CN114634962B - 一种鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于蛋白肽制备领域，涉及一种鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，包括：将鲍鱼内脏用饱和盐水进行预处理，将预处理鲍鱼内脏加入水后粉碎，加入由胰酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶与烷基硫醇按照质量比1:(0.1～0.2):(2～5):(0.5～1.5):(0.01～0.1)组成的复合酶Ⅰ进行第一次酶解，加入由木瓜蛋白酶、羧肽酶以及钠盐按照质量比1:(0.05～0.2):(0.01～0.1)组成的复合酶Ⅱ进行第二次酶解，往所得酶解液中加入絮凝剂进行含有海藻酸盐、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝的絮凝剂进行絮凝沉淀，固液分离即可。本发明提供的方法能够提高鲍鱼内脏蛋白肽的收率和纯度，极具工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于蛋白肽制备领域，具体涉及一种鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法。
背景技术
蛋白质是复杂的生物大分子，可以为有机体的新陈代谢提供必须的氨基酸成分，保证有机体的成长并维持生命活性的能量。在蛋白质分子中，氨基酸按照一定的排列顺序通过相互连接氨基酸序列，经“分子伴侣”和折叠酶的协助使得蛋白折叠、盘曲构成稳定的空间多维结构。蛋白质除了拥有乳化功能、组织化作用、凝胶作用等自身的功能性质以外，还可以被人体摄入后进入胃肠道消化吸收。在20世纪80年代以前，人们一直认为蛋白质在胃肠道中是以游离氨基酸的形式被吸收。然而，随着生物代谢研究的深入，国内外研究发现蛋白质在胃肠道中大部分以蛋白肽的形式吸收，且吸收速度、生物效价以及营养效价比游离氨基酸更快、更高。
随着人们饮食结构的变化，市场上开始涌现大量鲍鱼加工制品，包括煮干鲍、冷冻鲍和罐头鲍等。在鲍鱼加工过程中，会产生大量的鲍鱼内脏，约占鲍鱼重量的25％。目前研究者主要从鲍鱼内脏中提取蛋白、多糖、脂肪酸等活性成分。鲍鱼内脏富含蛋白，但目前主要作为调味品的原料，宝贵的蛋白资源没有得到有效利用。此外，虽然目前的研究也有将鲍鱼内脏加工成蛋白肽的报道，但是现有的加工方式一般所得鲍鱼蛋白肽的收率和纯度均低。
发明内容
本发明的目的是为了克服采用现有的方法制备鲍鱼蛋白肽时所得鲍鱼蛋白肽的收率和纯度较低的缺陷，而提供一种鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，该方法能够获得高收率和纯度的蛋白肽。
具体地，本发明提供的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法包括以下步骤：
S1、将鲍鱼内脏清洗干净后置于饱和盐水中回流处理1～2h，得到预处理鲍鱼内脏；
S2、将预处理鲍鱼内脏加入水后粉碎，加入复合酶Ⅰ，所述复合酶Ⅰ由胰酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶与烷基硫醇按照质量比1:(0.1～0.2):(2～5):(0.5～1.5):(0.01～0.1)组成，在温度为30～60℃、pH值为7.0～9.0的条件下酶解2～10h，之后将所得酶解产物的pH值调整至4～6.5，加入复合酶Ⅱ，所述复合酶Ⅱ由木瓜蛋白酶、羧肽酶以及钠盐按照质量比1:(0.05～0.2):(0.01～0.1)组成，在温度为30～60℃的条件下继续酶解10～20h，灭酶后过滤，得到酶解液；
S3、在搅拌条件下，往步骤S2所得酶解液中加入絮凝剂进行絮凝沉淀，所述絮凝剂中含有海藻酸盐、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝，所述改性氢氧化铝为经硅烷偶联剂改性后的氢氧化铝，固液分离，所得固体产物经干燥后即为鲍鱼内脏蛋白肽。
步骤S1中，所述鲍鱼内脏与饱和盐水的质量比优选为1:(2～10)，如1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10等。需要说明的是，本发明中，术语“饱和盐水”是指在室温下为饱和状态。
步骤S2中，所述预处理鲍鱼内脏与水的质量比优选为1:(0.5～2)，如1:0.5、1:0.8、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2等。
步骤S2中，所述酶解分两步进行。第一步：所采用的酶为复合酶Ⅰ，所述复合酶Ⅰ由胰酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶与烷基硫醇按照质量比1:(0.1～0.2):(2～5):(0.5～1.5):(0.01～0.1)组成。以胰酶的质量为1重量份计，所述胰凝乳蛋白酶的含量为0.1～0.2重量份，如0.1、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.2重量份；所述木瓜蛋白酶的含量为2～5重量份，如2、2.2、2.5、2.8、3、3.2、3.5、3.8、4、4.2、4.5、4.8、5重量份；所述羧肽酶的含量为0.5～1.5重量份，如0.5、0.8、1、1.2、1.5重量份；所述烷基硫醇的含量为0.01～0.1重量份，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1重量份。第一步酶解的条件包括温度为30～60℃，如30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃；pH值为7.0～9.0，如7.0、7.5、8、8.5、9.0；时间为2～10h，如2、3、4、5、6、7、8、9、10h。第二步：所采用的酶为复合酶Ⅱ，所述复合酶Ⅱ由木瓜蛋白酶、羧肽酶以及钠盐按照质量比1:(0.05～0.2):(0.01～0.1)组成。以木瓜蛋白酶的质量为1重量份计，所述羧肽酶的含量为0.05～0.2重量份，如0.05、0.08、0.1、0.12、0.15、0.18、0.2重量份；所述钠盐的含量为0.01～0.1重量份，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1重量份。第一步酶解的条件包括温度为30～60℃，如30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃；pH值为4～6.5，如4、4.5、5、5.5、6、6.5；时间为10～20h，如10、12、15、18、20h。所述复合酶Ⅰ中的烷基硫醇以及复合酶Ⅱ中的钠盐均起到酶促进剂的作用，这两种物质的使用能够显著提高蛋白肽的收率。其中，所述烷基硫醇中烷基的碳原子数优选为1～20，其具体实例包括但不限于：甲硫醇、乙硫醇、丙硫醇、丁硫醇、2-戊基硫醇、2-乙基己基硫醇、1-己硫醇、1-庚硫醇、正辛基硫醇、正十二硫醇、叔十二烷基硫醇、正十六硫醇和正十八硫醇中的至少一种。所述钠盐优选为氯化钠和/或硫酸钠。此外，所述复合酶Ⅰ和复合酶Ⅱ的用量优选各自独立地为鲍鱼内脏质量的1‰～1％。
步骤S2中，所述灭酶的方式可以按照现有的各种方式进行，例如，可以将酶解产物加热至90～110℃保持5～30min。
步骤S3中，所述絮凝剂中含有海藻酸盐、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝，其中，所述海藻酸盐、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝的质量比优选为1:(0.01～0.5):(1～3):(5～10)。具体地，以海藻酸盐的质量为1重量份计，所述明胶的含量为0.01～0.5重量份，如0.01、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5重量份；所述卡拉胶的含量为1～3重量份，如1、1.2、1.5、1.8、2、2.2、2.5、2.8、3重量份；所述改性氢氧化铝的含量为5～10重量份，如5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10重量份。在一种优选实施方式中，所述改性氢氧化铝按照以下方式制备得到：将100重量份的氢氧化铝置于浓度为10～20％的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的二甲苯溶液中，于温度为80～90℃下搅拌处理10～20min，过滤，所得固体于温度为100～150℃下焙烧处理0.5～2h。其中，所述氢氧化铝的粒径优选为5～10微米。所述絮凝沉淀的条件包括温度可以为室温，时间可以为1～5小时。此外，所述絮凝剂的用量优选为酶解液质量的2～8％。
本发明的发明人经过深入研究之后发现，将鲍鱼内脏依次采用饱和盐水进行预处理、特定酶和酶解条件下进行酶解、特定絮凝剂进行絮凝沉淀，由此得到的鲍鱼内脏蛋白肽的收率和纯度非常高。推测其原因，可能是由于：将鲍鱼内脏采用饱和盐水进行回流预处理，有利于增大组织间隙，更有利于后续酶解的进行，能够将鲍鱼内脏中的蛋白最大程度地转化为小分子蛋白肽；在酶解过程中，依次采用复合酶Ⅰ(由胰酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶与烷基硫醇按照质量比1:(0.1～0.2):(2～5):(0.5～1.5):(0.01～0.1)组成)和复合酶Ⅱ(由木瓜蛋白酶、羧肽酶以及钠盐按照质量比1:(0.05～0.2):(0.01～0.1)组成)在特定条件下进行酶解，能够使得鲍鱼内脏高效降解成蛋白肽，从而提高蛋白肽的收率；将所得酶解液采用含有海藻酸盐、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝的絮凝剂进行絮凝沉淀，这种特定的絮凝剂能够将酶解液中的蛋白肽与活性副产物如多糖、脂肪酸等分离，从而提高蛋白肽的纯度，极具工业应用前景。
具体实施方式
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例和对比例中，各原料的份数均指重量份。
以下实施例和对比例中，胰酶购自盖德化工，牌号为232-650-8；胰凝乳蛋白酶购自上海源叶生物科技有限公司，牌号为9004-07-3；木瓜蛋白酶购自云南力莲生物有限公司，牌号为9001-73-4；羧肽酶购自上海源叶生物科技有限公司，牌号为S10158-500U；海藻酸钠购自阿拉丁，牌号为S100126-100g；明胶购自阿拉丁，牌号为G108397-250g；卡拉胶购自阿拉丁，牌号为C107615-25g。
以下实施例和对比例中，鲍鱼内脏蛋白肽的收率＝W1/W0×100％，其中，W1为最终所得鲍鱼内脏蛋白肽干重，W0为鲍鱼内脏中蛋白质干重；鲍鱼内脏蛋白肽纯度采用高效液相色谱(Agilent 1260)检测得到。
制备例1：改性氢氧化铝的制备
将粒径为5～10微米的氢氧化铝置于浓度为10wt％的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的二甲苯溶液中，将温度控制在85℃下搅拌处理15min，过滤，所得固体于温度120℃下焙烧处理2h，即得改性氢氧化铝。
实施例1：鲍鱼内脏蛋白肽的制备
S1、在室温下配制饱和盐水溶液。将1份的鲍鱼内脏(蛋白质含量为11.67％，下同)清洗干净后置于5份的饱和盐水中回流处理2h，得到预处理鲍鱼内脏。
S2、将1份的预处理鲍鱼内脏加入1份的水后粉碎，加入鲍鱼内脏质量5‰的复合酶Ⅰ，所述复合酶Ⅰ由胰酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶与2-戊基硫醇按照质量比1:0.1:2:0.5:0.01组成，在温度为60℃、pH值为7.0的条件下酶解2h，之后将所得酶解产物的pH值调整至6.5，加入鲍鱼内脏质量5‰的复合酶Ⅱ，所述复合酶Ⅱ由木瓜蛋白酶、羧肽酶以及氯化钠按照质量比1:0.05:0.01组成，在温度为60℃的条件下继续酶解10h，加热至90℃保持30min进行灭酶处理，过滤，得到酶解液。
S3、在搅拌条件下，往步骤S2所得酶解液中加入酶解液质量5％的絮凝剂进行絮凝沉淀，所述絮凝剂由海藻酸钠、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝(由制备例1得到，下同)按照质量比质量比为1:0.01:1:5组成，过滤，所得固体产物经干燥后即为鲍鱼内脏蛋白肽，经检测，收率为92.6％，纯度为96.1％。
实施例2：鲍鱼内脏蛋白肽的制备
S1、在室温下配制饱和盐水溶液。将1份的鲍鱼内脏(蛋白质含量为11.67％)清洗干净后置于2份的饱和盐水中回流处理1h，得到预处理鲍鱼内脏。
S2、将1份的预处理鲍鱼内脏加入1份的水后粉碎，加入鲍鱼内脏质量5‰的复合酶Ⅰ，所述复合酶Ⅰ由胰酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶与叔十二烷基硫醇按照质量比1:0.2:5:1.5:0.1组成，在温度为30℃、pH值为9.0的条件下酶解10h，之后将所得酶解产物的pH值调整至6.5，加入鲍鱼内脏质量5‰的复合酶Ⅱ，所述复合酶Ⅱ由木瓜蛋白酶、羧肽酶以及硫酸钠按照质量比1:0.2:0.1组成，在温度为30℃的条件下继续酶解20h，加热至110℃保持5min进行灭酶处理，过滤，得到酶解液。
S3、在搅拌条件下，往步骤S2所得酶解液中加入酶解液质量2％的絮凝剂进行絮凝沉淀，所述絮凝剂由海藻酸钠、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝按照质量比质量比为1:0.5:3:10组成，过滤，所得固体产物经干燥后即为鲍鱼内脏蛋白肽，经检测，收率为91.8％，纯度为95.9％。
实施例3：鲍鱼内脏蛋白肽的制备
S1、在室温下配制饱和盐水溶液。将1份的鲍鱼内脏(蛋白质含量为11.67％)清洗干净后置于10份的饱和盐水中回流处理1.5h，得到预处理鲍鱼内脏；
S2、将1份的预处理鲍鱼内脏加入1份的水后粉碎，加入鲍鱼内脏质量5‰的复合酶Ⅰ，所述复合酶Ⅰ由胰酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶与丁硫醇按照质量比1:0.15:4:1:0.05组成，在温度为45℃、pH值为8的条件下酶解5h，之后将所得酶解产物的pH值调整至5，加入鲍鱼内脏质量5‰的复合酶Ⅱ，所述复合酶Ⅱ由木瓜蛋白酶、羧肽酶以及氯化钠按照质量比1:0.1:0.05组成，在温度为45℃的条件下继续酶解15h，加热至100℃保持10min进行灭酶处理，过滤，得到酶解液。
S3、在搅拌条件下，往步骤S2所得酶解液中加入酶解液质量8％的絮凝剂进行絮凝沉淀，所述絮凝剂由海藻酸钠、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝按照质量比质量比为1:0.3:2:8组成，过滤，所得固体产物经干燥后即为鲍鱼内脏蛋白肽，经检测，收率为93.2％，纯度为96.9％。
对比例1
按照实施例1的方法制备鲍鱼内脏蛋白肽，不同的是，不包括将鲍鱼内脏进行预处理的步骤，而是将鲍鱼内脏清洗干净后直接粉碎酶解，具体步骤如下：
S1、将1份的鲍鱼内脏清洗干净后加入1份的水，粉碎，加入鲍鱼内脏质量5‰的复合酶Ⅰ，所述复合酶Ⅰ由胰酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶与2-戊基硫醇按照质量比1:0.1:2:0.5:0.01组成，在温度为60℃、pH值为7.0的条件下酶解2h，之后将所得酶解产物的pH值调整至6.5，加入鲍鱼内脏质量5‰的复合酶Ⅱ，所述复合酶Ⅱ由木瓜蛋白酶、羧肽酶以及氯化钠按照质量比1:0.05:0.01组成，在温度为60℃的条件下继续酶解10h，加热至90℃保持30min进行灭酶处理，过滤，得到酶解液。
S2、在搅拌条件下，往步骤S1所得酶解液中加入酶解液质量5％的絮凝剂进行絮凝沉淀，所述絮凝剂由海藻酸盐、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝按照质量比质量比为1:0.01:1:5组成，过滤，所得固体产物经干燥后即为鲍鱼内脏蛋白肽，经检测，收率为89.2％，纯度为92.5％。
对比例2
按照实施例1的方法制备鲍鱼内脏多肽，不同的是，步骤S2中，将复合酶Ⅰ中的2-戊基硫醇采用相同重量份的胰酶替代，并将复合酶Ⅱ中的氯化钠采用相同重量份的木瓜蛋白酶替代，其余条件与实施例1相同，得到鲍鱼内脏蛋白肽，经检测，收率为85.1％，纯度为92.5％。
对比例3
按照实施例1的方法制备鲍鱼内脏多肽，不同的是，步骤S3中，将改性氢氧化铝采用相同重量份的海藻酸钠替代，其余条件与实施例1相同，得到鲍鱼内脏蛋白肽，经检测，收率为88.7％，纯度为91.8％。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (11)
1.一种鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
S1、将鲍鱼内脏清洗干净后置于饱和盐水中回流处理1～2h，得到预处理鲍鱼内脏；
S2、将预处理鲍鱼内脏加入水后粉碎，加入复合酶Ⅰ，所述复合酶Ⅰ由胰酶、胰凝乳蛋白酶、木瓜蛋白酶、羧肽酶与烷基硫醇按照质量比1:(0.1～0.2):(2～5):(0.5～1.5):(0.01～0.1)组成，在温度为30～60℃、pH值为7.0～9.0的条件下酶解2～10h，之后将所得酶解产物的pH值调整至4～6.5，加入复合酶Ⅱ，所述复合酶Ⅱ由木瓜蛋白酶、羧肽酶以及钠盐按照质量比1:(0.05～0.2):(0.01～0.1)组成，在温度为30～60℃的条件下继续酶解10～20h，灭酶后过滤，得到酶解液；
S3、在搅拌条件下，往步骤S2所得酶解液中加入絮凝剂进行絮凝沉淀，所述絮凝剂中含有海藻酸盐、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝，所述改性氢氧化铝为经硅烷偶联剂改性后的氢氧化铝，固液分离，所得固体产物经干燥后即为鲍鱼内脏蛋白肽。
2.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述鲍鱼内脏与饱和盐水的质量比为1:(2～10)。
3.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述预处理鲍鱼内脏与水的质量比为1:(0.5～2)。
4.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述复合酶Ⅰ和复合酶Ⅱ的用量各自独立地为鲍鱼内脏质量的1‰～1％。
5.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述烷基硫醇中烷基的碳原子数为1～20。
6.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，所述烷基硫醇选自甲硫醇、乙硫醇、丙硫醇、丁硫醇、2-戊基硫醇、2-乙基己基硫醇、1-己硫醇、1-庚硫醇、正辛基硫醇、正十二硫醇、叔十二烷基硫醇、正十六硫醇和正十八硫醇中的至少一种。
7.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述钠盐选自氯化钠和/或硫酸钠。
8.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述灭酶的方式为将酶解产物加热至90～110℃保持5～30min。
9.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述絮凝剂中海藻酸盐、明胶、卡拉胶和改性氢氧化铝的质量比为1:(0.01～0.5):(1～3):(5～10)。
10.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述改性氢氧化铝按照以下方式制备得到：将100重量份的氢氧化铝置于浓度为10～20％的γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷的二甲苯溶液中，于温度为80～90℃下搅拌处理10～20min，过滤，所得固体于温度为100～150℃下焙烧处理0.5～2h；所述氢氧化铝的粒径为5～10微米。
11.根据权利要求1所述的鲍鱼内脏蛋白肽的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述絮凝剂的用量为酶解液质量的2～8％。
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