CN105368828B - 一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法；一种7a‑类固醇脱氢酶(7a‑HSDH)和一种用于辅酶NAD+再生的乳酸脱氢酶(LDH)在大肠杆菌里的高效共表达，上述大肠杆菌全细胞用于催化鹅去氧胆酸(CDCA)生成3α‑羟基‑7‑氧代‑5β‑胆烷酸(7‑KLCA)；将上述全细胞催化鹅去氧胆酸得到的反应液调酸7‑KLCA粗品；上述重组细胞可以通过发酵方法廉价易得，生产成本和产品质量优于化学合成方法，适合于工业化生产。
Description
技术领域：
本发明提供一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法。本发明属于生物工程技术领域。
背景技术：
熊去氧胆酸(I,UDCA)是名贵中药熊胆所含的主要有效成分，它与其相应的非对映异构体鹅去氧胆酸(II，CDCA)在临床上用于治疗各种胆石疾病，各种急性、慢性肝病，具有良好的效果。从人工养殖的熊的熊胆中提取UDCA收率低，来源有限，而且有违于动物保护，因而人工合成UDCA具有重要意义。UDCA的合成方法主要有全化学法合成和化学酶法相结合的方法，起始原料为动物来源的胆酸(CA)或去氧胆酸(如CDCA)。
(I)熊去氧胆酸(UDCA)
(II)鹅去氧胆酸(CDCA)
(III)胆酸(CA)
(IV)3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸(7KLCA)
UDCA的经典化学合成方法如下。因为化学氧化是非选择性的，所以必须借助酯化来保护3α-和7α-羟基。此外，7-酮基石胆酸(7-KLCA)的还原用到金属钠或者Pd/C催化氢化，选择性低，工业化放大生产不容易控制且不安全。
PCT/EP2009/002190里描述(如下)使用12α-类固醇脱氢酶(12α-HSDH)选择性地将胆酸(CA)氧化成12酮-去氧胆酸(12酮-CDCA)，避免了两个保护步骤，但是仍然需要7-KLCA的还原步骤。
胆酸→12-酮-CDCA→CDCA→7-KLCA→UDCA
Monti,D.,等(Advanced Synthesis&Catalysis 2009,351,1303-1311)描述了另外一种酶促转化方法。首先通过来自脆弱杆菌ATCC 25285的7α-HSDH和12α-HSDH(Tetrahedron,2006,62(18):4535-4539)将CA氧化成7，12-二酮-LCA，然后通过梭菌ATCC27555的7β-HSDH(Biochim Biophys Acta,1981,665(2):262-269)的还原而形成12-酮-UDCA，最后通过wolff-kishner还原反应获得终产物。整个反应需要三种酶的参与，以及相关辅酶的再生系统(乳酸脱氢酶和葡萄糖脱氢酶)，使得整个过程比较复杂。而且因为催化反应的平衡问题，完全转化是不可能的。
CA→7，12-二酮-LCA→12-酮-UDCA→UDCA
Hirano和Masuda描述了来自产气柯林斯菌ATCC 25986的NADP+依赖性的7β-HSDH(Appl Environ Microbiol,1982,43(5):1057-1063),但是没有公开序列信息。2007年ATCC25986基因组测序完成，2011年Rolf D.Schmid和德国细胞制药公司将此7β-HSDH基因高效表达于大肠杆菌中，鉴定了它的酶学性质并用于还原7，12-二酮-LCA或者7-KLCA获得12-酮-UDCA或者UDCA(Appl Microbiol Biotechnol,2011,90:127-135),发现此酶表现出高的选择性不会形成副产物。德国细胞制药公司在此序列基础上继续优化得到了活性提高和去除底物抑制的突变子(CN201080062617，CN201180067680),重组产生的酶7β-HSDH的高转化率和高专一性使得UDCA的酶法大规模生产成为可能。此外，华东理工大学许建和从扭链瘤胃球菌Ruminococcus torques ATCC35915克隆并高效表达了其7β-HSDH基因，UDCA的酶法合成试验证明了此酶也具有与产气柯林斯菌来源的7β-HSDH相似的、对底物7-KLCA的高转化率和高特异性。尽管如此，上述由不同来源的7β-HSDH催化的UDCA的合成反应，使用低的底物浓度(4～40g/L),而且在40g/L的底物浓度下转化率只有90％,产品收率仅71％。一般情况下，酶转化工艺使用100g/L或者更高底物浓度，且转化率要接近100％,才可视为具有工业化生产的意义，故表明此酶促反应离工业化大规模生产还有一定的距离。此外，上述不同的UDCA的酶促合成反应中使用的底物7-KLCA依然依赖于鹅去氧胆酸的化学氧化；反应中使用游离酶，因为整个反应需要多种酶与辅酶德的参与，使得整个过程比较复杂而在工业化生产中难以实现。
发明内容
本发明的目的是获得一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法。涉及一种在大肠肝菌细胞中高效表达双酶的方法，使用这种方法构建的共表达7α-类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的重组大肠杆菌，以及构建的共表达7β-类固醇脱氢酶(7β-HSDH)突变子和醇脱氢酶(LKADH)的重组大肠杆菌；本发明也包括上述酶基因序列、编码的酶蛋白序列、产生此类酶的方法，以及上述重组大肠杆菌全细胞在胆酸化合物的酶促合成中，特别是在熊去氧胆酸(UDCA)合成中的用途；此外，本发明也包括使用全细胞合成UDCA的新方法，以及UDCA的后提取方法。
技术方案
一种串联形成双基因表达模块，其特征在于双基因表达模块为模块1或模块
2；其中所述模块1的序列依次由Seq ID NO：1，Seq ID NO:5，Seq ID NO:
2，Seq ID NO:3组成；所述模块2的序列依次由Seq ID NO：1，Seq ID NO:
9，Seq ID NO:2，Seq ID NO:7组成。
一种重组大肠杆菌，其特征在于含有权利要求1所述的模块1。
一种重组大肠杆菌，其特征在于含有权利要求2所述的模块2.
一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于由如下步骤实现：
A、采用含有模块1的重组大肠杆菌细胞催化底物鹅去氧胆酸CDCA合成3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA，反应液酸化后得到3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA粗品，同时采用乳酸脱氢酶及丙酮酸钠使得辅酶循环再生；
B、采用含有模块2的重组大肠杆菌细胞催化步骤A中所述的3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA粗品，反应液液酸化过滤后得到UDCA粗品，同时采用醇脱氢酶及异丙醇使得辅酶循环再生。
所述的一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于所述的熊去氧胆酸粗品在有机溶剂中加碱溶解、回流、过滤除去固形物以及酸化分离的获得精制成品。
具体介绍如下：
一种如附图2所示，使用单一启动子和双核糖体结合位点(Ribosome Bindingsite,RBS)在大肠杆菌中实现双基因高效共表达的方法,其特征在于所述的每个基因前有一段包含核糖体结合位点的序列以实现双基因的高效表达，此序列如Seq ID NO:1和SeqID NO:2。使用上述方法构建的共表达7α-类固醇脱氢酶(7α-HSDH)基因和乳酸脱氢酶(LDH)基因的重组大肠杆菌,其中7α-类固醇脱氢酶基因来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K-12，基因序列如Seq ID NO:3所示，其编码的蛋白序列如Seq ID NO：4；乳酸脱氢酶基因来源于魏斯氏菌(Weissella sp.),基因序列如Seq ID NO:5所示，其编码的蛋白序列如Seq IDNO：6。
上述重组大肠杆菌细胞的应用，其特征在于所述的使用全细胞催化鹅去氧胆酸CDCA合成熊去氧胆酸UDCA前体3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA，反应中所需要的辅酶由细胞自身的乳酸脱氢酶催化丙酮酸钠而合成，从而实现辅酶的循环再生。
使用上述方法构建的共表达7β-类固醇脱氢酶(7β-HSDH)基因和醇脱氢酶(LKADH)基因的重组大肠杆菌，其中7β-类固醇脱氢酶基因为来源于活波瘤胃菌属(Ruminococcusgnavus)的突变子，基因序列如Seq ID NO:7所示，其编码的蛋白序列如Seq ID NO：8；密码子优化的醇脱氢酶基因来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)，基因序列如SeqID NO:9所示，其编码的蛋白序列如Seq ID NO:10。
上述重组大肠杆菌细胞的应用，其特征在于所述的使用全细胞催化3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA,反应中所需要的辅酶由细胞自身的醇脱氢酶催化异丙醇而合成，从而实现辅酶的循环再生。
一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于采用上述重组大肠杆菌细胞催化底物鹅去氧胆酸CDCA合成3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA，反应液酸化后得到7-KLCA粗品，同时采用所述乳酸脱氢酶(LDH)及丙酮酸钠使得辅酶循环再生；其特征也在于采用所述的重组大肠杆菌细胞催化如上所述的3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA粗品，反应液液酸化过滤后得到UDCA粗品，同时采用上述醇脱氢酶及异丙醇使得辅酶循环再生。
所述的一种熊去氧胆酸的合成方法，其特征在于获得熊去氧胆酸粗品在有机溶剂中加碱溶解、回流、过滤除去固形物以及酸化分离的获得精制成品。
本发明原理：
本发明提供的用于熊去氧胆酸UDCA合成的方法如附图1所示。以鹅去氧胆酸为底物，通过使用共表达来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K-12的7α-类固醇脱氢酶基因和来源于魏斯氏菌(Weissella sp.)的乳酸脱氢酶基因的重组大肠杆菌细胞，将鹅去氧胆酸氧化成3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA，同时使用细胞自带的乳酸脱氢酶/丙酮酸钠体系来实现辅酶NAD+的循环再生。进一步通过使用共表达来源于活波瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)的7β-类固醇脱氢酶突变子基因和来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)的醇脱氢酶基因的重组大肠杆菌细胞，将3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA一步还原成熊去氧胆酸UDCA，同时使用细胞自带的醇脱氢酶/异丙醇体系来实现辅酶NADP+的循环再生。上述的重组大肠杆菌全细胞催化体系能高效地、专一地将高浓度底物鹅去氧胆酸转化成UDCA，从而能实现酶法UDCA合成的工业化生产。
本发明的目的是具体通过以下技术方案实现的：
1、共表达7α-类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的重组大肠杆菌细胞的构建以及摇瓶发酵和酶活鉴定
如附图2所示，来源于大肠杆菌(Escherichia coli)K-12的7α-类固醇脱氢酶基因(基因序列：Seq NO:3,编码的蛋白序列：Seq ID NO：4)和来源于魏斯氏菌(Weissella sp.)的乳酸脱氢酶基因(基因序列：Seq ID NO:5,编码的蛋白序列：Seq ID NO：6)通过特定的连接序列(Seq ID NO:1)串联后。将上述合成的串联的双基因插入到表达载体pET21a(+)的NdeI和XhoI位点得到含双基因表达模块的重组DNA pET21a(+)-LDH-7αHSDH。经过测序验证后，此重组DNA转入大肠杆菌宿主BL21(DE3)。获得的重组大肠杆菌接种在小体积的LB培养基(100μg/mL氨苄)中，30～37℃过夜培养后，以5-10％的接种量接入相应体积的LB培养基(100μg/mL氨苄)中，继续在30～37℃培养直至OD600达到1.0。加入终浓度为0.1～0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在25～30℃下诱导表达3～5小时后离心收集细胞。细胞悬浮于1/20发酵液体积的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)并超声破碎，离心后得到重组的7α-HSDH和LDH混合粗酶液。7α-HSDH酶活测定以鹅去氧胆酸为底物,在一个3mL的反应混合物中包含:2.89mL的0.2mM NAD+(50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0中配制),10μL的150mM鹅去氧胆酸,100μL稀释的酶液,在340nm处测定吸光值增加。LDH酶活测定以丙酮酸钠为底物,在一个3mL的反应混合物中包含:2.8mL的0.2mM NADH(50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0中配制),100μL的34mM丙酮酸钠,100μL稀释的酶液,在340nm处测定吸光值减少。二者酶活性单位(单位/mL)计算公式为：[△A340/分钟×3(mL)×粗酶稀释倍数]/[6.22×0.1(mL)]。
表一 大肠杆菌共表达双酶7α-HSDH和LDH的摇瓶发酵酶活
| 酶名称 | 酶活(单位/mL酶液) |
| 7α-HSDH | 698.8±67.9 |
| LDH | 1069.2±114.3 |
2、共表达7β-类固醇脱氢酶(7β-HSDH)和醇脱氢酶(LKADH)的重组大肠杆菌细胞的构建以及摇瓶发酵和酶活鉴定
如附图2所示，来源于活波瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)的密码子优化的7β-类固醇脱氢酶突变子基因(基因序列：Seq ID NO:7,编码的蛋白序列：Seq ID NO：8)和来源于高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)的醇脱氢酶基因(基因序列：Seq ID NO:9,编码的蛋白序列：Seq ID NO：10)通过特定的连接序列(Seq NO:1)串联。将上述合成的串联的双基因插入到表达载体pET21a(+)的NdeI和HindIII位点得到含双基因表达模块的重组DNApET21a(+)-LKADH-7βHSDH。经过测序验证后，此重组DNA转入大肠杆菌宿主BL21(DE3)。获得的重组大肠杆菌接种在小体积的LB培养基(100μg/mL氨苄)中，30～37℃过夜培养后，以5-10％的接种量接入相应体积的LB培养基(100μg/mL氨苄)中，继续在30～37℃培养直至OD600达到1.0。加入终浓度为0.1～0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)，在25～30℃下诱导表达3～5小时后离心收集细胞。细胞悬浮于1/20发酵液体积的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)并超声破碎，离心后得到重组的7β-HSDH和LKADH混合粗酶液。7β-HSDH酶活测定以熊去氧胆酸为底物,在一个3mL的反应混合物中包含:2.89mL的0.2mM NADP+(50mM磷酸钾缓冲液，pH8.0中配制),10μL的150mM熊去氧胆酸,100μL稀释的酶液,在340nm处测定吸光值增加。酶活性单位(单位/mL)计算公式为：[△A340/分钟×3(mL)×粗酶稀释倍数]/[6.22×0.1(mL)]。醇脱氢酶LKADH酶活测定方法见US8257952。
表二 大肠杆菌共表达双酶7β-HSDH和LKADH的摇瓶发酵酶活
| 酶名称 | 酶活(单位/mL酶液) |
| 7β-HSDH | 114.0±28.8 |
| LKADH | 33.4±4.5 |
3、共表达双酶(LDH-7αHSDH或者LKADH-7βHSDH)的重组大肠杆菌细胞的高密度发酵产酶
将平板上单菌落接种到250～500mLLB培养基(100μg/mL氨苄)中,在30～37℃下振荡培养12～16小时。由此方法得到的种子液以5～10％的量接种到5L的起始培养基中,起始培养基含有:15～30g/L的甘油,25～30g/L的磷酸二氢钾,10～15g/L的硫酸胺,5-10g/L的七水硫酸镁,0.2～0.5g/L的七水硫酸铁。重组大肠杆菌在10L发酵罐里进行通气搅拌培养，温度30～37℃，pH6.0～7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在15-30％。待起始培养基里的甘油耗尽后，开始流加诱导培养基(乳糖：40～50g/L，甘油：200-250g/L)诱导酶的产生。流加速度逐步增加，范围为60-250mL/小时。温度30～37℃，pH6.0～7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在15-30％，总的诱导时间为8-12小时，直至细胞湿重达到100g/L以上。离心收集细胞于-20℃保存，用于催化鹅去氧胆酸CDCA合成熊去氧胆酸UDCA前 体7-KLCA或者催化7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA。取少量细胞悬浮于同体积发酵液的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中并超声破碎，离心后得到重组混合酶液后用于酶活测定。
表三 大肠杆菌共表达双酶7α-HSDH和LDH的高密度发酵酶活
| 酶名称 | 酶活(单位/mL酶液) |
| 7α-HSDH | 482.0±72.1 |
| LDH | 938.1±172.4 |
表四 大肠杆菌共表达双酶7β-HSDH和LKADH的高密度发酵酶活
| 酶名称 | 酶活(单位/mL酶液) |
| 7β-HSDH | 141.9±9.8 |
| LKADH | 44.7±7.1 |
4、重组大肠杆菌全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸以及熊去氧胆酸的提取和精制
全细胞催化鹅去氧胆酸CDCA合成熊去氧胆酸UDCA前体7-KLCA:将鹅去氧胆酸悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH7.8)中，用2N NaOH调节pH至8.0。加入共表达7α-类固醇脱氢酶和乳酸脱氢酶的的大肠杆菌BL21(DE3)湿细胞(25％总反应体积，W/V)、0.1～0.5mM NAD+和340mM丙酮酸钠补充50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)至最终反应体积。底物终浓度在100g/L，反应在25℃、300～400rpm和pH7.8～8.0下进行,反应时间20～24小时。每隔一定时间取样在甲醇里稀释50～100倍，微孔过滤后10μL进样液相分析。液相检测使用安捷伦C-18柱为分析柱，1mM磷酸二氢钾：乙腈＝45:55(体积比)为洗脱剂，柱温35℃，检测波长210nm。反应结束后，用2N NaOH调节反应液pH至产物全部溶解，然后加入0.5～1.0％硅藻土在50～60℃搅拌0.5～1小时后过滤。滤液在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2.0左右，继续搅拌20～30分钟后过滤得到7-KLCA粗品。
全细胞催化7-KLCA合成熊去氧胆酸UDCA：将7-KLCA悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，用2N NaOH调节pH至8.0。加入共表达7β-类固醇脱氢酶和醇脱氢酶的的大肠杆菌BL21(DE3)湿细胞(25％总反应体积，W/V)、0.1～0.5mM NADP+和20～35％异丙醇后补充50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)至最终反应体积。底物终浓度在100g/L，反应在25℃、300～400rpm和pH7.8～8.0下进行,反应时间20～24小时。每隔一定时间取样，按照上述方法进行样品处理和液相分析。反应结束后，用2N NaOH调节反应液pH至产物全部溶解，然后加入0.5～1.0％硅藻土在50～60℃搅拌0.5～1小时后过滤。滤液在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2.0左右，继续搅拌20～30分钟后过滤得到熊去氧胆酸粗品。
熊去氧胆酸粗品的精制：在有机溶剂如乙酸乙酯里加入25-30％(重量比)的熊去氧胆酸粗品，加热到60～70℃用碱(如三乙胺)溶解后，继续搅拌回流1～2小时。待上述溶液冷却并过滤除去固形物后，用盐酸溶液调节滤液pH至2.0左右,过滤得到的结晶真空干燥后得到精制的熊去氧胆酸。
表五 重组大肠杆菌全细胞催化鹅去氧胆酸CDCA合成熊去氧胆酸UDCA
有益效果
1、使用高效共表达7α-类固醇脱氢酶(7α-HSDH)和乳酸脱氢酶(LDH)的重组大肠杆菌,以及高效共表达7β-类固醇脱氢酶(7β-HSDH)和醇脱氢酶(LKADH)的重组大肠杆菌全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸，反应体系无需额外添加辅酶再生用酶，各步反应底物浓度高达100g/L，转化率大于99.5％，熊去氧胆酸总的重量收率88-94％；
2、大肠杆菌细胞可以通过发酵方法廉价易得，无需酶的提取和纯化，生产成本和产品质量优于化学合成方法，适合于工业化生产；
3、酶促反应条件温和，不使用化学法用到的金属钠或者Pd/C等催化氢化还原剂，工业化放大生产容易控制而且安全。产生的废水容易处理，环境友好；
4、酶促反应选择性高，与化学法比较副产物少，产品后提取和精制简单。
附图说明
图1重组大肠杆菌全细胞催化的熊去氧胆酸的合成以及辅酶NAD+/NADP+的循环再生。
图2使用单一启动子和双核糖体结合位点(Ribosome Binding site,RBS)在大肠杆菌中实现双基因的高效共表达。
具体实施方式
实施例1
将含有重组DNA pET21a(+)-LDH-7αHSDH的大肠杆菌BL21(DE3)接种到含有50mLLB培养基(100μg/mL氨苄)的250mL三角摇瓶中，37℃和300转/份过夜培养后，以10％的接种量接入装有400mLLB培养基(100μg/mL氨苄)的2L摇瓶中，继续在37℃和300转/分下培养2小时直至OD600达到1.0。加入终浓度为0.2mM的IPTG，在25℃下诱导表达4小时后离心收集细胞。细胞悬浮于20mL100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中超声破碎，离心后得到重组混合粗酶液，7α-HSDH和LDH酶活分别为747.0单位/mL、1083单位/mL。
实施例2
使用和实施例1同样的方法来对含有重组DNA pET21a(+)-LKADH-7βHSDH的大肠杆菌BL21(DE3)进行摇瓶发酵。诱导时间为4小时。离心收集细胞。细胞悬浮于20mL100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中超声破碎，离心后得到重组混合粗酶液，7β-HSDH和LKADH酶活分别为131.8单位/mL、32.0单位/mL。
实施例3
将含有重组DNA pET21a(+)-LDH-7αHSDH的大肠杆菌BL21(DE3)平板上单菌落接种到两个装有250mLLB培养基(100μg/mL氨苄)的1L摇瓶中,在37℃和300转/分下振荡培养15小时。将两个摇瓶里的种子液合并成500mL，接种到5L的起始培养基中,起始培养基含有:30g/L的甘油,25g/L的磷酸二氢钾,10g/L的硫酸胺,10g/L的七水硫酸镁,0.4g/L的七水硫酸铁。重组大肠杆菌在10L发酵罐里进行通气搅拌培养，温度30℃，pH7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在25％。待起始培养基里的甘油耗尽后，开始流加诱导培养基(乳糖：50g/L，甘油：200g/L)诱导酶的产生。流加速度为60-250mL/小时，在3小时内逐步达到最大流速。温度30℃，pH7.0,调节搅拌和通气控制溶氧在25％。总的诱导时间为10小时，细胞湿重达到115g/L。离心收集细胞，并于-20度保存用于后续合成反应。称取50g湿细胞，悬浮于440mL的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中并超声破碎，离心后得到重组混合酶液。7α-HSDH和LDH酶活分别为431.0单位/mL、816.2单位/mL。
实施例4
使用和实施例3同样的方法来对含有重组DNA pET21a(+)-LKADH-7βHSDH的大肠杆菌BL21(DE3)进行发酵，总的诱导时间为9小时，细胞湿重达到110g/L。离心收集细胞，并于-20℃保存用于后续合成反应。称取50g湿细胞，悬浮于450mL的100mM的磷酸缓冲液(pH8.0)中并超声破碎，离心后得到重组混合酶液。7β-HSDH和LKADH酶活分别为148.8单位/mL、49.7单位/mL。
实施例5
取100g含量为99.89％的鹅去氧胆酸,悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH7.8)中，用2NNaOH调节pH至8.0。加入实施例3的重组大肠杆菌湿细胞25g、500mg辅酶NAD+二钠盐和37.4g丙酮酸钠后开始反应。总的反应体积为1000mL，底物终浓度在100g/L。反应在25℃、350rpm和pH7.8～8.0下进行,6小时后转化率为99.8％。反应液用2N NaOH调节其pH至产物全部溶解。加入1.0％硅藻土在50～60℃搅拌1小时后过滤。滤液冷却后，在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2.0左右，继续搅拌30分钟后过滤得到7-KLCA粗品。
实施例6
将实施例5得到的全部7-KLCA粗品,悬浮在50mM磷酸钾缓冲液(pH8.0)中，用2NNaOH调节pH至8.0。加入实施例4的重组大肠杆菌湿细胞25g、300mg辅酶NADP+二钠盐和330mL异丙醇后开始反应。总的反应体积为1000mL，底物终浓度约100g/L。反应在25℃、350rpm和pH7.8～8.0下进行,20小时后转化率为99.6％。反应液用2N NaOH调节其pH至产物全部溶解。加入1.0％硅藻土在50～60℃搅拌1小时后过滤。滤液冷却后，在快速搅拌的情况下缓慢滴加盐酸溶液至pH为2.0左右，继续搅拌30分钟后过滤得到熊去氧胆酸，初步烘干后得到131.0g熊去氧胆酸粗品
实施例7
在330mL乙酸乙酯中加入实施例6得到的全部熊去氧胆酸粗品，加热到60～70℃滴加三乙胺溶解后，继续搅拌回流2小时。待上述溶液冷却并过滤除去固形物后，用盐酸溶液调节滤液pH至2.0左右,过滤得到的结晶真空干燥后得到精制的熊去 氧胆酸93.95g，从鹅去氧胆酸CDCA的重量收率约为94％，经检测符合欧洲药典标准。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京普瑞特生物科技有限公司
刘志斌
<120> 一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法
<130>
<160> 10
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 串联双基因含RBS的前导序列
<220>
<221> Unsure
<222> (1)..(14)
<400> 1
aaggagatat acat 14
<210> 2
<211> 14
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 串联双基因之间含RBS的连接序列
<220>
<221> Unsure
<222> (1)..(14)
<400> 2
aaggagatat atat 14
<210> 3
<211> 768
<212> DNA
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）K-12
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(768)
<400> 3
atg ttt aat tct gac aac ctg aga ctc gac gga aaa tgc gcc atc atc 48
Met Phe Asn Ser Asp Asn Leu Arg Leu Asp Gly Lys Cys Ala Ile Ile
1 5 10 15
aca ggt gcg ggt gca ggt att ggt aaa gaa atc gcc att aca ttc gcg 96
Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ile Gly Lys Glu Ile Ala Ile Thr Phe Ala
20 25 30
aca gct ggc gca tct gtg gtg gtc agt gat att aac gcc gac gca gct 144
Thr Ala Gly Ala Ser Val Val Val Ser Asp Ile Asn Ala Asp Ala Ala
35 40 45
aac cat gtt gta gac gaa att caa caa ctg ggt ggt cag gca ttt gcc 192
Asn His Val Val Asp Glu Ile Gln Gln Leu Gly Gly Gln Ala Phe Ala
50 55 60
tgc cgt tgt gat att act tcc gaa cag gaa ctc tct gca ctg gca gac 240
Cys Arg Cys Asp Ile Thr Ser Glu Gln Glu Leu Ser Ala Leu Ala Asp
65 70 75 80
ttt gct atc agt aag ctg ggt aaa gtt gat att ctg gtt aac aac gcc 288
Phe Ala Ile Ser Lys Leu Gly Lys Val Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala
85 90 95
ggt ggc ggt gga cct aaa ccg ttt gat atg cca atg gcg gat ttt cgc 336
Gly Gly Gly Gly Pro Lys Pro Phe Asp Met Pro Met Ala Asp Phe Arg
100 105 110
cgt gct tat gaa ctg aat gtg ttt tct ttt ttc cat ctg tca caa ctt 384
Arg Ala Tyr Glu Leu Asn Val Phe Ser Phe Phe His Leu Ser Gln Leu
115 120 125
gtt gcg cca gaa atg gaa aaa aat ggc ggt ggc gtt att ctg acc atc 432
Val Ala Pro Glu Met Glu Lys Asn Gly Gly Gly Val Ile Leu Thr Ile
130 135 140
act tct atg gcg gca gaa aat aaa aat ata aac atg act tcc tat gca 480
Thr Ser Met Ala Ala Glu Asn Lys Asn Ile Asn Met Thr Ser Tyr Ala
145 150 155 160
tca tct aaa gct gcg gcc agt cat ctg gtc aga aat atg gcg ttt gac 528
Ser Ser Lys Ala Ala Ala Ser His Leu Val Arg Asn Met Ala Phe Asp
165 170 175
ctg ggt gaa aaa aat att cgg gta aat ggc att gcg ccg ggg gca ata 576
Leu Gly Glu Lys Asn Ile Arg Val Asn Gly Ile Ala Pro Gly Ala Ile
180 185 190
tta acc gat gcc ctg aaa tcc gtt att aca cca gaa att gaa caa aaa 624
Leu Thr Asp Ala Leu Lys Ser Val Ile Thr Pro Glu Ile Glu Gln Lys
195 200 205
atg tta cag cac acg ccg atc aga cgt ctg ggc caa ccg caa gat att 672
Met Leu Gln His Thr Pro Ile Arg Arg Leu Gly Gln Pro Gln Asp Ile
210 215 220
gct aac gca gcg ctg ttc ctt tgc tcg cct gct gcg agc tgg gta agc 720
Ala Asn Ala Ala Leu Phe Leu Cys Ser Pro Ala Ala Ser Trp Val Ser
225 230 235 240
gga caa att ctc acc gtc tcc ggt ggt ggg gta cag gag ctc aat taa 768
Gly Gln Ile Leu Thr Val Ser Gly Gly Gly Val Gln Glu Leu Asn
245 250 255
<210> 4
<211> 255
<212> PRT
<213> 大肠杆菌（Escherichia coli）K-12
<400> 4
Met Phe Asn Ser Asp Asn Leu Arg Leu Asp Gly Lys Cys Ala Ile Ile
1 5 10 15
Thr Gly Ala Gly Ala Gly Ile Gly Lys Glu Ile Ala Ile Thr Phe Ala
20 25 30
Thr Ala Gly Ala Ser Val Val Val Ser Asp Ile Asn Ala Asp Ala Ala
35 40 45
Asn His Val Val Asp Glu Ile Gln Gln Leu Gly Gly Gln Ala Phe Ala
50 55 60
Cys Arg Cys Asp Ile Thr Ser Glu Gln Glu Leu Ser Ala Leu Ala Asp
65 70 75 80
Phe Ala Ile Ser Lys Leu Gly Lys Val Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala
85 90 95
Gly Gly Gly Gly Pro Lys Pro Phe Asp Met Pro Met Ala Asp Phe Arg
100 105 110
Arg Ala Tyr Glu Leu Asn Val Phe Ser Phe Phe His Leu Ser Gln Leu
115 120 125
Val Ala Pro Glu Met Glu Lys Asn Gly Gly Gly Val Ile Leu Thr Ile
130 135 140
Thr Ser Met Ala Ala Glu Asn Lys Asn Ile Asn Met Thr Ser Tyr Ala
145 150 155 160
Ser Ser Lys Ala Ala Ala Ser His Leu Val Arg Asn Met Ala Phe Asp
165 170 175
Leu Gly Glu Lys Asn Ile Arg Val Asn Gly Ile Ala Pro Gly Ala Ile
180 185 190
Leu Thr Asp Ala Leu Lys Ser Val Ile Thr Pro Glu Ile Glu Gln Lys
195 200 205
Met Leu Gln His Thr Pro Ile Arg Arg Leu Gly Gln Pro Gln Asp Ile
210 215 220
Ala Asn Ala Ala Leu Phe Leu Cys Ser Pro Ala Ala Ser Trp Val Ser
225 230 235 240
Gly Gln Ile Leu Thr Val Ser Gly Gly Gly Val Gln Glu Leu Asn
245 250 255
<210> 5
<211> 996
<212> DNA
<213> 魏斯氏菌（Weissella sp.）
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(996)
<400> 5
atg aag att ttt gca tac gga att cgt gaa gac gaa caa cct gct ttg 48
Met Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Glu Asp Glu Gln Pro Ala Leu
1 5 10 15
aag gcc tgg att gct gca cat cca gag gtt act gtt gaa ttt act gac 96
Lys Ala Trp Ile Ala Ala His Pro Glu Val Thr Val Glu Phe Thr Asp
20 25 30
caa ctt ttg gac cct gaa act gct aag tta gca gaa ggt ttc gat gct 144
Gln Leu Leu Asp Pro Glu Thr Ala Lys Leu Ala Glu Gly Phe Asp Ala
35 40 45
gtt aat gta tat caa caa ttg gac tac aca cgt gag act ttg aca gcc 192
Val Asn Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Thr Leu Thr Ala
50 55 60
ttg cat gag ttg gga att aac aag atg tca ttg cgt aat gtt gga act 240
Leu His Glu Leu Gly Ile Asn Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly Thr
65 70 75 80
gac aac att gac ttt gat gct gca cgt gag ttt gat ttt tca atc tca 288
Asp Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Arg Glu Phe Asp Phe Ser Ile Ser
85 90 95
aat gtc cca gtt tac tca cct aat gca att gct gaa cac tca atc atc 336
Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Ile Ile
100 105 110
caa atg tca cgt ttg ctt cgt cgg act aag gca atg gat gct aag gtt 384
Gln Met Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Met Asp Ala Lys Val
115 120 125
gct aag cat gac ttg cgc tgg gca cca aca att ggt cgc gag atg cgg 432
Ala Lys His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met Arg
130 135 140
atg caa aca gtt ggt gtt atc gga act ggt aac atc ggc cgt gtt gca 480
Met Gln Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Asn Ile Gly Arg Val Ala
145 150 155 160
atg aag att cta aag ggc ttt ggg gct aag gtc att gct tat gac ttg 528
Met Lys Ile Leu Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Leu
165 170 175
tac cac aat gct gaa gtt gaa gct gaa ggt cta tac gta gat act ttg 576
Tyr His Asn Ala Glu Val Glu Ala Glu Gly Leu Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
gaa gag ttg tat gca caa gct gac gta att act ttg tac gtt cca ggt 624
Glu Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Thr Leu Tyr Val Pro Gly
195 200 205
gta cca gct aac cac cac atg att aat gct gat tca atc gct aag atg 672
Val Pro Ala Asn His His Met Ile Asn Ala Asp Ser Ile Ala Lys Met
210 215 220
aaa gat ggc gtt gta atc gta aat tgc tca cgt gga aac ttg atg gat 720
Lys Asp Gly Val Val Ile Val Asn Cys Ser Arg Gly Asn Leu Met Asp
225 230 235 240
att gac gat gta atc gct ggt ttg gac tca ggt aag att tct gac ttc 768
Ile Asp Asp Val Ile Ala Gly Leu Asp Ser Gly Lys Ile Ser Asp Phe
245 250 255
gca atg gat gtt tac gaa gaa gaa gtt ggt ttg ttc aat gtt gat tgg 816
Ala Met Asp Val Tyr Glu Glu Glu Val Gly Leu Phe Asn Val Asp Trp
260 265 270
tca aac aaa gaa ttc cca gat gct aag att gct gat ttg att gct cgt 864
Ser Asn Lys Glu Phe Pro Asp Ala Lys Ile Ala Asp Leu Ile Ala Arg
275 280 285
gag aac gtt ttg gtt aca cca cac act gct ttc tac aca act aag gct 912
Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Ala
290 295 300
gta ttg gaa atg gtt act caa tca atg aat gct tca ttg gct ttc att 960
Val Leu Glu Met Val Thr Gln Ser Met Asn Ala Ser Leu Ala Phe Ile
305 310 315 320
aat ggt gag aag cca tca atc gct gtt gaa tac taa 996
Asn Gly Glu Lys Pro Ser Ile Ala Val Glu Tyr
325 330
<210> 6
<211> 331
<212> PRT
<213> 魏斯氏菌（Weissella sp.）
<400> 6
Met Lys Ile Phe Ala Tyr Gly Ile Arg Glu Asp Glu Gln Pro Ala Leu
1 5 10 15
Lys Ala Trp Ile Ala Ala His Pro Glu Val Thr Val Glu Phe Thr Asp
20 25 30
Gln Leu Leu Asp Pro Glu Thr Ala Lys Leu Ala Glu Gly Phe Asp Ala
35 40 45
Val Asn Val Tyr Gln Gln Leu Asp Tyr Thr Arg Glu Thr Leu Thr Ala
50 55 60
Leu His Glu Leu Gly Ile Asn Lys Met Ser Leu Arg Asn Val Gly Thr
65 70 75 80
Asp Asn Ile Asp Phe Asp Ala Ala Arg Glu Phe Asp Phe Ser Ile Ser
85 90 95
Asn Val Pro Val Tyr Ser Pro Asn Ala Ile Ala Glu His Ser Ile Ile
100 105 110
Gln Met Ser Arg Leu Leu Arg Arg Thr Lys Ala Met Asp Ala Lys Val
115 120 125
Ala Lys His Asp Leu Arg Trp Ala Pro Thr Ile Gly Arg Glu Met Arg
130 135 140
Met Gln Thr Val Gly Val Ile Gly Thr Gly Asn Ile Gly Arg Val Ala
145 150 155 160
Met Lys Ile Leu Lys Gly Phe Gly Ala Lys Val Ile Ala Tyr Asp Leu
165 170 175
Tyr His Asn Ala Glu Val Glu Ala Glu Gly Leu Tyr Val Asp Thr Leu
180 185 190
Glu Glu Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Val Ile Thr Leu Tyr Val Pro Gly
195 200 205
Val Pro Ala Asn His His Met Ile Asn Ala Asp Ser Ile Ala Lys Met
210 215 220
Lys Asp Gly Val Val Ile Val Asn Cys Ser Arg Gly Asn Leu Met Asp
225 230 235 240
Ile Asp Asp Val Ile Ala Gly Leu Asp Ser Gly Lys Ile Ser Asp Phe
245 250 255
Ala Met Asp Val Tyr Glu Glu Glu Val Gly Leu Phe Asn Val Asp Trp
260 265 270
Ser Asn Lys Glu Phe Pro Asp Ala Lys Ile Ala Asp Leu Ile Ala Arg
275 280 285
Glu Asn Val Leu Val Thr Pro His Thr Ala Phe Tyr Thr Thr Lys Ala
290 295 300
Val Leu Glu Met Val Thr Gln Ser Met Asn Ala Ser Leu Ala Phe Ile
305 310 315 320
Asn Gly Glu Lys Pro Ser Ile Ala Val Glu Tyr
325 330
<210> 7
<211> 792
<212> DNA
<213> 活波瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(792)
<400> 7
atg acc atg cgt gaa aaa tac ggc gaa tgg ggc att atc ctg ggc gct 48
Met Thr Met Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
acg gaa ggt gtt ggt aaa gca ttc tgt gaa cgt ctg gca aaa gaa ggc 96
Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Arg Leu Ala Lys Glu Gly
20 25 30
atg aac gtg gtt atg gtg ggt cgt cgc gaa gaa aaa ctg aaa gaa ctg 144
Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Lys Glu Leu
35 40 45
ggc gaa gaa ctg aaa aac acc tat gaa atc gat tac aaa gtc gtg aaa 192
Gly Glu Glu Leu Lys Asn Thr Tyr Glu Ile Asp Tyr Lys Val Val Lys
50 55 60
gcg gac ttt tct ctg ccg gat gcc acc gac aaa atc ttc gcg gcc acg 240
Ala Asp Phe Ser Leu Pro Asp Ala Thr Asp Lys Ile Phe Ala Ala Thr
65 70 75 80
gaa aac ctg gat atg ggc ttt atg gcg tat gtg gct tgc ctg cat agc 288
Glu Asn Leu Asp Met Gly Phe Met Ala Tyr Val Ala Cys Leu His Ser
85 90 95
ttc ggt aaa att cag gac acc ccg tgg gaa aaa cac gaa gcc atg atc 336
Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Ala Met Ile
100 105 110
aac gtg aac gtt gtc acg ttc atg aaa tgt ttc tac cat tac atg aaa 384
Asn Val Asn Val Val Thr Phe Met Lys Cys Phe Tyr His Tyr Met Lys
115 120 125
atc ttt gca gct cag gat cgt ggt gcg gtc att aac gtg agc agc atg 432
Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Met
130 135 140
acc ggc atc agt tcc tca ccg tgg aat ggt caa tac ggc gcg ggt aaa 480
Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln Tyr Gly Ala Gly Lys
145 150 155 160
gcc ttc att ctg aaa atg acg gaa gcg gtt gcc tgc gaa acc gaa aaa 528
Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Thr Glu Lys
165 170 175
acg aac gtc gat gtg gaa gtt atc acc ctg ggc acc acg ctg acg ccg 576
Thr Asn Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Leu Thr Pro
180 185 190
tcg ctg ctg agc aat ctg ccg ggc ggt ccg cag ggt gaa gca gtg atg 624
Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln Gly Glu Ala Val Met
195 200 205
aaa aac gct caa acg ccg gaa gaa gtg gtt gat gaa gcg ttt gaa aaa 672
Lys Asn Ala Gln Thr Pro Glu Glu Val Val Asp Glu Ala Phe Glu Lys
210 215 220
ctg ggc aaa gaa ctg tct gtt att agt ggt gaa cgt aac aaa gca tcc 720
Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ser Gly Glu Arg Asn Lys Ala Ser
225 230 235 240
gtc cat gac tgg aaa gct aat cac act gaa gat gac tat atc cgc tac 768
Val His Asp Trp Lys Ala Asn His Thr Glu Asp Asp Tyr Ile Arg Tyr
245 250 255
atg ggc agc ttc tat caa gaa taa 792
Met Gly Ser Phe Tyr Gln Glu
260
<210> 8
<211> 263
<212> PRT
<213> 活波瘤胃菌属(Ruminococcus gnavus)
<400> 8
Met Thr Met Arg Glu Lys Tyr Gly Glu Trp Gly Ile Ile Leu Gly Ala
1 5 10 15
Thr Glu Gly Val Gly Lys Ala Phe Cys Glu Arg Leu Ala Lys Glu Gly
20 25 30
Met Asn Val Val Met Val Gly Arg Arg Glu Glu Lys Leu Lys Glu Leu
35 40 45
Gly Glu Glu Leu Lys Asn Thr Tyr Glu Ile Asp Tyr Lys Val Val Lys
50 55 60
Ala Asp Phe Ser Leu Pro Asp Ala Thr Asp Lys Ile Phe Ala Ala Thr
65 70 75 80
Glu Asn Leu Asp Met Gly Phe Met Ala Tyr Val Ala Cys Leu His Ser
85 90 95
Phe Gly Lys Ile Gln Asp Thr Pro Trp Glu Lys His Glu Ala Met Ile
100 105 110
Asn Val Asn Val Val Thr Phe Met Lys Cys Phe Tyr His Tyr Met Lys
115 120 125
Ile Phe Ala Ala Gln Asp Arg Gly Ala Val Ile Asn Val Ser Ser Met
130 135 140
Thr Gly Ile Ser Ser Ser Pro Trp Asn Gly Gln Tyr Gly Ala Gly Lys
145 150 155 160
Ala Phe Ile Leu Lys Met Thr Glu Ala Val Ala Cys Glu Thr Glu Lys
165 170 175
Thr Asn Val Asp Val Glu Val Ile Thr Leu Gly Thr Thr Leu Thr Pro
180 185 190
Ser Leu Leu Ser Asn Leu Pro Gly Gly Pro Gln Gly Glu Ala Val Met
195 200 205
Lys Asn Ala Gln Thr Pro Glu Glu Val Val Asp Glu Ala Phe Glu Lys
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Leu Gly Lys Glu Leu Ser Val Ile Ser Gly Glu Arg Asn Lys Ala Ser
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245 250 255
Met Gly Ser Phe Tyr Gln Glu
260
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<211> 759
<212> DNA
<213> 高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(759)
<400> 9
atg acc gat cgt ctg aag ggc aaa gta gcc atc gta acc ggc ggg act 48
Met Thr Asp Arg Leu Lys Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Gly Thr
1 5 10 15
ctg ggt atc ggt ttg gca atc gcc gat aaa ttt gta gag gag ggt gcg 96
Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
aaa gta gtt att act ggt cgt cac gcg gat gta ggt gaa aag gcc gcc 144
Lys Val Val Ile Thr Gly Arg His Ala Asp Val Gly Glu Lys Ala Ala
35 40 45
aaa tca atc ggc ggc act gat gtt att cgc ttt gtc cag cac gat gca 192
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
tcc gat gaa gca ggc tgg acg aaa ctg ttc gac acc acc gag gag gca 240
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
ttc ggc ccg gtt acg acc gtc gtg aac aat gca ggg att gca gtt tcc 288
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser
85 90 95
aaa agc gtt gaa gac act acc acg gag gaa tgg cgt aaa ctg ctg tcc 336
Lys Ser Val Glu Asp Thr Thr Thr Glu Glu Trp Arg Lys Leu Leu Ser
100 105 110
gtt aat ctg gat ggt gtt ttt ttc ggc acc cgt ctg ggc att cag cgc 384
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
atg aaa aat aaa ggc ttg ggc gct agc atc atc aat atg agc agt att 432
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
gag ggg ttc gta ggc gat ccg acg ctg ggg gca tac aac gct tcc aag 480
Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
ggg gcg gta cgt atc atg tcg aaa agc gca gcg ctg gat tgc gca ctg 528
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
aag gac tac gat gtg cgt gtc aac aca gta cat ccg ggc tat atc aag 576
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys
180 185 190
acc ccg ctg gtc gat gat ctg gaa ggt gct gag gaa atg atg tca cag 624
Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln
195 200 205
cgt acg aaa acc cct atg ggc cac att ggc gaa ccg aat gac atc gca 672
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
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Trp Ile Cys Val Tyr Leu Ala Ser Asp Glu Ser Lys Phe Ala Thr Gly
225 230 235 240
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Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
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<211> 252
<212> PRT
<213> 高加索酸奶乳杆菌(Lactobacillus kefir)
<400> 10
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Leu Gly Ile Gly Leu Ala Ile Ala Asp Lys Phe Val Glu Glu Gly Ala
20 25 30
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35 40 45
Lys Ser Ile Gly Gly Thr Asp Val Ile Arg Phe Val Gln His Asp Ala
50 55 60
Ser Asp Glu Ala Gly Trp Thr Lys Leu Phe Asp Thr Thr Glu Glu Ala
65 70 75 80
Phe Gly Pro Val Thr Thr Val Val Asn Asn Ala Gly Ile Ala Val Ser
85 90 95
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100 105 110
Val Asn Leu Asp Gly Val Phe Phe Gly Thr Arg Leu Gly Ile Gln Arg
115 120 125
Met Lys Asn Lys Gly Leu Gly Ala Ser Ile Ile Asn Met Ser Ser Ile
130 135 140
Glu Gly Phe Val Gly Asp Pro Thr Leu Gly Ala Tyr Asn Ala Ser Lys
145 150 155 160
Gly Ala Val Arg Ile Met Ser Lys Ser Ala Ala Leu Asp Cys Ala Leu
165 170 175
Lys Asp Tyr Asp Val Arg Val Asn Thr Val His Pro Gly Tyr Ile Lys
180 185 190
Thr Pro Leu Val Asp Asp Leu Glu Gly Ala Glu Glu Met Met Ser Gln
195 200 205
Arg Thr Lys Thr Pro Met Gly His Ile Gly Glu Pro Asn Asp Ile Ala
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225 230 235 240
Ala Glu Phe Val Val Asp Gly Gly Tyr Thr Ala Gln
245 250
Claims (3)
1.一种串联形成双基因表达模块，其特征在于，双基因表达模块为模块1和模块2；其中所述模块1的序列依次由SeqID N O：1，SeqID NO:5，SeqID NO:2，SeqID NO:3组成；所述模块2的序列依次由SeqID NO：1，SeqID NO:9，SeqID NO:2，SeqID NO:7组成。
2.一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于，由如下步骤实现：
A、采用含有权利要求1所述模块1的重组大肠杆菌细胞催化底物鹅去氧胆酸CDCA合成3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA，反应液酸化后得到3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA粗品，同时采用乳酸脱氢酶及丙酮酸钠使得辅酶循环再生；
B、采用含有权利要求1所述模块2的重组大肠杆菌细胞催化步骤A中所述的3α-羟基-7-氧代-5β-胆烷酸7-KLCA粗品，反应液液酸化过滤后得到UDCA粗品，同时采用醇脱氢酶及异丙醇使得辅酶循环再生。
3.根据权利要求2所述的一种高效全细胞催化鹅去氧胆酸合成熊去氧胆酸的方法，其特征在于所述的熊去氧胆酸粗品在有机溶剂中加碱溶解、回流、过滤除去固形物以及酸化分离的获得精制成品。
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