CN112322596B

CN112322596B - 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体J-1-1 △C6及其应用

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Publication number: CN112322596B
Application number: CN202011118838.2A
Authority: CN
Inventors: 潘银平; 王伯初; 祝连彩; 唐士金
Original assignee: Chongqing University
Current assignee: Chongqing University
Priority date: 2020-10-19
Filing date: 2020-10-19
Publication date: 2023-01-24
Anticipated expiration: 2040-10-19
Also published as: CN112322596A

Abstract

本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体J‑1‑1△C6及其应用。本发明提供一种7α‑羟基类固醇脱氢酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7α‑羟基类固醇脱氢酶的C‑端截短6个氨基酸所得。该突变体具有底物选择性，能够专一性催化CDCA及其牛磺酸或甘氨酸缀合物，对于CA及其牛磺酸或甘氨酸缀合物没有催化活性，可用于从复杂底物鸡胆粉中高效合成TUDCA，而不产生有毒物质即副产物TUCA，在特异性生物转化TCDCA获取TUDCA的过程中具有巨大的应用潜力。

Description

7α-羟基类固醇脱氢酶突变体J-1-1 △C6及其应用

技术领域

本发明涉及羟基类固醇脱氢酶，具体涉及7α-羟基类固醇脱氢酶(J-1-1)的突变体J-1-1 △ C6及其在以复杂底物鸡胆粉为原料催化制备TUDCA中的应用。

背景技术

羰基的不对称还原一直是化学反应研究的热点之一。虽然目前化学方法已经取得了一定的成果，但是化学方法往往存在催化剂种类和数目有限、立体选择性不高、辅助试剂昂贵且不易回收等缺点。而酶促反应不仅具有高效性、化学选择性、区域选择性，还具有高度的立体选择性。羟基类固醇脱氢酶(Hydroxysteroid dehydrogenase，HSDH)介导的酶促反应具有相对严格的立体选择性和“不”严格的底物特异性。早有文献指出7α-HSDHs能够催化胆酸 (CA)或鹅去氧胆酸(CDCA)及其牛磺酸或甘氨酸缀合物——牛磺胆酸(TCA)，牛磺鹅去氧胆酸(TCDCA)，甘氨胆酸(GCA)和甘氨鹅脱氧胆酸(GCDCA)C-7位的α-位羟基脱羟基反应形成酮基。

HSDH的底物不仅仅局限在甾体类化合物，文献报道HSDH还可以催化烷基取代单环酮类、二环酮类等物质的羰基不对称还原。HSDH所具有的优秀催化品质决定了其在生物转化领域具有较大的应用潜力。近年来，科研人员逐渐认识到了7α-HSDH、7β-HSDH在生物转化领域所具有的巨大应用潜力。目前，GenBank序列数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank) 中登记的功能已经确认的7α-HSDH共有8个，它们分别来自于Bacteroides fragilis、Clostridium scindens、Clostridium sordellii、Clostridium absonum、Stenotrophomonas maltophilia、Eubacterium sp.VPI 12708、Clostridium difficile和Escherichia coli；来自C.absonum，Collinsella aerofacien，Ruminococcus gnavus和R.torques的7β-HSDH基因也已经成功被克隆。

有文献指出，选择鸡胆粉这类复杂基质作为生物合成TUDCA的底物，因为鸡胆粉主要以TCDCA为主，且鸡胆粉来源广泛可以入药，将废弃的鸡胆粉作为培育熊胆粉的底物，变废为宝，提高资源利用度。鸡胆粉中TCDCA的含量为42.58％，但是TCA含量占4.743％，生物催化合成后的产物中出现TUCA，影响产品的纯度，增加了后期产品纯化分离的困难。此外，TUCA游离型UCA是一种天然的胆酸，在体内肠道厌氧菌作用下转化生成次级胆汁酸脱氧胆酸DCA，DCA是一种肿瘤刺激因子，通过激活信号传导通路促进大肠癌上皮细胞的侵袭和生长，可以诱导大肠癌的发生。同时卫生部规定人工熊胆粉中TUDCA的含量不低于23％。因此，有必要挖掘具有底物选择性的7α-HSDHs或者通过分子改造技术使7α-HSDHs 具有底物选择性，从而高效合成TUDCA，使其更好的应用于工业化生产中。

发明内容

本发明的目的在于提供一种专一性催化CDCA及其缀合物的酶，该酶具有底物选择性，可识别特定底物(CDCA、TCDCA、GCDCA)，在以复杂底物鸡胆粉为原料催化制备TUDCA 中具有巨大的应用价值。

一方面，本发明提供一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如 SEQ ID NO:2所示，是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的C-端截短6个氨基酸所得。

编码所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因也属于本发明的保护范围。

优选地，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

包含所述基因的表达盒、载体或重组菌也属于本发明的保护范围。

在本发明的一些实施例中，所述载体可以是克隆载体，包含所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因以及质粒复制所需的其它元件；也可以是表达载体，包含所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因和能够使蛋白成功表达的其它元件。在一些实施例中，所述表达载体为插入了所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体基因的pGEX-6p-2载体。

在本发明的一些实施例中，所述重组菌可以是包含克隆载体的重组菌，例如E.coli DH5α，通过培养细胞使细胞内的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体基因得到复制；也可以是包含表达载体的重组细胞，在适当的条件下培养该重组细胞，例如，加入适量的IPTG，16℃诱导7α-羟基类固醇脱氢酶突变体蛋白的表达。

本发明还提供所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：合成所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因，构建表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达并纯化。

在本发明所述制备方法的优选实施例中，所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

本发明还提供一种催化剂，其特征在于：其有效成分包含所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体。所述催化剂可以单独使用，也可以与其它适合的催化剂同时使用，以提高酶催化效率或者在同一反应体系中先后进行两种催化反应。

所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或所述催化剂在羰基不对称还原反应中的应用也属于本发明的保护范围。本发明的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体在羰基不对称还原反应中具有底物选择性，能够选择性催化CDCA及其缀合物(TCDCA、GCDCA)。

本发明还提供一种制备TUDCA的方法，其特征在于：以鸡胆粉为原料，使用所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或所述催化剂进行催化反应，得到TUDCA。本发明的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体(J-1-1 △C6)能够特异性催化复杂底物鸡胆粉中的TCDCA而对TCA没有催化作用，从而避免反应副产物TUCA的生成，简化了后期产品的分离纯化步骤。TUCA在体内会转化生成DCA，具有致大肠癌风险，本发明的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体不会催化产生TUCA，确保了药品安全。

在本发明的优选实施例中，本发明的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体(J-1-1 △C6)，在25℃ 条件下，在pH 9.0，50mM Gly-NaOH中能够催化鸡胆粉中TCDCA C₇α-羟基的羰基不对称还原反应而对TCA没有催化作用。

附图说明

图1.7α-HSDH转化CDCA、TCDCA、GCDCA、CA、TCA或GCA的示意图；当底物为CA、TCA或GCA时，化学结构式中的R1为-OH；当底物为CDCA、TCDCA或GCDCA 时，化学结构式中的R1为-H；当底物为CA或CDCA时，化学结构式中的R为

当底物为GCDCA或GCA时，化学结构式中的R为

当底物为TCDCA或TCA时，化学结构式中的R为

图2.7α-羟基类固醇脱氢酶(J-1-1)突变体J-1-1 △C6的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质分子量标准(Marker)，从上到下分子量大小依次是120，85，50，35，25，20kDa； J-1-1 △C6表示突变体酶蛋白，分子量大小为27.58kDa。

图3.7α-羟基类固醇脱氢酶(J-1-1)野生型的SDS-PAGE电泳图；其中，M为蛋白质分子量标准(Marker)，从上到下分子量大小依次是120，85，50，35，25，20kDa；J-1-1表示野生型酶蛋白，分子量大小为28.25kDa。

图4.NADPH的标准曲线；其中，横坐标为NADPH溶液的浓度(mM)，纵坐标为NADPH 溶液在340nm处的光吸收值。

图5.野生型7α-HSDH J-1-1及其突变体的酶活测定结果；分别以CDCA、TCDCA、GCDCA、CA、TCA和GCA为底物，其中J-1-1为野生型(灰柱)，J-1-1 △C6为突变体(黑柱)。

图6.TCDCA和TUDCA的标准曲线；横坐标为进样量m(μg)的对数值lg(m)，纵坐标为峰面积A的对数值lg(A)。

图7.7α-羟基类固醇脱氢酶(J-1-1)及其突变体J-1-1 △C6催化转化鸡胆粉的HPLC-ELSD 检测结果。(A)TUCA，TUDCA，T-7-KLCA，TCA和TCDCA标准品图谱；(B)以J-1-1 为催化剂催化转化鸡胆粉合成TUDCA的检测结果；(C)以J-1-1 △C6为催化剂选择性催化转化鸡胆粉合成TUDCA的检测结果。横坐标为保留时间min，纵坐标为电信号mV。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。

主要试剂

Prime STAR Max Premix(2×)，宝生物科技有限公司(大连)，货号：R045A；BamHI，宝生物科技有限公司(大连)，货号：1010S；Xho I，宝生物科技有限公司(大连)，货号：1094S；T4 DNA Ligase，宝生物科技有限公司(大连)，货号：2011A；pGEX-6p-2质粒为已知载体，购买自上海生工生物科技有限公司；Trans5α感受态细胞，全式金生物技术有限公司，货号：CD201-01；E.coli BL21(DE3)感受态细胞，全式金生物技术有限公司，货号：CD601；磷酸盐缓冲液(PBS)干粉，北京索莱宝科技有限公司，货号：P1010；Glutathione Sepharose4B，购买自GE Healthcare，货号：10223836；PreScission Protease酶，购买自GenScript公司，货号：Z02799-100；Bradford蛋白浓度测定试剂盒，购买自Beyotime公司，货号：P0006；回收试剂盒

Cycle Pure Kit，OMEGA BIO-TEK(中国代理商)，货号：D6493；质粒提取试剂盒

Plasmid Mini Kit I，OMEGA BIO-TEK(中国代理商)，货号：D6943；NADPH：CAS号2646-71-1，购买自Sigma-Aldrich公司，货号：10621692001；NADP⁺：CAS 号53-59-8，购买自Sigma-Aldrich公司，货号：N5755；CDCA(鹅去氧胆酸)：CAS号2646-38-0，购买自Sigma-Aldrich公司，货号：C8261；TCDCA(牛磺鹅去氧胆酸)：CAS号6009-98-9，购买自百灵威科技公司，货号：330776；GCDCA(甘氨鹅去氧胆酸)：CAS号16564-43-5，购买自麦克林试剂公司，货号：G835599；CA(胆酸)：CAS号206986-87-0，购买自Sigma-Aldrich 公司，货号：C1254；TCA(牛磺胆酸)：CAS号345909-26-4，购买自Sigma-Aldrich公司，货号：T4009；GCA(甘氨胆酸)：CAS号338950-81-5，购买自Sigma-Aldrich公司，货号：G7132；UCA(熊胆酸)：CAS号2955-27-3，购买自麦克林，货号：U879761；TUCA(牛磺熊胆酸)：委托重庆波克底科技开发有限责任公司制备，记载有TUCA制备方法的非专利文献：B,Dayal,G,Salen.Stereospecific synthesis and two-dimensional 1H-NMR investigation ofisoursocholic acid.Journal of lipid research,1991,32(8):1381-7；TUDCA(牛磺熊去氧胆酸)： CAS号14605-22-2，购买自Sigma-Aldrich公司，货号：T0266；7-KLCA(7-酮石胆酸)：购买自深圳紫勋医药有限公司，CAS号4651-67-6，货号：001；T-7-KLCA(牛磺-7-酮石胆酸)：委托重庆波克底科技开发有限责任公司制备，记载有胆汁酸牛磺酸化的非专利文献：王海龙, 吴成龙,邓勇.牛磺熊去氧胆酸的合成.中国医药工业杂志2009,40(2)。

培养基

每100ml LB培养基含有：1g胰蛋白胨、0.5g酵母提取物、1g氯化钠，pH 7.4。配制方法：在950ml ddH₂O中溶解10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10g氯化钠，然后用NaOH调节 pH为7.4，用ddH₂O定容至1L。若配制固体培养基，则每升加入15g琼脂。121℃高压蒸汽灭菌20min。

缓冲液

10mM PBS(pH 7.4)的配制方法：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na₂HPO₄和0.24gKH₂PO₄，溶于800mL蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L 即可。121℃高压蒸气灭菌至少20分钟，保存于室温或4℃冰箱中备用。

50mM Tris-HCl(pH 8.0)的配制方法：取6.057g Tris(三羟甲基氨基甲烷，CAS号1185-53-1)固体粉末溶于1L去离子水中，用盐酸调pH到8.0，室温放置备用。

50mM Gly-NaOH(pH 9.0)的配制方法：取15.01g甘氨酸固体粉末溶于1L去离子水中配置成0.2M甘氨酸母液，取8g NaOH固体粉末溶于1L去离子水中配置成0.2M氢氧化钠母液，取50mL 0.2M甘氨酸母液和8.8mL 0.2M氢氧化钠母液加水稀释至200mL即为 50mM Gly-NaOH(pH 9.0)缓冲液，室温放置备用。

若未特别说明，以下实施例所使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例所使用的实验方法和实验条件均为本领域常规的实验方法和实验条件，可参考相关实验手册、公知文献或厂商说明书。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义相同的含义。

实施例1. 7α-羟基类固醇脱氢酶(J-1-1)突变体的制备

1.突变体基因的设计与合成

野生型7α-羟基类固醇脱氢酶J-1-1(7α-HSDH J-1-1)的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。7α-HSDH J-1-1的基因是本实验室从四川黑熊保护及孵育基地的健康黑熊的粪便样品中分离得到的，其开放阅读框全长786bp，编码261个氨基酸。该基因的分离和克隆方法记载在2017年12月18日提交的申请号为2017113648196，发明名称为“7α-羟基类固醇脱氢酶及其编码基因与应用”的专利申请文本中，通过引用将该专利申请的全部内容并入本文。

野生型7α-羟基类固醇脱氢酶J-1-1的氨基酸序列(261aa)如下：

MRVKDKIALVTSSTKGIGLACAKALAKNGALVYIAARNEELANEVIAEIESEGGKAKFVYF NAREVETYNSMIDTVIENEGRLDILVNNYGGTNVQLDKNLVDGDTDAFFNIVQDNLQSVY LPCKRVVPHMIKNGGGSIVNISSIGSVVPDLSRMGYCVTKAAINSLTQNIALQYAHDNVRC NAVLPGLTATKAALTNMPDEFRKSFLRHVPLNRMGTPEDIANAVLFYASDESSYITGDILE VSGGYALGTPQYGDLVQR(SEQ ID NO:1)

野生型7α-羟基类固醇脱氢酶J-1-1的核苷酸序列(786bp)如下：

ATGAGAGTAAAAGATAAAATAGCTTTAGTTACATCATCTACAAAGGGAATAGGGTTAG CTTGTGCTAAGGCTCTTGCAAAAAATGGAGCATTAGTTTATATAGCTGCAAGAAATGA AGAATTAGCTAATGAAGTTATAGCTGAAATAGAAAGTGAAGGCGGAAAAGCTAAGTTT GTATATTTCAATGCAAGAGAAGTTGAAACATACAATTCTATGATAGATACAGTTATCG AAAACGAAGGAAGATTAGATATATTAGTAAACAACTACGGAGGAACTAATGTACAAC TAGATAAAAACTTAGTTGATGGAGATACAGATGCTTTCTTCAACATAGTGCAAGATAA TCTACAAAGTGTTTACTTACCTTGTAAAAGAGTTGTACCTCACATGATAAAAAACGGTG GAGGAAGTATAGTAAATATCTCTTCTATAGGTTCTGTTGTACCTGATTTATCAAGAATG GGTTATTGTGTTACAAAGGCTGCAATAAACTCTTTAACACAAAATATAGCGCTTCAATA TGCACATGATAATGTAAGATGTAATGCAGTTTTACCAGGACTTACAGCTACTAAGGCT GCTCTTACAAATATGCCTGATGAGTTTAGAAAATCATTCTTAAGACATGTTCCTTTAAA TAGAATGGGAACTCCAGAAGATATAGCAAATGCTGTATTATTCTATGCTTCTGATGAAT CTTCATATATAACTGGAGATATATTAGAAGTGTCTGGTGGATATGCCCTTGGAACACCT CAATACGGAGACCTTGTTCAAAGATAA(SEQ ID NO:3)

通过从一级结构至高级结构的多角度多层次比较野生型7α-HSDH J-1-1与同源酶蛋白的异同，确定了影响7α-HSDH J-1-1酶学性质的位点为C-末端。因此，我们将野生型7α-HSDH J-1-1基因序列的第766-783位碱基去除，也就是将野生型7α-HSDH J-1-1酶C-端的甘氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、缬氨酸、谷氨酰胺、精氨酸这6个氨基酸去除，得到7α-HSDH J-1-1酶突变体，命名为J-1-1 △C6突变体。该突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

2.表达载体构建

2.1基因扩增

本实验以野生型7α-HSDH J-1-1基因为模板，通过PCR法获得突变体基因，分别在J-1-1 △C6突变体基因序列的5’端引入酶切位点BamH I(GGATCC)，3’端引入酶切位点XhoI (CTCGAG)。实验中所使用的野生型7α-HSDH J-1-1基因是本实验室前期以黑熊粪便样品的总DNA为模板，采用PCR技术克隆所得。所述野生型7α-HSDH J-1-1基因也可通过基因合成的方法获得。实验中所使用的引物的核苷酸序列如下表所示，委托Sangon Biotech(中国，上海)公司进行引物合成。

表1：7α-HSDH J-1-1 △C6突变体基因引物

同时，按照上述PCR体系和PCR条件扩增野生型7α-HSDH J-1-1基因，引物为：

J-1-1-FP：5’-CGCGGATCCATGAGAGTAAAAGATAAAATAG-3’；

J-1-1-RP：5’-CGCTCGAGTTATCTTTGAACAAGGTCTCCGTATT-3’。

2.2酶切

利用BamH I(Takara Bio，货号：1010S)和Xho I(Takara Bio，货号：1094S)限制性内切酶分别对扩增的基因和pGEX-6p-2质粒进行双酶切。

酶切体系：

酶切条件：37℃酶切3h(干浴)。

采用回收试剂盒

Cycle Pure Kit(OMEGA BIO-TEK，货号D6493)，按照试剂盒说明书上的操作步骤进行酶切产物回收：

1)向每个离心管加入等体积的结合剂Binding Buffer，使之与酶切产物充分混匀后，吸入

DNA微型柱的2mL收集管中，离心(10000×g，1min)。

2)向收集管加入300μL Binding Buffer，离心(14000×g，1min)。

3)加入700μL乙醇稀释的SPW Wash Buffer洗涤吸附柱，离心(14000×g，1min)，重复一次。

4)弃去液体，并将空的吸附柱离心(14000×g，2min)。

5)将收集管弃去，将

DNA微型柱放在干净的纸上，开盖静置10min，充分挥发酒精。期间将一管无菌的ddH₂O预热至65℃备用。

6)将

DNA微型柱放于已灭菌的1.5mL离心管中，加50μL加热到65℃的ddH₂O，于室温下放置1-2min，洗脱DNA，离心(14000×g，2min)。

7)测浓度。吸取2μL DNA于超微量分光光度计中，测定DNA的浓度。(浓度单位：ng/μL， 260/280：核酸含量)。

2.3连接

使用T4 DNA Ligase(Takara Bio，货号：2011A)，按照如下体系和条件对pGEX-6p-2 线性载体和基因酶切产物进行连接。

16℃连接过夜，得到连接产物：pGEX-6p-2/J-1-1、pGEX-6p-2/J-1-1 △C6。

2.4连接产物转化Trans5α感受态细胞

1)配制100mL固体LB培养基，121℃高压蒸汽灭菌30min，待冷至40-50℃，向其中加入终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素。取适量培养基均匀地铺在无菌的培养皿中，于超净台上凝固。期间将-80℃冷冻保存的Trans5α感受态细胞(全式金，货号：CD201-01)取出并迅速放在冰上，静置10min，融化后使用。

2)快速将Trans5α感受态细胞按照需求分装于无菌的1.5mL离心管中，加入10μL连接产物，在冰上静置30min。

3)于45℃，热激45s。

4)快速将离心管转移到冰上放置2min(切勿晃动离心管)。

5)向其中加入无抗生素无菌的LB液体培养基500μL，摇床培养，温度37℃，摇速180rpm，时间45min，复苏细胞。

6)吸取100μL左右菌液，涂布于100μg/mL Amp⁺抗性LB平板培养基上，37℃过夜培养。

2.5阳性克隆筛选

1)挑取单菌落，接种于适量的无菌的100μg/mL Amp⁺抗性LB液体培养基中，摇床培养，温度37℃，摇速220rpm。培养至OD₆₀₀大约为0.8-1。

2)保种：菌液和25％(v/v)无菌甘油按照2：1的体积比混匀后，液氮速冻，保存于-80℃。

3)余下的菌液用于质粒提取。采用质粒提取试剂盒

Plasmid Mini KitI(OMEGA BIO-TEK，货号：D6943)按试剂盒说明书提取质粒，步骤如下：

1)菌液生长至OD₆₀₀大约为0.8-1，8000rpm离心5min获取菌体。

2)弃上清液，并立即用200μL移液枪吸干残留液体，立即加入250μL Solution I(已加入RNA酶，并保存于4℃)，涡旋直至菌体沉淀完全悬浮。

3)将混匀的菌液加入1.5mL无菌离心管中，向离心管中加入同等体积的SolutionⅡ，缓慢的转动离心管彻底混匀样品，以获得澄清裂解液。立即向其中加入350μLSolutionⅢ，缓慢的转动离心管混合样品(出现白色絮状沉淀)，离心(4℃，13000×g，10min)。(注意这步必须在5min内完成，并且不能剧烈混合，否则染色体DNA断裂使得到的质粒纯度降低)。

4)用200μL移液枪小心吸取上清(确保没有吸入沉淀)，转移至装

DNA微型柱的2mL收集管中。

5)离心(13000×g，1min)，弃滤液。

6)向收集柱中加入500μL Buffer HB，离心(13000×g，1min)，弃滤液。

7)向收集柱中加入700μL DNA Wash Buffer(已加入无水乙醇)，离心(13000×g，1min)，弃滤液，除杂。重复一次，弃液体。

8)离心(15000×g，2min)以甩干

DNA微型柱，打开收集柱盖子，静置10min，使无水乙醇挥发干净。期间取一管无菌的ddH₂O预热到65℃。

9)将

DNA微型柱置于无菌的1.5mL离心管中，加入50μL已经预热到65℃ddH₂O，室温静置2min，离心(15000×g，2min)。

10)测浓度。吸取2μL DNA于超微量分光光度计，测定DNA的浓度。(浓度单位：ng/μL， 260/280：核酸含量)。

2.6质粒的双酶切鉴定

酶切体系：

酶切条件：37℃酶切1.5h。琼脂糖凝胶电泳检测酶切产物。

2.7测序确认

选取双酶切鉴定结果正确的重组质粒送Sangon Biotech(中国，上海)公司测序，将测序结果正确的重组质粒作为J-1-1野生型和J-1-1 △C6突变体的表达载体。

3.酶蛋白的GST融合异源表达

3.1质粒转化E.coli BL21细胞

按照上述2.4(连接产物转化Trans5α感受态细胞)的转化方法将上述2.7测序结果正确的重组质粒转入E.coli BL21(DE3)细胞(全式金，货号：CD601)中，获得用于蛋白表达的重组菌。

3.2蛋白表达与纯化

(1)接种100μL重组菌的菌液于400mL无菌LB培养基中，氨苄青霉素终浓度为100 μg/mL，37℃，180rpm摇床培养。

(2)待OD₆₀₀≈0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，化学式C₉H₁₈O₅S)，16℃诱导过夜(12h)。将菌液分装至高速离心瓶中，8000rpm离心5min，收集菌体。

(3)按1L培养体系加30mL裂解缓冲液(pH 7.4，10mM PBS)的比例重悬菌体，4℃ 超声破菌至澄清。破碎的菌液均分至4℃预冷的50mL无菌离心管，4℃，12000rpm离心20 min，沉降菌体，待离心结束，用精密移液枪将上清转移到4℃预冷的50mL无菌离心管中。

(4)取Glutathione Sepharose 4B填料装于亲和层析柱(GE Healthcare，货号：10223836) 中，填料使用的比例为每升培养体系使用5mL填料。用4℃预冷的无菌的pH 7.4，10mM PBS 冲洗3个柱体积，去除无水乙醇。将步骤(3)得到的上清与GlutathioneSepharose 4B结合， 4℃结合2h。轻轻垂直颠倒混悬。

(5)结合完毕后，500rpm离心5min沉淀填料。滤掉上清，用4℃预冷的无菌的pH7.4，10mM PBS(含有体积分数为0.25％的吐温20)冲洗填料3到5个柱体积，去除杂蛋白。

(6)加入1mL 4℃预冷的酶切缓冲液(pH 7.4，10mM PBS)，加入40μL PreScissionProtease 酶(GenScript，Z02799-100)，4℃酶切过夜。

(7)酶切完毕后，将上清从层析柱中放出即为洗脱的7α-HSDH酶液。

(8)将所得酶液进行SDS-PAGE，鉴定其分子量大小及纯度，野生型酶的分子量约为28.25 kDa，突变体酶的分子量约为27.58kDa。使用Bradford蛋白浓度测定试剂盒(Beyotime，P0006) 按照试剂盒说明书测定纯化蛋白的浓度。将酶液和体积分数为80％的无菌甘油按照3：1的体积比混匀，并将含有甘油的酶液分装于无菌的1.5mL离心管中，保存于-80℃。

(9)使用后的Glutathione Sepharose 4B填料用6mol/L的盐酸胍(CAS号50-01-1)浸泡 20min，再用PBS大量冲洗填料后用20％乙醇浸泡填料，保存于4℃冰箱。

SDS-PAGE检测结果显示，J-1-1 △C6突变体可溶性表达成功(图2)，并且经一步亲和层析后蛋白的条带单一，纯化的J-1-1 △C6突变体酶蛋白的浓度是1.21mg/mL。野生型酶 J-1-1可溶性表达成功(图3)。纯化的野生型酶蛋白的浓度为1.23mg/mL。

实施例2. 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体J-1-1 △C6的酶活测定

1.NADPH标准曲线的制作

利用反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)分别配制0mM，0.1mM，0.2mM，0.3mM，0.4mM的NADPH(Sigma-Aldrich，货号：10621692001)溶液。用上述反应缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0)调零后将各个浓度的NADPH溶液分别加入2mL比色皿中，于室温下，在340nm处测定光吸收值OD₃₄₀。以NADPH溶液的浓度为横坐标，对应的340nm光吸收值为纵坐标，绘制标准曲线。结果如图4所示，获得的标准曲线方程式为y＝2.79559x-0.0003， R²＝0.9999。

2.酶活测定

(1)用ddH₂O分别配制50mM NADP⁺辅酶(Sigma-Aldrich，货号：N5755)，50mM CDCA(Sigma-Aldrich，货号：C8261)，50mM TCDCA(百灵威科技，货号：330776)，50mM GCDCA (麦克林试剂，货号：G835599)，50mM CA(Sigma-Aldrich，货号：C1254)，50mM TCA (Sigma-Aldrich，货号：T4009)和50mM GCA(Sigma-Aldrich，货号：G7132)溶液。

(2)设置6个实验组，每个实验组在2mL比色皿中首先加入1955μL 50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲溶液，再依次加入20μL 50mM NADP⁺辅酶溶液，以及2μL实施例1制备的酶蛋白溶液，充分混匀后在波长为340nm条件下调零，然后立即向各实验组的混合液中分别加入20μL 50mM CDCA(鹅去氧胆酸)底物溶液/20μL 50mM TCDCA(牛磺鹅去氧胆酸) 底物溶液/20μL 50mM GCDCA(甘氨鹅去氧胆酸)底物溶液/20μL 50mM CA(胆酸)底物溶液/20μL50mM TCA(牛磺胆酸)底物溶液/20μL 50mM GCA(甘氨胆酸)底物溶液，充分吹打混匀，于室温下在340nm处记录30s内的光吸收变化，并根据NADPH的标准曲线计算产物的生成量。每个酶蛋白样品进行3次重复试验，结果取平均值。

(3)酶活计算：将340nm处记录的30s内的光吸收变化值带入NADPH标准曲线y＝2.79559x-0.0003，R²＝0.9999中，计算得到30s时已转化底物浓度(mmol/L)。

Vt：反应总体积，mL

酶活单位：相应条件下，每分钟转化1μmol CDCA或TCDCA或GCDCA或CA或TCA 或GCA所需的7α-HSDH酶量定义为一个酶活单位U。酶的比活定义为：每毫克酶蛋白含有的活性单位数，单位为：U/mg。

结果如图5所示，野生型酶J-1-1在底物CDCA和NADP⁺的存在下，酶活为168.2U/mg；在底物TCDCA和NADP⁺的存在下，酶活为188.01U/mg；在底物GCDCA和NADP⁺的存在下，酶活为216.98U/mg；在底物CA和NADP⁺的存在下，酶活为238.6U/mg；在底物TCA 和NADP⁺的存在下，酶活为249.69U/mg；在底物GCA和NADP⁺的存在下，酶活为208.01 U/mg。而突变体J-1-1 △C6在底物CDCA和NADP⁺的存在下，酶活为16.6U/mg；底物TCDCA 和NADP⁺的存在下，酶活为18.45U/mg，在底物GCDCA和NADP⁺的存在下，酶活为15.32 U/mg；在底物CA和NADP⁺的存在下，酶活为0U/mg；在底物TCA和NADP⁺的存在下，酶活为0U/mg；在底物GCA和NADP⁺的存在下，酶活为0U/mg。可见，突变体J-1-1 △C6 出现了底物选择性，其专一性催化CDCA及其缀合物。

实施例3. 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体J-1-1 △C6催化转化鸡胆粉的应用

1.HPLC-ELSD法检测产物转化

①检测方法

柱温40℃；流速0.8mL/min；流动相A：50mM的醋酸铵甲酸溶液(pH4.5)；流动相B：甲醇；检测器：ELSD(蒸发光散射检测器，安捷伦，1260Infinity ELSD，GB14460009)，撞击器：关；雾化器温度80℃；N₂流量1.6L/min。按下表线性梯度洗脱。

50mM的醋酸铵甲酸溶液(pH4.5)：精确称取3.854g醋酸铵溶于1L超纯水中，用甲酸调节pH至4.5。

HPLC-ELSD法检测胆汁酸的梯度洗脱

②标准曲线绘制

精确称定TCDCA和TUDCA标准品，使用容量瓶配制其甲醇溶液，并用甲醇稀释至0.1mg/mL，0.2mg/mL，0.4mg/mL，0.6mg/mL和0.8mg/mL，用0.22μm滤膜过滤，按照上述 HPLC检测方法进行检测，进样量10μL。以进样量m(μg)的对数值lg(m)横坐标，峰面积A 的对数值lg(A)为纵坐标绘制TCDCA和TUDCA的标准曲线(图6)，用于计算TCDCA和 TUDCA的含量。

③TCDCA的转化率、TUDCA的收率检测及产物处理

鸡胆粉是由鸡的鲜胆汁或鸡胆提取液除去固体杂质后冷冻至凝固状，抽真空使水蒸气升华，升温干燥后灭菌所得得粉状物。本实验使用的鸡胆粉由上海凯宝药业股份有限公司制备馈赠，生产批号为2017-2-24。

鸡胆粉中TCDCA含量为42.6％(w/w)，精密称取0.1173g鸡胆粉，用2mL ddH₂O溶解配制成含有50mM TCDCA的鸡胆粉溶液。取20μL鸡胆粉溶液，并加甲醇980μL稀释至终浓度1mM，混匀，用0.22μm滤膜过滤，取滤过液，将加入鸡胆粉中的TCDCA的初始浓度经上述检测方法检测。反应液中加入反应体系四倍体积的甲醇，使得蛋白变性，4℃，8000 rpm离心10min，取上清弃沉淀，挥干甲醇，真空干燥箱干燥。甲醇溶解固体配制成1mg/mL，按照上述检测方法进行检测，根据标准曲线，计算TCDCA的转化率和TUDCA的收率。

④转化反应

50mL反应体系，在25℃，加入50mM pH 9.0Gly-NaOH缓冲液32mL，加入底物含有50mM TCDCA的鸡胆粉溶液8mL使其终浓度为8mM，加入辅酶50mM NADP⁺2mL使其终浓度为2mM，7α-HSDH、7β-HSDH酶液(7α-HSDH 2mL，7β-HSDH 6mL，初始浓度1 mg/mL)的条件下，酶催化反应5h。HPLC-ELSD法检测产物转化。其中，7α-HSDH为野生型J-1-1/突变体J-1-1 △C6，7β-HSDH为本实验室前期制备的酶，制备方法参照专利号为 ZL2017100085889，发明名称为新的7β-羟基类固醇脱氢酶基因Y1-b-1的专利公布文本。

如图7和表2所示，分别用野生型J-1-1和突变体J-1-1△C6催化转化鸡胆粉来合成TUDCA，HPLC-ELSD检测结果显示J-1-1△C6具有底物选择性，不催化转化TCA，没有 TUCA的生成；同时J-1-1△C6催化鸡胆粉中TCDCA的转化率高达83.12％，较高于野生型 J-1-1的78.83％；J-1-1△C6催化鸡胆粉中TUDCA的收率达到34.01％，较高于野生型J-1-1 的30.71％；J-1-1及J-1-1△C6以鸡胆粉为原料，合成TUDCA的含量分别占总产物的25.61％和25.92％，均满足卫生部规定人工熊胆粉中TUDCA的含量不得低于23％的要求。因此J-1-1△C6在以鸡胆粉为原料催化制备TUDCA中具有显著优势，选择性高效催化合成TUDCA，避免杂质副产物TUCA的引入，减小分离难度，提高产物占有率，在工业化生产中具有巨大的应用前景。

表2

序列表

<110> 重庆大学

<120> 7α-羟基类固醇脱氢酶突变体J-1-1 △C6及其应用

<130> P2031016-CQD-CQ-TXH

<141> 2020-10-19

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 261

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Arg Val Lys Asp Lys Ile Ala Leu Val Thr Ser Ser Thr Lys Gly

1 5 10 15

Ile Gly Leu Ala Cys Ala Lys Ala Leu Ala Lys Asn Gly Ala Leu Val

20 25 30

Tyr Ile Ala Ala Arg Asn Glu Glu Leu Ala Asn Glu Val Ile Ala Glu

35 40 45

Ile Glu Ser Glu Gly Gly Lys Ala Lys Phe Val Tyr Phe Asn Ala Arg

50 55 60

Glu Val Glu Thr Tyr Asn Ser Met Ile Asp Thr Val Ile Glu Asn Glu

65 70 75 80

Gly Arg Leu Asp Ile Leu Val Asn Asn Tyr Gly Gly Thr Asn Val Gln

85 90 95

Leu Asp Lys Asn Leu Val Asp Gly Asp Thr Asp Ala Phe Phe Asn Ile

100 105 110

Val Gln Asp Asn Leu Gln Ser Val Tyr Leu Pro Cys Lys Arg Val Val

115 120 125

Pro His Met Ile Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Ile Ser Ser

130 135 140

Ile Gly Ser Val Val Pro Asp Leu Ser Arg Met Gly Tyr Cys Val Thr

145 150 155 160

Lys Ala Ala Ile Asn Ser Leu Thr Gln Asn Ile Ala Leu Gln Tyr Ala

165 170 175

His Asp Asn Val Arg Cys Asn Ala Val Leu Pro Gly Leu Thr Ala Thr

180 185 190

Lys Ala Ala Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Phe Arg Lys Ser Phe Leu

195 200 205

Arg His Val Pro Leu Asn Arg Met Gly Thr Pro Glu Asp Ile Ala Asn

210 215 220

Ala Val Leu Phe Tyr Ala Ser Asp Glu Ser Ser Tyr Ile Thr Gly Asp

225 230 235 240

Ile Leu Glu Val Ser Gly Gly Tyr Ala Leu Gly Thr Pro Gln Tyr Gly

245 250 255

Asp Leu Val Gln Arg

260

<210> 2

<211> 255

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Val Lys Asp Lys Ile Ala Leu Val Thr Ser Ser Thr Lys Gly

1 5 10 15

Ile Gly Leu Ala Cys Ala Lys Ala Leu Ala Lys Asn Gly Ala Leu Val

20 25 30

Tyr Ile Ala Ala Arg Asn Glu Glu Leu Ala Asn Glu Val Ile Ala Glu

35 40 45

Ile Glu Ser Glu Gly Gly Lys Ala Lys Phe Val Tyr Phe Asn Ala Arg

50 55 60

Glu Val Glu Thr Tyr Asn Ser Met Ile Asp Thr Val Ile Glu Asn Glu

65 70 75 80

Gly Arg Leu Asp Ile Leu Val Asn Asn Tyr Gly Gly Thr Asn Val Gln

85 90 95

Leu Asp Lys Asn Leu Val Asp Gly Asp Thr Asp Ala Phe Phe Asn Ile

100 105 110

Val Gln Asp Asn Leu Gln Ser Val Tyr Leu Pro Cys Lys Arg Val Val

115 120 125

Pro His Met Ile Lys Asn Gly Gly Gly Ser Ile Val Asn Ile Ser Ser

130 135 140

Ile Gly Ser Val Val Pro Asp Leu Ser Arg Met Gly Tyr Cys Val Thr

145 150 155 160

Lys Ala Ala Ile Asn Ser Leu Thr Gln Asn Ile Ala Leu Gln Tyr Ala

165 170 175

His Asp Asn Val Arg Cys Asn Ala Val Leu Pro Gly Leu Thr Ala Thr

180 185 190

Lys Ala Ala Leu Thr Asn Met Pro Asp Glu Phe Arg Lys Ser Phe Leu

195 200 205

Arg His Val Pro Leu Asn Arg Met Gly Thr Pro Glu Asp Ile Ala Asn

210 215 220

Ala Val Leu Phe Tyr Ala Ser Asp Glu Ser Ser Tyr Ile Thr Gly Asp

225 230 235 240

Ile Leu Glu Val Ser Gly Gly Tyr Ala Leu Gly Thr Pro Gln Tyr

245 250 255

<210> 3

<211> 786

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgagagtaa aagataaaat agctttagtt acatcatcta caaagggaat agggttagct 60

tgtgctaagg ctcttgcaaa aaatggagca ttagtttata tagctgcaag aaatgaagaa 120

ttagctaatg aagttatagc tgaaatagaa agtgaaggcg gaaaagctaa gtttgtatat 180

ttcaatgcaa gagaagttga aacatacaat tctatgatag atacagttat cgaaaacgaa 240

ggaagattag atatattagt aaacaactac ggaggaacta atgtacaact agataaaaac 300

ttagttgatg gagatacaga tgctttcttc aacatagtgc aagataatct acaaagtgtt 360

tacttacctt gtaaaagagt tgtacctcac atgataaaaa acggtggagg aagtatagta 420

aatatctctt ctataggttc tgttgtacct gatttatcaa gaatgggtta ttgtgttaca 480

aaggctgcaa taaactcttt aacacaaaat atagcgcttc aatatgcaca tgataatgta 540

agatgtaatg cagttttacc aggacttaca gctactaagg ctgctcttac aaatatgcct 600

gatgagttta gaaaatcatt cttaagacat gttcctttaa atagaatggg aactccagaa 660

gatatagcaa atgctgtatt attctatgct tctgatgaat cttcatatat aactggagat 720

atattagaag tgtctggtgg atatgccctt ggaacacctc aatacggaga ccttgttcaa 780

agataa 786

<210> 4

<211> 768

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

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gatatagcaa atgctgtatt attctatgct tctgatgaat cttcatatat aactggagat 720

atattagaag tgtctggtgg atatgccctt ggaacacctc aatactaa 768

<210> 5

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cgcggatcca tgagagtaaa agataaaata g 31

<210> 6

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgctcgagtt atctttgaac aaggtctccg tatt 34

<210> 7

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

cgcggatcca tgagagtaaa agataaaata g 31

<210> 8

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cgctcgagtt agtattgagg tgttccaagg gca 33

Claims

1.一种7α-羟基类固醇脱氢酶突变体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，是由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的7α-羟基类固醇脱氢酶的C-端截短6个氨基酸所得。

2.编码权利要求1所述的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

4.包含权利要求2或3所述基因的表达盒、载体或重组菌。

5.权利要求1所述的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：合成所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因，构建表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达并纯化。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述7α-羟基类固醇脱氢酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。

7.一种催化剂，其特征在于：其有效成分包含权利要求1所述的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体。

8.权利要求1所述的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或权利要求7所述的催化剂在羰基不对称还原反应中的应用。

9.一种制备TUDCA的方法，其特征在于：以鸡胆粉为原料，使用权利要求1所述的7α-羟基类固醇脱氢酶突变体或权利要求7所述的催化剂进行催化反应，得到TUDCA，不产生副产物TUCA。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述催化反应在25℃条件下，在pH 9.0，50mM Gly-NaOH中进行。