CN112143692B - 一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株及构建方法和应用 - Google Patents

一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株及构建方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，尤其是一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株及构建方法和应用，所述重组菌株以pET‑28a质粒为载体，表达洛伐他丁酯水解酶基因；所述洛伐他丁酯水解酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明在大肠杆菌中实现了异源表达，其底物转化率>99％，催化效率可达2.5g/L/h；可以替代现有的化学法进行莫那克林J的高效清洁生产。

Description

一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株及构建方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程与酶工程技术领域，具体领域为一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株的构建及其应用。
背景技术
洛伐他丁酯水解酶可以高效地催化洛伐他汀生成重要的药物中间体莫那克林J。近年来，朱丽平等(生物法合成辛伐他汀[J].生物加工过程，2011，09(5)：11-16)以莫那克林J为起始化合物，利用酰基转移酶LovD合成辛伐他汀，用于控制血液中胆固醇含量及预防心血管疾病。辛伐他汀是一种非常畅销的降血脂药物，其作用机制是作为竞争性抑制剂抑制内源性胆固醇合成的限速酶——羟甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMG-CoA reductase)的活性，从而降低胆固醇的合成。
莫那克林J是合成辛伐他汀的重要中间体。然而，辛伐他汀的合成主要为化学法，在化学法中，莫那克林J也作为中间体参与其中，Kumar等(Process for manufacturingsimvastatin from lovastatin or mevinolinic acid.US Patent,5763646,1998)将这条路线进行修改和提高，但合成过程需要用到多种昂贵或者危险的化学试剂，且总体收率水平在60％到80％之间，副产物较多，分离纯化难度大，造成的污染也很严重。
目前，也发展出了一些生物法生产莫那克林J，Komagata等(Microbialconversion of compactin(ML-236B)to ML-236A.J Antibiot,1986,39:1574-1577)报道了一株对洛伐他汀有着较高水解活力的菌株，其转化率可以达到86％，但由于是野生菌株，因此也会产生一些副产物，后期需要纯化。
因此，找到一种可实现大规模生产辛伐他汀的前体莫那克林J的方法成为了该领域亟需解决的问题之一。
发明内容
本发明的目的在于提供一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株及构建方法和应用，通过基因工程技术筛选高效催化洛伐他丁的基因并实现异源功能性表达，获得高效催化洛伐他丁生成莫那克林J的生物催化剂。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株，以pET-28a质粒为载体，表达洛伐他丁酯水解酶基因；所述洛伐他丁酯水解酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。所述洛伐他丁酯水解酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
洛伐他丁酯水解酶基因连接到pET-28a质粒的EcoR I和Hind III位点，然后转化到大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。
一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株的构建方法：
设计洛伐他丁酯水解酶基因CDV55的上下游引物P1、P2，如SEQ ID NO：3-4所示；以pUC57-CDV55为模板，PCR扩增含有EcoR I和Hind III酶切位点的CDV55基因；PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，34个循环；PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL；
采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度；EcoRI，Hind III酶切胶回收产物及pET-28a质粒，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度；目的基因CDV55与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a 2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接；将构建好的载体通过化转技术导入E.coli BL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该酯酶基因的重组工程菌。
采用本发明所述的洛伐他丁酯水解酶重组菌株发酵生产洛伐他丁酯水解酶：将洛伐他丁酯水解酶重组菌株种子液按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃诱导14h，即洛伐他丁酯水解酶发酵液。
本发明还要求保护所述洛伐他丁酯水解酶重组菌株及其生产得到的洛伐他丁酯水解酶在制备莫那克林J方面的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明通过基因工程技术，发现了一种全新的洛伐他丁酯水解酶并构建了洛伐他丁酯水解酶重组菌株，并实现了异源表达；可以替代现有的化学法进行莫那克林J的高效清洁生产。
附图说明
图1为pET28a-CDV55质粒结构图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1洛伐他丁酯水解酶重组菌株的构建
设计洛伐他丁酯水解酶基因(CDV55)的上下游引物P1、P2(如表1所示)，以通用公司全基因合成构建的pUC57-CDV55为模板，通过PCR的方式扩增含有EcoR I和Hind III酶切位点的CDV55基因。PCR条件为：98℃3min，98℃30s，55℃90s、72℃90s，34个循环。PCR扩增体系：模板1.5μL，上下游引物各1.5μL，灭菌的双蒸水20.5μL，PrimerSTAR Mix 25μL。采用胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收，电泳检验回收产物的浓度。EcoR I，Hind III酶切胶回收产物(目的基因CDV55)及pET-28a质粒(表达载体)，胶回收试剂盒对酶切后的胶回收产物进行纯化和回收，胶回收试剂盒对酶切后质粒进行纯化回收，电泳检验回收产物的浓度。如图1所示，目的基因CDV55与载体pET-28a连接，连接体系：目的基因4μL，载体pET-28a2μL，Buffer 2μL，连接酶1μL，16℃过夜连接。将构建好的载体通过化转技术导入E.coliBL21(DE3)中，涂布在含卡那霉素的LB平板中，放入37℃培养箱中过夜，将长出来的单菌落进行质粒提取和测序，最终获得含该酯酶基因的重组工程菌。
其中，洛伐他丁酯水解酶基因的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，洛伐他丁酯水解酶基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.2。
LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 10g/L，pH 7.0。
表1引物
引物名称 序列 编号
P1 g<u>gaattc</u>atgaccgacgacatcgagactaccttcc SEQ ID NO：3
P2 ccc<u>aagctt</u>ctactgccccttgaacgcatcatacttgc SEQ ID NO：4
实施例2重组菌发酵生产莫那克林J
(1)制备洛伐他丁酯水解酶发酵液
将实施例1构建的重组菌接种于5mL的LB培养基中，37℃震荡培养过夜，次日按照2％的接种量转接于LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6时，加入50μl 0.5mol/L的IPTG，18℃诱导14h，即为洛伐他丁酯水解酶发酵液。
对洛伐他丁酯水解酶活力进行测定，结果表明：洛伐他丁酯水解酶的发酵液酶活可以达到1.5U/mL。
洛伐他丁酯水解酶活力的测定方法：
采用高效液相色谱法测定洛伐他丁酯水解酶的酶活。
1个单位洛伐他丁酯水解酶酶活定义为：
酶活定义：在30℃反应条件下，每分钟内生成1μmol莫那克林J所需要的酶量为一个酶活单位(U/ml)。
酶活测定条件：100ul的酶液和800ul Tris-HCl(pH8.0)放入2ml EP管中，在30℃金属浴中预热5min，加入100ul的底物，900prm反应10min。然后加入1ml甲醇终止反应。利用Shimadzu SPD-M20A在237nm处测定吸光值，通过莫那克林J绘制标准曲线，根据标准曲线计算酶活。
(2)重组菌发酵生产莫那克林J：
取4.65ml的水，加入0.35ml的甲醇，然后溶解0.1g的氢氧化钠，最后加入1g的洛伐他丁，搅拌2h，洛伐他丁全部水解为洛伐他丁酸，浓度为200g/L，用缓冲液(Tris-HCl,pH8.0)将制备得洛伐他丁酸稀释20倍，再用6M HCl调节pH至8.0，配制成10g/L洛伐他丁酸溶液。
加入10g发酵液，在30℃环境下反应，反应过程中用氢氧化钠溶液(30％)控制pH在8.0。4小时后终止反应，获得底物莫那克林J，转化率>99％，催化效率达2.5g/L/h。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。
序列表
<110> 江苏阿尔法药业有限公司
<120> 一种洛伐他丁酯水解酶重组菌株及构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 403
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Thr Asp Asp Ile Glu Thr Thr Phe Gln Ala Phe Ile Asp Ala Gly
1 5 10 15
Arg Ile Asn Gly Ala Val Ile Cys Ala Thr Asp Thr Glu Gly His Phe
20 25 30
Val Tyr Asn Lys Ala Leu Gly Glu Arg Thr Leu Leu Ser Gly Glu Lys
35 40 45
Leu Pro Gln Gln Leu Asp Asp Val Leu Tyr Leu Ala Ser Ala Thr Lys
50 55 60
Leu Val Thr Ala Ile Ala Ala Leu Gln Cys Val Glu Asp Gly Leu Leu
65 70 75 80
Thr Leu Thr Gly Asp Leu Ser Ser Val Ala Pro Asp Leu Ala Ala Lys
85 90 95
Gln Val Leu Thr Gly Phe Ser Asp Asp Gly Glu Thr Pro Ile Leu Glu
100 105 110
Pro Pro Ala Arg Pro Val Thr Leu Glu Met Leu Leu Thr His Ser Ser
115 120 125
Gly Leu Cys Tyr His Phe Leu Thr Pro His Ile Ala Lys Trp Arg Glu
130 135 140
Lys Phe Ala Pro Pro Gln Glu Gly Lys Leu Leu Ser Val Glu Glu Leu
145 150 155 160
Phe Cys Tyr Pro Leu Gly Phe Gln Pro Gly Thr Glu Phe Met Tyr Gly
165 170 175
Pro Gly Leu Asp Trp Ala Gly Arg Val Val Glu Arg Val Thr Gly Arg
180 185 190
Thr Leu Gly Glu Gln Met Gln Gln Arg Ile Phe Asp Pro Leu Gly Ile
195 200 205
Thr Asp Ala Gln Phe Cys Pro Val Thr Arg Glu Asp Leu Arg Pro Arg
210 215 220
Leu Val Asp Leu Asn Pro Asp Asp Pro Glu Ala Gln Gly Arg Ala Val
225 230 235 240
Leu Gly Gly Ser Ala Asp Met Asn Lys Arg Gly Arg Gly Asp Phe Gly
245 250 255
Gly His Gly Leu Phe Met Ser Gly Val Ser Tyr Leu Lys Ile Leu His
260 265 270
Ser Leu Leu Ala Asn Asp Gly Lys Leu Leu Lys His Ala Thr Val Asp
275 280 285
Asp Met Phe Gln His His Leu Ser Pro Gln Ala Thr Ala Gly His Gln
290 295 300
Thr Ala Leu Ala Ser Pro Met Gly His Phe Phe Arg Val Gly Leu Asp
305 310 315 320
Ala Gly Thr Lys Leu Gly His Ser Leu Gly Gly Leu Leu Thr Leu Gln
325 330 335
Asp Val Asp Gly Gly Tyr Gly Glu Gly Thr Leu Thr Trp Gly Gly Gly
340 345 350
Ile Thr Leu Ile Trp Phe Ile Asp Arg Lys Asn Gly Phe Cys Gly Val
355 360 365
Gly Ala Ile Gln Ala Ser Leu Pro Phe Asp Thr Asp Ala Val Met Ala
370 375 380
Leu Arg Gln Thr Phe Arg Arg Asp Ile Tyr Arg Lys Tyr Asp Ala Phe
385 390 395 400
Lys Gly Gln
<210> 2
<211> 1212
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaccgacg acatcgagac taccttccag gccttcatcg atgctggcag aatcaacggc 60
gccgtgattt gtgccaccga caccgagggt cactttgttt acaacaaggc tctcggcgag 120
cgtaccttac tgtccggtga aaagctcccg cagcagctcg acgatgtcct gtacttggcc 180
tccgctacca agctggtcac cgccattgct gccctgcagt gcgtcgaaga tggactactt 240
accctgactg gcgatttatc gtctgtcgca cccgacctcg ccgccaagca ggtcttgacc 300
ggcttctccg atgacggcga aacccccatt cttgagccgc cagcccgccc cgtcacactc 360
gagatgttgc tcacgcacag ctcaggcttg tgctaccact ttttaactcc tcacatcgcc 420
aagtggcgtg agaagtttgc acctccacaa gaaggcaagc tcctctcggt cgaggaactg 480
ttctgctacc cgctcggctt ccaacccggc accgagttca tgtatggtcc aggactggac 540
tgggctggcc gtgtggtgga gcgggtgacg gggcgcacac tcggggagca gatgcagcag 600
cgcatcttcg accccctcgg catcaccgac gcccaattct gccccgtcac gcgcgaagac 660
ctgcgccctc gcctcgtgga ccttaacccg gacgacccgg aagcccaggg gcgtgcggtg 720
ctcggcggca gcgcagacat gaacaagcgc gggcgcggtg actttggcgg ccacggtctg 780
ttcatgtcgg gcgtgagcta cctcaaaatc ctccattctc tgctggccaa cgacggaaag 840
ctgctcaaac acgcgacggt cgacgatatg tttcagcatc acctaagtcc ccaagcgaca 900
gcggggcacc aaactgcgct ggcctctcct atgggccact tcttccgtgt aggcctcgac 960
gccggaacaa aactgggcca cagcctgggc ggcctgctca ccctgcagga tgtggatggc 1020
gggtacgggg aggggacgct gacctggggc ggcgggataa cactgatctg gttcatcgac 1080
cgcaagaacg gcttctgcgg tgttggcgcc atccaggcct cgctgccgtt cgatactgac 1140
gctgtgatgg cgctgaggca gacctttcgc cgtgacattt accgcaagta tgatgcgttc 1200
aaggggcagt ag 1212
<210> 3
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaattcatg accgacgaca tcgagactac cttcc 35
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cccaagcttc tactgcccct tgaacgcatc atacttgc 38

Claims (1)

1.洛伐他丁酯水解酶在催化洛伐他丁生成莫那克林J中的应用，其特征在于：所述洛伐他丁酯水解酶基因的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
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Address before: 223800 No.5 Yanshan Road, eco Chemical Technology Industrial Park, Suqian City, Jiangsu Province

Applicant before: JIANGSU ALPHA PHARMACEUTICAL Co.,Ltd.

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