CN103502442A - 新的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体和制备熊去氧胆酸的方法 - Google Patents

新的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体和制备熊去氧胆酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及新的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，编码这些酶突变体的序列，制备酶突变体的方法及其在胆酸化合物的酶促反应，特别是在制备熊去氧胆酸(UDCS)中的用途；本发明也涉及使用酶突变体合成UDCS的新方法；和使用重组的，经多重修饰的微生物制备UDCS。

Description

新的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体和制备熊去氧胆酸的方法
本发明涉及新的7β-羟基类固醇脱氢酶突变体，编码这些酶突变体的序列，制备酶突变体的方法及其在胆酸化合物的酶促反应，特别是在制备熊去氧胆酸(UDCA)中的用途；本发明也涉及使用酶突变体合成UDCA的新方法；和使用重组的，经多重修饰的微生物制备UDCA。
发明背景：
多年来，活性物质熊去氧胆酸(UDCA)及相关的非对映异构体鹅去氧胆酸(CDCA)特别用于胆石病的药物治疗。这2种化合物仅在7位碳原子上的羟基构型上不同(UDCA：β-构型，CDCA：α-构型)。现有技术已描述了多种制备UDCA的方法，其通过纯化学进行，或包含化学和酶促方法步骤的组合。在每种情况下起点是胆酸(CA)或从胆酸制备的CDCA。
因此，制备UDCA的经典化学方法可图示如下：
Figure BDA0000367127010000011
其中严重的缺点如下：因为化学氧化是非选择性的，羧基和3α和7α-羟基必须通过酯化保护。
基于使用酶12α-羟基类固醇脱氢酶(12α-HSDH)的备选化学/酶促方法可示意如下，且例如在本申请人的PCT/EP2009/002190中描述。
Figure BDA0000367127010000012
12α-HSDH选择性地将CA氧化为12-酮-CDCA。于是省略了根据经典化学方法所需的2个保护步骤。
此外，Monti，D.，等人，(One-Pot Multienzymatic Synthesis of12-KetoKetoursodeoxycholic Acid：Subtle Cofactor Specificities Rule theReaction Equilibria of Five Biocatalysts Working in a Row.AdvancedSynthesis&Catalysis，2009)描述了备选的酶-化学方法，其可图示如下：
Figure BDA0000367127010000021
CA首先由来自脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)ATCC25285的7α-HSDH(zhu，D.，等人，Enzymatic enantioselective reduction of-ketoestersby a thermostable7-hydroxysteroid dehydrogenase from Bacteroides fragilis.Tetrahedron，2006.62(18)：第4535-4539页)和12α-HSDH氧化为7，12-二酮-LCA。这两种酶每者是NADH依赖的。在通过来自不同梭菌(Clostridium absonum)ATCC27555(DSM599)的7β-HSDH(NADPH依赖的)还原后(MacDonald，I.A.和P.D.Roach，Bile induction of7alpha-and7beta-hydroxysteroid dehydrogenases in Clostridium absonum.BiochimBiophys Acta，1981.665(2)：第262-9页)，形成12-酮-UDCA。通过Wolff-Kishner还原得到终产物。此方法的缺点是，由于催化反应的平衡位置，完全反应是不可能的，且对于反应第一步必须使用两种不同的酶，使得方法更昂贵。为了辅因子再生，使用乳酸脱氢酶(LDH；为了再生NAD+)和葡萄糖脱氢酶(GlcDH或GDH，为了再生NADPH)。使用辅因子再生的缺点在于从反应混合物中移除得到的联产品非常困难，因此不能正向地影响反应平衡，这导致离析物的不完全反应。
来自菌株产气柯林斯菌(Collinsella aerofaciens)ATCC25986(DSM3979；以前称为产气真杆菌(Eubacterium aerofaciens))的7β-HSDH在1982年由Hirano和Mashda(Hirano，S.和N.Masuda，Characterization ofNADP-dependent7beta-hydroxysteroid dehydrogenases fromPeptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens.Appl EnvironMicrobiol，1982.43(5)：第1057-63页)描述。此酶的序列信息未公开。通过凝胶过滤测定的分子量是45000 Da(参见Hirano，第1059页，左栏)。此外，对此酶没有观察到7-桥氧基还原为7β-羟基(参见Hirano，第1061页，讨论的第一段)。本领域技术人员因此可见，Hirano等人描述的酶不适于在7位催化脱氧胆酸(DHCA)还原至3，12-二酮-7β-CA。
申请人早先的国际专利申请PCT/EP2010/068576描述了来自产气柯林斯菌ATCC25986的新的7β-HSDH，其特别地具有(在SDS凝胶电泳中的)约28-32kDa的分子量，(在非变性条件，例如特别是无SDS条件下的凝胶过滤中)约53至60kDa的分子量，和将7-酮-LCA的7-羰基立体选择性还原为7β-羟基的能力。
另外，在PCT/EP2010/068576中，提供了制备UDCA的方法，其可图示如下：
Figure BDA0000367127010000031
在此情况下，CA的氧化仅通过经典的化学途径进行。DHCA被酶对7β-HSDH和3α-HSDH单独地连续或一起还原为12-酮-UDCA。通过与Wolff-Kishner还原组合，因此可仅用3步从CA合成UDCA。7β-HSDH依赖于辅因子NADPH，而3α-HSDH需要辅因子NADH。具有对相同辅因子的依赖性或扩展的依赖性(例如依赖辅因子NADH和NADPH)的酶对的可用性将是有利的，因为这可简化辅因子再生。
本发明要解决的问题是提供进一步改进的7β-HSDH。特别地，应提供酶突变体，所述突变体可甚至更有利地用于通过将7位处的DHCA立体特异性还原为3，12-二酮-7β-CA酶促或微生物制备UDCA，并且特别地具有降低的底物抑制和/或具有改变的辅因子利用(增加的、改变的特异性或扩展的依赖性)。
另-个问题是提供新的酶促和微生物合成途径，所述途径特别地也由在通过DHCA还原制备UDCA中的简化的辅因子再生表征。
发明概述：
出乎意料地，通过生产和表征来自柯林斯菌属(collinsella)的需氧菌，特别是菌株产气柯林斯菌的新的区域和立体特异性7β-HSDH的突变体，及其在胆酸化合物的反应中，特别是制备UDCA中的用途，解决了上述问题。
此外，通过提供生物催化(微生物或酶促)方法解决了上述问题，所述方法包括经通过7β-HSDH或3α-HSDH催化的2个部分还原步骤(其可同时进行或具有任意顺序的时间延迟)的DHCA酶促转化至12-酮-UDCA和使用脱氢酶(例如特别是甲酸脱氢酶(FDH)或葡萄糖脱氢酶(GDH))的辅因子再生，所述脱氢酶再生在2个部分还原步骤中用过的辅因子。
附图描述：
图1a显示了来自产气柯林斯菌的7β-HSDH的氨基酸序列，图1b显示了图1a的氨基酸序列的编码核酸序列；图1c显示了来自睾丸酮丛毛单胞菌(Comanomonas testosteroni)的3α-HSDH的氨基酸序列，图1d显示了图1c的氨基酸序列的编码核酸序列；图1e显示了来自褐家鼠(Rattusnorvegicus)的3α-HSDH的氨基酸序列，图1f显示了图1e的氨基酸序列的编码核酸序列；图1g显示了FDH突变体D221G的编码核酸序列，图1h显示了图1g的核酸序列编码的氨基酸序列。
图2显示了根据本发明制备的纯化7β-HSDH的SDS凝胶，第1道：细胞粗提取物；第2道：经纯化的蛋白质；M道：Page RoulerTM，分子量标记物(Fermentas，Germany)。
图3显示了(A)pET21a(+)，(B)pET22b(+)，(C)pCOLA(Mod)和(D)pET28a(+)的构建图。
图4显示了pET21a(+)FDH D221G(图4a)和pET21a(+)FDH7β-HSDH(图4b)的构建图。
图5显示了pCOLA(mod)3α-HSDH的构建图。
图6显示了7β-HSDH野生型和7β-HSDH突变体G39A和G39S的活性比较，即在A行：酶比活性对在100μM的恒定辅因子浓度下使用的不同底物浓度的图；在B行：酶比活性对在0.3mM的恒定底物浓度下使用的不同辅因子浓度的图。
图7显示了在全细胞方法中用7β-HSDH和3α-HSDH生物转化DHCS的HPLC色谱图。其显示了菌株大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+pET21a(+)FDH7β-HSDHpCOLA(mod)3α-HSDH的全细胞转化的HPLC色谱图。选择的起始条件是50mM底物，400 mM共底物，pH 6.0。在48小时后进行取样。可以看到12-酮-UDCA(1)，未知副产物(2)，3，12-二酮-UDCA(3)，7，12-二酮-UDCA(4)和DHCA(5)的峰。
图8显示了具有FDHD221G，7β-HSDHG39A和3α-HSDH的编码序列的三元载体pET21a(+)FDH7β(G39A)的构建图。
图9显示了DHCA的全细胞生物转化过程。将12-酮-UDCA，3，12-二酮-UDCA，7，12-二酮-UDCA和DHCA的成比例的峰面积(根据HPLC分析)显示为时间的函数。
图10显示了7β-HSDH野生型和选定的突变体之间的序列比较。名为“7β-HSDH野生型”，“7β-HSDHG39D”，“7β-HSDHG39DR40L”，“7β-HSDH G39D R40I”和“7β-HSDH G39D R40V”的序列对应SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39。
图11显示了7β-HSDH及其突变体的酶动力学研究。将酶比活对在0.1mM NADPH或0.5mM NADH的恒定辅因子浓度下使用的不同底物浓度(DHCA浓度)作图。
图12显示了根据本发明的脱氢胆酸至12-酮-熊去氧胆酸的2步酶促还原的示意图，其中使用NADH依赖性7β-HSDH，并且甲酸脱氢酶(FDH)用于辅因子再生。
图13显示了用于表达7β-HSDH的多种NADH依赖性突变体的载体pFr7(D)，pFr7(DI)，pFr7(DL)和pFr7(DV)的构建原理示意图。
图14显示了在使用NADH依赖性7β-HSDH突变体的生物转化批次中胆汁盐的比例。显示了在24小时处理时间后和使用100 mM底物(DHCA)的结果。
图15显示了载体pFr3T7(D)的示意图。
图16显示了使用菌株大肠杆菌BL49pFr3T7(D)的全细胞生物转化的结果，所述菌株包含NADH依赖性7β-HSDH(G39D)，NADH依赖性3α-HSDH和NADH依赖性FDH。在以下条件下进行生物转化：20mL反应体积，17.7g/lBTM细胞，100mM DHCA，500mM甲酸铵，26％甘油，50mM MgCl2，50mM KPi缓冲液(pH 6.5)。在前5小时期间以1小时的间隔用甲酸将pH手动调节至初始值。
图17显示了使用的多种载体的示意图：a)pF(G)r7(A)r3(其中此载体对应图8中显示的载体)和b)pF(G)r7(S)r3。
图18显示了脱氢胆酸至12-酮-熊去氧胆酸的2步酶促还原的示意图，其中使用NADPH依赖性7β-HSDH，并且使用再生NADPH-和NADH的甲酸脱氢酶(FDH)突变体用于辅因子再生。
图19显示了在升规模上使用菌株大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)r3的生物转化的时间分辨的变化。批次包含在50mM KPi缓冲液(pH6.5)中的70mM DHCA，17.7g/lBTM贮藏的生物催化剂，500mM甲酸钠，26％(v/v)甘油，50mM MgCl2。贯穿生物转化使用pH调节将pH维持在pH6.5。
图20显示了载体p3T7(A)rG的示意图。
图21显示了载体p7(A)T3rG的示意图。
图22显示了使用菌株大肠杆菌BL49 p7(A)T3rG的生物转化的时间分辨的变化，所述菌株包含用于辅因子再生的GDH。批次包含在50 mM KPi缓冲液(pH7)中的100mM DHCA，17.7g/lBTM贮藏的生物催化剂，500mM葡萄糖，10mM MgCl2，没有(图顶部)和有(图底部)0.1mM NAD。用氢氧化钾将pH手动调节至初始值。
图23显示了不同载体的示意图：a)载体pF(G)r7(A)和b)载体pFr3。
图24显示了使用2种不同的全细胞生物催化剂的脱氢胆酸至12-酮-熊去氧胆酸的2步酶促还原的示意图。反应A和D由含有7β-HSDH的全细胞生物催化剂催化，而反应B和C由含有3α-HSDH的全细胞生物催化剂催化。在2步反应过程中，中间体3，12-二酮-熊去氧胆酸必须从含有7β-HSDH的全细胞生物催化剂传递进入含有3α-HSDH的全细胞生物催化剂中，且中间体7，12-二酮-熊去氧胆酸必须从含有3α-HSDH的全细胞生物催化剂传递进入含有7β-HSDH的全细胞生物催化剂中。
图25显示了当使用70 mM底物(DHCA)时在24小时后生物转化批次的胆汁盐比例。显示了当使用不同比例的2种生物催化剂菌株大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和大肠杆菌BL49 pFr3时的批次。
图26显示了升规模的使用生物催化剂大肠杆菌BL49 pF(G)r7(A)和大肠杆菌BL49pFr3的生物转化的时间分辨的变化。批次含有在50mM KPi缓冲液(pH6.5)中的90mM DHCA，8.85g/lBTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和8.85g/lBTM大肠杆菌BL49pFr3，500mM甲酸铵，26％(v/v)甘油，50mM MgCl2。贯穿生物转化使用pH调节用甲酸将pH维持在pH 6.5。
发明的特别实施方案
本发明特别涉及以下特别实施方案：
1.7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)突变体，其至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，其中较之未突变的酶，例如特别是包含SEQ ID NO：2和/或至少包含根据其第36至42位的序列基序VMVGRRE的酶，所述突变体具有降低的底物抑制(特别是对7-酮类固醇底物)；和/或改变的辅因子利用(例如增加、改变的关于辅因子(特别是NADH或NADPH)的特异性)或扩展的依赖性，即利用以前没有用过的另外的辅因子)。
2.根据实施方案1的突变体，所述突变体对7-酮类固醇底物，特别是脱氢胆酸(DHCA)不展示任何底物抑制，或具有在从＞10mM的范围内的，例如11至200mM，12至150mM，15至100mM的Ki值。
3.根据前述实施方案之一的突变体，其中较之未突变的酶，在存在辅因子NADPH时，比活性(U/mg)提高或降低至少1，5或10％，但特别地至少1倍，特别地2-10倍；或基本缺乏且被替换为NADH利用，或具有扩展的NADPH和HADH利用。
4.7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)突变体，其至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，任选地根据前述实施方案之一，其中所述突变体在根据SEQ ID NO：2的氢基酸序列或从其衍生的与此序列具有至少60％序列同一性，例如至少65，70，75，80，85或90，例如至少91，92，93，94，95，96，97，98，99或99.5％序列同一性的氨基酸序列中具有至少一个突变。
5.7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)突变体，其至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，任选地根据前述实施方案之一，其中所述突变体在根据SEQ ID NO：2的第36至42位的序列基序VMVGRRE中或从其衍生的与此序列具有至少60％序列同一性，例如至少65，70，75，80，85或90，例如至少91，92，93，94，95，96，97，98，99或99.5％序列同一性的氨基酸序列的对应序列基序中具有至少一个突变。
6.根据实施方案4或5的突变体，其选自
a)单突变体G39X1和R40X2，
b)双突变体(G39X1，R40X2)，(R40X2，R41X3)和(G39X1，R41X3)或
c)三突变体(G39X1，R40X2，R41X3)，
(在每种情况下相对于SEQ ID NO：2)
其中在每种情况下X1，X2和X3彼此独立地代表与G或R不同的任意氨基酸，特别是任意的，特别是天然的氨基酸，其降低底物抑制和/或改变辅因子利用或辅因子依赖性；
或
d)源自SEQ ID NO：2的与此序列具有至少60％序列同一性，例如至少65，70，75，80，85或90，例如至少91，92，93，94，95，96，97，98，99或99.5％序列同一性的氨基酸序列的对应的单、双或三突变体。
合适的单突变体实例包括：G39A，G39S，G39D，G39V，G39T，G39P，G39N，G39E，G39Q，G39H，G39R，G39K和G39W，和R40D，R40E，R40I，R40V，R40I，R40G，R40A。
合适的双突变体实例包括：
上述G39X1和R40X2突变体的双组合，其中X1特别代表D或E和/或X2可为任意氨基酸，特别是蛋白氨基酸，例如特别是具有脂肪族侧链的氨基酸，例如(G39D，R40I)，(G39D，R40L)，(G39D，R40V)；和用G39E代替G39D的类似的双突变体；和
上述G39X1突变体或R40X2突变体与R41X3突变体的双组合，其中X3为与R不同的任意氨基酸，特别是天然氨基酸，其降低底物抑制和/或改变辅因子利用或辅因子依赖性，例如(G39X1，R41X3)或(R40X2，R41X3)型，
例如X1＝D或E；X2＝I，L或V；X3＝N，I，L或V)
例如(R40D，R41I)；(R40D，R41L)；(R40D，R41V)；(R40I，R41I)；(R40V，R41I)，(R40L，R41I)。
合适的三突变体的实例包括上述单突变体G39X1，R40X2和R41X3的任意三重组合；其中X1，X2和X3定义如上；但特别地，其中X1代表D，或E和/或X2和X3彼此独立地代表任意氨基酸，特别是蛋白氨基酸，例如特别是(G39X1＝D或E；R40X2＝I，L或V；R41X3＝N，I，L或V)型的三突变体，例如(G39D，R40I，R41N)。
任选地，实施方案1至6的突变体可另外或备选地，特别是另外地具有至少一个其他取代，例如在位置K44，R53，K61和R64处的1，2，3或4个取代。在此情况下，这些残基可彼此独立地被任意氨基酸，特别是蛋白氨基酸，特别是下述取代替换，所述取代使得到的突变体具有如本文定义的降低的底物抑制(特别是对7-酮类固醇底物)；和/或具有改变的辅因子利用或辅因子依赖性(例如增加的、改变的关于辅因子的特异性或扩展的依赖性，即利用以前没有使用过的另外的辅因子)。
7.编码根据前述实施方案之一的7β-HSDH突变体的核酸序列。
8.表达盒，其包含在至少一个调节核酸序列的基因控制下的根据实施方案7的核酸序列，和任选地至少一种(例如1，2或3种)另外的酶的编码序列，所述酶选自羟基类固醇脱氢酶，特别是3α-HSDH，和适于辅因子再生的脱氢酶，例如FDH，GDH，ADH，G-6-PDH，PDH。特别地，表达盒中含有的酶可使用不同的，但优选相同的辅因子对，例如辅因子对NAD+/NADH或NADP+/NADPH。
9.载体，其包含至少一种根据实施方案8的表达盒。
10.重组微生物，其具有至少一种根据实施方案7的核酸序列或至少一种根据实施方案8的表达盒或具有至少一种根据实施方案9的载体和额外地，任选地具有3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSDH)的编码序列。
11.用于7β-羟基类固醇的酶促或微生物合成的方法，其中在存在根据实施方案1至6之一定义的7β-HSDH突变体时，或在存在根据实施方案10的表达此突变体的重组微生物时，使对应的7-酮类固醇起反应，且任选地从反应混合物中分离至少一种得到的还原产物。
12.根据实施方案11的方法，其中所述待还原的酮类固醇选自
a)脱氢胆酸(DHCA)，
b)7-酮-石胆酸(7-酮-LCA)，
c)7，12-二酮-石胆酸(7，12-2酮-LCA)和
d)其衍生物，例如特别是所述酸的盐、酰胺或烷基酯。
13.根据实施方案11和12之一的方法，其中所述还原在存在(和消耗)NADPH和/或NADH时进行。
14.用于7β-羟基类固醇的酶促或微生物氧化的方法，其中在存在根据实施方案1至6之一定义的7β-HSDH突变体时，或在存在根据实施方案10的表达此突变体的重组微生物时，使羟基类固醇起反应，且任选地从反应混合物中分离得到的氧化产物。
15.根据实施方案14的方法，其中所述7β-羟基类固醇是3，12-二酮-7β-CA或其衍生物，例如特别是盐、酰胺或烷基酯。
16.根据实施方案14和15之一的方法，其中所述氧化在存在(和消耗)NADP+和/或NAD+时进行。
17.根据实施方案13和16之一的方法，其中通过化学、电化学或酶促再生用过的氧化还原等同物，特别是在原位再生。
18.根据实施方案17的方法，其中通过与NADPH再生酶偶联再生用过的NADPH，其中所述NADPH再生酶特别选自NADPH脱氢酶、醇脱氢酶(ADH)、和NADPH再生甲酸脱氢酶(FDH)、和葡萄糖脱氢酶(GDH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PDH)，或亚磷酸盐脱氢酶(PtDH)，其中所述NADPH再生酶任选地通过重组微生物表达；或
其中通过与NADH再生酶偶联再生用过的NADH，其中所述NADH再生酶特别选自NADH脱氢酶、NADH再生甲酸脱氢酶(FDH)、NADH再生醇脱氢酶(ADH)、NADH再生葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、NADH再生亚磷酸盐脱氢酶(PtDH)和NADH再生葡萄糖脱氢酶(GDH)，其中所述NADH再生酶任选地在重组微生物中表达。
优选在重组微生物中表达辅因子再生酶。
19.根据实施方案18的方法，其中所述NADPH再生酶选自天然或重组的、分离或富集的
a)醇脱氢酶(EC1.1.1.2)和
b)从其衍生的功能等同物。
20.根据实施方案18的方法，其中所述NADPH再生酶选自NAD+依赖性甲酸脱氢酶(FDH)的突变体，所述甲酸脱氢酶特别地至少催化甲酸至CO2的酶促氧化，其中较之未突变的酶，所述突变体专有地或另外地，特别是另外地，接受NADP+作为辅因子；或
其中所述NADH再生酶选自NAD+依赖性FDH或NAD+依赖性GDH，例如特别是根据SEQ ID NO：36的来自母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)N10的FDH，和根据SEQ ID NO：48的来自枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的GDH(其再生NADPH和/或NADH)或在每种情况下与2种所述酶功能等价(关于辅因子再生)的其经修饰的形式。
21.根据实施方案20的方法，其中所述FDH突变体以这样的比活将NADPH的还原为NADP+，所述比活对应未突变的(野生型)酶将NAD+还原为NADH的比活的约0.1至1000％，例如1至100％，5至80％或10至50％。
22.根据实施方案20和21之一的方法，其中所述NADP+接受FDH突变体在根据SEQ ID NO：36的来自母牛分枝杆菌N10的FDH的氨基酸序列或从其衍生的与此序列具有至少60％序列同一性，例如至少65，70，75，80，85或90，例如至少91，92，93，94，95，96，97，98，99或99.5％序列同一性的氢基酸序列中具有至少一个突变。
23.根据实施方案20至22之一的方法，其中所述NADP+接受突变体在根据SEQ ID NO：36的位置221至226的序列基序TDRHRL中或在从其衍生的与此序列具有至少60％序列同一性，例如至少65，70，75，80，85或90，例如至少91，92，93，94，95，96，97，98，99或99.5％序列同一性的氨基酸序列的对应序列基序中具有至少一个突变。
可能的合适FDH突变体的非限制性实例包含在SEQ ID NO：36的位置D222和/或R223处的突变。作为实例，我们可提到D222X，其中X＝G，A，K或N；和R223X，其中X＝H或Y，和在位置222和223处的突变的组合。
24.根据实施方案20至23之一的方法，其中所述NADP+接受突变体选自根据SEQ ID NO：36的单突变体D222G(本文中也更经常称为“D221G”突变体(从SEQ ID NO：36的第2位Ala作为第一个氨基酸开始计数)或从其衍生的与此序列具有至少60％序列同一性，例如至少65，70，75，80，85或90，例如至少91，92，93，94，95，96，97，98，99或99.5％序列同一性的氨基酸序列的对应的单突变体。作为具体的实例，我们可提到根据SEQ ID NO：15，19和35的FDH突变体。
从可从例如博伊丁假丝酵母(Candida boidinii)或假单胞菌属物种(Pseudomonas sp)分离的野生型酶开始，并插入至少一个对应上述用于改变辅因子特异性的突变的功能突变，可获得其他合适的FDH酶。此外，现有技术中已有大量研究用于提高多种FDH性能，例如化学或热稳定性或催化活性。这些总结在例如Tishkov等人，Biomolecular Engineering 23(2006)，89-110中。因此，可将其中描述的例如用于增加酶稳定性的单或多点突变与根据本发明描述的用于修饰的辅因子利用的突变组合。
25.核酸序列，其选自以下核酸序列：a)同时编码根据实施方案22至24之一的FDH突变体和根据实施方案1至6之一的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH；或b)同时编码根据实施方案22至24之一的FDH突变体和未突变的7β-HSDH和任选地3α-HSDH；或c)编码包含根据实施方案22至24之一的FDH突变体和根据实施方案1至6之一的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH的融合蛋白；或d)编码包含根据实施方案22至24之一的FDH突变体和未突变的7β-HSDH和任选地3α-HSDH的融合蛋白，e)同时编码FDH野生型和根据实施方案1至6之一的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH；或f)编码包含FDH野生型，根据实施方案1至6之一的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH的融合蛋白；g)同时编码GDH、7β-HSDH野生型和任选地3α-HSDH；h)编码包含GDH、7β-HSDH野生型和任选地3α-HSDH的融合蛋白；i)同时编码GDH、根据实施方案1至6之一的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH；和k)编码包含GDH、根据实施方案1至6之一的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH的融合蛋白；其中所述编码序列可彼此独立地单个或多个(例如以2，3，4，5或6至10个拷贝)包含在构建体中。通过选择合适的拷贝数，可补偿在个体表达产物中任选地出现的活性差异。
26.表达盒，其包含在至少一个调节核酸序列的基因控制下的根据实施方案25的核酸序列，其中所述编码序列可彼此独立地单个或多个(例如以2，3，4，5或6至10个拷贝)包含在构建体中。通过选择合适的拷贝数，可补偿在个体表达产物中任选地出现的活性差异。
27.载体，其包含至少一种根据实施方案26的表达盒，其中所述编码序列可彼此独立地单个或多个(例如以2，3，4，5或6至10个拷贝)包含在构建体中。通过选择合适的拷贝数，可补偿在个体表达产物中任选地出现的活性差异。
28.重组微生物，其具有至少一种根据实施方案25的核酸序列或至少一种根据实施方案27的表达盒或具有至少一种根据实施方案28的载体。
29.重组微生物，其能够同时表达7β-HSDH(野生型)、NADP+接受FDH突变体和/或对应的FDH野生型和任选地3α-HSDH；或其能够同时表达7β-HSDH(野生型)、本文描述的GDH和任选地本文描述的3α-HSDH。
30.重组微生物，其能够同时表达7β-HSDH突变体、NADP+接受FDH突变体和/或对应的FDH野生型和任选地3α-HSDH；或其能够同时表达7β-HSDH突变体、本文描述的GDH和任选地本文描述的3α-HSDH。
31.根据实施方案30的重组微生物，其中所述7β-HSDH突变体是根据实施方案1至6之一的突变体。
32.根据实施方案29或30的重组微生物，其中所述FDH突变体是根据实施方案20至24之一中的定义的突变体；且其中所述FDH野生型是根据SEQ ID NO：36的来自母牛分枝杆菌N10的FDH或从其衍生的与此序列具有至少60％序列同一性，例如至少65，70，75，80，85或90，例如至少91，92，93，94，95，96，97，98，99或99.5％序列同一性的FDH。
33.根据实施方案29或30的重组微生物，其中所述3α-HSDH是这样的酶，所述酶包含根据SEQ ID NO：6或8或22的氨基酸序列或从其衍生的与此序列具有至少60％序列同一性，例如至少65，70，75，80，85或90，例如至少91，92，93，94，95，96，97，98，99或99.5％序列同一性的氨基酸序列。
34.根据实施方案29至33之一的重组微生物，其具有在一个或多个(不同)表达构建体上的7β-HSDH，FDH和3α-HSDH的编码序列。因此，本发明涉及用单质粒系统修饰(例如转化)的重组微生物，所述单质粒系统具有1个或多个拷贝，例如2，3，4，5，或6至10个拷贝的7β-HSDH或其突变体，FDH或其突变体和3α-HSDH或其突变体的编码序列。本发明因此也涉及用单质粒系统修饰(例如转化)的重组微生物，所述单质粒系统具有1个或多个拷贝，例如2，3，4，5，或6至10个拷贝的7β-HSDH或其突变体、GDH或其突变体和3α-HSDH或其突变体的编码序列。然而，酶(7β-HSDH，FDH和3α-HSDH或其突变体)也可以以1个或多个拷贝包含在2或3个单独的、互相兼容的质粒上。用于制备单质粒系统和多拷贝质粒的合适的基础载体是本领域技术人员已知的。作为实例，我们可提到例如用于单质粒系统的pET21a，和例如用于多拷贝质粒的Novagen公司销售的duet载体，例如pACYCDuet-1，pETDuet-1，pCDFDuet-1，pRSFDuet-1和pCOLADuet-1。在例如Novagen公司的“用户手册TB340Rev.E0305”中提供了此类载体，它们与其他载体的相容性和微生物宿主菌株。
根据本发明的教导，本领域技术人员可无需过度努力实施用于生成质粒系统的酶的最佳组合。因此，本领域技术人员可以，例如，取决于在每种情况下使用的7β-HSDH酶的辅因子特异性，从上述脱氢酶，特别是FDH、GDH和其各自的突变体中选择最适于辅因子再生的酶。
此外，存在这样的可能性，即将选定的用于反应的酶分配在2个或多个质粒上，并使用得到的质粒生产2种或多种不同的重组微生物，然后将所述重组微生物一起用于根据本发明的生物催化反应。也可特别地应用用于制备质粒的特别的酶组合，指明可比较的辅因子利用。例如，可用下述质粒修饰第一微生物，所述质粒具有NADPH依赖性7β-HSDH突变体和根据本发明的再生此辅因子的FDH突变体的编码序列，或具有NADPH依赖性7β-HSDH突变体和NADPH再生GDH的编码序列，或NADH依赖性7β-HSDH和NADH再生FDH和/或GDH的编码序列。相反地，可用下述质粒修饰第二微生物，所述质粒具有NADH依赖性3α-HSDH的编码序列和NADH再生FDH野生型和/或NADH再生GDH的编码序列。然后可同时使用两种微生物用于根据本发明的生物催化反应。
使用2种单独的生物催化剂(重组微生物)与仅使用其中表达所有合成酶的一种生物催化剂相比可提供2个基本优势：
a)2种生物催化剂可彼此独立地进行基因修饰和优化。特别地可以使用不同的辅因子再生酶，所述酶被优化用于NADH再生或NADPH再生。
b)对生物催化剂而言，可以以不同比例使用生物催化剂。这允许干预生物催化期间多酶过程的单个反应速率，甚至在所有生物催化剂都已制备完以后。
出乎意料地，在本发明上下文中也能显示，使用2种生物催化剂所必需的待反应物质的额外的膜转运步骤对反应速率影响很少或没有影响，因此这些推测的不利方面被双细胞系统的优势克服。
35.制备式(1)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法
其中
R代表烷基、NR1R2、H、碱金属离子或N(R3)4 +，其中残基R3可为相同或不同的，并代表H或烷基。
其中
a)任选地将式(2)的胆酸(CA)
Figure BDA0000367127010000162
其中R具有上文给出的含义，化学氧化为式(3)的脱氢胆酸(DHCA)，
Figure BDA0000367127010000163
其中R具有上文给出的含义；
b)在存在至少一种根据实施方案1至6之一中的定义的7β-HSDH突变体时(作为分离的酶存在或由对应的重组微生物表达)和存在至少一种3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSDH)时(作为分离的酶存在或由对应的重组微生物表达)将DHCA还原为对应的式(5)的12-酮-熊去氧胆酸(12-酮UDCA)
其中R具有上文给出的含义，(存在并消耗NADH和/或NADPH)，然后
d)将式(5)的12-酮-UDCA化学还原为UDCA；和
e)任选地进一步纯化反应产物。
可不同地配制方法步骤b)。2种酶(7β-HSDH突变体和3α-HSDH)可同时存在(例如一锅反应，存在2种分离的酶或表达两种酶的一种或多种对应的重组微生物)，或以任意顺序进行部分反应(首先是7β-HSDH突变体催化的还原，并然后是3α-HSDH催化的还原；或首先是3α-HSDH催化的还原，并然后是7β-HSDH突变体催化的还原)。
因此制备式(1)的UDCA的方法变体可例如如下：
a)任选地化学氧化式(2)的胆酸(CA)；
b)在存在至少一种根据实施方案1至6之一中的定义的7β-HSDH突变体时(作为分离的酶存在或由对应的重组微生物表达)将DHCA还原为式(4)的3，12-二酮-7β-胆烷酸(3，12-二酮-7β-CA)
Figure BDA0000367127010000172
(存在并消耗NADPH和/或NADH)，
c)在存在至少一种3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSDH)时(作为分离的酶存在或由对应的重组微生物表达)将3，12-二酮-7β-CA还原为对应的式(5)的12-酮-熊去氧胆酸(12-酮UDCA)
Figure BDA0000367127010000181
其中R具有上文给出的含义，(存在和消耗NADH和/或NADPH，取决于使用的3α-HSDH)，并然后
d)将式(5)的12-酮-UDCA化学还原为UDCA；和
e)任选地进一步纯化反应产物。
36.根据实施方案35的方法，其中在存在本文描述的一种或多种重组微生物，例如至少一种根据实施方案10的微生物时进行步骤b)和c)。
37.根据实施方案35或36的方法，其中步骤b)和/或c)与相同或不同的辅因子再生系统(作为分离的酶存在或由对应的重组微生物表达)偶联。
38.根据实施方案37的方法，其中步骤b)与辅因子再生系统偶联，其中通过根据实施方案20至24之一中的定义的NADP+接受FDH突变体再生NADPH并消耗甲酸或其盐；或与辅因子再生系统偶联，其中通过ADH再生NADPH并消耗异丙醇；或与辅因子再生系统偶联，其中通过GDH再生NADPH并消耗葡萄糖；或与辅因子再生系统偶联，其中通过NADH再生GDH，ADH或FDH再生用过的NADH。
39.根据实施方案37或38的方法，其中步骤c)与辅因子再生步骤偶联，其中通过根据实施方案20至24之一中的定义的NADP+接受FDH突变体再生NADPH并消耗甲酸或其盐；或其中步骤c)与辅因子再生步骤偶联，其中通过根据实施方案20至24之一中的定义的NADH再生FDH突变体或通过未突变的FDH再生NADH并消耗甲酸或其盐，或通过NADH再生GDH再生NADH并消耗葡萄糖。
40.式(1)的熊去氧胆酸(UDCA)的微生物制备方法
Figure BDA0000367127010000191
其中
R代表烷基、NR1R2、H、碱金属离子或N(R3)4 +，其中残基R3可为相同或不同的并代表H或烷基，
其中
a)任选地将式(2)的胆酸(CA)
Figure BDA0000367127010000192
化学氧化为式(3)的脱氢胆酸(DHCA)，其中R具有上文给出的含义，
Figure BDA0000367127010000193
其中R具有上文给出的含义；
b)在存在至少一种7β-HSDH和存在至少一种3α-HSDH时将DHCA还原为对应的式(5)的12-酮-熊去氧胆酸(12-酮UDCA)
Figure BDA0000367127010000201
其中R具有上文给出的含义，(存在并消耗NADH和/或NADPH)，然后
c)将式(5)的12-酮-UDCA化学还原为UDCA；和
d)任选地进一步纯化反应产物；
其中通过微生物，即在存在一种或多种不同的根据实施方案28或29至34之一的重组微生物的全细胞时，进行步骤b)的反应，其中一种或多种微生物以在本文中更详细描述的方式携带用于反应和辅因子再生所必需的酶，或使用至少一种根据实施方案25的核酸序列。
例如，可在存在至少一种7β-HSDH或其突变体时将DHCA还原为式(4)的3，12-二酮-7β-胆烷酸(3，12-二酮-7β-CA)
Figure BDA0000367127010000202
(存在并消耗NADPH)，和
可在存在至少一种3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSDH)或其突变体时将3，12-二酮-7β-CA还原为对应的式(5)的12-酮-熊去氧胆酸(12-酮UDCA)
Figure BDA0000367127010000203
其中R具有上文给出的含义，(存在和消耗NADH和/或NADPH)。
然而此外也可设想反应顺序，包括首先用3α-HSDH还原DHCA并随后用7β-HSDH还原得到的反应产物，以及基于2种HSDH的同时存在同时进行2种反应顺序。
41.根据实施方案40的方法，其中使用一种或多种，特别是一种根据实施方案29至34之一的重组微生物，其例如同时表达至少一种根据实施方案1至6之一的7β-HSDH突变体，至少一种根据实施方案20至24之一的NADP+接受FDH突变体和至少一种3α-HSDH，例如特别是根据SEQ ID NO：6，8或22的3α-HSDH或具有至少约60％序列同一性的其突变体；或其同时表达至少一种根据实施方案1至6之一的7β-HSDH突变体，至少一种GDH和至少一种3α-HSDH，例如特别是根据SEQ ID NO：6，8或22的3α-HSDH或具有至少约60％序列同一性的其突变体。
42.实施根据实施方案35至41之一的方法的生物反应器，其特别包含至少一种酶(7β-HSDH，FDH和/或3α-HSDH或其突变体；或7β-HSDH，GDH和/或3α-HSDH或其突变体)或重组表达至少一种这些酶的重组微生物，特别是以固定的形式。
本发明不限于此处描述的具体实施方案。恰恰相反，通过本发明的教导，本领域技术人员将能够无需过度努力地提供本发明的其他配置。技术人员也可例如有目的地生产其他酶突变体并筛选和优化具有期望性能谱(改进的辅因子依赖性和/或稳定性，降低的底物抑制)的这些酶突变体；或分离其他的合适的野生型酶(7β-和3α-HSDH，FDH，GDH ADH等)并根据本发明使用它们。此外，例如取决于使用的HSDH，例如特别是7β-HSDH和3α-HSDH或其突变体的性能谱(特别是辅因子依赖性)，技术人员可选择可用于辅因子再生的合适的脱氢酶(GDH，FHD，ADH等、)及其突变体，并将选定的酶分配到一种或多种表达构建体或载体上，并因此如有必要，生产一种或多种重组微生物，然后使经优化的基于全细胞的生产方法成为可能。
本发明的进一步配置
1．使用的一般定义和缩写
除非另外规定，术语“7β-HSDH”表示脱氢酶，其至少催化DHCA或7，12-二酮-3α-CA(7，12-二酮-LCA)还原为3，12-二酮-7β-CA或12-酮-UDCA的立体特异性和/或区域特异性，特别地消耗NADPH，和任选地相应的逆反应。酶可为天然的或重组生产的酶。酶可基本上与细胞杂质，例如蛋白质杂质混合，但优选为纯的形式。合适的检测方法在例如下文提供的实施例章节中描述，或可从文献中获得(例如Characterization ofNADP-dependent7beta-hydroxysteroid dehydrogenases fromPeptostreptococcus productus and Eubacterium aerofaciens.S Hirano和NMasuda.Appl Environ Microbio1.1982)。具有此活性的酶被归类在EC号1.1.1.201下。
除非另外规定，术语“3α-HSDH”表示脱氢酶，其至少催化3，12-二酮-7β-CA或DHCA立体特异性和/或区域特异性还原为12-酮-UDCA或7，12-二酮-3α-CA(7，12-二酮-LCA)，特别地化学计量消耗NADH和/或NADPH，和任选地相应的逆反应。合适的检测方法在例如下文提供的实施例章节中描述，或可从文献中获得。合适的酶可从例如睾丸酮丛毛单胞菌(例如ATCCll996)中获得。也可使用例如已知来自啮齿动物的NADPH依赖性3a-HSDH。(Cloning and sequencing of the cDNA for rat liver 3α-hydroxysteroid/dihydrodiol dehydrogenase，J E Pawlowski，M Huizinga和T M Penning，May 15，1991，The Journal of Biological Chemistry，266，8820-8825、)。具有此活性的酶被归类在EC号1.1.1.50下。
除非另外规定，术语“GDH"表示脱氢酶，其至少催化β-D-葡萄糖氧化为D-葡萄糖酸内酯，化学计量消耗NAD+和/或NADP+，和任选地相应的逆反应。合适的酶可从例如枯草芽孢杆菌或巨大芽胞杆菌(Bacillusmegaterium)中得到。具有此活性的酶被归类在EC号1.1.1.47下。除非另外规定，术语“FDH”表示脱氢酶，其至少催化甲酸(或对应的甲酸盐)氧化为二氧化碳，化学计量消耗NAD+和/或NADP+，和任选地相应的逆反应。合适的检测方法在例如下文提供的实施例章节中描述，或可从文献中获得。合适的酶可从例如博伊丁假丝酵母、假单胞菌属物种或母牛分枝杆菌中得到。具有此活性的酶被归类在EC号1.2.1.2下。
根据本发明将“纯的形式”或“纯的”或“基本纯的”酶理解为相对总蛋白质含量具有超过80，优选超过90，特别地超过95，和最特别地超过99 wt％纯度的酶，所述纯度通过检测蛋白质的常规方法测定，例如双缩脲法或根据Lowry等人的蛋白质检测(参见R.K.Scopes，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin(1982)中的描述)。
“氧化还原等同物”指可用作电子供体或电子接受体的低分子量有机化合物，例如烟酰胺衍生物，例如NAD+和NADH+或其各自的还原形式NADH和NADPH。在本发明上下文中，将“氧化还原等同物”和“辅因子”用作同义词。因此，在本发明的意义上，“辅因子”也可被描述为“能够氧化还原的辅因子”，即可以还原和氧化形式存在的辅因子。
将“用过的”辅因子理解为辅因子的还原或氧化的形式，其在底物的指明的还原或氧化反应的过程中被转化为相应的氧化或还原的形式。通过再生，将反应中形成的氧化或还原的辅因子转变回还原或氧化的初始形式，因此其可再次用于底物的反应。
在本发明上下文中将“改变的辅因子利用”理解为相比参考的定性或定量变化。特别地，可通过进行氨基酸序列突变观察改变的辅因子利用。然后可测定相比未突变的初始酶的此变化。此外，与特定辅因子相关的活性可通过进行突变增加或减少，或可被完全阻止。然而，改变的辅因子利用也包括这样的改变，所述改变使得现在可利用不同于第一辅因子的至少另一种第二辅因子(即存在扩展的辅因子利用)而非对个体辅因子的特异性的利用。然而相反地，可改变原来存在的利用2种不同辅因子的能力，使得仅增加对于这些辅因子之一或仅减少对于这些辅因子之一的特异性或完全消除特异性。例如，由于辅因子利用的改变，依赖于辅因子NAD(NADH)的酶现在可依赖于NAD(NADH)和辅因子NADP(NADPH)，或原来对于NAD(NADH)的依赖性可完全被转化为对于NADP(NADPH)的依赖性，反之亦然。
除非另外规定，根据本发明广义地解释术语“NAD+/NADH依赖性”或“NADP+/NADPH依赖性”。这些术语包含“特异性”依赖性，即专一地依赖于NAD+/NADH或NADP+/NADPH，以及根据本发明使用的酶对这2种辅因子的依赖性，即依赖于NAD+/NADH和NADP+/NADPH二者。
这相应地适用于术语“NAD+/NADH接受”或“NADP+/NADPH接受”。
除非另外规定，根据本发明广义地解释术语“NAD+/NADH再生”或“NADP+/NADPH再生”。这些术语包含“特异性”即专一地再生用过的辅因子NAD+/NADH或NADP+/NADPH的能力，和再生这2种辅因子，即NAD+/NADH和NADP+/NADPH的能力二者。
“蛋白质”氨基酸特别包含(单字母编码)：G，A，V，L，I，F，P，M，W，S，T，C，Y，N，Q，D，E，K，R和H。
根据本发明，“固定”表示根据本发明使用的生物催化剂，例如7β-HSDH在固体(即基本不溶于周围的液体介质)载体材料上的共价或非共价结合。根据本发明，也可相应地通过此类载体固定全细胞，例如根据本发明使用的重组微生物。
“相比未突变的酶减少的底物抑制”表示不再观察到使用特别底物的未突变的酶观察到的底物抑制，即基本不再测得到，或仅在较高的底物浓度上出现，即Ki值增加。
“胆酸化合物”表示根据本发明的这样的化合物，所述化合物具有胆酸的碳骨架结构，特别是类固醇结构，并在环的7位和任选地环的3和/或12位存在酮和/或羟基或酰氧基。
特别类型的化合物，例如“胆酸化合物”或“熊去氧胆酸化合物”特别地也表示基础初始化合物(例如胆酸或熊去氧胆酸)的衍生物。
所述衍生物包含“盐”，例如化合物的碱金属盐，例如锂、钠和钾盐；和铵盐，其中铵盐包含NH4 +盐或下述铵盐，其中至少一个氢原子可被C1-C6烷基残基取代。典型的烷基残基特别地是C1-C4烷基残基，例如甲基，乙基，正或异丙基，正、仲或叔丁基和正戊基和正己基及其单或多分支的类似物。
根据本发明的化合物的“烷基酯”特别地是低烷基酯，例如C1-C6烷基酯。作为非限制性实例，我们可提到甲基，乙基，正或异丙基，正、仲或叔丁基酯，或长链酯，例如正戊基和正己基酯及其单或多分支的类似物。
“酰胺”特别地是根据本发明的酸与氨或一级或二级单胺的反应产物。此类胺为例如单或双C1-C6烷基单胺，其中烷基残基可任选地彼此独立地被进一步取代为例如羧基、羟基、卤素(例如F，Cl，Br，I)、硝基和磺酸基。
根据本发明的“酰基，，特别地是具有2至4个碳原子的非芳香基，例如乙酰基、丙酰基和丁酰基，和具有任选地经取代的单核芳香环的芳香基，其中合适的取代基选自例如羟基、卤素(例如F，Cl，Br，I)、硝基和C1-C6烷基，例如苯甲酰或甲苯酰。
可以立体异构纯的形式或在与根据本发明的方法或由其得到的其他立体异构体的混合物中使用根据本发明使用或制备的羟基类固醇化合物，例如胆酸、熊去氧胆酸、12-酮-鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸和7-酮-石胆酸。然而，优选地，以基本上立体异构纯的形式使用和分离使用和制备的化合物。
下表提供了重要化学化合物的结构式、化学名称和缩写：
Figure BDA0000367127010000261
Figure BDA0000367127010000271
Figure BDA0000367127010000281
2.蛋白质
本发明不局限于具体公开的具有7β-HSDH，FDH，GDH或3α-HSDH活性的蛋白质或酶或其突变体，而是也扩展至其功能等同物。
在本发明上下文中，具体公开的酶的“功能等同物，，或类似物是与所述酶不同，但仍然具有合乎要求的生物活性，例如7βHSDH活性的多肽。
例如，应将“功能等同物”理解为这样的酶，其在7β-HSDH，FDH，GDH或3α-HSDH活性的测试中具有比包含本文定义的氨基酸序列的初始酶高或低至少1％，例如至少10％或20％，例如至少50％或75％或90％的活性。
另外，功能等同物优选地在pH4至11的范围内稳定，并有利地具有在pH6至10，例如特别是8.5至9.5范围内的最适pH，和在15℃至80℃或20℃至70℃，例如约45至60℃或约50至55℃范围内的最适温度。
可使用多种已知测试检测7β-HSDH活性。我们可提到如在实验章节中定义的标准化的条件下使用参考底物，例如CA或DHCA的测试，但不限于此。
测定FDH，GDH或3α-HSDH活性的测试也是本身已知的。
根据本发明的“功能等同物”也特别地表示“突变体”，所述突变体在上述氨基酸序列的至少一个序列位置处具有不同于具体陈述的氨基酸的氨基酸，但仍然具有上述生物学活性中的一种。因此“功能等同物”包含通过一个或多个，例如1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14或15个氨基酸添加、替换、缺失和/或倒置可得到的突变体，其中所述变化可发生在任意序列位置处，只要它们导致突变体具有根据本发明的性能谱。当突变体和未改变的多肽之间的反应模式定性地一致时(即例如以不同速率转变相同底物)，特别地也可得到功能等价性。合适的氨基酸替换的实例显示在下表中：
Figure BDA0000367127010000291
Figure BDA0000367127010000301
上述意义上的“功能等同物”也是描述的多肽的“前体”和多肽的“功能衍生物”和“盐”。
“前体”是多肽的天然或合成的前体，其具有或不具有合乎要求的生物活性。
表达法“盐”表示根据本发明的蛋白质分子的羧基的盐和氨基的酸加成盐二者。羧基盐可以自身已知的方式制备，并包含无机盐，例如钠、钙、铵、铁和锌盐，和与有机碱的盐，例如胺，例如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等等。酸加成盐，例如与无机酸例如盐酸或硫酸的盐，和与有机酸例如醋酸和草酸的盐，也是本发明的目的。
也可使用已知技术，在功能氨基酸侧链上或在其N-或C-末端上制备根据本发明的多肽的“功能衍生物”。此类衍生物包含例如羧酸基的脂肪族酯，通过与氨或一级或二级胺反应可得到的羧酸基的酰胺；通过与酰基反应制备的游离氨基的N-酰基衍生物；或通过与酰基反应得到的游离羟基的O-酰基衍生物。
“功能等同物”也天然地包含可从其他生物得到的多肽，和天然存在的变体。例如，通过序列比较，基于本发明的具体教导可找到同源序列区并可测定等价的酶。
“功能等同物”也包含根据本发明的多肽的片段，优选单独的结构域或序列基序，其例如具有合乎要求的生物学功能。
“功能等同物”另外是融合蛋白，其具有上述多肽序列或从其衍生的功能等同物中的至少一种和处于N-或C-端功能连接的至少一种另外的、与其功能不同的异源序列(即融合蛋白部分彼此没有实质功能损害)。所述异源序列的非限制性实例为例如信号肽、组氨酸锚定物或酶。
根据本发明也包括的“功能等同物”是具体公开的蛋白质的同源物。根据Pearson和Lipman的算法，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)85(8)，1988，2444-2448所计算的，其与具体公开的氨基酸序列之一具有至少60％，优选至少75％，特别地至少85％，例如90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％的同源性(或同一性)。根据本发明的同源多肽的百分比同源性或同一性特别表示，相对本文具体描述的氨基酸序列之一的全长的氨基酸残基的百分比同一性。
也可基于BLAST算法，blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)算法，或使用下文提供的Clustal设置测定百分比同一性值。
在可能的蛋白质糖基化的情况下，根据本发明的“功能等同物”包含处于去糖基化或糖基化形式和通过改变糖基化模式得到的修饰的形式的上述类型的蛋白质。
可通过诱变，例如通过蛋白质的点突变、加长或缩短生产根据本发明的蛋白质或多肽的同源物。
可通过筛选突变体，例如缩短的突变体的组合文库鉴定根据本发明的蛋白质的同源物。例如，可通过在核酸水平的组合诱变，例如通过合成的寡核苷酸的混合物的酶促连接，生产蛋白质变体的多样化数据库。有许多方法可用于从简并的寡核苷酸序列中制备潜在的同源物的文库。可在自动化DNA合成仪中进行简并的基因序列的化学合成，然后可将合成的基因连接进合适的表达载体。使用基因的简并组使得可以在一种混合物中提供编码合乎要求的潜在蛋白质序列组的所有序列。合成简并的寡核苷酸的方法是本领域技术人员已知的(例如Narang，S.A.(1983)Tetrahedron 39：3；Itakura等人(1984)Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，(1984)Science 198：1056；Ike等人(1983)Nucleic Acids Res.11：477)。
用于筛选通过点突变或缩短生产的组合文库的基因产物，和筛选cDNA文库的具有选定性能的基因产物的若干技术是现有技术中已知的。这些技术可适用于通过根据本发明的同源物的组合诱变生产的基因库的快速筛选。基于高通量分析的最常用于筛选大基因库的技术包括将基因库克隆进可复制的表达载体，用得到的载体库转化合适的细胞，和在这样的条件下表达组合基因，在所述条件中对合乎要求的活性的检测有助于分离载体，所述载体编码其产物被检测的基因。为了鉴定同源物，可使用递归集合诱变(REM)，一种增加库中功能突变体的频率的技术，与筛选实验的组合(Arkin和Yourvan(1992)PNAS 89：7811-7815；Delgrave等人(1993)Protein Engineering 6(3)：327-331)。
本发明还包含在申请人早先的国际专利申请PCT/EP2010/068576中(在此明确参考)描述的来自产气柯林斯菌ATCC 25986的7β-HSDH野生型的用途。
可从产气柯林斯菌DSM 3979得到的此7β-HSDH特别由至少另一种以下性能，例如2，3，4，5，6或7种或所有这些性能表征：
a)分子量(SDS凝胶电泳)：约28-32 kDa，特别是约29至31 kDa或约30 kDa；
b)分子量(凝胶过滤，在非变性条件下，例如特别地不含SDS)：约53至60 kDa，特别是约55至57 kDa，例如56.1 kDa。这证明了来自产气柯林斯菌DSM 3979的7β-HSDH的二聚本性；
c)7-酮-LCA的7-羰基立体选择性还原为7β-羟基；
d)氧化UDCA的最适pH在pH 8.5至10.5，特别是9至10的范围内；
e)还原DHCA和7-酮-LCA的最适pH在pH 3.5至6.5，特别是pH 4至6的范围内；
f)来自下表的提及的至少一种底物/辅因子的至少一种动力学参数；在下表中每种情况下在具体陈述的值附近的±20％，特别是±10％，±5％，±3％，±2％或±1％的范围内。
KM(μM) Vmax(U/mg蛋白质)b) kcat(1 μmol/(μmol×min))
NADP+ 5.32 30.58 944.95
NADPH 4.50 33.44 1033.44
UDCA 6.23 38.17 1179.39
7-Keto-LCA 5.20 30.77 950.77
DHCA 9.23 28.33 875.35
NAD+ -a) - 痕量
NADH - -痕量
a)由于活性极低无法测定
b)1U＝1μmol/分钟
g)来自产气柯林斯菌DSM 3979的原核7β-HSDH相对于包含豚鼠(Cavia porcellus)、智人(Homo sapiens)和小家鼠(Mus musculus)的动物11β-HSDH亚组的系统发生序列相似性。
例如，此7β-HSDH显示了以下性能或性能组合：a)；b)；a)和b)；a)和/或b)和c)；a)和/或b)和c)和d)；a)和/或b)和c)和d)和e)；a)和/或b)和c)和d)和e)和f)。
此外，此类7β-HSDH或从其衍生的功能等同物通过下述表征
a)7-酮类固醇立体特异性还原为对应的7β-羟基类固醇，和/或
b)包含7-位酮基和在类固醇骨架上的至少另一个酮基的酮类固醇区域特异性羟基化为对应的7β-羟基类固醇，例如特别是由7位的脱氢胆酸(DHCA)催化为对应的3，12-二酮-7β-胆烷酸，和例如是NADPH依赖的。
所述7β-HSDH特别具有根据SEQ ID NO：2(登录号：ZP_01773061)的氨基酸序列或从其衍生的与此序列具有至少60％，例如至少65，70，75，80，85或90，例如至少91，92，93，94，95，96，97，98，99或99.5％同一性程度的序列；任选地由以下性能中的一种或性能组合另外表征：根据上述定义的a)；b)；a)和b)；a)和/或b)和c)；a)和/或b)和c)和d)；a)和/或b)和c)和d)和e)；a)和/或b)和c)和d)和e)和f)。
3.核酸和构建体
3.1核酸
本发明也涉及编码具有7β-HSDH，FDH，GDH和/或3αt-HSDH活性的酶及其突变体的核酸序列。
本发明也涉及与本文描述的具体序列具有指明的同一性程度的核酸。
2种核酸之间的“同一性”表示在每种情况下在核酸全长上的核苷酸的同一性，特别是通过Informax公司(USA)的Vector NTI Suite 7.1软件比较计算的同一性，所述软件应用Clustal方法(Higgins DG，Sharp PM.Fastand sensitive multiple sequence alignments on a microcomputer.ComputAppl.BioSci.1989 Apr；5(2)：151-1)，设定以下参数：
多重比对参数：
Figure BDA0000367127010000341
成对比对参数：
可选地，也可根据Chenna，Ramu，Sugawara，Hideaki，Koike，Tadashi，Lopez，Rodrigo，Gibson，Toby J，Higgins，Desmond G，Thompson，Julie D.Multiple sequence alignment with the Clustal series ofprograms.(2003)Nucleic Acids Res31(13)：3497-500，根据互联网地址：http://www.ebi.ac.Hk/Tools/clustalw/index.html#测定同一性，使用以下参数：
本文提及的所有核酸序列(单和双链DNA和RNA序列，例如cDNA和mRNA)可通过化学合成以自身已知的方式从核苷酸构件生产，例如通过双螺旋的单独的重叠、互补的核酸构件的片段缩合。寡核苷酸的化学合成可例如通过亚磷酰胺法(Voet，Voet，第二版，Wiley Press New York，第896-897页)以已知方式进行。在Sambrook等人(1989)，MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press中描述了使用DNA聚合酶的Klenow片段和连接反应以及一般的克隆技术插入合成的寡核苷酸和填充空位。
本发明也涉及编码上述多肽中的一种及其功能等同物的核酸序列(单和双链DNA和RNA序列，例如eDNA和mRNA)，其可例如使用人工核苷酸类似物获得。
本发明也涉及编码根据本发明的多肽或蛋白质或其生物活性片段的分离的核酸分子，和核酸片段，所述核酸片段可用作例如用于鉴定或扩增根据本发明的编码核酸的杂交探针或引物。
此外，根据本发明的核酸分子可含有来自编码基因区的3'-和/或5'-末端的非翻译序列。
本发明还包含与具体描述的核苷酸序列或其区段互补的核酸分子。
根据本发明的核苷酸序列使得可以生产可用于鉴定和/或克隆在其他细胞类型和生物中的同源序列的探针和引物。这些探针或引物通常包含核苷酸序列区，所述核苷酸序列区在“严格”条件下(见下)与根据本发明的核酸序列的有义链或对应的反义链的至少约12个，优选至少约25个，例如约40，50或75个连续的核苷酸杂交。
“分离的”核酸分子是与核酸的天然来源中存在的其他核酸分子分离的核酸分子，并且此外当其是通过重组技术生产的时可基本不合其他细胞材料或培养基，或当其是通过化学合成时可基本不含化学前体或其他化学品。
可使用分子生物学标准技术和根据本发明提供的序列信息分离根据本发明的核酸分子。例如，使用具体公开的完整序列或其区段中的一种作为杂交探针和标准杂交技术(例如在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述)，可从合适的cDNA文库分离cDNA。此外，可通过聚合酶链式反应分离包含公开的序列或其区段中的一种的核酸分子，使用基于此序列制备的寡核苷酸引物。这样扩增的核酸可被克隆进合适的载体并可通过DNA序列分析表征。根据本发明的寡核苷酸也可通过标准合成技术生产，例如使用自动DNA合成仪。
可例如使用通常的杂交方法或PCR技术，例如通过基因组或cDNA文库，从其他细菌中分离根据本发明的核酸序列或其衍生物、这些序列的同源物或部分。这些DNA序列在标准条件下与根据本发明的序列杂交。
“杂交”表示多核苷酸或寡核苷酸在标准条件下结合几乎互补的序列的能力，而在这些条件下在非互补伙伴之间不出现非特异性结合。为此，序列可为90-100％互补的。互补序列能够特异性彼此结合的性质在例如Northern或Southern杂交中或PCR或RT-PCR的引物结合中得到利用。
有利地，使用保守区的短寡核苷酸用于杂交。然而，也可以使用根据本发明的核酸的长片段或完整序列用于杂交。这些标准条件取决于使用的核酸(寡核苷酸、长片段或完整序列)或取决于用于杂交的核酸类型，DNA或RNA而不同。因此，例如DNA:DNA杂交物的熔点比相同长度的DNA:RNA杂交物低约10℃。
标准条件指，例如，取决于核酸，42和58℃之间的温度和在具有0.1和5x SSC(1X SSC＝0.15M NaCI，15mM柠檬酸钠，pH 7.2)之间的浓度或另外存在50％甲酰胺的水性缓冲液中，例如42℃和在5x SSC，50％甲酰胺中。有利地，用于DNA：DNA杂交物的杂交条件是0.1x SSC和在约20℃和45℃之间的温度，优选地在约30℃和45℃之间。用于DNA:RNA杂交物，杂交条件有利地是0.1 x SSC和在约30℃和55℃之间，优选地在约45℃和55℃之间的温度。所述杂交的这些温度是例如对于具有约100个核苷酸的长度和50％的G+C含量的核酸在缺乏甲酰胺时计算的熔点值。用于DNA杂交的实验条件在相关的遗传学教科书，例如Sambrook等人，"Molecular Cloning″，Cold Spring Harbor Laboratory，1989中描述，并可根据例如核酸的长度、杂交物类型或G+C含量从由本领域技术人员已知的公式计算。本领域技术人员还可从以下教科书中找到有关杂交的进一步信息：Ausubel等人(编)，1985，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，New York；Hames和Higgins(编)，1985，Nucleic Acids Hybridization：A Practical Approach，IRL Press atOxford University Press，Oxford；Brown(编)，1991，Essential MolecularBiology：A Practical Approach，IRL Press at Oxford University Press，Oxford。
“杂交”可特别地在严格条件下进行。这些杂交条件在例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，Maniatis，T.，在：Molecular Cloning (A LaboratoryManual)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989，第9.31-9.57页或Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中描述。
将“严格”杂交条件特别理解为：在由50％甲酰胺，5x SSC(750mMNaCI，75mM柠檬酸三钠)，50mM磷酸钠(pH7.6)，5x Denhardt溶液，10％硫酸葡聚糖和20g/mi变性的剪切的鲑鱼精子DNA组成的溶液中于42℃过夜孵育，接着用0.1x SSC在65℃下过滤洗涤的步骤。
本发明也涉及具体公开的或可衍生出的核酸序列的衍生物。
因此，根据本发明的其他核酸序列可衍生自例如SEQ ID NO：1，5，7，14，19，34或47并与其具有单个或若干核苷酸的添加、替换、插入或缺失的差异，但此外仍编码具有合乎要求的性能谱的多肽。
本发明也包含与具体描述的序列相比包含所谓的沉默突变或与特别的原始或宿主生物的密码子利用相符合而被改变的那些核酸序列，以及其天然存在的变体，例如剪接变体或等位基因变体。
本发明也涉及可通过保守核苷酸替换(即将讨论中的氨基酸替换为相同电荷、大小、极性和/或溶解性的氨基酸)得到的序列。
本发明也涉及衍生自具体公开的核酸的序列多态性的分子。由于自然变异这些遗传多态性可存在于群体内的个体之间。这些天然变异通常导致基因核苷酸序列的约1至5％的变异。
根据本发明的具有序列SEQ ID NO：1，5，7，14，19，34或47的核酸序列的衍生物指例如等位基因变体，所述等位基因变体在衍生的氨基酸水平上具有至少60％同源性，优选地在全序列区上具有至少80％的同源性，非常特别优选地至少90％的同源性(关于氨基酸水平上的同源性，可参考多肽的上述信息)。同源性可有利地在序列的部分区较高。
此外，也将衍生物理解为根据本发明的核酸序列的同源物，特别是SEQ ID NO：1，5，7，14，19，34或47的同源物，例如真菌或细菌同源物，缩短的序列，编码和非编码DNA序列的单链DNA或RNA。例如，SEQ ID NO：1，5，7，14，19，34或47的同源物在DNA水平上在SEQ IDNO：1，5，7，14，19，34或47中给出的整个DNA区域上具有至少40％，优选至少60％，特别优选至少70％，非常特别优选至少80％的同源性。
另外，将衍生物理解为，例如与启动子的融合物。可通过至少一个核苷酸替换，至少一个插入、倒置和/或缺失改变位于陈述的核苷酸序列之前的启动子，但不损伤启动子的功能性或有效性。此外，可通过改变其序列增加启动子的有效性，或其甚至可被不同物种的生物的更有效的启动子完全替换。
此外，用于生产功能性突变体的方法是本领域技术人员已知的。
取决于使用的技术，本领域技术人员可在基因或非编码核酸区(其例如对表达调节很重要)中插入完全随机的或甚至靶向的突变，然后制备基因库。此所需的分子生物学方法是本领域技术人员已知的，并例如在Sambrook和Russell，Molecular Cloning.第三版，Cold Spring HarborLaboratory Press 2001中描述。
修饰基因和因此修饰其编码的蛋白质的方法是本领域技术人员早已熟悉的，例如
-定点诱变，给出基因的单个或若干核苷酸的定向替换(Trower MK(Publ.)1 996；In vitro mutagenesis protocols.Humana Press，New Jersey)，
-饱和诱变，其中可在基因的任意位点处替换或添加任意氨基酸的密码子(Kegler-Ebo DM，Docktor CM，DiMaio D (1994)Nucleic Acids Res22：1593；Barettino D，Feigenbutz M，
Figure BDA0000367127010000391
R，Stunnenberg HG(1994)Nucleic Acids Res 22：541；Barik S(1995)Mol Biotechnol 3：1)，
-易错聚合酶链反应(易错PCR)，其中通过不正确发挥功能的DNA聚合酶突变核苷酸序列(Eckert KA，Kunkel TA(1990)Nucleic Acids Res 18：3739)；
-在增变菌株中的基因传代，其中例如由于缺陷的DNA修复机制，具有增加的核苷酸序列的突变率(Greener A，Callahan M，Jerpseth B(1996)An efficient random mutagenesis technique using an E.coli mutator strain.In：Trower MK(Publ.)In vitro mutagenesis protocols.Humana Press，NewJersey)，或
-DNA重排，其中形成密切相关的基因池并消化，并使用片段作为模板用于聚合酶链式反应，其中通过重复的链分离和再次汇集最终生产全长镶嵌基因(Stemmer WPC(1994)Nature 370：389；Stemmer WPC(1994)Proc Natl Acad Sci USA 91：10747)。
使用所谓的定向进化(尤其在Reetz MT和Jaeger K-E(1999)，TopicsCurr Chem 200：31；Zhao H，Moore JC，Volkov AA，Arnold FH(，1999)，Methods for optimizing industrial enzymes by directed evolution，在：Demain AL，Davies JE(Publ.)Manual of industrial microbiology andbiotechnology.American Society for Microbiology中描述)，本领域技术人员可以靶向方式和大规模生产功能突变体。在第一步中，首先生产各个蛋白质的基因库，例如使用上面提供的方法。以合适的方式，例如通过细菌或通过噬菌体展示系统表达基因库。
可以对宿主生物的相关基因进行另一轮突变，所述宿主生物表达具有与合乎要求的性能基本相符的性能的功能突变体。突变和选择或筛选的步骤可反复重复，直到出现具有足够程度的合乎要求的性能的功能突变体。使用此重复程序，在步骤中可进行有限数量的突变，例如1至5个突变并评估和选择其对相关酶性能的影响。然后对选定的突变体以相同的方式进行另一个突变步骤。因此，可显著减少待研究的个体突变体的数量。
根据本发明的结果提供了有关讨论中的酶的结构和序列的重要信息，这是靶向生产具有合乎要求的修饰的性能的其他酶所必需的。特别地，可定义所谓的“热点”，即可能适于通过引入靶向突变而修饰酶性能的序列区段。
3.2构建体
本发明还涉及表达构建体，所述表达构建体含有在调节核酸序列的基因控制下的编码至少一种根据本发明的多肽的核酸序列；和载体，所述载体包含这些表达构建体中的至少一种。
根据本发明，“表达单元”指具有表达活性的核酸，其包含本文定义的启动子，在与待表达的核酸或基因功能连接后调节此核酸或此基因的表达，即转录和翻译。因此在此上下文中也使用术语“调节核酸序列”。除了启动子以外，可存在其他调节元件，例如增强子。
根据本发明，“表达盒”或“表达构建体”指与待表达的核酸或待表达的基因功能性连接的表达单元。因此与表达单元相比，表达盒不仅包含调节转录和翻译的核酸序列，而且包含应被表达为转录和翻译的结果的蛋白质的核酸序列。
在本发明上下文中术语“表达”或“过表达”描述了在微生物中由对应的DNA编码的一种或多种酶的细胞内活性的生产或增加。为此，可在生物中插入基因，可用另一种基因替换存在的基因，可增加基因的拷贝数，可使用强启动子或可使用编码具有高活性的对应的酶的基因，并且任选地可组合这些措施。
优选地根据本发明的所述构建体包含在各个编码序列的5，-上游的启动子和3，-下游的终止子序列，和任选地其他通常的调节元件，在每种情况下与编码序列有效连接。
根据本发明，“启动子”、“具有启动子活性的核酸”或“启动子序列”指核酸，其与待转录的核酸功能连接并调节所述核酸的转录。
“功能”或“有效”连接在此上下文中表示例如具有启动子活性的核酸中的一种与待转录的核酸序列和任选地其他调节元件，例如确保核酸转录的核酸序列，和例如终止子以这样的方式连续排列，所述方式使得每种调节元件可完成其在核酸序列的转录中的功能。这不一定需要在化学意义上的直接连接。基因控制序列，例如增强子序列，可从甚至更远的位置上或甚至从其他DNA分子上对靶序列施加其功能。优选这样的排列，其中待转录的核酸序列位于启动子序列后面(即位于3’-端)，使得2种序列共价连接在一起。启动子序列和待经历转基因表达的核酸序列之间的距离可少于200个碱基对，或少于100个碱基对或少于50个碱基对。
除了启动子和终止子以外，可提及的其他调节元件的实例是靶向序列、增强子、聚腺苷酸化信号、可选择的标记物、扩增信号、复制起点等等。合适的调节序列在例如Goeddel，Gene Expression Technology：Methods inEnzymology 185，Academic Press，San Diego，CA(1990)中描述。
根据本发明的核酸构建体特别包含序列SEQ ID NO：1，5，7，14，19，34或47或其衍生物和同源物，和可从其衍生的核酸序列，所述序列可有利地与一种或多种用于控制(例如增加)基因表达的调节信号有效或功能连接。
除了这些调节序列以外，这些序列的天然调节仍然可存在于实际的结构基因前，并且任选地可以已经被遗传修饰，使得天然调节关闭并增加基因表达。然而，核酸构建体也可具有较简单的构造，即在编码序列前未插入另外的调节信号，且未去除天然启动子和其调节。作为替代，突变天然调节序列使得调节不再存在并增加基因表达。
优选的核酸构建体有利地也含有与启动子功能连接的一种或多种上述“增强子”序列，其能使得核酸序列的表达增加。也可在DNA序列的3’-端插入另外的有利序列，例如其他调节元件或终止子。构建体可包含根据本发明的核酸的一个或多个拷贝。构建体也可包含其他标记物，例如抗生素抗性或营养缺陷型互补基因，任选地用于构建体的选择。
合适的调节序列的实例包含在启动子例如cos，tac，trp，tet，trp-tet，lpp，lac，lpp-lac，lacIq-，T7，T5，T3，gal，trc，ara，rhaP(rhaPBAD)SP6，λ-PR或λ-PL启动子中，其有利地应用在革兰氏阴性菌中。其他有利的调节序列包含在例如革兰氏阳性启动子amy和SPO2中，酵母或真菌启动子ADC1，MFα，AC，P-60，CYC1，GAPDH，TEF，rp28，ADH中。也可使用人工启动子用于调节。
为了在宿主生物中表达，将核酸构建体有利地插入载体，例如质粒或噬菌体，这使得在宿主中能最佳地表达基因。除了质粒和噬菌体之外，也将载体理解为本领域技术人员已知的所有其他载体，例如病毒，例如SV40、CMV、杆状病毒和腺病毒，转座子，IS元件、质粒、粘粒和线性或环状DNA。这些载体可在宿主生物中自我复制，或可通过染色体复制。这些载体表示本发明的另一个配置。
合适的质粒是例如大肠杆菌中的pLG338，pACYC184，pBR322，pUC18，pUC19，pKC30，pRep4，pHS1，pKK223-3，pDHE19.2，pHS2，pPLc236，pMBL24，pLG200，pUR290，pIN-III113-B1，λgt11或pBdCI，链霉菌中的pIJ101，pIJ364，pIJ702或pIJ361，芽孢杆菌中的pUB110，pC194或pBD214，棒状杆菌中的pSA77或pAJ667，真菌中的pALS1，p1L2或pBB116，酵母中的2αM，pAG-1，YEp6，YEp13或pEMBLYe23或植物中的pLGV23，pGHlac+，pBIN19，pAK2004或pDH51。上述质粒代表可能的质粒的小部分选择。其他质粒是本领域技术人员熟知的，并可在书中例如Cloning Vectors(Pouwels P.H.等人编Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985，ISBN 0 444 904018)中找到。
在本发明的另一个配置中，可以线性DNA的形式将含有根据本发明的核酸构建体或根据本发明的核酸的载体有利地插入微生物中，并可通过异源或同源重组整合进宿主生物的基因组中。此线性DNA可由线性化的载体，例如质粒组成，或仅由根据本发明的核酸构建体或核酸组成。
为了异源基因在生物中的最佳表达，有利地根据在生物中使用的特异性的“密码子利用”修饰核酸序列。可基于讨论中的生物的其他已知基因的计算机评估容易地确定“密码子利用”。
通过融合合适的启动子与合适的编码核苷酸序列和终止子或聚腺苷酸化信号制备根据本发明的表达盒。为此，使用通常的重组和克隆技术，例如在T.Maniatis，E.F.Fritsch和J.Sambrook，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor，NY(1 989)中和在T.J.Silhavy，M.L.Berman和L.W.Enquist，Experiments with Gene Fusions，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor，NY(1 984)和Ausubel，F.M.等人，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience(1987)中描述的。
为了在合适的宿主生物中表达，将重组核酸构建体或基因构建体有利地插入宿主特异性载体，这使得能在宿主中最佳地表达基因。载体是本领域技术人员熟知的，并可在例如″Cloning Vectors″(Pouwels P.H.等人，Pub1.，Elsevier，Amsterdam-New York-Oxford，1985)中找到。
4.微生物
根据上下文，术语“微生物”表示起始(野生型)微生物或基因修饰的重组微生物，或二者。
使用根据本发明的载体可生产重组微生物，所述重组微生物例如已用根据本发明的至少一种载体转化并可用于生产根据本发明的多肽。有利地，将根据本发明的上述重组构建体引入合适的宿主系统并表达。优选地，使用本领域技术人员已知的普通克隆和转染方法，例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等，使得所述的核酸在各自的表达系统中表达。合适的系统在例如Current Protocols in Molecular Biology，F.Ausubel等人，Publ.，Wiley Interscience，New York 1 997，或Sambrook等人Molecular Cloning：A Laboratory Manual.第二版，Cold Spring HarborLaboratory，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989中描述。例如Terpe，K.Appl.Microbio1.Biotechno1.(2006)72：211-222也提供了用于蛋白质的异源表达的细菌表达系统的综述。
原则上，可考虑所有原核或真核生物作为根据本发明的核酸或核酸构建体的重组宿主生物。有利地，使用微生物例如细菌、真菌或酵母作为宿主生物。有利地，使用革兰氏阳性菌或革兰氏阴性菌，优选肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，假单胞菌科(Pseudomonadaceae)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)，链霉菌科(Streptomycetaceae)或诺卡氏菌科(Nocardiaceae)的细菌，特别优选埃希氏菌属(Escherichia)，假单胞菌属(Pseudomonas)，链霉菌属(Streptomyces)，诺卡氏菌属(Nocardia)，伯克氏菌属(Burkholderia)，沙门氏菌属(Salmonella)，农杆菌属(Agrobacterium)，梭菌属(Clostridium)或红球菌属(Rhodococcus)的细菌。非常特别优选大肠杆菌属种。此外，其他有利的细菌可在α-变形菌门，β-变形菌门或γ-变形菌门的组中找到。
根据本发明的宿主生物优选地包含在本发明中描述的核酸序列、核酸构建体或载体中的至少一种，其编码具有根据上述定义的7β-HSDH活性的酶。
取决于宿主生物，以本领域技术人员已知的方式培养或培育在根据本发明的方法中使用的生物。通常在液体培养基中培养微生物，所述培养基包含碳源，一般以糖的形式，氮源，一般以有机氮源的形式例如酵母提取物或盐例如硫酸铵，微量元素例如铁、锰、镁盐和任选地维生素，培养温度在0℃和100℃之间，优选10℃和60℃之间，使用氧气通气。可将液体营养培养基的pH维持在固定值，即在培养期间其可或可不被调节。培养可为分批的、半分批的或连续的。营养物可在发酵开始时提供或可半连续或连续地补充。
5.UDCA的制备
步骤1：CA至DHCA的化学反应
通过经典化学途径以本身已知的方式将CA的羟基用铬酸或铬酸盐在酸性溶液中(例如H2SO4)氧化为羰基。形成DHCA。
步骤2：DHCA酶促或微生物转化为12-酮-UDCA
在水性溶液中，在存在NADPH或NADH时，通过3α-HSDH和7β-HSDH或其突变体将DHCA特异性还原为12-酮-UDCA。可通过ADH或FDH或GDH或其突变体从异丙醇或甲酸钠或葡萄糖再生辅因子NADPH或NADH。反应在温和条件下进行。例如，可在pH＝6至9，特别地约pH＝8和在约10至30，15至25或约23℃进行反应。
在微生物反应步骤的情况下，可在存在待转变的底物(DHCA)时，在合适的液体培养基中厌氧或需氧地培养表达必需酶活性的重组微生物。合适的培养条件是本领域技术人员本身已知的。其包含在例如5至10或6至9的pH范围中，在10至60或15至45或25至40或37℃的温度范围中的反应。合适的培养基包含例如下述LB和TB培养基。反应可例如分批或连续地或以其他通常方法变体(如下所述)进行。反应时间的范围可为例如从几分钟到几小时或几天，可为例如1小时至48小时。任选地，如果酶活性不是连续表达的，这可通过在达到目的细胞密度，例如约OD600＝0.5至1.0后添加合适的诱导剂诱导。
除了培养基、酶固定和分离有价值的物质以外，有关发酵模式的微生物生产过程的其他可能的合适修改也可见以下涉及“酶或突变体的生产”的章节。
步骤3：12-酮-UDCA化学转化为UDCA
通过Wolff-Kishner还原以本身已知的方式去除12-酮-UDCA的12-羰基，从12-酮-UDCA形成UDCA。在反应中，首先羰基与肼反应形成腙。然后在碱(例如KOH)的存在下加热腙至200℃，裂解出氮气并形成UDCA。
6.酶和突变体的重组生产
本发明还涉及根据本发明的多肽或其功能，生物活性片段的重组生产的方法，其中培养生产多肽的微生物，任选地诱导多肽的表达和从培养物中分离多肽。如果合乎要求的话，也可在工业规模上以此方式生产多肽。
可使用分批法(分批培养)或补料分批或重复补料分批法连续地或不连续地培养根据本发明生产的微生物。在Chmiel的教科书(Bioprozeβtechnik 1.Einfiihrung in die Bioverfahrenstechnik[Bioprocesstechnology 1.Introduction to bioprocess engineering](Gustav FischerVerlag，Stuttgart，1991))或在Storhas的教科书(Bioreaktoren undperiphere Einrichtungen [Bioreactors and peripheral equipment])(ViewegVerlag，Brunswick/Wiesbaden，1994))中可找到已知的培养方法的总结。
待使用的培养基必须合适地满足各自的菌株的要求。在美国细菌学学会的手册″Manual of Methods (or General Bacteriology"(WashingtonD.C.，USA，1981)中提供了用于多种微生物的培养基的描述。
可根据本发明使用的这些培养基通常包含一种或多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖，例如单糖、二糖或多糖。很好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。可通过复杂化合物，例如糖蜜，或糖精制的其他副产品将糖添加至培养基中。也可有利地添加多种碳源的混合物。其他可能的碳源为油和脂肪，例如大豆油、向日葵油、花生油和椰子油，脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸或亚油酸，醇例如甘油、甲醇或乙醇，和有机酸例如醋酸或乳酸。
氮源通常是有机或无机氮化合物或包含这些化合物的材料。氮源的实例包含氨气或铵盐，例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸或复杂氮源，例如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白、酵母提取物、肉提取物等等。氮源可单独使用，或作为混合物使用。
可包含在培养基中的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸或硫酸盐。
使用的硫源可为无机硫化合物，例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物以及有机硫化合物，例如硫醇(mercaptan)和硫醇(thiols)。
使用的磷源可为磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或对应的含钠盐。
可对培养基添加螯合剂以保持溶液中的金属离子。特别合适的螯合剂包括二羟苯酚，例如儿荼酚或原儿茶酸，或有机酸，例如柠檬酸。
根据本发明使用的发酵培养基通常也包含其他生长因子，例如维生素或生长促进剂，其包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸盐和吡哆醇。生长因子和盐经常源自培养基的复杂组分，例如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等等。此外，可对培养基添加合适的前体。培养基中化合物的精确组成强烈依赖于特定实验，并根据每种特定情况单独决定。在教科书″Applied Microbio1.Physiology，A Practical Approach″(Publ.P.M.Rhodes，P.F.Stanbury，IRL Press(1997)p.53-73，ISBN0 19 963577 3)中可找到有关培养基优化的信息。也可从商业供应商处获得生长培养基，例如Standard1(Merck)或BHI(脑心浸液，DIFCO)等等。
通过加热(在1.5巴和121℃下20分钟)或通过无菌过滤对培养基的所有组分灭菌。组分可在一起灭菌，或单独灭菌，如有必要。培养基的所有组分可在培养开始时存在，或可任选地连续或分批添加。
培养温度通常在15℃和45℃之间，优选在25℃至40℃之间，并可在实验期间保持恒定或变化。培养基的pH应在5至8.5的范围内，优选约7.0。可通过添加碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水或酸性化合物例如磷酸或硫酸在培养期间控制培养pH。为了控制起泡，可以使用消泡剂，例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可对培养基添加合适的选择性作用物质，例如抗生素。为了维持需氧条件，可将氧气或含氧气体混合物，例如环境空气补料进入培养基。培养温度通常在20℃至45℃。持续培养直至形成最多的合乎要求的产物。此目的通常在10小时至160小时内达到。
然后进一步处理发酵肉汤。根据需要，通过分离技术例如离心、过滤、倾析或这些方法的组合完全或部分地从发酵肉汤中去除生物质，或使生物质完全留在发酵肉汤中。
如果多肽不分泌到培养基中，也可破坏细胞，并通过已知的蛋白质分离法从裂解液中得到产物。可任选地通过高频超声波，通过高压，例如在弗氏压碎器中，通过渗透裂解，通过去垢剂、裂解酶或有机溶剂的作用，使用均质器或通过列出的若干方法的组合破坏细胞。
可通过已知的层析方法，例如分子筛层析(凝胶过滤)，例如Q-琼脂糖凝胶层析、离子交换层析和疏水层析，和使用其他通常的方法例如超滤、结晶、盐析、透析和天然凝胶电泳纯化多肽。合适的方法在例如Cooper，F.G.，Biochemische Arbeitsmethoden[Methods of BiochemicalProcessing]，Verlag Walter de Gruyter，Berlin，New York或在Scopes，R.，Protein Purification，Springer Verlag，New York，Heidelberg，Berlin中描述。
为了分离重组蛋白质，可有利地使用载体系统或寡核苷酸，所述载体系统或寡核苷酸使cDNA延长确定的核苷酸序列并因此编码修饰的多肽或融合蛋白，例如用于更容易的纯化。合适的此类修饰为例如所谓的起锚定物作用的“标签”，例如称为六组氨酸锚定物的修饰，或可被抗体识别为抗原的表位(例如在Harlow，E.和Lane，D.，1988，Antibodies：A LaboratoryManual.Cold Spring Harbor(N.Y.)Press中描述)。这些锚定物可用于将蛋白质附着至固体载体，例如聚合物基质，所述固相载体可例如填充在层析柱中，或可用在微滴定板上或一些其他支持物上。
同时，这些锚定物也可用于识别蛋白质。为了识别蛋白质，除了通常的标记物，可单独或与用于衍生化蛋白质的锚定物组合使用例如荧光染料，与底物反应后形成可检测的反应产物的酶标记物，或放射性标记物。
7.酶固定
在本文描述的方法中，可游离地或固定地使用根据本发明的酶。将固定的酶理解为固定至惰性支持物的酶。合适的支持材料和固定在其上的酶可从EP-A-1149849，EP-A-1 069 183和DE-OS 100193773和其中引用的参考文献中知晓。对此，完全参考这些文件的公开内容。合适的支持材料包括例如粘土、粘土矿物，例如高岭石、硅藻土、珍珠岩、二氧化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉、阴离子交换材料、合成的聚合物，例如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、苯酚甲醛树脂、聚氨酯和聚烯烃，例如聚乙烯和聚丙烯。为了制备被支持的酶，通常使用的精细分割的颗粒形式的支持材料，优选多孔形式。支持材料的颗粒大小通常不超过5mm，特别是不超过2mm(颗粒大小分布曲线)。类似地，当使用脱氢酶作为全细胞催化剂时，可选择游离或固定的形式。支持材料为例如Ca-藻朊酸盐，和卡拉胶。也可使用戊二醛(与CLEA交联)直接交联酶和细胞。在例如J.Lalonde和A.Margolin″Immobilization of Enzymes″中和在K.Drauz和H.Waldmann，Enzyme Catalysis in Organic Synthesis 2002，Vo1.III，991-1032，Wiley-VCH，Weinheim中描述了相应和其他的固定方法。
实验章节：
除非另外说明，在本发明上下文中进行的克隆步骤，例如限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、将核酸转移到硝酸纤维素和尼龙膜上、DNA片段的连接、微生物的转化、微生物的培养、噬菌体的增殖和重组DNA的序列分析根据Sambrook等人(1989)，同上描述的进行。
A.一般信息
材料：
产气柯林斯菌DSM 3979(ATCC 25986，以前名为产气真杆菌(Eubacterium aerofaciens))的基因组DNA从德国微生物和细胞培养物保藏所(German Collection of Microorganisms and Cell Cultures)(DSMZ)获得。UDCA和7-酮-LCA是本身已知的起始化合物并在文献中描述。所有其他化学品购自Sigma-Aldrich和Fluka(德国)。所有限制性内切酶、T4 DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、Phusion DNA聚合酶和异丙基-β-D-1-硫代半乳糖苷(IPTG)购自Fermentas(德国)。
培养基：
LB培养基，每升培养基含有胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl10g。
TB培养基，每升培养基含有胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，4mL甘油，10％TB缓冲液(11.55gKH2PO4，62.7gK2HPO4，H2O至500mL)。
基本培养基，根据Wilms等人，BIOTECHNOLOGY ANDBIOENGINEERING，2001VOL.73，No.2，95-103修改。
表达载体和载体构建体
为了表达重组蛋白质，使用以下本身已知的表达载体：
pET21a(+)，(参见图3a)
pET22b(+)(参见图3b)
pET28a(+)(参见图3d)和
pCOLADuet-1
(分别来自Novagen，Madison，Wisconsin，USA)。
载体pET21a(+)和pET22b(+)每个具有多克隆位点(MCS)，在每个载体中处于具有下游lac操纵子和随后的核糖体结合位点(rb)的T7启动子的控制下。在每个载体中，在表达结构域的C-端区具有T7终止子。2种质粒都具有ColEl-复制子(pBR322-复制子)，氨苄青霉素抗性基因(bla)，f1起点和编码lac抑制子的基因(lacI)。
另外，pET21a(+)质粒在MCS的N-端区具有T7标签和在MCS的C-端的任选的His标签。pET22b(+)质粒在MCS的N-端区具有pelB信号序列和在MCS的C-端的His标签。
pCOLADuet-1载体具有2个MCS，每个处于具有下游lac操纵子和随后的核糖体结合位点(rb)的T7启动子的控制下。在2个MCS的C-端具有T7终止子。此外，此载体具有编码lac抑制子的基因和COLA复制子(ColA复制子)。
在本研究中使用可商购的pCOLADuet-1载体的修饰变体。在此修饰的质粒变体(名为pCOLA(mod)；参见图3c))中，将原始载体的卡那霉素抗性基因替换为氯霉素抗性基因。另外，通过定点的点诱变从氯霉素抗性基因中去除NcoI限制性位点。在第一MCS的N-端区中具有His标签，而在第二MCS的C-端具有S标签。
pET质粒的ColE1复制子和pCOLA质粒的COLA复制子是相互兼容的。这允许在大肠杆菌中同时稳定插入pET质粒和pCOLA质粒。这样可将多种基因的组合克隆进大肠杆菌，而不使其位于相同的操纵子上。由于pET载体(～40)和pCOLA载体(20-40)的不同拷贝数，此外有可能影响共转化的基因的表达水平。
使用以下载体构建体
pET22b(+)7β-HSDH：pET22b(+)载体，其中通过Nde I和Hind III切割位点以通常方式已经克隆了来自产气柯林斯菌ATCC 25986的7β-HSDH。
pET22b(+)3α-HSDH：pET22b(+)载体，其中通过Nde I和EcoR I切割位点以通常方式已经克隆了来自睾丸酮丛毛单胞菌的3α-HSDH(Oppermann等人，J Biochem，1996，241(3)：744-749)。
pET21a(+)FDH D221G(参见图4a)：pET21a(+)载体，其中通过Nde I和EcoR I切割位点已经克隆了来自母牛分枝杆菌N10的甲酸脱氢酶。使用定点诱变，将甲酸脱氢酶第221位(不考虑第1位的甲硫氨酸)或第222位(从第1位的甲硫氨酸开始计数；参见SEQ ID NO：15，19，35)的天冬氨酸残基(D)替换为甘氨酸残基(参见下文的生产实施例4)。甲酸脱氢酶在核苷酸序列的第1202位具有单碱基缺失，这导致最后一个氨基酸缬氨酸替换为丙氨酸。同时，此碱基缺失导致终止密码子的关闭和原本位于阅读框之外的His标签的激活(参见SEQ ID NO：34和35)。
pET21a(+)7β-HSDH：pET21a(+)载体，其中通过Nde I和Xho I切割位点以通常方式已经克隆了来自产气柯林斯菌ATCC 25986的7β-HSDH。
pET21a(+)FDH D221G 7β-HSDH(参见图4b)
pET2 1a(+)FDH 7β-HSDH(G39A)3α-HSDH(参见图8)
pCOLA(mod)3α-HSDH(参见图5)
微生物
Figure BDA0000367127010000521
在37℃在含有合适抗生素的LB培养基中增殖大肠杆菌菌株DH5α(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)。
在37℃在含有合适抗生素的LB培养基中增殖大肠杆菌菌株BL21(DE3)(Novagen，Madison，Wisconsin，USA)，并在OD600＝0.8用0.5mM IPTG诱导后维持在25℃和140 rpm。
方法
1.测定7β-HSDH活性的标准条件
反应混合物包含1ml的总体积的：
880μl    50 mM磷酸钾缓冲液，pH 8.0
10μl    10mM UDCA(溶于水中，pH8)
10μl    酶溶液(在上述缓冲液中，范围从1至10U/ml)
100l    1mM NADP+(在上述缓冲液中)
测量340nm处的消光的增加，并使用6.22mM-1×cm-1的摩尔消光系数以酶单位(U，即μmol/分钟)计算活性。
根据生产实施例7测定7β-HSDH活性的标准条件
反应混合物包含1ml的总体积的
870μl    50mM磷酸钾(KPi)缓冲液，pH 8.0
100μl    100mMDHCA(溶于50mM KPi中，pH8)
10l    酶溶液(在上述缓冲液中，范围从2至6U/ml)
20μl    12.5 mM NADPH(溶于ddH2O)
测量340 nm处的消光的增加，使用6.22 mM-1×cm-1的摩尔消光系数以酶单位(U，即μmol/分钟)计算活性。
2.通过BCA测定法测定蛋白质
样品与BCA试剂(来自Interchim)混合并在37℃孵育45分钟。针对测定法使用的浓度范围中的校正曲线(BSA)在562nm处测定蛋白质含量。
3.薄层色谱
将5至10μg样品应用于TLC薄膜硅胶60(Merck)。应用真实物质作为参考。将TLC薄膜的一端浸入溶剂，直至达到流动相的顶端。干燥TLC薄膜并用磷钼酸显色。
4.分子生物学流程：
除非另外说明，根据建立的方法进行分子生物学操作，例如在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.MolecularC1oning：ALaboratory Manual.第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989；AuSubel等人(eds.)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY(1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual，Stockton Press，NY(1990)中描述。
B.实施例
生产实施例1：7β-HSDH活性的鉴定
产气柯林斯菌ATCC 25986的基因组DNA序列由“华盛顿大学基因组测序中心”的“人肠微生物组计划，，于2007年公布在GenBank上。HSDH属于“短链脱氢酶”。由于GenBank没有注释来自产气柯林斯菌ATCC25986的“短链脱氢酶”的生化功能，将9种候选物克隆进载体pET22b+，并然后在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。
为此，PCR扩增7β-HSDH编码序列。使用产气柯林斯菌ATCC 25986(DSM3979)的基因组DNA作为模板和引物5′-gggaattcCATATGAACCTGAGGGAGAAGTA-3′(SFQ ID NO.3)和5′-cccAAGCTTCTAGTCGCGGTAGAACGA-3′(SEQ ID NO：4)得到PCR产物。下划线指示引物序列中的NdeI和HindIII切割位点。使用PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物，然后用NdeI和HindIII酶切割。对应的载体也用NdeI和H1indIII切割。将产物应用于琼脂糖凝胶，分离，切割和纯化。通过T4连接酶连接切割的PCR产物和切割的载体。将连接产物转化进大肠杆菌DH5α。通过测序验证得到的载体(包含7β-HSDH基因)，并将所述载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG诱导和表达。
在50ml LB培养基中进行表达。为了制备预培养物，挑取在5ml LB培养基(包含相应的抗生素)中的LB琼脂板上的菌落中并在37℃和160rpm下孵育过夜。用500μl预培养物接种50ml LB培养基(包含相应的抗生素)。在37℃和160rpm下孵育培养物。直到OD600约0.8时，通过添加0.5mM IPTG诱导表达。在6小时或过夜后，离心去除细胞。在6ml磷酸钾缓冲液(50mM，pH8，包含0.1mM PMSF)中重悬沉淀并用超声波破碎。通过离心去除细胞碎片。
为了鉴定7β-HSDH活性，通过光度测量法研究活性。在1ml比色皿中在磷酸钾缓冲液(50mM，pH8)中混合酶和0.1mM测试物质(UDCA)。在添加NADPH(NADH)或NADP+(NAD+)后，测量NAD(P)H的降解或形成。9种候选物中的一种酶在存在NADP+时显示了针对UDCA的活性(60U/ml)，但没有针对CA的活性。鉴定了此酶的NADPH依赖性7β-HSDH活性。
在光度测定研究中，7β-HSDH在存在NADP+或NADPH时显示了针对UDCA的60U/ml的活性，针对7-酮-LCA的35U/ml的活性和针对DHCA的119U/ml的活性。无法检测到针对CA的活性。
将编码7β-HSDH的基因亚克隆进具有His标签的pET28a+中以允许快速纯化。如上所述在大肠杆菌BL21(DE3)中活跃表达此具有His标签的7β-HSDH。使用Talon柱进行纯化。首先用磷酸钾缓冲液(50mM，pH8，具有300mM NaCl)平衡柱。在装载了细胞裂解液后，用磷酸钾缓冲液(50mM，pH8，具有300mM NaCl)洗涤柱。用磷酸钾缓冲液(50mM，pH8，具有300mM NaCl和200mM咪唑)洗脱7β-HSDH。通过透析去除洗脱液中的咪唑。纯化产率为76％，纯度为约90％。
生产实施例2：来自产气柯林斯菌ATCC 25986的7β-HSDH的制备级克隆、表达和纯化和酶的进一步表征
2.1表达构建体的克隆和生产
通过PCR和使用在上文生产实施例1中描述的引物从基因组DNA中再次扩增编码7β-HSDH的基因：
如上述再次纯化PCR产物，并用限制性内切酶NdeI和HindIII消化。再次纯化消化的PCR产物并使用T4连接酶克隆进pET-28a(+)载体，以生产表达载体。然后将得到的表达构建体转化进大肠杆菌DH5α细胞。预期的蛋白质应具有包含信号肽和N-端6xHis标签和凝血酶切割位点的20个氨基酸残基。通过测序验证插入的DNA的序列。
2.27β-HSDH的过表达和纯化
用表达构建体转化大肠杆菌BL21(DE3)。为此，在包含30μg/ml卡那霉素的LB培养基(2×400ml在2升的摇瓶中)中增殖包含表达构建体的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。通过离心(10.000×g，15分钟，4℃)收获细胞。在20ml磷酸盐缓冲液(50mM，pH8，包含0.1mM PMSF)中重悬沉淀。使用Sonifier250超声波装置(Branson，德国)，通过超声波处理1分钟(40W功率，40％工作间隔和1分钟停顿)以及恒定冷却破粹细胞。裂解重复3次。离心细胞提取物(22.000×g，20分钟，4℃)。将上清装载至用上样缓冲液(50mM磷酸钾，300mM NaCl，pH8)平衡的Talon柱(Clontech，USA)。流程在24℃下进行。通过用上样缓冲液(3倍柱体积)洗涤柱洗去未结合的材料。通过用洗涤缓冲液(在上样缓冲液中20mM咪唑；3倍柱体积)洗涤去除弱结合的蛋白质。用洗脱缓冲液(在上样缓冲液中200mM咪唑)洗脱His标签-7β-HSDH蛋白。在2升磷酸钾缓冲液(50mM，pH8)中的具有5kDa分子排阻极限的透析管(Sigma，USA)中在4℃过夜透析洗脱液。最后将样品转移至新管并贮藏在-20℃用于进一步分析。使用BCA测试试剂盒(Thermo，USA)根据制造商的说明书测定蛋白质浓度。另外通过12.5％SDS-PAGE和用考马斯亮蓝染色分析样品。使用Scion Image Beta4.0.2(Scion，USA)通过密度计测定蛋白质的纯度。
2.3凝胶过滤
在Pharmacia 蛋白质纯化系统上进行凝胶过滤以测定7β-HSDH的分子量。将纯化的酶应用于已事先用包含200mM氯化钠的50mM Tris-HCl(pH8)平衡的Sephadex G-200柱上。用相同的缓冲液以1ml/分钟的流速洗脱蛋白质。通过比较7β-HSDH与蛋白质标准物(血清白蛋白(66kDa)、来自米曲霉(Aspergillus oryzae)的α-淀粉酶(52kDa)、猪胰腺胰蛋白酶(24kDa)和鸡蛋溶菌酶(14.4kDa))的洗脱体积测定其的分子量。
2.4酶测定和动力学分析
用于酶测定的反应混合物在1ml总体积中包含50μmol磷酸钾(pH8)，0.1μmol NAD(P)H或NAD(P)+，底物和蛋白质。反应混合物包含在具有1cm光程长度的比色皿中。使用分光光度计(Ultraspec3000，PharmaciaBiotech，Great Britain)，通过记录NAD(P)H浓度相对340nm处的消光的变化测定7β-HSDH活性。使用6.22mM-1×cm-1的摩尔消光系数以酶单位(U，即μmol/分钟)在25℃测定酶活性。使用底物、辅酶、浓度、pH、缓冲液和孵育温度为变量进行若干不同的测量。使用标准方法测定动力学常数。
2.57-酮-石胆酸通过7β-HSDH的生物转化
进行7-酮-LCA通过7β-HSDH的转化以验证7β-HSDH的生化功能。在10ml磷酸钾缓冲液(50mM，pH8)中悬浮0.4g7-酮-LCA并通过添加2M氢氧化钠将pH调节为pH8。添加0.2ml异丙醇，100U7β-HSDH和80U来自嗜热厌氧乙醇杆菌(Thermoanaerobacter ethanolicus)的醇脱氢酶(ADH-TE)(由Dr.K.Momoi，ITB University，Stuttgart馈赠)和1μmolNADP+。添加相同的缓冲液以得到20ml的总反应体积。将反应混合物在24℃孵育并搅拌24小时。期间使用ADH通过2-丙醇的氧化再生NADPH。产物用1ml2M盐酸酸化并用5ml乙酸乙酯提取5X。然后蒸馏有机溶液。
2.6色谱产物的测定
在HPLC系统LC20AD(Shimadzu，日本)上的具有
Figure BDA0000367127010000581
STAR RP18型前置柱(封端的，Merck，德国)的
Figure BDA0000367127010000582
STAR RP-18型柱(
Figure BDA0000367127010000583
RT125-4预填充柱，
Figure BDA0000367127010000584
STAR RP-18封端的，Merck，德国)上以1ml/分钟的流速进行HPLC分析。流动相由2种洗脱液组成。洗脱液A包含乙腈，洗脱液B包含蒸馏水(pH2.6，用85％正磷酸调节)。使用以下梯度：A35％(8分钟)-35％-43％(1％分钟-1)-43％-70％(1％分钟-1)-70％(5分钟)-70％-35％(17.5％分钟-1)-35％(5分钟)；洗脱液A65％(8分钟)-65％-57％(1％分钟-1)-57％-30％(1％分钟-1)-30％(5分钟)-30％-65％(17.5％分钟-1)-65％(5分钟)。分析20μl样品(1mg/m1)。使用相同浓度的真实的UDCA，7-酮-LCA和CDCA作为标准物。通过在200nm处的紫外检测进行记录。
2.7序列比对和系统发生分析
使用Clustal X软件(Thompson等人，1997，Nucleic Acid Research25：4876-82)产生多序列比对，并使用Jalview软件(Clamp等人，2004，Bioinformatics20：426-7)修改。使用程序TreeView1.6.6(Roderic2001，http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/rod/rod.html)产生系统发生树。
2.8测试结果：
2.8.1在制备性生物转化中鉴定7β-HSDH活性
为了验证酶的功能，在10-ml规模上进行了7-酮-LCA的生物转化，其中如已经描述的与ADH组合使用分离的酶，用于使用2-丙醇再生NADPH。HPLC分析显示，UDCA是由酶生产的唯一反应产物(90％转化)。在反应混合物中没有检测到CDCA(保留时间19.4分钟)。结果显示，酶是NADPH依赖性7β-HSDH且能够将7-酮-LCA的7-羰基选择性还原为7β-羟基。
保留时间UDCA：15.5分钟
保留时间7-酮-LCA：18.3分钟
2.8.2.纯化和凝胶过滤
在将来自产气柯林斯菌DSM3979的7β-HSDH基因克隆进表达载体pET28a(+)和随后的过表达后，得到在N-端具有His标签的融合蛋白，每升培养物的7β-HSDH产量为332.5mg(5828U)。通过固定化金属离子亲和层析一步纯化具有His标签的7β-HSDH(纯度＞90％，产率76％，参见图2)。道1和2的主带代表30kDa处的预期的表达产物，这对应于从基因的氨基酸序列推导的预测的分子量。然而，通过凝胶过滤发现7β-HSDH的分子量为56.1kDa。这证明来自产气柯林斯菌DSM3979的7β-HSDH的二聚本性。
2.8.3.序列比对
将根据本发明使用的7β-HSDH的氨基酸序列与已知的HSDH序列比较(比对未显示)。观察到的序列相似性指示，根据本发明的酶属于短链脱氢酶(SDR)家族。已知SDR具有极低的同源性和序列同一性(Jornvall，H.，B.Persson，M.Krook，S.Atrian，R.Gonzalez-Duarte，J.Jeffery，和D.Ghosh.1995.Short-chain dehydrogenases/reductases(SDR).Biochemistry34：6003-13和Persson，B.，M.Krook，和H.Jornvall.1991.Characteristicsof short-chain alcohol dehydrogenases and related enzymes.Eur JBiochem200：537-43)。然而，序列比对清楚地显示了SDR一级结构中的保守结构域。N-端基序Gly-X-X-X-Gly-X-Gly(对应于Gly-41，Gly-45和Gly-47，编号对应于比对)对应于SDR超家族的特有的二核苷酸结合基序。此外，观察到3个非常保守的残基Ser-177，Tri-190和Lys-194，这对应于SDR酶的催化三元组。
2.8.4.系统发生分析
来自索氏梭菌(Clostridium sordellii)、羊布鲁氏菌(Brucella melitensis)和大肠杆菌的7α-HSDH属于相同的亚组。2种3α-HSDH比其他HSDH显示了更显著的相似性。有趣地是，原核7β-HSDH与包含豚鼠、智人和小家鼠的动物11β-HSDH亚组相关。
2.8.5.动力学常数
通过Lineweaver-Burk作图进行了动力学平衡分析以测定UDCA，7-酮-LCA，DHCA，NADP+和NADPH的Vmax和KM的绝对值。下表显示了从底物饱和曲线和倒数作图得到的测试的底物和辅酶的所有动力学数据。所有底物和辅酶的Vmax，KM和kcat值处于相同的区中，而DHCA的KM值显著高于其他底物，可能是由于在水中的低溶解度导致的。酶是NADPH依赖的，并且由于活性极低不能测定用于NAD+和NADH的动力学常数。
来自产气柯林斯菌DSM3979的7β-HSDH的动力学常数总结
Figure BDA0000367127010000601
a)由于活性极低无法测定
b)1U＝1μmol/分钟
2.8.6.最佳pH
另外，使用纯化的酶对多种底物测定了7β-HSDH活性作为pH的函数。对于用7β-HSDH氧化UDCA，在pH9至10的范围内观察到最佳活性，在酸性侧逐渐降低。相反地，对于通过7β-HSDH还原DHCA和7-酮-LCA，在pH4至6的范围内具有最佳活性，在酸性侧急剧降低，在碱性侧逐渐降低。在相同的pH下不同的缓冲液仅对7β-HSDH的活性具有轻微影响。
2.8.7.热稳定性
根据本发明使用的NADP依赖性7β-HSDH显示了以下稳定性行为：在400分钟后，在30℃的活性比在23℃的低约30％。在30℃，酶在1500分钟后完全失活，而在23℃和1500分钟后残留活性为20％。在反复冷冻和融解后在磷酸钾缓冲液(50mM，pH8)中于-20℃贮藏数月时间没有观察到显著的活性丧失。
生产实施例3：7β-HSDH突变体的生产及其表征
突变了氨基酸序列的第39位(包含起始的甲硫氨酸)(参见SEQ IDNO：2)。
3.1引物
使用下面陈述的诱变引物用于7β-HSDH的定点诱变。基于7β-HSDH基因序列选择引物，使得其导致合乎要求的氨基酸替换。记住待突变的碱基位于引物的中心，并且引物对的熔点也在相同的区。
使用引物对7β_mut_G39A_fwd和7β_mut_G39A_rev制备G39A突变体。使用引物对7β_mut_G39S_fwd和7β_mut_G39S_rev制备G39S突变体。
甘氨酸→丙氨酸
正向：7β_mut_G39A_fwd：
CGTCGTCATGGTCGCCCGTCGCGAGG.SEQ ID NO：9)
反向：7β_mut_G39A_rev：
CCTCGCGACGGGCGACCATGACGACG.SEQ ID NO：10)
甘氨酸→丝氨酸
正向：7β_mut_G39S_fwd：
CGTCGTCATGGTCAGCCGTCGCGAGG.SEQ ID NO：11)
反向：7β_mut_G39S_rev：
CCTCGCGACGGCTGACCATGACGACG.SEQ ID NO：12)
3.2PCR程序
在反应中，首先在98℃进行2分钟的初始变性步骤。然后进行25个循环的变性(30秒，98℃)，引物杂交(2.5分钟，58℃)和延伸(6分钟，72℃)。作为最后一步，在72℃进行最终的15分钟延伸，然后通过冷却至4℃终止聚合酶链式反应。
3.3PCR测定
HF缓冲液(5x) 4μl
dNTP混合物(10mM) 0.4μl
正向引物(10μM) 2μl
反向引物(10μM) 2μl
模板 1μl
Phusion聚合酶(2UμL-1) 0.2μl
DMSO 1μl
ddH2O 9.4μl
20μl
使用具有7β-HSDH的pET22b载体作为模板。
3.4流程
为了允许在蛋白质序列中的氨基酸的靶向替换，对相应基因的DNA序列进行定点突变。为此，使用在其序列中具有合乎要求的突变的互相互补的引物。使用具有待突变基因的N6-腺嘌呤甲基化的双链质粒DNA作为模板。从dam+大肠杆菌菌株例如大肠杆菌DH5中分离N6-腺嘌呤甲基化的质粒DNA。.
如上所述进行聚合酶链式反应。引物相对模板互补地延长，从而形成具有合乎要求的突变的质粒，所述质粒具有链断裂。与其他PCR反应不同，在此情况下DNA产量的增加仅是线性的，因为新形成的DNA分子不能作为PCR反应的模板。
在PCR反应完成后，通过限制酶DpnI消化N6-腺嘌呤甲基化的DNA。此酶具有下述特别的特性，即其非特异性地限制性酶切N6-腺嘌呤甲基化的DNA，而不限制性酶切新形成的非甲基化的DNA。通过对PCR反应混合物添加1μL DpnI并在37℃孵育1小时进行限制性酶切。
使用10μl此制品用于转化200μl化学感受态DH5α细胞。在分离质粒后，通过测序验证成功的突变。
3.5表征
对每种突变体和野生型酶，在微滴定板光度计中进行动力学测量，记录在恒定底物浓度和变化的辅因子浓度下和变化的底物浓度和恒定的辅因子浓度下的酶的转化率。为了测定酶比活，通过光密度法测定细胞裂解液中的酶浓度。
为了测定底物转化率对底物浓度的依赖性，使用相对于反应体积的100M NADPH的辅因子浓度，而底物浓度在7M至10mM脱氢胆酸的范围内变化，具有31种不同浓度(在每种情况下相对于反应混合物)。
为了测定底物转化率对辅因子浓度的依赖性，使用相对于反应体积0.3mM脱氢胆酸的底物浓度，而辅因子浓度在251μM至1001μM NADPH的范围内变化，具有8种不同浓度的野生型蛋白或在6μM至100μM NADPH的范围内变化，具有16种不同浓度的两种突变体(在每种情况下相对于反应混合物)。在这些测量系列中，通过前4次测量(0秒-18秒)的线性回归测定反应速率。
使用IGOR Pro评估得到的数据。从底物或辅因子对酶比活的图中，恒定的底物浓度和变化的辅因子浓度的测量系列中可见典型的Michaelis-Menten动力学曲线。然而，从具有恒定的辅因子浓度和变化的底物浓度的测量系列的图中可见典型的具有底物抑制的Michaelis-Menten动力学曲线(参见图6)。为此，使用经典的Michaelis-Menten模型评估恒定的底物浓度和变化的共底物浓度的测量系列，并且使用具有底物抑制的Michaelis-Menten模型评估恒定的共底物浓度和变化的底物浓度的测量系列。
通过非线性回归测定vmax，Km和Ki。
Figure BDA0000367127010000641
v酶比活，Umg-1＝μmol分钟1mg-1
vmax最大酶比活，Umg-1＝umol分钟1mg-1
cs底物或辅因子浓度，mol L-1
Km半饱和浓度，mol L-1
Ki抑制常数，mol L-1
表中显示了发现的参数。
表：3种不同7β-HSDH变体的发现的参数
Km，DCS，μM Ki，DCs，mM Km，NADPH，μM vmax，U/mg
7β-HSDH WT 31±5 8.6±1.5 46±7 14.6±1.0
7β-HSDH G39A 33±6 17±4 16.4±1.9 21.0±1.1
7β-HSDH G39S 75±9 80±50 13.1±2.9 20.7±1.0
在检查了测量的数据后显而易见7β-HSDH展示了经脱氢胆酸的底物抑制，野生型蛋白所述底物抑制最强，G39S突变体最弱。特别是在最后提及的蛋白质的情况下，根据高Ki及其大误差指示，可以质疑到底是否存在底物抑制。脱氢胆酸的半饱和浓度在二位数的微摩尔范围。尽管这与野生型蛋白和G39A突变体(分别为31±5μM和33±6μM)差异不显著，G39S突变体的此值为75±9μM，几乎是另两种酶的值的两倍。在NADPH的半饱和浓度的情况下，发现突变体酶比野生型酶的值低(野生型为46+7μM，相对地，G39A突变体为16.4+1.9μM，G39S突变体为13.1±2.9μM)。
两种突变体的vmax值约是野生型蛋白的值的1.5倍(G39A突变体为21.0±1.1U/mg，G38S突变体为20.1+1.0U/mg，相对地，野生型蛋白为14.6+1.0U/mg)。然而与经典的Michaelis-Menten模型不同，在具有底物抑制的Michaelis-Menten模型中，vmax值不被视为最大可达到的酶比活，因为随着底物浓度的增加，酶比活不渐进地接近vmax，而是再次降低。最大可达到酶活性，即动力学曲线最大值处的酶比活，对野生型蛋白而言是～13U/mg，对突变体蛋白而言是～19U/mg(G39A)和～20U/mg(G39S)。在用于全细胞生物转化的底物浓度上可达到的酶活性比最大可达到的酶活性更引人关注。例如，在10mM脱氢胆酸的底物浓度上对此进行比较，对于野生型蛋白质为～6.7U/mg，G39A突变体为～13U/mg，G39S突变体为～18U/mg。因此，在10mM的底物浓度上，G39A突变体的活性是野生型蛋白的2倍，G39S突变体甚至具有野生型蛋白的3倍活性。这些差异在更高的底物浓度上应当更显著，因为野生型蛋白展示了比G39A突变体强的底物抑制，而G39A突变体转而比G39S突变体具有更强的底物抑制。
生产实施例4：FDH D221G突变体的生产和表征
4.1pET21a(+)FDH的克隆
4.1.1母牛分枝杆菌甲酸脱氢酶的PCR扩增
用于扩增的模板是母牛分枝杆菌的基因组DNA，其来自德国微生物和细胞培养物保藏所(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undzellkulturen GmbH，DMSz)，Brunswick。用于扩增的引物是
fdh_for(5′-CGATCATATGGCAAAGGTCCTGTGCGTTC-3′)(SEQID NO：23)和
fdh_rev(5′-GCTAGAATTCTCAGCCGCCTTCTTGAACT-3′)(SEQID NO：24)，
其来自Eurofins MWG GmbH，Ebersberg。下划线部分为限制酶的识别位点。rev-引物包含EcoRI切割位点，for-引物包含NdeI切割位点。
表中显示了PCR测定和PCR程序。
表：用于扩增来自母牛分枝杆菌甲酸脱氢酶的PCR测定
组分 体积[μl]
10x Taq缓冲液(含Mg2+) 5
dNTP(10mM) 1
Fdh_for(100μM) 0.5
Fdh_rev(100μM) 0.5
模板DNA(≥100ng/μL) 1
Taq DNA聚合酶(5U/mL) 0.5
蒸馏水 41.5
表：用于扩增来自母牛分枝杆菌甲酸脱氢酶的PCR程序
区段 循环数 变性 复性 延伸
1 1 94℃，2分钟
2 5 94℃，30秒 55.6℃，30秒 72℃，75秒
3 25 94℃，30秒 58.6℃，30秒 72℃，75秒
4 1 72℃，75秒
4.1.2pET21a(+)和FDH PCR产物的限制性消化
将5μl 10x NEBuffer EcoRI，2.5μl NdeI(20U/mL)和2.5μl EcoRI(20U/mL)(在每种情况下来自New England Biolabs，Frankfurt)添加至溶于水的1-5μg DNA(pET21a(+)或FDH PCR产物)中，用蒸馏水补至50μl的总体积。在每种情况下将制剂在37℃孵育1小时。然后将切割的DNA片段应用于1％的琼脂糖凝胶(1％(w/v)琼脂糖，0.05％(v/v)溴化乙锭)，并在120V电泳分离DNA片段55分钟。然后用手术刀从琼脂糖凝胶中切下正确大小的条带(FDH基因为1.2kb，pET21a(+)质粒为5.4kb)，并使用QIAquick凝胶提取试剂盒(QIAGEN，Hilden)根据制造商的方案分离。
4.1.3切割的pET21a(+)和FDH的连接
将1μl T4连接酶(3U/μL)和1μl 10x连接酶缓冲液(每个来自NewEngland Biolabs，Frankfurt)添加至100ng切割的载体DNA和111ng切割的FDH DNA中，并用蒸馏水补至10μl的总体积。在4℃过夜孵育连接制剂。
4.1.4将连接制品转化进化学感受态大肠杆菌DH5α
在连接步骤的结尾，将10μL连接制剂添加至200μl根据标准方案制备的化学感受态大肠杆菌DH5α中。下一步是在冰上孵育30分钟，接着在42℃热休克(90秒)。然后将600μl无菌LB培养基添加至转化制剂中，并在振荡培养箱中在200rpm和37℃孵育细胞45分钟。在下一步中，在台式离心机中于3000rpm离心制剂60秒，丢弃700μl上清，在剩余上清中重悬细胞然后涂在具有100mg/l氨苄青霉素的LB琼脂板上。然后在37℃过夜孵育琼脂板。
4.2.pET21a(+)FDH D221G的生产
在突变体D221G中将更详细的解释不仅可再生NADH，也可再生NADHP的FDH突变体的生产。
天冬氨酸(D)221是具有负电荷的大侧链的氨基酸，其直接与NADP+要结合的精氨酸(R)残基相邻。这可导致对NADP+中同为负电荷的磷酸基的排斥。因此将天冬氨酸替换为小的无电荷氨基酸残基甘氨酸(G)。
4.2.1使用的引物
mt1：5′-C CTG CAC TAC ACC GGC CGT CAC CGC CTG C-3′(SEQ ID NO：30)
NI_fdh_R：5′-GCTCGAATTCTCAGACCGCCTTC--3′(SEQ IDNO：31)
4.2.2流程
首先使用mt引物和引物NI_fdh_R生产一组2个互补的大引物。
使用质粒pET21a(+)FDH作为模板。在下表中显示了使用的PCR程序：
表：大引物PCR程序
区段 循环数 变性 复性 延伸
1 1 94℃，2分钟
2 30 94℃，30秒 60℃，30秒 72℃，40秒
3 1 72℃，5分钟
通过组合引物mtl和引物NI_fdh_R，使大引物的长度变为650bp。使用此第一PCR的PCR产物进行凝胶电泳和从凝胶上分离合乎要求的条带。以全质粒PCR进行第二PCR，使用大引物作为引物和质粒DNA(pETfdh)作为模板。下表中显示了用于全质粒PCR的反应混合物和温度方案。2x EZClone酶混合物、EZClone溶液1、1.1 kb标记物和DpnI来自GeneMorph II EZClone结构域诱变试剂盒(Stratagene)。
表：MEGAWHOP PCR的制各(总体积50μL)
组分
大引物 250ng(～2.5laL来自标准PCR)
模板(pETfdh) 50ng
2x EZClone酶混合物 25pL
EZClone溶液1 3pL
蒸馏水 至50pL
在PCR程序(68℃，5分钟)中的第一步是为了通过在MEGA WHOPPCR中使用的聚合酶的3’->5’外切酶活性去除Taq聚合酶非特异性附加的碱基。
表：MEGA WHOP PCR程序
区段 循环数 变性 复性 延伸
l 1 68℃，5分钟
2 1 95℃，1分钟
3 25 95℃，50秒 60℃，50秒 68℃，13分钟
PCR产物是具有单-链断裂的双链质粒，其仅在大肠杆菌中闭合。将10U DpnI添加至50μL PCR产物中并将制剂在37℃孵育2小时。DpnI只降解甲基化的DNA，即使用的模板DNA，但不降解大引物或合成的质粒。必须用dam+菌株(例如DH10B或JM109)生产模板质粒，以获得甲基化的起始DNA。
4.3突变体D221G的表达和分离
首先，从冷冻贮藏的材料或用来自琼脂板上的单个菌落接种LB预培养物并过夜孵育预培养物。在37℃和250rpm进行孵育。测定预培养物的OD并在OD为0.1时接种培养物。在OD达到0.5-1时(约2.5小时后)，用IPTG(终浓度1mM)诱导培养物。在诱导后3小时收获细胞。
用玻璃珠机械破碎细胞。为此，将0.5mL玻璃珠添加至在1.5-mL反应容器中的0.5mL细胞样品中，并在Retsch振动研磨机中以最高频率(30s-1)振动反应容器3分钟。在细胞浸渍后，离心去除玻璃珠(2分钟，13000rpm)。在浸渍之前和之后，将培养物置于冰上以最小化在振动研磨机中加热样品时的蛋白质变性。为使用在-20℃冷冻的样品优化此浸渍方案。
4.4突变体D221G的表征
在pH6，7和8下的FDH的动力学常数总结
Figure BDA0000367127010000701
Figure BDA0000367127010000711
数据证明生产的突变体可利用NAD+和NADP+作为辅因子。
生产实施例5：大肠杆菌7α-HSDH敲除突变体(大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+)的生产
目标是在表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中去除干扰的7α-HSDH活性。
使用下述方法，在靶基因7α-HSDH中插入抗生素抗性基因，从而关闭靶基因。
5.1来自大肠杆菌BL21(DE3)的7α-HSDH的序列信息
氨基酸序列：(SEQ ID NO：26)
核苷酸序列(SEQ ID NO：25)
登录号：NC_012971区：1642470..1643237
5.2使用的引物
制备了以下引物用于关闭来自大肠杆菌BL21(DE3)的7α-HSDH：
重新靶向L1.LtrB内含子的引物：
467|468a-IBS(SEQ ID NO：27)
AAAAAAGCTTATAATTATCCTTATAGGACGTCATGGTGCGCCCAGATAGGGTG
467|468a-EBS1d(SEQ ID NO：28)
CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCGTCATGTTTAACTTACCTTTCTTTGT
467|468a-EBS2(SEQ ID NO：29)
TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTTCCTATCGATAGAGGAAAGTGTCT
插入
位置
467|468a GCAGCTTTAGATGATGCATAGGAAGTCATG-内含子-TTTATATTTTTATTT
5.3敲除突变体的制备
使用来自Sigma Aldrich的TargeTronTM基因敲除系统试剂盒，根据制造商的说明书制备敲除突变体。根据TargeTronTM基因敲除系统的步骤B.6，使用来自Qiagen的QIAquick PCR纯化试剂盒纯化PCR产物。
如下进行HindIII/BsrGI消化的内含子PCR产物连接进入线性化pACD4K-C载体：反应在16℃过夜进行。
20μl制剂：
2μl pACD4K-C线性载体(40ng)
6μl HindIII/BsrGI消化的内含子PCR产物
2μl ATP(10mM)
2μl连接酶缓冲液(10x)(Fermentas)
2μl T4连接酶(Fermentas)
6μl H2O
将5μl连接反应溶液添加至200μl大肠杆菌BL21(DE3)的化学感受态细胞中并在冰上孵育20分钟。根据制造商描述的进行进一步的转化。
将转化制剂涂在包含33μg/mL卡那霉素的LB琼脂板上。挑取卡那霉素抗性的细胞并在每种情况下接种在5ml LB过夜培养物中(在每种情况下含有5μl卡那霉素溶液(33mg/m1))数晚。最后用过夜培养物接种200ml LB培养基(含有200μl卡那霉素溶液(33mg/mL))并在振荡培养箱中在37℃和180rpm孵育5小时。然后将温度升高至42℃为时1小时。使用此培养物接种5mL LB过夜培养物(在每种情况下含有5μl卡那霉素溶液(33mg/mL))。在37℃和180rpm过夜孵育后，将培养物在含33ug/mL卡那霉素的LB琼脂板上划线。在37℃过夜孵育后，挑取菌落并在含33μg/mL卡那霉素和34μg/mL氯霉素的LB琼脂板上划线。
在37℃过夜孵育后，找到氯霉素敏感突变体。这是证实质粒丢失所必需的，所述质粒是可诱导敲除系统携带的并在成功的敲除后不再需要。
5.4.敲除的检测
通过菌落PCR扩增7α-HSDH基因，使用引物
7α-ko-check_fwd
(5′-TTAATTGAGCTCCTGTACCCCACCACC-3′)SEQ IDNO：32和
7α-ko-check_rev
(5′-GTGTTTAATTCTGACAACCTGAGACTCGAC-3′)SEQ IDNO：33。
得到的片段长度约2.5-3kb并用引物7α-ko-check_fwd测序。测序显示7α-HSDH的DNA序列被来自pACD4K载体的插入片段中断，导致7α-HSDH的敲除(测序数据未显示)。
反应实施例1：7-酮-LCA通过7β-HSDH的酶促转化
为了验证7β-HSDH的生化功能，进行了7-酮-LCA通过7β-HSDH的转化。20ml反应混合物包含50mM7-酮-LCA(约0.4g)，5U/ml7β-HSDH和0.05mM NADP+。使用4U/ml ADH和1％异丙醇用于NADPH的再生(见方案1)。在通风橱中在pH8和24C搅拌进行反应。因为丙酮比异丙醇挥发得快，反应向形成UDCA的方向移动。在24小时、48小时和72小时后添加另外1％异丙醇。通过TLC(硅胶60，Merck，溶剂石油醚和乙酸乙酯1∶10，体积：体积)分析产物。在TLC中，将产物与真实参考7-酮-LCA，UDCA和CDCA比较。TLC分析显示，通过7β-HSDH从7-酮-LCA形成UDCA。在TLC中无法检测到对映体CDCA。
方案1：7-酮-LCA通过7β-HSDH的还原的示意图。ADH再生辅因子NADPH。
Figure BDA0000367127010000741
反应实施例2：通过7β-HSDH从DHCA酶促生产3，12-二酮-7β-CA
为了验证7β-HSDH在从DHCA制备12-酮-UDCA中的可用性，进行了DHCA通过7β-HSDH的转化。50ml反应混合物包含50mM DHCA(1g)，5U/ml7β-HSDH和0.05mM NADP+。使用4U/mI ADH和1％异丙醇用于NADPH的再生(见方案2)。在通风橱中在pH8和24℃搅拌进行反应。因为丙酮比异丙醇挥发得快，反应向形成3，12-二酮-7β-CA的方向移动。为了实现完全转化，在24小时、48小时和72小时后添加另外1％异丙醇。通过TLC分析中间体3，12-二酮-7β-CA。在TLC(硅胶60，Merck；溶剂氯仿∶甲醇∶乙酸10∶1∶0.08体积：体积：体积)中不再能检测到离析物DHCA。
方案2：DHCA通过7β-HSDH的还原的示意图。ADH再生辅因子NADPH。
Figure BDA0000367127010000751
反应实施例3：3，12-二酮-7β-CA酶促转化为12-酮-UDCA
中间体3，12-二酮-7β-CA(根据反应实施例2生产)通过来自睾丸酮丛毛单胞菌的3α-HSDH(SEQ ID NO：5和6)(Mobus，E.和E.Maser，MolecularCloning，overexpression，and characterization of steroid-inducible3alpha-hydroxysteroid dehydrogenase/carbonyl reductase.from Comamonastestosteroni.A novel member of the short-chain dehydrogenase/reductasesuperfamily.J Biol Chem，1998.273(47)：p.30888-96)进一步转化为12-酮-UDCA。此3α-HSDH需要辅因子NADH，所述NADH是通过FDH再生的(见图3)。将4U/ml3α-HSDH，1U/ml FDH(NADH依赖的，Codexis)，200mM甲酸钠和0.05mM NAD+添加至反应混合物中。40小时后，用2MHCl将产物酸化至pH2并用6×10ml乙酸乙酯提取。在挥发后得到1.07g产物。通过TLC和NMR分析和验证产物12-酮-UDCA。和制备7β-HSDH一样制备3α-HSDH，但使用质粒pET22b+，无需进一步纯化即可使用。
方案3：3，12-酮-7β-CA通过3α-HSDH的还原的示意图。FDH再生辅因子NADH。
Figure BDA0000367127010000761
反应实施例4：CA至DHCA的化学反应
将1320L冰醋酸置于2000L搅拌的容器中，并在其中溶解110kg(260mo1)胆酸(CA)。将422L次氯酸钠溶液(2.3重量摩尔浓度)在20至40℃添加至此溶液中，然后再搅拌反应溶液至少1小时以使反应完成。通过离心分离脱氢胆酸(DHCA)，产量为100kg(90％)。
反应实施例5：12-酮-UDCA至UDCA的化学反应
将105g(0.258mo1)12-酮-UDCA溶解在384ml三甘醇，52.2g(1.304mo1)氢氧化钠和75.95ml(1.563mo1)水合肼中，并缓慢加热至180℃。从160℃开始形成的腙转化为UDCA，分裂出氮气。将反应混合物维持在180℃为时8小时以完成反应。将反应混合物冷却至100℃之下，并添加1500ml水。然后通过用盐酸酸化来沉淀UDCA。得到产量为96.2g至99.2g(高达95％-98％)的产物。
反应实施例6：通过7β-HSDH，FHD D221G和3α-HSDH的DHCA至12-酮-UDCA的酶促转化
此实例的目的是为了研究DHCA至12-酮-UDCA的两步酶促转化和使用根据本发明使用的FDH突变体的同时的辅因子再生是否可能。由于使用的FDH突变体D221G接受NADP+和NAD+作为辅因子，对于NADH依赖性3α-HSDH，反应混合物不需要包含任何额外的辅因子再生系统。
下面图示了两个部分反应的实例。FDH*表示突变体FDH D221G。
Figure BDA0000367127010000771
为此，在修饰的大肠杆菌表达菌株中彼此分开地表达了酶来自产气柯林斯菌的7β-HSDH，来自睾丸酮丛毛单胞菌的3α-HSDH和源自牛分枝杆菌FDH的FDH突变体D221G并用于反应。修饰了用于表达的大肠杆菌菌株，如此使得其不表达任何7α-HSDH酶活性。在大肠杆菌中广泛存在的此副活性(side activity)可导致在本类型的反应(7-酮基的立体特异性转化)中出现不想要的副反应，并因此污染待生产的反应产物。
在下一个实验中使用敲除菌株大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH，其在申请人早先的欧洲专利申请EP10164003.5中描述。在此明确参考此专利申请的公开内容。
6.1使用的质粒
用于表达7β-HSDH，3α-HSDH和FHD D221G的质粒：
pET28a(+)-7β-HSDH，
pET22b(+)-3α-HSDH和
pET21a(+)-FDH-D221G。
6.2细菌菌株和培养条件：
在包含必需抗生素的LB培养基中在37℃培养上述敲除菌株大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH。在达到OD600＝0.8时用0.5mM IPTG诱导，之后在140rpm和25℃继续培养12小时的时间。
6.3酶的过表达和纯化
在与上述生产实施例2中用于在大肠杆菌BL21(DE3)中过表达和纯化7β-HSDH的相同条件下进行在大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH中的7β-HSDH，3α-HSDH和FDH突变体D221G的过表达和酶纯化。每升培养基的产量(OD600～6的摇瓶)如下：
7β-HSDH：3883U(对于DHCA和NADPH)
3α-HSDH：6853U(对于DHCA和NADH)
FDH突变体：47U(对于甲酸钠和NAD+)。
通过SDS-PAGE和使用Scion Image Beta4.0.2(Scion，USA)进行密度扫描测定蛋白质含量和纯度。
6.412-酮-UDCA的制备性规模的酶促合成
在24℃搅拌800ml包含7β-HSDH(2.4U x ml-1)，3α-HSDH(2.4U xml-1)，FDH D221G(0.325U x ml-1)，NADP+(10μM)，NAD+(10μM)，甲酸钠(250mM)，DHCA(10mM，3.2g)和磷酸钾缓冲液(50mM，pH6)的反应混合物。在此实验中使用的所有三种酶均作为细胞粗提物使用，没有另外的纯化步骤。在12小时后通过使用具有10kDa孔径的膜(Millipore，USA)超滤移除酶来终止反应。通过用盐酸酸化至pH2接着通过纸过滤纯化滤液中的产物。在60℃过夜干燥产物后，得到2.9g合乎要求的产物。
通过HPLC和NMR分析产物
分析数据(部分)：
1H NMR(氘化的DMSO，500MHz)δ＝3.92(2H，m，H-3α和H-7β)和
1H NMR(氘化的DMSO，125MHz)δ＝69.38(CH，3-C)；δ＝69.09(CH，7-C)；δ＝213.86(C，12-C)
产率：90.6％
纯度：99％
反应实施例7：通过在二质粒系统中共表达FDH D221G，7β-HSDH和3α-HSDH的DHCA至12-酮-UDCA的全细胞生物转化
目的是研究脱氢胆酸(DHCA)至12-酮-熊去氧胆酸(12-酮-UDCA)的两步全细胞还原(参见根据反应实施例6的方案，见上)是否可能。
为此，使用以上制备的敲除菌株大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+pET21a(+)FDH7β-HSDH pCOLA(mod)3α-HSDH，其中除了7β-HSDH和突变体FDH D221G以外，还重组表达来自睾丸酮丛毛单胞菌的3α-HSDH。由于使用的FDH突变体接受NADP+和NAD+二者作为辅因子，对于NADH依赖性3α-HSDH，不需要在生物转化菌株中插入任何另外的辅因子再生系统。
7.1使用的菌株：
大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+
7.2使用的分子生物学流程
7.2.1聚合酶链式反应
使用聚合酶链式反应(PCR)克隆7β-HSDH。质粒pET22b(+)7β-HSDH充当模板用于扩增7β-HSDH。
在500μL PCR管中进行PCR反应，反应体积20μL。反应在Eppendorf公司的Thermocycler中进行。为扩增7β-HSDH，在每种情况下添加4μL HF缓冲液，1μL模板DNA，正向和反向引物每个1μL(10μM)，0.4μL三磷酸脱氧核苷酸溶液(10mM)和0.2μL Phusion DNA聚合酶(2U/μL)。用不含RNA酶的水将制剂体积调节为20μL。
在反应中，首先在98℃进行2分钟的初始变性步骤。然后进行34个循环的变性(30秒，98℃)，引物杂交(2分钟，48℃)和延伸(2分钟，72℃)。作为最后一步，在72℃进行最终的10分钟延伸，然后通过冷却至4℃终止聚合酶链式反应。
7.2.2通过凝胶提取纯化DNA片段
为了纯化DNA片段，首先通过琼脂糖凝胶电泳将其分离。通过UV光显现相应的条带，基于其大小鉴定并使用手术刀从凝胶中切出。使用QIAquick凝胶提取试剂盒根据制造商的方案进行提取。使用30-50μLH2O洗脱纯化的DNA。
7.2.3用内切酶限制性酶切
在20-50μL的总体积中进行限制性酶切反应。为此，将10-20U对应的限制酶添加至待切割的DNA中。另外，使用制造商建议的反应缓冲液并基于制造商的建议，任选地添加0.5μL牛血清白蛋白(BSA，10mg/mL)。在37℃进行2小时限制性消化。然后通过凝胶提取(载体消化产物)或使用QIAquick PCR纯化试剂盒(消化的PCR产物)纯化限制性酶切的片段。
7.2.4使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化DNA片段
为了纯化限制性酶切的PCR片段，使用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化DNA。根据制造商的说明书进行纯化，使用30-50μL H2O洗脱纯化的DNA。
7.2.5DNA片段的连接
为了将限制性酶切的DNA片段克隆进表达载体，用相同的限制酶切割2种DNA分子。通过使用2种不同的酶，一方面可防止载体的连接，另一方面可以以确定的取向掺入插入片段。使用的酶为T4-DNA连接酶，其催化脱氧核酸的游离5'-磷酸基和游离3'-OH端之间形成磷酸二酯键。
为了克隆表达构建体，在每种情况下将4μL具有限制性末端的编码基因的纯化DNA片段添加至12μL限制性纯化的载体中。然后添加2μL10x连接酶缓冲液，1μL三磷酸腺苷(ATP，1mM)和1μL T4-DNA连接酶(400U/μL)。反应在16℃持续过夜。
7.3使用的载体构建体
7.3.1pET21a(+)FDH7β-HSDH
对于此载体构建体，将7β-HSDH克隆进pET21a(+)FDH，使得7β-HSDH编码基因位于FDH的下游。为此目的，必须在FDH中的5，-末端插入终止密码子。与原来的序列(Lys-Lys-Ala-Val-终止)相比，在此构建体中C-端缬氨酸残基被替换为丙氨酸残基并附加了另外的3个氨基酸，导致以下C-端序列：Lys-Lys-Ala-Ala-Gly-Asn-Ser-终止。此外，为了增加的翻译，在FDH和7β-HSDH之间在7β-HSDH中插入额外的核糖体结合位点。
使用引物7β_fwd_EcoRI和S_7β_rev_HindIII用于7β-HSDH的PCR扩增。
7β_fwd_EcoRI(SEQ ID NO：13)：
5’-GCGAATTCG
Figure BDA0000367127010000821
AAGGAGATATACATGAACCTGAGGGAGAAGTACGG-3’
S7β_rev_HindIII(SEQ ID NO：3)：
5′-CCCAAGCTTCTAGTCGCGGTAGAACGA-3’
显示了杂交序列区(黑色)，限制位点(黑体下划线)，核糖体结合位点(下划线)和填充的核苷酸(斜体)。在引物7β_fwd_EcoRI中，另外添加终止密码子(双下划线)和阅读框移动的核苷酸(黑体)。
通过EcoRI和HindIII切割位点进行克隆。
7.3.2pCOLA(mod)3α-HSDH
为了能够将脱氢胆酸两步还原为12-酮-熊去氧胆酸，除了辅因子再生系统FDH外，在细胞中也必须存在酶7β-HSDH和3α-HSDH。为了使其可行，制备载体构建体pCOLA(mod)3α-HSDH，pCOLA-duet载体的修饰的衍生物，其可与pET-载体共转化。
为此，经由NdeI和BlpI切割位点从载体pET22b(+)3α-HSDH切下3α-HSDH编码基因，并且经由相同的切割位点，克隆进pCOLA(mod)载体的MCS2。测序后发现在DNA序列第45位处，鸟嘌呤被替换为胞嘧啶，但这导致沉默突变。然而，此突变对氨基酸序列没有影响，因此这是所谓的沉默突变。
如下所述，将2种载体共转化入上述菌株中。基因可用IPTG诱导。
7.4大肠杆菌细胞的热休克转化
为此，融解200μL化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+或DH5α并添加1μμL DNA。首先将这些在冰上孵育45分钟。然后对细胞进行热休克，在42℃为时45秒。然后将600μL LB培养基添加至细胞中，并将其在37℃和200rpm振荡，使得其可出现合乎要求的抗生素抗性。接下来在台式离心机中以3000rpm离心细胞2分钟，之后丢弃150μL上清。在剩余的上清中重悬细胞并涂在具有相应抗生素的LB琼脂板上。然后将板在37℃孵育过夜。
在共转化2种不同质粒的情况下，这是产生包含质粒pCOLA(mod)3α-HSDH和pET21a(+)FDH7β-HSDH的菌株所必需，在每种情况下将2μL待插入的质粒添加至50μL化学感受态大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+中。转化后，将细胞添加至具有5mL含相应抗生素的LB培养基的预培养试管中并在37℃在预培养摇床上以200rpm孵育16-48小时，直到在预培养试管中检测到细菌的生长。下一步将5μL细菌悬浮液涂在具有相应抗生素的LB琼脂板上，并在37℃孵育过夜。
7.5在摇瓶中培养菌株：
为了表达重组蛋白，将包含2种表达质粒的相应大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+在37℃和200rpm在5mL添加了相应抗生素的LB培养基中孵育过夜。然后用此预培养物接种200mL添加了相应抗生素的TB培养基，并在37℃，250rpm孵育。在OD600达到0.6-0.8时，用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导重组蛋白的表达，并在25℃，160rpm下再培养21小时培养物。
7.6进行全细胞生物转化和测试结果
在2mL反应体积的pH6.0的悬浮液中进行反应，使用OD600＝20的细胞密度。选择25mM或50mM的脱氢胆酸作为底物浓度，使用的共底物浓度为400mM。在25℃隔绝空气进行测试。在48小时后采样。
在使用25mM的反应混合物的情况下，不再能检测到底物，而在使用50mM脱氢胆酸的反应混合物的情况下，可检测到底物峰，但其峰面积低于使用HPLC方法校准的样品中1μg/mL底物的限制。同样地也适用于3，12-二酮-熊去氧胆酸的峰。在色谱图中最大的峰是产物12-酮-熊去氧胆酸的峰。
因此，出乎意料地，可见脱氢胆酸至3-酮-熊去氧胆酸的两步全细胞还原是可行的。
HPLC测量的色谱图显示在图7中。
如下进行HPLC分析：使用的色谱柱是Merck，Darmstadt公司的反相层析柱Hi-bar Purospher125-4RP-18e(5μm)。在此情况下使用非极性相作为固定相，而极性相形成流动相。使用梯度洗脱法用于HPLC分析。对洗脱剂磷酸水(pH2.6)添加增加的比例的乙腈，并且溶剂的酸化导致待研究的分析物的均匀的质子化程度。在洗脱了所有组分后，用初始比例的两种溶剂平衡层析柱。如下进行梯度洗脱：首先泵送具有65％(v/v)磷酸水和35％(v/v)乙腈的恒定组成的溶剂混合物通过HPLC柱，持续3分钟。从第3-7.5分钟，将乙腈的比例线性增加至39％(v/v)。在第7.5-10分钟之间，再次线性增加乙腈的比例至40％(v/v)。为了洗脱所有样品组分，在第10-11分钟之间也线性增加乙腈的比例至70％(v/v)，并再恒定地维持此数值2分钟。之后，从第13-15分钟将乙腈的比例降低回35％的初始值，并用此溶剂组成平衡柱3分钟。在全程中将流速设定为1.000mL/分钟。通过UV-检测器在200nm波长处检测洗脱的分析物。
反应实施例8：通过在单质粒系统中共表达FDH D221G，7β-HSDH和3α-HSDH的DHCA至12-酮-UDCA的全细胞生物转化
目的是研究在细胞单质粒系统中脱氢胆酸至12-酮-熊去氧胆酸的两步全细胞还原是否可行。
8.1使用的质粒：
下划线为限制性酶切位点；核糖体结合位点具有灰色背景。
8.2载体的生产：
如下制备质粒构建体pET21a(+)FDH7β-HSDH(G39A)3α-HSDH(图8)：从质粒pET21a(+)FDH7β-HSDH开始，经由HindIII和NotI切割位点在7β-HSDH之后克隆入野生型3α-HSDH(睾丸酮丛毛单胞菌；SEQ IDNO：5，6)。为了扩增3α-HSDH，使用引物3α_fwd_HindIII和3α_rev_NotI，为此使用质粒pET22b(+)3α-HSDH作为模板。然后通过定点诱变根据QuikChange方案将G39A突变插入7β-HSDH中。使用诱变引物7β_mut_G39A_fwd和7β_mut_G39A_rev。
8.3反应：
将制备的质粒转化进大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+。使用得到的菌株大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+pET21a(+)FDH7β-HSDH(G39A)3α-HSDH，在150-mL规模上在以下条件下进行全细胞反应：细胞密度OD30，50mM DHCA，750mM甲酸钠，在50mM磷酸钾缓冲液(pH6.5)中悬浮为细胞和底物悬浮液。反应在25℃下进行3.5小时。HPLC分析的结果(程序见反应实施例7，见上)显示在图9中。
生产实施例6：其他7β-HSDS突变体的生产及其表征
生成NADH特异性7β-HSDH的一种可能性由通过多种诱变技术修饰可用的酶组成。因此，使用定点诱变，将7β-HSDH的单个氨基酸取代为导致7β-HSDH的辅因子特异性从NADPH变为NADH的其他氨基酸，从而有利地将NADP替换为较便宜的NAD。
6.1引物
总共生产了7β-HSDH突变体G39D，G39D/R40L，G39D/R40I和G39D/R40V。通过Quickchange诱变生产G39D突变体，并通过Sanchis等人的PCR法(Sanchis J，Fernández L，Carballeira JD，Drone J，Gumulya Y，
Figure BDA0000367127010000861
，Kahakeaaw D，Kille S，Lohmer R，Peyralans JJ，Podtetenieff J，Prasad S，SoHi P，Taglieber A，Wu S，Zilly FE，Reetz MT.Improved PCR method for the creation of saturation mutagenesis librariesin directed evolution：application to difficHlt-to-amplify templates.Appl Microbiol Biotechnol.2008Nov；81(2)：387-97)生产其他突变体。野生型的序列和生产的突变体的序列比较显示在图10中。使用以下引物用于诱变，在每种情况下斜体显示编码替换的氨基酸的碱基：
G39D
7βmut G39D fwd
(SEQ ID NO：41)：CGTCGTCATGGTCGACCGTCGCGAGG
7βmut G39D rev
(SEQ ID NO：42)：CCTCGCGACGGTCGACCATGACGACG
G39D R40L
7βmut G39D R40L fwd
(SEQ ID NO：43)：CGTCGTCATGGTCGACCTGCGCGAGG
3αmut_AntiMid_rev
(SEQ ID NO：44)：CCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCC
G39D R40I
7βmut G39D R40I fwd
(SEQ ID NO：45)：CGTCGTCATGGTCGACATTCGCGAGG
3αmut_AntiMid_rev
(SEQ ID NO：44)：CCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCC
G39D R40V
7βmut G39D R40V fwd
(SEQ ID NO：46)：CGTCGTCATGGTCGACGT7CGCGAGG
3αmut_AntiMid_rev
(SEQ ID NO：44)：CCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCC
6.2  7β-HSDH突变体的酶动力学研究
通过酶动力学研究评估了制备的突变体，其结果以图的形式显示在图11中。使用0.1mM NADPH作为辅因子研究未修饰的7β-HSDH，而使用0.5mM NADH用于研究7β-HSDH突变体。在7β-HSDH突变体的酶动力学研究中需要增加辅因子浓度的原因是在突变体中辅因子NADH的半饱和浓度增加。从底物浓度对酶比活的图中，对7β-HSDH突变体可见Michaelis-Menten动力学的特征曲线，而从未修饰的野生型7β-HSDH的图中可见具有底物抑制的Michaelis-Menten动力学曲线。因此，使用经典的Michaelis-Menten模型(方程1)评估7β-HSDH突变体的测量系列，使用具有底物抑制的Michaelis-Menten模型用于未修饰的野生型7β-HSDH的测量系列(方程2)。
方程1(Michaelis-Menten方程)
EA X = v max · c s K m + c s
EAx：酶比活，Umg-1＝μmol分钟-1mg-1
vmax：最大酶比活，Umg-1＝μmol分钟-1mg-1
cs：底物或辅因子浓度，mol L-1
Km：半饱和浓度，mol L-1
方程2(具有底物抑制的Michaelis-Menten方程)
EA X = v max · c s K m + ( 1 + c s K i ) c s
EAx：酶比活，Umg-1＝μmol分钟-1mg-1
vmax：最大酶比活，Umg-1＝μmol分钟-1mg-1
cs：底物或辅因子浓度，mol L-1
Km：半饱和浓度，mol L-1
Ki：抑制常数，mol L-1
下表提供了未修饰的野生型7β-HSDH及其具有改变的辅因子特异性的突变体的酶动力学参数。使用NADPH作为野生型的辅因子，而使用NADH作为突变体的辅因子。
Km，DHCA，μM Ki，DHCA，μM vmax，U mg-1
野生型 31±5 8600±1500 14.6±1.0
G39D 660±120 n.d. 2.90±0.16
G39D R40I 920±170 n.d. 4.64±0.27
G39D R40V 880±120 n.d. 2.69±0.12
G39D R40L 560±80 n.d. 1.60±0.07
生产实施例7：其他7β-HSDS突变体的生产及其表征
与生产实施例6平行制备生产了其他7β-HSDS突变体。
7.1引物
使用下面显示的诱变引物用于7β-HSDH的定点诱变。基于7β-HSDH基因序列选择引物，使得其引起合乎要求的氨基酸替换。注意，待突变的碱基位于引物的中间，引物对的熔点位于相同区。
使用以下引物对制备突变体：
表：用于7β-HSDH的定点诱变的引物
Figure BDA0000367127010000891
7.2PCR程序
在反应中，首先在98℃进行2分钟的初始变性步骤。然后进行23个循环的变性(30秒，98℃)，引物杂交(1分钟，60-68℃)和延伸(3.5分钟，72℃)。作为最后一步，在72℃进行最终的10分钟延伸，然后通过冷却至4℃终止聚合酶链式反应。
7.3PCR测定
表：用于生产不同7β-HSDH变体的PCR测试
HF缓冲液(5x) 10μl
dNTP混合物(10mM) 1.0μl
正向引物(10pmol/μl) 5μl
反向引物(10pmol/μl) 5μl
模板 1.5μl
Phusion聚合酶 0.5μl
DMSO 2.5μl
ddH2O 24.5μl
50μl
使用具有7β-HSDH(野生型)的pET21a载体作为模板。
7.4流程
为了在蛋白质序列中氨基酸的靶向替换，对相应基因的DNA序列进行定点突变。为此，使用在其序列中携带合乎要求的突变的互相互补的引物。使用携带待突变的基因的N6-腺嘌呤甲基化的双链质粒DNA作为模板。从dam+大肠杆菌菌株例如大肠杆菌DH5中分离N6-腺嘌呤甲基化的质粒DNA。
如上所述进行聚合酶链式反应。引物相对模板互补地延长，从而形成具有合乎要求的突变的质粒，所述质粒具有链断裂。与其他PCR反应不同，在此情况下DNA产量的增加仅是线性的，因为新形成的DNA分子不能作为PCR反应的模板。
在PCR反应完成后，使用PCR纯化试剂盒(Analytik Jena)纯化PCR产物，并使用限制酶DpnI消化亲本N6-腺嘌呤甲基化的DNA。此酶具有下述特别的特性，即其非特异性地限制性酶切N6-腺嘌呤甲基化的DNA，而不限制性酶切新形成的非甲基化的DNA。通过对PCR反应混合物添加lμL DpnI并在37℃孵育2小时或过夜进行限制性酶切。
使用5μl此制剂用于转化100μl化学感受态DH5α细胞。在分离质粒后，通过测序验证成功的突变。
7.5表征
根据QuikChange方案通过定点诱变将突变引入7β-HSDH。使用在章节7.1中显示的表中的诱变引物。
使用在“方法，，章节中提供的测定用于光度测量活性，在NADPH或NADH的存在下测量突变的酶的活性。得到的活性显示在下表中。
表：对不同7β-HSDH变体得到的活性
Figure BDA0000367127010000911
反应实施例9：在脱氢胆酸全细胞还原至3，12-二酮-uDCA中使用NADH依赖性7β-HSDH
下面证明了在生产实施例6中生产的NADH依赖性7β-HSDH在DHcA全细胞生物催化转化至3，12-二酮-UDCA中的用途。为了便于理解，在图12中显示了可能的反应途径和反应产物的回顾。
在目前情况下，将7β-HSDH突变体与来自母牛分枝杆菌的NADH依赖性甲酸脱氢酶一起插入表达载体。其中插入7β-HSDH(G39D)的载体名为pFr7(D)，对应于SEQ ID No：49；其中插入7β-HSDH(G39D R40L)的载体名为pFr7(DL)，对应于SEQ ID No：50；其中插入7β-HSDH(G39DR40I)的载体名为pFr7(DI)，对应于SEQ ID NO：51，而其中插入7β-HSDH(G39D R40V)的载体名为pFr7(DV)，对应于SEQ ID No：52。图13中显示了这些载体的一般质粒图。
将这些载体转化进菌株大肠杆菌BL49(与大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+相同)中。首先，将来自这些菌株的5mL过夜培养物生长在具有100mg L-1氨苄青霉素的LB培养基中。在第二天在每种情况下将1mL这些过夜培养物转移至在摇瓶中的具有100mg L-1氨苄青霉素的200mL TB培养基中。在37℃和250rpm在振荡孵育箱中培养这些培养物，直到达到0.6-0.8的OD。然后用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。在25℃和160rpm进行随后的表达阶段21小时。通过以3220g离心10分钟收获细胞。
使用以这种方式生产的细胞建立全细胞生物转化反应。通过高效液相色谱(HPLC)测定在多个时点处反应混合物中的底物DHCA和产物3，12-二酮-UDCA的浓度。
用于生物转化的反应混合物含有17.7g L-1 BTM全细胞生物催化剂，100mM底物(DHCA)，500mM甲酸钠并悬浮在50mM甲酸钾缓冲液(pH6.5)中。该过程在20mL规模以分批过程进行，没有pH监控。在24小时后的产物和底物浓度显示在图14中。可见所有突变体都适于DHCA全细胞生物催化转化至3，12-二酮-UDCA。
反应实施例10：在脱氢胆酸两步全细胞还原至12-酮-UDCA中使用NADH依赖性7β-HSDH
下面证明了NADH依赖性7β-HSDH在DHCA两步全细胞生物催化转化至12-二酮-UDCA中的用途。将突变体7β-HSDH(G39D)与来自母牛分枝杆菌的NADH依赖性甲酸脱氢酶和来自睾丸酮丛毛单胞菌的NADH依赖性3α-HSDH一起插入表达载体。显示了使用7β-HSDH(G39D)作为所有NADH依赖性7β-HSDH的实例。载体名为pFr3T7(D)并图示在图15中。
将这些载体转化进菌株大肠杆菌BL49中(与大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+相同)；得到的菌株名为大肠杆菌BL49pFr3T7(D)。在7L生物反应器中以4L的工作体积在成分确定的基本培养基中培养此菌株。在37℃的短暂的初始阶段后是在30℃的底物受限的指数生长阶段。在达到25-30的光密度后，通过添加0.5mM IPTG诱导细胞的蛋白质表达。然后在20℃进行表达24小时。通过离心收获细胞(32.0g L-1 BTM)，重悬在磷酸钾缓冲液(pH6.5)中并根据标准方案贮藏在-20℃。
在20-mL规模在以下反应条件下建立生物转化：100mM DHCA，17.7g L-l BTM贮藏的生物催化剂，500mM甲酸铵，26％甘油，50mM MgCl2，悬浮在50mM KPi缓冲液(pH6.5)中。使用手动pH调节，在生物转化过程的前5小时期间将pH维持在pH6.5。在图16中显示了作为时间的函数的胆汁盐浓度。在24小时后，已形成了92％的产物12-酮-UDCA。DHCA至3，12-二酮-UDCA的转化和7，12-二酮-UDCA至12-酮-UDCA的转化显示，在图12中显示的所有7β-HSDH反应实际上是由7β-HSDH(G39D)催化的。
反应实施例11：在单细胞系统中脱氢胆酸的两步还原
熊去氧胆酸合成的一个途径包含胆酸化学氧化至脱氢胆酸，随后是3-羰基至3α-羟基和7-羰基至7β-羟基的非对称酶促还原，接着是12-羰基的化学去除。
对于此合成途径，需要酶7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)和3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSDH)催化酶促还原反应。在反应中，额外地，化学计量地消耗辅因子(NADH或NADPH)，在经济的方法中必须再生这些辅因子。为此通常优选酶促再生的可能性。合适的酶包括甲酸脱氢酶(FDH)、葡萄糖脱氢酶(GDH)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)、醇脱氢酶(ADH)或亚磷酸盐脱氢酶(PtDH)。
与使用分离的酶相反，在全细胞生物催化中，对于在宿主生物，通常是单细胞微生物内的必需的酶，不可能对反应介质添加单独量的单独酶。在这种情况下必须通过改变所有参与的酶的表达水平来平衡酶的活性，所述改变所有参与的酶的表达水平是通过培养方法或通过全细胞生物催化剂的基因修饰进行的。
在本实施例中，根据本发明使用包含7β-HSDH，3α-HSDH和FDH的所有3种基因的载体。构建载体使得以所有三种酶具有尽可能相似的酶活性的方式来调整三种基因在指定的宿主菌株，特别是基于大肠杆菌BL21(DE3)的全细胞生物催化剂菌株中的表达水平。
在脱氢胆酸至12-酮-熊去氧胆酸的全细胞还原中所需的3种基因位于同一个载体上。这些基因编码以下酶：来自产气柯林斯菌的NADPH依赖性7β-HSDH，来自睾丸酮丛毛单胞菌的NADH依赖性3α-HSDH，来自母牛分枝杆菌的NAD和NADP依赖性的突变的FDH。通过基因构建体平衡这三种基因的表达水平，从而进行最佳全细胞生物催化。在本实施例中，将7β-HSDH突变体G39A和G39S而不是未修饰的野生型酶插入载体用于全细胞生物催化。载体名为pF(G)r7(A)r3和pF(G)r7(S)r3并显示在图17a和b中。图18显示了可能的反应途径和反应产物的示意图。
将将根据本发明的这些载体转化进入大肠杆菌生产菌株。这些菌株代表全细胞生物催化剂。使用的宿主菌株是经修饰的大肠杆菌BL21(DE3)，名为大肠杆菌BL49。然而，宿主生物不限于此宿主菌株。用pF(G)r7(A)r3转化的大肠杆菌BL49名为大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)r3，并且用pF(G)r7(S)r3转化的大肠杆菌BL49名为大肠杆菌BL49pF(G)r7(S)r3。
11.120-mL规模的脱氢胆酸的两步全细胞还原
通过20-mL规模的全细胞生物转化比较生物催化剂。为此，首先在具有100mg L-1氨苄青霉素的LB培养基中培养5mL过夜培养物。第二天，将1mL此过夜培养物转移进摇瓶中的具有100mg L-1氨苄青霉素的200mL TB培养基中。在振荡孵育箱中在37℃和250rpm培养这些培养物，直至达到0.6-0.8的OD。然后用1mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。在25℃和160rpm进行随后的表达阶段21h。通过以3220g离心10分钟收获细胞。
使用以此方式生产的细胞建立全细胞生物转化。在反应混合物中形成的产物(12-酮-UDCA)的量决定了对细胞的评估。通过高效液相色谱(HPLC)测定反应混合物中的底物DHCA，中间体3，12-二酮-UDCA和7，12-二酮-UDCA和产物12-酮-UDCA的浓度。
用于生物转化的反应混合物含有11.8g L-1 BTM全细胞生物催化剂，100mM底物(DHCA)，500mM甲酸钠并悬浮在50mM甲酸钾缓冲液(pH6.5)中。该过程在20mL规模以分批过程进行，没有pH监控。下表给出了在5小时的过程时间后上述全细胞生物转化的结果。将2种新菌株大肠杆菌BL49pF(G)r7(S)r3和大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)r3与参考菌株大肠杆菌BL49pF(G)r7pC3进行比较。使用参考菌株大肠杆菌BL49pF(G)r7pC3，仅形成了5.7±1.0％的产物(12-酮-UDCA)，而使用新生物催化剂菌株大肠杆菌BL49pF(G)r7(S)r3形成了38.4±8.2％的12-酮-UDCA，并且使用菌株大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)r3形成了47.7±2.1％的12-酮-UDCA。因此在反应混合物中的产物浓度相对参考菌株增加了6.7倍(大肠杆菌BL49pF(G)r7(S)r3)和8.4倍(大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)r3)。
因此，下表显示了当使用100mM底物(DHCA)时，在5小时后在生物转化批次中胆汁盐的比例。显示了使用2种新生物催化剂菌株大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)r3和大肠杆菌BL49pF(G)r7(S)r3的批次和根据现有技术的菌株大肠杆菌BL49pF(G)r7pC3的比较：
11.21L规模的脱氢胆酸的两步全细胞还原
通过过程控制，相对毫升规模提高了使用生物催化剂大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)r3的产物形成。为此，在7L生物反应器中以4L工作体积在成分确定的基本培养基中培养生物催化剂。在37℃的短暂的初始阶段后是在30℃的底物受限的指数生长阶段。在达到25-30的光密度后，通过添加0.5mM IPTG诱导细胞的蛋白质表达。然后在25℃进行表达10小时，之后通过离心收获细胞并贮藏在-20℃。
在1L生物反应器中在以下反应条件下建立生物转化：70mM DHCA，17.7g L-1 BTM贮藏的生物催化剂，500mM甲酸铵，26％(v/v)甘油，50mMMgCl2，悬浮在50mM KPi缓冲液(pH6.5)中。使用pH调节，在生物转化全程中将pH维持在pH6.5。在图19中显示了作为时间函数的胆汁盐浓度的变异。在21小时后，已形成了99.4％的产物(12-酮-UDCA)，并仅可检测到0.6％的副产物3，12-二酮-UDCA。
反应实施例12：在单细胞系统中脱氢胆酸的两步还原，使用用于辅因子再生的葡萄糖脱氢酶
在此实施例中，除了来自产气柯林斯菌的NADPH依赖性7β-HSDH(突变体G39A)和来自睾丸酮丛毛单胞菌的NADH依赖性3α-HSDH以外，在全细胞生物催化剂(单细胞系统)中表达用于辅因子再生的来自枯草芽孢杆菌的NAD和NADP依赖性的GDH，用于DHCA两步还原至12-酮-UDCA。此GDH的核酸序列和相关联的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：47和SEQ ID NO：48中给出。
用于此的载体名为p3T7(A)rG和p7(A)T3rG，并分别显示在图20和图21中。
将根据本发明的载体转化进大肠杆菌生产菌株中。这些菌株代表全细胞生物催化剂。使用的宿主菌株是经修饰的大肠杆菌BL21(DE3)，名为大肠杆菌BL49(与大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+相同)。然而，宿主生物不限于此宿主菌株。用p7(A)T3rG转化的大肠杆菌BL49名为大肠杆菌BL49p7(A)T3rG，用p3T7(A)rG转化的大肠杆菌BL49名为大肠杆菌BL49p3T7(A)rG。
使用新生产的生物催化剂，使用总共17.7g/L BTM生物催化剂，可将100mM DHCA以98％的程度转化为12-酮-UDCA。
12.120-mL规模的脱氢胆酸的两步全细胞还原
通过20-mL规模的全细胞生物转化比较生物催化剂。如反应实施例11.1中描述的进行培养和测定反应混合物中的底物DHCA，中间体3，12-二酮-UDCA和7，12-二酮-UDCA和产物12-酮-UDCA的浓度。
用于生物转化的反应混合物包含11.8g/L BTM全细胞生物催化剂，100mM底物(DHCA)，500mM葡萄糖并悬浮在50mM甲酸钾缓冲液(pH7.3)中。该过程在20mL规模以分批过程进行，没有pH监控。不需要穿孔生物催化剂。下表显示了在24小时过程时间后上述全细胞生物转化的结果，显示了使用2种菌株大肠杆菌BL49p7(A)T3rG和大肠杆菌BL49p3T7(A)rG的全细胞生物转化结果。使用新生物催化剂，使用11.8g L-1 BTM生物催化剂，在24小时内可将100mM脱氢胆酸(DHCA)以46％(大肠杆菌BL49p3T7(A)rG)或68％(大肠杆菌BL49p7(A)T3rG)的程度转变为12-酮-熊去氧胆酸(12-酮-UDCA)。下表显示了使用100mM底物(DHCA)在24小时后的生物转化批次(使用2种新生物催化剂菌株大肠杆菌BL49p3T7(A)rG和大肠杆菌BL49p7(A)T3rG的批次)中的胆汁盐比例：
Figure BDA0000367127010000971
12.2使用20-mL规模的在生物反应器中培养的菌株大肠杆菌BL49p7(A)T3rG的细胞的脱氢胆酸的两步全细胞还原
在7L生物反应器中以4L的工作体积在成分确定的基本培养基中培养菌株大肠杆菌BL49p7(A)T3rG。在37℃的短暂的初始阶段后是在30℃的底物受限的指数生长阶段。在达到25-30的光密度后，通过添加0.5mMIPTG诱导细胞的蛋白质表达。然后在20℃表达24小时。通过离心收获细胞(46.7g/L BTM)，重悬在磷酸钾缓冲液(pH6.5)中并根据标准方案贮藏在-20℃。在收获时，酶活性为：16.4U/mL7β-HSDH，3.6U/mL3α-HSDH，44.9U/mL GDH(NADP)，18.1U/mL GDH(NAD)。
在20-mL规模在以下反应条件下建立生物转化：100mM DHCA，17.7g/L BTM贮藏的生物催化剂，500mM葡萄糖，10mM MgCl2，悬浮在50mM KPi缓冲液(pH7)中。使用手动pH调节，在生物转化全程将pH维持在pH7。不添加辅因子或添加0.1mM NAD进行反应。在图22中显示了作为时间的函数的胆汁盐浓度的变异。在2小时后，在添加和不添加NAD的每种情况下形成了≥98％的产物(12-酮-UDCA)。
使用总共17.7g/L BTM生物催化剂，将100mM DHCA以98％的程度转变为12-酮-UDCA。
反应实施例13：平行使用2种不同的全细胞生物催化剂的脱氢胆酸的两步还原
在此实施例中，使用2种全细胞生物催化剂而不是一种全细胞生物催化剂。为此，在一种生物催化剂中表达来自母牛分枝杆菌的NADP特异性FDH和来自产气柯林斯菌的NADPH特异性7β-HSDH，而在另一种生物催化剂中表达来自母牛分枝杆菌的NAD依赖性FDH和来自睾丸酮丛毛单胞菌的NADH依赖性3α-HSDH。
在本实施例中，具体使用包含来自母牛分枝杆菌的NADP特异性FDH的基因和来自产气柯林斯菌的NADPH特异性7β-HSDH的基因的载体pF(G)r7(A)，和包含来自母牛分枝杆菌的NAD依赖性FDH的基因和来自睾丸酮丛毛单胞菌的NADH依赖性3α-HSDH的基因的载体pFr3。载体pF(G)r7(A)和pFr3显示在图23a和b中。图24显示了具有可能的途径和产物的反应方案。然而，本发明不限于这两种陈述的载体，而是可包含所有可想到的包含7β-HSDH基因和合适的辅因子再生酶基因的载体和包含3α-HSDH基因和合适的辅因子再生酶基因的载体的组合。
13.1使用不同混合比例的两种生物催化剂的DHCA的全细胞还原
在以下实施例中显示了DHCA全细胞还原至12-酮-UDCA，其中使用不同混合比例的生物催化剂大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和大肠杆菌BL49pFr3。在此情况中，在3个批次的每种情况下使用17.7g L-1 BTM的生物催化剂总量。然而，在批次中使用不同比例的2种生物催化剂。比例为
-8.85g L-1 BTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和8.85g L-1 BTM大肠杆菌BL49pFr3
-10.33g L-1 BTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和7.38g L-1 BTM大肠杆菌BL49pFr3
-11.80g L-1 BTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和5.90g L-1 BTM大肠杆菌BL49pFr3
在20mL的工作体积中进行这些生物催化反应。批次的其他成分是：70mM DHCA，500mL甲酸钠，26％甘油，50mM MgCl2，悬浮在50mL磷酸钾缓冲液(pH6.5)中。反应进行24小时。在24小时后胆汁盐的比例显示在图25中。
在具有8.85g L-1 BTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和8.85g L-1 BTM大肠杆菌BL49pFr3的制剂中，形成了79％12-酮-UDCA，4％3，12-二酮-UDCA和17％7，12-二酮-UDCA，在具有10.33g L-l BTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和7.38g L-l BTM大肠杆菌BL49pFr3的制剂中，形成了87％12-酮-UDCA，9％3，12-二酮-UDCA和4％7，12-二酮-UDCA，而在具有11.80g L-l BTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和5.90g L-l BTM大肠杆菌BL49pFr3的制剂中，形成了71％12-酮-UDCA和29％3，12-二酮-UDCA。从形成的中间体的比例中可见，在具有8.85g L-1 BTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和8.85g L-1 BTM大肠杆菌BL49pFr3的制剂的情况下，3α-HSDH的反应以增加的速率进行，因为在此情况下形成了高比例的中间体7，12-二酮-UDCA，而在具有11.80g L-1 BTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和5.90g L-1 BTM大肠杆菌BL49pFr3的制剂的情况下，7β-HSDH的反应以增加的速率进行并因此形成高比例的中间体3，12-二酮-UDCA。在具有10.33g L-1 BTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和7.38g L-1 BTM大肠杆菌BL49pFr3的制剂中，从几乎一致的中间体形成可见，7β-HSDH的反应和3α-HSDH的反应被调整使得二者以大约相等的速率发生。因此，使用此制剂可形成最高比例的产物12-酮-UDCA(87％)。
此实施例显示，可通过调整使用的生物催化剂的比例影响单独反应步骤的速率。
13.1使用两种生物催化剂的1L规模的DHCA的全细胞还原
通过过程控制，使用生物催化剂大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和大肠杆菌BL49pFr3，相对于毫升规模可增加产物形成。在1L生物反应器中在以下反应条件下建立生物转化：90mM DHCA，使用8.85g L-1 BTM大肠杆菌BL49pF(G)r7(A)和8.85g L-1 BTM大肠杆菌BL49pFr3，500mM甲酸铵，26％(v/v)甘油，50mM MgCl2，悬浮在50mM KPi缓冲液(pH6.5)中。用甲酸进行pH调节，在生物转化全程将pH维持在pH6.5。在图26中显示了作为时间的函数的胆汁盐浓度的变异。在20h后，已形成了99.4％产物(12-酮-UDCA)，仅检测到总共0.6％的中间体3，12-二酮-UDCA和7，12-二酮-UDCA。
使用根据本发明的生物催化剂，使用总共17.7g L-1 BTM生物催化剂，可将90mM DHCA以99.5％的程度转变为12-酮-UDCA。
SEO ID NO的分配：
Figure BDA0000367127010001011
Figure BDA0000367127010001031
AS＝氨基酸序列
NS＝核酸序列
明确参考本文提及的文件的公开内容。
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Claims (23)

1.7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)突变体，所述突变体至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，其中突变体较之非突变的酶，具有特别是对7-酮类固醇底物的降低的底物抑制，和/或改变的辅因子利用。
2.如权利要求1中要求保护的突变体，其中所述突变体在根据SEQ IDNO：2的氨基酸序列或从其衍生的具有至少60％序列同一性的氨基酸序列中有至少一个突变。
3.7β-羟基类固醇脱氢酶(7β-HSDH)突变体，所述突变体至少催化7-酮类固醇立体特异性酶促还原至对应的7-羟基类固醇，其中所述突变体在根据SEQ ID NO：2的第36至42位的序列基序VMVGRRE中或从其衍生的具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的对应的序列基序中有至少一个突变。
4.如权利要求2或3中要求保护的突变体，所述突变体选自
a)单突变体G39X1和R40X2
b)双突变体(G39X1，R40X2)，(R40X2，R41X3)和(G39X1，R41X3)或
c)三突变体(G39X1，R40X2，R41X3)，
d)或从SEQ ID NO：2衍生的具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的对应的单、双或三突变体；
其中在每种情况下X1，X2和X3彼此独立地代表突变的氨基酸残基。
5.重组微生物，其携带编码如前述权利要求之一中要求保护的突变体的至少一种核酸序列或至少一种对应的表达盒或至少一种对应的载体并另外任选地携带另一种酶的编码序列，所述另一种酶选自羟基类固醇脱氢酶，例如3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSDH)，和适于辅因子再生的脱氢酶。
6.用于7β-羟基类固醇的酶促或微生物合成的方法，其中在存在根据权利要求1至4之一中定义的7β-HSDH突变体时或在存在表达此突变体的重组微生物时，使对应的7-酮类固醇起反应，且任选地从反应混合物中分离形成的至少一种还原产物。
7.如权利要求6中要求保护的方法，其中所述还原在存在和特别是消耗NADPH和/或NADH时进行。
8.如权利要求7中要求保护的方法，其中通过与NADPH再生酶偶联再生用过的NADPH，其中所述NADPH再生酶特别选自NADPH脱氢酶、醇脱氢酶(ADH)、和NADPH再生甲酸脱氢酶(FDH)和NADPH再生葡萄糖脱氢酶(GDH)，其中所述NADPH再生酶任选地通过重组微生物表达；和/或其中通过与NADH再生酶偶联再生用过的NADH，其中所述NADH再生酶特别选自NADH脱氢酶、NADH再生甲酸脱氢酶(FDH)、NADH再生醇脱氢酶(ADH)、NADH再生葡萄糖-6-磷酸-脱氢酶(G6PDH)、NADH再生亚磷酸盐脱氢酶(PtDH)和NADH再生葡萄糖脱氢酶(GDH)，其中所述NADH再生酶任选地在重组微生物中表达。
9.如权利要求8中要求保护的方法，其中所述NADPH再生酶选自NAD+依赖性甲酸脱氢酶(FDH)(其至少催化甲酸酶促氧化至CO2)的突变体，其中所述突变体较之非突变的酶，额外地接受NADP+作为辅因子。
10.如权利要求9中要求保护的方法，其中所述NADP+接受FDH突变体在根据SEQ ID NO：36的来自母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)N10的FDH的氨基酸序列或从其衍生的具有至少60％序列同一性的氨基酸序列中有至少一个突变。
11.如权利要求9和10之一中要求保护的方法，其中所述NADP+接受突变体在根据SEQ ID NO：36的第221至226位的序列基序TDRHRL中或在从其衍生的具有至少60％序列同一性的氨基酸序列的对应序列基序中有至少一个突变。
12.核酸序列，其选自以下核酸序列：
a洞时编码如权利要求9至11之一中要求保护的FDH突变体和如权利要求1至4之一中要求保护的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH；或
b)同时编码如权利要求9至11之一中要求保护的FDH突变体和非突变的7β-HSDH(野生型)和任选地3α-HSDH；或
c)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如权利要求9至11之一中要求保护的FDH突变体和如权利要求1至4之一中要求保护的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH；或
d)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含如权利要求9至11之一中要求保护的FDH突变体和非突变的7β-HSDH和任选地3α-HSDH；或
e)同时编码FDH野生型和如权利要求1至4之一中要求保护的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH；或
f)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含FDH野生型，如权利要求1至4之一中要求保护的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH；或
g)同时编码GDH、7β-HSDH野生型和任选地3α-HSDH；或
h)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含GDH、7β-HSDH野生型和任选地3α-HSDH；或
i)同时编码GDH、如权利要求1至4之一中要求保护的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH；或
k)编码融合蛋白，所述融合蛋白包含GDH、如权利要求1至4之一中要求保护的7β-HSDH突变体和任选地3α-HSDH。
13.重组微生物，其携带至少一种如权利要求12中要求保护的核酸序列。
14.重组微生物，其能够同时表达7β-HSDH(野生型)、NADP+接受FDH突变体和/或对应的FDH野生型和任选地3α-HSDH；或其能够同时表达7β-HSDH(野生型)、GDH和任选地3α-HSDH。
15.重组微生物，其能够同时表达7β-HSDH突变体、NADP+接受FDH突变体和/或对应的FDH野生型和任选地3α-HSDH；或其能够同时表达7β-HSDH突变体、GDH和任选地3α-HSDH。
16.如权利要求14或15中要求保护的重组微生物，其中所述FDH突变体是根据权利要求9至11之一中定义的突变体；且其中所述FDH野生型是根据SEQ ID NO：36的来自母牛分枝杆菌N10的FDH或从其衍生的具有至少60％序列同一性的FDH。
17.制备式(1)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法
Figure FDA0000367127000000041
其中
R代表烷基、NR1R2、H、碱金属离子或N(R3)4 +，其中残基R3可为相同或不同的，并代表H或烷基，
其中
a)任选地将式(2)的胆酸(CA)
Figure FDA0000367127000000042
其中R具有上文给出的含义，化学氧化为式(3)的脱氢胆酸(DHCA)
其中R具有上文给出的含义；
b)在存在至少一种根据权利要求1至4之一中定义的7β-HSDH突变体时和存在至少一种3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSDH)时，将DHCA还原为对应的式(5)的12-酮-熊去氧胆酸(12-酮UDCA)
其中R具有上文给出的含义，(特别是在存在和消耗NADH和/或NADPH时)，然后
c)将式(5)的12-酮-UDCA化学还原为UDCA；和
d)任选地进一步纯化反应产物。
18.如权利要求17中要求保护的方法，其中在存在如权利要求5中要求保护的重组微生物时至少进行步骤b)。
19.如权利要求17或18中要求保护的方法，其中步骤b)与相同或不同的辅因子再生系统偶联。
20.如权利要求19中要求保护的方法，其中步骤b)，7β-HSDH部分步骤，与辅因子再生系统偶联，其中通过根据权利要求9至11之一中定义的NADP+接受FDH突变体再生用过的NADPH并消耗甲酸或其盐；或与辅因子再生系统偶联，其中通过ADH再生用过的NADPH并消耗异丙醇；或与辅因子再生系统偶联，其中通过GDH再生用过的NADPH并消耗葡萄糖；或与辅因子再生系统偶联，其中通过NADH再生GDH，ADH或FDH再生用过的NADH。
21.如权利要求19或20中要求保护的方法，其中步骤b)，3α-HSDH部分步骤，与辅因子再生步骤偶联，其中通过根据权利要求9至11之一中定义的NADP+接受FDH突变体再生NADPH并消耗甲酸或其盐；或其中步骤b)与辅因子再生步骤偶联，其中通过根据权利要求9至11之一中定义的NAD+和NADP+接受FDH突变体或通过非突变的FDH再生NADH并在每种情况下消耗甲酸或其盐，或通过NAD+接受GDH再生NADH并消耗葡萄糖。
22.制备式(1)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法
其中
R代表烷基、NR1R2、H、碱金属离子或N(R3)4 +，其中残基R3可为相同或不同的并代表H或烷基，
其中
a)任选地将式(2)的胆酸(CA)
Figure FDA0000367127000000062
其中R具有上文给出的含义，化学氧化为式(3)的脱氢胆酸(DHCA)
其中R具有上文给出的含义；
b)在存在至少一种7β-HSDH和存在至少一种3α-羟基类固醇脱氢酶(3α-HSDH)时将DHCA还原为对应的式(5)的12-酮-熊去氧胆酸(12-酮UDCA)
其中R具有上文给出的含义，(特别是在存在和消耗NADH和/或NADPH时)，然后
c)将式(5)的12-酮-UDCA化学还原为UDCA；和
d)任选地进一步纯化反应产物；
其中在存在如权利要求13和14至16之一中要求保护的重组微生物时，或使用至少一种如权利要求12中要求保护的核酸序列，进行步骤b)的反应。
23.如权利要求22中要求保护的方法，其中使用如权利要求14至16之一要求保护的重组微生物，所述微生物同时表达至少一种如权利要求1至4之一中要求保护的7β-HSDH突变体，至少一种如权利要求9至11之一中要求保护的NADP+接受FDH突变体和至少一种3α-HSDH；或同时表达至少一种如权利要求1至4之一中要求保护的7β-HSDH突变体，至少一种GDH和至少一种3α-HSDH。
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