KR20230058876A - 7-Keto-LCA에서 우르소데옥시콜산으로의 전환율을 증진시키는 루미노코쿠스 나버스 균주 유래 7-beta-HSDH의 변이체 및 이를 이용한 우르소데옥시콜산 생산방법 - Google Patents
7-Keto-LCA에서 우르소데옥시콜산으로의 전환율을 증진시키는 루미노코쿠스 나버스 균주 유래 7-beta-HSDH의 변이체 및 이를 이용한 우르소데옥시콜산 생산방법 Download PDFInfo
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Abstract
7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산 (ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환율을 증진시키는 루미노코쿠스 나버스(Ruminococcus gnavus) 균주 유래 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)의 변이체 및 이를 이용한 우르소데옥시콜산 생산방법에 관한 것이다. 본 발명에서는 효소 개량을 통한 변이체 제조 및 재조합 단백질 생산 개발을 통해 7-Keto-LCA의 UDCA 전환 효율을 증진시킨 바, UDCA 생합성 및 생합성 효율 증진을 위해 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
Description
7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산 (ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환율을 증진시키는 루미노코쿠스 나버스 (Ruminococcus gnavus) 균주 유래 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)의 변이체 및 이를 이용한 우르소데옥시콜산 생산방법에 관한 것이다.
담즙산은 담즙의 주요 구성 성분이며, 지방, 지방산 및 소수성 비타민의 소화 및 흡수에 필요한 생체분자이다. 대사가 잘 이루어지지 않는 안정적인 물질이며, 생화학적 기능 및 용해도의 차이를 유발하는 다양한 hydroxy group들이 중심 cholesterol ring의 다양한 탄소위치에 배치되어있다. 다양한 종류의 담즙산 중 우르소데옥시콜산 (ursodeoxycholic acid; UDCA)은 소량으로만 발견되는 담즙산중 하나이다. UDCA는 최근에, 콜레스테롤-포함 담석의 용해와 관련한 치료적 기능이 밝혀진바 있다. 이러한 화합물은 화학적 단계 또는 효소적 단계에서 톤 단위의 양(tonne quantity)으로 공업적으로 생산된다. UDCA의 합성에 대한 중요한 전구체는 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)가 존재하며, 나트륨을 촉매로 7-Keto-LCA와 n-뷰탄올을 반응시켜 UDCA로 전환시킬 수 있다. 효소를 이용한 방법의 경우 7-케토기를 입체선택적으로 환원시킬수 있는 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)에 의해 촉매화되는 효소적 촉매 작용을 이용하여 우르소데옥시콜산 (ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환을 진행한다. 이러한 단계는 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)에 의해 촉매화되는 효소적 촉매 작용을 이용하며 반응에서 조효소인 NAD(P)H를 요구한다. 하지만, 종래 루미노코쿠스 나버스(Ruminococcus gnavus) 균주의 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)를 이용한 7-keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 UDCA로의 전환 반응의 경우, 30 g/L이상의 7-keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)가 기질로 존재할 경우 기질 농도에 의한 저해로 전환능이 감소하는 문제점이 존재한다.
따라서, 기질 결합 부위(substrate binding site)의 아미노산 서열 변경을 통해 기질 농도 증가에 따른 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 효소 활성 감소 효과를 완화하거나 재조합 대장균을 이용하여 상기 개량된 효소의 대량생산에 대한 연구가 필요하며, 아직까지 관련 분야에서의 연구는 미흡한 실정이다.
일 양상은 루미노코쿠스 나버스 (Ruminococcus gnavus) 균주 유래 7-beta-HSDH의 아미노산 서열 변이를 포함하는, 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체를 제공하는 것이다.
다른 양상은 상기 변이체를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 수탁번호 KCTC 14715 BP로 기탁된 Escherichia coli ABP-5 균주를 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 효소의 기질 결합 부위가 변이된 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)에 의해 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)를 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로 전환시키는 단계를 포함하는, 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환율을 증진시키는, 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)의 생산방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 효소의 기질 결합 부위가 변이된 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)에 의해 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)를 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로 전환시키는 단계를 포함하는, 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환율 증진 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 루미노코쿠스 나버스(Ruminococcus gnavus) 균주 유래 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)의 아미노산 서열 변이를 포함하는, 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체로서,
상기 아미노산 서열 변이는, 1) M207X₁, 2) T210X₂ 및 3) Q212X₃으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하고, X₁은 메티오닌(M) 이외의 아미노산을 나타내고, X₂는 트레오닌(T) 이외의 아미노산을 나타내고, X₃은 글루타민(Q) 이외의 아미노산을 나타내는 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체는 4) D252X₄ 변이를 부가적으로 가지며 X₄는 아스파르트산(D) 이외의 아미노산일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “7-beta-HSDH (7 beta-hydroxy steroid dehydrogenase)”는 7-케토스테로이드의 상응하는 7-beta-HSDH의 입체특이적 환원 (수소화), 또는 7-위치에서 케토기 및 스테로이드 구조 상에 1개 이상의 추가의 케토 기를 포함하는 케토스테로이드의 상응하는 7-beta-HSDH를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “아미노산”은 알라닌(A; Alanine, A), 시스테인(C;Cysteine, Cys), 아스파틱산(D; Aspatic acid, Asp), 글루탐산(E; Glutamic acid, Glu), 페닐알라닌(F; Phenylalanine, Phe), 글리신(G; Glycine, G), 히스티딘(H; Histidine, His), 아이소류신(I; Isoleucine, Ile), 라이신(K; Lysine, Lys), 류신(L; Leucine, Leu), 메티오닌(M; Methionine, Met), 아스파라긴(N; Asparagine, Asn), 프롤린(P; Proline, Pro), 글루타민(Q; Glutamine, Gln), 아르기닌(R; Argineine, Arg), 세린(S; Serine, Ser), 트레오닌(T; Threonine, Thr), 발린(V; Valine, Val), 트립토판(W; Tryptophan, Trp), 티로신(Y; Tyrosine,Tyr)일 수 있으며, 구체적으로는 발린(V; Valine, Val), 이소류신 (I; Isoleucine, Ile), 류신 (L; Leucine, Leu) 또는 글루탐산(E; Glutamic acid, Glu)에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “아미노산 서열 변이”는 하나 이상의 아미노산 서열의 변이를 나타내는 것으로, 하나의 돌연변이를 나타내는 M207X₁, T210X₂, Q212X₃ 및 D252X₄으로 이루어진 군에서 선택되는 하나일 수 있고, 이때 X1 내지 X4는 발린(V, Valine, Val), 아이소류신 (I; Isoleucine, Ile), 류신 (L; Leucine, Leu) 또는 글루탐산(E; Glutamic acid, Glu)에서 선택되는 것일 수 있으며, 구체적으로 X1은 발린(V, Valine, Val), X2는 아이소류신 (I; Isoleucine, Ile), X3은 류신 (L; Leucine, Leu), X4는 글루탐산(E; Glutamic acid, Glu)일 수 있다.
또한, 복수의 아미노산 서열 변이를 가지는 경우 (M207X₁ 및 T210X₂), (M207X₁, 및 Q212X₃), (M207X₁ 및 D252X₄), (T210X₂ 및 Q212X₃), (T210X₂ 및 D252X₄), (M207X₁, Q212X₃ 및 D252X₄), (M207X₁, T210X₂ 및 Q212X₃), (M207X₁, T210X₂, 및 D252X₄), (T210X₂, Q212X₃ 및 D252X₄) 또는 (M207X₁, T210X₂, Q212X₃ 및 D252X₄)에서 선택되는 것일 수 있으며, X1 내지 X4는 발린(V, Valine, Val), 아이소류신 (I; Isoleucine, Ile), 류신 (L; Leucine, Leu) 또는 글루탐산(E; Glutamic acid, Glu)에서 선택되는 것일 수 있고, 구체적으로 X1은 발린(V, Valine, Val), X2는 이소류신 (I; Isoleucine, Ile), X3은 류신 (L; Leucine, Leu), X4는 글루탐산(E; Glutamic acid, Glu)일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열에 상응하는 서열 모티프에 적어도 하나의 돌연변이를 부가적으로 가진 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체일 수 있으며, 상기 돌연변이는 서열번호 1의 207 내지 212 서열 모티프가 VMKIAL일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "변이체(variant)"는 하나 이상의 아미노산이 보존적 치환(conservative substitution) 및/또는 변형(modification)되어 상기 변이체의 변이 전 아미노산 서열과 상이하나 기능(functions) 또는 특성(properties)이 유지되는 폴리펩티드를 지칭한다. 이러한 변이체는 일반적으로 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열 중 하나 이상의 아미노산을 변형하고, 상기 변형된 폴리펩티드의 특성을 평가하여 동정(identify)될 수 있다. 즉, 변이체의 능력은 변이 전 폴리펩티드에 비하여 증가되거나, 변하지 않거나, 또는 감소될 수 있다. 또한, 일부 변이체는 N-말단 리더 서열 또는 막전이 도메인(transmembrane domain)과 같은 하나 이상의 부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 다른 변이체는 성숙 단백질(mature protein)의 N- 및/또는 C-말단으로부터 일부분이 제거된 변이체를 포함할 수 있다. 상기 용어 "변이체"는 변이형, 변형, 변이형 폴리펩티드, 변이된 단백질, 변이 및 변이체 등의 용어(영문 표현으로는 modification, modified polypeptide, modified protein, mutant, mutein, divergent 등)가 혼용되어 사용될 수 있으며, 변이된 의미로 사용되는 용어라면 이에 제한되지 않는다. 본 출원의 목적상 상기 변이체는 서열번호 3의 아미노산 서열의 210번째 아미노산인 트레오닌이 이소루신으로 치환되고, 212번째 아미노산인 글루타민이 류신으로 치환된, 서열번호 1로 기재된 폴리펩티드일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “입체 선택성(Stereo selectivity)”은 화학 반응 시 하나의 입체적인 구조를 가지며 선택적으로 생성되는 성질을 의미한다.
일 구체예에 있어서, 상기 7-beta-HSDH 변이체는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열에 상응하는 서열 모티프에 적어도 하나의 돌연변이를 부가적으로 가진 7-beta-HSDH 변이체일 수 있다. 상기 변이체는 서열번호 1과 80% 이상, 90% 이상, 95, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있으며, 상기 돌연변이는 서열번호 1의 207 내지 212 서열 모티프가 VMKIAL인 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “서열 모티프(sequence motif)”는 서열의 일부 구성요소로서 R. gnavus 유래의 7-beta-HSDH 아미노산 서열 중 기질 결합 부위(substrate binding site)인 서열번호 1의 207 내지 212 서열을 의미한다.
다른 구체예에 있어서, 상기 루미노코쿠스 나버스(Ruminococcus gnavus) 균주 유래 7-beta-HSDH는 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)를 기질로 인지하며 7번째 탄소에 입체특이적 효소적 환원의 촉매화를 유도할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “입체특이성(stereospecificity)”은 반응에서 한 특정 입체이성질체(stereoisomer) 반응물이 하나의 특정 입체이성질체(혹은 거울상 이성질체 쌍) 생성물을 생성하는 것을 의미하며, 주어진 반응 물질에서 생성되는 입체화학적 결과를 확실하게 명시할(specify) 수 있는 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “효소적 환원”은 미생물 유래 환원 효소를 이용하는 방법으로써, 효소적 환원법은 자연계로부터 분리된 신규 미생물 또는 논문 또는 특허에 공지된 미생물로부터 환원 효소 유전자를 분리하고, 분리된 유전자를 플라즈미드에 이식하여 대장균 내에서 형질전환시키고, 결과된 대장균을 배양시킨 다음, 세포를 파쇄 및 원심분리하여 수득된 균체를 그대로 반응에 사용할 수 있으며, 혹은 상기 대장균을 파쇄 및 원심분리하여 회수된 상등액을 반응에 사용할 수도 있다. 루미노코쿠스 나버스(Ruminococcus gnavus) 균주를 이용하여 효소적 환원의 촉매화를 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
다른 양상은 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체의 유전자를 포함하는, 재조합 벡터를 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터에 포함된 변이체는 서열번호 1과 80% 이상, 보다 구체적으로는 90% 이상, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 서열 상동성을 가지는 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유전자"는 유전정보를 결정하는 구조단위를 의미하는 것으로, 단백질의 아미노산 서열 또는 기능 RNA(tRNA, rRNA 등)의 염기 배열을 결정하는 정보를 가지는 구조 유전자, 및/또는 구조유전자의 발현을 제어하는 조절유전자(예를 들면, 프로모터, 억제자(repressor), 작동유전자(operator) 등)를 포함하며, 유전자의 산물을 생성하기 위해 전사되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일가닥 쪽을 의미하는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터"는 그것이 연결되어 있는 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 벡터는, 단일-가닥, 이중-가닥, 또는 부분적 이중-가닥인 핵산 분자; 하나 이상의 자유 말단을 포함하는 핵산 분자, 자유 말단이 없는 핵산 분자(예를 들어, 원형); DNA, RNA 또는 이들 둘 다를 포함하는 핵산 분자; 및 당업계에서 알려진 기타 다른 다양한 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "재조합 벡터"는, 발현시키고자 하는 목적 폴리펩타이드(핵산)의 암호화 유전자가 작동 가능하게 연결될 경우, 적절한 숙주 세포에서 상기 목적 폴리펩타이드를 높은 효율로 발현시킬 수 있는 목적 폴리펩타이드의 발현 벡터로 사용될 수 있으며, 상기 재조합 벡터는 숙주 세포에서 발현 가능할 수 있다. 숙주 세포는 원핵세포일 수 있으며, 숙주세포의 종류에 따라 프로모터(promoter), 종결자(terminator), 인핸서(enhancer) 등과 같은 발현 조절 서열, 막 표적화 또는 분비를 위한 서열 등을 적절히 선택하고 목적에 따라 다양하게 조합할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 재조합 벡터는 Tac promoter 및 카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “프로모터(Promoter)”는 유전자가 언제 어디서 어느 정도 발현할 것인가를 결정하는 작용을 하는 염기서열, 즉 유전자의 발현 조절 기능을 갖는 조절영역의 일종으로, trp 및 lac 오페론의 프로모터 조합으로 생성된 합성 DNA 프로모터로서 일반적으로 대장균에서 단백질 생산에 사용되는 Tac promoter를 사용할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “카나마이신(kanamycin) 저항성 유전자”는 재조합 미생물이 항생제에 노출되어도 생존할 수 있는 약물 저항성을 나타내는 유전자를 의미한다.
또 다른 양상은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 세포를 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "형질전환"은 외부로부터 주어진 DNA에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것으로, 즉 생물의 어떤 계통의 세포에서 추출된 핵산의 일종인 DNA를 다른 계통의 살아있는 세포에 도입했을 때 DNA가 그 세포에 들어가서 유전형질이 변화하는 현상을 의미하는 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 형질전환된 것일 수 있으며, 상기 형질전환된 세포는 수탁번호 KCTC 14715 BP로 기탁된 것일 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 대장균은 LB 배지를 포함하는 발효배지에서 30 내지 40℃에서 4시간 내지 48시간 동안 배양될 수 있으며, 이때, 상기 배양은, 진탕 삼각 플라스크(baffled flask)를 이용하여 호기성 조건에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “발현”은 대장균 균주가 자체적으로 발현시킬 수 없는 효소를, 인위적으로 발현시키기 위해 외부 유래의 유전자를 균주 내로 도입하여 발현시키는 것을 의미하고, “과발현”이라는 용어는 대장균 균주가 자체적으로 해당 효소를 암호화하는 유전자를 가져, 스스로 발현시킬 수 있으나, 대량생산을 위한 목적으로 이의 발현량을 증대시키기 위해 인위적으로 해당 효소의 발현량을 증대시켜 과발현한 것을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 핵산의 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 핵산 주형의 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 중합효소 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오타이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.
상기 프라이머 설계시, 프라이머의 A, G, C, T 함량비, 프라이머 결합체(dimer) 형성 방지, 같은 염기서열의 3회 이상 반복금지 등 여러 가지 제약이 따르며, 그 외에 단독 PCR 반응조건에 있어서 주형(template) DNA의 양, 프라이머의 농도, dNTP의 농도, Mg2+의 농도, 반응온도, 반응시간 등의 조건이 적정해야 한다.
상기의 프라이머는 기본 성질을 변화시키지 않은 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 즉 핵산 서열이 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형될 수 있다. 이러한 변형의 예로는 메틸화, 캡화, 뉴클레오타이드의 하나 이상의 동족체로의 치환 및 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트 또는 카바메이트 등의 하전되지 않은 연결체나 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트 등의 하전된 연결체로의 뉴클레오타이드의 변형이 가능하다. 또한 핵산은 뉴클레아제, 독소, 항체, 시그날 펩타이드, 폴리 L 리신 등의 단백질, 아크리딘 또는 프소랄렌 등의 삽입제, 금속, 방사성 금속, 철 산화성 금속 등의 킬레이트화제 및 알킬화제 등의 하나 이상의 부가적인 공유 결합된 잔기를 가질 수 있다.
일 구체예에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 7-beta-HSDH 효소의 아미노산 4종이 변경된 효소(서열번호 1)를 발현하기 위해 상기 유전자가 삽입된 발현 벡터를 대장균(E. coli MG1655)에 도입하여 형질전환된 것일 수 있다.
또 다른 양상은 수탁번호 KCTC 14715 BP로 기탁된 Escherichia coli ABP-5 균주를 제공한다. 상기 재조합 대장균(E. coli ABP-5 (기탁번호 KCTC 14715 BP))는 R. gnavus 균주로부터 유래한 해당 균주를 이용한 단백질 발현 과정을 통해 개량된 7-beta-HSDH 효소 변이체인 ABP-5를 발현할 수 있다.
또 다른 양상은 효소의 기질 결합 부위가 변이된 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)에 의해 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)를 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로 전환시키는 단계를 포함하는,
7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환율을 증진시키는, 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)의 생산방법을 제공한다.
또 다른 양상은 효소의 기질 결합 부위가 변이된 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)에 의해 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)를 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로 전환시키는 단계를 포함하는,
7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환율 증진 방법을 제공한다.
일 구체예에 있어서, 상기 효소의 기질 결합 부위는 7-beta-HSDH 아미노산 서열 200 내지 215 서열 모티프일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 구체예에 있어서, 상기 변이는 1) M207X₁, 2) T210X₂ 및 3) Q212X₃으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하고, X₁은 메티오닌(M) 이외의 아미노산을 나타내고, X₂는 트레오닌(T) 이외의 아미노산을 나타내고, X₃은 글루타민(Q) 이외의 아미노산을 나타내는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “7-keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)”는 인간의 장내 세균에 의한 2차 담즙산 우르소데옥시콜산 (ursodeoxycholic acid; UDCA) 합성의 중간체로서 케노데옥시콜린산에서 형성되는 중간체를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “전환율"은 본래 특정 물질(원료)의 몰수를 기준으로 하여, 화학적 반응에 의해 다른 물질로 전환되는 본래 특정 물질(원료)의 백분율을 의미한다.
본 발명에서는 효소 개량을 통한 변이체 제조 및 재조합 단백질 생산 개발을 통해 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산 (ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환 효율을 증진시킨 바, 우르소데옥시콜산 (ursodeoxycholic acid; UDCA) 생합성 및 생합성 효율 증진을 위해 널리 활용될 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 R. gnavus 유래의 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) (서열번호 3)와 본 발명에서 개량한 ABP-5의 아미노산 서열(서열번호 1)을 비교한 결과이다.
도 2는 개량된 7-beta-HSDH 효소인 ABP-5를 발현하기 위해 이용한 pCDFDuet-1-Tac-Kan 벡터(Tac promoter, kanamycin resistance)를 나타낸 것이다.
도 3은 대장균을 이용한 R. gnavus 유래 7-beta-HSDH 및 개량된 R. gnavus 7-beta-HSDH(ABP-5) 효소 발현 SDS-PAGE 분석결과이다. (A: R. gnavus 7-beta-HSDH 효소 (29.32 kDa), B: ABP-5 (29.3 kDa))
도 4는 조효소 재생 시스템을 포함한 7-beta-HSDH 효소를 이용한 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)의 UDCA 전환 모식도이다.
도 5는 다양한 7-Keto-LCA농도별 각 효소의 UDCA 전환율을 비교한 결과이다. (○: R. gnavus 7-beta-HSDH ■: ABP-5)
도 6은 pH조절에 따른 다양한 7-Keto-LCA농도별 각 효소의 UDCA 전환율을 비교한 결과이다. (○: ABP-5 with pH control ■: ABP-5 W/O pH control)
도 2는 개량된 7-beta-HSDH 효소인 ABP-5를 발현하기 위해 이용한 pCDFDuet-1-Tac-Kan 벡터(Tac promoter, kanamycin resistance)를 나타낸 것이다.
도 3은 대장균을 이용한 R. gnavus 유래 7-beta-HSDH 및 개량된 R. gnavus 7-beta-HSDH(ABP-5) 효소 발현 SDS-PAGE 분석결과이다. (A: R. gnavus 7-beta-HSDH 효소 (29.32 kDa), B: ABP-5 (29.3 kDa))
도 4는 조효소 재생 시스템을 포함한 7-beta-HSDH 효소를 이용한 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)의 UDCA 전환 모식도이다.
도 5는 다양한 7-Keto-LCA농도별 각 효소의 UDCA 전환율을 비교한 결과이다. (○: R. gnavus 7-beta-HSDH ■: ABP-5)
도 6은 pH조절에 따른 다양한 7-Keto-LCA농도별 각 효소의 UDCA 전환율을 비교한 결과이다. (○: ABP-5 with pH control ■: ABP-5 W/O pH control)
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
<실시예 1: ABP-5 발현 벡터 및 발현 균주의 개발>
R. gnavus 유래 7-beta-HSDH의 아미노산 서열 중 200에서 215 주위의 영역이 기질 결합과 관여되어 있고, 240에서 259 주위의 영역은 기질의 입체선택성(Stereo selectivity)에 관여되어 있는 것으로 알려져 있으며, 기질 결합에 관여하는 아미노산 중 207번 위치의 메티오닌(methionine), 210번 위치의 트레오닌(threonine), 212위치의 글루타민(glutamine) 및 기질 입체선택성에 관여하는 아미노산 중 252위치의 글루탐산(glutamic acid)을 대체하였을 경우 기질 농도가 증가하여도 활성이 유지되는 것을 확인하였다.
따라서, 7-beta-HSDH의 변이체인 ABP-5는 기존 7-beta-HSDH의 아미노산에서 M207V, T210I, Q212L, D252E 변이를 포함하는 것으로, 보다 구체적으로 207번째 아미노산인 메티오닌이 발린으로 대체되고, 210번째 아미노산인 트레오닌이 이소류신으로 대체되고, 212번째 아미노산인 글루타민이 류신으로 대체되고, 252번째 아미노산인 아스파틱산이 글루탐산으로 대체된 변이체를 의미한다(도 1).
루미노코쿠스 나버스 (Ruminococcus gnarvus) 균주로부터 유래한 7-beta-HSDH 효소를 개선한 재조합 효소 ABP-5의 유전자를E. coli MG1655 균주에 삽입하기 위하여, Integrated DNA Technologies, Inc.의 홈페이지에서 제공하는 Codon Optimization Tool을 이용하여 ABP-5의 아미노산 서열을 이용한 코돈 최적화를 진행한 후 마크로젠(Seoul, Republic of Korea)사에 의뢰하여 DNA 합성을 진행하였다.
구체적으로, 본 실험의 코돈 최적화된 ABP-5 유전자(서열번호 2) 및 비교대상인 R. gnavus 7-beta-HSDH(서열번호 4)를 확보하기 위하여 ABP-5_F(서열번호 5), ABP-5_R(서열번호 6), 7-beta-HSDH-F(서열번호 7), 그리고 7-beta-HSDH-R(서열번호 8) 프라이머를 이용하여 PCR을 통한 유전자 증폭을 진행하였다.
발현에 사용할 벡터를 제작하기 위해 대장균용 발현 벡터인 pCDFDuet-1를 사용하였다. 상기 벡터에 존재하는 T7 promoter를 Tac promoter로 치환하기 위해 hangover PCR을 응용한 방법을 이용하였으며, 이때 사용한 프라이머인 F_Tac_overhang 및 R_Tac_overhang은 서열번호 9 및 10에 있는 서열로 제작하여 진행하였다. 벡터를 제작하기 위해 DNA Polymerase (Q5® High-Fidelity DNA Polymrase, NEB)를 조건은 98℃에서 10초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 유전자 크기 1 kb당 30초간 반응을 설정하여 상기 사이클(98℃에서 10초간, 50℃에서 30초간, 72 ℃에서 유전자 크기 1 kb당 30초간 반응)을 30회 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 벡터 전체를 Reverse PCR 반응을 수행하였다. 이후 주형 벡터인 pCDFDuet-1을 제거하기 위해 37℃조건에서 DpnI (NEB)을 1시간 처리하였으며, 이후 clonning host인 E. coli DH5α에 삽입한 후 제작한 벡터를 증폭하여 이용했다.
또한 pCDFduet-1 벡터의 엠피실린 카세트를 카나마이신 카세트로 교체하기 위하여 all vector-F, R 프라이머(서열번호 13, 14)를 이용하여 DNA Polymerase (Q5® High-Fidelity DNA Polymrase, NEB)를 이용하였다. 조건은 98℃에서 10초간, 55℃에서 30초간, 72℃에서 유전자 크기 1kb당 30초간 반응을 설정하여, 상기 사이클(98 ℃에서 10초간, 50℃에서 30초간, 72℃에서 유전자 크기 1 kb당 30초간 반응)을 30회 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 벡터 전체를 Reverse PCR 반응을 수행하였다. 이를 남아있는 주형 벡터를 제거하기 위해서 DpnI (NEB)를 37℃에서 1시간 수행하였으며 카나마이신 카세트를 Kanamycin-F,R 프라이머(서열번호 11, 12)를 이용하여 GXL DNA 중합효소 (타카라사, 일본)를 이용하여 98℃에서 30초 동안 반응시키고, 98℃에서 10초간, 50℃에서 30초간, 72℃에서 유전자 크기 1 kb당 30초간 반응을 설정하여, 상기 사이클(98℃에서 10초간, 50℃에서 30초간, 72℃에서유전자 크기 1 kb당 30초간 반응)을 30회 수행하고, 마지막으로 72℃에서 5분간 반응시키는 조건으로 수행하였다. Reverse PCR 반응한 벡터와 카나마이신 카세트를 In Fusion HD Enzyme (타카라, 일본)을 이용하여 in-fusion 방법으로 클로닝 하였으며 최종적으로 제작된 발현 벡터를 pCDFDuet-1-Tac-Kan벡터로 명명하였다.
이후, pCDFDuet-1-Tac-Kan벡터(도 2)에 NcoI, BamHI 제한효소를 처리한 뒤 증폭한 ABP-5 효소 및 R. gnavus 7-beta-HSDH 유전자를 In Fusion HD Enzyme (타카라, 일본)을 이용하여 in-fusion 방법으로 삽입하였으며, 최종적으로 E. coli MG1655 균주에 상기 재조합 벡터를 삽입하였다.
형질전환 이후 ABP-5 유전자를 포함한 pCDFDuet-1-Tac-Kan 삽입된 균주를 선별하기 위해 카나마이신(kanamycin)이 50 μg/mL 농도로 함유되어있는 LB 배지에 도말한 후 37℃ 온도조건에서 하루동안 배양하였다. 이후 BioFACT사의 2X Taq PCR pre-Mix제품 및 ABP-5_F와 ABP-5_R프라이머 또는 7-beta-HSDH-F와 7-beta-HSDH-R프라이머를 이용한 colony PCR을 수행하여 최종적으로 ABP-5 유전자 및 R. gnavus 7-beta-HSDH 유전자를 포함한 pCDFDuet-1-Tac-Kan 삽입된 균주를 선별하였다. ABP-5유전자가 포함된 pCDFDuet-1-Tac-Kan벡터를 지닌 대장균(E. coli MG1655)을 ‘E. coli ABP-5’라 명명였으며, 2021년 09월 17일자로 한국생명공학연구원에 기탁하여 기탁번호 KCTC 14715 BP를 부여받았다. 또한 해당 균주에서 발현된 개량된 7-beta-HSDH를 ABP-5로 명명하였다.
| 서열번호 | 서열명 | 서열 (핵산서열 5’ →3’/ 아미노산 서열 N-terminal →C-terminal) |
| 1 | ABP-5 아미노산 서열 | [서열목록]에 상세표기 |
| 2 | ABP-5 염기서열 | [서열목록]에 상세표기 |
| 3 | R. gnavus 7-beta-HSDH 아미노산 서열 | [서열목록]에 상세표기 |
| 4 | R. gnavus 7-beta-HSDH염기서열 | [서열목록]에 상세표기 |
| 5 | ABP-5_F | ataaggagatataccATGAATTTGCGTGAGAAATACGG |
| 6 | ABP-5_R | ctcgaattcggatccTTAATCTCTGTAAAAGCTACCCATGT |
| 7 | 7-beta-HSDH-F | ataaggagatataccatgacattgagagaa |
| 8 | 7-beta-HSDH-R | gaattcggatccttattattcttgatagaa |
| 9 | F_Tac_overhang | cattatacgagccgatgattaattgtcaaATTTCGCGGGATCGAGATCG |
| 10 | R_Tac_overhang | ttgacaattaatcatcggctcgtataatgGGAATTGTGAGCGGATAACAATTC |
| 11 | Kanamycin-F | acgaattgttagacattagaaaaactcatc |
| 12 | Kanamycin-R | ttgaaaaaggaagagatgagccatattcaa |
| 13 | All vector-F | ACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAG |
| 14 | All vector-R | TGTCTAACAATTCGTTCAAGCCGAGGG |
<실시예 2: ABP-5효소 발현 및 7-keto LCA의 UDCA 전환율 확인>
상기 실시예 1에서 제조된, ABP-5효소 발현 유전자가 과발현되도록 형질전환된 재조합 대장균(E. coli ABP-5 (기탁번호 KCTC 14715 BP))을 이용하여 재조합 단백질의 발현 및 재조합 단백질을 이용한 7-Keto-LCA의 UDCA 전환을 확인하였다.
균주 (E. coli ABP-5 (기탁번호 KCTC 14715 BP))의 성장은 600㎚ 파장에서 OD값을 UV-visible spectrophotometer (UV-1800, SHIMADZU)를 이용하여 측정하였다. 배양 후 단백질 분석은 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (Mini-PROTEIN Tetra system, Bio-Rad) 방법을 이용하여 진행하였으며, 분석용 polyacrylamide gel (Mini-PROTEAN TGX Precast Gels) 및 sample buffer (2x Laemmli Sample Buffer)를 이용하여 분석을 수행했다.
재조합 단백질 ABP-5를 이용한 7-Keto-LCA의 UDCA전환을 확인하기 위해 UFLC (LC-20AD, SHIMADZU)와 배양액의 3-HP를 분석하기 위하여 HPLC Chromaster (Hitachi, Japan)와 ACCUCORE C30 2.6UM 250X2.1MM COLUMN을 이용하여 분석을 수행하였으며, RID (refractive index detector)를 이용하여 분석하였다. 용매로는 1 M K₂HPO₄(pH 3.0) 2.2 mL, HPLC water 370 mL, acetonitrile 300 mL, 그리고 메탄올 400 mL을 혼합한 뒤 0.2 μm pore size filter를 이용하여 filtering 한 후 이용하였으며 40℃ 조건에서 분당 0.4 mL의 용매를 사용하는 조건으로 분석을 진행하였다.
2-1. 재조합 단백질(ABP-5)발현 및 SDS-PAGE 확인
균주(E. coli ABP-5)의 전배양은 LB 배지(Luria bertani medium)를 사용하였으며, 카나마이신(kanamycin) 50 μg/L, 글루코오스 0.5 g/L, 글리세롤 5 g/L 및 락토오스 2 g/L를 첨가하여 사용하였다. 접종에 사용한 균주는 -80℃에서 글리세롤 스톡(glycerol stock) 방법으로 보관한 균주를 사용하였으며, LB 배지에 1% 농도로 접종하여 180rpm, 37℃의 조건에서 전배양을 진행하였다. 또한, 전배양 후 대수기에 회수하여 멸균 증류수로 2회 세척하여 본배양에 이용하였다.
한편, ABP-5 효소 및 비교군인 R. gnavus 7-beta-HSDH 생산을 위해 250 mL 삼각 플라스크에 50 mL의 LB_Kan 배지를 사용하였다. 배양은 진탕 플라스크(baffled flask)를 사용하였으며, 교반속도는 180 rpm으로 하였고, 37℃의 온도조건에서 대장균 배양 및 효소 발현을 진행하였다.
각 배양시간 별 배양액을 회수하여 원심분리하여 상등액을 제거한 후 회수된 대장균을 멸균 증류수로 2회 세척하였으며, 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)으로 재현탁 후 초음파파쇄기를 이용하여 파쇄 및 단백질 발현을 확인하였다(도 3). 그 결과 2시간 이후 ABP-5 효소 및 비교군인 R. gnavus 7-beta-HSDH 발현이 원활하게 진행됨을 확인하였다.
2-2.
R. gnavus
유래 7-beta-HSDH 및 ABP-5 활성 측정
ABP-5 효소의 활성 측정을 위해 R. gnavus 유래 7-beta-HSDH 및 ABP-5 효소발현을 수행한 후 이를 이용하여 7-Keto-LCA의 UDCA 전환 반응을 이용하여 효소 활성을 측정하였다.
7-Keto-LCA의 UDCA 효소적 전환의 경우, 조효소로 NADPH를 요구하는 반응이다. 따라서 효소 활성 측정을 위해 NADPH가 지니고있는 340 nm 파장대의 흡광도를 이용하였으며, 이를 측정하기 위해 UV-visible spectrophotometer (UV-1800, SHIMADZU)를 이용하였다.
효소 반응을 위해 NADPH 0.5 mM 농도로 첨가하였으며 반응 완충용액은 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)을 사용하였다. 기질 7-Keto-LCA는 10 g/L 농도로 첨가하였으며 R. gnavus 7-beta-HSDH 및 ABP-5 효소의 경우 세포파쇄액 상태로 2 μL 첨가하여, 최종 2 mL 부피로 반응을 진행하였다.
활성 측정의 경우 각각의 효소를 첨가한 뒤 1분 간격으로 340 nm 흡광도의 변화를 측정한 뒤 측정된 흡광도 변화값을 NADPH-표준곡선(340 nm, 0.01 - 0.1 mM NADPH)에 대입하여 효소의 활성을 측정하였다. 세포파쇄액의 단백질 농도를 측정하기 위해 bradford 단백질 정량법을 사용하였으며 각각의 측정된 단백질 농도를 측정하였다.
R. gnavus 유래 7-beta-HSDH 및 ABP-5 효소 활성을 비교하기 위해 R. gnavus 유래 7-beta-HSDH 및 ABP-5 효소 유전자가 삽입된 발현벡터가 삽입된 재조합 대장균 E. coli ABP-5 및 E. coli R. gnavus 유래 7-beta-HSDH를 이용하였으며, 형질전환 시 확보한 10개의 colony를 선별하여 실시예 2.1의 발현방법으로 발현한 뒤 재조합 대장균에서 발현된 재조합 7-beta-HSDH인 R. gnavus 유래 7-beta-HSDH 및 ABP-5의 활성 측정을 진행하였다(표 2). 그 결과 R. gnavus 유래 7-beta-HSDH의 경우 평균 41.62±4.55 U/mg의 활성을 나타냈으며 ABP-5의 경우 49.13±4.72 U/mg의 활성을 나타내 기존 효소에 비해 활성이 약 18.10% 증진된 것을 확인할 수 있었다.
| Colony No. | Activity (U/mg) | |
| R. gnavus 7-beta-HSDH | ABP-5 | |
| 1 | 39.35 | 45.33 |
| 2 | 38.24 | 46.37 |
| 3 | 42.74 | 48.50 |
| 4 | 45.87 | 51.64 |
| 5 | 41.12 | 53.73 |
| 6 | 33.98 | 55.42 |
| 7 | 35.45 | 39.82 |
| 8 | 47.90 | 48.94 |
| 9 | 45.15 | 53.84 |
| 10 | 43.32 | 47.70 |
| Average | 41.62±4.55 | 49.13±4.72 |
2-3. ABP-5 효소 및
R. gnavus
유래 7-beta-HSDH를 이용한 7-Keto-LCA의 UDCA전환
발현된 ABP-5 효소 및 비교군인 R. gnavus 7-beta-HSDH를 이용하여 7-Keto-LCA의 UDCA의 전환을 수행하였다.
7-Keto-LCA의 UDCA의 전환에 이용되는 효소인 7-beta-HSDH의 경우 조효소로 NADPH를 요구한다. 하지만 상기 반응의 경우 당량 대 당량 반응이기 때문에 전환시키고자 하는 7-Keto-LCA와 동일량의 NADPH를 반응에서 요구한다. 이러한 점으로 인해 다량의 NADPH가 필요한 비효율적 반응이 될 수 있기 때문에 이를 해결하기 위해, 도 4에 표기한 조효소 재생 시스템(Co-factor regeneration)을 포함한 반응 시스템을 구성한 후 전환을 진행하였다.
전환반응을 위해 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)을 사용하였으며, 7-Keto-LCA (10, 20, 30, 40, 또는 50 g/L), NADPH 1 mM, Glucose 200 mM, Glucose dehydrogenase(GDH) 2 U/mL, 그리고 ABP-5 효소 또는 R. gnavus 7-beta-HSDH 4 U/mL 조건으로 30℃, 150 rpm 조건으로 반응을 진행하였다.
반응 결과 7-Keto-LCA 20 g/L 농도까지는 두 효소 모두 UDCA 전환율이 100%인 것이 확인되었다. 하지만 R. gnavus 7-beta-HSDH를 이용한 전환의 경우 기질인 7-Keto-LCA의 농도가 30 g/L일 경우 55.12%, 40 g/L일 경우 23.53%로 전환율이 감소하였으며, 50 g/L의 농도에서는 5.37%로 기질농도의 증가에 따라 전환율이 감소하는 것을 확인하였다.
이에 반해 ABP-5 효소를 이용하여 전환을 진행한 경우 7-Keto-LCA의 농도가 30 g/L일 경우 100%, 40 g/L일 경우 92.44%로 전환율이 감소하였으며, 50 g/L의 농도에서는 79.82%로 기질 농도 증가에 따른 전환율 감소폭이 R. gnavus 7-beta-HSDH에 비해 현저히 낮은 것을 확인하였다(도 5). 즉, 개량된 효소 변이체는 기존 전환활성이 유지되는 7-keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid) 농도인 20 g/L뿐만 아니라 30 g/L의 농도에서도 동일한 전환 효율을 보였으며, 40 g/L 그리고 50 g/L의 7-keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid) 농도에서도 UDCA로의 전환이 가능함을 확인하였다.
이러한 결과를 바탕으로, 7-beta-HSDH 효소 변이체 ABP-5의 경우, 기존의 효소에 비해 기질 농도 증가에 따른 저해에 대해 저항성을 지니고 있음을 확인하였으며, 이러한 장점을 활용하여 다양한 공정상의 이득을 취할 수 있을 것으로 사료된다.
<실시예 3: pH 조절에 따른 ABP-5 효소를 이용한 7-keto LCA의 UDCA전환>
실시예 2와 같이 본 발명에서 신규 개발한 효소 ABP-5를 이용할 경우 R. gnavus 7-beta-HSDH를 사용한 것과 다르게 40 g/L이상의 7-Keto-LCA 농도에서 발생하는 UDCA로 전환 저해 현상이 어느정도 완화되는 것을 확인하였다. 하지만, 50 g/L이상으로 7-Keto-LCA 농도가 증가할 경우, 전환율이 79.82%로 대폭 감소하는 경향이 나타났다.
7-Keto-LCA의 UDCA로의 전환에 조효소 재생 시스템으로 사용되는 GDH의 경우, 글루코오스를 글루콘산으로 전환하며 조효소로 NADP를 이용한다. 따라서 반응이 진행됨에 따라 축적되는 글루콘산에 의해 반응액의 pH가 감소하게 되며, 시작 pH 8.0에서 반응을 시작할 경우 종료시 pH가 7.2까지 감소하는 경향을 보인다. 이러한 pH의 감소가 활성 저해의 원인이라 사료되어 반응용액의 pH를 매 시간 측정하여 pH를 8.0으로 재조정하며 전환능을 확인하였다.
전환반응을 위해 50 mM 인산완충용액(pH 8.0)을 사용하였으며, 7-Keto-LCA (10, 20, 30, 40, 또는 50 g/L), NADPH 1 mM, 글루코오스 200 mM, Glucose dehydrogenase(GDH) 2 U/mL, 그리고 ABP-5 효소 또는 R. gnavus 7-beta-HSDH 4 U/mL 조건으로 30℃, 150 rpm 조건으로 반응을 진행하였다. 또한 매 시간 pH 측정기(FiveEasy, Mettler toledo)를 이용해 측정한 뒤 5 N NaOH를 이용하여 반응액의 pH를 8.0으로 적정하며 전환을 수행하였다. 그 결과 기존 pH조절을 하지 않은 조건에 비해 40 g/L에서는 4.2%(92.44→96.24%), 그리고 50 g/L에서는 12.43%(79.82%→92.45%) 전환율이 향상됨을 확인하였다(도 6).
전술한 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
<110> Ace Biopharm co., ltd
<120> Variant of 7 beta-hydroxysteroid dehydrogenase from Ruminococcus
gnavus for the conversion rate increasement of 7-Keto-LCA to UDCA
and a method for producing UDCA using the same
<130> PN210805KR
<160> 14
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 263
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified 7beta-HSDH aminoacid sequence (ABP-5)
<400> 1
Met Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Arg Leu Ala Lys Glu Gly
20 25 30
Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Lys Glu Leu
35 40 45
Gly Glu Glu Leu Lys Asn Thr Tyr Glu Ile Asp Tyr Lys Val Val Lys
50 55 60
Ala Asp Phe Ser Leu Pro Asp Ala Thr Asp Lys Ile Phe Ala Ala Thr
65 70 75 80
Glu Asn Leu Asp Met Gly Phe Met Ala Tyr Val Ala Cys Leu His Ser
85 90 95
Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Ala Met Ile
100 105 110
Asn Val Asn Val Val Thr Phe Met Lys Cys Phe Tyr His Tyr Met Lys
115 120 125
Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Met
130 135 140
Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln Tyr Gly Ala Gly Lys
145 150 155 160
Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Thr Glu Lys
165 170 175
Thr Asn Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Val Leu Thr Pro
180 185 190
Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln Gly Glu Ala Val Met
195 200 205
Lys Ile Ala Leu Thr Pro Glu Glu Val Val Asp Glu Ala Phe Glu Lys
210 215 220
Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ser Gly Glu Arg Asn Lys Ala Ser
225 230 235 240
Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Glu Tyr Ile Arg Tyr
245 250 255
Met Gly Ser Phe Tyr Gln Glu
260
<210> 2
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Modified 7beta-HSDH Nucleic acid sequence (ABP-5)
<400> 2
atgactttac gcgagaaata cggtgagtgg ggaattattc ttggtgctac agagggcgta 60
ggcaaggcct tctgcgagcg tttagcgaag gaggggatga atgttgtcat ggtaggacgc 120
cgcgaggaaa aattgaagga attaggagaa gagcttaaga acacctatga aatcgactat 180
aaagttgtta aggccgactt ttctttgccc gacgcgaccg ataaaatttt cgcggcgact 240
gaaaatttgg acatgggatt tatggcctat gttgcatgct tgcactcgtt tggtaagatt 300
caagacactc cctgggagaa gcacgaagca atgattaacg tgaatgtcgt cacgttcttg 360
aaatgctttc accactatat gcgtattttt gcggcgcagg atcgtggagc ggtaattaac 420
gtgtcttcca tgacggggat tagctctagc ccatggaatg gccaatacgg cgctggtaaa 480
gcatttattc ttaagatgac cgaagccgtg gcatgtgaat gcgagggaac cggagtggac 540
gtggaggtaa ttacgctggg aaccaccctt acgccgtcac ttttgtccaa cctgccgggc 600
gggccacaag gagaagctgt aatgaaaatt gcattgactc ccgaagagtg cgtagatgag 660
gcttttgaaa agttgggaaa agaattgtct gtgattgcag gccaacgcaa caaagactca 720
gttcatgact ggaaagctaa ccacactgag gacgaataca tccgctacat gggctccttc 780
taccgtgatt aa 792
<210> 3
<211> 263
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7beta-HSDH amino acid sequence for Ruminococcus gnavus
<400> 3
Met Thr Leu Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Arg Leu Ala Lys Glu Gly
20 25 30
Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Lys Glu Leu
35 40 45
Gly Glu Glu Leu Lys Asn Thr Tyr Glu Ile Asp Tyr Lys Val Val Lys
50 55 60
Ala Asp Phe Ser Leu Pro Asp Ala Thr Asp Lys Ile Phe Ala Ala Thr
65 70 75 80
Glu Asn Leu Asp Met Gly Phe Met Ala Tyr Val Ala Cys Leu His Ser
85 90 95
Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Ala Met Ile
100 105 110
Asn Val Asn Val Val Thr Phe Met Lys Cys Phe Tyr His Tyr Met Lys
115 120 125
Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Met
130 135 140
Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln Tyr Gly Ala Gly Lys
145 150 155 160
Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Thr Glu Lys
165 170 175
Thr Asn Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Val Leu Thr Pro
180 185 190
Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln Gly Glu Ala Met Met
195 200 205
Lys Thr Ala Gln Thr Pro Glu Glu Val Val Asp Glu Ala Phe Glu Lys
210 215 220
Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ser Gly Glu Arg Asn Lys Ala Ser
225 230 235 240
Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Asp Tyr Ile Arg Tyr
245 250 255
Met Gly Ser Phe Tyr Gln Glu
260
<210> 4
<211> 792
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 7beta-HSDH nucleic acid sequence for Ruminococcus gnavus
<400> 4
atgacattga gagaaaaata tggagaatgg ggaattattt taggcgctac tgaaggtgtc 60
ggaaaagcat tttgtgaaag gcttgccaaa gaaggtatga atgtcgtaat ggtcggacgc 120
cgtgaagaaa aattaaaaga gctcggtgag gaactaaaaa acacttatga gattgattat 180
aaagtcgtaa aagcagactt ttcgctgcca gatgctactg acaaaatttt tgctgcaaca 240
gaaaatctgg atatgggatt tatggcctat gtagcctgct tacactcttt tggcaaaatc 300
caggatacac cttgggaaaa gcatgaggca atgatcaacg taaacgttgt tacatttatg 360
aaatgcttct atcactatat gaaaatcttt gctgcacagg atcgcggtgc tgtcatcaac 420
gtatcttcta tgactggaat ttccagttca ccatggaatg gccaatatgg tgcaggaaag 480
gcattcattt taaaaatgac agaggctgtt gcctgtgaaa cggaaaagac caatgttgat 540
gtggaagtca tcactttggg aactgtgctg acaccaagtc ttttaagcaa cctgcctggc 600
ggaccacagg gggaagctat gatgaagact gctcaaacac cggaagaagt tgtggacgaa 660
gcttttgaaa aattaggaaa agaactgtct gtcatttccg gagagcgtaa taaagccagc 720
gtccatgact ggaaagcgaa tcatacagaa gatgactata tccgctatat gggatctttc 780
tatcaagaat aa 792
<210> 5
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for ABP-5
<400> 5
ataaggagat ataccatgaa tttgcgtgag aaatacgg 38
<210> 6
<211> 41
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for ABP-5
<400> 6
ctcgaattcg gatccttaat ctctgtaaaa gctacccatg t 41
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for 7beta-HSDH
<400> 7
ataaggagat ataccatgac attgagagaa 30
<210> 8
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for 7beta-HSDH
<400> 8
gaattcggat ccttattatt cttgatagaa 30
<210> 9
<211> 49
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for Tac_overhang
<400> 9
cattatacga gccgatgatt aattgtcaaa tttcgcggga tcgagatcg 49
<210> 10
<211> 53
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for Tac_overhang
<400> 10
ttgacaatta atcatcggct cgtataatgg gaattgtgag cggataacaa ttc 53
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for Kanamycin
<400> 11
acgaattgtt agacattaga aaaactcatc 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for Kanamycin
<400> 12
ttgaaaaagg aagagatgag ccatattcaa 30
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> forward primer for all vector
<400> 13
actcttcctt tttcaatatt attgaag 27
<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> reverse primer for all vector
<400> 14
tgtctaacaa ttcgttcaag ccgaggg 27
Claims (18)
- 루미노코쿠스 나버스 (Ruminococcus gnavus) 균주 유래 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)의 아미노산 서열 변이를 포함하는, 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체로서,
상기 아미노산 서열 변이는,
1) M207X₁,
2) T210X₂ 및
3) Q212X₃
으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하고,
X₁은 메티오닌(M) 이외의 아미노산을 나타내고,
X₂는 트레오닌(T) 이외의 아미노산을 나타내고,
X₃은 글루타민(Q) 이외의 아미노산을 나타내는, 7-beta-HSDH (7beta-hydroxysteroid) 변이체. - 청구항 1에 있어서, 상기 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체는 서열번호 1과 적어도 80% 서열 동일성을 가진 아미노산 서열에 상응하는 서열 모티프에 적어도 하나의 돌연변이를 부가적으로 가진 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체.
- 청구항 2에 있어서, 상기 돌연변이는 서열번호 1의 207 내지 212 서열 모티프가 VMKIAL인, 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 루미노코쿠스 나버스 (Ruminococcus gnavus) 균주 유래 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)는 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)를 기질로 인지하며 7-Keto-LCA의 7번째 탄소에 입체특이적 효소적 환원의 촉매화를 유도하는, 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체.
- 청구항 1에 있어서, 상기 아미노산 서열 변이는,
4) D252X₄를 부가적으로 가지며 X₄가 아스파르트산(D) 이외의 아미노산을 나타내는, 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체. - 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid) 변이체를 포함하는, 재조합 벡터.
- 청구항 6에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 염기 서열로 이루어진, 재조합 벡터.
- 청구항 6에 있어서, 상기 변이체는 서열번호 2의 염기 서열로 이루어진, 재조합 벡터.
- 청구항 6에 있어서, 상기 재조합 벡터는 Tac promoter 및 카나마이신(kanamycin)저항성 유전자를 포함하는, 재조합 벡터.
- 청구항 6의 재조합 벡터로 형질전환된 세포.
- 청구항 10에 있어서, 상기 세포는 재조합 벡터를 대장균에 도입하여 형질전환된 세포.
- 수탁번호 KCTC 14715 BP로 기탁된 Escherichia coli ABP-5 균주.
- 효소의 기질 결합 부위가 변이된 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)에 의해 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)를 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로 전환시키는 단계를 포함하는,
7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환율을 증진시키는, 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)의 생산방법. - 청구항 13에 있어서, 상기 효소의 기질 결합 부위는 7-beta-HSDH 아미노산 서열 200 내지 215 서열 모티프인, 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)의 생산방법.
- 청구항 13에 있어서, 상기 변이는
1) M207X₁,
2) T210X₂ 및
3) Q212X₃
으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하고,
X₁은 메티오닌(M) 이외의 아미노산을 나타내고,
X₂는 트레오닌(T) 이외의 아미노산을 나타내고,
X₃은 글루타민(Q) 이외의 아미노산을 나타내는, 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)의 생산방법. - 효소의 기질 결합 부위가 변이된 7-beta-HSDH (7 beta-hydroxysteroid)에 의해 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)를 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로 전환시키는 단계를 포함하는,
7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환율 증진 방법. - 청구항 16에 있어서, 상기 효소의 기질 결합 부위는 7-beta-HSDH 아미노산 서열 200 내지 215 서열 모티프인, 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환율 증진 방법.
- 청구항 16에 있어서, 상기 변이는
1) M207X₁,
2) T210X₂ 및
3) Q212X₃
으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 변이를 포함하고,
X₁은 메티오닌(M) 이외의 아미노산을 나타내고,
X₂는 트레오닌(T) 이외의 아미노산을 나타내고,
X₃은 글루타민(Q) 이외의 아미노산을 나타내는, 7-Keto-LCA (7-keto Lithocholic Acid)에서 우르소데옥시콜산(ursodeoxycholic acid; UDCA)으로의 전환율 증진 방법.
Priority Applications (4)
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