KR102097397B1 - 돼지 장내균총 비피도박테리움 써모필룸 유래 담즙염분해효소를 이용한 우르소데스옥시콜린산 합성방법 - Google Patents

돼지 장내균총 비피도박테리움 써모필룸 유래 담즙염분해효소를 이용한 우르소데스옥시콜린산 합성방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 장내균총인 비피도박테리움 써모필룸(Bifidobacterium thermophilum)에서 유래한 담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)를 이용하여 돼지 담즙산으로부터 우르소데스옥시콜린산(ursodesoxycholic acid; UDCA)을 합성하는 방법에 관한 것으로써, 본 발명자들은 돼지 장내균총인 Bifidobacterium thermophilum의 담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)를 사용한 UDCA 합성 방법이 반복적인 정제과정을 거치는 기존의 합성방법 보다 간편하고, 시간적인 이점과 함께 대량 생산 및 안정성 문제에 있어서 큰 이점이 있으며, 훨씬 경제적이면서 UDCA의 취득 수율을 높일 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 무엇보다도 폐기 부산물인 돼지 부산물을 활용하여 간 기능 개선, 간 개선을 통한 피로회복, 콜레스테롤 감소, 담성용해, 원발담즙성간경화증 등의 효과가 있는 고부가가치 UDCA를 제공한다는 점에서 경제적인 이점이 클 것으로 기대된다.

Description

돼지 장내균총 비피도박테리움 써모필룸 유래 담즙염분해효소를 이용한 우르소데스옥시콜린산 합성방법{A method of synthesis of ursodesoxycholic acid(UDCA) using bile salt hydrolase(BSH) from Porcine intestinal flora Bifidobacterium thermophilum}
본 발명은 돼지 장내균총인 비피도박테리움 써모필룸(Bifidobacterium thermophilum)에서 유래한 담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)를 이용하여 돼지 담즙산으로부터 우르소데스옥시콜린산(ursodesoxycholic acid; UDCA)을 합성하는 방법에 관한 것이다.
우르소데스옥시콜린산(ursodesoxycholic acid; UDCA)는 Actigall, Urso로 불리기도 하며, 간에서 콜레스테롤로부터 대사에 의해 생성된 일차 담즙산이 장내에서 미생물에 의해 생성된 2차 담즙산이다. 이렇게 생성된 2차 담즙산은 친수성을 띄어 PXR(Pregnane X receptor) 및 VDR(Vitamin D receptor)과 결합 및 활성화 되는데, 이 두 수용체는 소수성이 강한 담즙산, 약물, 및 이물질의 회복에 중요한 역할을 한다. 이러한 효과로 UDCA는 담즙산 중 미국 식품의약국(FDA)에서 승인을 받은 의약품이다. UDCA는 1902년에 처음 북극곰 답즙에서 처음 발견되었고 1954년 경제적으로 효율적인 합성법이 발견되었다. 이 방법은 담즙산을 대량으로 얻을 수 있는 소에서 콜산(cholic acid; CA)에서 캐노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid; CDCA)를 생성한 후 산화·환원반응을 통해 UDCA를 합성하는 방법이다. 이 합성법은 많은 제약 회사에서 이용되고 있지만 CA에서 CDCA를 생성한 후 UDCA를 합성하기 때문에 많은 시간이 소요된다. 그리고 산화·환원반응에 따라 UDCA와 CDCA의 생성 비율이 다르기 때문에 반복적인 정제과정을 필요로 하는 단점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 산화·환원반응을 특이적으로 할 수 있는 미생물에서 효소를 추출하여 합성하는 방법도 있다. 하지만, 연구에서 사용된 대부분의 미생물들이 유해균이라는 단점이 있으므로 장내 미생물들에서의 연구가 필요한 실정이다. 또한 다른 담즙산에서 UDCA 추출이 연구되고 있지만 CA와 CDCA에 비해 담즙 중 적은량을 차지하기 때문에 UDCA 추출만으로는 상업화하기에 어려운 단점이 있다.
한편, 돼지 도체 중 내장은 횡경막을 중심으로 상단부에 위치하는 심장, 허파 및 간과 같은 장기인 적내장과 하단부위에 있는 위, 소장, 대장과 같은 소화기관인 백내장으로 구분된다. 돼지 적내장의 경우에는 대부분 순대 또는 순대국으로 소비되고 있고, 간의 경우에는 헤파린과 같은 소재가 추출되고 있으나 소량에 불과하다. 돼지 백내장 중 소장의 경우 외국에서는 내부의 점막물질을 기계적으로 제거한 후 주로 소시지의 케이싱원료로 사용하나 우리나라에서는 대부분 순대의 껍질로 이용되고 있다. 대장의 소비는 주로 곱창볶음 또는 순대국의 재료로 사용되고 있으며 특유의 냄새를 제거하기 위해 강한 양념류와 함께 섭취하는 것이 일반적이다. 순대 또는 소시지 케이싱으로 일부 사용되는 돼지 소장에 비해, 돼지 대장의 경우는 케이싱 용도로 가공이 이루어지지 못하고 있을 뿐 아니라, 자체 이취 발생은 물론 질긴 조직감으로 인해 식품으로의 가치가 매우 떨어져 소비가 열악한 형편이어서 생산량의 약 20~30% 가량만이 도축장 판매 기준 400원/kg의 낮은 가격으로 유통되는 한편, 나머지 70~80%는 비용(약 5만원/톤)을 발생업체인 도축장에서 부담하여 폐기되고 있는 실정이다. 국외의 경우 중국, 태국, 말레이시아, 필리핀 등 동남아시아 국가에서는 전통적으로 돼지 내장류를 이용한 식품이 대중적인 인기를 얻고 있으나, 단순 식품 섭취 소비에 불과하고, 현지에서 생산 판매 되고 있는 돼지 내장류 관련 제품의 품질 및 기호성은 매우 열악한 수준이므로 이를 개선한 고품질 돼지 내장류 가공제품의 개발이 필요한 실정이다. 유럽지역에서도 돼지 또는 소의 내장류를 전통적으로 섭취는 해왔지만 소시지와 햄류를 제외하고 다른 소비 형태는 나타나지 않고 우리나라와 마찬가지로 많은 양의 돼지 도축 부산물이 잉여 및 폐기되고 있는 상황이며, 돼지 도축 부산물은 농림축산식품부 조사에 따르면 백내장 기준으로 2009년 61,100톤, 2010년 64,200톤, 2011년 48,300톤, 2012년 62,900톤, 2013년 71,800톤, 2014년 70,200톤으로 매년 많은 양이 생산되고 있다. 돼지 도축 부산물의 소비가 이루어지지 않아 많은 양이 폐기되고 있는 상황에서도 부산물의 수입량은 줄지 않고 있다. 한국육류유통수출협회에 따르면 2013년 소 5만 8593톤, 돼지 11만 2584톤으로 총 17만 1177톤이 수입됐고, 지난해 역시 11월까지 소 5만 1839톤, 돼지 12만 9335톤으로 총 18만 1174톤이 수입된 것으로 조사됐다. 이러한 이유는 국내에서 생산되는 도축 부산물을 처리 및 가공하는 비용보다 외국에서 수입하는 부산물의 가격이 더 낮기 때문이다. 이와 같은 상황이 지속되면서 도축비용과 관련한 제반비용을 부산물 판매비로 충당하던 축산농가의 어려움은 커지고 있으며, 유통업계 역시 재고 누적으로 보관비를 더욱 걱정해야 하는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 UDCA를 합성할 수 있는 다른 원료를 모색하다 잉여 및 페기되고 있는 돼지 도축 부산물으로부터 유래 담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)를 이용한 UDCA를 합성하는 방법을 발명함으로서, 폐기 자원을 활용한 고부가 가치 상품을 생산하여 축산 농가의 새로운 시장 개척을 활성화 시키고자 하였다.
대한민국 등록특허공보 10-1812366
본 발명자들은 현재 많은 양의 돼지 도축 부산물이 잉여 및 폐기되고 있는 상황에서 이를 활용하여 고부가가치 유용 물질인 우르소데스옥시콜린산(ursodesoxycholic acid; UDCA)를 합성하는 방법에 대해 개발함으로써 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명은 (a) 돼지 부산물로부터 돼지 담즙산을 추출하는 단계; (b) 상기 돼지 담즙산에 돼지 장내균총 비피도박테리움 써모필룸(Bifidobacterium thermophilum) 유래 담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)를 첨가하여 캐노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid; CDCA)을 추출하는 단계; 및 (c) 상기 CDCA를 산화환원 반응시켜 UDCA를 합성하는 단계를 포함하는 UDCA의 합성방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 돼지 부산물로부터 돼지 담즙산을 추출하는 단계; (b) 상기 돼지 담즙산에 돼지 장내균총 비피도박테리움 써모필룸(Bifidobacterium thermophilum) 유래 담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)를 첨가하여 캐노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid; CDCA)을 추출하는 단계; 및 (c) 상기 CDCA를 산화환원 반응시켜 우르소데스옥시콜린산(ursodesoxycholic acid; UDCA)를 합성하는 단계를 포함하는 UDCA의 합성방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예로, 상기 돼지 부산물은 돼지의 간, 위, 소장, 및 대장으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명은 다른 구현예로, 상기 BSH는 형질전환(transformation)되어 있는 BL21 콜로니를 배양하여 얻어질 수 있다.
본 발명은 또 다른 구현예로, 상기 (a) 단계는 상기 돼지 부산물에 에탄올을 첨가하는 단계; 균질기(Homogenizer)를 이용하여 균질화하는 단계; 필터 페이퍼를 이용하여 여과하는 단계; 석유 에테르(petroleum ether)를 첨가하여 지방질을 제거하는 단계; 및 메탄올을 첨가하여 돼지 담즙산을 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 구현예로, 상기 (b) 단계는 상기 돼지 담즙산에 상기 BSH를 첨가하여 가수분해시키는 단계; 염화칼슘(CaCl2)를 첨가하여 CDCA 칼슘 염(CDCA calcium salt) 침전물을 형성시키는 단계; 상기 CDCA 칼슘 염 침전물에 프로피온산(propionic acid)을 첨가하는 단계; 및 물을 첨가하여 CDCA를 추출하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 구현예로, 상기 (c) 단계는 CDCA에 N-브로모숙신이미드(N-bromosuccinimide)를 첨가하여 산화시키는 단계; 나트륨 금속(sodium metal)를 첨가하여 환원시키는 단계; 디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF)와 비스(트리메틸실릴)아민(bis(trimethylsilyl)amine; HMDS)을 첨가하는 단계; 및 염산(HCl)을 첨가하여 UDCA를 합성하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명자들은 돼지 장내균총인 비피도박테리움 써모필룸(Bifidobacterium thermophilum)의 담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)를 사용한 UDCA 합성 방법이 반복적인 정제과정을 거치는 기존의 합성방법 보다 간편하고, 시간적인 이점과 함께 대량 생산 및 안정성 문제에 있어서 큰 이점이 있으며, 훨씬 경제적이면서 UDCA의 취득 수율을 높일 수 있다는 것을 확인하였다. 또한, 무엇보다도 폐기 부산물인 돼지 부산물을 활용하여 간 기능 개선, 간 개선을 통한 피로회복, 콜레스테롤 감소, 담성용해, 원발담즙성간경화증 등의 효과가 있는 고부가가치 UDCA를 제공한다는 점에서 경제적인 이점이 클 것으로 기대된다.
도 1은 돼지 장내균총 비피도박테리움 써모필룸(Bifidobacterium thermophilum) 유래 담즙염분해효소를 이용한 우르소데스옥시콜린산(ursodesoxycholic acid; UDCA) 합성 및 분석과정을 5단계로 분류하여 나타낸 도면이다.
도 2는 UDCA 합성과 분석을 위해 돼지 부산물을 처리하는 과정을 순서대로 나타낸 도면이다.
도 3은 돼지 부산물에서 유래한 담즙산을 추출하는 과정을 순서대로 나타낸 도면이다.
도 4는 돼지 장내균총 Bifidobacterium thermophilum 유래 담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)를 추출하는 과정을 순서대로 나타낸 도면이다.
도 5는 캐노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid; CDCA)을 추출하는 과정을 순서대로 나타낸 도면이다.
도 6은 UDCA를 합성하는 과정을 순서대로 나타낸 도면이다.
도 7은 돼지에 많은 비율을 차지하는 Bifidobacterium thermophilum과 소에 많은 비율을 차지하는 Bifidobacterium boum의 CDCA 추출수율을 확인한 도이다.
도 8은 닭과 오리와의 CDCA 추출수율과 돼지의 CDCA 추출수율을 확인한 도이다.
본 발명자들은 돼지 장내균총인 비피도박테리움 써모필룸(Bifidobacterium thermophilum)의 담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)를 사용한 UDCA 합성 방법이 반복적인 정제과정을 거치는 기존의 합성방법 보다 간편하고, 시간적인 이점과 함께 대량 생산 및 안정성 문제에 있어서 큰 이점이 있으며, 훨씬 경제적이면서 UDCA의 취득 수율을 높일 수 있다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 자세히 설명한다.
본 발명의 일 실시예에서는 UDCA를 합성하기 위해 돼지 부산물을 처리하는 과정을 나타내었다(실시예 1 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는 도 1에 따른 제조방법에 따라 UDCA를 합성하였다(실시예 2 내지 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 표 1에 따른 조건에 따라 고성능액체크로마토그래피(HPLC)를 이용하여, 합성한 UDCA를 분석하였다(실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는 돼지로부터 UDCA 합성 비율이 다른 축종에 비해 높다는 것을 확인하기 위해, 소, 닭, 오리의 CDCA 추출 수율과 비교한 결과, 돼지의 추출 효율이 가장 높다는 것을 확인하였다(실시예 7 참조).
따라서, 본 발명은 (a) 돼지 부산물로부터 돼지 담즙산을 추출하는 단계; (b) 상기 돼지 담즙산에 돼지 장내균총 Bifidobacterium thermophilum 유래 BSH를 첨가하여 캐노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid; CDCA)을 추출하는 단계; 및 (c) 상기 CDCA를 산화환원 반응시켜 UDCA를 합성하는 단계를 포함하는 UDCA의 합성방법을 제공한다.
상기 (a) 단계는 상기 돼지 부산물에 에탄올을 첨가하는 단계; 균질기(Homogenizer)를 이용하여 균질화하는 단계; 필터 페이퍼를 이용하여 여과하는 단계; 석유 에테르(petroleum ether)를 첨가하여 지방질을 제거하는 단계; 및 메탄올을 첨가하여 돼지 담즙산을 추출하는 단계를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 상기 돼지 부산물은 돼지의 간, 위, 소장, 및 대장으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계는 상기 돼지 담즙산에 상기 BSH를 첨가하여 가수분해시키는 단계; 염화칼슘(CaCl2)를 첨가하여 CDCA 칼슘 염(CDCA calcium salt) 침전물을 형성시키는 단계; 상기 CDCA 칼슘 염 침전물에 프로피온산(propionic acid)을 첨가하는 단계; 및 물을 첨가하여 CDCA를 추출하는 단계를 포함할 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어 '비피도박테리움 써모필룸(Bifidobacterium thermophilum)'란 BSH를 생성하는 균총이며 돼지 장내에 가장 많은 비율을 차지하고 있는 균으로 Bifidobacterium thermophilum 을 이용한 경우에 CDCA 추출이 다른 균에 비해 많이 추출된다.
본 발명에 사용되는 용어 '담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)'란 BSH 활성으로 인하여 건강-보호 효과(health-protective effects)(예를 들면, 콜레스테롤 감소, 담즙 내성, 항균 활성 등)로 인해 기능적 프로 바이오틱 바이오 마커로 간주되며, 또한, BSH 활성은 미생물 담즙 내성, 위장(gastrointestinal tract; GIT)의 콜로니, 숙주 신진 대사, 및 에너지 수확에 기여할 수 있고, 바람직하게는 형질전환(transformation)되어 있는 BL21 콜로니를 배양하여 얻을 수 있으나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어 '캐노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid; CDCA)'이란 간에 의해 생성되는 주요 담즙산 중 하나로써, 물에 녹지 않지만 알코올 및 아세트산에 용해되는 백색 결정성 물질로서 발생하며 융점은 165-167 ℃이다. 이 CDCA의 염을 캐노데옥시콜레이트(chenodeoxycholates)라고 한다.
상기 (c) 단계는 N-브로모숙신이미드(N-bromosuccinimide)를 첨가하여 산화시키는 단계; 나트륨 금속(sodium metal)를 첨가하여 환원시키는 단계; 디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF)와 비스(트리메틸실릴)아민(bis(trimethylsilyl)amine; HMDS)을 첨가하는 단계; 및 염산(HCl)을 첨가하여 UDCA를 합성하는 단계를 포함하나 이에 제한되지 않는다.
본 발명에 사용되는 용어 'BL21'이란 대장균(Escherichia coli)의　수용성 세포(competent cells) 중 하나의　균주 번호(strain number)이나 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. UDCA 합성과 분석을 위한 부산물 처리
UDCA 합성과 분석을 위한 시료는 국내에서 정상 유통되고 있는 당일 도축된 일반적인 돼지 도축 부산물을 사용하였다. 돼지 도축 부산물은 돼지의 간, 위, 소장, 대장, 담낭을 사용하였으며 도축장에서 받아온 부산물을 부위별로 분할 과정을 실시하였고, 부위별로 세척 과정을 실시하였다. 이 때, 처리하는 장소의 온도를 10℃ 내외로 유지하였고, 세척 과정을 마친 부산물은 부위별로 갈아 소분하여 냉동 저장하였다. 상기 과정은 도 2에 순서대로 나타내었다.
실시예 2. 돼지 부산물로부터 돼지 담즙산 추출
담낭을 제외한 간, 위, 소장, 대장의 경우 담즙산을 먼저 추출하였다. 20g에 75ml의 메탄올을 첨가한 후 균질기(homogenizer)를 이용하여 1000rpm으로 3분간 균질화 한 후 필터페이퍼(Whatman No.1)을 이용하여 여과 후 석유 에테르(petroleum ether)를 첨가하여 지방질을 제거 하였다. 지방질이 제거된 분쇄액을 메탄올을 첨가하여 담즙산 성분을 추출하였다. 추출된 담즙산을 적당한 농도로 40℃로 감압농축한 후 건조하여 담즙산 분말을 얻었다. 상기 과정은 도 3에 순서대로 나타내었다.
실시예 3. BSH의 발현 및 정제
형질전환(Transformation) 되어 있는 BL21 콜로니(colony)를 배양하고, IPTG를 첨가하였다. 그 후, 세척(washing)을 통해 효소가 포함되어 있는 플라스미드(plasmid)를 분리한 다음, 초음파 처리(sonication)를 통하여 플라스미드에서 효소를 분리하고, Ni-NTA 컬럼(column)을 통해 정제된 BSH를 얻었다. 상기 과정은 도 4에 순서대로 나타내었다.
실시예 4. CDCA 추출
담즙산 5ml에 BSH에 50ml 첨가하여 37°C에서 30분 가수분해 시켜준 후 5% CaCl2 10ml을 추가하면 CDCA 칼슘 염(calcium salt)인 침전물이 형성되었고 50% 프로피온산(propionic acid) 30ml를 추가하여 45℃에서 침전물을 녹여 준 후 물을 첨가하면 침전물인 CDCA를 얻을 수 있었다. 상기 과정은 도 5에 순서대로 나타내었다.
실시예 5. UDCA 합성 및 정제
CDCA에 3% N-브로모숙신이미드(N-bromosuccinimide)를 10ml 첨가하여 냉장 상태로 10시간 산화를 시켜주면 7-리토콜산(7-lithocholic acid)을 얻을 수 있었다. 7-리토콜산에 부탄올(butanol)을 넣고 60℃에서 2시간 반응시켜준 후 나트륨 금속(sodium metal)을 넣어 환원시켜주면 CDCA와 UDCA의 혼합물이 생성되었다. 0.1g의 CDCA와 UDCA의 혼합물에 1ml 디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF)와 비스(트리메틸실릴)아민(bis(trimethylsilyl)amine; HMDS)를 넣고 60℃에서 250rpm으로 반응 시켰다. 0℃에서 12시간 방치하였고 12시간 후 생성된 결정화 물질을 상온에서 건조하였다. 8% HCl을 넣고 50℃에서 2시간 반응시켜 UDCA를 획득하였다. 상기 과정은 도 6에 순서대로 나타내었다.
실시예 6. 고성능액체크로마토그래피(High performance liquid chromatography; HPLC)를 통한 UDCA 분석
각각의 부산물(간, 위, 소장, 대장, 담낭)로부터 합성한 UDCA를 메탄올에 녹여 0.45μm syringe filter를 한 후 유리병(vial)에 회수하여 HPLC 분석을 실시하였다. 이때 HPLC 조건은 하기 표 1과 같다.
Items Conditions
Instrument Agilent 1100 HPLC
Column C18 (150*4.6mm id, 5um)
Injection Volume 10uL
Mobile A
Mobile B		 30% Phosphate acid buffer (pH3)
70% ACN
Flow 1.0 min/ml
Detector UV detector (208nm)
Temperature 30 ℃
Time 15 min
실시예 7. 여러 축종에서의 CDCA 추출 비교
실시예 7-1. 축종 별 유래된 미생물의 BSH효소를 이용하여 돼지 담즙산에서의 CDCA추출
돼지에 많은 비율을 차지하는 B.thermophilum과 소에 많은 비율을 차지하는 비피도박테리움 붐(Bifidobacterium boum)에서 BSH 효소를 이용하여 돼지 담즙산에서 CDCA를 추출하였다. 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이 돼지 장내균에서 유래된 BSH가 돼지 담즙산에서 더 높은 CDCA의 추출수율을 보였다.
실시예 7-2. 여러 축종에서의 CDCA 추출
소의 경우 담낭의 이용률이 높아 경제성이 뛰어나지 않아 제외하였고 돼지다음으로 많이 도축이 되고 있는 닭과 오리의 담낭에서 실험을 진행하였다. 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이 닭과 오리에서의 CDCA 추출수율은 본 실험 방법으로 진행할 시 돼지에서 보다 낮은 수율을 보였다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다름 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 아닌 것으로 이해해야 한다.

Claims (6)

  1. (a) 돼지 부산물로부터 돼지 담즙산을 추출하는 단계;
    (b) 상기 돼지 담즙산에 돼지 장내균총 비피도박테리움 써모필룸(Bifidobacterium thermophilum) 유래의 담즙염분해효소(bile salt hydrolase; BSH)를 발현하는 형질전환체로부터 분리한 담즙염분해효소를 첨가하여 캐노데옥시콜산(chenodeoxycholic acid; CDCA)을 추출하는 단계; 및
    (c) 상기 CDCA를 산화환원 반응시켜 우르소데스옥시콜린산(ursodesoxycholic acid; UDCA)를 합성하는 단계를 포함하는 UDCA의 합성방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 돼지 부산물은 돼지의 간, 위, 소장, 및 대장으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는, 합성방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 BSH는 형질전환(transformation)되어 있는 BL21 콜로니를 배양하여 얻어지는 것을 특징으로 하는, 합성방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (a) 단계는,
    상기 돼지 부산물에 에탄올을 첨가하는 단계;
    균질기(Homogenizer)를 이용하여 균질화하는 단계;
    필터 페이퍼를 이용하여 여과하는 단계;
    석유 에테르(petroleum ether)를 첨가하여 지방질을 제거하는 단계; 및
    메탄올을 첨가하여 돼지 담즙산을 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 합성방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (b) 단계는,
    상기 돼지 담즙산에 상기 BSH를 첨가하여 가수분해시키는 단계;
    염화칼슘(CaCl2)를 첨가하여 CDCA 칼슘 염(CDCA calcium salt) 침전물을 형성시키는 단계;
    상기 CDCA 칼슘 염 침전물에 프로피온산(propionic acid)을 첨가하는 단계; 및
    물을 첨가하여 CDCA를 추출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 합성방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 (c) 단계는,
    CDCA에 N-브로모숙신이미드(N-bromosuccinimide)를 첨가하여 산화시키는 단계;
    나트륨 금속(sodium metal)를 첨가하여 환원시키는 단계;
    디메틸포름아미드(dimethylformamide; DMF)와 비스(트리메틸실릴)아민(bis(trimethylsilyl)amine; HMDS)을 첨가하는 단계; 및
    염산(HCl)을 첨가하여 UDCA를 합성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 합성방법.


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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN101215308A (zh) * 2007-01-04 2008-07-09 苏州天绿生物制药有限公司 一种以猪胆为原料生产熊去氧胆酸的方法
CN101215310A (zh) * 2008-01-10 2008-07-09 辽宁百隆生物工程有限公司 用含量为98.0%牛羊胆酸生产熊去氧胆酸的生产方法
KR101812366B1 (ko) 2010-05-27 2017-12-26 파마젤 게엠베하 신규 7α-히드록시스테로이드 데히드로게나제 녹아웃 돌연변이체 및 그의 용도

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