CN114196653B

CN114196653B - 重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用

Info

Publication number: CN114196653B
Application number: CN202111508069.1A
Authority: CN
Inventors: 范新炯; 刘艳艳; 张艺馨
Original assignee: Anhui Medical University
Current assignee: Anhui Medical University
Priority date: 2021-12-10
Filing date: 2021-12-10
Publication date: 2023-06-20
Anticipated expiration: 2041-12-10
Also published as: CN114196653A

Abstract

本发明适用于酶工程技术领域，提供了重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用，所述重组酯酶Est1260由酯酶基因est1260重组表达得到，所述重组酶酯Est1260的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示，本发明将酯酶基因est1260序列进行异源表达，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组酶酯，通过测定其应用时发现重组酯酶对尼泊金酯包括MeP、EtP、PrP、BuP有强降解作用。因此在去除尼泊金酯残留方面有广阔的应用前景。

Description

重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用

技术领域

本发明属于酶工程技术领域，尤其涉及重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用。

背景技术

尼泊金酯是一类以烷基取代基从甲基到丁基或苄基的对羟基苯甲酸酯，包括尼泊金甲酯(MeP)、尼泊金乙酯(EtP)、尼泊金丙酯(PrP)、尼泊金丁酯(BuP)。主要用作有机合成、食品、化妆品、医药的杀菌防腐剂，也用作于饲料防腐剂，是国际上公认的广谱性高效食品防腐剂。但是其作为一种环境内分泌干扰物对生态环境和人类健康所产生的不利影响越来越受到关注。因此，在自然分解能力无法满足人类安全需求的形势下，寻找高效降解尼泊金酯的新方法，降低尼泊金酯的毒负作用已成为一个重要研究领域。

生物法尤其是生物酶在处理尼泊金酯残留问题上具有处理简便、安全高效、应用范围广且无二次污染等优点，日益受到重视。因此，急需一种具有优良性能的生物催化剂尼泊金酯降解酶。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用，旨在解决上述背景技术中提出的问题。

本发明实施例是这样实现的，重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用，所述重组酯酶Est1260由酯酶基因est1260重组表达得到，所述重组酶酯Est1260的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述酶酯基因est1260的核苷酸序列为SEQID NO.1所示。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述重组酶酯Est1260的制备方法包括以下步骤：

用酶酯基因est1260构建的重组载体转化宿主细胞，得到重组菌；

经IPTG诱导，得到重组酯酶Est1260。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述重组载体为pET-32a(+)。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述IPTG终浓度为10-1000μM，诱导温度为16～30℃。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述尼泊金酯为MeP、EtP、PrP或BuP。

作为本发明实施例的一个优选方案，所述降解温度为0-40℃；降解时的pH为6.47-9.18。

本发明将酯酶基因est1260序列进行异源表达，通过对阳性克隆子的诱导表达得到重组酶酯，通过测定其应用时发现重组酯酶对尼泊金酯包括MeP、EtP、PrP、BuP有强降解作用。因此在去除尼泊金酯残留方面有广阔的应用前景。

附图说明

图1为重组酶酯对底物MeP、EtP、PrP、BuP降解液相色谱图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

实施例

1、基因片段的克隆

根据酯酶基因est1260的基因序列设计引物如下：

est1260-F’:5'-TTATTGGATCCATGATGCCCGGAGCGGCAAC-3'(如序列表SEQ ID NO.3所示)；

est1260-R’:5'-ATTAAGCTTTCATCGCGTTGCCCCCAGGTCG-3'(如序列表SEQ ID NO.4所示)。

以质粒pUC118-est1260为模板、est1260-F’和est1260-R’为引物，对est1260基因进行PCR扩增，体系如下：

PCR反应条件如下：预变性：98℃，5min；变性：98℃，30s，退火：63℃，10s，延伸：72℃，10s；其中，重复变性-退火-延伸过程30个循环；再延伸：72℃，10min。PCR扩增结束后，取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，剩余部分放于-20℃保存备用。

用胶回收试剂盒将PCR产物纯化并用BamH I和HindⅢ于30℃双酶切8h，与用BamHI和HindⅢ双酶切的pET-32a(+)表达载体进行连接，取5μL连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)，转化液涂布含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB固体培养基，37℃培养过夜，随机挑取5株单菌落接种提取质粒DNA，双酶切验证后，送交测序。

2、重组酯酶粗酶液的获得

将重组工程菌划线至含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB固体培养基中，37℃培养过夜活化，随机挑取1株重组菌接种至含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB液体培养基中，37℃、220rpm摇床培养过夜，按1:100的接种量转接至50mL的含氨苄青霉素钠(100μg/mL)的LB液体培养基中，当菌体密度OD600＝0.5-0.6时加入IPTG至终浓度0.1mM，30℃、200rpm摇床培养10h。14000rpm离心5min，弃上清，将菌体重悬于50mL，100mM的磷酸钾(pH＝6.8)缓冲液中，用超声波破碎仪(Sonics公司)破碎细胞。4℃，14000rpm离心10min，收集上清，得到粗重组蛋白，将粗重组蛋白用Ni-NTA(上海生工)亲和柱纯化重组蛋白，亲和柱具体操作步骤按上海生工产品说明书进行。

3、重组酯酶Est1260对尼泊金酯的降解能力测定

1、反应体系

(1)配置终浓度为1mM的MeP、EtP、PrP、BuP的反应液；

(2)取1mL上述反应溶液，分别加入100μL粗酶液，以灭活酶作为空白对照，30℃反应1h；

(3)向(2)中加入100μL 1M的HCl终止反应后，加入等体积的乙酸乙酯充分涡旋混匀，萃取上层有机相重复萃取过程3次；

(4)将上述溶液蒸干，利用500μL甲醇重悬后，进行高效液相色谱分析。

2、检测条件

HPLC检测条件：采用C18(4.6x 250mm)色谱柱，流动相为甲醇-0.1％冰乙酸，流速：0.8mL/min，检测波长：254nm，进样量：10μL。

如图1所示，经HPLC检测分析，大肠杆菌表达的重组酯酶在30℃对MeP、EtP、PrP、BuP的降解率分别为42.87％、60.6％、99.3％、99.34％。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽医科大学

<120> 重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatgcccg gagcggcaac cggctttttg cagcgccgcg cgctgcctaa cgtggcgggc 60

ctctccccac ggatcaccat gatgaatgcc gctctttccc ttgaacctgc accgacgctg 120

ccttcggtgc agcggctgct gcagcaggtc catccgttgc gcctggttgg tgcggtggtg 180

ctggtgcgcg agcacggcgt gctgcgccat gccagcgcga gcgggctggc cgaccgcgag 240

tcggccaggc cgatgctgcg cgatcagctg ttccggctgg catcggtcag caagccgttg 300

ctggccacgg tgatcctgcg cctggtggct gaaggcgtgc tcgacctcga cgcgccggtg 360

cagcgctggc tgccggactt ccgcccggcg ctggccgatg gcagcacgcc gccgatcagc 420

ctgcgccagc tgctcagcca cagcagcgga ctgggctatc gcttcctgga ggcggatgcg 480

gagggaccct acgcgcgcgc tggcgtcagc gatggcatgg atgccaaccc ggtgtccctg 540

gccgagaacg tgcgccgcat cgcgcaggtg ccactgctgt tcgcaccggg cagccagtgg 600

ctttactcgt tgggcgtgga cgtggccggt gcggtggccg aagccgcgac cggtgaaacg 660

ctgcaggcgc tgttccagcg tctgctggct gccccgttgg gcctgcgcga taccgcgttc 720

gttacgcgcg atgcagagcg gctggccacg ccgtatgtga gcgacaggcc gcaaccgcat 780

cgcctgcagg aaggcgaggt ggtcgcacct ttcgagggaa cgctgggcat cgagttcagt 840

cccgcacgtg ccaccgacgc cagtcggttc gcttcggccg gcgccggcct ggtcggtacc 900

gccgatgagg tgatggcggt gctggaggct ttgcgcgacg tgcaacgctc cggcctgctg 960

ccgcccgcgc tggcggcgca gatggccagc ccgcaggtgg gcgagcaggg gcccccggaa 1020

ccggccggct ggggcttcgg gctgggcttt gcggtactgc gcgatgccgc cgccagcggc 1080

acaccacagc gcgaaggcag ctggcgctgg ggcggtgcct acgggcacag ctggttcgtc 1140

gacccgtcgc gtgggctgag cgtggtggcg ctgaccaaca ccctgtacga agggatggat 1200

ggcgttttcg tcgatgacct gcgcgatgcg atttatgccg acctgggggc aacgcgatga 1260

<210> 2

<211> 419

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Met Pro Gly Ala Ala Thr Gly Phe Leu Gln Arg Arg Ala Leu Pro

1 5 10 15

Asn Val Ala Gly Leu Ser Pro Arg Ile Thr Met Met Asn Ala Ala Leu

20 25 30

Ser Leu Glu Pro Ala Pro Thr Leu Pro Ser Val Gln Arg Leu Leu Gln

35 40 45

Gln Val His Pro Leu Arg Leu Val Gly Ala Val Val Leu Val Arg Glu

50 55 60

His Gly Val Leu Arg His Ala Ser Ala Ser Gly Leu Ala Asp Arg Glu

65 70 75 80

Ser Ala Arg Pro Met Leu Arg Asp Gln Leu Phe Arg Leu Ala Ser Val

85 90 95

Ser Lys Pro Leu Leu Ala Thr Val Ile Leu Arg Leu Val Ala Glu Gly

100 105 110

Val Leu Asp Leu Asp Ala Pro Val Gln Arg Trp Leu Pro Asp Phe Arg

115 120 125

Pro Ala Leu Ala Asp Gly Ser Thr Pro Pro Ile Ser Leu Arg Gln Leu

130 135 140

Leu Ser His Ser Ser Gly Leu Gly Tyr Arg Phe Leu Glu Ala Asp Ala

145 150 155 160

Glu Gly Pro Tyr Ala Arg Ala Gly Val Ser Asp Gly Met Asp Ala Asn

165 170 175

Pro Val Ser Leu Ala Glu Asn Val Arg Arg Ile Ala Gln Val Pro Leu

180 185 190

Leu Phe Ala Pro Gly Ser Gln Trp Leu Tyr Ser Leu Gly Val Asp Val

195 200 205

Ala Gly Ala Val Ala Glu Ala Ala Thr Gly Glu Thr Leu Gln Ala Leu

210 215 220

Phe Gln Arg Leu Leu Ala Ala Pro Leu Gly Leu Arg Asp Thr Ala Phe

225 230 235 240

Val Thr Arg Asp Ala Glu Arg Leu Ala Thr Pro Tyr Val Ser Asp Arg

245 250 255

Pro Gln Pro His Arg Leu Gln Glu Gly Glu Val Val Ala Pro Phe Glu

260 265 270

Gly Thr Leu Gly Ile Glu Phe Ser Pro Ala Arg Ala Thr Asp Ala Ser

275 280 285

Arg Phe Ala Ser Ala Gly Ala Gly Leu Val Gly Thr Ala Asp Glu Val

290 295 300

Met Ala Val Leu Glu Ala Leu Arg Asp Val Gln Arg Ser Gly Leu Leu

305 310 315 320

Pro Pro Ala Leu Ala Ala Gln Met Ala Ser Pro Gln Val Gly Glu Gln

325 330 335

Gly Pro Pro Glu Pro Ala Gly Trp Gly Phe Gly Leu Gly Phe Ala Val

340 345 350

Leu Arg Asp Ala Ala Ala Ser Gly Thr Pro Gln Arg Glu Gly Ser Trp

355 360 365

Arg Trp Gly Gly Ala Tyr Gly His Ser Trp Phe Val Asp Pro Ser Arg

370 375 380

Gly Leu Ser Val Val Ala Leu Thr Asn Thr Leu Tyr Glu Gly Met Asp

385 390 395 400

Gly Val Phe Val Asp Asp Leu Arg Asp Ala Ile Tyr Ala Asp Leu Gly

405 410 415

Ala Thr Arg

<210> 3

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttattggatc catgatgccc ggagcggcaa c 31

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

attaagcttt catcgcgttg cccccaggtc g 31

Claims

1.重组酶酯Est1260在降解尼泊金酯上的应用，其特征在于，所述重组酯酶Est1260由酯酶基因est1260重组表达得到，所述重组酶酯Est1260的氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.根据权利要求1所述的应用，所述酶酯基因est1260的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1所述的应用，所述重组酶酯Est1260的制备方法包括以下步骤：

经IPTG诱导，得到重组酯酶Est1260。

4.根据权利要求3所述的应用，所述重组载体为pET-32a(+)。

5.根据权利要求3所述的应用，所述宿主细胞为大肠杆菌E.coli BL21(DE3)。

6.根据权利要求3所述的应用，所述IPTG终浓度为10-1000μM，诱导温度为16～30℃。

7.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述尼泊金酯为MeP、EtP、PrP或BuP。

8.根据权利要求1-6任一所述的应用，其特征在于，所述降解温度为0-40℃；降解时的pH为6.47-9.18。