CN114592027A - 两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法 - Google Patents

两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法。包括：第一步：牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）通过化学氧化反应制备得到牛磺7‑酮石胆酸(T‑7K)；第二步：将第一步制备得到的牛磺7‑酮石胆酸(T‑7K)通过共表达7β‑羟基类固醇脱氢酶（7β‑HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌全细胞催化还原生产得到牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）。本发明主要利用来源广泛的TCDCA，先通过化学氧化生产牛磺7‑酮石胆酸(T‑7K)，然后利用7β‑类固醇脱氢酶（7β‑HSDH）将牛磺7‑酮石胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸，同时共表达的葡萄糖脱氢酶在葡萄糖存在的情况下将NADP+循环再生。上述方法中两种酶蛋白共表达，且催化过程全细胞催化，保证高活性的同时使酶蛋白具体更好的稳定性，能够实现牛磺熊去氧胆酸高收率、高纯度的制备。

Description

两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法
技术领域
本发明涉及一种制备牛磺熊去氧胆酸的方法，特别涉及通过两步法制备牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）的方法，即将天然来源的牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）先通过化学氧化，生成牛磺7-酮石胆酸(T7K)后，再通过大肠杆菌共表达全细胞催化将牛磺7-酮石胆酸转为牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)的方法，属于化学合成技术领域。
背景技术
牛磺熊去氧胆酸（TUDCA），化学名为2 -[[（3α，5β，7β）-3，7-二羟基-24-氧代胆甾烷-24-基]氨基]乙烷磺酸二水合物，是由熊去氧胆酸（UDCA）的羧基与牛磺酸的氨基之间缩水而成的结合型胆汁酸。1902年自熊胆中发现TUDCA，其为熊胆中主要胆汁酸，具有解痉、抗惊厥、抗炎及溶胆石等作用。意大利贝思迪大药厂于1991年上市该药物，2007年以商品名滔罗特（taurolite）获准在中国销售，临床主要用于治疗胆囊胆固醇结石、原发硬化性胆管炎、原发胆汁性肝硬化和慢性丙型病毒性肝炎等。临床研究表明，牛磺熊去氧胆酸与熊去氧胆酸相比，溶石速度加快、全溶率提高，且无明显的不良反应。
牛磺熊去氧胆酸是熊胆汁的有效成分，治疗胆结石及肝病具有明显的疗效。近年来，有关牛磺熊去氧胆酸的研究领域一直非常活跃，其化学合成也倍受关注。国内基本以人工提取熊胆汁为主要途径得到牛磺熊去氧胆酸，来源有限，不利于大规模生产。化学合成牛磺熊去氧胆酸，国外报道主要有三种化学半合成法：
①用熊去氧胆酸与氯甲酸乙酯或特戊酰氯反应形成混合酸酐，在碱性条件下与牛磺酸反应，再经离子交换柱纯化制得TUDCA，总收率约62%。
②熊去氧胆酸和牛磺酸在碱性条件下分别在N-乙氧羰基-2-乙氧基-1，2-二氢喹啉（EEDQ）或氰基磷酸二乙酯（DEPC）作用下直接缩合得到，收率分别为67%和90%，此法试剂价昂。
③熊去氧胆酸和氯甲酸乙酯形成混合酸酐后，与对羟基苯丙酮缩合，得熊去氧胆酸的活性酚酯，再与牛磺酸反应制得TUDCA，总收率约64%，此法反应步骤较多。
比较三种合成方法，后两种需用EEDQ和DEPC，价格昂贵，制备也较烦琐。
牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）是一种广泛存在于鸡鸭鹅等禽畜胆汁中，人们利用较多的，是将这些胆汁水解制备鹅去氧胆酸，而利用结合态TCDCA制备TUDCA的方法报导不多。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法，本发明主要利用来源广泛的TCDCA，先通过化学氧化生产牛磺7-酮石胆酸(T-7K)，然后7β-类固醇脱氢酶（7β-HSDH）将牛磺7-酮石胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸，同时共表达或融合表达的葡萄糖脱氢酶在葡萄糖存在的情况下将NADP+循环再生。上述方法中两种酶蛋白共表达，且催化过程全细胞催化，保证高活性的同时使酶蛋白具体更好的稳定性，能够实现高收率、高纯度牛磺熊去氧胆酸的制备。本发明所述方法的原理如图1所示。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：
本发明的一种两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法，包括：
第一步：牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）通过化学氧化反应制备得到牛磺7-酮石胆酸(T-7K)；
第二步：将第一步制备得到的牛磺7-酮石胆酸(T-7K)通过共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌全细胞催化还原生产得到牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）。
其中，优选的，第一步反应包括如下步骤：取牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA），按照1g牛磺鹅去氧胆酸加入1ml甲醇的量加入甲醇，溶解后，加入牛磺鹅去氧胆酸重量0.3倍的磷酸，滴加与甲醇相同体积的次氯酸钠水溶液，控温反应，反应过程温度不超过5℃；滴加完成后，采用液相检测TCDCA残留，若小于1%，则反应完成，加入无水亚硫酸钠搅拌20-40min后，缓慢滴加水，过滤烘干，即得产物牛磺7-酮石胆酸(T-7K)。
其中，优选的，次氯酸钠水溶液的有效氯为12%。
其中，优选的，缓慢滴加与甲醇相同体积的水，过滤后置于真空干燥箱75℃干燥10h，即得产物牛磺7-酮石胆酸(T-7K)。
其中，优选的，第二步反应中，共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌中，编码7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示。
其中，优选的，共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌通过以下方法构建得到：
（1）将7β-HSDH和GDH基因分别进行密码子优化，并进行全基因合成，编码7β-HSDH和GDH的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示；
（2）将合成的两个基因各自依次连接入pETDuet1载体，得到共表达7β-HSDH和GDH的重组质粒pETDuet1-GDH-7βHSDH；
（3）将pETDuet1-GDH-7βHSDH转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到带有重组质粒的工程菌BL21(DE3)-pETDuet1-GDH-7β-HSDH；
（4）工程菌的培养，将工程菌接种到培养基中进行培养，得到共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌。
其中，优选的，步骤（4）中，所述的工程菌的培养包括以下步骤：
（1）将工程菌接种到LB固体平板培养基中活化，于37℃活化培养16~20h，从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于含有100mg/L氨苄青霉素(Amp+ ) LB液体培养基的三角瓶中，在200rpm/min、37℃下震荡培养16~20h；
（2）将步骤（1）的培养物按1:100比例转接到含有100mg/L氨苄青霉素(Amp+ ) 的TB液体培养基，在200rpm/min、37℃下震荡培养4~6h，加入0.4mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG )，25℃下继续培养10~16h，得到共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌工程菌；
（3）摇瓶种子培养
配制起始培养基，组成为：安琪大豆蛋白胨2.0g，安琪酵母浸膏3.0g，磷酸二氢钾0.23g，磷酸氢二钾1.3g，水100ml；
起始培养基配制100mL后，用250mL锥形瓶分2瓶50mL装，接种时，每瓶加葡萄糖1g、水2ml、硫酸镁0.05g，水2ml，每瓶加入抗生素50uL，加步骤（2）得到的工程菌300 uL；
在37±0.5℃，200±50rpm条件下培养7±0.5h后，分出5 mL摇瓶培养的工程菌种子液接到发酵罐；
（4）发酵罐培养
配制起始培养基，组成为：安琪大豆蛋白胨60.0g，安琪酵母浸膏90.0g，发酵用消泡剂1.0g，磷酸二氢钾6.9g，磷酸氢二钾37.6g，水3000mL；
接种时，向起始培养基中加入葡萄糖30g、硫酸镁3g，水35ml，抗生素3ml，步骤（3）得到的工程菌种子液5ml；
发酵罐条件控制：
温度37±0.5℃，pH7±0.2，通气量3L/min，200rpm-600 rpm下搅拌，串联溶氧30%；
降温补料：
当转速达到600rpm时，溶氧DO上升到10%以上或pH上升到7.10以上时，将温度设定到25±0.5℃，并开始补料，补料速度为45~55 mL/h；
加入诱导剂：
温度降至25±0.5℃时，加入0.4mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG )溶液进行诱导，诱导16h结束；
（5）下罐：
6000r/min，离心10min，得共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌菌体。
其中，优选的，所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂粉15.0g/L；所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L；所述的TB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)12g/L，酵母提取物(YeastExtract)24g/L，甘油 (Glycerol)5g/L，磷酸氢二钾（K2HPO4）9.4g/L,磷酸二氢钾（KH2PO4）2.2g/L。
其中，优选的，牛磺7-酮石胆酸(T-7K)通过共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌全细胞催化还原的步骤具体包括：
取T-7k，加入纯化水，加入一水葡萄糖，充分搅拌均匀后，待温度保持在20-30℃后，加入共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌全细胞水悬液，加入NADP+后，开始反应，转速300rpm-500rpm，反应过程用1M氢氧化钠调节反应pH6.5~8.0之间；反应过程通过TLC板子监控，每2h取样监控，反应8h后，用液相色谱测定，T-7k残留小于1.0%，反应完成，得牛磺熊去氧胆酸反应液。
其中，优选的，还包括对牛磺熊去氧胆酸纯化的步骤，具体包括：
将得到的牛磺熊去氧胆酸反应液，浓缩后，得到浓缩浸膏，加入乙酸乙酯萃取，萃取五次后，合并乙酸乙酯相，加入无水硫酸钠脱水后，浓缩乙酸乙酯至膏重的3~4倍，加入水，加热溶解后，自然降温后，放入4℃结晶，待晶体析出充分后，过滤，置于真空干燥箱干燥，得到纯化后的牛磺熊去氧胆酸产品，纯度大于98.5%。
相较于现有技术，本发明的有益效果在于：
1、针对牛磺熊去氧胆酸制备，脱离传统化学法和常规的酶法，通过化学法和酶法相结合，以牛磺7-酮石胆酸为原料，通过全细胞共表达催化的方法，获得了稳定高效的催化剂，其优点在于大大提升了酶的稳定性，共表达同时节约了成本，真正实现生产放大。
2、底物浓度可高达70g/L，反应时间短，对底物的转化率高达99％以上，所获得的产品纯度在99％以上；
3、反应中间物牛磺7-酮石胆酸转化为牛磺熊去氧胆酸的效率高，最终产品中几乎不含有副产物；
4、使用7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶，在反应体系中使NADP+循环再生，极大降低了辅酶NADP+的使用量，使酶催化反应的成本降低，利于工业放大；
5、将类固醇脱氢酶和辅酶再生酶通过共表达，更有利于转化反应的进行，在工业化生产中，减少发酵的次数，简化了工艺，节约时间成本和原料成本；
6、可以使用7β-类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶的全细胞进行牛磺鹅去氧胆酸的转化，避免了破碎细胞、细胞液澄清、酶的亲和纯化等工业成本大的步骤，保证了酶蛋白的稳定性，节约大量成本，且过程简单可控。
附图说明
图1为反应原理图；
图2是牛磺7-酮石胆酸(T-7K)的MS图谱；
图3是牛磺7-酮石胆酸(T-7K)的1H-NMR图谱；
图4是牛磺7-酮石胆酸(T-7K)的13C-NMR图谱；
图5是牛磺7-酮石胆酸(T-7K)的红外图谱；
图6为pETDuet1-GDH-7βHSDH的载体图谱；
图7是牛磺熊去氧胆酸的MS图谱；
图8是牛磺熊去氧胆酸的1H-NMR图谱；
图9是牛磺熊去氧胆酸的13C-NMR图谱；
图10是牛磺熊去氧胆酸的红外图谱。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明进行详细描述，以使本领域技术人员能够容易地根据本说明书得公开内容实施本发明。以下所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 TCDCA次氯酸钠化学氧化生成牛磺7-酮石胆酸(T-7K)
取300g TCDCA（98%）加入300mL甲醇，溶解后，加入100g磷酸，滴加次氯酸钠水溶液（有效氯12%）300mL，控温反应，反应过程温度不超过5℃。滴加完成后，采用液相检测TCDCA残留，用液相色谱测定，TCDCA残留0.43%，小于1.0%，反应完成，加入无水亚硫酸钠6.0g搅拌30min后，缓慢滴加300mL水，过滤后置于真空干燥箱75℃干燥10h，即得产物T-7K，称重292g，并测定纯度95.76%。
图2是牛磺7-酮石胆酸(T-7K)的MS图谱；图3是牛磺7-酮石胆酸(T-7K)的1H-NMR图谱；图4是牛磺7-酮石胆酸(T-7K)的13C-NMR图谱；图5是牛磺7-酮石胆酸(T-7K)的红外图谱。
实施例2 牛磺熊去氧胆酸酶还原工程菌的制备和表达。
一、全基因合成密码子优化的7β-HSDH基因和GDH基因
1.7β-HSDH和GDH基因分别为7β-羟基类固醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶
2.7β-HSDH来源于: 撒丁岛梭菌（Clostridium absonum，GenBank登录号：JN191345.1）
GDH来源于：枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，GenBank登录号NC-000964）
3.上述序列委托生工生物(上海)股份有限公司根据大肠杆菌密码子偏好性，对基因序列进行密码子优化，并在7β-HSDH基因序列5’和3’端分别加上EcoRⅤ和XhoI酶切位点，在GDH基因序列5’和3’端分别加上EcoRⅠ和HindⅢ酶切位点并进行全基因合成。得到的密码子优化后的7β-HSDH的基因序列如SEQ ID NO.1所示，密码子优化后的GDH的基因序列如SEQID NO.2所示。并将合成的密码子优化后的7β-HSDH基因以及GDH基因分别与PUC57载体连接，得到PUC57-7β-HSDH质粒，PUC57-GDH质粒，以上载体构建的工作也由生工生物(上海)股份有限公司完成。
二、工程菌的构建
1.扩大培养含有PUC57-7β-HSDH质粒的大肠杆菌，以及含有pETDuet1载体的大肠杆菌，取10μl样品，加入5ml的LB( Amp+ )培养基，37℃摇床培养12~16 h，摇床速度为200rpm/min。
2.用购自生工生物(上海)股份有限公司的柱式质粒小量抽提试剂盒抽提以上培养好的大肠杆菌质粒，按试剂盒的操作说明操作。
3.分别用EcoRⅤ和XhoI双酶切抽提得到的PUC57-7β-HSDH质粒和pETDuet1载体，酶切体系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
37℃酶切3~6h，用购自生工生物(上海)股份有限公司的柱式DNA胶回收试剂盒回收纯化目的片段和线性载体。
4.将回收的7β-HSDH目的基因片段和线性化载体pETDuet1用T4DNA连接酶连接，体系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
22℃连接30~60min
5.连接体系转化大肠杆菌DH5α感受态细胞
将10μl体系于超净台转入到根据标准方案制备的化学感受态大肠杆菌DH5α中，轻轻混匀，冰上放置30min。
42℃热击60s，冰上放置2min，于超净台加入700μl的灭菌LB培养基。
放置37℃摇床，200rpm，活化40~60min，涂至LB( Amp+ )固体平板培养基。
将涂好的平板放入37℃培养箱，倒置培养12~16h。
6.菌落PCR检测阳性克隆
扩增7β-HSDH的正反向引物为DuetUP2和T7t。
PCR反应体系如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
在超净台用无菌接种环挑取优势菌落，在PCR管中涮一下，作为模板。
PCR扩增条件如下：
94℃3min；(94℃30s，60℃30s，72℃1min) × 32个循环；72℃10min；4℃保存
7.电泳检测PCR产物，选出带有目的片段的阳性菌落DH5a- pETDuet1-7β-HSDH。
于超净台挑取以上阳性菌落，加入5mL LB( Amp+ )液体培养基，于37℃、200rpm摇床，培养12~16 h。
8.同时扩大培养含有PUC57-GDH质粒的大肠杆菌，取10μL样品，加入5mL的LB( Amp+ )培养基，37℃摇床培养12~16 h，摇床速度为200rpm/min
用生工生物(上海)股份有限公司的柱式质粒小量抽提试剂盒抽提以上培养好的阳性菌质粒和PUC57-GDH质粒，并用EcoRⅠ和HindⅢ，双酶切抽提得到的PUC57-GDH质粒和pETDuet1-7β-HSDH载体。酶切体系同上述3。胶回收目的基因片段和线性载体。
9.将回收的GDH目的基因和线性载体pETDuet1-7β-HSDH连接，连接体系同上述4。
10将连接体系转化大肠杆菌DH5α感受态，操作同上述5。
11.菌落PCR检测阳性克隆：通过pET Upstream和DuetDOWN1 正反向引物扩增GDH，电泳检测PCR产物，筛选出带有目的片段的阳性菌落pETDuet1-GDH-7βHSDH，PCR反应体系及循环条件同上述6。
12.挑取阳性克隆菌，加入5mL LB( Amp+ )液体培养基，于37℃、200rpm摇床， 培养12~16 h，提取质粒，酶切鉴定，确认载体构建正确，其载体图谱如图6所示。
13.将重组质粒转入( Escherichia coli，E .coli )BL21( DE3 )表达菌株，得到工程菌BL21(DE3)-pETDuet1-GDH-7β-HSDH。
14.工程菌的培养
将工程菌接种到LB固体平板培养基中活化，于37℃活化培养16~20h。从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于含有100mg/L氨苄青霉素(Amp+ ) LB液体培养基的三角瓶中，在200rpm/min、37℃下震荡培养16~20h。
将上述培养物按1:100比例转接到含有100mg/L氨苄青霉素(Amp+ ) 的TB液体培养基，在200rpm/min、37℃下震荡培养4~6h，加入0.4mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG )，25℃下继续培养10~16h。保存作为工程菌备用。
所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(YeastExtract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂粉15.0g/L。
所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(YeastExtract)5g/L，氯化钠 (NaCl)10g/L。
所述的TB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)12g/L，酵母提取物(YeastExtract)24g/L，甘油 (Glycerol)5g/L，磷酸氢二钾（K2HPO4）9.4g/L,磷酸二氢钾（KH2PO4）2.2g/L。
三、工程菌的发酵罐培养
1培养基配制及灭菌
1.1摇瓶种子培养基
按照表1：（5L种子）100mL(50mL/瓶)摇瓶培养基配方进行配制，在37±0.5℃，200±50rpm条件下培养7±0.5h后，分出5 mL摇瓶培养的工程菌种子液接到发酵罐。
1.2发酵罐培养基
按照表2：5L发酵培养基配方进行配制。
1.3灭菌条件：121℃，20min。
2发酵罐条件控制：
温度37±0.5℃，pH7±0.2，通气量3L/min，搅拌（低限：200 rpm，高限：600 rpm）串联溶氧30%。
3降温补料：
当转速达到600rpm时，大概再过2h左右起始培养基会消耗殆尽，此时溶氧DO会突然上升到10%以上（假如溶氧没有明显上升，可以选择关掉酸泵，观察pH上涨情况，上升到7.10以上也可以开始下一步操作）将温度设定到25±0.5℃，并开始补料，补料速度为45~55mL/h。其中补料1是发酵降温诱导时开始补，补料2和补料3是调节发酵过程中的酸碱调节剂，补料4为控制泡沫的，根据实际发酵泡沫情况加。
4加入诱导剂：
温度降至25±0.5℃时，加入选择0.4mM（0.4g）的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG )溶液进行诱导，诱导16h结束。
5下罐：
5.16000r/min，离心10min，得220g菌体。
6 菌活力测定
反应体系（10mL）：
8mL pH=8.0±0.2的100mM 磷酸盐缓冲液
1mL 0.2g/mLT-7K溶液
20μL 10mg/mL NADP+溶液
10mL重悬菌液（1mL发酵液（取样时摇匀）8000rpm离心2min，弃去上清，加1mL磷酸盐缓冲液重悬，吸取1mL加入反应体系。）
反应条件：恒温振荡培养箱20℃，200rpm反应30min，终止反应
取100μL反应液加入到900μL甲醇中，过0.45um滤膜待用。进行液相测定T-7K和TUDCA峰面积比。当TUDCA峰面积大于10%，则该酶活性较好。
表1：（5L种子）100mL(50mL/瓶)摇瓶培养基配方
Figure DEST_PATH_IMAGE004
表2：5L发酵培养基配方
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例3 全细胞酶催化制备牛磺熊去氧胆酸。
取实施例1获得的T-7k 250g，加入1150mL纯化水，加入137.5g一水葡萄糖，充分搅拌均匀后，待温度达到25℃后，加入实施例2制备的菌体50g(用100mL纯化水混悬均匀)后，加入NADP+0.25g后，开始反应，转速400rpm，反应过程用1M氢氧化钠调节反应pH6.5~8.0之间。反应过程通过TLC板子监控，每2h取样监控，反应8h后，用液相色谱测定，T-7k残留0.43%，小于1.0%，反应完成，得牛磺熊去氧胆酸反应液。
实施例4 牛磺熊去氧胆酸的纯化
将实施例3得到的牛磺熊去氧胆酸反应液，浓缩水至400mL左右后，得到浓缩浸膏，加入2000mL乙酸乙酯萃取，萃取五次后，合并乙酸乙酯相，加入50g无水硫酸钠脱水后，浓缩乙酸乙酯至膏重750g（即浓缩膏250g，乙酸乙酯500g）左右，加入5g水(乙酸乙酯的1%)，加热溶解后，自然降温后，放入4℃结晶48h，待晶体析出充分后，过滤，置于真空干燥箱75℃干燥10h，称重得牛磺熊去氧胆酸产品221g，测定纯度98.56%，收率87.3%。
图7是牛磺熊去氧胆酸的MS图谱；图8是牛磺熊去氧胆酸的1H-NMR图谱；图9是牛磺熊去氧胆酸的13C-NMR图谱；图10是牛磺熊去氧胆酸的红外图谱。
实施例5 反应废液的处理
制备过程产生废液主要来源于发酵产生的菌代谢废液和酶催化反应后废液。由于都是以水作为载体，浓缩至浸膏后，喷雾干燥后，获得固体干粉，发酵干粉，由于营养物丰富，可用作植物肥料原料。酶反应干粉，主要成分为葡萄糖酸盐，可用作某些水处理工程菌的营养物。
序列表
<110> 北京岳达生物科技有限公司
<120> 两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 785
<212> DNA
<213> Clostridium absonum
<400> 1
atgaatttta gagaaaaata tggacaatgg ggaattgttt taggggcaac agaaggaatt 60
ggtaaagcta gtgcttttga attagctaaa agagggatgg atgttatttt agttggaaga 120
agaaaagaag cattagaaga gttagctaag gcaatacatg aagaaacagg aaaagaaatc 180
agagtattac cacaagattt atctgaatat gatgctgcag aaagattaat agaagcaact 240
aaagatttag atatgggagt cattgagtat gttgcatgtc tacatgcaat gggacaatat 300
aataaagttg actacgctaa atatgaacaa atgtatagag ttaatataga acattctcaa 360
aattattaca tcactatata ggtgaattca aagaaagaga tagaggtgca ttcataacaa 420
taggatcttt atcaggatgg acatcattac cattctgtgc agaatatgca gcagaaaaag 480
cttatatgat gacagtaaca gaaggagttg cttacgaatg tgcaaatact aatgttgacg 540
taatgctttt atcagcgggt tcaacaatca cacctacttg gttaaaaaat aaaccatcag 600
atcctaaggc ggttgcagca gcaatgtatc cagaagatgt tataaaagat ggatttgaac 660
aattaggaaa gaaatttact tatttagctg gagagttaaa tagagaaaaa atgaaggaaa 720
ataatgcaat ggatagaaat gatttaattg caaaactagg aaaaatgttt gatcatatgg 780
cataa 785
<210> 2
<211> 786
<212> DNA
<213> Bacillus subtilis
<400> 2
atgtatacag atttaaaaga taaagtagta gttgtaacag gcggatcaaa aggattgggt 60
cgcgcaatgg ccgttcgttt tggtcaagag cagtcaaaag tggttgtaaa ctaccgcagc 120
aatgaagaag aagcgctaga agtaaaaaaa gaaattgaac aagctggcgg ccaagcaatt 180
attgttcgag gcgacgtaac aaaagaggaa gacgttgtga atcttgtaga gacagctgtt 240
aaagagtttg gcacattaga cgttatgatt aacaatgctg gtgttgaaaa cccggttcct 300
tcacatgaat tatcgttaga aaactggaat caagtaatcg atacaaactt aacaggcgcg 360
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ggtattacac tatttgctga tggcggtatg acaaaatatc cttctttcca agcgggaaga 780
ggttaa 786

Claims (10)

1.一种两步法制备牛磺熊去氧胆酸的方法，其特征在于，包括：
第一步：牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA）通过化学氧化反应制备得到牛磺7-酮石胆酸(T-7K)；
第二步：将第一步制备得到的牛磺7-酮石胆酸(T-7K)通过共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌全细胞催化还原生产得到牛磺熊去氧胆酸（TUDCA）。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第一步反应包括如下步骤：取牛磺鹅去氧胆酸（TCDCA），按照1g牛磺鹅去氧胆酸加入1ml甲醇的量加入甲醇，溶解后，加入牛磺鹅去氧胆酸重量0.3倍的磷酸，滴加与甲醇相同体积的次氯酸钠水溶液，控温反应，反应过程温度不超过5℃；滴加完成后，采用液相检测TCDCA残留，若小于1%，则反应完成，加入无水亚硫酸钠搅拌20-40min后，缓慢滴加水，过滤烘干，即得产物牛磺7-酮石胆酸(T-7K)。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，次氯酸钠水溶液的有效氯为12%。
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，缓慢滴加与甲醇相同体积的水，过滤后置于真空干燥箱75℃干燥10h，即得产物牛磺7-酮石胆酸(T-7K)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，第二步反应中，共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌中，编码7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌通过以下方法构建得到：
（1）将7β-HSDH和GDH基因分别进行密码子优化，并进行全基因合成，编码7β-HSDH和GDH的基因的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1以及SEQ ID NO.2所示；
（2）将合成的两个基因各自依次连接入pETDuet1载体，得到共表达7β-HSDH和GDH的重组质粒pETDuet1-GDH-7βHSDH；
（3）将pETDuet1-GDH-7βHSDH转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到带有重组质粒的工程菌BL21(DE3)-pETDuet1-GDH-7β-HSDH；
（4）工程菌的培养，将工程菌接种到培养基中进行培养，得到共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤（4）中，所述的工程菌的培养包括以下步骤：
（1）将工程菌接种到LB固体平板培养基中活化，于37℃活化培养16~20h，从LB固体平板培养基上挑取单菌落，接种于含有100mg/L氨苄青霉素(Amp+ ) LB液体培养基的三角瓶中，在200rpm/min、37℃下震荡培养16~20h；
（2）将步骤（1）的培养物按1:100比例转接到含有100mg/L氨苄青霉素(Amp+ ) 的TB液体培养基，在200rpm/min、37℃下震荡培养4~6h，加入0.4mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG )，25℃下继续培养10~16h，得到共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌工程菌；
（3）摇瓶种子培养
配制起始培养基，组成为：安琪大豆蛋白胨2.0g，安琪酵母浸膏3.0g，磷酸二氢钾0.23g，磷酸氢二钾1.3g，水100ml；
起始培养基配制100mL后，用250mL锥形瓶分2瓶50mL装，接种时，每瓶加葡萄糖1g、水2ml、硫酸镁0.05g，水2ml，每瓶加入抗生素50uL，加步骤（2）得到的工程菌300 uL；
在37±0.5℃，200±50rpm条件下培养7±0.5h后，分出5 mL摇瓶培养的工程菌种子液接到发酵罐；
（4）发酵罐培养
配制起始培养基，组成为：安琪大豆蛋白胨60.0g，安琪酵母浸膏90.0g，发酵用消泡剂1.0g，磷酸二氢钾6.9g，磷酸氢二钾37.6g，水3000mL；
接种时，向起始培养基中加入葡萄糖30g、硫酸镁3g，水35ml，抗生素3ml，步骤（3）得到的工程菌种子液5ml；
发酵罐条件控制：
温度37±0.5℃，pH7±0.2，通气量3L/min，200rpm-600 rpm下搅拌，串联溶氧30%；
降温补料：
当转速达到600rpm时，溶氧DO上升到10%以上或pH上升到7.10以上时，将温度设定到25±0.5℃，并开始补料，补料速度为45~55 mL/h；
加入诱导剂：
温度降至25±0.5℃时，加入0.4mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG )溶液进行诱导，诱导16h结束；
（5）下罐：
6000r/min，离心10min，得共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌菌体。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述的LB固体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast Extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂粉15.0g/L；所述的LB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(YeastExtract)5g/L，氯化钠 (NaCl)10g/L；所述的TB液体培养基的组成如下：胰蛋白胨(Tryptone)12g/L，酵母提取物(YeastExtract)24g/L，甘油 (Glycerol)5g/L，磷酸氢二钾（K2HPO4）9.4g/L,磷酸二氢钾（KH2PO4）2.2g/L。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，牛磺7-酮石胆酸(T-7K)通过共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌全细胞催化还原的步骤具体包括：
取T-7k，加入纯化水，加入一水葡萄糖，充分搅拌均匀后，待温度保持在20-30℃后，加入共表达7β-羟基类固醇脱氢酶（7β-HSDH）和葡萄糖脱氢酶（GDH）的大肠杆菌全细胞水悬液，加入NADP+后，开始反应，转速300rpm-500rpm，反应过程用1M氢氧化钠调节反应pH6.5~8.0之间；反应过程通过TLC板子监控，每2h取样监控，反应8h后，用液相色谱测定，T-7k残留小于1.0%，反应完成，得牛磺熊去氧胆酸反应液。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，还包括对牛磺熊去氧胆酸纯化的步骤，具体包括：
将得到的牛磺熊去氧胆酸反应液，浓缩后，得到浓缩浸膏，加入乙酸乙酯萃取，萃取五次后，合并乙酸乙酯相，加入无水硫酸钠脱水后，浓缩乙酸乙酯至膏重的3~4倍，加入水，加热溶解后，自然降温后，放入4℃结晶，待晶体析出充分后，过滤，置于真空干燥箱干燥，得到纯化后的牛磺熊去氧胆酸产品，纯度大于98.5%。
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