CN110396494A - 一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备及应用，包括基因敲除质粒的构建、基因敲除质粒对宿主微生物的转化，腈水合酶基因的转化等步骤，可有效敲除或抑制多种微生物宿主的烟酸磷酸核糖转移酶、吡啶酰胺脱氨酶、异分支酸酶、半胱氨酸水解酶、嘌呤核酸磷酸酶，降低上述酶蛋白的活性或直接失活，减少生物催化过程中生成副产物羧基吡啶的生成，使得合成的产物中3‑吡啶甲酰胺、4‑吡啶甲酰胺的脱氨副产物3‑羧基吡啶、4‑羧基吡啶含量较低或不含有副产物，利用这些重组微生物可高得率催化制备副产物含量低的3‑吡啶甲酰胺、4‑吡啶甲酰胺产品。

Description

一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备及应用

技术领域

本发明涉及微生物基因重组技术领域，特别涉及一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的 制备及应用。

背景技术

通过腈水合酶催化氰基吡啶生产吡啶甲酰胺的微生物转化法已经普遍用于工业生产，但 在利用生物静息细胞或固定化细胞生产吡啶酰胺的过程中，通常由于底盘细胞或微生物自身 所具备催化吡啶甲酰胺转化羧基吡啶的基因存在，导致在生物催化过程中生成副产物羧基吡 啶，并最终导致生产成品中羧基吡啶含量过高，影响吡啶甲酰胺在食品、药品、美容化妆品 的使用。尽管通过严格控制过程工艺温度，如及时加热或冷却、离心、陶瓷膜等膜技术过滤 能够部分缓解羧基吡啶副产物的生成，但工艺的改变大大增加了生产过程中的水电、设备、 人力等的投入，无法从根本上改变及突破现有的技术瓶颈。

发明内容

本发明所要解决的技术问题：本发明主要通过遗传基因水平改造，利用分子生物学及微 生物学中的基因敲除或敲入技术，降低或完全失活微生物代谢关键酶基因，降低或消除微生 物转化生成羧基吡啶的功能，从而避免氰基吡啶类化合物转化为吡啶甲酰胺类化合物过程中， 产生的酰胺基不可逆转脱氨后生成的相关羧基产物，从而降低或消除生物催化制品中副产物 羧基吡啶水平。

为解决上述技术问题，本发明提供以下的技术方案：

一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备方法，通过如下具体步骤制备：

(1)根据靶蛋白基因序列设计合成两对突变引物，以宿主微生物基因组为模板，利用突 变引物PCR扩增靶蛋白突变体基因，再利用靶蛋白突变体基因重组构建基因敲除质粒；

(2)将基因敲除质粒转化进入宿主微生物中，利用同源重组或基因编辑方法使靶蛋白基 因中至少一个酶活性相关基因突变，进而敲除或失活靶基因或靶蛋白，最终使得靶蛋白的酶 活性降低或完全丧失；所述靶基因或蛋白质包括但不限于烟酸磷酸核糖转移酶、吡啶酰胺脱 氨酶、异分支酸酶、半胱氨酸水解酶、嘌呤核酸磷酸酶，所述靶蛋白的主要催化产物为3-羧 基吡啶、4-羧基吡啶；

(3)通过基因重组方法将腈水合酶基因以游离质粒或以基因敲入整合至基因组的方式， 使微生物具有催化3-氰基吡啶、4-氰基吡啶等氰基吡啶化合物转化为3-吡啶甲酰胺、4-吡啶甲 酰胺等甲酰胺吡啶化合物的能力即得低副产物吡啶甲酰胺转化微生物。

优选地，所述同源重组方法为单交换或双交换法，所述基因编辑方法为Crispr/Cas9。

优选地，所述宿主微生物包括但不限于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母、马克斯克 鲁维酵母，红球菌属、谷氨酸棒杆菌。

优选地，所述靶基因或蛋白质序列包括但不限于SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQ NO.5、SEQ NO.6、SEQ NO.7、SEQ NO.8、SEQ NO.9、SEQ NO.10、SEQ NO.11、SEQ NO.12、SEQ NO.13、SEQ NO.14、SEQ NO.15、SEQ NO.16、SEQ NO.17、SEQ NO.18、 SEQNO.19、SEQ NO.20、SEQ NO.21、SEQ NO.22。

优选地，所述靶基因或蛋白质还包括与靶基因序列或靶蛋白质一级序列相似度不低于50％ 的基因或蛋白质。

优选地，所述酶活性相关基因突变包括但不限于基因点突变、部分基因缺失、基因完全 缺失、基因从原始基因座移位到新的基因座、基因序列倒转、基因序列中间任意位点插入不 相关基因、基因上游启动子序列钝化或失活、核糖体结合位点钝化或失活等方式。

优选地，所述敲除或失活后的靶基因序列或靶蛋白质一级序列通过Sanger测序、高通量基 因组测序、等点聚焦-聚丙烯酰胺凝胶、蛋白质质谱等方法，不能检测出基因序列或蛋白质序 列或者检测出的基因序列或蛋白质序列不具有完整性。

一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物，由上述的低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备 方法制备获得。

将上述低副产物吡啶甲酰胺转化微生物应用于催化氰基吡啶类化合物反应生产吡啶甲酰 胺，氰基基团水合后转化为甲酰胺基团，且不产或仅含有不大于30ppm的含羧基基团的吡啶 化合物；所述氰基吡啶的母体结构为杂环类吡啶，且在3位或4-位发生了氰基加成。

优选地，应用于催化3-氰基吡啶反应生产3-吡啶甲酰胺过程中，显著降低或不含有3-吡啶 甲酰胺脱氨后的副产物3-羧基吡啶的生成。

优选地，应用于催化4-氰基吡啶反应生产4-吡啶甲酰胺过程中，显著降低或不含有4-吡啶 甲酰胺脱氨后的副产物4-羧基吡啶的生成。

本发明获得的有益效果：

1、开发了一种吡啶甲酰胺生物催化反应合成方法，该方法采用本发明中构建的低副产物 吡啶甲酰胺转化微生物进行催化合成吡啶甲酰胺，合成的产物中3-吡啶甲酰胺、4-吡啶甲酰 胺的脱氨副产物3-羧基吡啶、4-羧基吡啶含量较低或不含有副产物。高得率制备获得了副产 物3-羧基吡啶、4-羧基吡啶含量低的3-吡啶甲酰胺、4-吡啶甲酰胺产品。

2、利用重组构建获得的基因敲除质粒转入宿主微生物中，通过双交换、单交换法或 Crispr/Cas9法突变了多种微生物的烟酸磷酸核糖转移酶、吡啶酰胺脱氨酶、异分支酸酶、半 胱氨酸水解酶、嘌呤核酸磷酸酶，有效敲除或抑制了宿主微生物内上述酶蛋白的表达及活性， 减少生物催化过程中羧基吡啶的生成。

3、获得了一种吡啶甲酰胺转化微生物，其胞内相对应的催化吡啶甲酰胺转化为羧基吡啶 的酶蛋白活性缺失或较低，而腈水合酶高表达且活性高。

附图说明

图1双交换基因突变原理示意图。

图2质粒载体构建示意图。

图3 B.subtilis 168菌种的靶酶活性检测结果；

图4未转化腈水合酶基因质粒的ΔEKO-Bsi菌种的靶酶活性检测结果；

图5Bacillus cereus ATCC 14579菌种的靶酶活性检测结果；

图6未转化腈水合酶基因质粒的ΔEKO-Bci菌种的靶酶活性检测结果；

图7 Escherichia coli K-12 MG1655菌种的靶酶活性检测结果；

图8未转化腈水合酶基因质粒的ΔEKO-Epn菌种的靶酶活性检测结果；

图9 Bacillus subtilis subsp.Subtilis 168菌种的靶酶活性检测结果；

图10未转化腈水合酶基因质粒的ΔEKO-Epp菌种的靶酶活性检测结果；

图11 Saccharomyces cerevisiae菌种的靶酶活性检测结果；

图12未转化腈水合酶基因质粒的ΔEKO-Scn菌种的靶酶活性检测结果；

图13 Kluyveromyces marxianus菌种的靶酶活性检测结果；

图14未转化腈水合酶基因质粒的ΔEKO-Kmm菌种的靶酶活性检测结果；

图15 Bacillus subtilis subsp.subtilis 168菌种的靶酶活性检测结果；

图16未转化腈水合酶基因质粒的ΔEKO-Bpp菌种的靶酶活性检测结果；

图17～26实施例1～10中PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图；

图17～26中均采用同一DNA marker，条带自上而下依次为1500bp、1000bp、800bp、600bp、 500bp、400bp、200bp；

图27未转化腈水合酶基因质粒的ΔEKO-GBN菌种的靶酶活性检测结果；

图28野生型谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum ATCC 13032的靶酶活性检测结果。

其中，图3～16及图27、28中3.5min出峰为副产物峰，5.5～6min出峰为主产物峰。

具体实施方式

下面通过对实施例的描述，对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明，以帮助本领 域的技术人员对本发明的发明构思、技术方案有更完整、准确和深入的理解。

实施例1：按如下方法制备低副产物吡啶甲酰胺转化微生物：

一、构建基因敲除质粒pEKO-Bsi

以枯草芽孢杆菌的异分支酸酶(isochorismatase)序列SEQ NO.1为靶基因设计突变引物：

引物1：TAAAAAGGATCATCGGATCCCAGCAACCGCATCAAGAGTAGT

引物2：CGCGCAGGAAATTCTTTTTTTCACCTCTTAAAATTTTTATACT

引物3：GGTGAAAAAAAGAATTTCCTGCGCGAACATAACG

引物4：GACCATGATTACGCCAAGCTTTTGGGTGCTTGAATACTAATCC

SEQ NO.11为SEQ NO.1对应的蛋白质一级序列，引物设计须考虑基因突变导致的蛋白质 一级序列中氨基酸残基的改变是否可以导致酶活的丧失或降低，避免产生氨基酸残基的等同 置换或非酶活相关氨基酸残基的改变。

引物1和引物2，引物3和引物4分别以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis 168)基因 组序列为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应条件：

95℃预变性4min；94℃变性45s，56.5℃退火45S，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延 伸10min，PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在600bp左右出现特异条带(见图17)。

通过天根重组试剂盒克隆到目标载体，构建成最终的基因敲除载体pEKO-Bsi，扩增的基 因片段如图1所示，最终构建载体如图2所示。

二、基因敲除菌种ΔEKO-Bsi的构建

培养基：

GM：LB培养基+0.5M山梨醇；

ETM：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油，余量为水；

RM：LB培养基+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇；

电转仪：Bio-Rad公司生产的gene-pulser；

具体转化步骤如下：

1)新鲜平板挑单菌落Bacillus subtilis subsp.Subtilis 168，接种于5mL LB培养基中，过夜 培养.。

2)测量摇管内OD₆₀₀，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。培养基 为50mlGM，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝1.0(大约3-4小时)左右。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。

4)用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗 3次。

5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl。

6)将60μl感受态细胞中加入1μl质粒pEKO-Bsi，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm) 中，电击一次。电转仪设置：2.0kV，25μF200Ω，1mm，电击1次。

7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂含有5μg/ml的LB平板。37℃，过夜培养

8)挑取阳性转化子即为ΔEKO-Bsi，用于摇瓶筛选。

pEKO-Bsi转化进入菌体内后，通过双交换法与宿主靶基因重组，重组过程中向靶基因中 随机引入基因点突变、部分基因缺失、基因完全缺失、基因从原始基因座移位到新的基因座、 基因序列倒转、基因序列中间任意位点插入不相关基因、基因上游启动子序列钝化或失活、 核糖体结合位点钝化或失活等方式，最终导致靶蛋白一级序列的改变，进而使靶蛋白酶活丧 失或降低。

三.敲除菌种(未转化腈水合酶基因质粒)酶活性检测具体方法如下：

1.反应体系为0.5mL，50mM氯化铵-氨水缓冲液(pH8.0)，含100mM 3-氰基吡啶。

2.添加适量的菌体B.subtilis 168或ΔEKO-Bsi。37℃振荡反应60min，立即添加0.5mL无 水乙腈终止反应。12000rpm离心1min。

3.HPLC法采用安捷伦高效液相色谱(Agilent 1100,USA)，色谱柱为Varianpursuit C18反 向色谱柱(4.6mm*250mm)，流动相为15mM磷酸钾缓冲液(pH2.8):乙腈92:8(v/v)，流速设 定为0.5mL/min，UV检测器，检测波长为265mm。

4.在此条件下，副产物3-羧基吡啶测定结果如图3和图4；

5.通过图3和图4的HPLC检测副产物结果对比后可以得知，敲除菌株ΔEKO-Bsi比野生 型B.subtilis 168靶酶活低近90％。

四、腈水合酶基因在Bacillus subtilis subsp.Subtilis 168和ΔEKO-Bsi宿主中表达及催化应用 具体步骤如下：

1)按照步骤二的方法转化腈水合酶基因质粒pHT01-NHase(pHT01，氯霉素抗性，从pET28-NHase扩增基因后，克隆至pHT01载体)转入Bacillus subtilis subsp.Subtilis或ΔEKO-Bsi 中；

2)转化的阳性质粒分别挑取后接种于5ml LB液体培养基，37℃，200rpm培养过夜

3)次日按1:100转接到50ml LB液体培养基，37℃，200rpm培养。待OD600长至0.6时，降 低温度至20℃，同时加入终浓度为100uM IPTG。继续诱导24h后，离心收集菌体。

4)在50ml离心管中称取1g菌体，加入14ml无菌水，用浓氨水调节pH至7.5。

5)在恒温水浴摇床中，每间隔30分钟，迅速加入0.6ml的3-氰基吡啶，待加入终浓度为30％ 的3-氰基吡啶后，继续反应2小时。

6)反应结束后离心除去菌体，用HPLC检测3-吡啶甲酰胺、3-羧基吡啶、3-氰基吡啶含量

7)经检测，敲除菌种ΔEKO-Bsi全部转化3-氰基吡啶后生成3-吡啶甲酰胺，副产物3-羧基 吡啶含量小于30ppm，而对照菌种B.subtilis 168，副产物3-羧基吡啶含量超过100ppm。对照菌 种B.subtilis 168仅为腈水合酶基因转化阳性克隆。

表1重组菌催化应用生产性能

实施例2：按如下方法制备低副产物吡啶甲酰胺转化微生物：

一、构建基因敲除质粒pEKO-Bci

以蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus ATCC 14579)的异分支酸酶(isochorismatase)序列SEQ NO.2为靶基因设计突变引物：

引物1：CATGCCATATTCAAAACGATAAGATGG

引物2：TACATATTCACGAAAGCGTACGTCCACTCCTTAGA

引物3：ACGCATAATCATTCACAATAGTTTAAATGGC

引物4：ATAAGCACGCAAGAATTTTTAGCTCTCAAACAT

SEQ NO.12为SEQ NO.2对应的蛋白质一级序列。

引物1和引物2，引物3和引物4分别以蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus ATCC14579)基因组 序列为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：

95℃预变性5min；94℃变性60s，58.5℃退火42S，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延 伸10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1400bp左右出现特异条带(见图18)。

通过天根重组试剂盒克隆到目标载体，构建成最终的基因敲除载体pEKO-Bci。

二、基因敲除菌种ΔEKO-Bci的构建

培养基：

GM：MYP培养基+0.5M山梨醇；

ETM：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油，余量为水；

RM：MYP培养基+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇；

电转仪：Bio-Rad公司生产的gene-pulser；

具体转化步骤如下：

1)新鲜平板挑单菌落蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus ATCC 14579)，接种于5mLMYP培 养基中，过夜培养.。

2)测量摇管内OD₆₀₀，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。培养基 为50mlGM，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝1.0(大约3-4小时)左右。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。

4)用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗 3次。

5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl。

6)将60μl感受态细胞中加入1μl质粒pEKO-Bci，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm) 中，电击一次。电转仪设置：2.0kV，25μF200Ω，1mm，电击1次。

7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂布于含有5μg/ml 红霉素的MYP平板。37℃，过夜培养，挑取阳性转化子即为ΔEKO-Bci，用于摇瓶筛选。通过图5和图6的HPLC检测(方法同实施例1)副产物结果对比后可以得知，敲除菌株ΔEKO-Bci比野生型Bacillus cereus ATCC 14579菌株靶酶活大幅度降低。

pEKO-Bci转化进入菌体内后，通过单交换法与宿主靶基因重组，重组过程中向靶基因中 随机引入基因点突变、部分基因缺失、基因完全缺失、基因从原始基因座移位到新的基因座、 基因序列倒转、基因序列中间任意位点插入不相关基因、基因上游启动子序列钝化或失活、 核糖体结合位点钝化或失活等方式，最终导致靶蛋白一级序列的改变，进而使靶蛋白酶活丧 失或降低。

三、腈水合酶基因在Bacillus cereus ATCC 14579和ΔEKO-Bci宿主中表达及催化应用

具体步骤如下：

1)按照步骤二的方法转化腈水合酶基因质粒(同实施例1)进入ΔEKO-Bci中；

2)转化的阳性克隆分别挑取后接种于5ml MYP液体培养基，37℃，200rpm培养过夜；

3)次日按1:100转接到50ml MYP液体培养基，37℃，200rpm培养。待OD₆₀₀长至0.6时， 降低温度至20℃，同时加入终浓度为100μM IPTG，继续诱导24h后，离心收集菌体。

4)在50ml离心管中称取1g菌体，加入16ml无菌水，用浓氨水调节pH至7.5。

5)在恒温水浴摇床中，每间隔30分钟，迅速加入0.5ml的3-氰基吡啶，待加入终浓度为20％ 的3-氰基吡啶后，继续反应2小时。

6)反应结束后离心除去菌体，用HPLC检测3-吡啶甲酰胺、3-羧基吡啶、3-氰基吡啶含量

7)经检测，敲除菌种ΔEKO-Bci全部转化3-氰基吡啶后生成3-吡啶甲酰胺，副产物3-羧基 吡啶含量小于30ppm，而对照菌种Bacillus cereus ATCC 14579，副产物3-羧基吡啶含量超过 100ppm。对照菌种Bacillus cereus ATCC 14579仅为腈水合酶基因转化阳性克隆。

表2重组菌催化应用生产性能

实施例3：按如下方法制备低副产物吡啶甲酰胺转化微生物：

一、构建基因敲除质粒pEKO-Epn

以大肠杆菌(Escherichia coli K-12 MG1655)的嘌呤核苷酸磷酸酶(purine-nucleoside phosphorylase)序列SEQ NO.3为靶基因设计突变引物：

引物1：AGAATTCCAGACTACACATTAATGCAGAAATGGGCGATTTCGCTG

引物2：GCTGACTTCGACATGGTGCGTATCGCAGATCGACGATACAATA

引物3：ATATCCGGCTACGTCGCTGCAGAATTTGGCGCGAA

引物4：TGGAATCCGTTCTGCTGGGCGATAAAGAGAAACTAGACGT

SEQ NO.13为SEQ NO.3对应的蛋白质一级序列。

引物1和引物2，引物3和引物4分别以大肠杆菌(Escherichia coli K-12 MG1655)基因组序 列为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：

95℃预变性5min；94℃变性40s，59℃退火45S，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸 10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1250bp左右出现特异条带(见图19)。

通过天根重组试剂盒克隆到目标载体，构建成最终的基因敲除载体pEKO-Epn。

二、基因敲除菌种ΔEKO-Epn的构建

培养基：

GM：LB培养基+0.5M山梨醇；

ETM：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油；余量是水。

RM：LB培养基+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇；

电转仪：Bio-Rad公司生产的gene-pulser；

具体转化步骤如下：

1)新鲜平板挑Escherichia coli K-12 MG1655单菌落，接种于5mL LB培养基中，过夜培养.。

2)测量摇管内OD₆₀₀，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。培养基 为50mlGM，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝1.0(大约3-4小时)左右。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。

4)用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗 3次。

5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl。

6)将60μl感受态细胞中加入1μl质粒pEKO-Epn，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm) 中，电击一次。电转仪设置：2.0kV，25μF200Ω，1mm，电击1次。

7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂布于含有5μg/ml 红霉素的LB平板。37℃，过夜培养

8)挑取阳性转化子即为ΔEKO-Epn，用于摇瓶筛选。

通过图7和图8的HPLC检测(方法同实施例1)副产物结果对比后可以得知，敲除菌株 ΔEKO-Epn比野生型Escherichia coli K-12 MG1655菌株靶酶活大幅度降低。

三、腈水合酶基因在Escherichia coli K-12 MG1655和ΔEKO-Epn宿主中表达及催化应用

具体步骤如下：

1)按照步骤二的方法转化腈水合酶基因质粒pET28-NHase进入ΔEKO-Epn中(pET28-NHas e,卡那霉素抗性，质粒来源参考文献，Efficient cloning and expressionof a thermost able nitrile hydratase inEscherichia coli using an auto-induction fed-batch strategy)；

2)转化的阳性克隆分别挑取后接种于5ml LB液体培养基，37℃，200rpm培养过夜；

3)次日按1:100转接到50ml LB液体培养基，37℃，200rpm培养。待OD₆₀₀长至0.5时，降 低温度至20℃，同时加入终浓度为100μM IPTG，继续诱导24h后，离心收集菌体。

4)在50ml离心管中称取1g菌体，加入14ml无菌水，用浓氨水调节pH至7.5。

5)在恒温水浴摇床中，每间隔30分钟，迅速加入0.6ml的3-氰基吡啶，待加入终浓度为30％ 的3-氰基吡啶后，继续反应2小时。

6)反应结束后离心除去菌体，用HPLC检测3-吡啶甲酰胺、3-羧基吡啶、3-氰基吡啶含量

7)经检测，敲除菌种ΔEKO-Epn全部转化3-氰基吡啶后生成3-吡啶甲酰胺，副产物3-羧基 吡啶含量小于30ppm，而对照菌种Escherichia coli K-12 MG1655，副产物3-羧基吡啶含量超过 100ppm。对照菌种Escherichia coli K-12 MG1655仅为腈水合酶基因转化阳性克隆。

表3重组菌催化应用生产性能

实施例4：按如下方法制备低副产物吡啶甲酰胺转化微生物：

一、构建基因敲除质粒pEKO-Epp

以枯草芽孢杆菌的嘌呤核酸磷酸酶(purine-nucleoside phosphorylase)序列SEQ NO.4为靶基因 设计突变引物：

引物1：ATTTCGACACATTACTGTGCTTTTGCCGGGAGA

引物2：TAAAGATGTCAAAGTGCGAGACGTCATAGATTAACATA

引物3：ATAGATACATGCGCAGATTTCGAGCTTATAAAAAATGCCTAT

引物4：AAACGACAGCGGAAGAGCGTCAAACGATCAGACCATTTTA

SEQ NO.14为SEQ NO.4对应的蛋白质一级序列。

引物1和引物2，引物3和引物4分别以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilissubsp.subtilis 168)基因 组序列为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：

95℃预变性4min；94℃变性45s，60℃退火45S，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸 10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在650bp左右出现特异条带(见图20)。

通过天根重组试剂盒克隆到目标载体，构建成最终的基因敲除载体pEKO-Epp。

二、基因敲除菌种ΔEKO-Epp的构建

培养基：

GM：LB培养基+0.5M山梨醇；

ETM：0.5M山梨醇，0.5M甘露醇，10％甘油；余量是水。

RM：LB培养基+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇；

电转仪：Bio-Rad公司生产的gene-pulser；

具体转化步骤如下：

1)新鲜平板挑单菌落Bacillus subtilis subsp.Subtilis 168，接种于5mL LB培养基中，过夜 培养.。

2)测量摇管内OD₆₀₀，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。培养基 为50mlGM，37℃，200rpm培养至OD₆₀₀＝1.0(大约3-4小时)左右。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。

4)用40ml预冷的电转缓冲液ETM洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗 3次。

5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的ETM中，每管分装60μl。

6)将60μl感受态细胞中加入1μl质粒pEKO-Epp，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm) 中，电击一次。电转仪设置：2.0kV，25μF200Ω，1mm，电击1次。

7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂布于含有5μg/ml 红霉素的LB平板。37℃，过夜培养

8)挑取阳性转化子即为ΔEKO-Epp，用于摇瓶筛选。

通过图9和图10的HPLC检测(方法同实施例1)副产物结果对比后可以得知，敲除菌株 ΔEKO-Epp比野生型Bacillus subtilis subsp.Subtilis 168菌株靶酶活大幅度降低。

三、腈水合酶基因在Bacillus subtilis subsp.Subtilis 168和ΔEKO-Epp宿主中表达及催化应用 具体步骤如下：

1)按照步骤二的方法转化腈水合酶基因质粒(同实施例1)进入ΔEKO-Epp中；

2)转化的阳性克隆分别挑取后接种于5ml LB液体培养基，37℃，200rpm培养过夜；

3)次日按1:100转接到50ml LB液体培养基，37℃，200rpm培养。待OD₆₀₀长至0.6时，降 低温度至20℃，同时加入终浓度为100μM IPTG，继续诱导24h后，离心收集菌体。

4)在50ml离心管中称取1g菌体，加入16ml无菌水，用浓氨水调节pH至7.5。

5)在恒温水浴摇床中，每间隔30分钟，迅速加入0.5ml的4-氰基吡啶，待加入终浓度为20％ 的4-氰基吡啶后，继续反应2小时。

6)反应结束后离心除去菌体，用HPLC检测4-吡啶甲酰胺、4-羧基吡啶、4-氰基吡啶含量

7)经检测，敲除菌种ΔEKO-Epp全部转化4-氰基吡啶后生成4-吡啶甲酰胺，副产物4-羧基 吡啶含量小于30ppm，而对照菌种B.subtilis 168，副产物4-羧基吡啶含量超过100ppm。对照菌 种B.subtilis 168仅为腈水合酶基因转化阳性克隆。

表4重组菌催化应用生产性能

实施例5：其余均与实施例3相同，不同之处在于：

以大肠杆菌(Escherichia coli)的烟酰胺酶/吡嗪酰胺酶(nicotinamidase/pyrazinamidase(E C:3.5.1.19))序列SEQ NO.5为靶基因设计突变引物：

引物1：ACATAAATTAACTCGCGCCCTGTTACTGGTCGATTTACAAAA

引物2：CCTTCTGGCCAGATCACTGTGTGCAGTACATAAAA

引物3：ATCATCCTATTTTGAAGTTTACCGTGCTGGACGCGTTACA

引物4：TGTCGTGGCGTGAATATCCAGCCCCAGCACATCATGCA

SEQ NO.15为SEQ NO.5对应的蛋白质一级序列。

引物1和引物2，引物3和引物4分别以大肠杆菌(Escherichia coli)基因组序列为模板，进 行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：

95℃预变性4min；94℃变性45s，58.5℃退火45S，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延 伸10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1300bp左右出现特异条带(见图21)。

应用时，以4-氰基吡啶为原料催化反应生成4-吡啶甲酰胺。经检测，敲除菌种ΔEKO全部 转化4-氰基吡啶后生成4-吡啶甲酰胺，副产物4-羧基吡啶含量小于30ppm，而对照菌种 Escherichia coli，副产物4-羧基吡啶含量超过100ppm。对照菌种Escherichia coli仅为腈水合酶 基因转化阳性克隆。

表5重组菌催化应用生产性能

实施例6：按如下方法制备低副产物吡啶甲酰胺转化微生物：

一、构建基因敲除质粒pEKO-Scn

以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的烟酰胺酶/吡嗪酰胺酶(nicotinamidase/pyrazin amidase(EC:3.5.1.19))序列SEQ NO.6为靶基因设计突变引物：

引物1：ATTGTTGTTGATATGCAAAATGATTTTATTTCA

引物2：AAGCCACCGACATATCCGCATTAGAA

引物3：AAATTCATCATTCAGCATACAACTATCACTCT

引物4：ATGAGACCGAGATGAACAGATCATCAA

SEQ NO.16为SEQ NO.6对应的蛋白质一级序列。

引物1和引物2，引物3和引物4分别以酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因组序列为模 板，进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：

95℃预变性4min；94℃变性45s，55℃退火50S，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸 10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1500bp左右出现特异条带(见图22)。

通过天根重组试剂盒克隆到目标载体，构建成最终的基因敲除载体pEKO-Scn。

二、基因敲除菌种ΔEKO-Scn的构建

培养基：

YEPD:1％酵母提取物，2％细菌学蛋白胨，2％葡萄糖；

1M山梨醇

电转仪：Bio-Rad公司生产的gene-pulser；

具体转化步骤如下：

1)新鲜平板挑酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)单菌落，接种于50mL YEPD培养基 中，过夜培养.。

2)测量摇管内OD₆₀₀，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。

4)用40ml预冷山梨醇洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。

5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的山梨醇中，每管分装60μl。

6)将60μl感受态细胞中加入1μl质粒pEKO-Scn，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm) 中，电击一次。电转仪设置：2.0kV，25μF200Ω，1mm，电击1次。

7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂布于含有5μg/ml 红霉素的PDA平板。37℃，过夜培养

8)挑取阳性转化子即为ΔEKO-Scn，用于摇瓶筛选。

通过图11和图12的HPLC检测(方法同实施例1)副产物结果对比后可以得知，敲除菌株 ΔEKO-Scn比野生型酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株靶酶活大幅度降低。

三、腈水合酶基因在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和ΔEKO-Scn宿主中表达及催化应 用具体步骤如下：

1)构建pYES2-NHase表达载体(从pET28-NHase中扩增腈水合酶基因，克隆到pYES2载体 中)按照步骤二的方法转化腈水合酶基因质粒进入ΔEKO-Scn中；

2)测量摇管内OD₆₀₀，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。

4)用40ml预冷山梨醇洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。

5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的山梨醇中，每管分装60μl。

6)将60μl感受态细胞中加入1μl质粒pEKO-Scn，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm) 中，电击一次。电转仪设置：2.0kV，25μF200Ω，1mm，电击1次。

7)经检测，敲除菌种ΔEKO-Scn全部转化3-氰基吡啶后生成3-吡啶甲酰胺，副产物3-羧基 吡啶含量小于30ppm，而对照菌种Saccharomyces cerevisiae，副产物3-羧基吡啶含量超过 100ppm。对照菌种Saccharomyces cerevisiae仅为腈水合酶基因转化阳性克隆。

表6重组菌催化应用生产性能

实施例7：按如下方法制备低副产物吡啶甲酰胺转化微生物：

一、构建基因敲除质粒pEKO-Kmn

以马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)的烟酰胺酶/吡嗪酰胺酶(nicotinamida se/pyrazinamidase(EC:3.5.1.19))序列SEQ NO.7为靶基因设计突变引物：

引物1：AAAATTCATTAGCCGTGCAAGATGGGGAT

引物2：ACTACAGCGCATTCACATACGAATCGCAAACAT

引物3：ACTCTTGTGTTATGGACACTGCTATAA

引物4：GACTATTATCCTCGAGGTCTACACACGCATGATA

SEQ NO.17为SEQ NO.7对应的蛋白质一级序列。

引物1和引物2，引物3和引物4分别以马克斯克鲁维酵母(Kluyveromycesmarxianus)基因 组序列为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：

95℃预变性4min；94℃变性45s，57.5℃退火30S，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延 伸10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在800bp左右出现特异条带(见图23)。

通过天根重组试剂盒克隆到目标载体，构建成最终的基因敲除载体pEKO-Kmn。

二、基因敲除菌种ΔEKO-Kmn的构建

培养基：

YEPD:1％酵母提取物，2％细菌学蛋白胨，2％葡萄糖；

1M山梨醇

电转仪：Bio-Rad公司生产的gene-pulser；

具体转化步骤如下：

1)新鲜平板挑马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)单菌落，接种于5mLPDA 培养基中，过夜培养.。

2)测量摇管内OD₆₀₀，控制好接种量，使接种完毕后培养基的OD在0.19-0.2之间。

3)取全部菌液冰水浴10min，然后5000rpm，8min，4℃离心收集菌体。

4)用40ml预冷山梨醇洗涤菌体，5000rpm，8min，4℃离心去上清，如此漂洗3次。

5)将洗涤后的菌体重悬于等500μl的山梨醇中，每管分装60μl。

6)将60μl感受态细胞中加入1μl质粒pEKO-Kmm，冰浴孵育5min，加入预冷的电转杯(1mm) 中，电击一次。电转仪设置：2.0kV，25μF200Ω，1mm，电击1次。

7)电击完毕立即加入1ml复苏培养基RM，37℃，200rpm，复苏3h后，涂布于含有5μg/ml 红霉素的PDA平板。37℃，过夜培养

8)挑取阳性转化子即为ΔEKO-Kmm，用于摇瓶筛选。

通过图13和图14的HPLC检测(方法同实施例1)副产物结果对比后可以得知，敲除菌株 ΔEKO-Kmm比野生型马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)菌株靶酶活大幅度降低。 三、腈水合酶基因在马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)和ΔEKO-Kmm宿主中表 达及催化应用

具体步骤如下：

1)按照步骤二的方法转化腈水合酶基因质粒(同实施例6)进入ΔEKO-Kmm中；

2)转化的阳性克隆分别挑取后接种于5ml PDA液体培养基，37℃，200rpm培养过夜；

3)次日按1:100转接到50ml PDA液体培养基，37℃，200rpm培养。待OD₆₀₀长至0.6时， 降低温度至20℃，同时加入终浓度为100μM IPTG，继续诱导24h后，离心收集菌体。

4)在50ml离心管中称取1g菌体，加入14ml无菌水，用浓氨水调节pH至7.5。

5)在恒温水浴摇床中，每间隔30分钟，迅速加入0.6ml的4-氰基吡啶，待加入终浓度为30％ 的4-氰基吡啶后，继续反应2小时。

6)反应结束后离心除去菌体，用HPLC检测4-吡啶甲酰胺、4-羧基吡啶、4-氰基吡啶含量

7)经检测，敲除菌种ΔEKO-Kmm全部转化4-氰基吡啶后生成4-吡啶甲酰胺，副产物4-羧 基吡啶含量小于30ppm，而对照菌种Kluyveromyces marxianus，副产物4-羧基吡啶含量超过 100ppm。对照菌种Kluyveromyces marxianus仅为腈水合酶基因转化阳性克隆。

表7重组菌催化应用生产性能

实施例8：其余均与实施例3相同，不同之处在于：

以大肠杆菌Escherichia coli O157:H7EDL933(EHEC)的烟酰胺酶/吡嗪酰胺酶(nicotina midase/pyrazinamidase(EC:3.5.1.19))序列SEQ NO.8为靶基因设计突变引物(点突变)：

引物1：AGTCGCTAACCGCCTTATTGACTGGTACCAGTC

引物2：GGCGCACAATTACATCCGTTACTGAA

引物3：AATTCAGGCGAGCATCGCAGTAGTT

引物4：CAGGACAGGGCGCACGCGCTTATACATAAGCA

SEQ NO.18为SEQ NO.8对应的蛋白质一级序列。

引物1和引物2，引物3和引物4分别以大肠杆菌(EHEC)基因组序列为模板，进行PCR扩 增反应，PCR反应条件如下：

95℃预变性4min；94℃变性60s，58℃退火30S，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸 10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在900bp左右出现特异条带(见图24)。

应用时，以4-氰基吡啶为原料催化反应生成4-吡啶甲酰胺。经检测，敲除菌种ΔEKO-Enp 全部转化4-氰基吡啶后生成4-吡啶甲酰胺，副产物4-羧基吡啶含量小于30ppm，而对照菌种 EHEC，副产物4-羧基吡啶含量超过100ppm。对照菌种EHEC仅为腈水合酶基因转化阳性克隆。

表8重组菌催化应用生产性能

实施例9：其余均与实施例3相同，不同之处在于：

以大肠杆菌Escherichia coli K-12 MG1655的烟酸磷酸核糖转移酶(nicotinatephosphorib osyltransferase)序列SEQ NO.9为靶基因设计突变引物：

引物1：ATCATAGCAGCCTGCAGGATGATGAATATCAGT

引物2：CTGATGGATTTTGGCACCCGTCGCCGCGATCAA

引物3：AATTTCAGCATTGTCGAGTTCGCTAGTCGGTA

引物4：CCAGGTAGCACCTCTGAATATCATATATTGA

SEQ NO.19为SEQ NO.9对应的蛋白质一级序列。

引物1和引物2，引物3和引物4分别以大肠杆菌(Escherichia coli K-12 MG1655)基因组序 列为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：

95℃预变性4min；95℃变性50s，59℃退火40S，72℃延伸90s，循环35次，最后72℃延伸 10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在1000bp左右出现特异条带(见图25)。

应用时，以3-氰基吡啶为原料催化反应生成3-吡啶甲酰胺。经检测，敲除菌种ΔEKO-Eno 全部转化3-氰基吡啶后生成3-吡啶甲酰胺，副产物3-羧基吡啶含量小于30ppm，而对照菌种 Escherichia coli K-12 MG1655，副产物3-羧基吡啶含量超过100ppm。对照菌种Escherichia coli K-12 MG1655仅为腈水合酶基因转化阳性克隆。

表9重组菌催化应用生产性能

实施例10：其余均与实施例1相同，不同之处在于：

以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis 168的嘌呤核酸磷酸酶(purine-nucleoside phosphorylase)序列SEQ NO.10为靶基因设计突变引物：

引物1：ATCAGCAAGAATATTTGCGCGGCTTATCTTTT

引物2：TCTGGACAGCGGCGATTTGGCGCACATA

引物3：ATAGACTCGTTGCCATGGAAGAAGAC

引物4：CCGGTTGATTTGAGCGAGGACTGAGAATTC

SEQ NO.20为SEQ NO.10对应的蛋白质一级序列。

引物1和引物2，引物3和引物4分别以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilissubsp.subtilis 168基因 组序列为模板，进行PCR扩增反应，PCR反应条件如下：

95℃预变性4min；94℃变性60s，58℃退火35S，72℃延伸80s，循环35次，最后72℃延伸 10min。PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳在700bp左右出现特异条带(见图26)。

通过图15和图16的HPLC检测(方法同实施例1)副产物结果对比后可以得知，敲除菌株 ΔEKO-Bpp比野生型枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis 168菌株靶酶活大幅度降低。

应用时，以4-氰基吡啶为原料催化反应生成4-吡啶甲酰胺。经检测，敲除菌种ΔEKO-Bpp 全部转化4-氰基吡啶后生成4-吡啶甲酰胺，副产物4-羧基吡啶含量小于30ppm，而对照菌种枯 草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis 168，副产物4-羧基吡啶含量超过100ppm。对照菌种 枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis subsp.subtilis 168仅为腈水合酶基因转化阳性克隆。

表10重组菌催化应用生产性能

实施例11：按如下方法制备低副产物吡啶甲酰胺转化微生物：

一、构建基因敲除质粒pEKO-GBN

以谷氨酸棒杆菌的异分支酸酶序列SEQ NO.21为靶基因，采用Crispr/cas9基因编辑技术进 行靶基因的失活操作，具体步骤如下：

设计Caspase 9识别位点GCCCAACAGGAGTATTTTGAAGG(如下划线所示)，并克隆 至pB0A载体(参考文献Younju S,Soo-Young P,Eun-Hye P,et al.A Highly Efficient CRISPR-Cas9-Mediated Large Genomic Deletion in Bacillus subtilis[J].Frontiersin Microbiol ogy,2017,8:1167-.)

SEQ NO.22为SEQ NO.21对应的蛋白质一级序列。

二、基因敲除菌种ΔEKO-GBN的构建

1.将pHCas9和pEKO-GBN同时转化至谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicumATCC 13032)

2.挑取生长的转化子，进行菌落PCR后测序验证基因是否敲除。阳性转化子用于后续实 验。

通过图27和图28的HPLC检测(方法同实施例1)副产物结果对比后可以得知，敲除菌株 ΔEKO-GBN比野生型谷氨酸棒杆菌菌株靶酶活大幅度降低。

三、腈水合酶基因在谷氨酸棒杆菌和ΔEKO-GBN宿主中表达及催化应用，具体步骤如下：

1)按照步骤二的方法转化腈水合酶基因质粒pET28-NHase进入ΔEKO-GBN中(pET28-NHa se,卡那霉素抗性，质粒来源参考文献，Efficient cloning and expressionof a thermos table nitrile hydratase inEscherichia coli using an auto-induction fed-batch strateg y)；

2)转化的阳性克隆分别挑取后接种于5ml LB液体培养基，37℃，200rpm培养过夜；

3)次日按1:100转接到50ml LB液体培养基，37℃，200rpm培养。待OD₆₀₀长至0.5时，降 低温度至20℃，同时加入终浓度为100μM IPTG，继续诱导24h后，离心收集菌体。

4)在50ml离心管中称取1g菌体，加入14ml无菌水，用浓氨水调节pH至7.5。

5)在恒温水浴摇床中，每间隔30分钟，迅速加入0.6ml的3-氰基吡啶，待加入终浓度为30％ 的3-氰基吡啶后，继续反应2小时。

6)反应结束后离心除去菌体，用HPLC检测3-吡啶甲酰胺、3-羧基吡啶、3-氰基吡啶含量

7)经检测，敲除菌种ΔEKO-GBN全部转化3-氰基吡啶后生成3-吡啶甲酰胺，副产物3-羧 基吡啶含量小于30ppm，而对照菌种谷氨酸棒杆菌，副产物3-羧基吡啶含量超过100ppm。对 照菌种谷氨酸棒杆菌仅为腈水合酶基因转化阳性克隆。

表11重组菌催化应用生产性能

综上所述，由于上述微生物具有催化3-吡啶甲酰胺、4-吡啶甲酰胺脱氨生成3-羧基吡啶、 4-羧基吡啶相关基因的酶催化活性降低或失活。分批或连续流加3-氰基吡啶、4-氰基吡啶后， 转化成不低于20％含量的终产物3-吡啶甲酰胺、不低于10％的终产物4-吡啶甲酰胺等，不含 或仅含不大于30ppm 3-羧基吡啶、4-羧基吡啶副产物。由此本发明开发了一种吡啶甲酰胺生 物催化反应合成方法，该方法采用本发明中构建的低副产物吡啶甲酰胺转化微生物进行催化 合成吡啶甲酰胺，合成的产物中3-吡啶甲酰胺、4-吡啶甲酰胺的脱氨副产物3-羧基吡啶、4- 羧基吡啶含量较低或不含有副产物。高得率制备获得了副产物3-羧基吡啶、4-羧基吡啶含量 低的3-吡啶甲酰胺、4-吡啶甲酰胺产品。利用重组构建获得的基因敲除质粒转入宿主微生物 中，通过同源重组或基因编辑(双交换、单交换、Crispr/Cas9中的一种)方法突变了烟酸磷酸 核糖转移酶、吡啶酰胺脱氨酶、异分支酸酶、半胱氨酸水解酶、嘌呤核酸磷酸酶的酶活相关 基因，有效敲除或抑制了宿主微生物内上述酶蛋白的表达及活性，减少生物催化过程中生成 副产物羧基吡啶的生成。获得了一种吡啶甲酰胺转化微生物，其胞内相对应的催化吡啶甲酰 胺转化为羧基吡啶的酶蛋白活性缺失或较低，而腈水合酶高表达且活性高。

以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本 发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本 发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。

SEQUENCE LISTING

<110> 安徽瑞邦生物科技有限公司

<120> 一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备及应用

<130> 11401

<160> 22

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 543

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis subsp. subtilis 168

<400> 1

atgacaacag ctttattagt gattgatatt caaaatgatt actttgctaa tgggaagatg 60

gctttaacaa acccagagaa agcagcacaa aatgcggcta aactactttc acactttaga 120

aacacaggcg cacctgtctt tcatgtacag catatcacag aaggtaacat cgctcatttt 180

ttccatccaa atacagaagg tgtcgaaatt catgagtcag tacgtccatt agagaaagag 240

acagtcattg taaaacatat gccgaatagc tttttcaata cagatttata tggaaagcta 300

caagaagaag gggttaaaga attagttgtt tgcggtatga tgtcccatat gtgtattgat 360

gcaacagttc gttctgcaga gggacatggt tatgtatgcc aagtggtaga agatgcttgc 420

gcaacaacaa cattgcaaat tgaagataaa atcgttcctg ctgagcatgt ccattacgca 480

tttatggccg cattaaatgg tgtctatgca acagtaaaaa ccacagaggc atttttaaaa 540

taa 543

<210> 2

<211> 546

<212> DNA

<213> Bacillus cereus ATCC 14579

<400> 2

atgaaaacag ctcttttact cgtcgatatt caaaacgatt attttccaaa tggaaagatg 60

gaattgcgta atccagtaga agcaagcgaa tatgctaatc agttattaca acactttaga 120

acaaacagcg aacctattct tcatatccaa cagttagcta taaaagatga cgctactttt 180

ttcctaccta atacagaagg tgtacatatt cacgaaagcg tacgtccact tagagaagaa 240

acagttatag tcaaacatta tccaaatagc ttccgagaaa ctaatcttct agagcaatta 300

aaacgtttaa atattgaaca tgtcgttgta tgtgggatga tgactcatat gtgtatcgat 360

gctacagtaa gggctgcatt cgattttggc tttcaatgta ccgttaaaca tgatgcttgt 420

gctacaaaag acctgtcttt taagaacgct actataccag ctgtttacat tcacaataca 480

attttagcta gtttaaatgg cgtatatgca aatgtaataa gcacgcaaga atttttagct 540

acataa 546

<210> 3

<211> 720

<212> DNA

<213> Escherichia coli K-12 MG1655

<400> 3

atggctaccc cacacattaa tgcagaaatg ggcgatttcg ctgacgtagt tttgatgcca 60

ggcgacccgc tgcgttcgaa gtatattgct gaaactttcc ttgaagatgc ccgtgaagtg 120

aacaacgttc gcggtatgct gggcttcacc ggtacttaca aaggccgcaa aatttccgta 180

atgggtcacg gtatgggtat cccgtcctgc tccatctaca ccaaagaact gatcaccgat 240

ttcggcgtga agaaaattat ccgcgtgggt tcctgtggcg cagttctgcc gcacgtaaaa 300

ctgcgcgacg tcgttatcgg tatgggtgcc tgcaccgatt ccaaagttaa ccgcatccgt 360

tttaaagacc atgactttgc cgctatcgct gacttcgaca tggtgcgtat cgcagtagat 420

gcagctaaag cactgggtat tgatgctcgc gtgggtaacc tgttctccgc tgacctgttc 480

tactctccgg acggcgaaat gttcgacgtg atggaaaaat acggcattct cggcgtggaa 540

atggaagcgg ctggtatcta cggcgtcgct gcagaatttg gcgcgaaagc cctgaccatc 600

tgcaccgtat ctgaccactt ccgcactcac gagcagacca ctgccgctga gcgtcagact 660

accttcaacg acatgatcaa aatcgcactg gaatccgttc tgctgggcga taaagagtaa 720

<210> 4

<211> 702

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis subsp. subtilis 168

<400> 4

atgagtgtac atataggtgc tgaaaaagga caaattgcgg atactgtgct tttgccggga 60

gatcctctca gagcaaaatt tattgcagaa acgtatcttg aaaatgtaga atgctacaat 120

gaagtcagag gcatgtatgg atttacgggt acatataaag gtaaaaaaat ctcagtacaa 180

ggcacgggaa tgggagttcc gtctatttca atttatgtga atgaattaat tcaaagctac 240

gatgtgcaaa atctaaatag agtcggtacc tgcggcgcta ttcgtaaaga tgtcaaagtg 300

cgagacgtca ttttggcgat gacctcctca actgattcac aaatgaacag agttgctttc 360

ggaagcgttg attttgcgcc ttgcgcagat ttcgagctta taaaaaatgc ctatgatgcc 420

gcaaaggata aaggtgtgcc ggtgactgta ggaagcgtat ttacagctga ccagttctac 480

aatgacgatt cgcaaattga taaacttgca aaatacggtg tgcttggcgt tgaaatgaca 540

gaaactgcat tgtatacatt agcagcgaag cacggaagaa aagccctgtc aattctcacc 600

gtgagtgatc acgtattaac aggagaagaa acgacagcgg aagagcgtca aacgacattt 660

catgatatga tagaagtggc tttacattcc gtatcacaat aa 702

<210> 5

<211> 642

<212> DNA

<213> Escherichia coli

<400> 5

atgccccctc gcgccctgtt actggtcgat ttacaaaatg atttctgtgc tggtggcgcg 60

ctcgccgtgc cggaaggtga cagtacggtg gatgtcgcta accgcctgat tgactggtgc 120

cagtcgcgcg gtgaagcggg tatcgccagt caggactggc acccggcgaa tcacggcagt 180

tttgccagtc agcacggtgt agagccttat acgccaggcc aactcgacgg tttgccacaa 240

accttctggc cagatcactg tgtgcagaac agtgaaggcg cacaattaca tccgttactg 300

caccaaaaag cgatcgcagc ggtgttccat aaaggcgaaa atcctttagt tgacagttac 360

agtgcctttt ttgataacgg ccgtcggcag aaaacctctc tcgatgactg gttacgcgat 420

catgaaatcg atgaattggt cgttatgggc ctggctactg actattgcgt gaagtttacc 480

gtgctggacg cgttacagtt aggttataag gtaaacgtga ttaccgatgg ttgtcgtggc 540

gtgaatatcc agccccagga cagtgcgcac gcgtttatgg agatgtcagc agctggggca 600

acgctatata cgctggcaga ctgggaagag acacaggggt ga 642

<210> 6

<211> 651

<212> DNA

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 6

atgaagactt taattgttgt tgatatgcaa aatgatttta tttcaccttt aggttccttg 60

actgttccaa aaggtgagga attaagcaat cctatctcgg atttgatgca agatgctgat 120

agagactggc acaggattgt ggtcaccaga gattggcacc cttccagaca tatttcgttc 180

gcaaagaacc ataaagataa agaaccctat tcaacataca cctaccactc tccaaggcca 240

ggcgatgatt ccacgcaaga gggtattttg tggcccgtac actgtgtgaa aaacacctgg 300

ggtagtcaac tggttgacca aataatggac caagtggtca ctaagcatat taagattgtc 360

gacaagggtt tcttgactga ccgtgaatac tactccgcct tccacgacat ctggaacttc 420

cataagaccg acatgaacaa gtacttagaa aagcatcata cagacgaggt ttacattgtc 480

ggtgtagctt tggagtattg tgtcaaagcc accgccattt ccgctgcaga actatgttat 540

aagaccactg tcctgctgga ttacacaaga cccatcagcg atgatcccga agtcatcaat 600

aaggttaagg aagagttgaa ggcccacaac atcaatgtcg tggataaata a 651

<210> 7

<211> 651

<212> DNA

<213> Kluyveromyces marxianus

<400> 7

atgggagctc gcgcgttgtt gataattgac atccaaaacg attttctccc acctgatggg 60

tctttagccg tgcaagatgg ggatgccatc attgatcccg tgatcaagct tctcaacgag 120

aagaaatggg actgtgttgc catcaccaaa gactggcacc cttcggacca catatcgttc 180

gctaaaaacc atggtttgcc agactacagc gcattcacat acgaatcgcc tgtgccaggc 240

agtacggaga aacaagaggc aaccctctgg ccggtacatt gtgtgcagga aagttggggt 300

tctgaagtcc cagaaaggct aatgaaggag ctacaaaagc aggaagtccc ccataccgtt 360

gtaaacaaag gatttctagc agatcgcgag tactattctg gatttaacga catttggaat 420

gaccaccgca cggaattaga cgatttcttg aaaaagaata acgtttcaga agtgtacttg 480

gtaggcttag ctttggactt ttgtgttatg aacactgcta taagtgccgc aaaattaggt 540

tacaagacta ctatcctcaa ggactacaca cgagacatta aaaacgatcc caaatcagta 600

gaaacattga tcaaagatct acattcccgt ttcaacatac aaatcgagta g 651

<210> 8

<211> 660

<212> DNA

<213> Escherichia coli O157:H7 EDL933

<400> 8

atgattaagg agactgcaat gccccctcgc gccctgttac tggtcgattt acaaaatgat 60

ttctgtgctg gtggcgcgct cgccgtgccg gaaggtgaca gtacggtgga tgtcgctaac 120

cgcctgattg actggtgcca gtcgcgcggt gaagcggttg tcgccagtca ggactggcac 180

ccggcgaatc acggcagttt tgccagccag cacggtgtag agccttatac gccaggccaa 240

ctcgacggtt tgccacaaac cttctggcca gatcactgtg tgcagaacag tgaaggcgca 300

caattacatc cgttactgaa ccaaaaagcg atcgcagcgg tgttccataa aggcgaaaat 360

cctttagttg acagttacag tgcctttttt gataacggcc gtcggcagaa aacctctctc 420

gatgactggt tacgcgatca tgaaatcgat gaattgatcg ttatgggcct ggctactgac 480

tattgcgtga agtttaccgt gctggacgcg ttacagttag gttataaggt aaacgtgatt 540

accgatggtt gtcgtggcgt gaatatccag ccccaggaca gtgcgcacgc gtttatggag 600

atgtcaggag ctggggcaac gctatatacg ctggcagact gggaagagac gcaggggtaa 660

<210> 9

<211> 1203

<212> DNA

<213> Escherichia coli K-12 MG1655

<400> 9

atgacacaat tcgcttctcc tgttctgcac tcgttgctgg atacagatgc ttataagttg 60

catatgcagc aagccgtgtt tcatcactat tacgatgtgc atgtcgcggc ggagtttcgt 120

tgccgaggtg acgatctgct gggtatttat gccgatgcta ttcgtgaaca ggttcaggcg 180

atgcagcacc tgcgcctgca ggatgatgaa tatcagtggc tttctgccct gcctttcttt 240

aaggccgact atcttaactg gttacgcgag ttccgcttta acccggaaca agtcaccgtg 300

tccaacgata atggcaagct ggatattcgt ttaagcggcc cgtggcgtga agtcatcctc 360

tgggaagttc ctttgctggc ggttatcagt gaaatggtac atcgctatcg ctcaccgcag 420

gccgacgttg cgcaagccct cgacacgctg gaaagcaaat tagtcgactt ctcggcgtta 480

accgccggtc ttgatatgtc gcgcttccat ctgatggatt ttggcacccg tcgccgtttt 540

tctcgcgaag tacaagaaac catcgttaag cgtctgcaac aggaatcctg gtttgtgggc 600

accagcaact acgatctggc gcgtcggctt tccctcacgc cgatgggaac acaggcacac 660

gaatggttcc aggcacatca gcaaatcagc ccggatctag ccaacagcca gcgagctgca 720

cttgctgcct ggctggaaga gtatcccgac caacttggca ttgcattaac cgactgcatc 780

actatggatg ctttcctgcg tgatttcggt gtcgagttcg ctagtcggta tcagggcctg 840

cgtcatgact ctggcgaccc ggttgaatgg ggtgaaaaag ccattgcaca ttatgaaaag 900

ctgggaattg atccacagag taaaacgctg gttttctctg acaatctgga tttacgcaaa 960

gcggttgagc tataccgcca cttctcttcc cgcgtgcaat taagttttgg tattgggact 1020

cgcctgacct gcgatatccc ccaggtaaaa cccctgaata ttgtcattaa gttggtagag 1080

tgtaacggta aaccggtggc gaaactttct gacagccctg gcaaaactat ctgccatgat 1140

aaagcgtttg ttcgggcgct gcgcaaagcg ttcgaccttc cgcatattaa aaaagccagt 1200

taa 1203

<210> 10

<211> 1473

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis subsp. subtilis 168

<400> 10

gtgttagagt acggatttaa agatgacagc ctgtcattac atacagacct ttatcagatc 60

aatatggcgg aaacgtactg gagagacggc attcatgaaa agaaagcgat ttttgagctg 120

tttttcagaa ggcttccgtt tgaaaatggc tatgccgtat ttgcgggctt ggaaaaagcc 180

attgaatact tggaaaattt caagtttacg gatagcgatt tgagttattt acaggatgaa 240

ctcgggtatc atgaagattt tattgaatat ttgcgcggct tatcttttac aggttcactt 300

tactccatga aagaaggaga actcgttttt aacaatgagc cgattatgag ggtggaggca 360

cccctggtag aagcgcagct gattgaaaca gctttgctca acattgtgaa ctatcaaaca 420

ttaatcgcaa caaaggctgc ccggattaaa ggcgtcatcg gtgatgaagt tgcgcttgaa 480

ttcggaacaa gacgggcgca cgaaatggat gcggccatgt ggggagcgag agcagcctta 540

atcggcggct ttagcgcgac aagcaatgta agagccggaa agcgctttaa tatcccggtt 600

tccggcacac atgcgcatgc gcttgtgcag gcttaccgcg atgaatatac agctttcaaa 660

aaatacgcgg aaacacataa ggattgcgtc ttcttagttg acacgtatga cacgcttcgt 720

tcaggcatgc cgaacgcgat tagggttgcc aaggaattcg gcgaccgcat taatttcatt 780

ggcatccgtc tggacagcgg cgatttggcg tacctgtcaa aaaaagcccg gaaaatgctt 840

gatgaagcag gatttacaga tgcgaaggtg attgcttcaa gcgatttgga tgagcacacc 900

attatgaatt taaaggctca gggagcgcgc attgatgtct ggggtgtcgg tacgaagctg 960

atcactgcct atgaccagcc ggctctcggc gcagtttata aactcgttgc cattgaagaa 1020

gacgggaaaa tggtcgacac gatcaaaatt tcgtccaatc ctgaaaaagt gacgacaccg 1080

ggcagaaaga aagtctaccg cattattaat cagtccaacc atcattctga aggcgactat 1140

attgcgcttt atgatgagca ggtgaatgat cagaagcggc tcagaatgtt ccacccggtt 1200

catacattca tcagcaaatt tgtcacgaat ttttatgcga aggatcttca tgaactgatt 1260

tttgagaagg gtattctttg ctaccaaaac cctgagattt cagacataca gcagtatgtg 1320

caggataacc tcagcctgct ttgggaggaa tataagagaa tcagcaagcc ggaggaatac 1380

ccggttgatt taagcgagga ctgctggagc aataaaatgc agcggatcca cgaagtgaaa 1440

agcagaattg aagaagagct tgaggaagaa taa 1473

<210> 11

<211> 180

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis subsp. subtilis 168

<400> 11

Met Thr Thr Ala Leu Leu Val Ile Asp Ile Gln Asn Asp Tyr Phe Ala

1 5 10 15

Asn Gly Lys Met Ala Leu Thr Asn Pro Glu Lys Ala Ala Gln Asn Ala

20 25 30

Ala Lys Leu Leu Ser His Phe Arg Asn Thr Gly Ala Pro Val Phe His

35 40 45

Val Gln His Ile Thr Glu Gly Asn Ile Ala His Phe Phe His Pro Asn

50 55 60

Thr Glu Gly Val Glu Ile His Glu Ser Val Arg Pro Leu Glu Lys Glu

65 70 75 80

Thr Val Ile Val Lys His Met Pro Asn Ser Phe Phe Asn Thr Asp Leu

85 90 95

Tyr Gly Lys Leu Gln Glu Glu Gly Val Lys Glu Leu Val Val Cys Gly

100 105 110

Met Met Ser His Met Cys Ile Asp Ala Thr Val Arg Ser Ala Glu Gly

115 120 125

His Gly Tyr Val Cys Gln Val Val Glu Asp Ala Cys Ala Thr Thr Thr

130 135 140

Leu Gln Ile Glu Asp Lys Ile Val Pro Ala Glu His Val His Tyr Ala

145 150 155 160

Phe Met Ala Ala Leu Asn Gly Val Tyr Ala Thr Val Lys Thr Thr Glu

165 170 175

Ala Phe Leu Lys

180

<210> 12

<211> 181

<212> PRT

<213> Bacillus cereus ATCC 14579

<400> 12

Met Lys Thr Ala Leu Leu Leu Val Asp Ile Gln Asn Asp Tyr Phe Pro

1 5 10 15

Asn Gly Lys Met Glu Leu Arg Asn Pro Val Glu Ala Ser Glu Tyr Ala

20 25 30

Asn Gln Leu Leu Gln His Phe Arg Thr Asn Ser Glu Pro Ile Leu His

35 40 45

Ile Gln Gln Leu Ala Ile Lys Asp Asp Ala Thr Phe Phe Leu Pro Asn

50 55 60

Thr Glu Gly Val His Ile His Glu Ser Val Arg Pro Leu Arg Glu Glu

65 70 75 80

Thr Val Ile Val Lys His Tyr Pro Asn Ser Phe Arg Glu Thr Asn Leu

85 90 95

Leu Glu Gln Leu Lys Arg Leu Asn Ile Glu His Val Val Val Cys Gly

100 105 110

Met Met Thr His Met Cys Ile Asp Ala Thr Val Arg Ala Ala Phe Asp

115 120 125

Phe Gly Phe Gln Cys Thr Val Lys His Asp Ala Cys Ala Thr Lys Asp

130 135 140

Leu Ser Phe Lys Asn Ala Thr Ile Pro Ala Val Tyr Ile His Asn Thr

145 150 155 160

Ile Leu Ala Ser Leu Asn Gly Val Tyr Ala Asn Val Ile Ser Thr Gln

165 170 175

Glu Phe Leu Ala Thr

180

<210> 13

<211> 239

<212> PRT

<213> Escherichia coli K-12 MG1655

<400> 13

Met Ala Thr Pro His Ile Asn Ala Glu Met Gly Asp Phe Ala Asp Val

1 5 10 15

Val Leu Met Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ser Lys Tyr Ile Ala Glu Thr

20 25 30

Phe Leu Glu Asp Ala Arg Glu Val Asn Asn Val Arg Gly Met Leu Gly

35 40 45

Phe Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Arg Lys Ile Ser Val Met Gly His Gly

50 55 60

Met Gly Ile Pro Ser Cys Ser Ile Tyr Thr Lys Glu Leu Ile Thr Asp

65 70 75 80

Phe Gly Val Lys Lys Ile Ile Arg Val Gly Ser Cys Gly Ala Val Leu

85 90 95

Pro His Val Lys Leu Arg Asp Val Val Ile Gly Met Gly Ala Cys Thr

100 105 110

Asp Ser Lys Val Asn Arg Ile Arg Phe Lys Asp His Asp Phe Ala Ala

115 120 125

Ile Ala Asp Phe Asp Met Val Arg Ile Ala Val Asp Ala Ala Lys Ala

130 135 140

Leu Gly Ile Asp Ala Arg Val Gly Asn Leu Phe Ser Ala Asp Leu Phe

145 150 155 160

Tyr Ser Pro Asp Gly Glu Met Phe Asp Val Met Glu Lys Tyr Gly Ile

165 170 175

Leu Gly Val Glu Met Glu Ala Ala Gly Ile Tyr Gly Val Ala Ala Glu

180 185 190

Phe Gly Ala Lys Ala Leu Thr Ile Cys Thr Val Ser Asp His Phe Arg

195 200 205

Thr His Glu Gln Thr Thr Ala Ala Glu Arg Gln Thr Thr Phe Asn Asp

210 215 220

Met Ile Lys Ile Ala Leu Glu Ser Val Leu Leu Gly Asp Lys Glu

225 230 235

<210> 14

<211> 233

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis subsp. subtilis 168

<400> 14

Met Ser Val His Ile Gly Ala Glu Lys Gly Gln Ile Ala Asp Thr Val

1 5 10 15

Leu Leu Pro Gly Asp Pro Leu Arg Ala Lys Phe Ile Ala Glu Thr Tyr

20 25 30

Leu Glu Asn Val Glu Cys Tyr Asn Glu Val Arg Gly Met Tyr Gly Phe

35 40 45

Thr Gly Thr Tyr Lys Gly Lys Lys Ile Ser Val Gln Gly Thr Gly Met

50 55 60

Gly Val Pro Ser Ile Ser Ile Tyr Val Asn Glu Leu Ile Gln Ser Tyr

65 70 75 80

Asp Val Gln Asn Leu Asn Arg Val Gly Thr Cys Gly Ala Ile Arg Lys

85 90 95

Asp Val Lys Val Arg Asp Val Ile Leu Ala Met Thr Ser Ser Thr Asp

100 105 110

Ser Gln Met Asn Arg Val Ala Phe Gly Ser Val Asp Phe Ala Pro Cys

115 120 125

Ala Asp Phe Glu Leu Ile Lys Asn Ala Tyr Asp Ala Ala Lys Asp Lys

130 135 140

Gly Val Pro Val Thr Val Gly Ser Val Phe Thr Ala Asp Gln Phe Tyr

145 150 155 160

Asn Asp Asp Ser Gln Ile Asp Lys Leu Ala Lys Tyr Gly Val Leu Gly

165 170 175

Val Glu Met Thr Glu Thr Ala Leu Tyr Thr Leu Ala Ala Lys His Gly

180 185 190

Arg Lys Ala Leu Ser Ile Leu Thr Val Ser Asp His Val Leu Thr Gly

195 200 205

Glu Glu Thr Thr Ala Glu Glu Arg Gln Thr Thr Phe His Asp Met Ile

210 215 220

Glu Val Ala Leu His Ser Val Ser Gln

225 230

<210> 15

<211> 213

<212> PRT

<213> Escherichia coli

<400> 15

Met Pro Pro Arg Ala Leu Leu Leu Val Asp Leu Gln Asn Asp Phe Cys

1 5 10 15

Ala Gly Gly Ala Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Thr Val Asp Val

20 25 30

Ala Asn Arg Leu Ile Asp Trp Cys Gln Ser Arg Gly Glu Ala Gly Ile

35 40 45

Ala Ser Gln Asp Trp His Pro Ala Asn His Gly Ser Phe Ala Ser Gln

50 55 60

His Gly Val Glu Pro Tyr Thr Pro Gly Gln Leu Asp Gly Leu Pro Gln

65 70 75 80

Thr Phe Trp Pro Asp His Cys Val Gln Asn Ser Glu Gly Ala Gln Leu

85 90 95

His Pro Leu Leu His Gln Lys Ala Ile Ala Ala Val Phe His Lys Gly

100 105 110

Glu Asn Pro Leu Val Asp Ser Tyr Ser Ala Phe Phe Asp Asn Gly Arg

115 120 125

Arg Gln Lys Thr Ser Leu Asp Asp Trp Leu Arg Asp His Glu Ile Asp

130 135 140

Glu Leu Val Val Met Gly Leu Ala Thr Asp Tyr Cys Val Lys Phe Thr

145 150 155 160

Val Leu Asp Ala Leu Gln Leu Gly Tyr Lys Val Asn Val Ile Thr Asp

165 170 175

Gly Cys Arg Gly Val Asn Ile Gln Pro Gln Asp Ser Ala His Ala Phe

180 185 190

Met Glu Met Ser Ala Ala Gly Ala Thr Leu Tyr Thr Leu Ala Asp Trp

195 200 205

Glu Glu Thr Gln Gly

210

<210> 16

<211> 216

<212> PRT

<213> Saccharomyces cerevisiae

<400> 16

Met Lys Thr Leu Ile Val Val Asp Met Gln Asn Asp Phe Ile Ser Pro

1 5 10 15

Leu Gly Ser Leu Thr Val Pro Lys Gly Glu Glu Leu Ser Asn Pro Ile

20 25 30

Ser Asp Leu Met Gln Asp Ala Asp Arg Asp Trp His Arg Ile Val Val

35 40 45

Thr Arg Asp Trp His Pro Ser Arg His Ile Ser Phe Ala Lys Asn His

50 55 60

Lys Asp Lys Glu Pro Tyr Ser Thr Tyr Thr Tyr His Ser Pro Arg Pro

65 70 75 80

Gly Asp Asp Ser Thr Gln Glu Gly Ile Leu Trp Pro Val His Cys Val

85 90 95

Lys Asn Thr Trp Gly Ser Gln Leu Val Asp Gln Ile Met Asp Gln Val

100 105 110

Val Thr Lys His Ile Lys Ile Val Asp Lys Gly Phe Leu Thr Asp Arg

115 120 125

Glu Tyr Tyr Ser Ala Phe His Asp Ile Trp Asn Phe His Lys Thr Asp

130 135 140

Met Asn Lys Tyr Leu Glu Lys His His Thr Asp Glu Val Tyr Ile Val

145 150 155 160

Gly Val Ala Leu Glu Tyr Cys Val Lys Ala Thr Ala Ile Ser Ala Ala

165 170 175

Glu Leu Cys Tyr Lys Thr Thr Val Leu Leu Asp Tyr Thr Arg Pro Ile

180 185 190

Ser Asp Asp Pro Glu Val Ile Asn Lys Val Lys Glu Glu Leu Lys Ala

195 200 205

His Asn Ile Asn Val Val Asp Lys

210 215

<210> 17

<211> 216

<212> PRT

<213> Kluyveromyces marxianus

<400> 17

Met Gly Ala Arg Ala Leu Leu Ile Ile Asp Ile Gln Asn Asp Phe Leu

1 5 10 15

Pro Pro Asp Gly Ser Leu Ala Val Gln Asp Gly Asp Ala Ile Ile Asp

20 25 30

Pro Val Ile Lys Leu Leu Asn Glu Lys Lys Trp Asp Cys Val Ala Ile

35 40 45

Thr Lys Asp Trp His Pro Ser Asp His Ile Ser Phe Ala Lys Asn His

50 55 60

Gly Leu Pro Asp Tyr Ser Ala Phe Thr Tyr Glu Ser Pro Val Pro Gly

65 70 75 80

Ser Thr Glu Lys Gln Glu Ala Thr Leu Trp Pro Val His Cys Val Gln

85 90 95

Glu Ser Trp Gly Ser Glu Val Pro Glu Arg Leu Met Lys Glu Leu Gln

100 105 110

Lys Gln Glu Val Pro His Thr Val Val Asn Lys Gly Phe Leu Ala Asp

115 120 125

Arg Glu Tyr Tyr Ser Gly Phe Asn Asp Ile Trp Asn Asp His Arg Thr

130 135 140

Glu Leu Asp Asp Phe Leu Lys Lys Asn Asn Val Ser Glu Val Tyr Leu

145 150 155 160

Val Gly Leu Ala Leu Asp Phe Cys Val Met Asn Thr Ala Ile Ser Ala

165 170 175

Ala Lys Leu Gly Tyr Lys Thr Thr Ile Leu Lys Asp Tyr Thr Arg Asp

180 185 190

Ile Lys Asn Asp Pro Lys Ser Val Glu Thr Leu Ile Lys Asp Leu His

195 200 205

Ser Arg Phe Asn Ile Gln Ile Glu

210 215

<210> 18

<211> 219

<212> PRT

<213> Escherichia coli O157:H7 EDL933

<400> 18

Met Ile Lys Glu Thr Ala Met Pro Pro Arg Ala Leu Leu Leu Val Asp

1 5 10 15

Leu Gln Asn Asp Phe Cys Ala Gly Gly Ala Leu Ala Val Pro Glu Gly

20 25 30

Asp Ser Thr Val Asp Val Ala Asn Arg Leu Ile Asp Trp Cys Gln Ser

35 40 45

Arg Gly Glu Ala Val Val Ala Ser Gln Asp Trp His Pro Ala Asn His

50 55 60

Gly Ser Phe Ala Ser Gln His Gly Val Glu Pro Tyr Thr Pro Gly Gln

65 70 75 80

Leu Asp Gly Leu Pro Gln Thr Phe Trp Pro Asp His Cys Val Gln Asn

85 90 95

Ser Glu Gly Ala Gln Leu His Pro Leu Leu Asn Gln Lys Ala Ile Ala

100 105 110

Ala Val Phe His Lys Gly Glu Asn Pro Leu Val Asp Ser Tyr Ser Ala

115 120 125

Phe Phe Asp Asn Gly Arg Arg Gln Lys Thr Ser Leu Asp Asp Trp Leu

130 135 140

Arg Asp His Glu Ile Asp Glu Leu Ile Val Met Gly Leu Ala Thr Asp

145 150 155 160

Tyr Cys Val Lys Phe Thr Val Leu Asp Ala Leu Gln Leu Gly Tyr Lys

165 170 175

Val Asn Val Ile Thr Asp Gly Cys Arg Gly Val Asn Ile Gln Pro Gln

180 185 190

Asp Ser Ala His Ala Phe Met Glu Met Ser Gly Ala Gly Ala Thr Leu

195 200 205

Tyr Thr Leu Ala Asp Trp Glu Glu Thr Gln Gly

210 215

<210> 19

<211> 400

<212> PRT

<213> ESCHERICHIA COLI K-12 MG1655

<400> 19

Met Thr Gln Phe Ala Ser Pro Val Leu His Ser Leu Leu Asp Thr Asp

1 5 10 15

Ala Tyr Lys Leu His Met Gln Gln Ala Val Phe His His Tyr Tyr Asp

20 25 30

Val His Val Ala Ala Glu Phe Arg Cys Arg Gly Asp Asp Leu Leu Gly

35 40 45

Ile Tyr Ala Asp Ala Ile Arg Glu Gln Val Gln Ala Met Gln His Leu

50 55 60

Arg Leu Gln Asp Asp Glu Tyr Gln Trp Leu Ser Ala Leu Pro Phe Phe

65 70 75 80

Lys Ala Asp Tyr Leu Asn Trp Leu Arg Glu Phe Arg Phe Asn Pro Glu

85 90 95

Gln Val Thr Val Ser Asn Asp Asn Gly Lys Leu Asp Ile Arg Leu Ser

100 105 110

Gly Pro Trp Arg Glu Val Ile Leu Trp Glu Val Pro Leu Leu Ala Val

115 120 125

Ile Ser Glu Met Val His Arg Tyr Arg Ser Pro Gln Ala Asp Val Ala

130 135 140

Gln Ala Leu Asp Thr Leu Glu Ser Lys Leu Val Asp Phe Ser Ala Leu

145 150 155 160

Thr Ala Gly Leu Asp Met Ser Arg Phe His Leu Met Asp Phe Gly Thr

165 170 175

Arg Arg Arg Phe Ser Arg Glu Val Gln Glu Thr Ile Val Lys Arg Leu

180 185 190

Gln Gln Glu Ser Trp Phe Val Gly Thr Ser Asn Tyr Asp Leu Ala Arg

195 200 205

Arg Leu Ser Leu Thr Pro Met Gly Thr Gln Ala His Glu Trp Phe Gln

210 215 220

Ala His Gln Gln Ile Ser Pro Asp Leu Ala Asn Ser Gln Arg Ala Ala

225 230 235 240

Leu Ala Ala Trp Leu Glu Glu Tyr Pro Asp Gln Leu Gly Ile Ala Leu

245 250 255

Thr Asp Cys Ile Thr Met Asp Ala Phe Leu Arg Asp Phe Gly Val Glu

260 265 270

Phe Ala Ser Arg Tyr Gln Gly Leu Arg His Asp Ser Gly Asp Pro Val

275 280 285

Glu Trp Gly Glu Lys Ala Ile Ala His Tyr Glu Lys Leu Gly Ile Asp

290 295 300

Pro Gln Ser Lys Thr Leu Val Phe Ser Asp Asn Leu Asp Leu Arg Lys

305 310 315 320

Ala Val Glu Leu Tyr Arg His Phe Ser Ser Arg Val Gln Leu Ser Phe

325 330 335

Gly Ile Gly Thr Arg Leu Thr Cys Asp Ile Pro Gln Val Lys Pro Leu

340 345 350

Asn Ile Val Ile Lys Leu Val Glu Cys Asn Gly Lys Pro Val Ala Lys

355 360 365

Leu Ser Asp Ser Pro Gly Lys Thr Ile Cys His Asp Lys Ala Phe Val

370 375 380

Arg Ala Leu Arg Lys Ala Phe Asp Leu Pro His Ile Lys Lys Ala Ser

385 390 395 400

<210> 20

<211> 437

<212> PRT

<213> Bacillus subtilis subsp. subtilis 168

<400> 20

Met Leu Glu Tyr Gly Phe Lys Asp Asp Ser Leu Ser Leu His Thr Asp

1 5 10 15

Leu Tyr Gln Ile Asn Met Ala Glu Thr Tyr Trp Arg Asp Gly Ile His

20 25 30

Glu Lys Lys Ala Ile Phe Glu Leu Phe Phe Arg Arg Leu Pro Phe Glu

35 40 45

Asn Gly Tyr Ala Val Phe Ala Gly Leu Glu Lys Ala Ile Glu Tyr Leu

50 55 60

Glu Asn Phe Lys Phe Thr Asp Ser Asp Leu Ser Tyr Leu Gln Asp Glu

65 70 75 80

Leu Gly Tyr His Glu Asp Phe Ile Glu Tyr Leu Arg Gly Leu Ser Phe

85 90 95

Thr Gly Ser Leu Tyr Ser Met Lys Glu Gly Glu Leu Val Phe Asn Asn

100 105 110

Glu Pro Ile Met Arg Val Glu Ala Pro Leu Val Glu Ala Gln Leu Ile

115 120 125

Glu Thr Ala Leu Leu Asn Ile Val Asn Tyr Gln Thr Leu Ile Ala Thr

130 135 140

Lys Ala Ala Arg Ile Lys Gly Val Ile Gly Asp Glu Val Ala Leu Glu

145 150 155 160

Phe Gly Thr Arg Arg Ala His Glu Met Asp Ala Ala Met Trp Gly Ala

165 170 175

Arg Ala Ala Leu Ile Gly Gly Phe Ser Ala Thr Ser Asn Val Arg Ala

180 185 190

Gly Lys Arg Phe Asn Ile Pro Val Ser Gly Thr His Ala His Ala Leu

195 200 205

Val Gln Ala Tyr Arg Asp Glu Tyr Thr Ala Phe Lys Lys Tyr Ala Glu

210 215 220

Thr His Lys Asp Cys Val Phe Leu Val Asp Thr Tyr Asp Thr Leu Arg

225 230 235 240

Ser Gly Met Pro Asn Ala Ile Arg Val Ala Lys Glu Phe Gly Asp Arg

245 250 255

Ile Asn Phe Ile Gly Ile Arg Leu Asp Ser Gly Asp Leu Ala Tyr Leu

260 265 270

Ser Lys Lys Ala Arg Lys Met Leu Asp Glu Ala Gly Phe Thr Asp Ala

275 280 285

Lys Val Ile Ala Ser Ser Asp Leu Asp Glu His Thr Ile Met Asn Leu

290 295 300

Lys Ala Gln Gly Ala Arg Ile Asp Val Trp Gly Val Gly Thr Lys Leu

305 310 315 320

Ile Thr Ala Tyr Asp Gln Pro Ala Leu Gly Ala Val Tyr Lys Leu Val

325 330 335

Ala Ile Glu Glu Asp Gly Lys Met Val Asp Thr Ile Lys Ile Ser Ser

340 345 350

Asn Pro Glu Lys Val Thr Thr Pro Gly Arg Lys Lys Val Tyr Arg Ile

355 360 365

Ile Asn Gln Ser Asn His His Ser Glu Gly Asp Tyr Ile Ala Leu Tyr

370 375 380

Asp Glu Gln Val Asn Asp Gln Lys Arg Leu Arg Met Phe His Pro Val

385 390 395 400

His Thr Phe Ile Ser Lys Phe Val Thr Asn Phe Tyr Ala Lys Asp Leu

405 410 415

His Glu Leu Ile Phe Glu Lys Gly Ile Leu Cys Tyr Gln Asn Pro Glu

420 425 430

Ile Ser Asp Ile Gln

435

<210> 21

<211> 630

<212> DNA

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 21

atgtcctcgc cccgccgcgc cctgatcgtc atcgatgccc aacaggagta ttttgaagga 60

ctgctgccga ttcaataccc cgcacgcgat gagtcactca ctcgtattgc cgaggcgatg 120

gacgttgctg agcaggcggg cattccggtc gtcgttggac aacatcaatc ccctacgggg 180

ttcccggtct tcgcgccgga gtcgtcgacc ttcgaattgc gccccgagat cgcgaagcgc 240

gctaacaacg tggcccatcg cttcacgaag tcattcgcca gcatcttcgc gggtactggc 300

ctcgaggaat ggttgcgcga acgcggaatc gatacaatca ccatcgtggg ctacatgacg 360

aacaactgcg ttatcggttc cgccgccgct gccgaacctc tcggattcac cgttgaggtg 420

ctgtcggatg caaccggagc catcgacatt gtgaattccg ctggttctgc gccggcgaag 480

agggcgcacg agacaatcat ggccgtcctg aactctaatt gggctgcggt cgccacgacg 540

agcgcttgga ccgaagccgt aacatccggg aacgctgtcg caggagacaa cctcatcgag 600

tcggctgctc gggggcggga cgccaggtaa 630

<210> 22

<211> 208

<212> PRT

<213> 谷氨酸棒杆菌

<400> 22

Met Ser Thr Pro Arg Arg Ala Leu Val Ile Ile Asp Val Gln Gln Glu

1 5 10 15

Tyr Phe Glu Gly Leu Leu Pro Ile Gln Tyr Pro Asn Arg Asp Glu Ser

20 25 30

Ile Ala Arg Ile Ala Ala Ala Met Asp Ala Ala Ser Ser Ala Asp Val

35 40 45

Pro Val Val Val Val Lys His Glu Met Pro Glu Gly Ala Pro Ile Phe

50 55 60

Val Pro Gly Thr Ala Thr Phe Pro Leu His Pro Glu Leu Asp Lys Arg

65 70 75 80

Ser Asp Lys Val Ser His Glu Leu Thr Lys Ile Tyr Ala Ser Ile Phe

85 90 95

Ala Asp Thr Asp Leu Glu Gln Trp Leu Arg Glu Arg Asn Ile Asp Thr

100 105 110

Ile Thr Leu Val Gly Tyr Met Thr Asn Asn Cys Val Ile Gly Ser Ala

115 120 125

Ala Ala Ala Glu Pro Leu Gly Phe Lys Val Glu Val Leu Ser Asp Ala

130 135 140

Thr Gly Ala Ile Asp Leu Val Asn Ala Ala Gly Ser Ala Pro Ala Lys

145 150 155 160

Gln Val His Glu Thr Ile Met Ala Leu Leu Asn Ser Asn Trp Ala Ala

165 170 175

Val Thr Thr Thr Glu Gly Trp Ile Glu Ala Val Ser Ser Lys Thr Ala

180 185 190

Leu Glu Gly Asp Asn Leu Ile Glu Ser Ala Ala Arg Gly Cys Asn Ala

195 200 205

Claims (11)

1.一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备方法，其特征在于，通过如下具体步骤制备：

(1)根据靶蛋白基因序列设计合成两对突变引物，以宿主微生物基因组为模板，利用突变引物PCR扩增靶蛋白突变体基因，再利用靶蛋白突变体基因重组构建基因敲除质粒；

(2)将基因敲除质粒转化进入宿主微生物中，利用同源重组或基因编辑方法使靶蛋白基因中至少一个酶活性相关基因突变，进而敲除或失活靶基因或靶蛋白，最终使得靶蛋白的酶活性降低或完全丧失；所述靶基因或蛋白质包括但不限于烟酸磷酸核糖转移酶、吡啶酰胺脱氨酶、异分支酸酶、半胱氨酸水解酶、嘌呤核酸磷酸酶，所述靶蛋白的主要催化产物为3-羧基吡啶、4-羧基吡啶；

(3)通过基因重组方法将腈水合酶基因以游离质粒或以基因敲入整合至基因组的方式，使微生物具有催化3-氰基吡啶、4-氰基吡啶等氰基吡啶化合物转化为3-吡啶甲酰胺、4-吡啶甲酰胺等甲酰胺吡啶化合物的能力即得低副产物吡啶甲酰胺转化微生物。

2.根据权利要求1中所述一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备方法，其特征在于：还包括步骤：所述同源重组方法为单交换或双交换法，所述基因编辑方法为Crispr/Cas9。

3.根据权利要求1中所述一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备方法，其特征在于：所述宿主微生物包括但不限于枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒杆菌、马克斯克鲁维酵母，红球菌属。

4.根据权利要求1中所述一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备方法，其特征在于：所述靶基因或蛋白质序列包括但不限于SEQ NO.1、SEQ NO.2、SEQ NO.3、SEQ NO.4、SEQNO.5、SEQ NO.6、SEQ NO.7、SEQ NO.8、SEQ NO.9、SEQ NO.10、SEQ NO.11、SEQ NO.12、SEQNO.13、SEQ NO.14、SEQ NO.15、SEQ NO.16、SEQ NO.17、SEQ NO.18、SEQ NO.19、SEQ NO.20、SEQ NO.21、SEQ NO.22。

5.根据权利要求3中所述一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备方法，其特征在于：所述靶基因或蛋白质还包括与靶基因序列或靶蛋白质一级序列相似度不低于50％的基因或蛋白质。

6.根据权利要求4中所述一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备方法，其特征在于：所述酶活性相关基因突变包括但不限于基因点突变、部分基因缺失、基因完全缺失、基因从原始基因座移位到新的基因座、基因序列倒转、基因序列中间任意位点插入不相关基因、基因上游启动子序列钝化或失活、核糖体结合位点钝化或失活等方式。

7.根据权利要求4中所述一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备方法，其特征在于：所述敲除或失活后的靶基因序列或靶蛋白质一级序列通过Sanger测序、高通量基因组测序、等点聚焦-聚丙烯酰胺凝胶、蛋白质质谱等方法，不能检测出基因序列或蛋白质序列或者检测出的基因序列或蛋白质序列不具有完整性。

8.一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物，其特征在于，由权利要求1～6中任一项所述的低副产物吡啶甲酰胺转化微生物的制备方法制备获得。

9.根据权利要求7中所述一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物，其特征在于：应用于催化氰基吡啶类化合物反应生产吡啶甲酰胺，氰基基团水合后转化为甲酰胺基团，且不产或仅含有不大于30ppm的含羧基基团的吡啶化合物；所述氰基吡啶的母体结构为杂环类吡啶，且在3位或4-位发生了氰基加成。

10.根据权利要求8中所述一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物，其特征在于：应用于催化3-氰基吡啶反应生产3-吡啶甲酰胺过程中，显著降低或不含有3-吡啶甲酰胺脱氨后的副产物3-羧基吡啶的生成。

11.根据权利要求8中所述一种低副产物吡啶甲酰胺转化微生物，其特征在于：应用于催化4-氰基吡啶反应生产4-吡啶甲酰胺过程中，显著降低或不含有4-吡啶甲酰胺脱氨后的副产物4-羧基吡啶的生成。