CN112553174B - 一种脱氢酶在(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤制备中的应用 - Google Patents

一种脱氢酶在(r)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物催化技术领域，尤其是一种脱氢酶在(R)‑9‑(2‑羟丙基)腺嘌呤制备中的应用，所述脱氢酶基因序列如SEQ ID NO：1所示。应用时，以脱氢酶的粗酶液为催化剂，在NADP+、辅酶循环酶、缓冲液存在的条件下，催化化合物II还原成目的产物化合物I（R）‑9‑（2‑羟丙基）腺嘌呤，合成路线为：
Figure 100004_DEST_PATH_IMAGE001
。该路线获得了高催化率产物，催化效率高达2，具有较高的经济价值。

Description

一种脱氢酶在(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤制备中的应用
技术领域
本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，具体领域为一种脱氢酶及其制备方法和应用。
背景技术
替诺福韦酯（商品名：韦瑞德）是吉利德公司非常成功的明星产品，(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤是生产替诺福韦酯的关键中间体。替诺福韦酯，全称替诺福韦二吡呋酯富马酸盐，属于新型核苷酸类逆转录酶抑制剂，由吉利德（Gilead）公司开发并于2001年在美国上市，国内市场由葛兰素史克独家销售，主要用于治疗艾滋病（HIV）和慢性乙型肝炎（HBV）。
Figure 100002_DEST_PATH_IMAGE001
以下为替诺福韦酯（商品名：韦瑞德）的分子结构式：
Figure 70889DEST_PATH_IMAGE002
目前，(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的制备鲜有生物法合成的报道，申请人于专利申请CN202011549680.4中提及了一种(R)-(+)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤的合成方法，具体路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
该路线中，化合物IV（即本申请中的化合物II）增加了溶解性才能达到催化率1，且成盐催化率还有一定的不稳定性，催化率不稳定。
因此，找到一种催化率稳定较高的经济化酶是该步骤生物法应用中亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种脱氢酶及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种脱氢酶，所述脱氢酶基因序列如SEQ ID NO：1 所示。
或者，将上述脱氢酶基因序列中第280位至282位碱基替换为GAG、TTA、TTT或TTC。
本发明所述脱氢酶的制备方法，具体为：将脱氢酶重组菌株种子液按照1-5%的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600=0.6时，加入50 μl 0.5 mol/L的IPTG，18 ℃过夜诱导后进行破碎，即获得脱氢酶粗酶液。
其中，所述脱氢酶重组菌株以pET-30a质粒为载体，表达脱氢酶基因；所述脱氢酶基因编号为TAA_AEL。
具体为，所述脱氢酶基因TAA_AEL连接到pET-30a质粒的XhoI，BamHI位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
本发明所述脱氢酶在(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤合成中的应用：
以所述脱氢酶的粗酶液为催化剂，在NADP+、辅酶循环酶、缓冲液存在的条件下，催化化合物II还原成目的产物化合物I（R）-9-（2-羟丙基）腺嘌呤，合成路线如下：
Figure 52619DEST_PATH_IMAGE004
。
其中，所述辅酶循环酶为异丙醇脱氢酶；所述缓冲液为0.2 M pH6.0-7.0 PB缓冲体系。
其中，反应温度为25-40℃，反应时间为5-36h，反应摇床转速为200-280rpm。
其中，化合物II与脱氢酶湿菌体的质量比为1：0.2-5；化合物II与辅酶循环酶质量比为1：0.5-5；化合物II与NADP+质量比为1：0.0001-0.01；化合物II 与缓冲液的比例为1g：10-100mL。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过基因工程技术构建了脱氢酶重组菌株，并实现了异源表达，生产的脱氢酶可以用于(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤生物催化合成。
本发明的合成路线获得了高催化率的产物获得，其底物转化率>90%，催化效率为2；可以替代现有的化学法以及复杂的成盐后再进行催化的方法制备（R）-9-（2-羟丙基）腺嘌呤，实现了高效经济化生产。
附图说明
图1为脱氢酶载体构建图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 脱氢酶重组菌株的构建
设计脱氢酶基因（TAA_AEL）的上下游引物F、R（如表1所示），以全基因合成构建的pUC57-TAA_AEL为模板，通过PCR的方式扩增含有XhoI，BamHI酶切位点的TAA_AEL。PCR条件为：98 ℃ 3 min，98 ℃ 30 s，55 ℃ 90 s、72 ℃ 90 s，30个循环。PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5 μL，灭菌的双蒸水20.5 μL，PrimerSTAR Mix 25 μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。XhoI，BamHI酶切胶回收产物（目的基因TAA）及pET-30a质粒（表达载体），胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。目的基因TAA与载体pET-30a连接，连接体系：目的基因4 μL，载体pET-28a 2 μL，Buffer 2 μL，连接酶1μL，16 ℃过夜连接。将构建好的载体（如图1所示）通过化转技术导入E. coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37 ℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该脱氢酶基因的重组工程菌。
其中，脱氢酶基因的DNA序列为SEQ ID NO：1。
LB培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0。
表1 引物
Figure DEST_PATH_IMAGE005
实施例2 重组菌发酵生产（R）-9-（2-羟丙基）腺嘌呤
（1）制备脱氢酶粗酶液
将实施例1构建的重组菌接种于5 mL的LB培养基中，37 ℃震荡培养过夜，次日按照1%的接种量转接于LB培养基中，37 ℃培养至OD600=0.6时，加入50 μl 0.5 mol/L的IPTG，18 ℃诱导14 h，离心收集菌体生理盐水洗涤后进行破碎，获得脱氢酶粗酶液。
（2）重组菌发酵生产（R）-9-（2-羟丙基）腺嘌呤：
将含有5g脱氢酶湿菌体破碎获得的脱氢酶粗酶液50mL和10 g底物化合物II加入250 mL规格三角瓶，摇匀。随后，加入300 μL 100 mg/mL NADP+辅酶母液（反应体系终浓度0.2 mg/mL）和5 mL IPA（异丙醇）、5g异丙醇脱氢酶酶粉。最后，用0.2M pH 7.0 PB buffer使反应体系定容至100 mL，摇匀。将该100 mL反应体系置于35 ℃、220 rpm摇床反应。
Figure 81535DEST_PATH_IMAGE004
反应过程监测与补加IPA，每隔6 h补加1mL IPA，同时，取样监测反应，取10 μL反应液，加入200 μL乙酸乙酯萃取、离心，取上清进行TLC检测，TLC展板条件为二氯甲烷：甲醇：冰乙酸= 10:1:0.1。在反应20h后，TLC检测发现底物点消失后，乙酸乙酯萃取产物进行HPLC分析鉴定，经分析底物转化率为96.1%，催化率为2。
实施例3 重组菌发酵生产（R）-9-（2-羟丙基）腺嘌呤
将实施例2步骤（1）中制备的含有5g脱氢酶湿菌体破碎获得的脱氢酶粗酶液50mL和10 g底物化合物II加入250 mL规格三角瓶，摇匀。随后，加入300 μL 100 mg/mL NADP+辅酶母液（反应体系终浓度0.2 mg/mL）和5 mL IPA（异丙醇）5g异丙醇脱氢酶酶粉。最后，用0.2M pH 6.0 PB buffer使反应体系定容至100 mL，摇匀。将该100 mL反应体系置于35 ℃、220 rpm摇床反应。
Figure 873081DEST_PATH_IMAGE004
反应过程监测与补加IPA，每隔6 h补加1mL IPA，同时，取样监测反应，取10 μL反应液，加入200 μL乙酸乙酯萃取、离心，取上清进行TLC检测，TLC展板条件为二氯甲烷：甲醇：冰乙酸= 10:1:0.1。在反应20h后，TLC检测发现底物点消失后，乙酸乙酯萃取产物进行HPLC分析鉴定，经分析底物转化率为95.3%，催化率为2。
实施例4 重组菌发酵生产（R）-9-（2-羟丙基）腺嘌呤
按照实施例1的方法制备基因序列第280位至282位碱基替换为TTT的脱氢酶菌株，将重组菌接种于5 mL的LB培养基中，37 ℃震荡培养过夜，次日按照1%的接种量转接于LB培养基中，37 ℃培养至OD600=0.6时，加入50 μl 0.5 mol/L的IPTG，18 ℃诱导14 h，离心收集菌体生理盐水洗涤后进行破碎，获得脱氢酶粗酶液。
将含有5g脱氢酶湿菌体破碎获得的脱氢酶粗酶液50mL和10 g底物化合物II加入250 mL规格三角瓶，摇匀。随后，加入300 μL 100 mg/mL NADP+辅酶母液（反应体系终浓度0.2 mg/mL）和5 mL IPA（异丙醇）5g异丙醇脱氢酶酶粉。最后，用0.2M pH 6.0 PB buffer使反应体系定容至100 mL，摇匀。将该100 mL反应体系置于35 ℃、220 rpm摇床反应。
Figure 813355DEST_PATH_IMAGE004
反应过程监测与补加IPA，每隔6 h补加1mL IPA，同时，取样监测反应，取10 μL反应液，加入200 μL乙酸乙酯萃取、离心，取上清进行TLC检测，TLC展板条件为二氯甲烷：甲醇：冰乙酸= 10:1:0.1。在反应20h后，TLC检测发现底物点消失后，乙酸乙酯萃取产物进行HPLC分析鉴定，经分析底物转化率为96.5%，催化率为2。
另外，经实验发现，按照实施例1的方法制备基因序列第280位至282位碱基替换为GAG、TTA或TTC的脱氢酶菌株，最终制得的脱氢酶粗酶液同样可用于发酵生产（R）-9-（2-羟丙基）腺嘌呤，且均可达到与实施例2-4相同的催化率。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 南京欧信医药技术有限公司
<120> 一种脱氢酶在(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤制备中的应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 756
<212> DNA
<213> 脱氢酶(Artificial Sequence)
<400> 1
ggatccatgg gccagtttga taataaagtg gccctggtta cgggcggcac aaaaggcatc 60
ggcttagcaa ttgccgaact gtttctgaaa gaaggtgcta aaggcgttgc ctttacaggt 120
cgtcatgaag atgaaggtaa agcggttcag gaacgtctgg gtgaacgtag cttatttatt 180
acgcaggatg tgagtaaaga agaagattgg cagaatgcta ccaaagccgt tgtggaaaaa 240
tttggtcagt tagatgcaat cgtgaataat gcaggtatcg aaacaccatt aggtatcgaa 300
gaaatgacac tggatcattg gaatcgcgaa atcgcaattg atctgaccgg caccatgctg 360
ggctgtaaat atggtgttaa agctatgaaa gaacatggtg gcgccattgt taatatctct 420
agcatcttag gcatgatcgg tgatcctatc gttccagcgt ataatgcagc caaaggcggc 480
gtgcgcttac tgacgaaatc agtggctctg gaatgtgccg aaaaaggcta tgcgattcgc 540
gttaatagta ttcatccggg cgcgattgcg accccgctga ttgatcattt agatgatgct 600
accaaacagt tttatatcga taaacatcct atgggtcgcc tgggcaaacc ggaagaagtt 660
gccaaaatgg ccgtgtttgt tgcctcagat ggtgcgagct tttctacggg tagtgaattt 720
gttgtggatg gcggttatac agcacagtaa ctcgag 756
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 引物F(Artificial Sequence)
<400> 2
ggatccatgg gccagtttga ta 22
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 引物R(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcgagttac tgtgctgtat aacc 24

Claims (9)

1.一种脱氢酶，其特征在于：所述脱氢酶基因序列如SEQ ID NO：1 所示。
2.一种脱氢酶，其特征在于：将权利要求1所述脱氢酶基因序列中第280位至282位碱基替换为GAG、TTA、TTT或TTC。
3.权利要求1或2所述的脱氢酶的制备方法，其特征在于：将脱氢酶重组菌株种子液按照1-5%的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600=0.6时，加入50 μl 0.5 mol/L的IPTG，18 ℃过夜诱导后进行破碎，即获得脱氢酶粗酶液。
4.根据权利要求3所述的脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述脱氢酶重组菌株以pET-30a质粒为载体，表达脱氢酶基因；所述脱氢酶基因编号为TAA_AEL。
5.根据权利要求4所述的脱氢酶的制备方法，其特征在于：所述脱氢酶基因TAA_AEL连接到pET-30a质粒的XhoI，BamHI位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
6.权利要求1或2所述脱氢酶在(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤合成中的应用，其特征在于：以所述脱氢酶的粗酶液为催化剂，在NADP+、辅酶循环酶、缓冲液存在的条件下，催化化合物II还原成目的产物化合物I（R）-9-（2-羟丙基）腺嘌呤，合成路线如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
。
7.根据权利要求6所述的脱氢酶在(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤合成中的应用，其特征在于：所述辅酶循环酶为异丙醇脱氢酶；所述缓冲液为0.2 M pH6.0-7.0 PB缓冲体系。
8.根据权利要求7所述的脱氢酶在(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤合成中的应用，其特征在于：反应温度为25-40℃，反应时间为5-36h，反应摇床转速为200-280rpm。
9.根据权利要求8所述的脱氢酶在(R)-9-(2-羟丙基)腺嘌呤合成中的应用，其特征在于：化合物II与脱氢酶湿菌体的质量比为1：0.2-5；化合物II与辅酶循环酶质量比为1：0.5-5；化合物II与NADP+质量比为1：0.0001-0.01；化合物II 与缓冲液的比例为1g：10-100mL。
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