CN103097400B - 新的7α-羟类固醇脱氢酶敲除突变体及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的微生物7α-羟类固醇脱氢酶(7α-HSDH)敲除突变体,和将其用于产生具有不同功能性的其他的HSDHs(例如3α-、7β-或者12α-HSDH)的用途,以及由此产生的HSDH酶在胆酸化合物的酶促反应中,并且特别是在熊去氧胆酸(UDCA)的产生中的用途。本发明尤其涉及合成UDCA的新方法。
Description
本发明涉及新的微生物7α-羟类固醇脱氢酶(7α-HSDH)敲除突变体,和将其用于产生不同功能性的其他的HSDHs(例如3α-、7β-或者12α-HSDH)的用途,以及由此产生的HSDH酶在胆酸化合物的酶促反应中,并且特别是在熊去氧胆酸(UDCA)的产生中的用途;本发明尤其涉及合成UDCA的新方法。
发明背景:
活性物质熊去氧胆酸(UDCA)和相关的非对映异构体鹅去氧胆酸(CDCA)已经多年被应用于胆结石的药物治疗。这两种化合物仅在第7位的C原子上的羟基的构型不同(UDCA:β-构型,CDCA:α-构型)。在现有技术中,描述了产生UDCA的多种方法,其完全用化学方法进行或者由化学和酶处理步骤的组合组成。在每种情况下,起点是胆酸(CA)或者从胆酸生成的CDCA。
因此产生UDCA的经典的化学方法可以以图示表示如下:
存在着以下的严重的缺点:因为化学氧化不是选择性的,所以必须通过酯化作用保护羧基以及3α和7α-羟基。
例如,在本申请的PCT/EP2009/002190中,描述了基于使用酶12α-HSDH进行的备选的化学/酶方法。特别地,本文利用了重组产生的12α-HSDH。本文的酶优选地由重组大肠杆菌宿主产生,从其分离并且用于反应。
本文12α-HSDH将CA选择性地氧化成12-酮-CDCA。根据经典的化学方法所必需的两个化学保护步骤在本文是不必要的。
在这种化学方法中有这样的问题:石胆酸(LCA)污染了以这种方式产生的有价值的产物UDCA,原因至今未知。
在申请人的PCT/EP2010/068576中描述了新的7β-HSDHs和其在还原途径中在UDCA的产生中的用途。其中有这样的问题:重组大肠杆菌宿主也产生内源的7α-HSDH,而7α-HSDH从去氢胆酸产生3,12-二酮-CDCA副产物。然后这种3,12-二酮-CDCA不再是7β-HSDH的底物,以致除了所希望的产物以外,也积聚了不希望的副产物。
因此,本发明的目的是提供产生UDCA的新方法,其避免了上述的缺点。特别地,可以酶促/化学产生UDCA,且不具有杂质,如LCA或者3,12-二酮-CDCA副产物。
发明简述:
根据本发明,惊奇地发现存在不希望的杂质(例如LCA)的原因,不是复杂的化学副反应的所不希望有的结果。LCA的存在也不是由12α-HSDH自身催化的副反应的结果。相反,由于7α-HSDH的活性,催化酶促反应步骤的12α-HSDH酶含有酶杂质。这导致了将12-酮-CDCA氧化成7,12-二酮-LCA,在进一步的化学转化反应中,所述7,12-二酮-LCA导致了UDCA,而在化学副反应中,所述7,12-二酮-LCA被还原成LCA。这在下面的路线图中显示。
12α-HSDH
7α-HSDH
尤其发现了形成7,12-二酮-LCA的原因是7α-HSDH酶污染了12α-HSDH。在重组产生12α-HSDH(如它的短的形式)的过程中,尤其在使用大肠杆菌宿主细胞产生12α-HSDH的过程中,事实上,在纯化之后,12α-HSDH自身被内源的7αHSDH污染。因为几乎相同的序列长度(12α-HSDH(短的形式)或7α-HSDH分别是257或255个氨基酸),所以这两种酶都具有非常相似的分子量且另外在纯化中也具有非常相似的分离行为,以致以这种方式产生的12α-HSDH几乎总是被7α-HSDH污染。
也不能将7β-HSDH与所不希望的7α-hSDH活性不费劲地分离。
根据本发明,只是通过选择性地关闭用于重组产生12α-HSDH或者其他的HSDHs(例如,7β-HSDH)的表达宿主中的次级活性就令人惊奇地实现了制备不再含有7α-hSDH活性的HSDHs,例如,12α-HSDH或7β-HSDH。
因此,很大程度上利用了表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)(基因型:F–ompTgaldcmlonhsdSB(rB-mB-)λ(DE3[lacIlacUV5-T7基因1ind1sam7nin5])(Novagen)(JournalofMolecularBiology(1985)189,113-130)来产生重组蛋白。然而,如根据本发明目前发现的,大肠杆菌BL21(DE3)含有NADH-依赖的7α-HSDH,例如在产生UDCA的过程中所述7α-HSDH导致了所不希望的副产物石胆酸的形成。
在产生UDCA的过程中,为了避免来自大肠杆菌BL21(DE3)的7α-HSDH引起的副反应,根据本发明,例如,首先通过同源重组成功地敲除来自大肠杆菌BL21(DE3)的编码内源的7α-HSDH的基因。得到的菌株大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH允许12α-HSDH制剂的重组产生,而在产生UDCA的过程中不再引起所不希望的副反应。
根据本发明,如下面的图示中显示,由此首次可以合成UDCA,且没有7α-HSDH催化的副反应。因此,12α-HSDH将CA选择性地氧化成12-酮-CDCA。
12α-HSDH
因此,所提出的上述目标的解决方案是更令人惊奇地,因为发现内源的7α-HSDH是NADH-依赖的酶,而重组表达的12α-HSDH是NADPH依赖的。然而,如根据本发明发现的,尽管在NADPH的存在下和NADH的缺失下,7α-HSDH也显示了痕量活性。即使用分离的酶而不是用全细胞进行酶促合成步骤,这种痕量活性最终也足够以所不希望的方式用LCA污染有价值的产物UDCA。当使用全细胞时,由于来自细胞的细胞NADH的存在,7α-HSDH是完全活化的,由此将更进一步地极大地增加副产物的形成。
因此根据本发明,也可以使用表达12α-HSDH活性但不含干扰性7α-HSDH活性的全重组细胞根据上文的酶促/化学合成途径产生不含LCA的UDCA。
附图描述:
图1显示菌落PCR的结果。特别地,可见含有1500bp的条带,其相应于通过重组整合的aparemycin抗性基因。因此将抗性基因整合到基因组中并且敲除7α-HSDH基因。第一泳道显示DNA标记。第二泳道是含有1500bp的PCR产物。
图2显示胆酸(CA)与多种大肠杆菌培养物温育的结果。A:胆酸与大肠杆菌BL21(DE3);B:胆酸与敲除突变大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH;C:作为对照的胆酸。图A中的箭头显示在转化大肠杆菌BL21(DE3)中产生的氧化产物(7-酮-3,12-二羟胆烷酸;存留时间(RT)=7.5min)。由于有杂质,在敲除菌株大肠杆菌BL21(DE3)中也可见在7-酮-3,12-二羟胆烷酸区中的小峰,但是观察到的峰不高于阴性对照中的峰(C)。
图3图示性地阐述了通过敲除技术关闭7α-HSDH基因的策略。H1和H2指示同源序列;P1和P2指示引物。基因A和C指示7α-HSDH基因侧翼的序列片段。H1和H2可以均是来自侧翼区的序列片段(如图3中显示的),或者也可以代表,例如来自7α-HSDH基因的5’-和3’-末端片段(来源:K.Datsenko和B.Wanner,PNASJune6,2000vol.97no.126640-6645)。
本发明的具体实施方案
本发明尤其涉及以下的实施方案:
1.重组微生物,其中抑制了7α-羟类固醇脱氢酶(7α-HSDH)的酶活性,同时可表达地含有功能不同的羟类固醇脱氢酶(例如,3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH,特别是3α-、7β-或12α-HSDH)的酶活性。
此处被抑制的7α-HSDH可以显示任何所希望的辅因子的依赖性,例如,对NADH或NADPH(或NAD+或NADP+)的依赖。
任选地,也可以额外地修饰这种经修饰的微生物,以便它不仅表达所希望的HSDH活性,而且表达可以任选地与HSDH结合发挥作用的其他的蛋白质或者酶,例如协助辅因子再生的酶(如下文更详细地解释的)。这些酶的实例是如醇脱氢酶(ADH)和甲酸脱氢酶(FDH)。
特别地,本发明涉及重组微生物,其中抑制了7α-HSDH的酶活性,同时可表达地含有外源12α-HSDH的酶活性;如,特别是这种类型的微生物,其中抑制了内源的(例如NADH-依赖的)7α-HSDH的酶活性,同时可表达地含有(例如NADPH-依赖的)12α-HSDH的酶活性。重要地,本文7α-HSDH和12α-HSDH可以显示出相同或不同的辅因子依赖性,即7α-HSDH和12α-HSDH可以都是NADH或NADPH(或NAD+或NADP+)依赖的。然而,7α-HSDH和12α-HSDH也可以依赖于多种辅因子;因此,例如7α-HSDH可以是NADH(或NAD+)依赖的,且12α-HSDH可以是NADPH(或NADP+)依赖的,或者相反的情况。特别地,在依赖于不同的辅因子的情况下,在其他的辅因子存在的每种情况下,也可以观察到分析的可检测的酶活性。因此,例如,7α-HSDH可以是NADH(或NAD+)依赖的,但在NADPH(或NADP+)的存在下,也显示出分析的可检测的酶活性。
如果代替12α-HSDH的是,例如选自3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12β-、17α-、17β-、20α-和20β-HSDH的一种或者多种其他的HSDHs预期被表达和任选地分离,如3α-和/或7β-HSDH,那么上文相应的应用。
2.根据实施方案1的重组微生物,其中敲除了编码7α-HSDH的核酸序列,特别是通过同源重组或者通过基因破坏(特别是通过插入抑制编码的基因产物的酶功能的核酸序列)敲除了编码7α-HSDH的核酸序列。
3.根据前面实施方案的一个的重组微生物,其来源于表达7α-HSDH的前体微生物,特别是内源表达7α-HSDH的前体微生物,如埃希氏菌属细菌,尤其大肠杆菌。
4.根据实施方案3的重组微生物,其来源于大肠杆菌BL21。
5.根据前面实施方案的一个的重组微生物,其重组表达在功能上不同于7α-HSDH的HSDH,特别是如3α-、7β-和/或12α-HSDH。
6.根据前面实施方案的一个的重组微生物,其中所述被抑制的(被敲除的)7α-HSDH具有根据SEQIDNO:10的氨基酸序列或者由根据SEQIDNO:9的核酸序列编码。
7.根据前面实施方案的一个的重组微生物,其中所述功能上不同于7α-HSDH的经表达的HSDH含有以下的氨基酸序列的一个:
a)3α-HSDH序列,其选自:SEQIDNO:29和31
b)7β-HSDH序列,其选自:SEQIDNO:25
和
c)12α-HSDH序列,其选自SEQIDNO:12,14,16;或
d)含有氨基酸序列,其编码的HSDH来源于a),b)或c),且所述氨基酸序列与a),b)或c)下的这些序列的一个具有至少50%或至少60%或至少75%,特别地至少85%,例如91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性。
8.用于重组产生功能上不同于7α-HSDH的所希望的HSDH(例如,3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或者20β-HSDH,特别是3α-、7β-或12α-HSDH)的方法,其中在表达所希望的HSDH的条件下培养根据前面权利要求的一个的重组微生物(其中抑制了7α-HSDH的酶活性),并且分离由此表达的HSDH,其中在分离的HSDH中基本上检测不到功能性的7α-HSDH。
特别地,此处本发明涉及(特别是NADPH-依赖的)12α-HSDH的产生,其中在表达12α-HSDH的条件下培养根据前面实施方案的一个的重组微生物,并且分离表达12α-HSDH,其中所分离的酶不被7α-HSDH酶污染。
特别地,然而本文中发明也涉及NADH-或特别是NADPH-依赖的7β-HSDH的产生,其中在表达7β-HSDH的条件下培养根据前面实施方案的一个的重组微生物,并且分离表达的7β-HSDH,其中所分离的酶不被7α-HSDH酶污染。
9.从根据实施方案1至7的一个的重组微生物可获得重组HSDH,例如3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH,特别是3α-、7β-或12α-HSDH,特别是NADPH-依赖的7β-HSDH或12α-HSDH,所述重组HSDH不被7α-HSDH酶或者酶活性污染,特别地不被NADPH-依赖的7α-HSDH或具有NADPH-依赖的次级活性的NADH-依赖的7α-HSDH污染。
10.根据实施方案9的重组HSDH,例如3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-、或20β-HSDH,特别是3α-、7β-或12α-HSDH,包含选自根据实施方案6的SEQIDNos的氨基酸序列和由其衍生的与这些序列的一个具有至少50%或至少60%或至少75%,特别地至少85%,例如,90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%的同一性的氨基酸序列。
11.选择性地酶促氧化羟类固醇的方法,所述羟类固醇除了在类固醇结构的3α-、3β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-位的至少一个(特别是在类固醇结构的12α-位)上含有羟基外,还在类固醇结构的7α-位上含有至少一个另外的羟基,在所述方法中,在3α-、3β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH的存在下,特别是在根据实施方案9或10的12α-HSDH的存在下,或者在根据实施方案1至7的一种的重组微生物的存在下,羟类固醇反应,并且任选地从反应批次分离所形成的至少一种氧化产物。
12.根据实施方案11的方法,其中所述羟类固醇是胆酸(CA)或胆酸衍生物,如,特别是胆酸的盐、酰胺或者烷基酯。
13.根据实施方案12的方法,其中所述CA或其衍生物反应产生12-酮鹅去氧胆酸(12-酮-CDCA)或者产生相应的衍生物。
14.根据实施方案11至13之一的方法,其中所述反应在NAD(P)+的存在下进行。
15.根据实施方案14的一个方法,其中所述被消耗的NAD(P)+由电化学或者酶促再生。
16.用于产生通式(1)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法
其中
R代表烷基、NR1R2、H、碱金属离子或者N(R3)4 +,其中R3基是相同的或者不同的,并且代表H或烷基,
其中
a)在根据实施方案9或10的12α-HSDH的存在下,或者在根据实施方案1至7的一个的重组微生物的存在下,通式(2)的胆酸(CA)被氧化成相应的通式(3)的12-酮鹅去氧胆酸(12-酮-CDCA)
在所述通式(2)中R具有上文所指示的含义,且Ra基是相同的或者不同的,并且代表H或酰基,
在所述通式(3)中R和Ra具有上文所指示的含义,并且随后
b)通式(3)的12-酮-CDCA通过脱氧反应产生通式(4)的鹅去氧胆酸(CDCA)
在所述通式(4)中R和Ra具有上文所指示的含义,和
c)将通式(4)的CDCA的第7位化学氧化生成通式(5)的7-酮石胆酸(KLCA)
在所述通式(5)中R和Ra具有上文所指示的含义,和
d)将通式(5)的KLCA还原,和
e)任选地进一步纯化反应产物。
17.根据实施方案16的方法,其中如果Ra代表酰基,那么在所述反应步骤b)或者d)进行之后可任选地除去这个酰基。
18.根据实施方案16或17的方法,其中所述步骤a)在NAD(P)+的存在下进行。
19.根据实施方案18的方法,其中所述被消耗的NAD(P)+由电化学或者酶促再生。
20.选择性地酶促还原酮类固醇的方法,所述酮类固醇除了在类固醇结构的3、11、12、17、20位的至少一个(特别是在类固醇结构的12位和/或3位)上具有至少一个酮基外,还在类固醇结构的7位上具有至少一个另外的酮基,在所述方法中,在3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH的存在下,特别是在根据实施方案9或10的7β-HSDH和/或3α-HSDH和/或12α-HSDH的存在下,或者在根据实施方案1至7的一个的重组微生物的存在下,酮类固醇被反应,并且任选地从反应批次分离所形成的至少一种还原产物。
21.产生通式(1)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法
其中
R代表烷基、NR1R2、H、碱金属离子或者N(R3)4 +,其中R3基是相同的或者不同的,并且代表H或烷基,
其中
a)将通式(2)的任选的胆酸(CA)化学氧化成通式(3)的去氢胆酸(DHCA),
在所述通式(2)中R具有上文所指示的含义,
在所述通式(3)中R具有上文所指示的含义;
b)以任一所希望的顺序用根据实施方案9或10的一个的7β-HSDH和3α-HSDH或者在两种酶同时存在的情况下将DHCA还原成相应的通式(5)的12-酮熊去氧胆酸(12-酮UDCA)
在所述通式(5)中R具有上文所指示的含义,并且随后
d)将通式(5)的12-酮UDCA化学还原成UDCA;和
e)任选地进一步纯化反应产物。
22.根据实施方案11至22的一个的方法,其中将所述酶促氧化还原步骤与(特别是酶促)辅因子再生步骤偶联。
23.根据实施方案11至22的一个的方法,其中所述的HSDHs以溶解的、分散的或者固定化形式使用;或者其中所述方法在根据实施方案1至7的一个的重组微生物的全细胞(任选地固定化细胞)的存在下进行。
本发明的进一步的实施方案
1.一般定义和使用的缩写
给出了与以下的命名一致的本文使用的涉及类固醇结构的取代基的位置细节:
在下表中,以表格形式概述了所用的结构式、化学名称和缩写:
在本发明的上下文中理解针对某个基因(例如,7α-HSDH基因)的生物的“敲除”突变体(或敲除菌株)指的是生物的突变体,其中所涉及的基因在DNA水平上“失活”。将在最广泛的意义上理解这种失活,并且其可以基于,例如适合的结构基因的核酸序列的完全缺失(以致没有蛋白质被翻译),或者所述序列的部分缺失(以致不完全的蛋白质被编码和翻译,与原始结构基因编码的蛋白质相比较,所述不完全的蛋白质的功能被限制,特别地被完全抑制)。此外,通过本领域技术人员已知的“无义突变”可以敲除结构基因,其中修饰了结构基因的核酸序列以便可读框中发生一个或多个未成熟终止密码子和蛋白质的重要部分未被翻译。备选地,可以引入“错义突变”,其中功能所必需的个别或者多个氨基酸(例如,酶中负责与底物结合、催化中心或者复变构区(reallostericregion)的氨基酸,或者负责与其他的蛋白质或分子结合或相互作用的氨基酸)被去除或者被氨基酸替换,导致所涉及的功能的部分或完全丧失。此外,可以进行一个或多个核苷酸的插入,其导致可读框的移位(移码),从而导致具有受限功能的蛋白质的表达,并且特别地发生在N-末端附近的移码导致功能的完全丧失。也可以使用这样的插入:将编码个别蛋白质(标记蛋白)(例如导致抗生素抗性的蛋白质)的核酸序列插入到待敲除的蛋白质的结构基因中,并且所述插入可用于被插入的核酸序列的表达,作为成功敲除的表型检测。通过前面提到的如下的方法也可以产生敲除突变体:在表达所涉及的结构基因所必需的调节区(例如结构基因的启动子或增强子)完全或部分地缺失或插入核酸。特别地,通过结构基因的部分或者完全缺失,通过在待敲除的结构基因的核酸序列中插入标记蛋白的可转录核酸序列,或者通过这两种方法的组合,都可进行敲除。如果所涉及的基因的很多拷贝或可实现所涉及基因的功能的这种同源物存在于生物或细胞中,例如很多基因存在于细菌染色体上,或存在于细菌染色体上并且同时存在于染色体外元件如原核细胞中的质体上,或存在于真核染色体的不同的点上,或存在于多种真核染色体上,任选地还存在于真核细胞的染色体外DNA上,那么由此可以敲除所涉及的基因的很多(优选地全部)拷贝或同源物。
理解“内源的”指的是已经包含在野生型基因组(如本文定义的)中的遗传信息,例如基因。
理解“外源的”指的是不包含在野生型基因组中的遗传信息,例如基因。如果将外源遗传信息,例如根据本发明的含有12α-HSDH的表达单位,引入到野生型菌株的基因组中从而产生遗传上经修饰的菌株,与用经修饰的菌株的后代首次产生的遗传菌株比较,这种遗传信息是内源的,但与原始的野生型菌株(不含这种遗传信息)比较,这种遗传信息是外源的。
根据本发明,理解术语“野生型”指的是相应的起始生物,并且不需要相应于天然存在的生物。
根据亲缘关系,可以理解术语“微生物”指的是根据本发明的起始微生物(野生型)或遗传上经修饰的微生物或者两者。
如果将编码序列持续地或者在时间方面受限制地(例如诱导后)翻译成相应的蛋白质产物,那么在生物中“可表达地”含有该编码序列。
“抑制”在本发明中的含义包含生物学功能的部分或者完全抑制。特别地,根据本发明,如果因为某些原因,不再希望有的生物学功能例如酶活性,如7α-HSDH的酶活性不再是通过分析可检测的,那么抑制是存在的。
如果没有给出其他的细节,那么术语“7α-HSDH”指示脱氢酶,在消耗化学当量的NAD(P),特别是NAD的情况下,所述脱氢酶至少催化12-酮-CDCA到7,12-二酮-LCA的立体特异性的和/或区域特异性的氧化。此类酶也以EC编号1.1.1.159来编译。7α-HSDH尤其发现于肠内微生物区系的生物,如梭菌属,例如不同梭菌(Clostridiumabsonum)、污泥梭状芽孢杆菌(Clostridiumsordellii)(JournalofBacteriology,1994,4865-4874),大肠杆菌(JournalofBacteriology1991,2173-2179)、脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)(CurrentMicrobiology,2003,47,475-484)以及布鲁杆菌属、真细菌属中。因此,本发明基本上可应用于全部这些微生物中。
如果没有给出其他的详述,那么术语“12α-HSDH”指示脱氢酶,在消耗化学当量的NAD+,特别是NADP+的情况下,所述脱氢酶至少催化胆酸(CA)到12-酮鹅去氧胆酸(12-酮-CDCA)的立体特异性的和/或区域特异性的氧化。此类酶也以EC编号1.1.1.159来编译。NADP+依赖的代表物(Harris和Hylemon(1978)BiochimBiophysActa528(1):148-57)和NAD+依赖的代表物(Macdonald等人.1976)均存在。在缺乏其他的HSDH的情况下,仍表达高的12α-HSDH活性的唯一已知的微生物是梭菌属组P菌株48–50DSM4029。特别合适的12α-HSDH和其突变体/变体尤其描述于本申请人的PCT/EP2009/002190中,将所述文献明确地作为参考。
如果没有给出其他的详述,那么术语“7β-HSDH”指示脱氢酶,特别是在消耗化学当量的NADPH情况下,所述脱氢酶至少催化DHCA到3,12-二酮-7β-CA的立体特异性和/或区域特异性的还原和任选地相应的逆反应。本文该酶可以是天然的或者重组产生的酶。该酶基本上可以存在于具有细胞的,例如蛋白质的杂质的混合物中,但优选地是以纯的形式存在。例如在以下的章节中描述或者从文献中已知合适的检测方法(例如,CharacterizationofNADP-Dependent7β-hydroxysteroidDehydrogenasesfromPeptostreptococcusproductusandEubacteriumaerofaciens.SHirano和NMasuda.ApplEnvironMicrobiol.1982;然而,其中,检测不到可以还原7-酮基的来自产气真杆菌(Eubacteriumaerofaciens)的7β-HSDH)。以EC编号1.1.1.201对这种活性的酶分类。
如果没有给出其他的详述,那么术语“3α-HSDH”指示脱氢酶,特别是在消耗化学当量的NADP和/或NADPH情况下,所述脱氢酶至少催化13,2-二酮-7β-CA到12-酮-UDCA的立体特异性和/或区域特异性的还原和任选地相应的逆反应。例如在以下的实验部分中描述或者从文献中已知合适的检测方法。例如,合适的酶可从Comanomonastestosteroni(例如,ATCC11996)获得。NADPH依赖的3α-HSDH是已知的,例如可使用来自啮齿类的3α-HSDH(CloningandsequencingofthecDNAforratliver3alpha-hydroxysteroid/dihydrodioldehydrogenase,JEPawlowski,MHuizinga和TMPenning,May15,1991TheJournalofBiologicalChemistry,266,8820-8825)。以EC编号1.1.1.50对这种活性的酶分类。
根据本发明理解“纯的形式”或“纯的”或“基本上纯的”酶指的是借助于常规的蛋白质检测方法,例如双缩脲法或者根据Lowry等人的蛋白质检测法(参见R.K.Scopes,ProteinPurification,SpringerVerlag,NewYork,Heidelberg,Berlin(1982)中的描述),测定的具有这样的纯度的酶:基于总蛋白质含量,以重量计超过80%、优选地超过90%、特别地超过95%、尤其超过99%。
理解“氧化还原剂等同物”指的是可用作电子供体或电子受体的低分子量的有机化合物,例如,烟酰胺衍生物如NAD+和NADH+或它们的还原形式tNADH或NADPH。本文NAD(P)+代表NAD+和/或NADP+,且NAD(P)H代表NADH和/或NADPH。也将它们称作“辅因子”。
根据本发明理解“胆酸化合物”指的是具有碳骨架,特别是胆酸的类固醇结构和在环的第7位中,且任选地在环的第3位和/或12位中存在酮基和/或羟基或酰氧基的化合物。
特别地,理解特殊型的化合物,例如,“胆酸化合物”或“熊去氧胆酸化合物”也指的是基本的起始化合物(例如,胆酸或熊去氧胆酸)的衍生物。
此类衍生物包含“盐”,例如,碱金属盐如该化合物的锂、钠和钾盐;铵盐,其中所述铵盐包含NH4 +盐或其中至少一个氢原子能被C1-C6-烷基替换的那些铵盐。典型的烷基尤其是C1-C4-烷基,如甲基,乙基,正-或异丙基,正-、仲-或叔-丁基,和正-戊基和正-己基,以及它们的单或多分枝的类似物。
根据本发明的化合物的“烷基酯”尤其为较低级的烷基酯,例如C1-C4-烷基酯。可提到的非限制性的实例是甲酯,乙酯,正-或异丙酯,正-、仲-或叔-丁酯,或较长链的酯,例如正-戊和正-己酯,以及它们的单或多分枝的类似物。
“酰胺”尤其为根据本发明的酸与氨或伯单胺或仲单胺的反应产物。此类胺为,例如单-或二-C1-C4-烷基-单胺,其中可以将彼此独立的烷基任选地进一步取代为,例如羧基,羟基,卤素(如氟、氯、溴、碘),硝基、磺酸酯基。
根据本发明的“酰基”尤其为具有2至4个碳原子的非芳族基,例如乙酰基、丙酰基和丁酰基,和具有任选地被取代的单核芳环的芳族基,其中合适的取代基,例如选自羟基,卤素(如氟、氯、溴、碘),硝基和C1-C4-烷基,如,苯甲酰基或甲苯酰基。
可以以立体异构纯的形式或与根据本发明的方法中使用的或者从其获得的其他的立体异构体的混合物的形式使用根据本发明使用或产生的羟类固醇化合物,例如胆酸、熊去氧胆酸、12酮鹅去氧胆酸、鹅去氧胆酸和7-酮石胆酸。然而,优选地,以基本上立体异构纯的形式使用或分离所使用的或产生的化合物。
根据本发明,理解“固定化”指的是将根据本发明使用的生物催化剂(例如,7β-HSDH)共价或非共价地结合到固体上,即在周围的液体基质中基本上不溶的载体材料。
2.蛋白质,特别是可以根据本发明产生的重组酶
2.112α-HSDHs
此类12α-HSDHs尤其描述于申请人的WO2009/118176中。
根据本发明,表达的12α-HSDHs尤其可从梭菌属获得,且在还原条件下通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)测定所述12α-HSDHs具有在超过约26KD的区域,尤其超过约26.5KD的区域内,如约27至30KD的分子量。12α-HSDHs具有这样的理论分子量:超过约29KD,尤其约29.1至29.5kD,如对于12α-HSDH长的形式为29.359kD,对于12α-HSDH短的形式为约27.8kD。本文分子量的细节涉及到酶的蛋白质亚基的分子量,不是用于限制,例如,特别地天然蛋白质由4个近似相同大小的此类亚基组成。
特别地,此类蛋白质从梭菌属组P菌株48-50(DSM4029)获得。例如,可以制备比活在超过约10,15,20或25U/mg的范围内,例如20至100U/mg或25至80U/mg的酶。本文在实验部分指示的标准条件下进行比活的测定。
根据本发明,使用了特别地包含以下的氨基酸基序的至少一个的12α-HSDH:
a)LINN
b)RMGIFD
c)N-末端序列,其选自
(1)MDFIDFKEMGRMGIFDGKVAIITGGGKAKSIGYGIAVAYAK
(2)MDFIDFKEMGRMGI
(3)ITGGGKAKSIGYGIA
(4)IFDGK
(5)GIFDGK
d)FGDPELDI或者从其衍生的序列,例如:GDPELDI、FGDPELD、DPELDI、FGDPEL、GDPEL、DPELD、GDPELD。
此外,根据本发明使用的12α-HSDH酶表征如下:12α-HSDH酶不含TGX3GXG型的N-末端序列基序(即约1至30个氨基酸残基的N-末端区域),其中X代表任一所希望的氨基酸残基。
特别地,也使用了这样的12α-HSDH:
a)包含根据SEQIDNO:12、14或16的氨基酸序列之一,在每种情况下从+1或+2位开始含有该序列;或
b)包含氨基酸序列,其衍生于与根据a)的序列,具有至少60%的百分比序列同一性;或
c)由编码根据a)和b)的蛋白质的核酸序列编码;或
d)由根据SEQIDNO:11、13或15的编码核酸序列编码;或是由SEQIDNO:11、13或15的序列衍生以适应于用于表达的生物的各自的密码子使用的序列编码;或
e)由编码序列编码,所述编码序列衍生于根据SEQIDNO:11、13或15的核酸序列之一并且与SEQIDNO:11、13或15具有至少60%的百分比序列同一性。
本文可根据常规方法,例如在http://slam.bs.jhmi.edu/cgi-bin/gd/gdRevTrans.cgi中可取得的方法进行核酸序列对密码子使用的适应。
也可以使用具有经修饰的协同底物的使用和/或降低的产物抑制的12α-HSDH突变体,并且特别地衍生于根据上文定义的12α-羟类固醇脱氢酶的那些突变体,其在基序VLTGRNE中具有至少一个突变以修饰协同底物的使用。此类突变体的非限制性实例包含:在该基序中具有以下的氨基酸取代的至少一个的突变体:G→D;R→A;和在形成酶的底物结合口袋的氨基酸残基的区域中具有至少一个突变的突变体,以减少产物抑制,例如,包含至少相应于SEQIDNO:16的98位或100位氨基酸Q的突变,特别地包含相应于SEQIDNO:16的Q98H的突变的突变体。
98位中的其他的潜在的氨基酸取代基(基于SEQIDNO:16)包括:A、N、D、C、E、G、H、M、S、T、V。基于根据本发明的12α-HSDH-HSDH同源性模型,认为取代导致减弱了产物的羧基结合。因此将邻近位置S100(基于SEQIDNO:16)突变至以下的氨基酸:A、N、D、C、Q、E、G、H、M、T、V、K。
因此根据本发明的一组12α-HSDH突变体在第98位或100位(根据SEQIDNO:16)中包含选自以下的一个或两个突变:
Q→A、N、D、C、E、G、H、M、S、T、V;
S→A、N、D、C、Q、E、G、H、M、T、V、K。
2.27β-HSDHs
此类7β-HSDHs尤其描述于申请人的PCT/EP2010/068576中,特别地如:
7β-HSDHs从厌氧菌,特别是柯林斯菌属(genusCollinsella),如产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)DSM3979(ATCC25986)获得,7β-HSDHs特别地包含根据SEQIDNO:25的氨基酸序列和衍生于其的功能等同物。
特别地通过以下性质的至少一个,例如2、3、4、5、6或7个或全部的这样的性质表征从产气柯林斯菌DSM3979获得的7β-HSDHs:
a)分子量(SDS凝胶电泳):约28-32kDa,特别地约29至31kDa或约30kDa;
b)分子量(尤其在没有SDS的非变性条件下凝胶过滤):约53-60kDa,特别地约55至57kDa,如56.1kDa,由此根据本发明的酶与由Hirano等人(参见上文)描述的来自产气柯林斯菌ATCC25986的45kDa7β-HSDH明显不同。这证实了来自产气柯林斯菌DSM3979的7β-HSDH的二聚性质(四级结构);
c)将7-酮-LCA的7位羰基立体选择性地还原成7β-羟基;
d)用于氧化UDCA的最优pH是在pH8.5至10.5,特别是在pH9至10的范围内;
e)用于还原DHCA和7-酮-LCA的最优pH是在pH3.5至6.5,特别是在pH4至6的范围内;借此,令人惊奇地可以通过pH的选择影响氧化(特征d)和还原进程;
f)针对本文提到的底物/辅因子的至少一个的来自下表的至少一个动力学参数;是在下表中每种情况下实际提到的值的大约±20%的范围内,特别地在±10%、±5%、±3%、±2%或±1%的范围内。
a)由于非常低的活性不能测定
b)1U=1μmol/min
c)由此根据本发明的酶与由Hirano等人(参见上文)描述的来自产气柯林斯菌ATCC25986的7β-HSDH明显不同,Hirano等人描述了所述7β-HSDH具有明显较低的KM和Vmax值(0.4和0.2)并且测量不到NADPH的活性。
g)来自产气柯林斯菌DSM3979的原核7β-HSDH与包含土拨鼠(Caviaporcellus)、人类(Homosapiens)和小鼠(Musmusulus)的动物11β-HSDH亚群具有系统发生的序列关系。
例如,根据本发明的7β-HSDH显示以下的性质或性质的组合:a);b);a)和b);a)和/或b)和c);a)和/或b)和c)和d);a)和/或b)和c)和d)和e);a)和/或b)和c)和d)和e)和f)。
此类7β-HSDH催化7-酮类固醇立体特异性地还原(氢化)至相应的7β-羟类固醇,和/或将第7位中包含酮基和类固醇结构上至少另一个酮基的酮类固醇的区域特异性地氢化(还原)成相应的7β-羟类固醇,如特别是将去氢胆酸(DHCA)的第7位特异性地氢化成相应的3,12-二酮-7β-胆烷酸,并且是例如NADPH依赖的。
合适的7β-HSDH具有根据SEQIDNO:25(登录号NO:ZP_01773061)的氨基酸序列或者从其衍生的并且与所述SEQIDNO:25的氨基酸序列具有至少60%例如,至少65、70、75、80、85、或90、至少91、92、93、94、95、96、97、98、99或99.5%的同一性的序列。任选地,通过以下性质之一或者性质的组合额外地表征7β-HSDH:根据上文定义的a);b);a)和b);a)和/或b)和c);a)和/或b)和c)和d);a)和/或b)和c)和d)和e);a)和/或b)和c)和d)和e)和f)。
2.3其他蛋白质
使用根据本发明的7α-HSDH-被抑制的微生物,以相应的方式可以制备以下的蛋白质,例如:
3α-HSDH,例如,已知其来自睾丸酮假单胞菌(Pseudomonastestosteroni)(J.Biol.Chem.276(13),9961-9970(2001));(SEQIDNO:28,29)或褐家鼠(Rattusnorvegicus)(SEQIDNO:30,31);
3β-HSDH,例如,已知其来自无害梭菌(Clostridiuminnocuum)(AppliedandEnvironmentalMicrobiology,June1989,p.1656-1659)或睾丸酮假单胞菌;
20β-HSDH,例如,已知其来自链霉菌属的生物(TheJournalofBiologicalChemistry,1977,VoI252No1,Jan10,205-211);
20α-HSDH,例如,已知其来自梭菌属,尤其是来自闪烁梭菌(Clostridiumscindens)(JournalofBacteriology,June1989,p.2925-2932)和梨形四膜虫(Tetrahymenapyriformis)(Biochem.J.(1994)297,195-200);
17β-HSDH,如,已知其来自真菌如Cylindrocarponradicola(J.Biochemistry103,1988,1039-1044)和Cochlioboluslunatus(J.SteroidBiochem.Molec.Biol.VoI59,1996,No.2,p.205-214),来自链霉菌属(Hoppe-Seyler’sZ.Physiol.Chem,Vol.356,1975,1843-1852)、假单胞菌属(TheJournalofBiologicalChemistry,Vol.252No.ll,June10,1977,p.3775-3783)和产碱菌属(TheJournalofBiologicalChemistry,Vol.260,No.25,Nov5,1985,p.13648-13655)家族的细菌;
17α-HSDH,如,已知其来自真细菌属(Eubacteriumsp.)(JournalofLipidResearch,Vol.35,1994,p.922-929);
或11β-HSDH,如,已知其来自较高级的哺乳动物。
2.4功能等同物
本发明不限于实际公开的具有HSDH活性,例如3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH,特别是3α-、7β-或12α-HSDH活性的蛋白质或酶,正相反,本发明还扩展到所述蛋白质或酶的功能等同物。
在本发明的上下文中,实际公开的酶的“功能等同物”或类似物是不同于所述酶的多肽,此外其具有所希望的生物学活性,例如7β-或12α-HSDH活性。
因此,例如,理解“功能等同物”指的是包含本文定义的氨基酸序列的酶,在HSDH活性,如7β-或12α-HSDH活性的测试中,所述酶具有高或低至少1%,例如,至少10%或20%,例如,至少50%或75%或90%的活性的酶或。此外,功能等同物在pH4和11之间更稳定,并且有利地具有pH6至10,特别是pH8.5至9.5的范围内的最优pH,还具有15°C至80°C或20°C至70°C的范围内的最优温度,例如约45至60°C或约50至55°C。
借助于多种已知的测试,可以检测HSDH活性,如7β-或12α-HSDH活性。不是用于限制,可以提及在实验部分定义的标准化条件下使用参照底物,例如胆酸进行的测试。
根据本发明理解“功能等同物”尤其指的是“突变体”,其在上文提到的氨基酸序列的至少一个序列位置中具有与实际提到的氨基酸不同的氨基酸但仍具有上文提到的生物学活性之一。因此,“功能等同物”包含通过一个或多个氨基酸的添加、取代、缺失和/或倒位获得的突变体,其中所提及的改变可以在任意序列位置发生,只要改变导致具有根据本发明的性质谱的突变体。特别地,如果突变体和未改变的多肽之间的反应性模式在性质上是一致的,即,例如以不同的速率转化相同的底物,那么也提供了功能的等同。合适的氨基酸取代的实例编辑于下表:
在上文的含义中“功能等同物”也是所描述的多肽的“前体”和多肽的“功能衍生物”和“盐”。
本文的“前体”是多肽的天然或合成的前体,其具有或不具有所希望的生物学活性。
理解表述“盐”指的是根据本发明的蛋白质分子的羧基盐和氨基的酸加成盐两种。可以以本身已知的方式制备羧基盐,并且其包含无机盐,例如钠盐、钙盐、铵盐、铁盐和锌盐,和与有机碱、例如胺类、如三乙醇胺、精氨酸、赖氨酸、哌啶等形成的盐。酸加成盐,例如与无机酸,如盐酸或者硫酸形成的盐,和与有机酸,如乙酸和草酸形成的盐等是本发明的主题。
借助于已知的技术也可在功能的氨基酸侧基上或者在根据本发明多肽的N-末端或者C-末端制备根据本发明多肽的“功能衍生物”。此类衍生物包含例如羧酸基团的脂肪族的脂,通过与氨或者与伯胺或者仲胺反应可获得的羧酸基团的酰胺,通过与酰基反应制备的自由氨基的N-酰基衍生物或者通过与酰基反应制备的自由羟基的O-酰基衍生物。
“功能等同物”当然也包含可以从其他生物获得的多肽以及天然出现的变体。例如,通过序列比较可以确定同源序列区的区域,并且在本发明的实际的规范可以确定等同的酶。
“功能等同物”也包含片段,优选地例如具有所希望的生物学功能的根据本发明的多肽的独立结构域或者序列基序。
此外,“功能等同物”是融合蛋白,其含有上文提到的多肽序列或者从其衍生的功能等同物的一种,和以功能性N-末端或者C-末端键合(即没有融合蛋白部分的相互的显著的功能损伤)的至少一种另外的功能不同的异源序列。这些异源序列的非限制性的实例是例如信号肽,组氨酸锚或者酶。
根据本发明,包括的“功能等同物”是实际公开的蛋白质的同源物。根据Pearson和Lipman,Proc.Natl.Acad,Sci.(USA)85(8),1988,2444-2448的算法计算,这些同源物与实际公开的氨基酸序列之一具有至少60%,优选地至少75%,特别地至少85%,例如90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或者99%的同源性(或同一性)。根据本发明的同源多肽的百分比同源性或同一性特别地指的是基于本文实际描述的氨基酸序列之一的全长的氨基酸残基的百分比同一性。
通过BLAST比对,算法blastp(蛋白质-蛋白质BLAST)或者通过使用下面指出的Clustal设定也可以确定百分比同一性的值。
在存在可能的蛋白质糖基化的情况下,根据本发明的“功能等同物”包含上文描述的类型的蛋白质,其为通过改变糖基化的模式可以获得的去糖基化或者糖基化的形式以及修饰的形式。
通过诱变例如点突变,蛋白质的延长或者截短可以产生根据本发明的蛋白质或者多肽的同源物。
通过筛选突变体,例如截短突变体的组合库可以鉴定根据本发明的蛋白质的同源物。例如,通过在核酸水平上的组合诱变,例如,通过合成寡核苷酸的混合物的酶连接可以产生蛋白质变体的多样化库。有许多方法可以用于从简并的寡核苷酸序列产生潜在的同源物库。可以在DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成,然后可以将合成基因连接到合适的表达载体中。简并的基因组的使用使得能够在混合物中制备全部序列,其编码一组所希望的潜在蛋白质序列。本领域的技术人员已知简并寡核苷酸的合成方法(例如,Narang,S.A.(1983)Tetrahedron39:3;Itakura等人,(1984)Annu.Rev.Biochem.53:323;Itakura等人,(1984)Science198:1056;Ike等人,(1983)NucleicAcidsRes.11:477)。
在现有技术中,已知用于筛选通过点突变或者截短产生的组合库的基因产物的多种技术和用于筛选cDNA库的具有所选择性质的基因产物的多种技术。这些技术可以适应于已经通过根据本发明的同源物的组合诱变产生的基因库的快速筛选。用于筛选大的基因库的最常用的技术是进行高通量分析,所述技术包括在可复制的表达载体中克隆基因库,用得到的载体库转化适合的细胞并在这样的条件下表达组合基因,其中所希望的活性的检测促进了编码基因的载体的分离,其中检测所述基因的产物。递归集合诱变(REM)是增加库中的功能突变体的频率的技术,可将所述递归集合诱变与筛选测试组合使用以鉴定同源物(Arkin和Yourvan(1992)PNAS89:7811-7815;Delgrave等人,(1993)ProteinEngineering6(3):327-331)。
3.核酸和构建体
3.1核酸
本发明也涉及编码具有HSDH活性,例如3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH活性,特别是3α-、7β-或12α-HSDH活性的酶的核酸序列,或用于产生根据本发明的敲除突变体的构建体。
本发明也涉及与本文实际描述的序列具有一定程度的“同一性”的核酸。
理解两种核酸之间的“同一性”指的是每种情况下在总核酸长度上的核苷酸的同一性,特别是借助于Informax(USA)的VectorNTISuite7.1软件使用Clustal方法(HigginsDG,SharpPM.Fastandsensitivemultiplesequencealignmentsonamicrocomputer.ComputAppl.Biosci.1989Apr;5(2):151-1)用以下参数的设定计算的同一性:
多重比对参数:
配对比对参数:
备选地,根据Chenna,Ramu,Sugawara,Hideaki,Koike,Tadashi,Lopez,Rodrigo,Gibson,TobyJ,Higgins,DesmondG,Thompson,JulieD.MultiplesequencealignmentwiththeClustalseriesofprograms.(2003)NucleicAcidsRes31(13):3497-500,根据网址:http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html#且使用以下的参数可以确定同一性:
以本身已知的方式通过来自从核苷酸的结构单元的化学合成,例如通过双螺旋的个别重叠的互补核酸结构单元的片段缩合可以制备本文提到的全部核酸序列(单链和双链DNA和RNA序列,例如cDNA和mRNA)。例如,以已知的方式,根据亚磷酰胺法(Voet,Voet,2ndedition,WileyPress,NewYork,pages896-897)可以进行寡核苷酸的化学合成。在Sambrook等人.(1989)MolecularCloning:Alaboratorymanual,ColdSpringHarborLaboratoryPress中描述了借助于DNA聚合酶的克列诺片段和连接反应以及一般的克隆方法添加合成的寡核苷酸和填补空位。
本发明也涉及编码上文的多肽和它们的功能等同物中的一种的核酸序列(单链和双链的DNA序列和RNA序列,例如cDNA和mRNA),所述功能等同物例如使用人工核苷酸类似物可得到。
本发明涉及编码根据本发明的多肽或者蛋白质或者它们的生物学活性部分的分离的核酸分子和可被用作例如鉴定或者扩增根据本发明的编码核酸的杂交探针或者引物的核酸片段。
此外,根据本发明的核酸分子可以含有编码基因区的3'和/或5'端的非翻译序列。
此外,本发明包含与实际描述的核苷酸序列或者它的部分互补的核酸分子。
根据本发明的核苷酸序列使得有可能产生可以用于鉴定和/或克隆在其他的细胞类型和生物中的同源序列的探针和引物。这种探针或者引物通常包含核苷酸序列区,其在“严格”条件(见下面)下与根据本发明的核酸序列的有义链或者相应的反义链的至少约12个,优选地至少约25个,例如约40,50或者75个连续的核苷酸杂交。
“分离的”核酸分子与在该核酸的天然来源中存在的其他的核酸分子分离,并且如果所述“分离的”核酸分子通过重组技术产生,那么它可以基本上不含其他的细胞物质或者培养基,如果所述“分离的”核酸分子是被化学合成的,那么它可以不含化学前体或者其他的化学品。
通过分子生物学的标准技术和根据本发明提供的序列信息可以分离根据本发明的核酸分子。例如,通过使用实际公开的全序列之一或者它的部分作为杂交探针和标准杂交技术(例如在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual.2ndedition,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中描述的)可以从合适的cDNA库中分离cDNA。此外,通过聚合酶链反应,使用在这种序列的基础上制备的寡核苷酸引物可以分离包含公开的序列之一或者其部分的核酸分子。以此方式扩增的核酸可被克隆到适合的载体中并可通过DNA测序表征。此外,通过标准的合成方法,例如使用DNA自动合成装置也可以制备根据本发明的寡核苷酸。
例如使用常规的杂交方法或者现有的PCR技术,通过基因组库或者cDNA库可以从其他的细菌分离根据本发明的核酸序列或者它的衍生物、这些序列的同源物或者部分。这些DNA序列在标准条件下与根据本发明的序列杂交。
理解“杂交”指的是多核苷酸或者寡核苷酸在标准条件下结合几乎互补的序列的能力,而在这些条件下在非-互补的配偶体之间的非特异的结合不发生。为此,序列可以是90-100%互补的。例如在RNA印迹法或者DNA印迹法或者在PCR或RT-PCR的引物结合中利用了互补序列能彼此特异地结合的特征。
将保守区的短寡核苷酸有利地用于杂交。然而,也可能将根据本发明的核酸的较长片段或者全序列用于杂交。取决于使用的核酸(寡核苷酸,较长的片段或者全序列)或者取决于用于杂交的核酸类型-DNA或RNA,这些标准条件不同。例如,DNA:DNA杂合体的解链温度比相同长度的DNA:RNA杂合体的解链温度低约10°C。
例如,取决于核酸,理解标准条件指的是在具有0.1SSC至5xSSC(1XSSC=0.15MNaCl,15mM柠檬酸钠,pH7.2)或者额外地存在50%的甲酰胺的水性缓冲液中在42°C和58°C之间的温度,例如在5xSSC,50%甲酰胺中42°C下。有利地,对于DNA:DNA杂合体,杂交条件是0.1xSSC和约20°C至45°C之间,优选地约30°C至45°C之间的温度。对于DNA:RNA杂合体,杂交条件有利地是0.1xSSC和约30°C至55°C之间,优选地约45°C至55°C之间的温度。这些指出的用于杂交的温度是在缺少甲酰胺的情况下计算具有近似100个核苷酸的长度和50%的G+C含量的核酸的理论解链温度值的实例。在相关的遗传学教科书,例如Sambrook等人,1989中描述了用于DNA杂交的实验条件,并且使用本领域技术人员已知的公式,例如取决于核酸长度,杂合体的类型或者G+C含量的公式可以计算所述实验条件。本领域的技术人员可以从以下的教科书中获得关于杂交的进一步的信息:Ausubel等人(eds),1985,CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,NewYork;Hames和Higgins(eds),1985,NucleicAcidsHybridization:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford;Brown(ed),1991,EssentialMolecularBiology:APracticalApproach,IRLPressatOxfordUniversityPress,Oxford。
特别地可以在严格条件下进行“杂交”。例如在Sambrook,J.,Fritsch,E.F.,Maniatis,T.,in:MolecularCloning(ALaboratoryManual),2ndedition,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989,pages9.31-9.57或者在CurrentProtocolsinMolecularBiology,JohnWiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6中描述了这种杂交条件。
“严格的”杂交条件特别地指的是:在42°C在溶液中温育过夜,接着在65°C用0.1xSSC洗涤滤器,所述溶液由50%甲酰胺、5xSSC(750mMNaCl,75mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5xDenhardt溶液、10%硫酸葡聚糖和20g/ml变性的被剪切的鲑精DNA组成。
本发明也涉及实际公开的衍生物或者可衍生的核酸序列。
因此,根据本发明进一步的核酸序列可以来源于,例如SEQIDNO:1至9,11,13,15,17至22,24,26,27,28,30和33至37并且可以通过添加、取代、插入或者缺失单个或者多个核苷酸与上述序列相区分,并且还编码具有所希望的性质谱的多肽。
根据本发明,也包含这些核酸序列,其包含“沉默”突变,或者相应于特定来源或者宿主生物的密码子使用与实际提到的序列比较已经被修饰,以及天然发生的变体,例如所述核酸序列的剪接变体或者等位变体。
本发明也涉及通过保守的核苷酸取代(即,用具有相同电荷、大小、极性和/或溶解度的氨基酸替换所涉及的氨基酸)可以获得的序列。
本发明也涉及由实际公开的核酸的序列多态性衍生的分子。由于天然变异,这些遗传多态性可在群体中的个体之间存在。这些天然变异在基因的核苷酸序列中通常产生1%至5%的变化。
理解根据本发明的上文提到的核酸序列的衍生物指的是,例如等位变体,其在衍生的氨基酸水平上,在整个序列范围内(在氨基酸水平的同源性方面,可以参考上文针对多肽的实施方案)具有至少60%的同源性,优选地至少80%的同源性,更特别优选地至少90%的同源性。有利地,在序列的部分区域同源性可以更高。
此外,理解衍生物指的是,例如与启动子的融合物。通过至少一个核苷酸的替换、至少一个插入、倒位和/或缺失可以修饰位于所指出的核苷酸序列的上游的启动子,而不损伤启动子的功能性或者功效。另外,通过修饰启动子的序列可以增加启动子的活性,或者外源生物的可以用更有活性的启动子完全替换。
此外,本领域的技术人员已知产生功能突变体的方法。
取决于使用的技术,本领域的技术人员可以将随机突变或者备选地更定向的突变完全引入到基因区或者备选地非编码核酸区(例如,其对于表达的调节是重要的)中,并且随后产生基因库。本领域的技术人员已知需要的分子生物学方法,并且其描述于例如Sambrook和Russell,MolecularCloning.3.Edition,ColdSpringHarborLaboratoryPress2001。
本领域的技术人员已经熟知修饰基因和因此修饰这些基因编码的蛋白质的方法很长时间,例如
-位点特异性诱变,其中以定向方式替换基因的单个或者多个核苷酸(TrowerMK(Ed.)1996;Invitromutagenesisprotocols.HumanaPress,NewJersey),
-饱和诱变,其中在基因的任一所希望的位点可以替换或者添加任一所希望的氨基酸的密码子(Kegler-EboDM,DocktorCM,DiMaioD(1994)NucleicAcidsRes22:1593;BarettinoD,FeigenbutzM,ValcárelR,StunnenbergHG(1994)NucleicAcidsRes22:541;BarikS(1995)MolBiotechnol3:1),
-易错聚合酶链反应(易错PCR),其中通过易错DNA-聚合酶突变核苷酸序列(EckertKA,KunkelTA(1990)NucleicAcidsRes18:3739);
-在增变株中基因的传代,其中,例如由于缺损DNA修复机制,出现了核苷酸序列突变率的增加(GreenerA,CallahanM,JerpsethB(1996)AnefficientrandommutagenesistechniqueusinganE.colimutatorstrain.In:TrowerMK(Hrsg.)Invitromutagenesisprotocols.HumanaPress,NewJersey)或者,
-DNA改组,其中形成并消化了密切相关的基因池,并且将片段用作聚合酶链反应的模板,其中通过重复的链分离和再接近最终产生了全长的嵌合基因(StemmerWPC(1994)Nature370:389;StemmerWPC(1994)ProcNatlAcadSciUSA91:10747)。
通过使用“定向进化”(尤其描述于ReetzMTundJaegerK-E(1999),TopicsCurrChem200:31;ZhaoH,MooreJC,VolkovAA,ArnoldFH(1999),Methodsforoptimizingindustrialenzymesbydirectedevolution,In:DemainAL,DaviesJE(Hrsg.)Manualofindustrialmicrobiologyandbiotechnology.AmericanSocietyforMicrobiology),本领域的技术人员也可以以选择性的方式大规模地产生功能突变体。本文,在第一步中,其中例如可以使用上文指出的方法首先产生各个蛋白质的基因库。以合适的方式例如通过细菌或者噬菌体展示系统表达基因库。
可以将宿主生物所涉及的基因再进行一轮突变,所述基因表达的功能突变体具有很大程度上相应于所希望性质的性质。可以迭代地重复突变和选择或筛选的步骤直到存在的功能突变体具有的所希望的性质达到了足够的程度。通过这种迭代步骤,可以逐步进行有限数目的突变,例如1到5轮突变,并且可以针对所述突变对所涉及的酶性质的影响来评价和选择。然后可以将所选择的突变体以相同的方式再进行突变的步骤。由此可以显著地减少待研究的单突变体的数目。
根据本发明的结果产生了关于所涉及的酶的结构和序列的重要信息,其是进一步选择性地产生具有所希望的修饰性质的酶必需的。特别地,可以限定“热点”,即序列部分,其潜在地适合通过引入选择突变来修饰酶的性质。
根据本发明的HSDH的这样的热点区的非限制性的实例总结如下:
35-40,特别是37-38,(在每种情况下是基于HSDH_短的氨基酸序列(SEQIDNO:14)。
90-105,93-100或96-100,特别是97和/或98,(在每种情况下是基于HSDH_短的氨基酸序列(SEQIDNO:14)。
3.2构建体
此外,本发明涉及表达构建体,其含有处于调节性核酸序列的遗传控制下的,编码根据本发明的多肽的核酸序列,以及包含这些表达构建体中的至少一种的载体。
根据本发明,理解“表达单位”指的是具有表达活性且包含如本文定义的启动子的核酸,并且所述启动子与待表达的核酸或者基因功能性连接之后调节这种核酸或者这种基因的表达,即转录和翻译。因此,关于这一点,启动子也被称作“调节性核酸序列”。除了启动子之外,可以含有另外的调控元件,例如增强子。
根据本发明,理解“表达盒”或者“表达构建体”指的是与待表达的核酸或者待表达的基因功能性连接的表达单位。因此,与表达单位比较,表达盒不仅包含调节转录和翻译的核酸序列,而且包含由于转录和翻译应当表达为蛋白质的核酸序列。
在本发明的上下文中,术语“表达”或“过表达”描述产生或增强一种或者多种酶在微生物中的细胞内活性,所述酶通过相应的DNA编码。为此,例如可以将基因引入到生物中,可以用另一种基因替换存在的基因,可以增加基因的拷贝数目,可以使用强启动子或者使用编码具有高活性的相应酶的基因,并且可以任选地组合这些措施。
根据本发明的此类构建体优选地包含各自的编码序列的5'-上游启动子和3'-下游终止子序列,以及任选地包含其他的常规的调控元件,即在每种情况下所述调控元件与编码序列有效连接。
根据本发明,理解“启动子”,“具有启动子活性的核酸”或者“启动子序列”指的是这样的核酸,其与待转录的核酸功能性地连接,调节这种核酸的转录。
在这一点上,理解“功能的”或者“有效的”连接指的是,例如将具有启动子活性的核酸的一种和待转录的核酸序列以及任选地其他的调控元件,例如保证核酸转录的核酸序列,例如终止子以这样的方式顺序排列,以致每种调控元件在核酸序列的转录中可以实现它的功能。为此,化学意义上的直接连接不是绝对必要的。遗传控制序列,例如增强子序列,也可以从更加远离的位置或者甚至从其他的DNA分子对靶序列发挥它们的功能。这样的排列是优选的,其中将待转录的核酸序列放置在启动子序列的下游(即,在3'端),以便两种序列互相共价结合。这里,启动子序列和待转基因表达的核酸序列之间的距离可以少于200bp(碱基对),或者少于100bp,或者少于50bp。
除了启动子和终止子之外,靶向序列、增强子、多腺苷酸化信号、选择标记、扩增信号、复制起点等是可提及的作为另外的调控元件的实例。例如在Goeddel,GeneExpressionTechnology:MethodsinEnzymology185,AcademicPress,SanDiego,CA(1990)中描述了合适的调节序列。
根据本发明的核酸构建体特别地包含序列SEQIDNO:11、13或15或者这些序列的衍生物和同源物,并且由此衍生的用于控制例如增强基因表达的核酸序列有利地与一种或者多种调节信号有效地或者功能性地连接。
除了这些调节序列之外,在实际的结构基因之前仍然可以已经存在这些序列的天然调节并且其任选地被遗传地修饰,以便关闭天然调节并且已经增强了基因的表达。然而,也可以更简单地构建核酸构建体,即在编码序列之前没有插入额外的调节信号,并且没有去除天然启动子及它的调节。代替的是,突变了天然调节序列以便不再发生调节并且增强了基因表达。
优选的核酸构建体也有利地含有与启动子功能性连接的已经提到的“增强子”序列的一种或者多种,其使核酸序列的增强表达变得可能。在DNA序列的3'端也可以插入额外的有利的序列,如另外的调控元件或者终止子。在构建体中可以含有根据本发明的核酸的一个或者多个拷贝。构建体中可以任选地含有用于构建体的选择的另外的标记,如抗生素抗性或者营养缺陷型互补基因。
在启动子例如cos-、tac-、trp-、tet-、trp-tet-、lpp-、lac-、lpp-lac-、lacIq-,T7-、T5-、T3-、gal-、trc-、ara-、rhaP(rhaPBAD)SP6-、λ-PR-或者在λ-PL启动子中含有合适的调节序列的实例,所述启动子在革兰氏阴性细菌中有利地被使用。例如在革兰氏阳性启动子amy和SPO2中,并且在酵母或者真菌启动子ADC1、MFalpha、AC、P-60、CYC1、GAPDH、TEF、rp28、ADH中含有另外的有利的调节序列。也可以将人工启动子用于调节。
为了在宿主生物中表达,将核酸构建体有利地插入到载体,例如质粒或者噬菌体中,所述载体可以使基因在宿主中最优表达。除了质粒和噬菌体之外,也将理解载体指的是本领域技术人员已知的所有其他的载体,即,例如病毒,如SV40、CMV,杆状病毒和腺病毒、转座子、IS元件、噬菌粒、粘粒以及线性或者环状DNA。这些载体在宿主生物中可被自主地复制或者可随染色体复制。这些载体是本发明进一步的实施方案。
合适的质粒,例如在大肠杆菌(E.coli)中为pLG338、pACYC184、pBR322、pUC18、pUC19、pKC30、pRep4、pHS1、pKK223-3、pDHE19.2、pHS2、pPLc236、pMBL24、pLG200、pUR290、pIN-III113-B1、λgt11或pBdCI;在链霉菌属(Streptomyces)中为pIJ101、pIJ364、pIJ702或者pIJ361;在芽孢杆菌属(bacillus)中为pUB110、pC194或pBD214;在棒杆菌属(Corynebacterium)中为pSA77或pAJ667;在真菌中为pALS1、pIL2或pBB116;在酵母中为2alphaM、pAG-1、YEp6、YEp13或pEMBLYe23,或者在植物中为pLGV23、pGHlac+、pBIN19、pAK2004或pDH51。提到的质粒代表可能的质粒的一小部分。另外的质粒是本领域的技术人员已知的并且例如可从书籍CloningVectors(Eds.PouwelsP.H.等人,Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985,ISBN0444904018)得到。
在载体的进一步的实施方案中,也可将含有根据本发明的核酸构建体或者根据本发明的核酸的载体以线性DNA的形式有利地引入到微生物中并且通过异源或者同源重组整合进宿主生物的基因组中。这种线性DNA可以由线性化的载体如质粒或者仅仅根据本发明的核酸构建体或者核酸组成。
为了异源基因在生物中的最优表达,相应于生物中使用的特定的“密码子选择”改变核酸序列是有利的。通过所涉及的生物的其他已知基因的计算机评估可以很容易确定“密码子选择”。
通过合适的启动子与合适的编码核苷酸序列以及终止子信号或多腺苷酸化信号的融合产生本发明的表达盒。为此,例如在T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)以及在T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984)并且在Ausubel,F.M.等人,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.andWileyInterscience(1987)中描述了通常的重组和克隆技术。
将重组核酸构建体或者基因构建体有利地插入到用于在合适的宿主生物中,有利地插入宿主特异的载体中用于表达,所述载体可以使该基因在该宿主中最优表达。本领域的技术人员已知并且例如将从“CloningVectors”(PouwelsP.H.等人,Publ.Elsevier,Amsterdam-NewYork-Oxford,1985)中得到所述载体。
4微生物
取决于组成,可以理解术语“微生物”指的是起始微生物(野生型)或者经遗传修饰的重组微生物或者这两种。
借助于根据本发明的载体可以产生重组敲除微生物,用例如根据本发明的至少一种载体转化所述微生物并且其可用于根据本发明的多肽的产生。有利地,将上文描述的根据本发明的重组构建体引入到合适的宿主系统中并且表达。本文中,本领域技术人员已知的通常的克隆和转染方法,例如共沉淀、原生质体融合、电穿孔、逆转录病毒转染等,优选地用于促使提到的核酸在各自的表达系统中表达。例如在CurrentProtocolsinMolecularBiology,F.Ausubel等人,Publ.WileyInterscience,NewYork1997,或者Sambrook等人,MolecularCloning:ALaboratoryManual.2ndedition,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NY,1989中描述了合适的系统。
适合于根据本发明的核酸或核酸构建体的重组宿主生物基本上为全部原核或真核生物。有利地,将微生物如细菌、真菌或酵母用作宿主生物。有利地,使用革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌,优选地使用肠杆菌科、假单胞菌科、根瘤菌科、链霉菌科或诺卡尔菌科的细菌,特别优选地使用埃希氏菌属、假单胞菌属、链霉菌属、诺卡尔菌属、伯霍尔德杆菌属、沙门菌属、土壤杆菌属、梭菌属或红球菌属的细菌。特别优选地是大肠杆菌的属和种。而且,可以在α-蛋白菌(proteobacteria)、β-蛋白菌、λ-蛋白菌的类群中发现更有利的细菌。
本文宿主生物或根据本发明的宿主生物优选地含有本发明中所述的核酸序列,编码具有HSDH活性例如根据上文定义的3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH活性,特别是3α-、7β-或12α-HSDH活性的酶的核酸构建体或载体中的至少一种。
根据宿主生物以本领域技术人员已知的方式各自培养根据本发明的方法中使用的生物或使其生长。通常在用氧气通气的情况下,在0°C至100°C,优选地10°C至60°C的温度下,在液体培养基中培养微生物,所述液体培养基含有通常为糖形式的碳源,通常为有机氮形式的氮源如酵母提取物,或盐如硫酸铵,微量元素如铁盐、锰盐或镁盐,任选地含有维生素。这里,可将培养液的pH保持在固定值,即在培养期间可调节或可不调节pH。可以以“批次”-方式,“半批次”方式或连续地进行培养。可以在发酵的起始提供营养物或随后半连续地或连续地提供营养物。
5.UDCA的酶/化学生产
5.1氧化方法
例如,在申请人的WO2009/118176中描述了这种氧化方法。
为了进行胆结石的药物治疗,尤其已经使用了活性物质熊去氧胆酸(UDCA)和相关的非对映异构体鹅去氧胆酸(CDCA)很多年。两种化合物仅在第7位C原子上的羟基构型不同(UDCA:β-构型,CDCA:α-构型)。为了产生商用量的UDCA,以前已经优选地使用一种方法,其中将CDCA用作原料。相应地,CDCA优选地从胆酸(CA)制备。
5.1.1CDCA的产生
作为唯一的化学方法的备选,根据本发明提供了将CA酶催化氧化到12-酮鹅去氧胆酸(12-酮-CDCA,CAS2458-08-4),然后将其进一步转化成CDCA的途径。这种合成途径仅包括两个步骤,因此与纯粹的化学途径比较显然更简单。
第一步:酶促氧化
第二步:脱氧
根据步骤1,通过12α-HSDH将胆酸NADP+依赖地氧化成12酮鹅去氧胆酸(12-酮-CDCA)。该反应是可逆的。12α-HSDH属于酶种类1.1.1.176并且主要发现于羧菌属的细菌。
根据本发明优选地通过根据本发明的12α-HSDH(长或短的形式)进行酶促氧化,并且通过ADH,例如ADHms或ADHt进行辅因子再生。
根据步骤2的脱氧是典型的化学Wolff-Kishner还原,并且类似于上文描述的CDCAIII的脱氧进行所述根据步骤2的脱氧。该途径的显著优点是由于酶的选择性,没有形成杂质石胆酸。
5.1.2CDCA至UDCA的反应
将上文的CDCA用作UDCA(CAS128-13-2)的原料。在第一个合成步骤中,将CDCA的第7位中的羟基氧化成相应的酮。得到了7-酮石胆酸(3α-羟基-7-酮胆烷酸,简称:KLCA,CAS4651-67-6)。之后,在第二步中,将7位中的酮基立体选择性地还原。目标在于获得具有尽可能高的非对映立体选择性的UDCA。通常,在直接还原之后,UDCA仍含有少量的非对映异构体CDCA。为了取得活性物质UDCA,必须在第三步中纯化粗制的UDCA。
第一步:氧化
第二步:还原
第三步:纯化
粗制UDCA->纯的UDCA
通常在次氯酸钠水溶液中进行CDCA的氧化。在文献中,发现铬酸氧化也是备选的。获得固体的KLCA,然后在第二步中将其进一步加工。可以在醇中用金属钠进行还原。粗制产物具有这样的组成:UDCA:CDCA为约85:15。在备选的方法中,使用作为溶剂的醇(例如,脂肪族醇)中的镍催化剂(Raneynickel)上的氢与碱(如叔-丁酸钾或氢氧化钾(EP-A-0230085)一起还原KLCA。另外,用钾和锂(具有比钠更高的选择性,C.Giordano等人.Angew.Chem.1985,97,510)和锌(ES489661)以及电化学地(US4547271)还原也是可以的。
将粗制的UDCA纯化至纯的UDCA是立体异构物盐的分离。所述纯化通过制备、分离和随后切割UDCA的合适的盐来进行。在文献中提到了以下的备选的纯化方法:相应的UDCA酯的制备,重结晶和切割(EP-A-0386538),萃取(JP60006699)和层析法(IT2000MI1177)。
5.2还原方法
例如在申请人的PCT/EP2010/068576中描述了此类方法。
5.2.1CA到DHCA的化学反应
用酸性溶液(例如H2SO4)中的铬酸或铬酸盐以经典化学途径中的本身已知的方式将CA的羟基氧化成羰基。由此得到了DHCA。
5.2.2DHCA到12-酮-UDCA的酶或微生物反应
在水溶液中,在NADPH或NADH的存在下,通过3α-HSDH和7β-HSDH或其突变体将DHCA特异性地还原成12-酮-UDCA。在异丙醇或甲酸钠或葡萄糖的存在下,通过醇脱氢酶(ADH)或甲酸脱氢酶(FDH)或葡糖脱氢酶(GDH)或所述酶的突变体可以使辅因子NADPH或NADH再生。该反应在温和条件下进行。例如,可以在pH=6至9,特别是pH约=8时,并且在约10至30,15至25或约23℃下进行反应。本文可以逐步(即以任何所希望的顺序依次)或同时(即组合)使用3α-HSDH和7β-HSDH。
在微生物的反应步骤的情况下,在待反应的底物(DHCA)的存在下,可以在合适的液体培养基中需氧或厌氧培养表达必需的酶活性的重组微生物。合适的培养条件是本领域技术人员本身已知的。所述培养条件包含在例如,5至10或6至9的pH值范围内,在10至60或15至45或25至40的温度范围内或37℃下的反应。合适的培养基包含,例如,LB和TB培养基。本文的反应时间可以采用,例如,分批或连续培养法或其他惯用方法的变型(如上文所述)。本文的反应时间可以是,例如,从几分钟到数小时或数天的范围,并且可以是,例如,1小时至48小时。任选地,如果还没有连续地表达酶活性,那么在达到例如约OD600=0.5至1.0的靶细胞密度之后,通过添加合适的诱导剂可以引入所述酶活性。
5.2.3:12-酮-UDCA至UDCA的化学反应
通过Wolff-Kishner还原以本身已知的方式除去12-酮-UDCA的12-羰基,由此从12-酮-UDCA得到UDCA。在该反应中,首先用肼将羰基转化成腙。随后,在碱(例如,KOH)的存在下,将腙加热至200°C,此时去除了氮并形成UDCA。
6.HSDHs的重组产生
本发明还包括HSDHs,例如,3α-、3β-、7β-、11α、11β-、12α、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH,特别是3α、7β-或12α-HSDHs,或所述HSDHs的功能性的生物学活性片段的重组产生,其中培养产生HSDH的敲除微生物,任选地诱导多肽的表达,并且将所述多肽从培养物分离。因此,根据需要,也可以以大的工业规模生产多肽。
可以连续地或以分批地在分批法(分批培养)或以补料分批(补料分批法)或重复补料分批方法(重复补料分批法)培养根据本发明产生的敲除微生物。可以在Chmiel的教科书(Bioprozeβtechnik1.EinführungindieBioverfahrenstechnik[Bioprocesstechnology1.Introductiontobioprocesstechnology](GustavFischerVerlag,Stuttgart,1991))中或在Storhas的教科书(BioreaktorenundperiphereEinrichtungen[Bioreactorsandperipheraldevices](ViewegVerlag,Brunswick/Wiesbaden,1994))中发现关于已知的培养方法的概述。
适合使用的培养基必须满足各个菌株的要求。在手册"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"oftheAmericanSocietyforBacteriology(WashingtonD.C.,USA,1981)中含有多种微生物的培养基的描述。
待使用的培养基合适地必须满足各自菌株的要求。美国细菌学协会的手册"ManualofMethodsforGeneralBacteriology"(WashingtonD.C.,USA,1981)中有多种微生物培养基的描述。
根据本发明可以使用的这些培养基通常包含一种或者多种碳源、氮源、无机盐、维生素和/或微量元素。
优选的碳源是糖,如单糖、二糖或者多糖。非常好的碳源是例如葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、核糖、山梨糖、核酮糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、棉子糖、淀粉或纤维素。通过复杂的化合物,如糖蜜或者糖精制的其他副产物也可以将糖加入到培养基中。加入多种碳源的混合物也可以是有利的。其他的可能的碳源是油和脂肪例如大豆油、葵花籽油、花生油和椰子脂,脂肪酸例如棕榈酸、硬脂酸、或亚油酸,醇例如甘油、甲醇或乙醇,以及有机酸例如乙酸或乳酸。
氮源通常是有机或者无机氮化合物或者含有这些化合物的物质。示例性的氮源包含氨气,或者铵盐如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵或硝酸铵、硝酸盐、尿素、氨基酸,或者复杂氮源、如玉米浆、大豆粉、大豆蛋白质、酵母提取物、肉膏和其他的物质。可以单独地或者作为混合物使用氮源。
可以在培养基中存在的无机盐化合物包含钙、镁、钠、钴、钼、钾、锰、锌、铜和铁的氯化物、磷酸盐或硫酸盐。
不但含硫的无机化合物,例如硫酸盐、亚硫酸盐、连二亚硫酸盐、连四硫酸盐、硫代硫酸盐、硫化物可被用作硫源,而且有机硫化合物如硫醇和硫醇类也可被用作硫源。
磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或相应的含钠的盐可以被用作磷源。
可将螯合剂加入到培养基中以维持溶液中的金属离子。特别适合的螯合剂包含二羟基酚如儿茶酚或者原儿茶酸,或者有机酸如柠檬酸。
根据本发明使用的发酵培养基通常也含有其他的生长因子,如维生素或者生长促进剂,所述维生素或者生长促进剂包括例如生物素、核黄素、硫胺素、叶酸、烟酸、泛酸和吡哆醇。生长因子和盐通常来源于复杂的培养基组分,如酵母提取物、糖蜜、玉米浆等。此外,可以将合适的前体加入到培养基中。培养基化合物的精确组成强烈地取决于各个实验并且对于每种特定的情况被单独确定。从教科书"AppliedMicrobiol.Physiology,APracticalApproach"(ed.P.M.Rhodes,P.F.Stanbury,IRLPress(1997)pp.53-73,ISBN0199635773)可获得培养基优化的信息。也可以从商业供应商获得生长培养基,如Standard1(默克)或者BHI(脑心浸液,DIFCO)等。
通过加热(在1.5巴和121°C下20min)或者通过过滤除菌将培养基的所有组分灭菌。组分可以一起灭菌,或者如果需要,单独灭菌。可以在培养的起始存在培养基的所有组分,或者其任选地可以连续地或者分批地被添加。
培养的温度通常在15°C和45°C之间,优选地在25°C和40°C之间,并且在实验期间可以保持不变或者改变。培养基的pH应当在5至8.5之间,优选地在7.0左右。在培养期间通过加入碱性化合物如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水,或酸性化合物如磷酸或硫酸可以控制培养物的pH。为了控制泡沫的产生,可以使用消泡剂,例如脂肪酸聚乙二醇酯。为维持质粒的稳定,可将合适的选择性作用的物质,例如抗生素加入到培养基中。为维持需氧条件,将氧气或者含有氧气的气体混合物,例如环境空气引入培养物中。培养的温度通常为20°C和45°C之间。继续培养直到已经形成了最大量的希望产物。通常在10小时至160小时内达到该目标。
随后对发酵液进一步加工。根据需要,通过分离方法例如,离心、过滤、倾析或这些方法的组合可从发酵液中完全或部分地除去生物质或将生物质全部留在发酵液中。
如果多肽没有分泌到培养基中,那么也可以使细胞破裂并根据已知的蛋白质分离方法从裂解物获得产物。任选地通过高频超声,通过高压例如在弗氏压碎器中,通过渗透裂解,通过去垢剂、分解酶或者有机溶剂的作用,通过匀浆器或者通过所列出的多种方法的组合可以使细胞破裂。
使用已知的层析方法,如分子筛层析(凝胶过滤),如Q-琼脂糖层析、离子交换层析和疏水层析,并使用其他的常规方法,如超滤、结晶、盐析、透析和非变性凝胶电泳可以实现多肽的纯化。例如,在Cooper,F.G.,BiochemischeArbeitsmethoden[BiochemicalWorkingMethods],VerlagWalterdeGruyter,Berlin,NewYorkorinScopes,R.,ProteinPurification,SpringerVerlag,NewYork,Heidelberg,Berlin中描述了合适的方法。
对于分离重组蛋白可以有利的是使用载体系统或寡核苷酸,其通过确定的核苷酸序列使cDNA延长并因此而编码例如用于更简单的纯化的经修饰的多肽或融合蛋白。这种类型的合适的修饰是,例如起到锚的作用的“标签”,例如,称作六-组氨酸锚的修饰或表位,其可被识别为抗体的抗原(例如,描述于Harlow,E.和Lane,D.,1988,Antibodies:ALaboratoryManual.ColdSpringHarbor(N.Y.)Press)。这种锚可以用于使蛋白质附着到固相载体(例如可以填充到层析柱的聚合物基质)上或者可用在微量滴定板或另一载体上。
同时,这种锚也可用于蛋白质的识别。此外,为了识别蛋白质,可以单独使用常规标记,如荧光染料、酶标记(与底物反应后形成可检测的反应产物)或放射性标记,或将上述标记与用于衍生蛋白质的锚组合使用。
酶的固定化
在本文描述的方法中可以以游离的或固定化形式使用根据本发明的酶。理解固定化酶指的是固定到惰性载体上的酶。从EP-A-1149849,EP-A-1069183和DE-A100193773以及其中引用的参考文献已知合适的载体材料和其上固定的酶。在这方面完全参考这些说明书的内容。合适的载体材料包括,例如粘土,粘土矿物质如高岭土、硅藻土、珍珠岩、硅化硅、氧化铝、碳酸钠、碳酸钙、纤维素粉,阴离子交换材料,合成聚合物如聚苯乙烯、丙烯酸树脂、苯酚-甲醛树脂、聚氨基甲酸酯,以及聚烯烃如聚乙烯和聚丙烯。为了产生支持酶,通常以细分的颗粒形式使用载体材料,其中多孔的形式是优选的。载体材料的颗粒大小通常不超过5mm,特别地不超过2mm(筛线)。类似地,当使用脱氢酶作为全细胞催化剂时,可以选择游离的或者固定的形式。载体材料是例如藻酸钙或者角叉菜胶。用戊二醛可以直接交联酶和细胞(交联到CLEAs上)。例如,在J.Lalonde和A.Margolin“ImmobilizationofEnzymes”inK.Drauz和H.Waldmann,EnzymeCatalysisinOrganicSynthesis2002,Vol.III,991-1032,Wiley-VCH,Weinheim中描述了相应的和另外的固定化方法。
8.敲除突变体的产生
本领域技术人员已知敲除的方法,例如缺失或插入核酸或核酸序列的方法,并且其包含,例如,使用寡核苷酸引物和PCR的常规方法以及使用质粒和限制性内切酶的方法,借助于所述限制性内切酶,可将所希望的经修饰的核酸序列整合到质粒中。通常在,例如以下文献中已知和描述这些和其他的分子遗传学方法:T.Maniatis,E.F.Fritsch和J.Sambrook,MolecularCloning:ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1989)和T.J.Silhavy,M.L.Berman和L.W.Enquist,ExperimentswithGeneFusions,ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarbor,NY(1984),Ausubel,F.M.等人.,CurrentProtocolsinMolecularBiology,GreenePublishingAssoc.和WileyInterscience(1987);"GeneExpressionTechnology“,MethodsinEnzymology,Vol185,Elsevier,1990;“BacterialGeneticSystems”,MethodsinEnzymology,Vol.204,Elsevier,1991;“RecombinantDNA,PartE”,MethodsinEnzymology,Vol.154,Elsevier,1987;和C.D.Smolke(ed.),Themetabolicpathwayengineeringhandbook:toolsandapplications,CRCPress.BocaRaton,2010;C.Mühlhardt,“TheExperimentator:Molekularbiologie/Genomics”,6thed.,SpektrumAkademischerVerlag,Heidelberg2010;D.Clark,N.Pazdernik,“MolekulareBiotechnologie”,SpektrumAkademischerVerlag,Heidelberg,2009;M.Jahnson(Ed.),“GentechnischeMethoden”,4thed.,SpektrumAkademischerVerlag,Heidelberg,2006;J.M.S.Bartlett,D.Stirling(Ed.),“MethodsinMolecularBiology”,Vol.226,“PCRProtocols”,SpringerVerlagGmbH,2003
产生敲除突变体的其他已知的方法是基于同源重组。本文,特别地提供了具有侧翼序列(与待敲除的基因序列同源)的标记基因,并且通过合适的载体(例如质粒、插入序列、转座子)将所述标记基因与待敲除的靶序列连接。标记基因优选地位于宿主生物中,例如染色体(取决于宿主生物,为细菌染色体或真核染色体)中或在所涉及的宿主中的染色体外的核酸构建体(例如质粒)上。然而,可以想到标记基因同样可以位于无细胞或体外系统中。在合适的重组系统(例如,重组酶)的存在下,进行同源重组,其中,由于侧翼序列的同源性,将标记基因整合到靶序列中,并且在位于靶序列的侧翼序列之间的核酸区的替换中将所述标记基因除去。以这种方式插入的标记基因的基因产物可用于敲除突变体的选择。标记基因优选地编码介导抗生素抗性的蛋白质,以便可以通过含有抗生素的固体培养平板或液体培养基进行选择。然而,标记基因也可编码其他的蛋白质,如荧光蛋白,例如“绿色荧光蛋白”(GFP),以便可通过在荧光显微镜下观察菌落或通过荧光激活细胞分选术(FACS)进行选择。除其他的重组形式外,通常已知同源重组的原则并且其描述于,例如R.Y.Stanier,J.L.Ingraham,M.L.Wheelis,P.R.Painter(ed.)“GeneralMicrobiology”,5thed.,1986,MacmillanEducationLtd.,Houndmills,London,pp.278–285,furthermorein“DNACloning”,VolumeII,D.M.Glover(ed.),IRLPress,Oxford,WashingtonD.C.,1986,pp.57-65;KarlDrlica,“DNAundGenklonierung–einLeitfaden“,G.FischerVerlag,Stuttgart,Jena,1995,“Transposition”chapter.pp.155-161,和D.H.Jones和S.C.Winistorfer,“RecombinationandSite-DirectedMutagenesisusingRecombinationPCR”,in:J.M.S.Bartlett,D.Stirling(eds.),“MethodsinMolecularBiology”,Vol.226,“PCRProtocols”,SpringerVerlagGmbH,2003,Chapter70,pp.517-525;和A.S.Waldman(ed.),“MethodsinMolecularBiology”,Vol.262,“GeneticRecombination–ReviewsandProtocols”,SpringerVerlagGmbH,2004;F.P.Miller,A.F.Vandome,J.McBrewster(Ed.),“GeneticRecombination”,AlphascriptPublishing,2009;F.P.Miller,A.F.Vandome,J.McBrewster(Eds.),“GeneTargeting”,AlphascriptPublishing,2010A.Aguilera和R.Rothstein,MolecularGeneticsofRecombination,Springer-VerlagGmbH,2007.Specialpublicationsongene-knockoutmethodsaredescribed,inparticularforeukaryoticcellsandanimals”GeneKnockoutProtocols“,RalfKühn和WolfgangWurst(eds.),HumanaPress.,2ndedition2009,以及WolfS.E.和Woodside,K.J,Transgenicandgeneknockouttechniquesandburnresearch,J.Surg.Res.123(2):328-339,2005。
此外,用于产生基因-敲除的商业化试剂盒是可获得的,例如Sigma-Aldrich的“TargeTron基因敲除系统”,其特别地用于大肠杆菌和相关的细菌种类。
适合产生敲除突变体或遗传修饰的另外的系统的实例是Cre/lox系统(尤其描述于SauerB和HendersonN,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85(14):5166-5170,1988),或“Red/ET重组(Recombination)”系统(GeneBridgesGmbH,海德堡,德国;描述于用户手册“Red/ETRecombination–CloningwithoutRestrictionsEnzymes”,GeneBridgesGmbH,尤其进一步描述于专利US6,355,412,US6,509,156和EP4139561)。
9.辅因子再生
通过与辅因子再生酶偶联可以减少辅因子的需要。为此,可以使用现有技术的各种方法。
现有技术教授了例如谷氨酸脱氢酶(GLDH)的用途(Carrea,G.,等人,BiotechnologyandBioengineering,1984.26(5):p.560-563)。GLDH将NADPH重新氧化成NADP+,同时将α-酮戊二酸还原胺化成谷氨酸。
备选地,也提出了将醇脱氢酶ADH-Tb、ADH-Lb和ADH-ms用于辅因子再生(Fossati,E.,等人,BiotechnolBioeng,2006.93(6):p.1216-20)。随着NADP+的再生,ADH将丙酮转化成2-丙醇。
用于NADH或NAD再生的其他的仲醇脱氢酶是,例如,从假丝酵母属和毕赤酵母属的酵母分离的那些仲醇脱氢酶,例如:来自近平滑假丝酵母(Candidaparapsilosis)(CPCR)(US5,523,223和US5,763,236;EnzymeMicrob.Technol.1993Nov;15(ll):950-8)、Pichiacapsulata(DE10327454.4)、粉状毕赤酵母(Pichiafarinosa)(A1261/2005,Kl.C12N)、Pichiafinlandica(EP1179595Al)、Candidanemodendra(A1261/2005,Kl.C12N)、喜海藻糖毕赤酵母(Pichiatrehalophila)(A1261/2005,Kl.C12N)、粘质红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)(A1261/2005,Kl.C12N)、Lodderomyceselongisporus(A1261/2005,Kl.C12N)和树干毕赤酵母(Pichiastipidis)(A1261/2005,Kl.C12N)的羰基还原酶。此外,使用如从放线菌类的细菌,例如从红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)(US5,523,223)、Norcardiafusca(Biosci.Biotechnol.Biochem.,63(10)(1999),pages1721-1729;Appl.Microbiol.Biotechnol.2003Sep;62(4):380-6,Epub2003Apr26)、赤红球菌(Rhodococcusruber)(J.Org.Chem.2003Jan24;8(2):402-6)或微杆菌属(Microbacterium)(A1261/2005,Kl.C12N)分离的仲醇脱氢酶也可以进行NADH的再生。
用于NADPH或NADP再生的合适的仲醇脱氢酶/氧化还原酶是,例如从乳杆菌目的高加索酸奶乳杆菌(Lactobacilluskefir)(US5,200,335)、短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)(DE19610984Al;ActaCrystallogr.D.Biol.Crystallogr.2000Dec;56Pt12:1696-8)、稍小乳杆菌(Lactobacillusminor)(DE10119274)、肉色明串珠菌(Leuconostoccarnosum)(A1261/2005,Kl.C12N)的生物分离的那些仲醇脱氢酶/氧化还原酶或如从Thermoanerobiumbrockii、Thermoanerobiumethanolicus或拜氏梭菌(Clostridiumbeijerinckii)描述的那些仲醇脱氢酶/氧化还原酶。在EP-A-1731618中描述了通过乳酸脱氢酶(LDH;随着NAD+的再生,丙酮酸反应成乳酸)进行的辅因子的再生。
用于辅因子再生的其它合适的脱氢酶是葡糖脱氢酶(GDH)、甲酸脱氢酶(FDH)(特别地,至少催化甲酸酶促氧化成二氧化碳)、葡糖-6-磷酸脱氢酶,或亚磷酸脱氢酶。
实验部分
如果没有给出其他的详述,那么可以如Sambrook等人.(1989)loc.Cit中描述的进行本发明的上下文中所进行的克隆步骤,例如,PCR(聚合酶链反应)、限制性切割、琼脂糖凝胶电泳、DNA片段的纯化、将核酸转移至核酸硝基纤维素和尼龙膜上、DNA片段的连接、微生物的转化、微生物的培养、噬菌体的复制和重组DNA的序列分析。
根据K.Datsenko和B.Wanner,(PNASJune6,2000vol.97no.126640-6645)的描述通过同源重组进行敲除实验,参见图3。
A.一般的内容
1.材料:
LB培养基:
2.方法
2.1用于测定12α-HSDH活性的标准条件
如下定义活性:1U酶相应于在室温下(即约20℃-23°C)催化磷酸钾缓冲液(50mM,pH8.0)中的5mM胆酸溶液以1μmol/min反应的酶的量。
反应混合物含有1ml的总体积:
测量340nm处的吸收的增加并且使用6.22mM-1×cm-1的摩尔消光系数将活性计算为酶单位(U,即μmol/min)。
2.2用于测定7β-HSDH活性的标准条件
反应混合物含有1ml的总体积:
测量340nm处的吸收的增加并且使用6.22mM-1×cm-1的摩尔消光系数将活性计算为酶单位(U,即μmol/min)。
2.3用于分析胆酸的反应产物的HPLC法
柱:STARRP-18(预包装的RT125-4,前置柱LiChroSTARRP18,Merck)
HPLC系统:LC20AD(岛津,日本)
流速:1ml/min.
样品:1mg/ml的样品20μl
检测波长:200nm
梯度:
用85%的亚磷酸将pH调整为2.6
存留时间:
7-酮-3,12-二羟胆烷酸7.5min
胆酸13.5min
3.表达载体和质粒及其产生
pIJ773(SEQIDNO:1)
pIJ773质粒含有编码aparamycin抗性的基因(B.Gust等人,PNASFebruary18,2003vol.100no.41541-1546)。在进行重组后,这种抗性是选择所需要的。
pJOE6038.1(来源于pIJ790)(SEQIDNO:2)
pJOE6038.1质粒(B.Gust等人.PNASFebruary18,2003vol.100no.41541-1546)含有由三个基因Gam、Bet和Exo组成的λRed(LambdaRed)重组系统(K.Murthy,J.Bacteriology,Apr.1998,p.2063–2071)。Gam抑制宿主外切核酸酶RecBCDV,并且可以使Bet和Exo进行重组。
pCP20
为了切除选择标记,使用了编码切除所必需的FLP重组酶的pCP20质粒(K.Datsenko和B.Wanner,PNASJune6,2000vol.97no.126640-6645)。FLP重组酶切割FRT位点之间的DNA。
pET28a(+)
pET28a(+)(Novagen,Darmstadt)是含有T7启动子和转录起点控制下的MCS并且具有T7终止子的载体,且用于12α-HSDH的表达。通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。
pET28a(+)-7β-HSDH
如下制备质粒(也参见申请人的PCT/EP20100/068576):
首先,扩增编码7β-HSDH的序列。将产气柯林斯菌(Collinsellaaerofaciens)ATCC25986(DSM3979)的基因组DNA作为模板并使用引物5'-gggaattcCATATGAACCTGAGGGAGAAGTA-3'(SEQIDNO:26)和5'-cccAAGCTTCTAGTCGCGGTAGAACGA-3'(SEQIDNO:27)来获得PCR产物。引物序列中的NdeI和HindIII切割位点以下划线标出。通过PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物,然后使用酶NdeI和HindⅢ切割所述PCR产物。
纯化消化的PCR产物并使用T4连接酶将所述PCR产物克隆到pET-28a(+)载体中以产生表达载体。然后,将得到的表达构建体转化到大肠杆菌DH5α细胞中。预期的蛋白质应该含有20个氨基酸残基,其包含信号肽和N-末端6xHis标签以及凝血酶切割位点。插入的DNA序列通过测序(参见SEQIDNO:24和25)来核实。
pET22b(+)3α-HSDH:
这是pET22b(+)载体,其中来自睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonastestosteroni)的3α-HSDH序列(参见SEQIDNO:28和29)通过切割位点NdeⅠ和EcoRⅠ以常规方式(Oppermann等人,JBiochem,1996,241(3):744-749)被克隆到该载体中。
pET21a(+)FDHD221G
这是pET21a(+)载体,其中通过切割位点NdeI和EcoRI将来自母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvacca)N10的甲酸脱氢酶(SEQIDNO:32)克隆到在载体中。通过定点诱变,将甲酸脱氢酶的第221位(不考虑第1位的甲硫氨酸)或第222位(从第1位的甲硫氨酸计算;参见SEQIDNO:38和23)的天冬氨酸残基(D)替换成甘氨酸残基。由此获得的FDH突变体不仅可再生NADH,而且可再生NADPH。甲酸脱氢酶在核苷酸序列的第1202位(考虑起始密码子ATG时计算的)上具有单碱基缺失,从而导致最后的氨基酸缬氨酸被替换成丙氨酸。同时,这种碱基缺失导致终止密码子的关闭并导致原来位于可读框之外的His标签的激活(参见SEQIDNO:22和23)。(没有His标签的FDHD221G,参见SEQIDNO:37和38)。
如下制备表达质粒(也参见申请人的EP申请10015726):
a)克隆pET21a(+)FDH
将从俄罗斯的莫斯科州立大学(MoscowStateUniversity)生物系的培养物保藏中心订购的母牛分枝杆菌N10(保藏号43292)的基因组DNA用作扩增的模板。用于扩增的引物是从EurofinsMWGGmbH,Ebersberg订购的:
fdh_for(5‘-CGATCATATGGCAAAGGTCCTGTGCGTTC-3‘)(SEQIDNO:33)和
fdh_rev(5‘-GCTAGAATTCTCAGCCGCCTTCTTGAACT-3‘)(SEQIDNO:34)。限制性内切酶的识别位点以下划线标出。rev引物含有EcoRⅠ切割位点,而for引物含有NdeI切割位点。
在下表中指出了PCR批次和PCR程序。
表:用于扩增来自母牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的PCR批次
组分 | 体积[μl] |
10x Taq缓冲液(有Mg2+) | 5 |
dNTPs(10mM) | 1 |
Fdh_for(100μM) | 0.5 |
Fdh_rev(100μM) | 0.5 |
模板DNA(>=100ng/μL) | 1 |
Taq DNA聚合酶(5U/mL) | 0.5 |
蒸馏水 | 41.5 |
表:用于扩增来自母牛分枝杆菌的甲酸脱氢酶的PCR程序
段 | 循环数 | 变性 | 退火 | 延伸 |
1 | 1 | 94°C,2分钟 | ||
2 | 5 | 94°C,30秒 | 55.6°C,30秒 | 72°C,75秒 |
3 | 25 | 94°C,30秒 | 58.6°C,30秒 | 72°C,75秒 |
4 | 1 | 72°C,75秒 |
用5μl的10×NE缓冲液EcoRI,2.5μl的NdeⅠ(20U/mL)和2.5μl的EcoRI(20U/mL)(在每一种情况下,都来自NewEnglandBiolabs,Frankfurt)处理溶解在水中的1-5μg的DNA(pET21a(+)或FDH-PCR产物),并且用蒸馏水补足到50μl的总体积。将每种情况下的批次在37℃下温育1小时。随后,将裂解的DNA片段应用到1%浓度的琼脂糖凝胶(1%(质量/体积)的琼脂糖,0.05%(体积/体积)溴化乙锭)中,并且在120V将DNA片段电泳分离55分钟。接着,用手术刀从琼脂糖凝胶切除正确大小的条带(FDH基因中为1.2kb,pET21a(+)质粒中为5.4kb),并且根据制造商的方案借助QIAQuick凝胶提取试剂盒(QIAGEN,Hilden)分离。
用1μlT4连接酶(3U/μL)和1μl的10x连接酶缓冲液(在每种情况下,都来自NewEnglandBiolabs,Frankfurt)处理100ng的裂解载体DNA和111ng的裂解FDH-DNA,并用蒸馏水补充至10μl的总体积。在4℃过夜温育连接批次。
连接步骤完成后,将10μL连接批次加入到根据标准方案产生的200μl的化学感受态大肠杆菌DH5α中。之后,在冰上进行温育步骤30分钟,接着在42℃热休克(90秒)。随后,将600μl无菌的LB培养基加入到转化批次中,并且在37℃下在摇动培养箱中以200rpm培养细胞45分钟。在下一步骤中,将该批次在台式离心机中以3000rpm离心60秒,丢弃700μl上清液,将细胞重新悬浮于剩余的上清液中并且平板接种到具有100mg/l的氨苄青霉素的LB琼脂平板上。随后在37℃过夜培养琼脂平板。
b)产生pET21a(+)FDHD221G
使用以下的引物:
mt1:5‘-CCTGCACTACACCGGCCGTCACCGCCTGC-3‘(SEQIDNO:35)
NI_fdh_R:5‘-GCTCGAATTCTCAGACCGCCTTC--3‘(SEQIDNO:36)
首先,借助于引物mt和引物NI_fdh_R产生了两个互补的巨大引物(megaprimer)组。使用的模板是pET21a(+)质粒。从下表中可以推断出所使用的PCR程序:
表:PCR程序巨大引物
段 | 循环数 | 变性 | 退火 | 延伸 |
1 | 1 | 94°C,2分钟 | ||
2 | 30 | 94°C,30秒 | 60°C,30秒 | 72°C,40秒 |
3 | 1 | 72°C,5分钟 |
通过引物mt1和引物NI_fdh_R的组合,巨大引物的长度达到650bp。使用第一PCR的PCR产物,进行凝胶电泳并从凝胶分离所希望的条带。将巨大引物作为引物并且将质粒DNA(pETfdh)作为模板进行第二PCR,作为全质粒PCR。下表显示了全质粒PCR的反应批次和温度方案。2xEZClone酶混合物、EZClone溶液1、1.1kb的标记和来源于GeneMorphIIEZCloneDomainMutagenesisKit(Stratagene)的DpnI。
表:用于MEGAWHOPPCR的批次(总体积50μL)
组分 | |
巨大引物 | 250ng(~2.5μL,来自标准PCR) |
模板(pETfdh) | 50ng |
2x EZClone酶混合物 | 25μL |
EZClone溶液1 | 3μL |
蒸馏水 | 到50μL |
通过MEGAWHOPPCR中使用的聚合酶的3’->5’外切核酸酶活性,将PCR程序的第一步(68℃,5分钟)用于除去通过Taq聚合酶非特异地添加的碱基。
表:PCR程序MEGAWHOP
段 | 循环数 | 变性 | 退火 | 延伸 |
1 | 1 | 68°C,5分钟 | ||
2 | 1 | 95°C,1分钟 | ||
3 | 25 | 95°C,50秒 | 60°C,50秒 | 68°C,13分钟 |
PCR产物是具有单链断裂且仅在大肠杆菌中闭合的双链质粒。将10U的DpnI加入到50μL的PCR产物中,并且在37℃下温育该PCR批次两小时。DpnI仅降解甲基化的DNA,即使用的模板DNA,而不降解巨大引物或合成的质粒。必须使用dam+菌株(如DH10B或JM109)产生模板以获得甲基化的起始DNA。
以这种方式,获得了上文提到的表达质粒pET21a(+)FDHD221G。
4.微生物
菌株基因型
大肠杆菌BL21(DE3)F–ompTgaldcmlonhsdSB(rB-mB-)λ(DE3[lacIlacUV5T7gene1ind1sam7nin5])
B.实施例
实施例1:大肠杆菌菌株BL21(DE3)的7α-HSDH缺失突变体(大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH)(1型)的产生(通过同源重组敲除)
1.1来自大肠杆菌BL21(DE3)的7α-HSDH的序列信息
氨基酸序列:(SEQIDNO:10)
长度:255个氨基酸
类型:蛋白质
来源:大肠杆菌BL21(DE3)
VFNSDNLRLDGKCAIITGAGAGIGKEIAITFATAGASVVVSDINADAANHVVDEIQQLGGQAFACRCDITSEQELSALADFAISKLGKVDILVNNAGGGGPKPFDMPMADFRRAYELNVFSFFHLSQLVAPEMEKNGGGVILTITSMAAENKNINMTSYASSKAAASHLVRNMAFDLGEKNIRVNGIAPGAILTDALKSVITPEIEQKMLQHTPIRRLGQPQDIANAALFLCSPAASWVSGQILTVSGGGVQELN
核苷酸序列(SEQIDNO:9)
长度:768个碱基对
类型:核酸
来源:大肠杆菌BL21(DE3)
登录号:NC_012971区:1642470..1643237
gtgtttaattctgacaacctgagactcgacggaaaatgcgccatcatcacaggtgcgggt60
gcaggtattggtaaagaaatcgccattacattcgcgacagctggcgcatctgtggtggtc120
agtgatattaacgccgacgcagctaaccatgttgtagacgaaattcaacaactgggtggt180
caggcatttgcctgccgttgtgatattacttccgaacaggaactctctgcactggcagac240
tttgctatcagtaagctgggtaaagttgatattctggttaacaacgccggtggcggtgga300
cctaaaccgtttgatatgccaatggcggattttcgccgtgcttatgaactgaatgtgttt360
tcttttttccatctgtcacaacttgttgcgccagaaatggaaaaaaatggcggtggcgtt420
attctgaccatcacttctatggcggcagaaaataaaaatataaacatgacttcctatgca480
tcatctaaagctgcggccagtcatctggtcagaaatatggcgtttgacctaggtgaaaaa540
aatattcgggtaaatggcattgcgccgggggcaatattaaccgatgccctgaaatccgtt600
attacaccagaaattgaacaaaaaatgttacagcacacgccgatcagacgtctgggccaa660
ccgcaagatattgctaacgcagcgctgttcctttgctcgcctgctgcgagctgggtaagc720
ggacaaattctcaccgtctccggtggtggggtacaggagctcaattaa768
(编码链)
1.2aparamycin缺失盒的产生
制备以下的引物,用于敲除来自大肠杆菌BL21(DE3)的7α-HSDH。
正向:5’-GTGTTTAATTCTGACAACCTGAGACTCGACG
GAAAAATGATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’(SEQIDNO:3)
反向:5’-TTAATTGAGCTCCTGTACCCCACCACCGGA
GACGGTTTATGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’(SEQIDNO:4)
用下划线标出7α-HSDH序列的同源序列,其中来自正向引物的加下划线的序列编码为“VFNSDENLRLDGK”(N->C),并且来自反向引物的加下划线的序列编码为“TVSGGGVQELN”(N->C)。
以斜体表示aparamycin抗性盒的同源序列。FRT位点(B.Gust等人.PNASFebruary18,2003vol.100no.41541-1546)位于来自pIJ773质粒的aparamycin抗性盒的侧翼,并且在进行重组之后,允许再次从基因组除去抗性。
根据标准方案,如Sambrook(1998),将来自质粒pIJ773的aparamycin抗性盒作为模板进行PCR。纯化由此产生的具有来自7α-HSDH基因的两个同源臂的PCR产物。
1.3靶序列的重组/缺失
装备有pIJ790(B.Gust等人.PNASFebruary18,2003vol.100no.41541-1546)的反向NheI切割位点的pJOE6038.1质粒编码外切核酸酶(LambdaRedrecombinase,K.Murthy,J.Bacteriology,Apr.1998,p.2063–2071)。pJOE6038.1质粒是温度敏感的,并且在37℃培养时丢失。通过电穿孔(25μF,200ohms和2.5kV)将pJOE6038.1质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。
将菌落挑取到5mlLB中并在30°C下培养过夜。将培养物以1:100接种到40ml的LB培养基并且在30℃下培养。在约0.3的OD600时,用0.4%的L-阿拉伯糖诱导培养物,并在37℃下培养1小时以表达可以进行重组的核酸外切酶(λRed重组酶)。
将细胞离心,并用30ml冰预冷水洗涤。将细胞再次离心并用700μl冰预冷水再悬浮。将50μl的悬浮液与5l的PCR产物(来自上文的第一步)在冰上温育30分钟。电穿孔(25μF,200ohms和2.5kV)之后,立即吸入1ml的预冷LB培养基到培养物中。在37℃下培养细胞2小时45分钟。然后将细胞平板接种到LBaparamycin琼脂平板上。挑取菌落。用7α-HSDH引物进行的菌落PCR显示1500bps的条带(aparmycin抗性)。这显示本文替换了7α-HSDH基因,并且将aparmycin抗性整合到基因组中(参见图1)。将由此获得的敲除型菌株命名为大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDHAparR。
1.4抗性的切除
应当再次切除用于敲除的抗性基因,其侧翼是两个FRT位点。为了切除,使用pCP20质粒(K.Datsenko和B.Wanner,PNASJune6,2000vol.97no.126640-6645),其编码切除所必需的FLP重组酶。FLP重组酶切割FRT位点之间的DNA。pCP20质粒也是温度敏感的,并且在37℃培养时丢失。通过电穿孔(25μF,200ohms和2.5kV)将pCP20质粒转化到敲除型菌株大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDHAparR中。将4个菌落划线接种到LB-0中,并在42℃培养过夜,其中表达FLP重组酶并且切除aparamycin抗性基因。由此获得敲除型菌株大肠杆菌BL21(DE3)Δ7αHSDH。
为了测试抗性的丢失,将50个菌落划线接种到LBaparamycin培养基和LB-0培养基中。只在LB-0中生长的菌落不再携带aparmycin抗性。将菌落挑取到5mlLB中。将20mM的胆酸加入到5ml培养物中。在敲除型菌株中通过HPLC检测不到氧化产物7-酮-3,12-二羟胆烷酸(RT:7.5分钟)。然而,大肠杆菌BL21(DE3)清楚地显示了对胆酸(RT:13.5分钟)的7α-HSDH活性。因此成功敲除了7α-HSDH基因(参见图2)。
因此成功产生了不含7α-HSDH的菌株大肠杆菌BL21(DE3)Δ7αHSDH。
实施例2:使用大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH(1型)进行12α-HSDH的异源表达
pET28a(+)载体,Novagen,Darmstadt,其含有T7启动子和转录起点控制下的MCS和T7终止子用于12α-HSDH的表达。通过异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达。
为此,PCR扩增(也参见申请人的PCT/EP2009/002190)编码12α-HSDH(短的形式)的序列。使用梭菌属组P菌株48–50的基因组DNA作为模板和以下的引物对获得PCR产物:
(5’-GGTATTCCATATGATCTTTGACGGAAAGGTCGC-3’(SEQIDNO:5)和
5’-CGGGATCCCTAGGGGCGCTGACCC-3’)(SEQIDNO:6).
斜体核苷酸残基是多余的。粗体残基编码切割位点。其它残基是12α-HSDH的同源序列。
将PCR产物应用到琼脂糖凝胶上,将所述PCR产物分离并从琼脂糖凝胶切除。随后,借助于NdeI和BamHI限制酶切PCR产物并将其与同样用NdeI和BamHI切割的pET28a(+)载体连接。
随后,使用以下的引物通过Quick-Change除去N-末端的His-标签。对质粒进行测序和验证。
5’-GTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGATCTTTGACGGAAAGGTCGCAATCATT-3’(SEQIDNO:7)
5’-AATGATTGCGACCTTTCCGTCAAAGATCATGGTATATCTCCTTCTTAAAGTTAAAC-3’(SEQIDNO:8)
为了使用大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH研究表达,根据下面指出的方案产生化学感受态细胞。将pET28a+载体(Novagen,含有T7启动子和卡那霉素抗性)与12α-HSDH(不带His标签)一起转化到大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH中。
化学感受细胞的产生:
将1ml大肠杆菌过夜培养物接种于100mlLB培养基中。在37℃和180rpm下培养细胞,直到OD600为0.4-0.6。在冰上冷却细胞15分钟,并在4℃和4000rpm下离心细胞10分钟。除去上清液,将细胞重悬浮于40ml预冷的TfbI溶液(30mM乙酸钾、100mM氯化铷、10mM氯化钙、50mM氯化锰、15%的甘油)。在冰上温育15分钟后,将细胞离心。除去上清液。将细胞重悬浮于4ml预冷的TfbII溶液(10mMMOPS、75mM氯化钙、10mM氯化铷、15%甘油)。为了转化,将1μl质粒DNA加入到200μl的感受态细胞中,并在冰上温育混合物10分钟。在42℃进行细胞的热休克40秒。然后立即加入800μlLB培养基。在37℃和200rpm下培养细胞1小时。将转化的细胞离心,并除去上清液。将沉淀平板接种到LB琼脂平板上。在37℃温育平板以形成菌落。
将菌落挑取到5mlLB中。4小时后,用5ml预培养物接种50mlLB。在OD600值约0.8时,用0.5mMIPTG诱导细胞。在25℃和140rpm下培养细胞过夜。然后将细胞离心,再悬浮和消化。根据上文所指出的方法测定12α-HSDH的活性。12α-HSDH的产率是每升LB培养基约50kU。
实施例3:大肠杆菌7α-HSDH敲除突变体(大肠杆菌BL21(DE3)hdhA-KanR+)(2型)的产生(通过基因破坏敲除)
目标是使表达菌株大肠杆菌BL21(DE3)中干扰性7α-HSDH活性缺失。
使用下述的方法将抗生素抗性基因插入到7α-HSDH的靶基因中,借此关闭靶基因。
3.1来自大肠杆菌BL21(DE3)的7α-HSDH的序列信息
参见实施例1
3.2使用的引物
为关闭来自大肠杆菌BL21(DE3)的7α-HSDH,制备下列引物:
用于Ll.LtrB内含子再定向的引物,所述内含子用于“TargeTronTM基因敲除系统”(参见3.3节):
467|468a-IBS(SEQIDNO:17)
AAAAAAGCTTATAATTATCCTTATAGGACGTCATGGTGCGCCCAGATAGGGTG
467|468a-EBS1d(SEQIDNO:18)
CAGATTGTACAAATGTGGTGATAACAGATAAGTCGTCATGTTTAACTTACCTTTCTTTGT
467|468a-EBS2(SEQIDNO:19)
TGAACGCAAGTTTCTAATTTCGGTTTCCTATCGATAGAGGAAAGTGTCT
EBS通用(Universal):5’-CGAAATTAGAAACTTGCGTTCAGTAAAC
(根据用户手册来控制反应)
将重编的内含子插入到以下位点
定位
467|468aGCAGCTTTAGATGATGCATAGGAAGTCATG-内含子-TTTATATTTTTATTT
3.3敲除突变体的产生
借助于SigmaAldrich的TargeTronTM基因敲除系统根据制造商的说明产生敲除突变体。根据Qiagen公司的QIAquickPCR纯化试剂盒的TargeTronTM基因敲除系统的B.6步骤,利用TargeTronTM基因敲除系统纯化PCR产物。
如下进行连接(将HindIII/BsrGl消化的内含子PCR产物连接到线性化的pACD4K-C载体中):在16℃下,过夜进行反应。
20μl批次:
将5μl连接反应溶液加入到200μl的化学感受态的大肠杆菌BL21(DE3)细胞中,并在冰上温育20分钟。如Herstellerseite所述进行进一步的转化。
将转化批次平板接种到含有33μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上。挑取卡那霉素抗性的细胞,并且在每种情况下在几个晚上将所述细胞再接种到5mlLB过夜培养物(在每种情况下都具有5μl的卡那霉素溶液(33mg/ml))中。最终,用过夜培养物接种200mlLB培养物(含有200μl卡那霉素溶液(33mg/ml)),并在37℃和180rpm下在摇床培养箱中培养5小时。然后将温度提高到42℃保持1小时。用这种培养物接种5mlLB过夜培养物(在每种情况下都具有5μl的卡那霉素溶液(33mg/ml))。在37℃和180rpm下培养过夜后,将培养物划线接种到含有33μg/mL卡那霉素的LB琼脂平板上。在37℃培养过夜后,挑取菌落并将其划线接种到具有33μg/mL的卡那霉素和34μg/mL氯霉素的LB琼脂平板上。
在37℃培养过夜后,发现氯霉素敏感的突变体。这是确认可诱导敲除系统支持的质粒丢失所必需的,并且在成功敲除后,不再需要所述质粒。
只有在插入时,卡那霉素抗性是有活性的。pACD4K-C载体具有缺失。因此,在卡那霉素和氯霉素的培养物上均生长的菌落不仅极有可能含有所希望的敲除,而且额外地含有pACD4K-C载体。只有当菌株仅是卡那霉素抗性的,所述菌株不但丢失了pACD4K-C载体而且是所希望的敲除。
3.4敲除的检测
使用以下引物通过菌落PCR扩增7α-HSDH基因:
7α-ko-check_fwd(5‘–TTAATTGAGCTCCTGTACCCCACCACC–3’)SEQIDNO:20和
7α-ko-check_rev(5’–GTGTTTAATTCTGACAACCTGAGACTCGAC–3’)SEQIDNO:21.
形成的片段具有约2.5-3kb的长度,并且使用7α-ko-check_fwd引物对所述片段测序。基于测序,可以检测到:来自pACD4K载体的插入片段使7α-HSDH的DNA序列中断,导致了7α-HSDH的敲除。(测序数据未显示)
3.5用KO菌株表达12α-和7β-HSDH突变体
例如,通过以摇瓶规模酶表达12α和7β-HSDH突变体验证了这种敲除菌株的可用性(结果未显示)。
实施例4:由7β-HSDH、FHDD221G和3α-HSDH((其在每种情况下都使用敲除菌株大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH(1型)产生))进行的DHCA到12-酮-UDCA的酶促反应
在这个实施例中,将使用特别的FDH突变体研究DHCA到12-酮-UDCA的两阶段酶促反应,其同时伴随着辅因子再生。因为使用的FDH突变体D221G均接受NADP+以及NAD+作为辅因子,所以不必将额外的辅因子再生系统引入到NADH依赖的3α-HSDH的反应批次中。
作为实例,通过下图显示的两部分反应阐述了该反应。FDH*指示D221G突变体。
为了这个目的,在敲除菌株大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH(1型)中彼此分开地制备来自产气柯林斯菌的7β-HSDH、来自睾丸酮丛毛单胞菌和来源于FDH(来自母牛分枝杆菌)的FDHD221G突变体的3α-HSDH,所述敲除菌株大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH根据上文实施例1制备,表达并用于反应。
4.1使用的质粒
用于表达7β-HSDH,3α-HSDH和FDHD221G的质粒:
pET28a(+)-7β-HSDH,
pET22b(+)-3α-HSDH和
pET21a(+)-FDH-D221G。
4.2细菌菌株及培养条件:
在37℃在含有必需的抗生素的LB培养基中培养根据实施例1产生的敲除菌株大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH(1型)。用0.5mMIPTG诱导,达到OD600=0.8后,在25℃在140rpm继续培养12小时。
4.3酶的过表达和纯化
在以下条件下进行7β-HSDH、3α-HSDH和FDHD221G突变体在大肠杆菌BL21(DE3)Δ7α-HSDH中的过表达和酶纯化:
用表达构建体转化大肠杆菌敲除菌株。为此,在含有30μg/ml卡那霉素的LB培养基中繁殖(2组,每组在2升摇瓶中有400ml)含有表达构建体的菌株。
通过离心(10000×g,15分钟,4℃)收获细胞。将沉淀重悬浮于20ml的磷酸盐缓冲液(pH8,50mM,含有0.1mMPMSF)中。在持续冷却的情况下通过使用超声波仪250超声装置(Branson,德国)进行一分钟的超声波处理(40W功率,40%的工作间隔和1分钟的中断)来消化细胞。消化重复三次。将细胞提取物离心(22000×g,20分钟,4℃)。最终,将样品转移到新管中,并储存在-20℃下以用于进一步分析。根据制造商的说明使用BCA试剂盒(Thermo,USA)测定蛋白质浓度。此外,通过12.5%浓度的SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色分析样品。借助于ScionImageBeta4.0.2(Scion,USA)通过光密度测定蛋白质的纯度。7β-HSDH,3α-HSDH及FDH的细胞提取物是粗提物。因为已经敲除7α-HSDH,所以进一步的纯化是多余的。
每升培养基(摇瓶的OD600约为6)的产率如下:
7β-HSDH:3883U(对于DHCA和NADPH)
3α-HSDH:6853U(对于DHCA和NADH)
FDH突变体:47U(对于甲酸钠和NAD+)。
通过SDS-PAGE和光密度扫描(通过ScieonImageBeta4.0.2(Scieon,USA))测定蛋白质的含量和纯度。
4.4制备规模上酶促合成12-酮-UDCA
在24℃搅拌800ml的反应批次,其含有7β-HSDH(2.4Uxml-1)、3α-HSDH(2.4Uxml-1)、FDHD221G(0.325Uxml-1)、NADP+(10μM)、NAD+(10μM)、甲酸钠(250mM)、DHCA(10mM,3.2g)和磷酸钾缓冲液(pH6,50mM)。以细胞粗提物(无需额外的纯化步骤)使用在这个实验中所使用的全部三种酶。12小时后,通过使用具有10kDa孔径的膜(Millipore,美国)超滤除去酶来停止反应。通过用盐酸将滤液中的产物酸化至pH2和随后的滤纸过滤来纯化所述产物。在60℃干燥产物过夜后,获得2.9克所希望的产物。
通过HPLC和NMR分析产物
分析的数据(部分):
1HNMR(氘化的DMSO,500MHz)δ=3.92(2H,m,H-3α和H-7β)和
1H-NMR(氘化的DMSO,125MHz)δ=69.38(CH,3-C);δ=69.09(CH,7-C);δ==213.86(C,12-C)
产率:90.6%
纯度:99%
SEQIDNOs的分配:
AA=氨基酸序列
NA=核酸序列
L=长形式
K=短形式
明确参考本文引用的出版物的公开内容。
Claims (25)
1.埃希氏菌属的重组微生物,其中抑制了7α-羟类固醇脱氢酶(7α-HSDH)的酶活性,同时可表达地含有功能不同的羟类固醇脱氢酶的酶活性,其中通过同源重组或者通过基因破坏敲除编码7α-HSDH的核酸序列,其中所述功能不同的羟类固醇脱氢酶为3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH。
2.根据权利要求1要求保护的重组微生物,其中所述功能不同的羟类固醇脱氢酶为3α-、7β-或12α-HSDH。
3.根据权利要求1要求保护的重组微生物,其中所述基因破坏通过插入抑制编码的基因产物的酶功能的核酸序列实现。
4.根据权利要求1-3任一项要求保护的重组微生物,其来源于表达7α-HSDH的前体微生物。
5.根据权利要求1-3任一项要求保护的重组微生物,其来源于内源表达7α-HSDH的前体微生物。
6.根据权利要求1-3任一项要求保护的重组微生物,其来源于大肠杆菌。
7.根据权利要求1-3任一项要求保护的重组微生物,其重组表达在功能上不同于7α-HSDH的HSDH。
8.根据权利要求7的要求保护的重组微生物,其中所述在功能上不同于7α-HSDH的HSDH是3α-、7β-和/或12α-HSDH。
9.根据权利要求1-3任一项要求保护的重组微生物,其中所述被敲除的7α-HSDH具有根据SEQIDNO:10的氨基酸序列或者由根据SEQIDNO:9的核酸序列编码。
10.根据权利要求1-3任一项要求保护的重组微生物,其中所述表达的功能上不同于7α-HSDH的HSDH含有以下的氨基酸序列的一个:
a)3α-HSDH序列,其选自SEQIDNO:29和31
b)7β-HSDH序列,其选自SEQIDNO:25
或
c)12α-HSDH序列,其选自SEQIDNO:12,14,16。
11.用于重组产生功能上不同于7α-HSDH的所希望的HSDH的方法,其中在表达所希望的HSDH的条件下培养7α-HSDH酶活性受抑制的权利要求1-10任一项要求保护的重组微生物,并且分离由此表达的HSDH,其中在所述分离的HSDH中检测不到功能性的7α-HSDH。
12.选择性地酶促氧化羟类固醇的方法,所述羟类固醇除了在类固醇结构的3α-、3β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-位的至少一个含有羟基外,还在类固醇结构的7α-位上含有至少一个另外的羟基,其中在3α-、3β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH的存在下,或者在权利要求1至10的一个要求保护的重组微生物的存在下,羟类固醇被反应,并且任选地从反应批次分离所形成的至少一种氧化产物。
13.根据权利要求12要求保护的方法,其中所述羟类固醇除了在类固醇结构的12α-位上含有羟基外,还在类固醇结构的7α-位上含有至少一个另外的羟基。
14.根据权利要求12要求保护的方法,其中在可从权利要求1至10的一个要求保护的重组微生物获得的12α-HSDH的存在下,羟类固醇被反应。
15.根据权利要求12要求保护的方法,其中所述羟类固醇是胆酸(CA)。
16.根据权利要求15要求保护的方法,其中所述CA反应产生12-酮鹅去氧胆酸(12-酮-CDCA)。
17.用于产生通式(1)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法
其中
R代表烷基、NR1R2、H、碱金属离子或者N(R3)4 +,其中R3基是相同的或者不同的,并且代表H或烷基,
其中
a)在可从权利要求1至10的一个要求保护的重组微生物获得的12α-HSDH的存在下,或者在权利要求1至10的一个要求保护的重组微生物的存在下,通式(2)的胆酸(CA)被氧化成相应的通式(3)的12-酮鹅去氧胆酸(12-酮-CDCA)
在所述通式(2)中,R具有上文所指示的含义,且Ra基是相同的或者不同的,并且代表H或酰基,
在所述通式(3)中R和Ra具有上文所指示的含义,并且随后
b)所述通式(3)的12-酮-CDCA通过脱氧反应产生通式(4)的鹅去氧胆酸(CDCA)
在所述通式(4)中,R和Ra具有上文所指示的含义,和
c)将所述通式(4)的CDCA在第7位化学氧化生成通式(5)的7-酮石胆酸(KLCA)
在所述通式(5)中,R和Ra具有上文所指示的含义,和
d)将所述通式(5)的KLCA还原,和
e)任选地进一步纯化反应产物。
18.选择性地酶促还原酮类固醇的方法,所述酮类固醇除了在类固醇结构的3、11、12、17或20位上具有至少一个酮基外,还在类固醇结构的7位上具有至少一个另外的酮基,其中在3α-、3β-、7β-、11α-、11β-、12α-、12β-、17α-、17β-、20α-或20β-HSDH的存在下,或者在权利要求1至10的一个要求保护的重组微生物的存在下,酮类固醇被反应,并且任选地从反应批次分离所形成的至少一种还原产物。
19.根据权利要求18要求保护的方法,其中所述酮类固醇除了在类固醇结构的12位和/或3位上具有至少一个酮基外,还在类固醇结构的7位上具有至少一个另外的酮基。
20.根据权利要求18要求保护的方法,其中在可从权利要求1至10的一个要求保护的重组微生物获得的7β-HSDH和/或3α-HSDH和/或12α-HSDH的存在下,酮类固醇被反应。
21.根据权利要求12至18任一项要求保护的方法,其中所述催化所希望的反应的至少一种HSDH以溶解的、分散的或者固定化形式使用;或者其中所述方法在权利要求1至10的一个要求保护的重组微生物的全细胞,任选地固定化细胞的存在下进行。
22.根据权利要求21的方法,其中所述至少一种HSDH是7β-HSDH、3α-HSDH和/或12α-HSDH。
23.产生通式(1)的熊去氧胆酸(UDCA)的方法
在所述通式(1)中
R代表烷基、NR1R2、H、碱金属离子或者N(R3)4 +,其中R3基是相同的或者不同的,并且代表H或烷基,其中
a)任选将通式(2)的胆酸(CA)化学氧化成通式(3)的去氢胆酸(DHCA),
在所述通式(2)中R具有上文所指示的含义,
在所述通式(3)中R具有上文所指示的含义;
b)以任一所希望的顺序用可从权利要求1至10的一个要求保护的重组微生物获得的7β-HSDH和3α-HSDH或者在两种酶同时存在的情况下将DHCA还原成相应的通式(5)的12-酮熊去氧胆酸(12-酮UDCA)
在所述通式(5)中R具有上文所指示的含义,并且随后
d)将所述通式(5)的12-酮UDCA化学还原成UDCA;和
e)任选地进一步纯化反应产物。
24.根据权利要求12至20和23任一项要求保护的方法,其中将所述酶促氧化还原步骤与辅因子再生步骤偶联。
25.根据权利要求24的方法,其中所述辅因子再生步骤是酶促辅因子再生步骤。
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