少なくとも1つの、以下の表から得られる少なくとも1つの動態パラメータ。
a)7-ケトステロイドの、対応する7β-ヒドロキシステロイドへの立体特異的還元および/または
b)7位にケト基およびステロイド骨格に少なくとも1つのさらなるケト基を含むケトステロイドの、対応する7β-ヒドロキシステロイドへの、例えば、特に、7位のデヒドロコール酸(DHCA)によって触媒される、例えば、NADPH依存性である、対応する3,12-ジケト-7β-コラン酸への位置特異的水酸化。
本発明は、本明細書によって明確に参照されるWO2012/080504、WO2015/197698およびWO2016/016213に記載されるような、コリンセラ・アエロファシエンス(Collinsella aerofaciens)ATCC25986から得られる7β-HSDH野生型の突然変異体の使用をさらに含む。
本発明は、本明細書によって明確に参照されるCN105274070の下で公開される中国特許出願に記載されるようなルミノコッカス・グナバス(Ruminococcus gnavus)由来の7β-HSDH野生型およびその突然変異体、特に、NADP+依存性突然変異体の使用をさらに含む。
3.1 核酸
本発明はまた、7β-HSDHまたは7α-HSDH活性を有する酵素およびその突然変異体をコードする核酸配列に関する。
マルチプルアラインメントパラメータ:
Gapオープニングペナルティー 10
Gap伸長ペナルティー 10
Gap分離ペナルティー範囲 8
Gap分離ペナルティー オフ
アラインメント遅れの同一性% 40
残基特異的gap オフ
親水性残基gap オフ
トランジション加重 0
ペアワイズアラインメントパラメータ:
FASTアルゴリズム オン
K-タプルサイズ 1
Gapペナルティー 3
ウィンドウサイズ 5
最良対角数 5
DNA gapオープンペナルティー 15.0
DNA gap伸長ペナルティー 6.66
DNAマトリックス 同一性
タンパク質gapオープンペナルティー 10.0
タンパク質gap伸長ペナルティー 0.2
タンパク質マトリックス Gonnet
タンパク質/DNA ENDGAP -1
タンパク質/DNA GAPDIST 4
-遺伝子の個々のまたはいくつかのヌクレオチドの標的化された交換をもたらす、部位特異的突然変異誘発(Trower MK(出版者) 1996年; In vitro mutagenesis protocols. Humana Press、New Jersey)、
-任意のアミノ酸のコドンが、遺伝子の任意の部位で交換または付加され得る、飽和突然変異誘発(Kegler-Ebo DM、Docktor CM、DiMaio D (1994年)Nucleic Acids Res 第22巻:1593頁;Barettino D、Feigenbutz M、Valcarel R、Stunnenberg HG (1994) Nucleic Acids Res第22巻:541頁;Barik S (1995年) Mol Biotechnol第3巻:1頁)、
-ヌクレオチド配列が不正確に機能するDNAポリメラーゼによって突然変異される、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応(エラープローンPCR)(Eckert KA、Kunkel TA (1990年)Nucleic Acids Res第18巻:3739頁)、
-例えば、欠損DNA修復機序のために、ヌクレオチド配列の突然変異率の増大がある、変異誘発株における遺伝子の継代(Greener A、Callahan M、Jerpseth B(1996年)An efficient random mutgenesis technique using an E.coli mutator strain. In: Trower MK(出版者) In vitro mutagenesis protocols. Humana Press、New Jersey)、または
-密接に関連する遺伝子のプールが形成され、消化され、断片が、鎖を分離し、再度一緒にすることを反復することによって、最後に全長のモザイク遺伝子が製造されるポリメラーゼ連鎖反応の鋳型として使用される、DNAシャッフリング(Stemmer WPC (1994年) Nature 第370巻:389頁;Stemmer WPC (1994年)Proc Natl Acad Sci USA第91巻:10747頁)
など。
本発明は、調節核酸配列の遺伝制御下に、本発明の少なくとも1つのポリペプチドをコードする核酸配列を含有する発現構築物およびこれらの発現構築物のうち少なくとも1つを含むベクターにさらに関する。
文脈により、用語「微生物」とは、出発(野生型)微生物または遺伝子修飾された組換え微生物または両方を意味する。
本発明は、さらに、ポリペプチド産生微生物が培養され、任意選択で、ポリペプチドの発現が誘導され、後者が培養物から単離される、本発明のポリペプチドまたはその機能的な生物学的に活性な断片の組換え製造のためのプロセスに関する。ポリペプチドはまた、これが望まれる場合には、この方法で工業的規模で製造され得る。
本明細書において記載される方法において、本発明の酵素は、遊離でまたは固定化されて使用できる。固定化された酵素は、不活性支持体に固定化されている酵素と理解されるべきである。適した支持体材料およびそれに固定化された酵素は、EP-A-1149849、EP-A-1069183およびDE-OS 100193773から、および本明細書において引用される参考文献から公知である。これに関して、これらの文書の開示内容が全参照される。適した支持体材料として、例えば、粘土、カオリナイトなどの粘土鉱物、珪藻土、パーライト、二酸化ケイ素、酸化アルミニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カルシウム、セルロース粉、陰イオン交換体材料、ポリスチレンなどの合成ポリマー、アクリル樹脂、フェノール-ホルムアルデヒド樹脂、ポリエチレンおよびポリプロピレンなどのポリウレタンおよびポリオレフィンが挙げられる。支持された酵素を調製するために、支持体材料は、微細に分割された、微粒子形態で普通使用され、多孔性形態が好ましい。支持体材料の粒径は、普通、5mm以下、特に、2mm以下である(粒径分布曲線)。同様に、デヒドロゲナーゼを、全細胞触媒として使用する場合には、遊離または固定化された形態が選択され得る。支持体材料は、例えば、アルギン酸Caおよびカラゲニンである。酵素ならびに細胞はまた、グルタルアルデヒド(CLEAと架橋する)と直接架橋され得る。固定化の対応するさらなる方法は、例えば、J.LalondeおよびA.Margolin「Immobilization of Enzymes」に、およびK.DrauzおよびH.Waldmann、Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002年、第III巻、991~1032頁、Wiley-VCH、Weinheimに記載されている。
特に断りのない限り、本発明に関連して実施されるクローニングステップ、例えば、制限切断、アガロースゲル電気泳動、DNA断片の精製、ニトロセルロースおよびナイロンメンブランへの核酸の移動、DNA断片の連結、微生物の形質転換、微生物の培養、ファージの増殖および組換えDNAの配列解析は、特に断りのない限り、例えば、Sambrookら(1989年)前掲に記載されるような周知の技術を適用することによって実施される。
この実施例では、C.ディフィシル(difficile)(DSM 12056)由来の新規7α-HSDHを成功裏にクローニングし、発現させ精製し、生化学的に特性決定した。すべての既知7α-HSDHとは対照的に、この酵素は、胆汁酸に対して基質阻害を示さない。このCd7α-HSDHは、推定ステロイドオキシドレダクターゼと注解され、大腸菌(E.coli)由来の7α-HSDH(NAD+依存性)のタンパク質配列に対して30%(N.Tanaka、T.Nonaka、T.Tanabe、T.Yoshimoto、D.Tsuru、Y.Mitsui、Crystal structures of the binary and ternary complexes of 7α-Hydroxysteroid Dehydrogenase from Escherichia coli., J. Am. Chem. Soc.第35巻(1996年)7715~30頁. doi:10.1021/bi951904d)およびC.ソルデリ(sordellii)由来の7α-HSDH(NADP+依存性)に対して55%(J.Coleman、L.Hudson、M.Adams、Characterization and regulation of the NADP-linked 7alpha-Hydroxysteroid Dehydrogenase gene from Clostridium sordellii., J. Bacteriol.第176巻(1994年)4865~74頁)の相同性を示した。7-KLCAの生物変換のHPLC解析によって、クローニングされた酵素が、胆汁酸の7α-ヒドロキシ基への可逆的な、立体特異的な還元を触媒することが確認された。
1.1 化学物質
特に断りのない場合、すべての化学物質は、Sigma AldrichまたはCarl Rothから購入した。胆汁酸は、PharmaZell GmbH(Raubling、Germany)から入手した。MCLAB(Nimagen、Netherlands)製のタンパク質精製用Ni-NTA、GE Healthcare製のSephadex G25を使用した。遠心分離は、遠心機RC5BPlus、Mikro22およびRotina 35R(Thermo Scientific、Dreieich、Germany)を使用して実施した。解析方法のために、Merck(Darmstadt、Germany)からHPLCカラムを購入した。制限酵素は、Thermo Scientific(Dreieich、Germany)から購入した。
7α-hsdh遺伝子(Genbank:YP_001086529.1)は、Deutsche Sammlung von Mikroorgansimen und Zellkulturen (DSMZ、Braunschweig、Germany)によって提供されたクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)(DSM12056)由来のゲノムDNAから、標準PCR技術によって入手した。以下のクローニングステップのために、制限酵素NdeIおよびNotIの認識部位を有するプライマーを増幅のために使用した(
)。NdeIおよびNotIの制限エンドヌクレアーゼ部位は、太字で書かれており、メチオニン/停止コドンには下線が引かれていた。作製されたNdeI-NotI断片を、T7-プロモーターの制御下にある市販のベクターpET28a(+)(Novagen、Madison、WI、USA)中にライゲーションした。それによって、構築されたベクターは、N末端に6xHisタグを有しており、pET28a_Cd7α-HSDHと名付けた。
)。NcoIおよびXhoIの制限エンドヌクレアーゼ部位は、太字であり、メチオニンコドンは、下線が引かれていた。作製されたNcoI-XhoI断片を、T7-プロモーターの制御下にある、市販のベクターpET28a(+)(Novagen、Madison、WI、USA)中にライゲーションした。構築されたベクターは、pET28a_LsNOXと名付けられている。正しいインフレームのDNA配列および何らかの突然変異がないことは、シーケンシングによって確認した。ラクトバチルス・サンフランシスエンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)由来の前記NAD(P)Hオキシダーゼの対応するヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号49および50に示されている。
単一突然変異を配列番号34の残基Lys16およびAla37で、二重突然変異を残基Ala37/Arg38で、Quikchange(登録商標)PCRプロトコールによって実施した。突然変異の導入のために使用されたフォワードおよびその相補的リバースプライマーは、表2中に示されている。PCRの得られたプラスミドを、大腸菌(E.coli)DH5α中に形質転換し、プラスミド調製とそれに続くLGC Genomics(Berlin、Germany)によるシーケンシングのために、LB寒天プレートからコロニーを選び出した。
大腸菌株DH5α(Novagen、Madison、WI、USA)を、50μg/mlカナマイシンを含有するLuria Bertani(LB)培地中、37℃で増殖させた。組換えプラスミドを保持する大腸菌(E. coli)BL21(DE3)Δ7α-HSDH細胞の出発培養物を、5mLの、50μg/mlカナマイシンを含有するLB培地中、37℃で一晩培養した。これらの培養物を使用して、600nm(OD600)で0.05光学濃度の最終濃度で、振盪フラスコ中での発現のために、50μg/mlカナマイシンを含有する、LBまたはTB培地(TB:100mMリン酸カリウムバッファー(KPi)pH7.0中、24g L-1酵母抽出物、12gL-1カゼイン加水分解物、5gL-1 グリセロール)中の主培養物に播種した。OD600が0.6から0.8の間の値に達した時点で、0.5mMの最終濃度へのイソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド(IPTG)の添加によって、組換え7α-HSDHの製造を誘導した。培養物を25℃で20時間振盪した、またはおよび遠心分離によって収穫した。
細菌培養物を、10,000xg、4℃で30分間の遠心分離によって収穫した。細胞懸濁液(20%)を、それぞれ、50mM KPiバッファーpH8.0または溶解バッファー(300mM NaCl、10mMイミダゾール、50mM NaH2PO4、pH8.0)中で調製した。間に冷却期間を設けて3回の1分の超音波処理サイクル(25%出力)によって、細胞を破壊した。溶解細胞を、4℃、18,000xgで30分間遠心分離し、それぞれ、HSDHまたはNOX活性の決定のために上清を使用した。標準としてBSAを使用するBradford(Bradford 1976)に従ってタンパク質濃度を決定した。
精製されたCd7α-HSDHは、Ni-NTA固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(IMAC)によって入手した。カラムは、25mLの溶解バッファー(10mMイミダゾール、300mM NaCl、50mM NaH2PO4、pH8)を用いて平衡化した。Cd7α-HSDH his-タグ(配列番号35)融合タンパク質を含有する細胞溶解物をカラムに適用し、40mLの洗浄バッファー(20mMイミダゾール、300mM NaCl、50mM NaH2PO4、pH8.0)を用いて洗浄した。10mLの溶出バッファー(250mM イミダゾール、300mM NaCl、50mM NaH2PO4、pH 8.0)を用いて結合されたタンパク質を溶出した。PD10カラム(Sephadex G25、GE healthcare、Germany)を用いるゲル濾過による脱塩ステップ後、酵素を50mM KPi pH8.0中に保存し、使用まで+4℃で維持した。
タンパク質過剰発現を、標準としてBSAを使用するBradfordに従ってSDS-PAGEによってモニタリングした。30kDaの予測される質量のために、15%アクリルアミドを含有するtris-グリシンゲルを使用した。サンプルを、ローディングバッファー中、95℃で10分間インキュベートし、10μgをゲルにロードした。Coomassie(登録商標)Brilliant Blue R-250を用いてゲルを染色し、変性条件下で、標準マーカー(Thermo Scientific、Dreieich、Germany)との比較によって分子量を決定した。
Cd7α-HSDHについての酵素アッセイ混合物は、キュベット中に、1mLの総容量中に、50mM KPi(pH8.0)、0.5mM NADP+、それぞれ、0.2mM NADPH、10mM胆汁酸およびタンパク質を含有していた。NOXについての酵素アッセイ混合物は、キュベット中に、1mLの総容量中に、50mM KPi(pH7.0)、0.2mM NADPHおよびタンパク質を含有していた。1ユニットの活性は、分光光度計(UV-1700 PharmaSpec、Shimadzu)を使用する標準条件(340nm、30℃、pH8.0)下でそれぞれ1μmolのNADP+の還元または1μmolのNADPHの酸化を触媒する酵素の量として定義された。還元アッセイ混合物は、874μLのバッファー(50mM KPiバッファーpH8.0)、100μLの7-KLCA(50mM KPiバッファーpH8.0中、100mM)、16μLのNADPH(蒸留水中、12.5mM)および10μLのCd7α-HSDHの酵素溶液を含有していた。NOXについてのアッセイは、974μLのバッファー(50mM KPiバッファーpH7.0)、16μLのNADPH(蒸留水中、25mM)および10μLの酵素溶液を含有する。酸化アッセイ混合物は、870μLのバッファー(50mM KPiバッファーpH8.0)、100μLのそれぞれCDCAまたはCA(50mM KPiバッファーpH8.0中、100mM)、20μLのNADP+(蒸留水中、25mM)および10μL酵素溶液を含有していた。酵素溶液の添加によって反応を開始し、30秒にわたって測定した。動態定数(KMおよびVmax)を決定するために、非線形フィッティングアルゴリズム(Graph padソフトウェア)を使用してミカエリス-メンテン方程式に従って、複数の測定値(少なくとも3連として)からパラメータを算出した。
HPLC解析を、1ml/分の流速でHPLC LC-2010AHTシステム(Shimadzu、Japan)でPurospher(登録商標)STAR RP-18カラム(Merck、Gemany)で実施した。移動相は、2つの溶出剤からなっていた。溶出剤Aは、蒸留水(オルトリン酸85%を用いて調整されたpH2.6)であり、溶出剤Bは、HPLC等級アセトニトリルであった。勾配プログラムの出発条件は、65%の溶出剤Aおよび35%の溶出剤Bであった。システムは、200nmでUV検出器によってモニタリングした。完全に、1mg/mlの範囲の胆汁酸濃度を有する20μlのサンプルを解析した。同一濃度のCDCA、7-KLCAおよびUDCAの標品を参照として使用した。
KPi-バッファー(100mM、pH7.0)における小規模10mM CDCAにおける生体内変換のために、0.1mM NADP+、0.5U mL-1のCd7α-HSDHおよび5U mL-1のNADPH-オキシダーゼを25℃でインキュベートした。生体内変換は、500rpmの撹拌速度で18時間、中に撹拌バーを備えるガラスバイアル中で行った。サンプルを周期的に取り出し、HPLC-解析のためにメタノール-水(pH2.6)(9:1 v/v)で希釈した。
Cd7α-HSDHの構造は、鋳型(PDBコード:4JRO)[22-25]としてfabGを使用して「Swissモデル」を用いてモデル化した。モデリングのために最高の類似性(38%)のために、出発点としてFabG[3-オキソアシル-(炭疽菌(Bacillus anthracis)由来のアシル-担体タンパク質)レダクターゼ]を選択した。3DLigandSiteを使用して、補因子NAD(P)Hをタンパク質の構造中に組み込んだ[26]。Yasara(Yasara molecular graphics and modelling program、バージョン12.11.25)を用いて構造アラインメントおよび構造比較を実施した。
C-7のヒドロキシル基のみが、α-からβ-位に変換されなければならないので、CDCAは、UDCAを合成するための魅力的な出発材料に相当する。このエピマー化は、7α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(HSDH)によって触媒されるC-7でのCDCAのNAD(P)H生成性酸化を、7β-HSDHによる7-ケト基のNAD(P)H消費性還元とカップリングすることによる酸化還元中立カスケード反応において到達され得る。
大腸菌(E.coli)、C.パーフリンジェンス(perfringens)、C.ソルデリ(sordellii)およびB.フラジリス(fragillis)由来の4種の7α-HSDHならびに本発明のC.ディフィシル(difficile)由来のHSDHのアミノ酸配列アラインメントを、「Clustal Omega」アラインメントツールを使用して実施した(図1)。
Cd7α-HSDHおよびその突然変異体の組換え過剰発現のために、大腸菌(E.coli)BL21(DE3) hsd- kan+ノックアウト突然変異体(大腸菌(E. coli)BL21(DE3)Δ7α-HSDH)を宿主として使用し、高レベルの組換えCd7α-HSDHをもたらした。30,154.3Daの算出分子量を有する精製Cd7α-HSDH(配列番号35)(N末端6xhis-タグを含む)を、SDS-PAGE解析によって判断されるような30kDaの単一バンドとして同定した(図2)。この方法によって、すでに、粗抽出物中(レーン1)に、この酵素の高過剰発現を実証できた。
Cd7α-HSDHの活性を、基質としてCDCAを使用して研究した。細胞不含粗抽出物では、活性は、CDCAおよびNADP+を用いて測定された精製サンプルの3.6U mg-1および5.5U mg-1であるとわかった。NAD+を用いた場合には、0.11U mg-1程度のわずかなバックグラウンド活性が検出されることもあった。TB培地における発現は、4.5U mg-1(粗抽出物)および7.7U mg-1(精製)(補因子としてNADP+)のわずかに増大した活性をもたらした。
基質としてCDCAを使用して、15から65℃の間で酵素活性に対する温度の影響を調べた(図3)。すべての測定は、精製タンパク質を用いて(N-His-タグを用いて)実施した。Cd7α-HSDHは、45℃まで活性のわずかな増大を示し、11U mg-1であった。45℃から60℃で、活性は急速に増大し、60℃で最大であり(77U mg-1)、続いて、タンパク質変性のために急速に低下した。温度安定性に関して、60℃で5分間のインキュベーションでわずか5%の残存活性しか検出されなかった。
Cd7α-HSDHに対する生成物7-KLCAの阻害効果は、CDCAをUDCAに変換するプロセスにおける重大なパラメータである。したがって、本発明者らは、種々の濃度の7-KLCAの存在下で、デヒドロゲナーゼの残存活性を測定した。測光アッセイは、標準活性アッセイと同様であり、CDCAのみを10mMの代わりに1mMで使用した。図4は、生成物7-KLCAが、Cd7α-HSDH(N-His-タグを有する)の強力な阻害剤であることを示す。すでに、1mMの生成物の存在下で、活性は28%に低減され、2.5mMで、わずか約10%の残存活性しか測定できなかった。
この酵素の適用性を確認するために、スキーム2に従うNADP+の再生のために、39mg(10mM)のCDCAの10mL規模の生体内変換を、Cd7α-HSDH(N-His-タグを有する)(配列番号35)を、ラクトバチルス・サンフランシスエンシス(Lactobacillus sanfranciscensis)由来のNAD(P)Hオキシダーゼ(配列番号51)(C-His-タグを有する)と組み合わせて使用して実施した。
野生型Cd7α-HSDH(N-His-タグを有するまたは有さない;配列番号34または35)は、NADP+に対して補酵素優先を示し、NAD+を用いる場合には小さな副活性(<0.1%)を有する。しかし、NAD+のより低い費用およびより高い安定性のために、工業的使用におけるこの補酵素の適用は、有利であり得る。NAD+活性を増大するために、NADP+依存性Cd7α-HSDHの補因子結合領域の、種々の生物に由来するNAD依存性HSDHとのアミノ酸配列アラインメントを実施した(図6)。このアラインメントは、典型的なグリシンモチーフ(G/A)XXXGXG(式中、Xは、任意のアミノ酸である)を示す補因子結合部位がより高く保存されていることを示した。Ala37およびArg38を、位置Ala37に酸性残基を、Arg38の代わりに小さい疎水性残基を導入することを目的とする突然変異のために標的とした。図7は、Ala37の推定可能な機能は、2’-リン酸基のための空間を提供することであることを実証する。電荷斥力または立体障害によるいずれかの好ましくない相互作用によるNADP+-結合の識別のために、アスパラギン酸またはグルタミン酸を導入することによって効果があり得る(図7、B)。
構造に基づく部位特異的突然変異誘発によって補酵素特異性をNADP+からNAD+に切り替えるための本発明者らの試みは、いくつかの突然変異体、特に、2種の酵素単一突然変異体(A37EおよびA37D)をもたらし、野生型と比較して、NAD+を用いた場合に活性の有意な増大があった。特に、A37Dは、0.9U/mgの比活性を示した。さらに、これは、この突然変異体について補酵素NADP+を用いた場合に活性の強力な低下をもたらした(野生型の3.2U/mgとの比較において0.4U/mg残存活性。要するに、得られた突然変異体、特に、A37D酵素変異体は、ここで、7α-HSDH活性をNADHオキシダーゼと組み合わせて7-KLCAを得る可能性またはNADH依存性7β-HSDHと組み合わせてUDCAを生成する可能性を提供する。
1. 材料および方法
1.1 化学物質
例えば、抗生物質のようなすべての化学物質は、Sigma-AldrichまたはCarl Roth(Germany)から入手した。すべての制限エンドヌクレアーゼおよびT4DNAリガーゼは、ThermoScientific(Germany)から入手し、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド(IPTG)は、Gerbu(The Netherlands)から入手した。
LB培地:1リットルの培地あたり、トリプトン10g、酵母抽出物5g、NaCl 10g
KPiバッファー:1リットルのバッファーあたり、8.3g K2HPO4および0.3g KH2PO4を含有する(50mM、pH8)
崩壊バッファー:10mMイミダゾール、50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8
洗浄バッファー:20mMイミダゾール、50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8
溶出バッファー:250mMイミダゾール、50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8
組換え7α-HSDHを発現させるために、発現ベクターpET28a(+)(Novagen、Madison、WI、USA)が適用され、以下のベクター構築物が作製されている:
・pET28a(+)_7α-HSDH(-):対応する大腸菌(E.coli)7α-HSDH遺伝子が、標準手順によって切断部位NcoIおよびXhoI中にクローニングされたpET28a(+)-ベクター。構築物は、6xHis-タグを含有しない。
・pET28a(+)_7α-HSDH(N):対応する大腸菌(E.coli)7α-HSDH遺伝子が、標準手順によって切断部位NdeIおよびXhoI中にクローニングされたpET28a(+)-ベクター。この構築物は、N末端6xHis-タグを含有する。
・pET28a(+)_7α-HSDH(C):対応する大腸菌(E.coli)7α-HSDH遺伝子が、標準手順によって切断部位NcoIおよびXhoI中にクローニングされたpET28a(+)-ベクター。前記構築物は、C末端6xHis-タグを含有する。
LB培地中、37℃で振盪フラスコ中で培養を実施した。OD600=0.6~0.8で、0.5mM IPTGの添加によって遺伝子発現を誘導した。その後、細胞を25℃で20時間増殖させ、次いで、回収した。
培養細胞を超音波処理(25%(w/v)細胞懸濁液)によって破壊し、このように得られた粗抽出物を活性アッセイに適用した。
反応混合物は、1mlの総容量中に以下を含有していた:
880μl 50mMリン酸カリウム(KPi)バッファー、pH8.0
100μl 100mM CDCA(50mM KPi、pH8中に溶解された)
10μl 酵素溶液(上記のようなバッファー中、2~6U/mlの範囲の)
10μl 50mM NAD+またはNADP+(ddH2Oに溶解された)
サンプル(100μl)を900μlのBradford試薬と混合し、暗所で少なくとも15分間インキュベートした。タンパク質含量を、適用されるアッセイの濃度範囲において標準物質としてBSAを用いて595nmで決定した。
特に断りのない限り、例えば、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T. Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989年;Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley &Sons、NY (1993年); Kriegler、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、NY (1990年)に開示されるような確立された方法が適用されている。
QuikChange(登録商標)-PCR(QC-PCR)によって、個々のアミノ酸残基の定方向交換を実施した。適用されたプライマーは、続く表6にまとめられている。前記プライマーは、位置42および/または43において意図されたアミノ酸交換を引きおこす。
大腸菌(E.coli)BL21(DE3)Δ7α-HSDHを、対応する発現構築物を用いて形質転換した。この目的のために、発現構築物を含有する大腸菌(E.coli)BL21(DE3)Δ7α-HSDH株を、50μg/mlカナマイシンを含有するLB培地で増殖させた。遠心分離(10.000xg、30分、4℃)によって細胞を回収した。ペレットを崩壊バッファー(25%(w/v)細胞懸濁液)に懸濁した。細胞を冷却下で2分間超音波処理した(30W、10~25%作業間隔および1分の中断)。超音波処理装置Sonopuls HD2070(Bandelin、Germany)を適用した。崩壊を3回反復した。細胞抽出物を遠心分離した(20.000×g、30分、4oC)。上清を、25mlの崩壊バッファーで平衡化しておいたカラム(Thermo Scientific、USA)に適用した。40~50mlの洗浄バッファーを用いて洗浄することによって弱く結合するタンパク質を溶出した。10mlの溶出バッファーによってHis-タグ-7α-HSDHタンパク質を溶出した。プロセスを、室温で実施した。Centricon限外濾過モジュールによって溶出液を濃縮し、PD10カラムによってバッファー交換を実施して、イミダゾールを除去した。
2.1 測光活性アッセイ
UV-1700分光光度計(Shimadzu、Japan)によって粗抽出物の測光活性アッセイを実施した(項目1.7の下で上記で記載された方法を参照のこと)。表8では、NAD+およびNADP+について得られたような個々の突然変異体の比活性値がまとめられている。
SDS-PAGEを実施して、相同発現の発現力ならびに精製の質を評価した。図10は、突然変異体7α-HSDH[D42G/I43R]のSDSゲルを示す。野生型ならびにNADP+突然変異体(N末端6xHis-タグを有する)(配列番号41)の分子量は、約28.9kDaである。図10は、7α-HSDHが、理論的分子量を示さないことを示す。むしろ、バンドは、約25kDaの分子量を示す。
各突然変異体について、ならびに野生型酵素について、動態定数VmaxおよびKMを決定した。測定は、基質CDCAおよび補酵素NAD(P)+について実施した。結果はまた、表9にまとめられている。測定は、精製タンパク質を用いて(項目7に従って)、0.5mMのNAD(P)+の補因子の一定濃度で、CDCAについて10μMから30mMの範囲の種々の基質濃度で実施した。補因子についての対応する定数は、1mMのCDCA濃度および10μMから5mMの範囲の補因子濃度で実施した。
1. 材料および方法
1.1 化学物質
例えば、抗生物質のようなすべての化学物質は、Sigma-Aldrich、Carl RothまたはBiomol(Germany)から入手した。すべての制限エンドヌクレアーゼおよびT4DNAリガーゼは、ThermoScientific(Germany)から入手し、イソプロピルチオ-β-D-ガラクトシド(IPTG)は、Gerbu(The Netherlands)から入手した。
LB培地:1リットルの培地あたり、トリプトン10g、酵母抽出物5g、NaCl 10g
KPiバッファー(50mM、pH8):1リットルのバッファーあたり、8.3g K2HPO4および0.3g KH2PO4
崩壊バッファー:10mMイミダゾール、50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8
洗浄バッファー:20mMイミダゾール、50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8
溶出バッファー:250mMイミダゾール、50mMリン酸ナトリウム、300mM NaCl、pH8
組換え7αおよび7β-HSDH酵素を発現させるために、それ自体公知の発現ベクターpET28a(+)ならびにpACYCDuet(Novagen、Madison、WI、USA)が使用され、以下のベクター構築物が調製されている:
・pET28a(+)_7α-HSDH(N)[D42G/I43R]:大腸菌(E.coli)由来の7α-HSDHの遺伝子が、制限部位NdeIおよびXhoIによって周知の方法でクローニングされたpET28a(+)ベクター。QuikChange(登録商標)-PCRによって、突然変異D42GおよびI43Rが導入されている。この構築物は、N末端6xHis-タグを含有する(配列番号41)。
・pET28a(+)_Cd7α-HSDH(N):C.ディフィシル(difficile)由来の7α-HSDHの遺伝子が、制限部位NdeIおよびXhoIによって周知の方法でクローニングされたpET28a(+)ベクター。この構築物は、N末端6xHis-タグを含有する(配列番号35)。
・pA_7β-HSDH:C.アエロファシエンス(aerofaciens)由来の7β-HSDHの遺伝子が、制限部位NcoIおよびXhoIによって周知の方法でクローニングされたpACYCDuetベクター。前記構築物は、6xHis-タグを含有しない(配列番号52)。
・pA_7β-HSDH[G39S/R64E]:C.アエロファシエンス(aerofaciens)由来の7β-HSDH遺伝子が、制限部位NcoIおよびXhoIによって周知の方法でクローニングされたpACYCDuetベクター。QuikChange(登録商標)-PCRによって、突然変異G39SおよびR64Eが導入された。この構築物は、6xHis-タグを含有しない(配列番号45)。
・pET28a(+)_7β-HSDH(C)[G39E]:大腸菌(E.coli)由来の7α-HSDHの遺伝子が、制限部位NcoIおよびXhoIによって周知の方法でクローニングされたpET28a(+)ベクター。QuikChange(登録商標)-PCRによって、突然変異G39Eが導入された。この構築物は、C末端6xHis-タグを含有する(配列番号48)。
LB培地中、37℃で振盪フラスコ中で培養を実施した。0.6~0.8のOD600で、0.5mM IPTGの添加によって遺伝子発現を誘導した。その後、細胞を25℃で20時間増殖させ、次いで、回収した。
培養細胞を超音波処理し(25%(w/v)細胞懸濁液)、得られた粗抽出物を遠心分離(20.000g、30分、4℃)して細胞断片を除去した。
反応混合物は、1mlの総容量中に以下を含有していた:
880μl 50mMリン酸カリウム(KPi)バッファー 、pH8.0
100μl 100mM CDCAまたは7-KLCA(50mM KPi、pH8中に溶解された)
10μl 酵素溶液(バッファー中に希釈された、1~5U/mlの範囲の)
10μl 50mM NAD+またはNADP+(ddH2Oに溶解された)
サンプル(100μl)を900μlのBradford試薬と混合し、暗所で少なくとも15分間インキュベートした。タンパク質含量を、適用されるアッセイの濃度範囲において標準物質としてBSAを用いて595nmで決定した。
特に断りのない限り、例えば、Sambrook,J.、Fritsch,E.F.およびManiatis,T. Molecular Cloning:A Laboratory Manual.第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、NY、1989年;Ausubelら(編)、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley &Sons、NY (1993年); Kriegler、Gene Transfer and Expression、A Laboratory Manual、Stockton Press、NY (1990年)に開示されるような確立された方法が適用されている。
QuikChange(登録商標)-PCR(QC-PCR)によって、個々のアミノ酸残基の定方向交換を実施した。適用されたプライマーは、続く表12にまとめられている。前記プライマーは、位置42および/または43において意図されたアミノ酸交換を引き起こす。
大腸菌(E.coli)BL21(DE3)Δ7α-HSDHを、発現構築物を用いて形質転換した。この目的のために、発現構築物を含有する大腸菌(E.coli)BL21(DE3)Δ7α-HSDH株を、対応する抗生物質(pET28aには50μg/mlカナマイシン、pACYCDuetには36μ/mlクロラムフェニコールまたは全細胞生体触媒には40μg/mlカナマイシン+29μg/mlクロラムフェニコール)の存在下、LB培地で培養した(上記の大腸菌(E.coli)DB06およびDB07を参照のこと。
胆汁酸および得られた生体内変換生成物を、アセトニトリル/水の勾配(リン酸を用いてpH2.6に調整した)を使用する順相RP-HPLC(HPLC-System LC-2010AHT、Shimadzu)によって解析した。
0~15分 一定40%アセトニトリル、
15~17分 90%アセトニトリルへの線形増大、
17~27分 一定90%アセトニトリル、
27~29分 40%アセトニトリルへの線形増大、
29~35分 一定40%アセトニトリル。
2.1 CDCAの1ステップ生体内変換の反応原理
図11に表わされるような2つの共役(couples)系を確立した。補因子再生下で、CDCAを7α-HSDHを用いて7-KLCAに酸化し、次いで、7-KCLAを7β-HSDHを用いてUDCAに還元する。図11Aは、補酵素としてNAD(H)に基づく反応変異体を示し、図11Bは、NADP(H)に基づく変異体を示す。共役プロセスは、単離酵素を用いて、または必要なHSDH酵素を発現する全細胞を用いて実施した。
25℃で100mM KPiバッファー(pH7.0)において標準化された、単離酵素を用いるUDCAの酵素的合成を実施した。反応混合物を500~700rpmで磁気的に撹拌した。補因子濃度は、0.25mM NAD+とした。補因子としてNAD+を用いる生体内変換のために、1U/mlの酵素を用いて反応を実施し、補因子としてNADP+を用いる生体内変換のために、0.5U/mlの7α-HSDHおよび1.0U/mlの7β-HSDHを用いて反応を実施した。事前に決定した時間間隔後に、サンプルを採取し、HPLCによって解析した。
25℃で100mM KPiバッファー(pH6.0)において標準化された、5mg/mlの細胞(CWW=細胞湿潤重量)によるUDCAの合成を実施した。反応混合物を700rpmで磁気的に撹拌した。反応混合物は、補因子として0.5mM NADP+を含有していた。事前に決定した時間間隔後に、サンプルを採取し、HPLCによって解析した。
・C.ディフィシル(difficile)由来のNADP+依存性野生型7α-HSDH(配列番号35)およびC.アエロファシエンス(aerofaciens)由来のNADP+依存性7β-HSDH二重突然変異体[G39S/R64E](配列番号44)を発現する、
大腸菌(E.coli)DB06(pET28a_CD7α(N) + pA_7β-HSDH[G39S/R64E])
・大腸菌(E.coli)由来のNADP+依存性7α-HSDH二重突然変異体[D42G/I43R](配列番号41)およびC.アエロファシエンス(aerofaciens)由来のNADP+依存性7β-HSDH二重突然変異体[G39S/R64E](配列番号44)を発現する、
大腸菌(E.coli)DB07(pET28a_7α-HSDH(N)[D42G/I43R] + pA_7β-HSDH[G39S/R64E])。
Claims (15)
- 一般式(1)
[式中、
Rは、アルキル、H、アルカリ金属イオンまたはN(R3)4 +(式中、残基R3は、同一または異なっており、Hまたはアルキルを表す)を表し、または基-CO2Rは、酸アミド基-CONR1R2(式中、R1およびR2は互いに独立に、アルキル残基を表す)によって置換される]
で示されるウルソデオキシコール酸(UDCA)化合物を調製するための共役生体触媒方法であって、当該方法は、
i)7α-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7α-HSDH)および7β-ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(7β-HSDH)ならびに補因子NAD + の存在下で、一般式(2)
[式中、
Rは、上記で定義されるものと同一の意味を有するか、または基-CO2Rは、上記で定義される酸アミド基-CONR1R2によって置換される]
で示されるケノデオキシコール酸(CDCA)化合物を反応させるステップであって、前記7α-HSDHおよび前記7β-HSDHは、補因子系NAD+/NADHを利用する能力を有し、
i1)前記7α-HSDHは、一般式(2)の前記CDCA化合物の、一般式(3)
[式中、Rは、上記で特定されるとおりであるか、または基-CO2Rは、上記で定義される酸アミド基-CONR1R2によって置換される]
で示される対応する中間体7-ケトリトコール酸(7-KLCA)化合物への酸化を触媒し、
i2)前記7β-HSDHは、反応ステップi1)において形成される一般式(3)の前記7-KLCA化合物の、一般式(1)の前記UDCA化合物への還元を、反応ステップi1)において消費された補因子の再生下で触媒するステップと、
ii)任意選択で、反応生成物をさらに精製するステップと、
を含み、そして
A)前記7α-HSDHおよび前記7β-HSDHが両方とも、補因子系NAD+/NADHを利用し、ここで
a)前記7α-HSDHが、
配列番号34のクロストリジウム・ディフィシル(Clostridium difficile)7α-HSDHの突然変異体である7α-HSDHであって、突然変異体が、補因子としてのNAD+の消費下で、少なくとも、7α-ヒドロキシステロイドの、対応する7-ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒し、前記7α-HSDHが、
a1)単一突然変異
K16X 1
A37X 2
および
a2)二重突然変異
A37X 3 /R38X 4
[式中、X 1 は、A、GまたはDを表し、
X 2 は、DまたはEを表し
X 3 は、Dを表し
X 4 は、IまたはLを表す]
から選択される突然変異を含み、配列番号34に対して、少なくとも90%の配列同一性を示す7α-HSDH
から選択され、
b)前記7β-HSDHが、
配列番号54のコリンセラ・アエロファシエンス(Collinsella aerofaciens)7β-HSDHの突然変異体である7β-HSDHであって、突然変異体が、補因子としてのNADHの消費下で、少なくとも、7-ケトステロイドの、対応する7β-ヒドロキシステロイドへの立体特異的な酵素的還元を触媒し、前記7β-HSDHが、配列番号54のT17、G39、R40、R41およびK44から選択される位置に少なくとも1つの突然変異を含み、配列番号54に対して、少なくとも90%の配列同一性を示す7β-HSDH
から選択される、方法。 - ステップi)が、単離された7α-HSDHおよび7β-HSDH酵素の存在下で、または前記酵素を機能的に発現する1種以上の組換え微生物の存在下で実施される、請求項1に記載の方法。
- 配列番号34のC.ディフィシル(difficile)7α-HSDHの突然変異体であり、突然変異体が、補因子としてのNAD+の消費下で、少なくとも、7α-ヒドロキシステロイドの、対応する7-ケトステロイドへの立体特異的な酵素的酸化を触媒し、酵素突然変異体が、配列番号34のK16、A37およびR38から選択される少なくとも1つのアミノ酸位置に突然変異を含み、
前記突然変異が、
a)単一突然変異
K16X1
A37X 2
および
b)二重突然変異
A37X 3 /R38X 4
[式中、X1は、A、GまたはDを表し、
X2は、DまたはEを表し
X 3 は、Dを表し
X 4 は、IまたはLを表す]
から選択され、
配列番号34に対して、少なくとも90%の配列同一性を示す7α-HSDH。 - 配列番号34の7α-HSDHと比較した場合に、以下の特徴プロフィール:
a)ケノデスオキシコール酸(chenodesoxycholic acid)(CDCA)に対する増大した比活性(Vmax[U/mg])、
b)補因子としてNAD+を用いるCDCAの酵素的酸化の間のNAD+に対する増大した比活性(Vmax[U/mg])、
c)NADHに関する修飾された補因子特異性、
d)少なくとも1種の胆汁酸、特に、コール酸(CA)および/またはCDCAおよ
び/または7-KLCAに対する、低減されたまたは失われた基質阻害
を示し、
e)特徴a)からd)が、個別に、または任意の組合せで存在し得る、
請求項3に記載の7α-HSDH。 - 前記の請求項3または4に記載の7α-HSDHをコードするヌクレオチド。
- 少なくとも1つの調節的配列の制御、請求項5に記載の少なくとも1つのヌクレオチドを含む発現カセット。
- 請求項6に記載の少なくとも1つの発現カセットを含む発現ベクター。
- 請求項5に記載の少なくとも1つのヌクレオチドまたは請求項6に記載の少なくとも1つの発現カセットまたは請求項7に記載の少なくとも1つの発現ベクターを保持する組換え微生物。
- 補因子再生に適したさらなるヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ(HSDH)から選択される少なくとも1つのさらなる酵素のコード配列をさらに保持する、請求項8に記載の組換え微生物。
- 両方とも補因子系NAD+/NADHを利用する7α-HSDHおよび7β-HSDHを同時発現する、請求項9に記載の組換え微生物。
- 請求項3または4において定義される、7α-HSDHおよび7β-HSDHを同時発現する、請求項10に記載の組換え微生物。
- 7α-ケトステロイドの酵素的または微生物的合成のための生体触媒方法であって、対応する7-ヒドロキシステロイドは、請求項3または4の定義に従う7α-HSDH突然変異体の存在下で、または請求項8から11のうち一項に従う前記7α-HSDH突然変異体を発現する組換え微生物の存在下で酸化され、任意選択で、形成される反応生成物のうち1種が、反応混合物から単離される、生体触媒方法。
- 前記7-ヒドロキシステロイドが、
-コール酸(CA)
-ケノデオキシコール酸(CDCA)、
-12-ケト-ケノデオキシコール酸(12-ケト-CDCA)から、好ましくは、酸化可能な前記7α-HSDH突然変異体、酸の塩、アミドまたはアルキルエステルから選択されるその誘導体、によって選択される、請求項12に記載の方法。 - 酸化が、NAD + の存在下で、特にそれらの消費下で実施される、請求項12または13に記載の方法。
- 消費されたようなNAD + が、NAD + 再生酵素とカップリングすることによって再生され、前記酵素が、7β-HSDH、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)およびギ酸(formiate)デヒドロゲナーゼ(FDH)、グルコースデヒドロゲナーゼ(GDH)、NADHデヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ(ADH)、グルコース-6リン酸-デヒドロゲナーゼ(G6PDH)、亜リン酸デヒドロゲナーゼ(PtDH)から選択される、請求項14に記載の方法。
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