JPWO2005010182A1

JPWO2005010182A1 - コリネ型細菌形質転換体及びそれを用いるジカルボン酸の製造方法

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Publication number: JPWO2005010182A1
Application number: JP2005512066A
Authority: JP
Inventors: 賜希子村上; かおり中田; 祥平沖野; 由布子池永; 乾　将行; 将行乾; 湯川　英明; 英明湯川
Original assignee: Research Institute of Innovative Technology for Earth
Current assignee: Research Institute of Innovative Technology for Earth
Priority date: 2003-07-29
Filing date: 2004-07-28
Publication date: 2007-09-27
Anticipated expiration: 2024-07-28
Also published as: WO2005010182A1; EP1647594A4; JP4451393B2; US7368268B2; DK1647594T3; DE602004026192D1; EP1647594B1; US20070087423A1; EP1647594A1; ATE462002T1

Abstract

本発明は、遺伝子工学的手法により、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊され、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が高発現すべく組換えられた好気性コリネ型細菌形質転換体を提供するものである。本発明の好気性コリネ型細菌形質転換体は、糖類からジカルボン酸を高生産速度で製造できる。

Description

ジカルボン酸は高分子合成原料、医薬原料、化粧品用途そして食品添加剤用途など広い分野で使用されている。例えば、コハク酸およびその誘導体は生分解性プラスチック原料や環境汚染をもたらさないクリーンな洗浄溶剤用途としてその需要がさらに拡大することが期待されている。
本発明はコリネ型細菌形質転換体およびそれを用いるジカルボン酸の製造方法に関する。さらに詳しくは、特定の形質転換処理が施されたコリネ型細菌を用いるジカルボン酸の高生産性製造方法に関する。

従来より、バイオ手法により目的物質を高い生産速度でもって製造する為に、目的物資に至る微生物代謝経路中のいずれかの経路に係わる触媒酵素遺伝子の発現を強化する方法は多く試みられている。コハク酸等のトリカルボン酸回路に介在するジカルボン酸は、糖類の解糖系で生じるホスホエノールピルビン酸やピルビン酸からホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、ＰＥＰＣと記す。）やピルビン酸カルボキシラーゼ（以下、ＰＣと記す。）の触媒作用により炭酸イオンを取り込み、オキザロ酢酸を経由して還元的トリカルボン酸回路反応により生成するとされている。

このため、コリネ型細菌を用いるリンゴ酸、フマール酸、コハク酸等の有機酸の製造方法としてＰＥＰＣ遺伝子を組換える方法（特許文献１）やＰＣ遺伝子を組換える方法（特許文献２）が提案されている。
しかしながら、これらいずれの方法によるコハク酸等有機酸の生成速度は充分なものではなく、さらなる向上が求められている。

一方、本発明の要件の一つである乳酸デヒドロゲナーゼ（以下ｌｄｈと記す）遺伝子（ピルビン酸から乳酸生成経路に係わる酵素遺伝子）が欠損した大腸菌変異株を用いたコハク酸、酢酸およびエタノールの同時生成技術も提案されている（特許文献３、特許文献４）。これら米国特許で使用されている大腸菌変異株はｌｄｈ遺伝子およびｐｆｌ遺伝子（ピルビン酸ギ酸リアーゼ遺伝子）を欠いた大腸菌株（ＮＺＮ１１１株）にさらに変異処理（変異を受けた発現遺伝子の明記なし）や組換え処理（リンゴ酸脱水素酵素−ｍｄｈ−遺伝子を含むプラスミド導入処理）により嫌気的条件下で、コハク酸、酢酸およびエタノールの同時生成が可能なものに形質転換された大腸菌変異株（ＡＦＰ１１１株）である。
この２件の米国特許は同一発明者等による類似した技術内容によるものである。本発明とこれら２件の米国特許は、本発明の要件であるｌｄｈ遺伝子発現機能を同じく欠いたそれぞれの微生物種を使用しているとはいえ、それぞれの発明思想に基づく技術内容やその結果から形質転換される微生物代謝機能内容は全く異なるものである。

本発明で使用されているコリネ型細菌形質転換株と上記大腸菌変異株の代謝機能の差異は下記の二つの事より明らかである。
１）上記大腸菌変異株（ＡＦＰ１１１）は、ｌｄｈ遺伝子およびｐｆｌ遺伝子の両遺伝子を欠いているため嫌気的増殖が不可能な大腸菌株（ＮＺＮ１１１株）にさらに変異や組換え操作によりエタノール生成機能を有するように形質転換されているが、本発明で使用する組換えコリネ型細菌はエタノール生成機能を全く有していない。
２）上記大腸菌変異株（ＡＦＰ１１１）は糖類からのコハク酸生成に炭酸イオンの供給を必須要件としていない（このことは上記１に関連して、ＡＦＰ１１１ではエタノールや酢酸生成機能を有しているのでこれら醗酵産物の副生物として発生する炭酸ガスを利用しているものと推定される）。本発明のコリネ型細菌による糖類からのコハク酸等のジカルボン酸生成には外部からの炭酸イオン若しくは重炭酸イオンまたは炭酸ガスの供給は必須である。

このように同じくｌｄｈ遺伝子を欠いた大腸菌変異株と本発明のコリネ型細菌はそれらの代謝機能、機構は全く異なっていると考えられる。本発明の技術が大腸菌変異株（ＡＦＰ１１１）に関する二つの米国特許（本発明ではこれら米国特許の変異処理や組換え技術は用いられていないが）と前記二つのコリネ型細菌に関する日本公開公報技術の組み合わせにより、得られるものでないこと、およびその技術構成内容が異なることは明らかである。

コハク酸生成に関して、ｌｄｈ遺伝子破壊効果は、特許文献５で明らかにされている。本公表特許公報は大腸菌野生株（ＭＧ１６５５）のｌｄｈ遺伝子破壊突然変異株およびＰＣ遺伝子高発現（大腸菌野生株は本来ＰＣ遺伝子を保有していないが外来ＰＣ遺伝子の導入も「高発現」と呼ばれる）／ｌｄｈ遺伝子破壊の二重組換え株それぞれについてコハク酸生成挙動が調べられている（特許文献５、実施例ＩＩ、表４参照）。
同表で大腸菌野生株のｌｄｈ遺伝子破壊はコハク酸生成に殆ど影響を与えないこと（効果がないこと）、そして、ｌｄｈ遺伝子破壊は、ＰＣ遺伝子高発現によるコハク酸生成増強効果に対して阻害効果を示すことが示されている。

これらの結果は、ピルビン酸から目的物質であるコハク酸への代謝経路の炭素質の流れを増強する為に、ピルビン酸からコハク酸への代謝経路以外の経路（例えば、ピルビン酸から乳酸生成の経路）を破壊、阻害、遮断等を行なうことは目的物質へ流れるピルビン酸の蓄積効果（増量効果）が期待できるとして、容易に考えられる手段の如く考えられるが、事実は逆であることを示している。即ち、ｌｄｈ遺伝子の破壊はコハク酸生成に対して一義的に正の効果をもたらすとは云えないことを示している。
特開平１１−１９６８８７号公報特開平１１−１９６８８８号公報米国特許第５，７７０，４３５号米国特許第５，８６９，３０１号特表２００２−５１１２５０号公報

本発明は、従来より知られていなかった新規な方法による好気性コリネ型細菌形質転換体を使用して、コハク酸等のトリカルボン酸回路に介在するジカルボン酸を高生産速度で製造する技術を提供するものである。すなわち、本発明は、特定の形質転換処理を施した好気性コリネ型細菌を創製し、特定の反応条件下で糖類からジカルボン酸を高速度で反応選択性も高く製造することのできる技術を提供することを目的とする。

本発明者等は好気性コリネ型細菌を使用してコハク酸等トリカルボン酸回路に介在するジカルボン酸を糖類から高生産速度で製造すべく、ＰＥＰＣ高発現形質転換コリネ型細菌やＰＣ高発現形質転換コリネ型細菌を用いて種々検討を行ったが、目的とする高生産速度でのジカルボン酸の製造は出来なかった。このような方法ではそれらの生産速度は形質転換される前のコリネ型細菌を用いた場合の生産速度と同程度のものに過ぎなかった。

ところが、思いがけないことに、トリカルボン酸回路とは別の乳酸醗酵経路に関与するｌｄｈ遺伝子破壊コリネ型細菌株（本発明のｌｄｈ遺伝子「破壊」とは、ｌｄｈ遺伝子の全部またはその一部が破壊、変異されたり、該遺伝子のプロモーターやリボソームバインディングサイト等の該遺伝子発現ユニットの改変または除去により、ｌｄｈ発現活性を有していないことを意味する）を用いてＰＣ高発現形質転換体を創製し、本発明の特定の還元状態下で糖類を反応させたところ、ｌｄｈ遺伝子が破壊されていない、単なるＰＣ高発現形質転換体によるジカルボン酸生産速度の２倍もの高生産速度でジカルボン酸が生成することを見出し、さらに検討を重ねて本発明に到達した。（なお、ＰＥＰＣ高発現形質転換体の場合には、後記の比較例で明らかにされているように、このような効果は認められなかった。）

すなわち、本発明は、
（１）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊され、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が高発現すべく組換えられた好気性コリネ型細菌形質転換体であって、
好気性コリネ型細菌がコリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌およびマイクロコッカス属菌の群から選ばれるいずれか１種であることを特徴とする好気性コリネ型細菌形質転換体、
（２）コリネバクテリウム属菌が、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０５８、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０５９、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０６０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３２３２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３２８６、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３２８７、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３６５５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３７４５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３７４６、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３７６１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０２０およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ３１８３１から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする前記（１）に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
（３）ブレビバクテリウム属菌が、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍＡＴＣＣ１３８６９、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＭＪ−２３３、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＭＪ−２３３ＡＢ−４１およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓＡＴＣＣ６８７２から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする前記（１）に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
（４）アースロバクター属菌が、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ８０１０、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ４３３６、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ２１０５６、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ３１２５０、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ３１７３８およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ３５６９８から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする前記（１）に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
（５）マイコバクテリウム属菌が、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓＡＴＣＣ１９２１０またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓＡＴＣＣ２７２８９であることを特徴とする前記（１）に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
（６）マイクロコッカス属菌が、ＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＮｏ．２３９、ＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓＮｏ．２４０、ＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｕｒｅａｅＩＡＭ１０１０およびＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｒｏｓｅｕｓＩＦＯ３７６４から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする前記（１）に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
（７）コリネバクテリウム属菌がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲであることを特徴とする前記（２）に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
（８）乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊が、相同性組換え法、トランスポゾン挿入法および変異原導入法から選ばれる方法により該遺伝子が分断もしくは該遺伝子の一部または全域が除去され、該酵素活性発現機能が喪失していることを特徴とする前記（１）〜（７）のいずれかに記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
（９）ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤであることを特徴とする前記（１）、（２）、（７）および（８）のいずれかに記載の好気性コリネ型細菌形質転換体、
（１０）炭酸イオン若しくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する還元状態下の反応液中で細菌と糖類とを反応させ反応液中に生成するジカルボン酸を採取する方法において、細菌が前記（１）に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体であることを特徴とするジカルボン酸の製造方法、
（１１）還元状態下の反応液の酸化還元電位が−２００ミリボルト乃至−５００ミリボルトであることを特徴とする前記（１０）に記載のジカルボン酸の製造方法、および
（１２）ジカルボン酸がコハク酸、フマール酸およびリンゴ酸から選ばれることを特徴とする前記（１０）または（１１）に記載のジカルボン酸の製造方法、
に関する。

本発明によれば、ジカルボン酸が糖類から高生産速度で製造できる。本発明は、遺伝子工学的手法により、乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊され、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が高発現すべく組換えられた好気性コリネ型細菌形質転換体を使用する。これは、ｌｄｈ遺伝子が破壊されていない、単なるＰＣ高発現形質転換体を使用する場合に対比して、２倍もの高生産速度でジカルボン酸が生成する。

本発明で用いられる好気性コリネ型細菌とは、バージーズ・マニュアル・デターミネイティブ・バクテリオロジー（ＢａｒｇｅｙｓＭａｎｕａｌｏｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，８，５９９、１９７４）に定義されている一群の微生物である。具体例を挙げれば、コリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌またはマイクロコッカス属菌等が挙げられる。

さらに具体的には、コリネバクテリウム属菌としては、コリネバクテリウムグルタミカムＲ（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲ；ＦＥＲＭＰ−１８９７６）、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０５８、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０５９、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０６０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３２３２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３２８６、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３２８７、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３６５５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３７４５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３７４６、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３７６１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０２０またはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ３１８３１等が挙げられる。

ブレビバクテリウム属菌としては、ブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９、ブレビバクテリウムフラバム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍ）ＭＪ−２３３（ＦＥＲＭＢＰ−１４９７）もしくはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＭＪ−２３３ＡＢ−４１（ＦＥＲＭＢＰ−１４９８）、またはブレビバクテリウムアンモニアゲネス（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ６８７２等があげられる。

アースロバクター属菌としては、アースロバクターグロビフォルミス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ）ＡＴＣＣ８０１０、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ４３３６、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ２１０５６、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ３１２５０、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ３１７３８またはＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ３５６９８等が挙げられる。

マイコバクテリウム属菌としては、マイコバクテリウムボビス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）ＡＴＣＣ１９２１０またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓＡＴＣＣ２７２８９等が挙げられる。

マイクロコッカス属菌としては、マイクロコッカス・フロイデンライヒ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）Ｎｏ．２３９（ＦＥＲＭＰ−１３２２１）、マイクロコッカス・ルテウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓ）Ｎｏ．２４０（ＦＥＲＭＰ−１３２２２）、マイクロコッカスウレアエ（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｕｒｅａｅ）ＩＡＭ１０１０またはマイクロコッカスロゼウス（Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｒｏｓｅｕｓ）ＩＦＯ３７６４等が挙げられる。

本発明で用いられる好気性コリネ型細菌としては、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲ（ＦＥＲＭＰ−１８９７６）、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２またはＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍＡＴＣＣ１３８６９などが好ましい。

また、本発明で用いられる好気性コリネ型細菌としては自然界に存在する野生株の変異株（例えば、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲ株のセロビオース資化能を獲得した変異株ＦＥＲＭＰ−１８９７７、ＦＥＲＭＰ−１８９７８株など；特開平２００４−８９０２９号公報参照）であってもよく、本発明の構成遺伝子以外の遺伝子が組換えられた人為株（例えば、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲ株のホスホトランスフェラーゼ系酵素ＩＩに関する遺伝子組み換えにより、グルコースとセロビオースの同時併行資化能を発現すべく形質転換された人為株、ＦＥＲＭＰ−１８９７９；特開平２００４−８９０２９号公報参照）を用いても良い。
これら上記の好気性コリネ型細菌が本発明の目的のため、下記に詳記するｌｄｈ発現遺伝子の破壊およびＰＣ高発現の形質転換処理が施される。

本発明のｌｄｈ遺伝子の破壊は、相同性組換え法、トランスポゾン挿入法および変異原導入法から選ばれる方法により該遺伝子が分断もしくは該遺伝子の一部または全域が除去され、該酵素活性発現機能を喪失させることができるが、トランスポゾン挿入法および変異原導入法は染色体上の遺伝子のランダムな破壊であり、ターゲットとするｌｄｈ遺伝子の破壊を効率よく実施するには相同性組換え法が好ましい。これらの方法はいずれも自体従来充分に確立された技術であるから、本発明にあっては、それらに従ってよい。
相同性組換え法によるコリネ型細菌のｌｄｈ遺伝子破壊株作製は、実施例で詳記するが、通常、以下の操作方法、手順で行なうことができる。

Ａ）発明に用いる微生物からＤＮＡ抽出；コリネ型細菌からのゲノムＤＮＡ抽出法は、４ｍｇ／ｍｌ濃度のリゾチームで３７℃、３０分間菌体を事前に処理する以外は、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｅ．Ｆ．ＦｒｉｔｓｃｈａｎｄＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ．１９８９．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｌｏｎｉｎｇ：ａｌａｂｏｒａｔｏｒｙｍａｎｕａｌ，２ｎｄｅｄ．ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）により行うことができる。

Ｂ）ターゲットとなるｌｄｈ遺伝子のクローン化と破壊用プラスミド作製；ｌｄｈ遺伝子のクローニングは、既知ｌｄｈ遺伝子間の保存アミノ酸配列からデザインしたプライマーを用いたＰＣＲ法や、既知ｌｄｈ遺伝子を用いたハイブリダイゼーションにより行うことができるが、最も効率的な方法としては、ゲノム配列（コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の場合、全ゲノム配列（野中寛、中田かおり、岡井直子、和田真利子、佐藤由美子、ＫｏｓＰｅｔｅｒ、乾将行、湯川英明「ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲゲノム解析」日本農芸化学会、２００３年４月、横浜、日本農芸化学会２００３年度大会講演要旨集、ｐ．２０参照）が決定されているので、利用できる）からプライマーをデザインし、コリネ型細菌のゲノムＤＮＡを鋳型として、ｌｄｈ遺伝子の全長を含む遺伝子をＰＣＲにより増幅・取得することができる。一方、ｌｄｈ遺伝子の破壊株の作成は、コリネ型細菌内で複製不可能なｐＨＳＧ３９８等の大腸菌ベクター等に、ＰＣＲで増幅したｌｄｈ遺伝子をクローニング後、ｌｄｈ遺伝子のほぼ中央に位置するユニークな制限酵素サイトに、カナマイシン等の薬剤耐性遺伝子（遺伝子破壊する際のマーカー遺伝子として利用）を挿入した、遺伝子破壊用プラスミドを作製する。

Ｃ）プラスミド導入による相同組換え法；ｌｄｈ遺伝子破壊株の作成は、上記遺伝子破壊用プラスミドを、コリネ型細菌への高効率遺伝子導入法〔電気パルス法（Ｙ．Ｋｕｒｕｓｕ，ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：４４３−４４７．１９９０．およびＡ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８１−１８５．１９９３）の方法〕により細胞内に導入し、染色体への相同性組換えにより、ｌｄｈ遺伝子を破壊（または不活性化）することにより行うことができる。尚、ｌｄｈ遺伝子の破壊の確認は、遺伝子レベルではＰＣＲやサザンハイブリダイゼーション法により、ｌｄｈ遺伝子断片に加えて、カナマイシン耐性遺伝子などのマーカー遺伝子断片が染色体に挿入されていることで、また、蛋白質レベルでは、乳酸デヒドロゲナーゼの酵素活性が消失していることにより確認できる。

上述の如くして作製されたコリネ型細菌のｌｄｈ破壊株は、さらに、ＰＣ遺伝子を高発現すべく形質転換される。すなわち、ＰＣ活性を有する酵素をコードする遺伝子配列を含む核酸断片を上記のコリネ型細菌のｌｄｈ破壊株に導入し、導入前のｌｄｈ破壊株に比しＰＣ活性をより高く発現すべく、形質転換される。

ＰＣ遺伝子を含む核酸断片の導入法は後記の実施例にて詳記するが、本発明の目的で使用されるＰＣ遺伝子を含む核酸断片は微生物、動植物の染色体上に広く存在しており、本発明のコリネ型細菌自身の有するものであっても外来（異種）由来のものでも良い。

また、その塩基配列が既知であれば、その配列に従って合成した遺伝子を使用することも出来る。遺伝子配列が不明の場合であっても、ＰＣ活性を指標にして酵素蛋白質を精製し、そのＮ末端アミノ酸配列、部分分解配列より、通常のハイブリダイゼーションの手法により核酸断片を単離できる。また、ＰＣ酵素蛋白質間で保存されているアミノ酸配列をもとにハイブリダイゼーション、ＰＣＲ法により断片を取得することが可能である。取得した断片は通常の手法により塩基配列を決定することができる。

特性が明らかにされているＰＣ酵素蛋白あるいは遺伝子には下記のものがある。
コリネバクテリウム・グルタミクム（Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）；（ＧｅｎＢａｎｋＹ０９５４８）ヒト；（ＧｅｎＢａｎｋＫ０２２８２；Ｓ．Ｆｒｅｙｔａｇｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９，１２８３１−１２８３７（１９８４））
サッカロミセス・セレビシェー（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）；（ＧｅｎＢａｎｋＸ５９８９０，Ｊ０３８８９，ａｎｄＭ１６５９５；Ｒ．Ｓｔｕｃｋａｅｔａｌ．，Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２２９，３０５−３１５（１９９１）；Ｆ．Ｌｉｍｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６３，１１４９３−１１４９４（１９８８）；Ｄ．Ｍｙｅｒｓｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２２，５０９０−５０９６（１９８３））
リゾビウム・エトリ（Ｒ．ｅｔｌｉ）；（ＧｅｎＢａｎｋＵ５１４３９；Ｍ．Ｄｕｎｎｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７８，５９６０−５０７０（１９９６））
シゾサッカロミッセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）；（ＧｅｎＢａｎｋＤ７８１７０）バシルス・ステアロサーモフルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）；（ＧｅｎＢａｎｋＤ８３７０６；Ｈ．Ｋｏｎｄｏ，Ｇｅｎｅ，１９１，４７−５０（１９９７）；Ｓ．Ｌｉｂｏｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１８，３６４７−３６５３（１９７９））
シュードモナス・フルオレセンス（Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）；（Ｒ．Ｓｉｌｖｉａｅｔａｌ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，９３，７５−８１（１９７６））

本発明のＰＣ遺伝子はＰＣ活性が保持される限り、塩基配列の一部が他の塩基と置換、削除または新たに塩基が挿入されていてもよく、さらには塩基配列の一部が転位されているものでも良い。これら誘導体のいずれも本発明に用いることができる。上記一部とは、例えばアミノ酸残基換算で、１乃至数個であってよい。

本発明のＰＣ遺伝子を含む核酸断片は前述のコリネ型細菌ｌｄｈ破壊株へ、プラスミドベクターを用いて、ＰＣ遺伝子が発現可能な制御配列下に導入される。ここで「制御配列下」とはＰＣ遺伝子が、例えば、プロモーター、インデューサー、オペレーター、リボソーム結合部位および転写ターミネーター等との共同作業により自律複製できることを意味する。このような目的で使用されるプラスミドベクターとしては、コリネ型細菌ｌｄｈ破壊株内で自律複製機能を司る遺伝子を含むものであれば良い。その具体例としては、例えば、ｐＡＭ３３０（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．４８，２９０１−２９０３（１９８４）およびＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＳｙｍｐＳｅｒ．，ｖｏｌ．１６，２６５−２６７（１９８５））（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ２２５６由来）、ｐＨＭ１５１９（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．ｈｅｍ．，ｖｏｌ．４８、２９０１−２９０３（１９８４））（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０５８由来）、ｐＣＲＹ３０（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．５７，７５９−７６４（１９９１））、ｐＥＫ０，ｐＥＣ５，ｐＥＫＥｘ１（Ｇｅｎｅ，ｖｏｌ．１０２，９３−９８（１９９１））そしてｐＣＧ４（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，ｖｏｌ．１５９，３０６−３１１（１９８４））（ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕａｔｍｉｃｕｍＴ２５０由来）等が挙げられる。

本発明のコリネ型細菌形質転換体創製に使用されるプラスミドの構築は、例えば、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株由来のＰＣ遺伝子を用いる場合では完全なＰＣ遺伝子を含む３．８−ｋｂ遺伝子断片〔コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の全ゲノム解析結果（野中寛、中田かおり、岡井直子、和田真利子、佐藤由美子、ＫｏｓＰｅｔｅｒ、乾将行、湯川英明「ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲゲノム解析」日本農芸化学会、２００３年４月、横浜、日本農芸化学会２００３年度大会講演要旨集、ｐ．２０参照）を基にＰＣＲで増幅可能（詳細は、実施例に記載）〕を、適当なプロモーター、ターミネーター等の制御配列を連結後、上記例示されているいずれかのプラスミドベクターの適当な制限酵素部位に挿入し、構築することが出来る。

上記組換えプラスミドにおいて、ＰＣ遺伝子を発現させるためのプロモーターとしては、コリネ型細菌が元来保有するプロモーターが挙げられるが、それに限られるものではなく、ＰＣ遺伝子の転写を開始させる機能を有する塩基配列であればいかなるものであってもよい。また、ＰＣ遺伝子の下流に配置される制御配列下のターミネーターについても、コリネ型細菌が元来保有するターミネーターが挙げられるが、それらに限定されるものではなく、例えば大腸菌由来のトリプトファンオペロンのターミネーター等のＰＣ遺伝子の転写を終了させる機能を有する塩基配列であれば、いかなるものであってもよい。

ＰＣ遺伝子を含むプラスミドベクターのコリネ型細菌ｌｄｈ破壊株への導入方法としては、電気パルス法（エレクトロポレーション法）やＣａＣｌ_２法等コリネ型細菌ｌｄｈ破壊株へのＰＣ遺伝子導入が可能な方法であれば特に限定されるものではない。
その具体例として、例えば電気パルス法は、公知の方法（Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５４，４４３−４４７（１９９０）、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．１４４，１８１−１８５（１９９３））を用いることができる。

本発明のコリネ型細菌形質転換創製体の取得方法としては、常法に従い、ＰＣ遺伝子を含むプラスミドベクターに薬剤耐性遺伝子等をも組み入れて、適切な濃度の当該薬剤を含むプレート培地上にＰＣ遺伝子導入処理を行った本発明のコリネ型細菌を塗布することにより形質転換されたコリネ型細菌を選抜することができる。その具体例としては、例えば、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．５４，４４３−４４７（１９９０）、Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ｖｏｌ．１４４，１８１−１８５（１９９３）に記載の方法等を用いることができる。

上記の如くして創製された、ｌｄｈ遺伝子が破壊され、そして、ＰＣ遺伝子が高発現すべく形質転換されている本発明のコリネ型細菌は、菌体名；ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣのもとに、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１００６０で寄託されている。

ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣへは、場合により、さらに付加的に本発明のジカルボン酸生成速度の向上に寄与するアナプレロティック経路酵素遺伝子やトリカルボン酸回路で寄与する、例えば、フマレートレダクターゼ（ＦＲＤ）遺伝子等を導入することも出来る。そのような本発明のコリネ型細菌の例として、菌体名；ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤのもとに、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１００６１で寄託されている。

かくして創製された本発明のコリネ型細菌は特定の還元状態下にある、炭酸イオン、重炭酸イオンまたは炭酸ガスを含有する反応液中で、換言すれば炭酸イオン、重炭酸イオンおよび炭酸ガスからなる群から選ばれる１種類または２種類以上の混合物を含有する反応液中で、糖類を原料として、ジカルボン酸、例えばコハク酸、フマール酸またはリンゴ酸などを高い生産速度で生成することが出来る。

本発明に係るジカルボン酸の製造方法においては、まず上述した本発明の方法で形質転換創製された好気性コリネ型細菌を好気条件下で増殖培養する。

本発明の好気性コリネ型細菌の培養は、炭素源、窒素源および無機塩等を含む通常の栄養培地を用いて行うことが出来る。培養には、炭素源として、例えばグルコースまたは廃糖蜜等を、そして窒素源としては、例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは尿素等をそれぞれ単独もしくは混合して用いることが出来る。また、無機塩として、例えばリン酸一水素カリウム、リン酸ニ水素カリウムまたは硫酸マグネシウム等を使用することが出来る。この他にも必要に応じて、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、コーンスティープリカー、カザミノ酸またはビオチンもしくはチアミン等の各種ビタミン等の栄養素を培地に適宜添加することも出来る。

培養は、通常、通気攪拌または振盪等の好気的条件下、約２０℃〜約４０℃、好ましくは約２５℃〜約３５℃の温度で行うことが出来る。培養時のｐＨは約５〜１０付近、好ましくは約７〜８付近の範囲がよく、培養中のｐＨ調整は酸またはアルカリを添加することにより行うことが出来る。培養開始時の炭素源濃度は、約１〜２０％（Ｗ／Ｖ）、好ましくは約２〜５％（Ｗ／Ｖ）である。また、培養期間は通常約１〜７日間程度である。

ついで、本発明の好気性コリネ型細菌の培養菌体を回収する。上記の如くして得られる培養物から培養菌体を回収分離する方法としては、特に限定されず、例えば遠心分離や膜分離等の公知の方法を用いることができる。

回収された培養菌体に対して処理を加え、得られる菌体処理物を次工程であるジカルボン酸生成反応工程に用いてもよい。菌体処理方法としては、培養菌体に何らかの処理が加えられたものであればよく、例えば、菌体をアクリルアミドまたはカラギーナン等で固定化する方法等が挙げられる。

ついで、上記の如くして得られる培養物から回収分離された本発明の好気性コリネ型細菌の培養菌体またはその菌体処理物は還元状態下の反応培地での目的とするジカルボン酸の生成反応に供せられる。ジカルボン酸生成方式は、回分式、連続式いずれの生成方式も可能である。

本発明の還元状態下の生化学反応に於いては、本発明の好気性コリネ型細菌の増殖分裂が抑制され、増殖に伴う分泌副生物の実質的な完全抑制を実現することが出来る。この観点からは、培養回収されたコリネ型細菌またはその菌体処理物が反応培地に供せられるときには、コリネ型細菌細胞内外の培養時の環境状態が反応培地にもたらされない方法や条件を用いることが推奨される。つまり、反応培地は、増殖培養過程で生成し、菌体内外に存在する生成物質を実質的に含有しないことが好ましい。より具体的には、増殖培養過程で生成し、菌体外に放出された分泌副生物、および培養菌体内の好気的代謝機能により生成し菌体内に残存する物質が、反応培地に実質的に存在しない状態であることが推奨される。このような状態は、例えば、増殖培養後の培養液の遠心分離、膜分離等の方法および／または培養後の菌体を還元状態下で約２時間ないし１０時間程度放置することで実現される。

本工程においては、還元状態下の反応培地を用いる。反応培地は、還元状態下にあれば、固体状、半固体状または液体状等いずれの形状を有していてもよい。本発明の一つの要件は、還元状態下でコリネ型細菌の代謝機能による生化学反応を行わせしめ、目的とするジカルボン酸を生成することである。

本発明における還元状態とは、反応系の酸化還元電位で規定され、反応培地の酸化還元電位は、好ましくは約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶ程度、より好ましくは約−２５０ｍＶ〜−５００ｍＶ程度である。反応培地の還元状態は簡便にはレサズリン指示薬（還元状態であれば、青色から無色への脱色）である程度推定できるが、正確には酸化還元電位差計（例えば、ＢＲＯＡＤＬＥＹＪＡＭＥＳ社製、ＯＲＰＥｌｅｃｔｒｏｄｅｓ）を用いる。本発明においては、反応培地に菌体またはその処理物を添加した直後からジカルボン酸を採取するまで、還元状態を維持していることが好ましいが、少なくともジカルボン酸を採取する時点で反応培地が還元状態であればよい。反応時間の約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の時間、反応培地が還元状態に保たれていることが望ましい。なかでも、反応時間の約５０％以上、より好ましくは約７０％以上、さらに好ましくは約９０％以上の時間、反応培地の酸化還元電位が約−２００ｍＶ〜−５００ｍＶ程度に保たれていることがより望ましい。

このような還元状態の実現は具体的には、前記の培養後の培養菌体調製方法、反応培地の調整方法、または反応途中における還元状態の維持方法等によりなされる。

還元状態下の反応培地の調整方法は、公知の方法を用いてよい。例えば、反応培地用水溶液の調整方法は、例えば硫酸還元微生物などの絶対嫌気性微生物用の培養液調整方法
（Ｐｆｅｎｎｉｇ，Ｎｅｔ．ａｌ．（１９８１）：Ｔｈｅｄｉｓｓｉｍｉｌａｔｏｒｙｓｕｌｆａｔｅ−ｒｅｄｕｃｉｎｇｂａｃｔｅｒｉａ，ＩｎＴｈｅＰｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ，ＡＨａｎｄｂｏｏｋｏｎＨａｂｉｔａｔｓ，ＩｓｏｌａｔｉｏｎａｎｄＩｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆＢａｃｔｅｒｉａ，Ｅｄ．ｂｙＳｔａｒｒ，Ｍ．Ｐ．ｅｔ．ａｌ．ｐ．９２６−９４０，Ｂｅｒｌｉｎ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ．や「農芸化学実験書第三巻、京都大学農学部農芸化学教室編、１９９０年第２６刷、産業図書株式会社出版」）などが参考となり、所望する還元状態の水溶液を得ることが出来る。

反応培地用水溶液の調整方法として、より具体的には反応培地用水溶液を加熱処理や減圧処理することにより溶解ガスを除去する方法等が挙げられる。より具体的には、約１０ｍｍＨｇ以下、好ましくは約５ｍｍＨｇ以下、より好ましくは約３ｍｍＨｇ以下の減圧下で、約１〜６０分程度、好ましくは５〜４０分程度、反応培地用水溶液を処理することにより、溶解ガス、特に溶解酸素を除去して還元条件下の反応培地用水溶液を作成することができる。また、適当な還元剤（例えば、チオグリコール酸、アスコルビン酸、システィン塩酸塩、メルカプト酢酸、チオール酢酸、グルタチオンそして硫化ソーダ等）を添加して還元状態の反応培地用水溶液を調整することも出来る。また、場合により、これらの方法を適宜組み合わせることも有効な還元状態の反応培地用水溶液を調整する方法となる。

反応途中における還元状態の維持方法としては、反応系外からの酸素の混入を可能な限り防止することが望ましく、反応系を窒素ガス等の不活性ガスや炭酸ガス等で封入する方法が通常用いられる。酸素混入をより効果的に防止する方法としては、反応途中において本発明のコリネ型細菌の菌体内の代謝機能を効率よく機能させるために、反応系のｐＨ維持調整液の添加や各種栄養素溶解液を適宜添加する必要が生じる場合もあるが、このような場合には添加溶液から酸素を予め除去しておくことが有効である。

反応系の酸化還元電位に影響する因子としては、反応系雰囲気ガスの種類と濃度、反応温度、反応溶液ｐＨ、目的とするジカルボン酸生成のために使用される無機および有機の各種化合物濃度と組成等が考えられる。本発明における反応培地の酸化還元電位とは上記各種影響因子が統合されて示されるものである。

反応培地には、ジカルボン酸生成の原料となる糖類および炭酸イオンまたは重炭酸イオンが含まれている。

糖類としては、グルコース、ガラクトース、フルクトースもしくはマンノースなどの単糖類、セロビオース、ショ糖もしくはラクトース、マルトースなどの二糖類、またはデキストリンもしくは可溶性澱粉などの多糖類などが挙げられる。なかでも、グルコースが好ましい。この場合、グルコースは約０．５〜５００ｇ／Ｌ（リットル）の濃度範囲で使用される。

炭酸イオンまたは重炭酸イオンは、炭酸または重炭酸もしくはこれらの塩あるいは炭酸ガスから供給されるものである。炭酸または重炭酸の塩の具体例としては、例えば、炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸アンモニウム、重炭酸ナトリウム、そして重炭酸カリウム等が挙げられる。これら炭酸イオンまたは重炭酸イオンは約１〜５００ｍＭ、好ましくは約２〜３００ｍＭの濃度範囲で使用される。炭酸ガスが供給される場合は、約５０ｍｇ／Ｌ〜２５ｇ／Ｌ、好ましくは、約１００ｍｇ／Ｌ〜１５ｇ／Ｌの濃度で溶液中に含有するように供給される。

ジカルボン酸の生成反応に用いられる反応培地組成は、コリネ型細菌またはその処理物がその代謝機能を維持するために必要な成分、即ち、各種糖類等の炭素源と炭酸源の他にも、蛋白質合成に必要な窒素源（例えばアンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、硝酸アンモニウムまたは尿素等）、その他リン、カリウムまたはナトリウム等の塩類、さらに鉄、マンガンまたはカルシウム等の微量金属塩を含む。これらの添加量は所要反応時間、目的ジカルボン酸生産物の種類または用いられるコリネ型細菌の種類等により適宜定めることが出来る。用いるコリネ型細菌によっては特定のビタミン類の添加が好ましい場合もある。好気性コリネ型細菌またはその菌体処理物と糖類との反応は、本発明の好気性コリネ型細菌またはその菌体処理物が活動できる温度条件下で行われることが好ましく、好気性コリネ型細菌またはその菌体処理物の種類などにより適宜選択することができる（詳しくは実施例参照）。

上述のようにして反応培地で生成したジカルボン酸を採取する。その方法はバイオプロセスで用いられる公知の方法を用いることが出来る。そのような公知の方法として、ジカルボン酸生成液の塩析法、再結晶法、有機溶媒抽出法、エステル化蒸留分離法、クロマトグラフィー分離法または電気透析法等があり、ジカルボン酸の特性に応じてその分離精製採取法は適宜定めることが出来る。

以下、実施例でもって本発明を説明するが、本発明はこのような実施例に限定されるものではない。なお、「％」は、特に断りのない限り、「重量％」を示す。

〔実施例１〕コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株（独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号：ＦＥＲＭＰ−１８９７６）のｌｄｈ遺伝子破壊株の作製
（Ａ）コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株からの全ＤＮＡの抽出
Ａ培地１Ｌ［組成：尿素：２ｇ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４：７ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４：０．５ｇ，Ｋ_２ＨＰＯ_４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ_４・ｎＨ_２Ｏ：４．２ｍｇ，Ｄ−ビオチン：２００μｇ，塩酸チアミン：２００μｇ，酵母エキス２ｇ，カザミノ酸７ｇ，グルコース２０ｇおよび蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）］に、野生株ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲを、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期後期まで３３℃で培養し、菌体を集めた。

得られた菌体を１０ｍｇ／ｍｌの濃度になるよう、１０ｍｇ／ｍｌリゾチーム、１０ｍＭＮａＣｌ、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）および１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａの各成分を含有する溶液１５ｍｌ（各成分の濃度は最終濃度である）に懸濁した。次にプロテナーゼＫを最終濃度が１００μｇ／ｍｌになるように添加し、３７℃で１時間保温した。さらにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度が０．５％になるように添加し、５０℃で６時間保温して溶菌した。この溶菌液に、等量のフェノール／クロロホルム溶液を添加し、室温で１０分間ゆるやかに振盪した後、全量を遠心分離（５，０００×ｇ，２０分間，１０〜１２℃）し、上清画分を分取した。この上清に酢酸ナトリウムを０．３Ｍとなるよう添加した後、２倍量のエタノールをゆっくりと加えた。水層とエタノール層の間に存在するＤＮＡをガラス棒でまきとり、７０％エタノールで洗浄した後、風乾した。得られたＤＮＡに１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ７．５）−１ｍＭＥＤＴＡ・２Ｎａ溶液５ｍｌを加え、４℃で一晩静置し、以後の実験に用いた。

（Ｂ）ｌｄｈ遺伝子のクローン化と遺伝子破壊用プラスミドの創製
上記（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲに際しては、ｌｄｈ遺伝子をクローン化するべく、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の全ゲノム解析結果（野中寛、中田かおり、岡井直子、和田真利子、佐藤由美子、ＫｏｓＰｅｔｅｒ、乾将行、湯川英明「ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲゲノム解析」日本農芸化学会、２００３年４月、横浜、日本農芸化学会２００３年度大会講演要旨集、ｐ．２０参照）を基に、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
ｌｄｈ遺伝子増幅用プライマー
ｌｄｈ−Ｎ；５’−ＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＡＴＣＡＧＧＡＡＧＴＧＧＧＡＴＣＧＡＡＡ−３’（配列番号１），
ｌｄｈ−Ｃ；５’−ＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＣＣＡＴＣＣＡＡＣＡＧＴＴＴＣＡＴＴ−３’（配列番号２）
尚、いずれのプライマーもＳａｌＩサイトが末端に付加されている。

ＰＣＲは、パーキンエルマーシータス社製の「ＤＮＡサーマルサイクラー」を用い、反応試薬として、タカラ・イーエックス・タック（ＴａＫａＲａＥｘＴａｑ）（宝酒造株式会社製）を用いて下記の条件で行った。
反応液：
（１０×）ＰＣＲ緩衝液１０μｌ
１．２５ｍＭｄＮＴＰ混合液１６μｌ
鋳型ＤＮＡ１０μｌ（ＤＮＡ含有量１μＭ以下）
上記記載の２種のプライマー各々１μｌ（最終濃度０．２５μＭ）
タカラ・イーエックス・タックＤＮＡ・ポリメラーゼ０．５μｌ
滅菌蒸留水６１．５μｌ
以上を混合し、この１００μｌの反応液をＰＣＲにかけた。
ＰＣＲサイクル：
デナチュレーション過程：９４℃ ６０秒
アニーリング過程：５２℃ ６０秒
エクステンション過程：７２℃ １２０秒
以上を１サイクルとし、３０サイクル行った。

上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ｌｄｈ遺伝子の場合、約１．１ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
次に、上記ｌｄｈ遺伝子を含む１．１ｋｂＰＣＲ産物１０μｌおよびクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有するプラスミドｐＨＳＧ３９８（宝酒造株式会社製）２μｌを各々制限酵素ＳａｌＩで切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させた。このライゲーション液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇ、Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｘｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）２００ｍｇ、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ１−ｔｈｉｏ−ｂｅｔａ−ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）１００ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

上記培地上で白色を呈する生育株を選定し常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＳａｌＩで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９８約２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、ｌｄｈ遺伝子を含有する長さ約１．１ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
該ｌｄｈ遺伝子を含むプラスミドをｐＨＳＧ３９８−ＬＤＨとした。
このプラスミドｐＨＳＧ３９８−ＬＤＨに含まれるｌｄｈ遺伝子のほぼ中央には、制限酵素部位ＥｃｏＲＶ（本プラスミド内で１箇所のみ）が存在する。上記のように抽出したプラスミドｐＨＳＧ３９８−ＬＤＨのＤＮＡ溶液１０μｌをＥｃｏＲＶで完全に切断し、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた。

一方、プラスミドｐＵＣ４Ｋ（ファルマシア社製）２μｌを制限酵素ＰｓｔＩで切断後、アガロース電気泳動により分離後、ゲルから約１．２ｋｂＰｓｔＩカナマイシン耐性遺伝子を含むＤＮＡ断片を切り出し、精製した。この精製１．２ｋｂＰｓｔＩカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡ断片をＤＮＡブランティングキット（宝酒造株式会社製）により平滑末端処理を行った。

上記ＥｃｏＲＶ切断ｐＨＳＧ３９８−ＬＤＨＤＮＡ溶液と平滑末端処理１．２ｋｂＰｓｔＩカナマイシン耐性遺伝子ＤＮＡ溶液を混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させた。このライゲーション液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、カナマイシン５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

上記培地上での生育株を選定し常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素ＳａｌＩで切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９８約２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、ｌｄｈ遺伝子の中央にカナマイシン耐性遺伝子を含有する長さ約２．３ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
このプラスミドをｐＨＳＧ３９８−ＬＤＨ／Ｋｍとした。

（Ｃ）ｌｄｈ遺伝子破壊株の創製
プラスミドｐＨＳＧ３９８およびその派生物である上記（Ｂ）項で得られたプラスミドｐＨＳＧ３９８−ＬＤＨ／Ｋｍは、コリネバクテリウム属（コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株を含む）内で複製不可能なプラスミドである。プラスミドｐＨＳＧ３９８−ＬＤＨ／Ｋｍを、電気パルス法（Ｙ．Ｋｕｒｕｓｕ，ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：４４３−４４７．１９９０．およびＡ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８１−１８５．１９９３）の方法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株へ導入し、カナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地（１Ｌ［組成：尿素：２ｇ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４：７ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４：０．５ｇ，Ｋ_２ＨＰＯ_４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ_４・ｎＨ_２Ｏ：４．２ｍｇ，Ｄ−ビオチン：２００μｇ，塩酸チアミン：２００μｇ，酵母エキス：２ｇ，カザミノ酸：７ｇ，グルコース：２０ｇ，寒天：１６ｇを蒸留水に１０００ｍｌ溶解（ｐＨ６．６）］）に塗布した。

上記のカナマイシン５０μｇ／ｍｌを含むＡ寒天培地上で増殖した生育株は、プラスミドｐＨＳＧ３９８−ＬＤＨ／Ｋｍが染色体上の野生型ｌｄｈ遺伝子と１点相同性組換えを起こした場合、ベクターｐＨＳＧ３９８上のクロラムフェニコール耐性遺伝子の発現によるクロラムフェニコール耐性と、ｌｄｈ遺伝子中のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性を示すのに対して、２点相同性組換えを起こした場合は、ベクターｐＨＳＧ３９８上のクロラムフェニコール耐性遺伝子が脱落するためクロラムフェニコール感受性と、ｌｄｈ遺伝子中のカナマイシン耐性遺伝子の発現によるカナマイシン耐性を示す。従って、目的とするｌｄｈ遺伝子破壊株は、クロラムフェニコール感受性、カナマイシン耐性を示す。

クロラムフェニコール感受性、カナマイシン耐性を示した生育株を常法により液体培養し、培養液より染色体ＤＮＡを抽出し、以下に述べるゲノミックサザンハイブリダイゼーションにより染色体上のｌｄｈ遺伝子の破壊を確認した。染色体ＤＮＡを適当な制限酵素で分解した後、ナイロンフィルター（ＨｙｂｏｎｄＮ；アマシャム社製）にブロッティングし、上記（Ｂ）項で得たＬＤＨ遺伝子を含む１．１ｋｂＰＣＲ産物をプローブとして、ＤＩＧシステム（ベーリンガー社製）によりラベル化し、ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行った。野生株より抽出した染色体ＤＮＡを用いたゲノミックサザンハイブリダイゼーションのパターンと比較して、遺伝子破壊株のパターンは、上記（Ｂ）項に示した１．２ｋｂカナマイシン耐性遺伝子分長いバンドが検出され、染色体上のｌｄｈ遺伝子の破壊が確認できた。このようにして得られたｌｄｈ遺伝子破壊株をコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株と命名した。

尚、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株におけるｌｄｈ活性の消失は、以下の方法により確認した。
コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株を、Ａ培地１００ｍｌ（１Ｌ［組成：尿素：２ｇ，（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４：７ｇ，ＫＨ_２ＰＯ_４：０．５ｇ，Ｋ_２ＨＰＯ_４：０．５ｇ，ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：０．５ｇ，ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ：６ｍｇ，ＭｎＳＯ_４・ｎＨ_２Ｏ：４．２ｍｇ，Ｄ−ビオチン：２００μｇ，塩酸チアミン：２００μｇ，酵母エキス：２ｇ，カザミノ酸：７ｇ，グルコース：２０ｇおよび蒸留水：１０００ｍｌ（ｐＨ６．６）］）に、白金耳を用いて植菌後、対数増殖期後期まで３３℃で培養し、菌体を集めた。この菌体をトリス緩衝液（１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），２０ｍＭＫＣｌ，２０ｍＭＭｇＣｌ_２，５ｍＭＭｎＳＯ_４，０．１ｍＭＥＤＴＡ，２ｍＭＤＴＴ）にて１回洗浄した。この洗浄菌体０．５ｇを同緩衝液２ｍｌに懸濁し、氷冷下で超音波破砕機（ＡｓｔｒａｓｏｎｍｏｄｅｌＸＬ２０２０）を用いて菌体破砕物を得た。該破砕物を遠心分離（１０，０００ｘｇ，４℃，３０分）し、上清を粗酵素液として得た。対照として野性型コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の粗酵素液も同様に調製し、以下の活性測定に供した。ｌｄｈの活性測定は、ピルビン酸を基質とした乳酸生成に伴い、補酵素ＮＡＤＨがＮＡＤ^＋に酸化される量を、３４０ｎｍの吸光度変化として測定する方法（Ｂｕｎｃｈ，Ｐ．Ｋ．，Ｆ．Ｍａｔ−Ｊａｎ，Ｎ．Ｌｅｅ，ａｎｄＤ．Ｐ．Ｃｌａｒｋ．１９９７．ＴｈｅｌｄｈＡｇｅｎｅｅｎｃｏｄｉｎｇｔｈｅｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｖｅｌａｃｔａｔｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ１４３：１８７−１９５．）により行った。この結果、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株におけるｌｄｈ活性は検出されなかったことより、ｌｄｈ遺伝子の破壊を確認した。

〔実施例２〕コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株のＰＣ遺伝子高発現組換え株創製。
（Ａ）コリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１の構築
ブレビバクテリウムラクトファーメンタム（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）ＡＴＣＣ１３８６９に内在するプラスミドｐＡＭ３３０（Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，Ｒ．ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５０，２７７１−２７７８（１９８６）、特開昭５８−６７６７９号公報）のＯＲＦ１（ｒｅｐ）を含むＤＮＡ断片を以下のＰＣＲ法により増幅した。
ＰＣＲに際しては、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
ＯＲＦ１（ｒｅｐ）遺伝子増幅用プライマー
Ｒｅｐ−Ｎ；５’−ＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＡＣＡＡＣＡＡＧＡＣＣＣＡＴＣＡＴＡＧＴ−３’（配列番号３），
Ｒｅｐ−Ｃ；５’−ＣＴＣＴＧＴＴＡＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＴＣＡＴＧＴＣＧＴＧＣＴ−３’（配列番号４）
尚、いずれのプライマーもＨｐａＩサイトが末端に付加されている。
鋳型ＤＮＡは、プラスミドｐＡＭ３３０を用いた。
ＰＣＲは、〔実施例１〕（Ｂ）項と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、Ｒｅｐ遺伝子を含む、約１．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。

一方、コリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターを構築する際に、クロラムフェニコール耐性遺伝子を含む大腸菌ベクターｐＨＳＧ３９８（宝酒造製）のｌａｃＺα遺伝子とその内部のマルチクローニングサイトを保存するため、ＰＣＲにより新たにＥｃｏＲＶサイトを付加するように、ｐＨＳＧ３９８を増幅した。
ＰＣＲに際しては、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
プラスミドｐＨＳＧ３９８増幅用プライマー
３９８−Ｎ；５’−ＣＴＣＴＧＡＴＡＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＴＣＡＧＡＣＣ−３’（配列番号５），
３９８−Ｃ；５’−ＣＴＣＴＧＡＴＡＴＣＴＣＣＧＴＣＧＡＡＣＧＧＡＡＧＡＴＣＡＣ−３’（配列番号６）
尚、いずれのプライマーもＥｃｏＲＶサイトが末端に付加されている。
鋳型ＤＮＡは、プラスミドｐＨＳＧ３９８を用いた。
ＰＣＲは、〔実施例１〕（Ｂ）項と同様の条件で行った。

上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、プラスミドｐＨＳＧ３９８全長を含む、約２．２ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。
次に、ＨｐａＩで切断した上記Ｒｅｐ遺伝子を含む約１．８ｋｂのＤＮＡ断片５μｌとＥｃｏＲＶで切断したプラスミドｐＨＳＧ３９８全長を含む約２．２ｋｂのＤＮＡ断片を混合し、これに、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させ、結合させた。

得られたプラスミド混合液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造製）を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

この培地上の生育株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出、該プラスミドを制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９８２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、長さ約１．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
このコリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターをｐＣＲＢ１と記する。

（Ｂ）ＰＣ遺伝子のクローン化と組換え体の創製
〔実施例１〕（Ａ）項で調製した染色体ＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。
ＰＣＲに際しては、ＰＣ遺伝子をクローン化するべく、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の全ゲノム解析結果（野中寛、中田かおり、岡井直子、和田真利子、佐藤由美子、ＫｏｓＰｅｔｅｒ、乾将行、湯川英明「ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲゲノム解析」日本農芸化学会、２００３年４月、横浜、日本農芸化学会２００３年度大会講演要旨集、ｐ．２０参照）を基に、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
ＰＣ遺伝子増幅用プライマー
ＰＣ−Ｎ；５’−ＣＴＣＴＡＣＡＴＧＴＴＧＣＡＧＧＴＣＡＧＡＧＧＡＧＴＧＴ−３’（配列番号７），
ＰＣ−Ｃ；５’−ＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＡＧＧＡＡＴＣＧＴＧＴＧＣＡＴＧＧＴＣ−３’（配列番号８）
尚、前者はＮｓｐＩサイトが、後者はＳｐｈＩサイトがそれぞれ末端に付加されている。
鋳型ＤＮＡは、上記（Ａ）項にて抽出したコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株のゲノムＤＮＡを用いた。
ＰＣＲは、〔実施例１〕（Ｂ）項と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ＰＣ遺伝子の場合、約３．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。

次に、上記ＰＣ遺伝子を含む３．８ｋｂＰＣＲ産物１０μｌを制限酵素ＮｓｐＩとＳｐｈＩで切断したもの、および上記（Ａ）項で構築したコリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１２μｌを制限酵素ＳｐｈＩで切断したものをそれぞれ、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させた。このライゲーション液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇ、Ｘ−ｇａｌ（５−Ｂｒｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｘｙｌ−ｂｅｔａ−Ｄ−ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）２００ｍｇ、ＩＰＴＧ（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ１−ｔｈｉｏ−ｂｅｔａ−ｄ−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ）１００ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。

上記培地上で白色を呈する生育株を選定し常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＨＳＧ３９８約２．２ｋｂのＤＮＡ断片に加え、ＰＣ遺伝子を含有する長さ約３．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
該ＰＣ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＲＢ１−ＰＣと命名した。

次に、プラスミドｐＣＲＢ１−ＰＣを電気パルス法（Ｙ．Ｋｕｒｕｓｕ，ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：４４３−４４７．１９９０．およびＡ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８１−１８５．１９９３）の方法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株へ導入した。
組み換え菌体名；コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター受託番号；ＦＥＲＭＢＰ−１００６０

尚、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣのＰＣ活性は、ＰＣ活性測定法（Ｕｙ，Ｄ．，Ｓ．Ｄｅｌａｕｎａｙ，Ｊ．Ｅｎｇａｓｓｅｒ，ａｎｄＪ．Ｇｏｅｒｇｅｎ．１９９９．ＡｍｅｔｈｏｄｆｏｒｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆｐｙｒｕｖａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅａｃｔｉｖｉｔｙｄｕｒｉｎｇｔｈｅｇｌｕｔａｍｉｃａｃｉｄｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｗｉｔｈＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．ＪＭｉｃｒｏｂｉｏｌＭｅｔｈｏｄｓ３９：９１−９６）およびウエスタンブロット法（Ｐｅｔｅｒｓ−Ｗｅｎｄｉｓｃｈ，Ｐ．Ｇ．，Ｖ．Ｆ．Ｗｅｎｄｉｓｃｈ，Ｓ．Ｐａｕｌ，Ｂ．Ｊ．Ｅｉｋｍａｎｎｓ，ａｎｄＨ．Ｓａｈｍ．１９９７．ＰｙｒｕｖａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅａｓａｎａｎａｐｌｅｒｏｔｉｃｅｎｚｙｍｅｉｎＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１４３：１０９５−１１０３）により、野生株（コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株）に比べて約６倍の活性上昇が観察された。

〔実施例３〕組換え株の菌体培養＆コハク酸生成実験
（１）コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ株の好気的条件による培養：
（培養基の調製）；尿素２ｇ、硫安７ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．５ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ４．２ｍｇ、Ｂｉｏｔｉｎ（ビオチン）２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、酵母エキス２ｇ、カザミノ酸７ｇ、蒸留水１０００ｍｌからなる培地５００ｍｌを容量１Ｌフラスコに分注し、１２０℃で１０分間加熱滅菌後、室温に冷却した該フラスコを種培養基とした。同じく同組成の培地１０００ｍｌを２Ｌ容ガラス製ジャーファーメンターに入れ、１２０℃、１０分間加熱滅菌し、本培養基とした。
（培養）：上記種培養基１ケに、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣを無菌条件下にて接種し、３３℃にて１２時間好気的振盪培養を行い、種培養液とした。この種培養液５０ｍｌを上記ジャーファーメンターに接種し、通気量１ｖｖｍ（Ｖｏｌｕｍｅ／Ｖｏｌｕｍｅ／Ｍｉｎｕｔｅ）、温度３３℃で一昼夜、本培養を実施した。培養液を約３時間窒素ガス雰囲気下で静置した後、培養液２００ｍｌを遠心分離機にかけ（５０００回転、１５分）、上澄み液を除去した。このようにして得られたｗｅｔ菌体を、以下の反応に用いた。

（２）反応用反応培地溶液の調製：
硫安７ｇ、ＫＨ_２ＰＯ_４０．５ｇ、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．５ｇ、ＭｇＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ０．５ｇ、ＦｅＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ６ｍｇ、ＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ４．２ｍｇ、Ｂｉｏｔｉｎ（ビオチン）２００μｇ、塩酸チアミン２００μｇ、蒸留水１０００ｍｌからなる反応原液を調製し、１２０℃で１０分加熱後、減圧条件（〜３ｍｍＨｇ）にて２０分間、溶解している酸素の除去を行った。反応原液の還元状態の確認は減圧開始時に反応原液に加えた還元状態指示薬レサズリンの色調変化（青色から無色への変化）にて行った。この反応原液５００ｍｌを容量１Ｌの窒素雰囲気下のガラス製反応容器に導入した。この反応容器はｐＨ調整装置、温度維持装置、容器内反応液攪拌装置および還元電位測定装置を備えている。

（３）反応の実施：
前記培養後調製されたコリネ型細菌菌体を窒素ガス雰囲気下にある反応容器内の反応原液５００ｍｌに加えた。グルコース２００ｍＭ、炭酸ナトリウム２００ｍＭを加え、反応温度３３℃に維持し、有機化合物生成反応を行った。反応時の酸化還元電位は初期−２００ｍＶであったが反応開始後直ちに低下し、−４００ｍＶに維持して反応が継続された。３時間反応後、反応培地溶液の液体クロマトグラフィーによる分析をしたところ、コハク酸１６３ｍＭ（１９．２ｇ／Ｌ）、リンゴ酸５ｍＭ（０．６７ｇ／Ｌ）が生成していた。乳酸は検出されなかった。

〔比較例１〕ｌｄｈ遺伝子の破壊効果その１
実施例３で使用したコリネ型細菌をコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株（野生株）とコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／ｐＣＲＢ１−ＰＣ（野生株（コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株）にプラスミドｐＣＲＢ１−ＰＣを形質転換した株）に変えた以外は、実施例３と同様の方法、条件にて有機化合物生成反応を行った。尚、形質転換は、実施例２（Ｂ）項と同様の方法により行った。３時間反応後、反応培地溶液の液体クロマトグラフィーによる分析をしたところ、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株（野生株）は、コハク酸８１ｍＭ（９．６ｇ／Ｌ）、乳酸２００ｍＭ（１８．０ｇ／Ｌ）が生成しており、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ／ｐＣＲＢ１−ＰＣは、コハク酸８２ｍＭ（９．７ｇ／Ｌ）、乳酸２０２ｍＭ（１８．１ｇ／Ｌ）が生成していた。なお、いずれの株を用いた場合もリンゴ酸は検出されなかった。
すなわち、これらの実験結果は、野生株（コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株）においてＰＣ遺伝子を高発現させてもコハク酸生成量の増加は認められないこと、また、いずれも実施例３におけるコリネバクテリウムグルタミカム（コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ株と比べて１／２程度のコハク酸生産性であることから、ｌｄｈ破壊がコハク酸生産性の向上に対して非常に有効であることを示している。

〔比較例２〕ｌｄｈ遺伝子の破壊効果その２
使用する菌体株を実施例１（Ｃ）記載の方法で作製したコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株に替えること以外は、実施例３と同様の方法、条件にて有機化合物生成反応を行った。
３時間反応後、反応培地溶液の液体クロマトグラフィーによる分析をしたところ、コハク酸８０ｍＭ（９．４ｇ／Ｌ）が生成していた。尚、乳酸、リンゴ酸は検出されなかった。この結果より、ｌｄｈ遺伝子の破壊のみではコハク酸生産性の向上効果はないこと、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株においてＰＣ遺伝子を高発現させることにより始めてコハク酸の生産性が２倍程度増加し、本発明の効果が現れることが判る。

〔比較例３〕ｌｄｈ遺伝子破壊株へのＰＥＰＣ遺伝子高発現効果
実施例３で使用したコリネ型細菌をコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＥＰＣ株に変えた以外は、実施例３と同様の方法、条件にて有機化合物生成反応を行った。
尚、プラスミドｐＣＲＢ１−ＰＥＰＣの創製は、文献（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：１７４６−１７５２（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８：３３０−３３（１９８９）およびＧｅｎｅ，７７：２３７−２５１（１９８９））で公知のＰＥＰＣ遺伝子を特異的に増幅するプライマーを利用する以外は、実施例２の方法に従った。
即ち２種のプライマー
ＰＥＰＣ−Ｎ；５’−ＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号９）
ＰＥＰＣ−Ｃ；５’−ＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡ−３’（配列番号１０）
（いずれのプライマーも（下線部分に示すようにＳａｌＩサイトが末端に付加されている）および鋳型ＤＮＡとしてコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲにより増幅し、コリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１のＳａｌＩサイトに導入する方法によりプラスミドｐＣＲＢ１−ＰＥＰＣを創製した。

また、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株への形質転換は、実施例２の方法に従った。尚、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＥＰＣ株は、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株に比べて、文献（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７９：４９４２−４９４５（１９９７））の方法によりＰＥＰＣ活性を比較したところ、ＰＥＰＣ活性が４倍上昇していた。
３時間反応後、反応培地溶液の液体クロマトグラフィーによる分析をしたところ、コハク酸８３ｍＭ（９．８ｇ／Ｌ）が生成していた。尚、乳酸は検出されなかった。コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株においてＰＥＰＣ遺伝子高発現させてもコハク酸の生産性は向上しないことが判る。

〔実施例４〕付加的にＦＲＤ遺伝子を導入した効果
実施例３で使用したコリネ型細菌をコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤ株に替えた以外は、実施例３と同様の方法、条件にて有機化合物生成反応を行った。
プラスミドｐＣＲＢ１−ＰＥＰＣ−ＦＲＤとは、実施例２（Ｂ）項で構築したプラスミドｐＣＲＢ１−ＰＣに大腸菌由来のフマール酸レダクターゼ遺伝子（酵素名はＦＲＤ、遺伝子名はｆｒｄと略）を連結したものである。フマール酸レダクターゼは、トリカルボン酸回路に於けるフマール酸からコハク酸への変換を触媒する酵素である。
プラスミドｐＣＲＢ１−ＰＥＰＣ−ＦＲＤの創製方法は下記の方法で行なった。

大腸菌由来のｆｒｄ遺伝子のクローニングは、ＰＣＲにより増幅したが、ＰＣＲに際しては、ｆｒｄ遺伝子をクローン化するべく、エシェリチアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２株の全ゲノム解析結果（ＴｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７（５３３１），１４５３−１４７４（１９９７）参照）を基に、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
ｆｒｄ遺伝子増幅用プライマー
ｆｒｄ−Ｎ；５’−ＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＡＧ−３’（配列番号１１）
ｆｒｄ−Ｃ；５’−ＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＣＧＴＣＧ−３’（配列番号１２）
尚、いずれのプライマーもＳｐｈＩサイト末端に付加されている。
実施例１（Ａ）項と同様の方法によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２ＭＧ１６６５株より全ＤＮＡを調整し、鋳型ＤＮＡとして用いた。
ＰＣＲは、〔実施例１〕（Ｂ）項と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ｆｒｄ遺伝子の場合、約３．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。

次に、上記ｆｒｄ遺伝子を含む３．８ｋｂＰＣＲ産物１０μｌを制限酵素ＳｐｈＩで切断したもの、および上記実施例２（Ｂ）項で構築したプラスミドｐＣＲＢ１−ＰＣ２μｌを制限酵素ＳｐｈＩで切断したものをそれぞれ、７０℃で１０分処理することにより制限酵素を失活させた後、両者を混合し、これにＴ４ＤＮＡリガーゼ１０×緩衝液１μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ１ｕｎｉｔの各成分を添加し、滅菌蒸留水で１０μｌにして、１５℃で３時間反応させた。このライゲーション液を用い、塩化カルシウム法〔ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，５３，１５９（１９７０）〕によりエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造株式会社製）を形質転換し、クロラムフェニコール５０ｍｇを含む培地〔トリプトン１０ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、ＮａＣｌ５ｇおよび寒天１６ｇを蒸留水１Ｌに溶解〕に塗抹した。
上記培地上で生育する株を常法により液体培養し、培養液よりプラスミドＤＮＡを抽出し、制限酵素で切断し、挿入断片を確認した。この結果、プラスミドｐＣＲＢ１−ＰＣ約６．０ｋｂのＤＮＡ断片に加え、ｆｒｄ遺伝子を含有する長さ約３．８ｋｂの挿入ＤＮＡ断片が認められた。
該ＰＣ遺伝子を含むプラスミドをｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤ命名とした。

次に、プラスミドｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤを電気パルス法（Ｙ．Ｋｕｒｕｓｕ，ｅｔａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５４：４４３−４４７．１９９０．およびＡ．Ａ．Ｖｅｒｔｅｓ，ｅｔａｌ．，Ｒｅｓ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４４：１８１−１８５．１９９３）の方法に従って、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻株へ導入した。
この株をコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤ株とした。（本組換え菌株は、菌体名；Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤのもとに、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センターに受託番号：ＦＥＲＭＢＰ−１００６１で寄託されている）。
本菌株内におけるフマール酸からコハク酸に至る経路の酵素活性を、（ＥＬＥＮＡＭＡＫＬＡＳＨＩＮＡ，ｅｔａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１８０：５９８９−５９９６．１９９８）記載の方法により測定したところ、形質転換前の親株に比して本経路の酵素活性は３倍に上昇していた。

本コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤ株に用いて３時間反応後、反応培地溶液を液体クロマトグラフィーにより分析したところ、コハク酸１６８ｍＭ（１９．８ｇ／Ｌ）が生成していた。乳酸、リンゴ酸は検出されなかった。

このことから、コリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ株とコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤ株を比較すると、ｌｄｈ遺伝子破壊株内でＰＣ遺伝子を高発現した株に、さらに、大腸菌由来のｆｒｄ遺伝子を高発現させることにより、コハク酸の生成量が増大すると共に、高純度のジカルボン酸が採取でき、ジカルボン酸の分離、精製の上からも有用な技術であることが明らかである。

本発明によって製造されるジカルボン酸は高分子合成原料、医薬原料、化粧品用途そして食品添加剤用途など広い分野で使用される。例えば、コハク酸およびその誘導体は生分解性プラスチック原料や環境汚染をもたらさないクリーンな洗浄溶剤用途に使用される。

〔比較例３〕ｌｄｈ遺伝子破壊株へのＰＥＰＣ遺伝子高発現効果
実施例３で使用したコリネ型細菌をコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＥＰＣ株に変えた以外は、実施例３と同様の方法、条件にて有機化合物生成反応を行った。
尚、プラスミドｐＣＲＢ１−ＰＥＰＣの創製は、文献（Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５７：１７４６−１７５２（１９９１）、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．，２１８：３３０−３３９（１９８９）およびＧｅｎｅ，７７：２３７−２５１（１９８９））で公知のＰＥＰＣ遺伝子を特異的に増幅するプライマーを利用する以外は、実施例２の方法に従った。
即ち２種のプライマー
ＰＥＰＣ−Ｎ；５’−ＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＡＧＣＡＣＡＧＣＣＴＴＡＡＡＧＣＡ−３’（配列番号９）
ＰＥＰＣ−Ｃ；５’−ＣＴＣＴＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＧＣＡＧＣＡＡＧＡＣＧＡＡＡ−３’（配列番号１０）
（いずれのプライマーも（下線部分に示すようにＳａｌＩサイトが末端に付加されている）および鋳型ＤＮＡとしてコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒ株の染色体ＤＮＡを用いたＰＣＲにより増幅し、コリネ型細菌−大腸菌シャトルベクターｐＣＲＢ１のＳａｌＩサイトに導入する方法によりプラスミドｐＣＲＢ１−ＰＥＰＣを創製した。

〔実施例４〕付加的にＦＲＤ遺伝子を導入した効果
実施例３で使用したコリネ型細菌をコリネバクテリウムグルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）Ｒｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤ株に替えた以外は、実施例３と同様の方法、条件にて有機化合物生成反応を行った。
プラスミドｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤとは、実施例２（Ｂ）項で構築したプラスミドｐＣＲＢ１−ＰＣに大腸菌由来のフマール酸レダクターゼ遺伝子（酵素名はＦＲＤ、遺伝子名はｆｒｄと略）を連結したものである。フマール酸レダクターゼは、トリカルボン酸回路に於けるフマール酸からコハク酸への変換を触媒する酵素である。
プラスミドｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤの創製方法は下記の方法で行なった。

大腸菌由来のｆｒｄ遺伝子のクローニングは、ＰＣＲにより増幅したが、ＰＣＲに際しては、ｆｒｄ遺伝子をクローン化するべく、エシェリチアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）Ｋ−１２株の全ゲノム解析結果（ＴｈｅｃｏｍｐｌｅｔｅｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７７（５３３１），１４５３−１４７４（１９９７）参照）を基に、下記の１対のプライマーを、アプライド・バイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）社製「３９４ＤＮＡ／ＲＮＡシンセサイザー（ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）」を用いて合成し、使用した。
ｆｒｄ遺伝子増幅用プライマー
ｆｒｄ−Ｎ；５’−ＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＧＧＡＴＧＣＣＧＴＴＴＣＧＣＴＣＡＴＡＧ−３’（配列番号１１）
ｆｒｄ−Ｃ；５’−ＣＴＣＴＧＣＡＴＧＣＴＡＡＴＡＡＧＧＣＧＣＡＧＡＧＣＧＴＣＧ−３’ （配列番号１２）
尚、いずれのプライマーもＳｐｈＩサイトが末端に付加されている。
実施例１（Ａ）項と同様の方法によりＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉＫ−１２ＭＧ１６６５株より全ＤＮＡを調整し、鋳型ＤＮＡとして用いた。
ＰＣＲは、〔実施例１〕（Ｂ）項と同様の条件で行った。
上記で生成した反応液１０μｌを０．８％アガロースゲルにより電気泳動を行い、ｆｒｄ遺伝子の場合、約３．８ｋｂのＤＮＡ断片が検出できた。

Claims

乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子が破壊され、かつ、ピルビン酸カルボキシラーゼ遺伝子が高発現すべく組換えられた好気性コリネ型細菌形質転換体であって、
好気性コリネ型細菌がコリネバクテリウム属菌、ブレビバクテリウム属菌、アースロバクター属菌、マイコバクテリウム属菌およびマイクロコッカス属菌の群から選択されるいずれか１種であることを特徴とする好気性コリネ型細菌形質転換体。
コリネバクテリウム属菌が、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲ、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０３２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０５８、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０５９、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３０６０、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３２３２、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３２８６、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３２８７、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３６５５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３７４５、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３７４６、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１３７６１、ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ１４０２０およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＡＴＣＣ３１８３１から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
ブレビバクテリウム属菌が、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｌａｃｔｏｆｅｒｍｅｎｔｕｍＡＴＣＣ１３８６９、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＭＪ−２３３、ＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＭＪ−２３３ＡＢ−４１およびＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍｆｌａｖｕｍＢｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓＡＴＣＣ６８７２から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
アースロバクター属菌が、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ８０１０、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ４３３６、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ２１０５６、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ３１２５０、ＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ３１７３８およびＡｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓＡＴＣＣ３５６９８から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
マイコバクテリウム属菌が、ＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓＡＴＣＣ１９２１０またはＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓＡＴＣＣ２７２８９であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
マイクロコッカス属菌が、ＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉＮｏ．２３９、ＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｌｕｔｅｕｓＮｏ．２４０、ＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｕｒｅａｅＩＡＭ１０１０およびＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓｒｏｓｅｕｓＩＦＯ３７６４から選択されるいずれかの菌であることを特徴とする請求の範囲第１項に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
コリネバクテリウム属菌がＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲであることを特徴とする請求の範囲第２項に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の破壊が、相同性組換え法、トランスポゾン挿入法および変異原導入法から選ばれる方法により該遺伝子が分断もしくは該遺伝子の一部または全域が除去され、該酵素活性発現機能が喪失していることを特徴とする請求の範囲第１項〜第７項のいずれかに記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
ＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣまたはＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍｇｌｕｔａｍｉｃｕｍＲｌｄｈ⁻／ｐＣＲＢ１−ＰＣ−ＦＲＤであることを特徴とする請求の範囲第１項、第２項、第７項および第８項のいずれかに記載の好気性コリネ型細菌形質転換体。
炭酸イオン若しくは重炭酸イオンまたは二酸化炭素ガスを含有する還元状態下の反応液中で細菌と糖類とを反応させ反応液中に生成するジカルボン酸を採取する方法において、細菌が請求の範囲第１項に記載の好気性コリネ型細菌形質転換体であることを特徴とするジカルボン酸の製造方法。
還元状態下の反応液の酸化還元電位が−２００ミリボルト乃至−５００ミリボルトであることを特徴とする請求の範囲第１０項に記載のジカルボン酸の製造方法。
ジカルボン酸がコハク酸、フマール酸およびリンゴ酸から選ばれることを特徴とする請求の範囲第１０項または第１１項に記載のジカルボン酸の製造方法。