CN105274070B - 7β-羟基类固醇脱氢酶突变子及其应用和合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供7β‑羟基类固醇脱氢酶突变子及其应用和合成方法；一种7β‑类固醇脱氢酶的突变子，其特征在于所述突变子的氨基酸序列Seq ID NO：4，编码核苷酸序列为Seq ID NO：3；或所述突变子的氨基酸序列Seq ID NO：6，编码核苷酸序列为Seq ID NO：5。使用高效的7β‑类固醇脱氢酶及其突变子酶，以及辅酶再生系统来催化合成胆酸化合物特别是熊去氧胆酸，底物浓度高达100g/L，转化率为99.2‑99.5%，重量收率高达94‑96%。酶可以通过发酵方法廉价易得，生产成本和产品质量优于化学合成方法，适合于工业化生产。
Description
技术领域：
本发明涉及来自于瘤胃菌属(Ruminococcus)，特别是活波瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)的细菌的新的7β-类固醇脱氢酶(7β-hydroxsteroiddehydrogenase,7β-HSDH)的突变子、编码这些酶的序列、产生此类酶的方法，及其在胆酸化合物的酶促合成中，特别是在熊去氧胆酸(UDCA)合成中的用途；此外，本发明也包括使用突变子合成UDCA的新方法，以及UDCA的后提取方法。
背景技术：
熊去氧胆酸(I,UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，它与其相应的非对映异构体鹅去氧胆酸(II，CDCA)在临床上用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具有良好的效果。从人工养殖的熊的熊胆中提取UDCA收率低，来源有限，而且有违于动物保护，因而人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学法合成和化学酶法相结合的方法，起始原料为动物来源的胆酸(CA)或去氧胆酸(如CDCA)。
UDCA的经典化学合成方法如下。因为化学氧化是非选择性的，所以必须借助 酯化来保护3α-和7α-羟基。此外，7-酮基石胆酸(7-KLCA)的还原用到金属钠或者Pd/C催化氢化，选择性低，工业化放大生产不容易控制且不安全。
PCT/EP2009/002190里描述(如下)使用12α-类固醇脱氢酶(12α-HSDH)选择性地将胆酸(CA)氧化成12酮-去氧胆酸(12酮-CDCA)，避免了两个保护步骤，但是仍然需要7-KLCA的还原步骤。
胆酸→12-酮-CDCA→CDCA→7-KLCA→UDCA
Monti,D.,等(Advanced Synthesis&Catalysis 2009,351,1303-1311)描述了另外一种酶促转化方法。首先通过来自脆弱杆菌ATCC 25285的7α-HSDH和12α-HSDH(Tetrahedron,2006,62(18):4535-4539)将CA氧化成7，12-二酮-LCA，然后通过梭菌ATCC27555的7β-HSDH(Biochim Biophys Acta,1981,665(2):262-269)的还原而形成12-酮-UDCA，最后通过wolff-kishner还原反应获得终产物。整个反应需要三种酶的参与，以及相关辅酶的再生系统(乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶)，使得整个过程比较复杂。而且因为催化反应的平衡问题，完全转化是不可能的。
CA→7，12-二酮-LCA→12-酮-UDCA→UDCA
Hirano和Masuda描述了来自产气柯林斯菌ATCC 25986的NADP+依赖性的7β-HSDH(Appl Environ Microbiol,1982,43(5):1057-1063),但是没有公开序列信息。2007年ATCC25986基因组测序完成，2011年Rolf D.Schmid和德国细胞制药公司将此7β-HSDH基因高效表达于大肠杆菌中，鉴定了它的酶学性质并用于还原7，12-二酮-LCA或者7-KLCA获得12-酮-UDCA或者UDCA(Appl Microbiol Biotechnol,2011,90:127-135),发现此酶表现出高的选择性不会形成副产物。德国细胞制药公司在此序列基础上继续优化得到了活性提高和去除底物抑制的突变子(CN201080062617，CN201180067680),重组产生的酶7β-HSDH的高转化率和高专一性使得UDCA的酶法大规模生产成为可能。此外，华东理工大学许建和从扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques ATCC35915克隆并高效表达了其7β-HSDH基因，UDCA的酶法合成试验证明了此酶也具有与产气柯林斯菌来源的7β-HSDH相似的、对底物7KLCA的高转化率和高特异性。尽管如此，上述由不同来源的7β-HSDH催化的UDCA的合成反应，使用低的底物浓度(4～40g/L),而且在40g/L的底物浓度下转化率只有90％,产品收率仅71％；一般情况下，酶转化工艺使用100g/L或者更高底物浓度，且转化率要接近100％,才可视为具有工业化生产的意义，故表明此酶促反应离工业化大规模生产还有一定的距离。
发明内容
本发明的目的是获得来自于瘤胃菌属(Ruminococcus)，特别是活波瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)的新的7β-类固醇脱氢酶(7β-HSDH)的突变子、产生此类重组酶的发酵方法以及其在胆酸化合物的酶促合成中，特别是在熊去氧胆酸(UDCA)合成中的用途；本发明也包括使用上述酶及突变子合成UDCA的新方法和UDCA的后提取方法。
一种7β-类固醇脱氢酶的突变子，其特征在于所述突变子的氨基酸序列Seq IDNO：4，编码核苷酸序列为Seq ID NO：3；或所述突变子的氨基酸序列Seq ID NO：6，编码核苷酸序列为Seq ID NO：5。
所述的的突变子的应用，其特征在于所述的突变子用于催化底物3α-羟基 -7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA。
所述的的突变子的应用，其特征在于所述的催化底物3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA的反应，反应中所需要的辅酶由醇脱氢酶催化异丙醇而合成，从而实现辅酶的循环再生；所述的醇脱氢酶的核苷酸序列为Seq ID NO:7、氨基酸序列为Seq ID NO:8。
一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于将采用权利要求1所述的突变子催化底物3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA，同时采用权利要求3所述的醇脱氢酶及异丙醇使得辅酶循环再生。
所述的一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于获得熊去氧胆酸粗品在有机溶剂中加碱溶解、回流、过滤除去固形物以及酸化分离的获得精制成品
本发明提供的用于UDCA合成的方法示意如下：
CA→7-酮-LCA(7-KLCA)→UDCA
以来源于胆酸的氧化产物(化学法或者酶法)7-KLCA为底物，通过来自于瘤胃菌属(Ruminococcus)，特别是活波瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)的细菌的新的7β-类固醇脱氢酶(7β-HSDH)的突变子，其将7-KLCA一步直接还原成UDCA，同时使用Lactobacilluskefir来源的醇脱氢酶/异丙醇体系来实现辅酶NADP+的循环再生(如图1)。此来源的7β-HSDH突变子能高效地、专一地将高浓度底物7-KLCA转化成UDCA，从而能实现酶法UDCA合成的工业化生产。
本发明的目的是具体通过以下技术方案实现的：
1、来源于活波瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)的新的重组7β-HSDH(RUHSDH)的获得
密码子优化的来源于活波瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)的7β-HSDH基因(Genebank ID：WP004843516)被合成后(合成基因序列：Seq ID NO:1，编码蛋白序列：SeqID NO:2)，插入到表达载体pET21a(+)的NdeI和HindIII位点得到重组DNA pET21a(+)-RUHSDH。经过测序验证后，此重组DNA转入大肠杆菌宿主BL21(DE3)。获得的重组大肠杆菌接种在小体积的LB培养基(100μg/mL氨苄)中，30～37℃过夜培养后，以5-10％的接种量接入相应体积的LB培养基(100μg/mL氨苄)中，继续在30～37℃培养直至OD600达到1.0。加入终浓度为0.1～0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在25～30℃下诱导表达3～5小时后离心收集细胞。细胞悬浮于1/20发酵液体积的100mM的磷酸缓冲液(pH 8.0)并超声破碎，离心后得到重组的野生型RUHSDH粗酶液。酶活测定以去熊氧胆酸或者7-KLCA为底物,在一个3mL的反应混合物中包含:2.89mL的0.2mM NADP+或者NADPH(50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0中配制),10μL的150mM熊去氧胆酸,100μL稀释的酶液,在340nm处测定吸光值增加或者减少，酶活性单位(单位/mL)计算公式为：[△A340/分钟×3(mL)×粗酶稀释倍数]/[6.22×0.1(mL)]。
2、制备和筛选RUHSDH随机突变文库获得高活性突变子
使用易错PCR法来产生RUHSDH随机突变子。PCR反应物中额外添加了0.8-1.0mM的dCTP+dTTP和5.5-8.0mM的MgCl2来增加易错率，具体方法来源于(Frances H.Arnold的Generating Mutant Libraries Using Error-Prone PCR(Directed Evolution LibraryCreation in“Methods in Molecular Biology”,Volume 31,P3,Humana Press)。
将易错PCR产物插入到表达载体pET21a(+)的NdeI和HindIII位点，并以电转化法转入BL21(DE3)后在LB平板(100μg/mL氨苄)上得到随机突变子文库。将得到的单菌落接种到2mL 96深孔板中，每孔含200μL LB培养基(100μg/mL氨苄)，对照为含有野生型RUHSDH重组DNA的重组菌。在30～37℃，300～400转/分和80％湿度下过夜培养后，加入400μL LB培养基(100μg/mL氨苄)继续在30-37℃下振荡培养2～4小时。加入终浓度为0.1～0.2mM的IPTG后，在25～30℃下诱导3～5小时。取50μL菌液于96微孔板里制备甘油保存液-80℃保存，剩余部分离心收集细胞。每孔加入100μL的1×bugbuster(71456-3CN,EMD Millipore)溶液后在常温下振荡裂解30分钟。加入50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)稀释2～10倍后再离心得到裂解酶液。在96微孔板上上依次加入140μL 0.2mM NADPH(50mM磷酸钾缓冲液，pH 8.0中配制)，10μL上述裂解酶液和50μL 15mM的7-KLCA溶液，使用酶标仪在340nm处测定吸光值的下降(单位时间内吸光值下降多的代表活性高)。通过两轮筛选得到两个活性明显提高的突变子RU-8C2(Seq ID NO:3and 4)和突变子RU-4F9(Seq ID NO:5and 6)。突变子在LB平板(100μg/mL氨苄)上划线纯化并测序，按上述的野生型粗酶液的制备方法制备摇瓶发酵液和突变子粗酶液，用于活性测定和比较。
表一RUHSDH高效突变子的氨基酸残基变化及摇瓶发酵活性比较
3、重组7β-类固醇脱氢酶及其突变子的高密度发酵生产
将平板上单菌落接种到250～500mL LB培养基(100μg/mL氨苄)中,在30～37℃下振荡培养12～16小时。由此方法得到的种子液以5～10％的量接种到5L的起始培养基中,起始培养基含有:15～30g/L的甘油,25～30g/L的磷酸二氢钾,10～15g/L的硫酸胺,5-10g/L的七水硫酸镁,0.2～0.5g/L的七水硫酸铁。重组大肠杆菌在10L发酵罐里进行通气搅拌培养，温度30～37℃，pH 6.0～7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在15-30％。待起始培养基里的甘油耗尽后，开始流加诱导培养基(乳糖：40～50g/L，甘油：200-250g/L)诱导酶的产生。流加速度逐步增加，范围为60-250mL/小时。温度30～37℃，pH 6.0～7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在15-30％，总的诱导时间为8-12小时，直至细胞湿重达到100g/L以上。离心收集细胞，将收集到的细胞悬浮于同体积发酵液的100mM的磷酸缓冲液(pH 8.0)中并超声破碎，离心后得到重组酶液后用于酶活测定和UDCA合成。
表二RUHSDH突变子的发酵罐酶活性比较
4、用于催化辅酶再生的醇脱氢酶的发酵和酶液制备
将密码子优化的来源于Lactobacillus kefir(高加索酸奶乳杆菌)的醇脱氢酶(alcohol dehydrogenase,ADH)合成基因(合成基因序列：Seq ID NO:7，编码蛋白序列：SeqID NO:8)插入到表达载体pET21a(+)的NdeI和HindIII位点得到重组DNA pET21a(+)-LKDH。经过测序验证后，此重组DNA转入大肠杆菌宿主BL21(DE3)得到重组大肠杆菌。按照前面描述的方法进行摇瓶发酵验证和发酵罐高密度发酵生产，并用收集的细胞进行超声破碎得到醇脱氢酶(30～40单位/mL)，从而用于酶活测定和UDCA合成过程中的辅酶再生。醇脱氢酶酶活测定方法见US8257952。
5、熊去氧胆酸的酶法合成、提取和精制
将7-KLCA悬浮在15～25％反应体积的50mM磷酸钾缓冲液(pH 8.0)中，用2N NaOH调节pH至8.0。加入25％反应体积的醇脱氢酶液、20～25％反应体积的RUHSDH酶液、0.1～0.5mM NADP+和20～35％异丙醇后补充50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)至最终反应体积。底物终浓度在50～100g/L，反应在25℃、300～400rpm和pH 7.8～8.0下进行,反应时间20～24小时。每隔一定时间取样在甲醇里稀释50～100倍，微孔过滤后10μL进样液相分析。液相检测使用安捷伦C-18柱为分析柱，1mM磷酸二氢钾：乙腈＝45:55(体积比)为洗脱剂，柱温35℃，检测波长210nm。反应结束后(>99.0％转化率)，用2N NaOH调节反应液pH至产物全部溶解，然后加入0.5～1.0％硅藻土在50～60℃搅拌0.5～1小时后过滤。滤液在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2.0左右，继续搅拌20～30分钟后过滤得到熊去氧胆酸粗品。在有机溶剂如乙酸乙酯里加入25-30％(重量比)的熊去氧胆酸粗品，加热到60～70℃用碱(如三乙胺)溶解后，继续搅拌回流1～2小时。待上述溶液冷却并过滤除去固形物后，用盐酸溶液调节滤液pH至2.0左右,过滤得到的结晶真空干燥后得到精制的熊去氧胆酸。
表三RUHSDH突变子催化底物7-KLCA合成熊去氧胆酸的比较
有益效果
1、使用高效的7β-类固醇脱氢酶及其突变子酶，以及辅酶再生系统来催化合成胆酸化合物特别是熊去氧胆酸，底物浓度高达100g/L，转化率为99.2-99.5％，重量收率高达94-96％。酶可以通过发酵方法廉价易得，生产成本和产品质量优于化学合成方法，适合于工业化生产；
2、酶促反应条件温和，不使用化学法用到的金属钠或者Pd/C等催化氢化还原剂，工业化放大生产容易控制而且安全。产生的废水容易处理，环境友好；
3、酶促反应选择性高，与化学法比较副产物少，产品后提取和精制简单。
附图说明
图1对7β-类固醇脱氢酶催化下的熊去氧胆酸的合成以及醇脱氢酶催化下的辅酶NADPH的循环再生。
具体实施方式
实施例1
分别将含有重组DNA pET21a(+)-RUHSDH、pET21a(+)-RU-8C2和pET21a(+)-RU-4F9的大肠杆菌BL21(DE3)接种到含有50mL LB培养基(100μg/mL氨苄)的250mL三角摇瓶中，37℃和300转/份过夜培养后，以10％的接种量接入装有400mL LB培养基(100μg/mL氨苄)的2L摇瓶中，继续在37℃和300转/分下培养2小时直至OD600达到1.0。加入终浓度为0.2mM的IPTG，在25℃下诱导表达4小时后离心收集细胞。细胞悬浮于20mL100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中超声破碎，离心后得到重组粗酶液。RUHSDH野生型酶、突变子RU-8C2和突变子RU-4F9酶活(正向/反向)分别为：5.3/10.6单位/mL、8.5/25.6单位/mL、16.7/48.5单位/mL。
实施例2
将含有重组DNA pET21a(+)-RUHSDH的大肠杆菌BL21(DE3)平板上单菌落接种到两个装有250mL LB培养基(100μg/mL氨苄)的1L摇瓶中,在37℃和300转/分下振荡培养15小时。将两个摇瓶里的种子液合并成500mL，接种到5L的起始培养基中,起始培养基含有:30g/L的甘油,25g/L的磷酸二氢钾,10g/L的硫酸胺,10g/L的七水硫酸镁,0.4g/L的七水硫酸铁。重组大肠杆菌在10L发酵罐里进行通气搅拌培养，温度30℃，pH 7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在25％。待起始培养基里的甘油耗尽后，开始流加诱导培养基(乳糖：50g/L，甘油：200g/L)诱导酶的产生。流加速度为60-250mL/小时，在3小时内逐步达到最大流速。温度30℃，pH 7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在25％。总的诱导时间为10小时，细胞湿重达到115g/L。离心收集细胞，并于-20度保存。称取50g湿细胞，悬浮于440mL的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中并超声破碎，离心后得到RUHSDH野生型重组酶液。重组酶液酶活(正向/反向)为5.8/12.3单位/mL，酶液于-20℃保存，用于UDCA合成。
实施例3
使用和实施例2同样的方法来对含有重组DNA pET21a(+)-RU-8C2的大肠杆菌BL21(DE3)进行发酵，总的诱导时间为9小时，细胞湿重达到110g/L。离心收集细胞，并于-20℃保存。称取50g湿细胞，悬浮于450mL的100mM的磷酸缓冲液(pH 8.0)中并超声破碎，离心后得到RU-8C2突变子重组酶液。此重组酶液酶活(正向/反向)为9.8/25.2单位/mL，酶液于-20℃保存，用于UDCA合 成。
实施例4
使用和实施例2同样的方法来对含有重组DNA pET21a(+)-RU-4F9的大肠杆菌BL21(DE3)进行发酵，总的诱导时间为10小时，细胞湿重达到114g/L。离心收集细胞，并于-20℃保存。称取50g湿细胞，悬浮于440mL的100mM的磷酸缓冲液(pH 8.0)中并超声破碎，离心后得到RU-4F9突变子重组酶液。此重组酶液酶活(正向/反向)为17.0/59.0单位/mL，酶液于-20℃保存，用于UDCA合成。
实施例5
使用和实施例2同样的方法来对含有重组DNA pET21a(+)-LKDH的大肠杆菌BL21(DE3)进行发酵，总的诱导时间为10小时，细胞湿重达到120g/L。离心收集细胞，并于-20℃保存。称取50g湿细胞，悬浮于420mL的100mM的磷酸缓冲液(pH 8.0)中并超声破碎，离心后得到用于辅酶再生的醇脱氢酶重组酶液。此重组酶液酶活为36.0单位/mL，酶液于-20℃保存，用于UDCA合成过程中的辅酶再生。
实施例6
取30.6g含量为98％的7-KLCA,悬浮在100mL的100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8)中，用2N NaOH调节pH至8.0。加入150mL实施例5的醇脱氢酶液和150mL实施例2的7β-类固醇脱氢酶(RUHSDH)野生型重组酶液,用100mM磷酸二氢钾溶液调节pH至7.8。继续加入178mg辅酶NADP+二钠盐和200mL异丙醇后开始反应。总的反应体积为600mL，底物终浓度在50g/L。反应在25℃、350rpm和pH 7.8～8.0下进行,24小时后转化率为69.7％。
实施例7
取30.6g含量为98％的7-KLCA,悬浮在100mL的100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8)中，用2N NaOH调节pH至8.0。加入150mL实施例5的醇脱氢酶液和150mL实施例3的7β-类固醇脱氢酶(RUHSDH)突变子RU-8C2重组酶液,用100mM磷酸二氢钾溶液调节pH至7.8。继续加入178mg辅酶NADP+二钠盐和200mL异丙醇后开始反应。总的反应体积为600mL，底物终浓度在50g/L。反应在25℃、350rpm和pH 7.8～8.0下进行,24小时后转化率为85％。
实施例8
取30.6g含量为98％的7-KLCA,悬浮在100mL的100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8)中，用2N NaOH调节pH至8.0。加入150mL实施例5的醇脱氢酶液和150mL实施例4的7β-类固醇脱氢酶(RUHSDH)突变子RU-4F9重组酶液,用100mM磷酸二氢钾溶液调节pH至7.8。继续加入178mg辅酶NADP+二钠盐和200mL异丙醇后开始反应。总的反应体积为600mL，底物终浓度在50g/L。反应在25℃、350rpm和pH 7.8～8.0下进行,24小时后转化率为99.4％。
实施例9
取61.2g含量为98％的7-KLCA,悬浮在100mL的100mM磷酸钾缓冲液(pH 7.8) 中，用2N NaOH调节pH至8.0。加入150mL实施例5的醇脱氢酶液和150mL实施例4的7β-类固醇脱氢酶(RUHSDH)突变子RU-4F9重组酶液,用100mM磷酸二氢钾溶液调节pH至7.8。继续加入178mg辅酶NADP+二钠盐和200mL异丙醇后开始反应。总的反应体积为600mL，底物终浓度在100g/L。反应在25℃、350rpm和pH 7.8～8.0下进行,24小时后转化率为99.2％。
实施例10
取实施例8反应液，用2N NaOH调节其pH至产物全部溶解。加入1.0％硅藻土在50～60℃搅拌1小时后过滤。滤液冷却后，在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2.0左右，继续搅拌30分钟后过滤得到熊去氧胆酸粗品。在乙酸乙酯里加入上述熊去氧胆酸粗品(重量比30％)，加热到60～70℃滴加三乙胺溶解后，继续搅拌回流2小时。待上述溶液冷却并过滤除去固形物后，用盐酸溶液调节滤液pH至2.0左右,过滤得到的结晶真空干燥后得到精制的熊去氧胆酸28.3g，重量收率(从7-KLCA出发)为94.6％，经检测符合欧洲药典标准。
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<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
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<213> 高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)
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Claims (5)
1.一种7β-类固醇脱氢酶的突变子，其特征在于所述突变子的氨基酸序列为Seq IDNO:6，编码核苷酸序列为Seq ID NO:5。
2.权利要求1所述的突变子的应用，其特征在于所述的突变子用于催化底物3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA。
3.如权利要求2所述的突变子的应用，其特征在于所述的催化底物3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA的反应，反应中所需要的辅酶由醇脱氢酶催化异丙醇而合成，从而实现辅酶的循环再生:所述的醇脱氢酶的核苷酸序列为Seq ID NO:7、氨基酸序列为Seq ID NO:8。
4.一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于将采用权利要求1所述的突变子催化底物3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA，同时采用权利要求3所述的醇脱氢酶及异丙醇使得辅酶循环再生。
5.如权利要求4所述的一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于获得熊去氧胆酸粗品在有机溶剂中加碱溶解、回流、过滤除去固形物以及酸化分离，获得精制成品。
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