CN113106130B

CN113106130B - 聚集性葡萄球菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用

Info

Publication number: CN113106130B
Application number: CN202110424889.6A
Authority: CN
Inventors: 姚红; 倪泉明; 王伟文; 黄晓飞; 陈文斌
Original assignee: Core Biomedical Technology Hangzhou Co ltd
Current assignee: Core Biomedical Technology Hangzhou Co ltd
Priority date: 2020-06-23
Filing date: 2020-06-23
Publication date: 2023-03-14
Anticipated expiration: 2040-06-23
Also published as: CN113025671A; CN111662938A; CN113106130A; CN113025671B; CN111662938B

Abstract

本发明提供了聚集性葡萄球菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用，属于生物化工技术领域；所述腈水合酶催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物；所述腈水合酶来源于聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM 12614)。本发明以氰基吡嗪类化合物为底物，利用离体的腈水合酶或表达腈水合酶的细胞作为催化剂，进行水合反应，能够获得酰胺吡嗪类化合物。本发明的应用原料转化率高，没有副反应，产物易于分离提纯且纯度较高；与传统化学催化工艺相比，本发明工艺绿色环保且操作简便，产率超过99％。

Description

聚集性葡萄球菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用

本申请是申请日为2020年06月23日、申请号为202010580723.9、发明名称为《腈水合酶在催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物中的应用》的分案申请。

技术领域

本发明涉及生物化工技术领域，尤其涉及聚集性葡萄球菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用。

背景技术

酰胺吡嗪(或称吡嗪酰胺)是一种重要的抗结核药物，对结核病有很好的疗效。近年来发现酰胺吡嗪对顽固菌有较好的杀菌作用，故在临床广泛应用；而且酰胺吡嗪可作为中间体，用于制备各种抗菌、抗病毒药物。例如，酰胺吡嗪的衍生物：6-氟-3-羟基-2-酰胺吡嗪，也称法匹拉韦(英语：Favipiravir，也称为Avigan或favilavir)，是一种抗病毒药物，由日本富山大学医学部白木公康教授与富士胶片旗下富山化学工业(今富士胶片富山化学)共同研发，该药能够对抗多种RNA病毒。法匹拉韦具有降低流感病毒、西尼罗河病毒、黄热病、口蹄疫病毒以及其他多种病毒活性的作用；其还被证明能够抑制活性如肠道病毒和裂谷热；该药还表现出对抗狂犬病的功效，并已被实验性的用于治疗感染狂犬病毒的患者。2020年2月，法匹拉韦在中国被用于2019冠状病毒病(COVID-19)的试验性治疗，3月17日，在武汉和深圳进行的试验中发现该药能有效治疗感染者，早期报告表明该药可有效治疗该疾病。

对于法匹拉韦的制备方法，主要有化学合成法和生物催化法。化学合成法方面，专利文献WO0010569公开了一种由6-溴-3-氨基-2-吡嗪羧酸甲酯经多步反应来制备；专利文献WO2010087117A1公开了一种由3-羟基-2-吡嗪酰胺经溴代后多步反应制备。专利文献CN102603658A以6-溴-3-氨基-2-吡嗪酰胺作为原料再经过保护氨基、卤素置换、脱保护、叠氮化四步反应制备。但是，这些已知的化学合成制备方法存在以下缺点：合成较为复杂，工艺繁琐，转化率和总收率都较低。

生物催化应用在有机合成工艺上拥有巨大的潜力，有着化学方法无法替代的优越性，如：反应条件温和、环境友好、成本低、无副反应等。在制备酰胺类化合物时，利用腈水合酶(NHase，E.C.4.2.1.84)催化腈类化合物水合反应生成酰胺，是一种较佳的选择。其中，一些产腈水合酶的微生物已用于丙烯酰胺、烟酰胺、2-氨基-2,3-二甲基丁酰胺等的生产中：如专利号为US007405064B2的专利文献公开了一种睾丸酮丛毛单胞菌ComamonasTestosteroni 5-MGAM-4D、专利号为ZL88106735的专利文献公开了一种玫瑰色红球菌Rhodococcus rhodococcus J-1、专利号为ZL103834600的专利文献公开了一株恶臭假单胞菌Pseudomonasputida，这些野生菌株都用于丙烯酰胺的生产中。但应用于吡嗪酰胺制备的腈水合酶目前报导较少。世界专利文献WO2006049618A1报导了以E.coli SW132为表达宿主、克隆表达来源于Comamonas testosteroni 5-MGAM-4D的腈水合酶生产2-酰胺吡嗪，重组E.coli SW132细胞在23℃的磷酸盐缓冲体系(pH7.0)中催化转化浓度为0.5·M的2-氰基吡嗪15min，转化率为100％。中国专利CN101481713A公开了一种以2-氰基吡嗪为底物、以表达腈水合酶的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens ZJB09104为生物催化剂，生产2-酰胺吡嗪。

虽然目前各种数据库中的腈水合酶的基因资源较为丰富，但能够催化底物氰基吡嗪制备酰胺吡嗪的腈水合酶较少。更为重要的是，目前还没有文献报导能够催化氰基吡嗪类化合物直接制备酰胺吡嗪类化合物(例如法匹拉韦)的腈水合酶。

发明内容

本发明的目的在于提供腈水合酶在催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了腈水合酶在催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物中的应用；所述腈水合酶来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM 12614)或苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。

优选的，来源于所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；来源于所述聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM 12614)的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQID NO.3所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4；来源于所述苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。

优选的，所述的氰基吡嗪类化合物的化学式如式I所示；所述酰胺吡嗪类化合物的化学式如式II所示；

式I和式II中：

R₁选自H，CH₃，F，Cl，Br，或者I；

R₂选自H，NH₂或者OH。

优选的，所述的氰基吡嗪类化合物包括2-氰基吡嗪，3-甲基-2-氰基吡嗪，6-甲基-2-氰基吡嗪，6-甲基-3-羟基-2-氰基吡嗪，6-溴-3-氨基-2-氰基吡嗪，6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪，6-氯-3-羟基-2-氰基吡嗪，6-溴-3-羟基-2-氰基吡嗪或6-碘-3-羟基-2-氰基吡嗪。

优选的，所述应用包括以下步骤：以氰基吡嗪类化合物为底物，在水溶液中，利用离体的腈水合酶或体外表达腈水合酶的细胞作为催化剂，进行水合反应，获得酰胺吡嗪类化合物。

优选的，所述底物在水中的浓度为2～100g/L；当以体外表达腈水合酶的细胞作为催化剂时，所述催化剂的添加量以12000rpm离心10min后的细胞湿重计，细胞的添加量为反应液重量的1％～20％；当以离体的腈水合酶作为催化剂时，离体的腈水合酶的添加量为每升反应液中10～10000U。

优选的，所述水合反应的温度为10～50℃，所述水合反应的pH值为5～10。

优选的，所述水合反应的温度为20～30℃；所述水合反应的pH值为6～8。

本发明的有益效果：本发明提供了腈水合酶在催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物中的应用；所述腈水合酶来源于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM 12614)或苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)。本发明以氰基吡嗪类化合物为底物，利用腈水合酶作为催化剂，进行水和反应，能够获得酰胺吡嗪类化合物。本发明的应用原料转化率高，没有副反应，产物易于分离提纯且纯度较高；与传统化学催化工艺相比，本发明工艺绿色环保且操作简便，产率超过99％。

附图说明

图1为本发明腈水合酶在催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物的反应式；

图2为腈水合酶转化6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪的HPLC分析图谱。

具体实施方式

本发明提供了腈水合酶在催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物中的应用，反应式如图1所示；所述腈水合酶来源于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)、聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM 12614)或苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)，优选的来源于聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM12614)。本发明的腈水合酶为钴型腈水合酶，由α亚基和β亚基组成，以二聚体(αβ)₂的形式存在。本发明的腈水合酶具有催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物的活力。

在本发明中，来源于所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(GenBank登录号CAD54074)，具体为：

MSHDHDHTEPPTEIALRVKALESLLTEKGLVDPAALDELVDTYENRIGPRNGALVVAKAWTDPAYKQRLLTNATEAIAELGFSGVQGEDMLVVENSPTVHNMTVCTLCSCYPWPTLGLPPAWYKSAPYRSRVVIDPRGVLAEFGVSVPADKEVRVWDSSAELRYLVLPERPAGTEGWSEEQLVELVTRDSMIGTGFPKNPADLH；

β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(GenBank登录号CAD54075)，具体为：

MNGVHDLGGMHGLGPIAPPADEPVFAHQWERRIFALFVPLFGGGHFNVDQFRHAIERMDPAHYLQGTYYEHWLHAFETLLIEGGAISRAELDARIKQIGGAQIMAVVTRDMIEPIVRTGASARVAADVAARFKVGDTVRAKNINPTTHTRLPRYVRGRVGTIEIDHGVFVTPDTVAHGKGEHPQHVYCVRFAAVELWGSDVSGTDNVRIDLWDDYLEKA。

在本发明中，来源于所述聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM12614)的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(GenBank登录号EAV46030)，具体为：

MSAHDHDHPHDHDHSELSEIELRVRALETLLTEKGYIDPPALDELIETYETKIGPRNGALVVAKAWTDPDYRERLMKDATAAIAELGFTGRQGEHMVAVENTDDIHNMVVCTLCSCYPWTVLGLPPVWYKSAPYRSRAVRDPRGVLAEFKVELPDDTEIRVWDSTAEIRYLVIPKRPAGTDGWSEERLADLVTRNSMIGTGLALDPSSLEDAA；

β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4(GenBank登录号EAV46029)，具体为：

MNGAQDLGGQMGFGPIELEENEPNFHAKWEERAFAVTLAMGATGSWTLDASRFARESLPPVTYLSSSYYEIWTRGLEKLLLSNGLVTEEELKEGRKLKEAKPIKRVLSADAVAGVLAKGSSVDREEHQPARFRTGDRVKTRRMNPEHHTRLPRYARDAVGTIEAIHGVHVFPDTNAHGEGEQPAWLYGVLFKGTDIWGPDSDPKLTLRIDLWEPYLDLAR。

在本发明中，来源于所述苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示(NCBI登录号WP_015007805.1)，具体为：

MSEHHHGHGDDHGHHHDNHLTDMEARVKALETVLTEKGLIDPAAIDAIVDAYETKVGPRNGARVVAKAWSDPGFADWLKRDATAAIASLGFTGRQGEHMRAVFNTSETHNLIVCTLCSCYPWAVLGLPPVWYKAPPYRSRAVIDPRGVLAEFGLELSAEKKGTVRNSVRWAMMMKRRESSHGYRERTSGPAPGWT；

β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示(NCBI登录号WP_010969705.1)，具体为：

MNGPHDLGGQHGMGPIAPERNEPIFHAEWEKRALGITLSCGAFGAWTLDESRHARESLAPATYLSASYYEIWTRALETLLKRHGFVTQAELDAGHMLDKGREPKRVLTADMVAGVLAKGGPCDRPVEAPPRFAAGDSVRTKNFNPESHTRLPRYARARTGMVEAVQGSFVFPDDNAHGKGENPQWLYMVVFDAGEIWGEGADPTLTVSIDAWESYLEHA。

在本发明中，所述的氰基吡嗪类化合物的化学式优选的如式I所示；所述酰胺吡嗪类化合物的化学式优选的如式II所示；

式I和式II中：

R₁优选的选自H，CH₃，F，Cl，Br，或者I；

R₂优选的选自H，NH₂或者OH。

在本发明中，所述的氰基吡嗪类化合物优选的包括2-氰基吡嗪，3-甲基-2-氰基吡嗪，6-甲基-2-氰基吡嗪，6-甲基-3-羟基-2-氰基吡嗪，6-溴-3-氨基-2-氰基吡嗪，6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪，6-氯-3-羟基-2-氰基吡嗪，6-溴-3-羟基-2-氰基吡嗪或6-碘-3-羟基-2-氰基吡嗪，更优选为6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪。本发明的腈水合酶对氰基吡嗪衍生物，尤其对6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪，有较高的催化活力。

在本发明中，腈水合酶催化2-氰基吡嗪水合反应生成2-酰胺吡嗪、催化3-甲基-2-氰基吡嗪生成3-甲基-2-酰胺吡嗪、催化6-甲基-2-氰基吡嗪生成6-甲基-2酰胺吡嗪、催化6-溴-3-氨基-2-氰基吡嗪生成6-溴-3-氨基-2-酰胺吡嗪、催化6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪生成6-氟-3-羟基-2-酰胺吡嗪、催化6-氯-3-羟基-2-氰基吡嗪生成6-氯-3-羟基-2-酰胺吡嗪、催化6-溴-3-羟基-2-氰基吡嗪生成6-溴-3-羟基-2-酰胺吡嗪、催化6-碘-3-羟基-2-氰基吡嗪生成6-碘-3-羟基-2-酰胺吡嗪。

在本发明中，所述应用优选的包括以下步骤：以氰基吡嗪类化合物为底物，在水溶液中，利用离体的腈水合酶或体外表达腈水合酶的细胞作为催化剂，进行水合反应，获得酰胺吡嗪类化合物。

在本发明中，所述底物在水中的浓度优选为2～4g/L，更优选为3g/L；当以体外表达腈水合酶的细胞作为催化剂时，所述催化剂的添加量以12000rpm离心10min后的细胞湿重计，细胞的添加量优选为反应液重量的1％～20％，更优选为5％～15％，最优选为10％；当以离体的腈水合酶作为催化剂时，离体的腈水合酶的添加量优选为每升反应液中10～10000U，更优选为100～5000U，最优选为500～1000U；所述反应液由底物和水组成。

在本发明中，所述水合反应的温度优选为10～50℃，更优选为20～30℃，所述水合反应的pH值优选为5～10，更优选为6～8，最优选为7。

本发明中，所述体外表达腈水合酶的细胞(基因工程菌)的制备方法包括：将表达腈水合酶的基因构建到目标质粒载体中、导入表达宿主菌中，得到体外表达腈水合酶的细胞；所述目标质粒载体优选为pET-30a(+)、pET-21a(+)、pET-22b(+)、pET-28a(+)、pETDuet-1或pACYCDuet-1，但不仅限于所述的这些载体，优选为pET-28a(+)，酶切位点优选为EcoRI/BamHI和HindIII；所述表达宿主菌优选为大肠杆菌，更优选为E.coliBL21(DE3)。本发明对将表达腈水合酶的基因构建到目标质粒载体中、导入表达宿主菌中的具体方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。

在本发明中，来源于所述根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的腈水合酶的核苷酸(基因)序列(GenBank登录号AJ511276.1)如SEQ ID NO.7所示，具体为：

atgtcacatgatcatgatcataccgaaccgccgactgagatcgcgctgcgtgtcaaggccctggagtccctgcttacggaaaagggacttgtcgatcccgctgcactcgatgagctcgttgacacgtacgagaacaggatcggaccccgcaacggggcgcttgttgtcgcaaaagcctggacggatcctgcctacaaacaacgcttgctgaccaacgctacggaggcaatcgccgagctcggcttttccggtgttcagggcgaggacatgctggtggtggaaaattcgcccaccgtgcataacatgaccgtctgcacgctttgctcctgctacccctggccgaccctcgggctgccgccggcgtggtacaaatccgcgccctatcgttcccgcgtcgtcatcgatccgcgcggcgtccttgccgaattcggcgtcagcgttcccgccgacaaggaagtccgtgtttgggacagcagcgccgagcttcgctacctggtcctgccagaacgcccggcgggaacggagggctggagcgaagagcagcttgtcgaactcgtgacacgcgattcgatgatcgggaccggctttcccaaaaacccggccgatcttcactaactccaatccaagaaggggaatgagcatgaatggagtacatgatctcggcggaatgcacgggcttggcccgatcgcgccgcctgccgacgagccggtgttcgcccaccagtgggagcggcgcatttttgcgctgttcgttccgttgttcgggggcgggcatttcaatgtcgaccagttccgccacgctatcgagcggatggatccggcgcattatcttcaagggacctactacgagcactggctgcatgcgttcgaaacccttctgatagagggtggtgcaatctcgcgagcggaactcgacgcccggatcaaacagatcggaggggcacagataatggccgtcgtcaccagagatatgatcgagccgattgtcaggaccggcgcctccgctcgcgtcgctgcagacgtcgccgcgagattcaaagtgggcgacacggtccgcgccaaaaatatcaatccgacgacccatacgcggttgccgcgctacgtccgcggcagggtcggaacaatcgagatcgatcacggcgtcttcgtgacgcctgataccgttgcccatggcaagggcgagcatccgcagcatgtctattgcgtgcggttcgccgcagtcgagctttggggttcggatgtttccggcaccgataatgtccgcatcgacttgtgggatgactatctggagaaggcataa。

在本发明中，来源于所述聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM12614)的腈水合酶的核苷酸(基因)序列(GenBank登录号AAUW01000001.1)如SEQ ID NO.8所示，具体为：

atgtccgctcacgaccacgatcatccccacgatcacgaccattccgaattgagcgagatcgagctgcgtgtgcgcgccctggaaacgctgctgacggaaaaggggtacatcgatcctcctgccctggatgaactcatcgagacctacgagacaaaaatcggcccccggaacggcgctctggtggtggcaaaggcctggacggatccggactatcgggaacggctgatgaaagacgcaacggcggccattgccgaacttggtttcaccggccggcagggcgaacacatggtagcggtcgagaataccgacgacattcacaacatggtcgtctgcacgctgtgctcctgttatccatggacagtgctgggcctgccgccggtctggtacaagtctgcgccctaccgctccagagccgtacgcgacccgcgcggcgttctggctgagttcaaggtagaactgcccgatgacaccgagatccgcgtttgggattcgacggcagaaatccggtatctggtgatcccgaaacgtcctgccggaaccgatggctggagcgaagagcgcctcgccgatctggtcacccgcaacagcatgatcggaacgggccttgccctcgatccttcctccctggaggacgcagcatgaacggtgcacaggatctgggcggacagatgggctttggccccattgaactggaagaaaacgagccgaactttcacgccaaatgggaagaacgcgcctttgccgtgacattggccatgggcgcgaccggatcctggacgctggatgcctcgcgctttgcccgcgaatccttgccgccggtcacctacctctcttccagctattacgagatctggacccgcgggcttgaaaaactcctgctctccaacggtctggtcacggaagaagagctgaaggaaggacgcaaacttaaagaggccaagccgatcaagcgtgtgctctcggcggacgctgtcgccggggtcctggcgaagggatcgtcggtcgaccgtgaagagcatcagcctgccaggttccgcaccggtgacagggttaagacacggcgcatgaaccccgaacatcacacccgcctgccccgttacgcccgcgatgccgtcggcacgatcgaggccattcacggcgttcacgtgtttccggacaccaatgcccacggcgaaggcgaacagcctgcctggctctatggcgtcctcttcaagggcactgacatctgggggccggacagcgatcccaagcttaccctgcgcatcgatctctgggagccatatcttgaccttgcccgctga。

在本发明中，来源于所述苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的腈水合酶的核苷酸(基因)序列(NCBI登录号NC_018700.1)如SEQ ID NO.9所示，具体为：

atgtccgaacatcatcatgggcatggcgacgatcacggccatcaccacgacaaccacctgaccgacatggaagcccgggtaaaggcgttggagacggtgctgacggaaaagggtttgatcgatcctgcggcgatcgacgcgatcgtcgacgcgtacgagacgaaggtgggaccgcgaaacggcgcacgcgtcgtcgccaaggcctggagcgatccgggttttgccgattggctgaaacgcgacgcgaccgcggcgatcgccagcctcggctttaccgggcgccagggcgagcacatgcgtgcggtgttcaacacgtccgagacgcacaacctcatcgtctgtacgctgtgctcctgctatccctgggcagtgctggggctgccgccggtctggtacaaggcgccgccctatcgttcgcgcgccgtcatcgatccccgcggcgtgcttgccgaattcgggctcgagctgtcggctgaaaagaaggggactgtcaggaattctgtgcggtgggccatgatgatgaaaaggagagaatcatcacatggctatcgagaaagaacttctggaccagctcctggctggacgtgaatgaacggtccgcatgatctcggcggccagcatggcatgggcccgatcgctccggaacgcaatgagcccattttccatgcagagtgggagaagcgggcgctcggcatcacgctttcctgtggcgctttcggtgcctggacgctggacgaaagccggcacgcgcgcgaaagcctggccccggcgacctatctctccgcgagctattatgaaatctggactcgagccctggaaacgcttctcaagcgccatggcttcgtgacgcaggccgagctcgatgccggccatatgctcgacaaggggcgggagccgaaacgggtgctcacagcggacatggtggccggcgtgctcgccaagggcgggccatgcgaccggccggtcgaagcgccgccgcgctttgccgccggcgacagtgtgcgtacgaagaacttcaatccggagagccacacgcgcctgccgcgctacgcccgcgcccggacaggcatggtggaggccgtgcagggcagcttcgtcttcccggacgacaacgcccacggcaagggcgagaacccgcaatggctctacatggtggtcttcgatgccggcgagatctggggtgagggcgcggacccgacgcttaccgtctccatcgatgcctgggagagctatcttgaacacgcttag。

在本发明具体实施过程中，将腈水合酶基因序列由上海生工生物工程技术有限公司全基因合成，并构建在质粒载体pET-28a(+)上，酶切位点为EcoRI/BamHI和HindIII；然后将构建好的质粒导入表达宿主E.coliBL21(DE3)菌株中，得到基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NHx。

得到基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NHx后，本发明将E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NHx接种于液体培养基，进行培养至菌体密度OD600值达到0.8～1.0，获得基因工程菌的培养液；所述液体培养基以水为溶剂，包括以下组分：蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L和NaCl10g/L；所述液体培养基的pH值优选为7.0；所述培养的温度优选为35～40℃，培养转速优选为180～220rpm。

本发明的基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NHx能够在常规的IPTG诱导条件下高效表达腈水合酶蛋白；所述IPTG的终浓度优选为0.5mM。

在本发明的催化反应体系中，催化剂的使用形式为基因工程菌细胞破碎后的粗酶液、表达重组酶的工程菌静息细胞、纯化后的纯酶或者是经固定化后的酶。

在本发明中，所述水合反应的介质优选为纯水或添加缓冲盐的水溶液；所述缓冲盐优选为Tris-HCl；所述Tris-HCl的浓度优选为50mM。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例中的材料与方法为：

本发明中的实验方法如无特别说明均为常规方法，具体可参见J.萨姆布鲁克等编的《分子克隆实验指南》。

本发明实施例中使用的限制性内切酶DNA连接酶等工具酶均购自TaKaRa，宝生物工程(大连)有限公司；基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA回收纯化试剂盒购自Axygen杭州有限公司；E.coliDH5α、E.coliBL21(DE3)、质粒pET-30a(+)、pET-21a(+)，pET-22b(+)等购自Novagen公司；DNAmarker、FastPfuDNA聚合酶、低分子量标准蛋白、琼脂糖电泳试剂购自北京全式金生物技术有限公司；基因合成与序列测序工作由上海生工生物工程技术有限公司完成。以上试剂使用方法参考商品说明书。原料氰基吡嗪类化合物均购自于(中国)浙江恒康药业股份有限公司。

实施例1

一、腈水合酶基因的获取

收集已报道的钴型腈水合酶的氨基酸序列，采用ClustalW2的方法(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2)分别对腈水合酶进行多序列比对，确定序列中的保守区域。以保守区域的氨基酸序列为分子探针，用于后续在基因信息数据库中腈水合酶基因的搜索。通过对已报道的腈水合酶氨基酸序列的比对，选择其α亚基中的一段保守氨基酸序列-CTLCSC-作为分子探针，采用BasicLocalAlignmentSearchTool(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)在GenBank生物信息数据(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/)库中搜索同源序列。挑选已报道的和经过全基因组测序后注解为腈水合酶的基因。将上述搜索到的腈水合酶的氨基酸序列分别进行汇总，并用ClustalW2的方法进行多序列比对，剔除相似度在95％以上的氨基酸序列，获得的腈水合酶具体信息如表1所示。

表1腈水合酶酶库信息

二、表达腈水合酶基因的菌株的构建

将腈水合酶基因序列提交给基因合成公司进行全基因合成，并构建在质粒载体pET-28a(+)上，酶切位点为EcoRI/BamHI和HindIII；然后将构建好的质粒导入表达宿主E.coliBL21(DE3)菌株中，即为基因工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NHx。

若要将腈水合酶基因构建在其他表达质粒上，可提取质粒pET-28a(+)，将经过双酶切后纯化回收的目标基因片段和目标空质粒分别用相应的限制性内切酶进行双酶切，酶切条件和体系如表2所示；之后用T4DNA连接酶将目标基因片段与目标质粒进行连接，连接体系如表3所示。

表2双酶切体系和条件

表3构建重组表达质粒的连接体系

三、腈水合酶的重组表达

将构建成功的工程菌接种于5mL液体培养基中，37℃摇床中，200rpm震荡培养10h。取培养好的培养液，按10％的接种量接种于新鲜液体培养基中。37℃摇床中，200rpm震荡培养2～3h，当菌体密度OD600值达到0.8时，降温到18℃，并加入IPTG至其终浓度为0.5mM。之后将三角瓶转入18℃摇床中，200rpm继续培养16h。

四、重组腈水合酶的酶活测定

以6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪为底物，来检测重组腈水合酶的酶活，同时考虑重组腈水合酶最适pH值和温度的不同，具体操作步骤和检测方法如下所述。

重组腈水合酶活力测定体系为：总反应体系为5.0mL，磷酸盐缓冲液(100mM，pH7.0)，5mM底物，添加适量的表达腈水合酶的工程菌细胞。在25℃下震荡反应60min，取样500μL立即加入500μL纯乙腈来终止反应。反应混合液12，000×g离心5min，除去细胞和酶蛋白。用高效液相色谱法来测定反应体系中所生成的6-氟-3-羟基-2-酰胺吡嗪，色谱柱为C18柱(5μm，4.6×250mm，Agilent)，流动相为10mMKH₂PO₄缓冲液：乙腈＝8:2(v/v)，流速为0.5mL/min。UV检测器进行检测，检测波长225nm。分析图谱如图2所示，按出峰时间先后顺序依次为6-氟-3-羟基-2-酰胺吡嗪和6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪，其保留时间分别为11.2min和16.5min。酶活定义：在25℃下，1min能转化底物(6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪)生成1μmol产物(6-氟-3-羟基-2-酰胺吡嗪)的酶量，即为1U。对所有重组腈水合酶进行活力测定，结果如表4所示。由表4可以看出，仅有来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM 12614)和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)的三种腈水合酶(NH16、NH25、NH27)具有相应的催化活力。

表4腈水合酶的活力测定

实施例2基因工程菌催化2-氰基吡嗪生成2-酰胺吡嗪

取25ml实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NH16的发酵液，12000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml50mMTris-HCl(pH8.0)的缓冲液重悬收集的菌体，重悬酶液的酶活力为10U/ml。向重悬液中加入1.0g2-氰基吡嗪，20℃下进行水合反应，反应24h。之后用液相色谱法检测反应体系内的2-氰基吡嗪、2-酰胺吡嗪和2-羧基吡嗪的含量。底物的转化率大于99％，2-酰胺吡嗪的产率大于92％，在反应体系中没有发现2-羧基吡嗪的生成。

实施例3基因工程菌催化3-甲基-2-氰基吡嗪生成3-甲基-2-酰胺吡嗪

取25ml实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NH27的发酵液，12000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml50mMTris-HCl(pH6.0)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。向重悬液中加入0.5g3-甲基-2-氰基吡嗪，在30℃下进行水合反应，反应120h。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的3-甲基-2-氰基吡嗪和3-甲基-2-酰胺吡嗪的含量。底物转化率大于99％，3-甲基-2-酰胺吡嗪产率大于89％。

实施例4基因工程菌催化6-甲基-2氰基吡嗪生成6-甲基-2酰胺吡嗪

取25ml实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NH25的发酵液，12000rpm，10min离心收集菌体，然后用10ml50mMTris-HCl(pH7.5)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。向重悬液中加入1.0g6-甲基-2氰基吡嗪，在25℃下进行水合反应，反应12h。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的6-甲基-2氰基吡嗪和6-甲基-2酰胺吡嗪的含量。底物转化率大于99％，6-甲基-2酰胺吡嗪产率大于99％。

实施例5基因工程菌催化6-甲基-3-羟基-2-氰基吡嗪生成6-甲基-3-羟基-2酰胺吡嗪

取25ml实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NH25的发酵液，12000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml50mMTris-HCl(pH8.0)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。向重悬液中加入0.6g6-甲基-3-羟基-2氰基吡嗪，在30℃下进行水合反应，反应26h。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的6-甲基-3-羟基-2-氰基吡嗪和6-甲基-3-羟基-2-酰胺吡嗪的含量。底物转化率大于99％，6-甲基-3-羟基-2酰胺吡嗪产率大于99％。

实施例6基因工程菌催化6-溴-3-氨基-2-氰基吡嗪生成6-溴-3-氨基-2-酰胺吡嗪

取25ml实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-30a(+)-NH25的发酵液，12000rpm，10min离心收集菌体，然后用25ml50mMTris-HCl(pH7.0)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。向重悬液中加入0.5g6-溴-3-氨基-2-氰基吡嗪，在35℃下进行水合反应，反应48h。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的6-溴-3-氨基-2-氰基吡嗪和6-溴-3-氨基-2-酰胺吡嗪的含量。底物转化率大于99％，6-溴-3-氨基-2-酰胺吡嗪产率大于99％。

实施例7基因工程菌催化6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪生成6-氟-3-羟基-2-酰胺吡嗪

取25ml实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-21a(+)-NH25的发酵液，12000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml50mMTris-HCl(pH7.0)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。向重悬液中加入0.75g6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪，在25℃下进行水合反应，反应18h。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪和6-氟-3-羟基-2-酰胺吡嗪的含量。底物转化率大于99％，6-氟-3-羟基-2-酰胺吡嗪产率大于99％。

实施例8基因工程菌催化6-氯-3-羟基-2-氰基吡嗪生成6-氯-3-羟基-2-酰胺吡嗪

取25ml实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-22b(+)-NH25的发酵液，12000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml50mMTris-HCl(pH7.0)的缓冲液对收集的菌体进行重悬、超声破胞获得离体的腈水合酶NH25的离体粗酶液，测定腈水合酶的酶活为1035.16U/L。向粗酶液中加入0.75g6-氯-3-羟基-2-氰基吡嗪，在40℃下进行水合反应，反应23h。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的6-氯-3-羟基-2-氰基吡嗪和6-氯-3-羟基-2-酰胺吡嗪的含量。底物转化率大于99％，6-氯-3-羟基-2-酰胺吡嗪产率大于99％。

实施例9基因工程菌催化6-溴-3-羟基-2-氰基吡嗪生成6-溴-3-羟基-2-酰胺吡嗪

取25ml实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pETDuet-NH25的发酵液，12000rpm，10min离心收集菌体，然后用10ml50mMTris-HCl(pH7.0)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。向重悬液中加入0.75g6-溴-3-羟基-2-氰基吡嗪，在20℃下进行水合反应，反应54h。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的6-溴-3-羟基-2-氰基吡嗪和6-溴-3-羟基-2-酰胺吡嗪的含量。底物转化率大于99％，6-溴-3-羟基-2-酰胺吡嗪产率大于99％。

实施例10基因工程菌催化6-碘-3-羟基-2-氰基吡嗪生成6-碘-3-羟基-2-酰胺吡嗪

取25ml实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pACYCDuet-NH25的发酵液，12000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml50mMTris-HCl(pH7.0)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。向重悬液中加入0.75g6-碘-3-羟基-2-氰基吡嗪，在20℃下进行水合反应，反应103h。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的6-碘-3-羟基-2-氰基吡嗪和6-碘-3-羟基-2-酰胺吡嗪的含量。底物转化率大于99％，6-碘-3-羟基-2-酰胺吡嗪产率大于99％。

对比例1

取25ml实施例1构建的工程菌E.coliBL21(DE3)/pET-28a(+)-NH4的发酵液，12000rpm，10min离心收集菌体，然后用250ml50mMTris-HCl(pH7.0)的缓冲液对收集的菌体进行重悬。向重悬液中加入0.75g6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪，在25℃下进行水合反应，反应120h。之后用高效液相色谱法来检测反应体系内的6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪和6-氟-3-羟基-2-酰胺吡嗪的含量，未监测到产物的生成。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江恒康药业股份有限公司

<120> 聚集性葡萄球菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 204

<212> PRT

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 1

Met Ser His Asp His Asp His Thr Glu Pro Pro Thr Glu Ile Ala Leu

1 5 10 15

Arg Val Lys Ala Leu Glu Ser Leu Leu Thr Glu Lys Gly Leu Val Asp

20 25 30

Pro Ala Ala Leu Asp Glu Leu Val Asp Thr Tyr Glu Asn Arg Ile Gly

35 40 45

Pro Arg Asn Gly Ala Leu Val Val Ala Lys Ala Trp Thr Asp Pro Ala

50 55 60

Tyr Lys Gln Arg Leu Leu Thr Asn Ala Thr Glu Ala Ile Ala Glu Leu

65 70 75 80

Gly Phe Ser Gly Val Gln Gly Glu Asp Met Leu Val Val Glu Asn Ser

85 90 95

Pro Thr Val His Asn Met Thr Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro

100 105 110

Trp Pro Thr Leu Gly Leu Pro Pro Ala Trp Tyr Lys Ser Ala Pro Tyr

115 120 125

Arg Ser Arg Val Val Ile Asp Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly

130 135 140

Val Ser Val Pro Ala Asp Lys Glu Val Arg Val Trp Asp Ser Ser Ala

145 150 155 160

Glu Leu Arg Tyr Leu Val Leu Pro Glu Arg Pro Ala Gly Thr Glu Gly

165 170 175

Trp Ser Glu Glu Gln Leu Val Glu Leu Val Thr Arg Asp Ser Met Ile

180 185 190

Gly Thr Gly Phe Pro Lys Asn Pro Ala Asp Leu His

195 200

<210> 2

<211> 219

<212> PRT

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 2

Met Asn Gly Val His Asp Leu Gly Gly Met His Gly Leu Gly Pro Ile

1 5 10 15

Ala Pro Pro Ala Asp Glu Pro Val Phe Ala His Gln Trp Glu Arg Arg

20 25 30

Ile Phe Ala Leu Phe Val Pro Leu Phe Gly Gly Gly His Phe Asn Val

35 40 45

Asp Gln Phe Arg His Ala Ile Glu Arg Met Asp Pro Ala His Tyr Leu

50 55 60

Gln Gly Thr Tyr Tyr Glu His Trp Leu His Ala Phe Glu Thr Leu Leu

65 70 75 80

Ile Glu Gly Gly Ala Ile Ser Arg Ala Glu Leu Asp Ala Arg Ile Lys

85 90 95

Gln Ile Gly Gly Ala Gln Ile Met Ala Val Val Thr Arg Asp Met Ile

100 105 110

Glu Pro Ile Val Arg Thr Gly Ala Ser Ala Arg Val Ala Ala Asp Val

115 120 125

Ala Ala Arg Phe Lys Val Gly Asp Thr Val Arg Ala Lys Asn Ile Asn

130 135 140

Pro Thr Thr His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr Val Arg Gly Arg Val Gly

145 150 155 160

Thr Ile Glu Ile Asp His Gly Val Phe Val Thr Pro Asp Thr Val Ala

165 170 175

His Gly Lys Gly Glu His Pro Gln His Val Tyr Cys Val Arg Phe Ala

180 185 190

Ala Val Glu Leu Trp Gly Ser Asp Val Ser Gly Thr Asp Asn Val Arg

195 200 205

Ile Asp Leu Trp Asp Asp Tyr Leu Glu Lys Ala

210 215

<210> 3

<211> 213

<212> PRT

<213> 聚集性葡萄球菌(Stappia aggregataI AM12614)

<400> 3

Met Ser Ala His Asp His Asp His Pro His Asp His Asp His Ser Glu

1 5 10 15

Leu Ser Glu Ile Glu Leu Arg Val Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu Thr

20 25 30

Glu Lys Gly Tyr Ile Asp Pro Pro Ala Leu Asp Glu Leu Ile Glu Thr

35 40 45

Tyr Glu Thr Lys Ile Gly Pro Arg Asn Gly Ala Leu Val Val Ala Lys

50 55 60

Ala Trp Thr Asp Pro Asp Tyr Arg Glu Arg Leu Met Lys Asp Ala Thr

65 70 75 80

Ala Ala Ile Ala Glu Leu Gly Phe Thr Gly Arg Gln Gly Glu His Met

85 90 95

Val Ala Val Glu Asn Thr Asp Asp Ile His Asn Met Val Val Cys Thr

100 105 110

Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Thr Val Leu Gly Leu Pro Pro Val Trp

115 120 125

Tyr Lys Ser Ala Pro Tyr Arg Ser Arg Ala Val Arg Asp Pro Arg Gly

130 135 140

Val Leu Ala Glu Phe Lys Val Glu Leu Pro Asp Asp Thr Glu Ile Arg

145 150 155 160

Val Trp Asp Ser Thr Ala Glu Ile Arg Tyr Leu Val Ile Pro Lys Arg

165 170 175

Pro Ala Gly Thr Asp Gly Trp Ser Glu Glu Arg Leu Ala Asp Leu Val

180 185 190

Thr Arg Asn Ser Met Ile Gly Thr Gly Leu Ala Leu Asp Pro Ser Ser

195 200 205

Leu Glu Asp Ala Ala

210

<210> 4

<211> 220

<212> PRT

<213> 聚集性葡萄球菌(Stappia aggregataI AM12614)

<400> 4

Met Asn Gly Ala Gln Asp Leu Gly Gly Gln Met Gly Phe Gly Pro Ile

1 5 10 15

Glu Leu Glu Glu Asn Glu Pro Asn Phe His Ala Lys Trp Glu Glu Arg

20 25 30

Ala Phe Ala Val Thr Leu Ala Met Gly Ala Thr Gly Ser Trp Thr Leu

35 40 45

Asp Ala Ser Arg Phe Ala Arg Glu Ser Leu Pro Pro Val Thr Tyr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Tyr Tyr Glu Ile Trp Thr Arg Gly Leu Glu Lys Leu Leu

65 70 75 80

Leu Ser Asn Gly Leu Val Thr Glu Glu Glu Leu Lys Glu Gly Arg Lys

85 90 95

Leu Lys Glu Ala Lys Pro Ile Lys Arg Val Leu Ser Ala Asp Ala Val

100 105 110

Ala Gly Val Leu Ala Lys Gly Ser Ser Val Asp Arg Glu Glu His Gln

115 120 125

Pro Ala Arg Phe Arg Thr Gly Asp Arg Val Lys Thr Arg Arg Met Asn

130 135 140

Pro Glu His His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr Ala Arg Asp Ala Val Gly

145 150 155 160

Thr Ile Glu Ala Ile His Gly Val His Val Phe Pro Asp Thr Asn Ala

165 170 175

His Gly Glu Gly Glu Gln Pro Ala Trp Leu Tyr Gly Val Leu Phe Lys

180 185 190

Gly Thr Asp Ile Trp Gly Pro Asp Ser Asp Pro Lys Leu Thr Leu Arg

195 200 205

Ile Asp Leu Trp Glu Pro Tyr Leu Asp Leu Ala Arg

210 215 220

<210> 5

<211> 195

<212> PRT

<213> 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)

<400> 5

Met Ser Glu His His His Gly His Gly Asp Asp His Gly His His His

1 5 10 15

Asp Asn His Leu Thr Asp Met Glu Ala Arg Val Lys Ala Leu Glu Thr

20 25 30

Val Leu Thr Glu Lys Gly Leu Ile Asp Pro Ala Ala Ile Asp Ala Ile

35 40 45

Val Asp Ala Tyr Glu Thr Lys Val Gly Pro Arg Asn Gly Ala Arg Val

50 55 60

Val Ala Lys Ala Trp Ser Asp Pro Gly Phe Ala Asp Trp Leu Lys Arg

65 70 75 80

Asp Ala Thr Ala Ala Ile Ala Ser Leu Gly Phe Thr Gly Arg Gln Gly

85 90 95

Glu His Met Arg Ala Val Phe Asn Thr Ser Glu Thr His Asn Leu Ile

100 105 110

Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Ala Val Leu Gly Leu Pro

115 120 125

Pro Val Trp Tyr Lys Ala Pro Pro Tyr Arg Ser Arg Ala Val Ile Asp

130 135 140

Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly Leu Glu Leu Ser Ala Glu Lys

145 150 155 160

Lys Gly Thr Val Arg Asn Ser Val Arg Trp Ala Met Met Met Lys Arg

165 170 175

Arg Glu Ser Ser His Gly Tyr Arg Glu Arg Thr Ser Gly Pro Ala Pro

180 185 190

Gly Trp Thr

195

<210> 6

<211> 219

<212> PRT

<213> 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)

<400> 6

Met Asn Gly Pro His Asp Leu Gly Gly Gln His Gly Met Gly Pro Ile

1 5 10 15

Ala Pro Glu Arg Asn Glu Pro Ile Phe His Ala Glu Trp Glu Lys Arg

20 25 30

Ala Leu Gly Ile Thr Leu Ser Cys Gly Ala Phe Gly Ala Trp Thr Leu

35 40 45

Asp Glu Ser Arg His Ala Arg Glu Ser Leu Ala Pro Ala Thr Tyr Leu

50 55 60

Ser Ala Ser Tyr Tyr Glu Ile Trp Thr Arg Ala Leu Glu Thr Leu Leu

65 70 75 80

Lys Arg His Gly Phe Val Thr Gln Ala Glu Leu Asp Ala Gly His Met

85 90 95

Leu Asp Lys Gly Arg Glu Pro Lys Arg Val Leu Thr Ala Asp Met Val

100 105 110

Ala Gly Val Leu Ala Lys Gly Gly Pro Cys Asp Arg Pro Val Glu Ala

115 120 125

Pro Pro Arg Phe Ala Ala Gly Asp Ser Val Arg Thr Lys Asn Phe Asn

130 135 140

Pro Glu Ser His Thr Arg Leu Pro Arg Tyr Ala Arg Ala Arg Thr Gly

145 150 155 160

Met Val Glu Ala Val Gln Gly Ser Phe Val Phe Pro Asp Asp Asn Ala

165 170 175

His Gly Lys Gly Glu Asn Pro Gln Trp Leu Tyr Met Val Val Phe Asp

180 185 190

Ala Gly Glu Ile Trp Gly Glu Gly Ala Asp Pro Thr Leu Thr Val Ser

195 200 205

Ile Asp Ala Trp Glu Ser Tyr Leu Glu His Ala

210 215

<210> 7

<211> 1300

<212> DNA

<213> 根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)

<400> 7

atgtcacatg atcatgatca taccgaaccg ccgactgaga tcgcgctgcg tgtcaaggcc 60

ctggagtccc tgcttacgga aaagggactt gtcgatcccg ctgcactcga tgagctcgtt 120

gacacgtacg agaacaggat cggaccccgc aacggggcgc ttgttgtcgc aaaagcctgg 180

acggatcctg cctacaaaca acgcttgctg accaacgcta cggaggcaat cgccgagctc 240

ggcttttccg gtgttcaggg cgaggacatg ctggtggtgg aaaattcgcc caccgtgcat 300

aacatgaccg tctgcacgct ttgctcctgc tacccctggc cgaccctcgg gctgccgccg 360

gcgtggtaca aatccgcgcc ctatcgttcc cgcgtcgtca tcgatccgcg cggcgtcctt 420

gccgaattcg gcgtcagcgt tcccgccgac aaggaagtcc gtgtttggga cagcagcgcc 480

gagcttcgct acctggtcct gccagaacgc ccggcgggaa cggagggctg gagcgaagag 540

cagcttgtcg aactcgtgac acgcgattcg atgatcggga ccggctttcc caaaaacccg 600

gccgatcttc actaactcca atccaagaag gggaatgagc atgaatggag tacatgatct 660

cggcggaatg cacgggcttg gcccgatcgc gccgcctgcc gacgagccgg tgttcgccca 720

ccagtgggag cggcgcattt ttgcgctgtt cgttccgttg ttcgggggcg ggcatttcaa 780

tgtcgaccag ttccgccacg ctatcgagcg gatggatccg gcgcattatc ttcaagggac 840

ctactacgag cactggctgc atgcgttcga aacccttctg atagagggtg gtgcaatctc 900

gcgagcggaa ctcgacgccc ggatcaaaca gatcggaggg gcacagataa tggccgtcgt 960

caccagagat atgatcgagc cgattgtcag gaccggcgcc tccgctcgcg tcgctgcaga 1020

cgtcgccgcg agattcaaag tgggcgacac ggtccgcgcc aaaaatatca atccgacgac 1080

ccatacgcgg ttgccgcgct acgtccgcgg cagggtcgga acaatcgaga tcgatcacgg 1140

cgtcttcgtg acgcctgata ccgttgccca tggcaagggc gagcatccgc agcatgtcta 1200

ttgcgtgcgg ttcgccgcag tcgagctttg gggttcggat gtttccggca ccgataatgt 1260

ccgcatcgac ttgtgggatg actatctgga gaaggcataa 1300

<210> 8

<211> 1301

<212> DNA

<213> 聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata IAM12614)

<400> 8

atgtccgctc acgaccacga tcatccccac gatcacgacc attccgaatt gagcgagatc 60

gagctgcgtg tgcgcgccct ggaaacgctg ctgacggaaa aggggtacat cgatcctcct 120

gccctggatg aactcatcga gacctacgag acaaaaatcg gcccccggaa cggcgctctg 180

gtggtggcaa aggcctggac ggatccggac tatcgggaac ggctgatgaa agacgcaacg 240

gcggccattg ccgaacttgg tttcaccggc cggcagggcg aacacatggt agcggtcgag 300

aataccgacg acattcacaa catggtcgtc tgcacgctgt gctcctgtta tccatggaca 360

gtgctgggcc tgccgccggt ctggtacaag tctgcgccct accgctccag agccgtacgc 420

gacccgcgcg gcgttctggc tgagttcaag gtagaactgc ccgatgacac cgagatccgc 480

gtttgggatt cgacggcaga aatccggtat ctggtgatcc cgaaacgtcc tgccggaacc 540

gatggctgga gcgaagagcg cctcgccgat ctggtcaccc gcaacagcat gatcggaacg 600

ggccttgccc tcgatccttc ctccctggag gacgcagcat gaacggtgca caggatctgg 660

gcggacagat gggctttggc cccattgaac tggaagaaaa cgagccgaac tttcacgcca 720

aatgggaaga acgcgccttt gccgtgacat tggccatggg cgcgaccgga tcctggacgc 780

tggatgcctc gcgctttgcc cgcgaatcct tgccgccggt cacctacctc tcttccagct 840

attacgagat ctggacccgc gggcttgaaa aactcctgct ctccaacggt ctggtcacgg 900

aagaagagct gaaggaagga cgcaaactta aagaggccaa gccgatcaag cgtgtgctct 960

cggcggacgc tgtcgccggg gtcctggcga agggatcgtc ggtcgaccgt gaagagcatc 1020

agcctgccag gttccgcacc ggtgacaggg ttaagacacg gcgcatgaac cccgaacatc 1080

acacccgcct gccccgttac gcccgcgatg ccgtcggcac gatcgaggcc attcacggcg 1140

ttcacgtgtt tccggacacc aatgcccacg gcgaaggcga acagcctgcc tggctctatg 1200

gcgtcctctt caagggcact gacatctggg ggccggacag cgatcccaag cttaccctgc 1260

gcatcgatct ctgggagcca tatcttgacc ttgcccgctg a 1301

<210> 9

<211> 1248

<212> DNA

<213> 苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)

<400> 9

atgtccgaac atcatcatgg gcatggcgac gatcacggcc atcaccacga caaccacctg 60

accgacatgg aagcccgggt aaaggcgttg gagacggtgc tgacggaaaa gggtttgatc 120

gatcctgcgg cgatcgacgc gatcgtcgac gcgtacgaga cgaaggtggg accgcgaaac 180

ggcgcacgcg tcgtcgccaa ggcctggagc gatccgggtt ttgccgattg gctgaaacgc 240

gacgcgaccg cggcgatcgc cagcctcggc tttaccgggc gccagggcga gcacatgcgt 300

gcggtgttca acacgtccga gacgcacaac ctcatcgtct gtacgctgtg ctcctgctat 360

ccctgggcag tgctggggct gccgccggtc tggtacaagg cgccgcccta tcgttcgcgc 420

gccgtcatcg atccccgcgg cgtgcttgcc gaattcgggc tcgagctgtc ggctgaaaag 480

aaggggactg tcaggaattc tgtgcggtgg gccatgatga tgaaaaggag agaatcatca 540

catggctatc gagaaagaac ttctggacca gctcctggct ggacgtgaat gaacggtccg 600

catgatctcg gcggccagca tggcatgggc ccgatcgctc cggaacgcaa tgagcccatt 660

ttccatgcag agtgggagaa gcgggcgctc ggcatcacgc tttcctgtgg cgctttcggt 720

gcctggacgc tggacgaaag ccggcacgcg cgcgaaagcc tggccccggc gacctatctc 780

tccgcgagct attatgaaat ctggactcga gccctggaaa cgcttctcaa gcgccatggc 840

ttcgtgacgc aggccgagct cgatgccggc catatgctcg acaaggggcg ggagccgaaa 900

cgggtgctca cagcggacat ggtggccggc gtgctcgcca agggcgggcc atgcgaccgg 960

ccggtcgaag cgccgccgcg ctttgccgcc ggcgacagtg tgcgtacgaa gaacttcaat 1020

ccggagagcc acacgcgcct gccgcgctac gcccgcgccc ggacaggcat ggtggaggcc 1080

gtgcagggca gcttcgtctt cccggacgac aacgcccacg gcaagggcga gaacccgcaa 1140

tggctctaca tggtggtctt cgatgccggc gagatctggg gtgagggcgc ggacccgacg 1200

cttaccgtct ccatcgatgc ctgggagagc tatcttgaac acgcttag 1248

Claims

1.聚集性葡萄球菌来源的腈水合酶在制备酰胺吡嗪类化合物中的应用；所述腈水合酶催化氰基吡嗪类化合物水合反应生成酰胺吡嗪类化合物；所述腈水合酶来源于聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata) IAM 12614；

所述来源于所述聚集性葡萄球菌(Stappia aggregata) IAM 12614的腈水合酶的α亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，β亚基的氨基酸序列如SEQ ID NO.4；

所述的氰基吡嗪类化合物为6-甲基-2-氰基吡嗪，6-甲基-3-羟基-2-氰基吡嗪，6-溴-3-氨基-2-氰基吡嗪，6-氟-3-羟基-2-氰基吡嗪，6-氯-3-羟基-2-氰基吡嗪，6-溴-3-羟基-2-氰基吡嗪或6-碘-3-羟基-2-氰基吡嗪。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述应用包括以下步骤：以氰基吡嗪类化合物为底物，在水溶液中，利用离体的腈水合酶或体外表达腈水合酶的细胞作为催化剂，进行水合反应，获得酰胺吡嗪类化合物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述底物在水中的浓度为2～100g/L；当以体外表达腈水合酶的细胞作为催化剂时，所述催化剂的添加量以12000rpm离心10min后的细胞湿重计，细胞的添加量为反应液重量的1％～20％；当以离体的腈水合酶作为催化剂时，离体的腈水合酶的添加量为每升反应液中10～10000U。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水合反应的温度为10～50℃，所述水合反应的pH值为5～10。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述水合反应的温度为20～30℃；所述水合反应的pH值为6～8。