CN112522223A - 一种用于l-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于L‑肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用，基因工程菌是以大肠杆菌为宿主，通过在其基因组上整合单拷贝亚胺还原酶基因dpkA；单拷贝柠檬酸合酶基因gltA；敲除乙醛酸循环抑制基因iclR；敲除苹果酸合酶基因aceB；单拷贝异柠檬酸裂解酶基因aceA；单拷贝膜结合转氢酶基因pntAB；敲除2‑酮酸还原酶基因ycdW；单拷贝磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc；敲除丙酮酸激酶基因pykF获得。通过系统代谢改造后，工程菌能够以葡萄糖和甲胺为主要原料合成L‑肌氨酸。在5L发酵罐发酵30h后L‑肌氨酸的产量可达10g/L。

Description

一种用于L-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，尤其是一种用于L-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用。
背景技术
L-肌氨酸（N-甲基-L-甘氨酸）是一种N-甲基化氨基酸，其钠盐肌氨酸钠经常被用作一些重要的产品合成前体。L-肌氨酸是一种重要的氨基酸产品，肌氨酸对大脑以及肌肉的损伤修复具有比较可观的作用，同时L-肌氨酸可以为机体提供速效能量，从而起到缓解机体疲劳的功效。肌氨酸钠及其下游产品基本上毒性很低，且在自然界中都易降解，对环境较友好。因此L-肌氨酸在养殖、食品、保健以及医学等领域存在广泛的应用前景。
现有的L-肌氨酸生产主要是由肌氨酸钠酸化而来的，肌氨酸钠制备途径主要为化学合成法（CN201310676025.9、CN200610155348.3），存在反应条件苛刻和产物分离困难的缺点。
亚胺还原酶DpkA（imine reductases，IRED）是一种能够在环状和脂肪族化合物中主动还原亚胺键的酶，可以将哌啶-2-羧酸还原为L-哌啶酸，该反应需要NADPH提供还原力。研究表明亚胺还原酶DpkA也能催化乙醛酸和甲胺合成L-肌氨酸，Melanie Mindt等人在谷氨酸棒杆菌表达了Pseudomonas putida ATCC12633来源的亚胺还原酶编码基因dpkA （Bioresource Technology,2019:281,135-142），该重组菌能够以木糖和乙酸为碳源，经126 h流加甲胺发酵合成8.7g/L的L-肌氨酸。
与谷氨酸棒杆菌相比，大肠杆菌具有培养条件简单、生产周期短以及发酵成本低廉等优势，具有更加良好的工业应用价值。为了获得更加高产的L-肌氨酸发酵生产菌株，本专利使用了一种新型高效的亚胺还原酶，该酶来源于Brevibacterium linens ATCC9172，具有较高的催化L-肌氨酸合成的活力。同时采用新的代谢工程改造策略，构建出一株以葡萄糖为碳源，高产L-肌氨酸的大肠杆菌基因工程菌。
通过检测，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种用于L-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种新型高效的亚胺还原酶，所述亚胺还原酶来源于Brevibacterium linensATCC9172，其编码基因dpkA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
一株无质粒、以廉价碳源为底物高效合成L-肌氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌为大肠杆菌Escherichia coli SAR，该大肠杆菌Escherichia coli SAR是以大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325为宿主，通过以下改造获得：在其基因组上整合单拷贝的亚胺还原酶基因dpkA，该基因由T7启动子控制；单拷贝柠檬酸合酶基因gltA，该基因由trc启动子控制；敲除乙醛酸循环抑制基因iclR；敲除苹果酸合酶基因aceB；单拷贝异柠檬酸裂解酶基因aceA，该基因由trc启动子控制；单拷贝膜结合转氢酶基因pntAB，该基因由trc启动子控制；敲除2-酮酸还原酶基因ycdW；单拷贝磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc，该基因由trc启动子控制；敲除丙酮酸激酶基因pykF。
而且，所述亚胺还原酶基因dpkA来源于Brevibacterium linens ATCC 9172，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
而且，所述柠檬酸合酶基因gltA来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC 27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
而且，所述异柠檬酸裂解酶基因aceA来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
而且，所述膜结合转氢酶基因pntAB来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
而且，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
如上所述的无质粒、以廉价碳源为底物高效合成L-肌氨酸的基因工程菌的构建方法，所述方法采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对大肠杆菌进行定向改造，具体包括如下步骤：
Figure 974969DEST_PATH_IMAGE001
为了引入L-肌氨酸的合成代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上的mbhA位点单拷贝来源于Brevibacterium linens ATCC 9172的亚胺还原酶基因dpkA，其序列为SEQ ID NO.1，该基因经过密码子优化并且由T7启动子控制；
Figure 838014DEST_PATH_IMAGE002
为了增强草酰乙酸到柠檬酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上ylbE位点单拷贝内源的柠檬酸合酶基因gltA，其序列为SEQ ID NO .2，该基因由trc启动子控制；
Figure 642022DEST_PATH_IMAGE003
为了菌株在正常培养条件下开启乙醛酸循环，对大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上iclR位点进行基因敲除；
Figure 839785DEST_PATH_IMAGE004
为了阻断乙醛酸到苹果酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上aceB位点进行基因敲除；
Figure 387441DEST_PATH_IMAGE005
为了增强异柠檬酸到乙醛酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上yeeP位点单拷贝内源的异柠檬酸裂解酶基因aceA，其序列为SEQ ID NO .3，该基因由trc启动子控制；
Figure 603527DEST_PATH_IMAGE006
为了增强NADH到NADPH的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上yghE位点单拷贝内源的膜结合转氢酶基因pntAB，其序列为SEQ ID NO .4，该基因由trc启动子控制；
Figure 109595DEST_PATH_IMAGE007
为了阻断乙醛酸到乙醇酸的代谢，对大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上ycdW位点进行基因敲除；
Figure 529075DEST_PATH_IMAGE008
为了增强磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上yeeL位点单拷贝内源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc，其序列为SEQID NO .5，该基因由trc启动子控制；
Figure 146001DEST_PATH_IMAGE009
为了减少磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸的代谢，对大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上pykF位点进行基因敲除；
其中，步骤
Figure 183971DEST_PATH_IMAGE001
至
Figure 595361DEST_PATH_IMAGE009
的构建顺序不分先后，根据需求进行调整即可。
如上所述的无质粒、以廉价碳源为底物高效合成L-肌氨酸的基因工程菌在L-肌氨酸生产方面中的应用。
利用如上所述的基因工程菌发酵生产L-肌氨酸的方法，具体步骤如下：
发酵培养：将基因工程菌的种子液按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2，温度维持在36.5-37.5℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加700-800g/L的葡萄糖溶液继续培养，并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜3g/L，当OD600＝40时，开始以20-25mL/h的流速流加1.5-1.6mol/L的甲胺盐酸盐溶液，流加量为75mL/L培养基，发酵周期28-32h，即得L-肌氨酸；
发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠3-5g/L，KH2PO41-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明使用了一种新型高效的亚胺还原酶，该酶来源于Brevibacterium linens ATCC9172，具有较高的催化L-肌氨酸合成的活力。
2、大肠杆菌自身没有L-肌氨酸合成代谢途径。为了得到能够直接发酵生产L-肌氨酸的菌株，本发明将Brevibacterium linens ATCC9172来源的亚胺还原酶基因整合到野生型大肠杆菌的基因组上，使得碳代谢流向L-肌氨酸的合成。此外本发明使用T7启动子调控亚胺还原酶基因的表达以达到增强基因表达的效果。
3、为了增加L-肌氨酸合成前体物乙醛酸的积累，本发明将乙醛酸循环抑制基因、苹果酸合酶基因以及2-酮酸还原酶基因进行了敲除，并引入了大肠杆菌内源的柠檬酸合酶基因和异柠檬酸裂解酶基因，大幅度提高了丙酮酸向前体物乙醛酸的代谢流量。
4、为了增加反应所需的NADPH的供给，本发明引入大肠杆菌内源的膜结合转氢酶基因，使得胞内更多的NADH能够转变为NADPH，为L-肌氨酸合成提供更多所需的还原力。
5、通过系统代谢改造策略，本发明在国内外首次实现了构建大肠杆菌基因工程菌以葡萄糖和甲胺为主要原料合成L-肌氨酸，5L发酵罐发酵30h后L-肌氨酸的产量可达10 g/L，为目前报道的最高值，具有很好的工业应用前景。
6、本发明提供一株无质粒、以葡萄糖等廉价碳源为底物高效合成L-肌氨酸的基因工程菌，是以大肠杆菌为宿主，通过在其基因组上整合单拷贝亚胺还原酶基因dpkA；单拷贝柠檬酸合酶基因gltA；敲除乙醛酸循环抑制基因iclR；敲除苹果酸合酶基因aceB；单拷贝异柠檬酸裂解酶基因aceA；单拷贝膜结合转氢酶基因pntAB；敲除2-酮酸还原酶基因ycdW；单拷贝磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc；敲除丙酮酸激酶基因pykF获得。通过系统代谢改造后，工程菌能够以葡萄糖和甲胺为主要原料合成L-肌氨酸。在5L发酵罐发酵30h后L-肌氨酸的产量可达10g/L。
附图说明
图1为本发明中mbhA::PT7-dpkA整合电泳图；其中，M—1kb Maker；1-上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；
图2为本发明中 ylbE::Ptrc- gltA整合电泳图；其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；
图3为本发明中 iclR敲除电泳图；其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—目的菌PCR片段；
图4为本发明中 aceB敲除电泳图；其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—目的菌PCR片段；
图5为本发明中 yeeP::Ptrc-aceA整合电泳图；其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；
图6为本发明中 yghE::Ptrc-pntAB整合电泳图；其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；
图7为本发明中 ycdW敲除电泳图；其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—目的菌PCR片段；
图8 为本发明中yeeL::Ptrc-ppc整合电泳图；其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—目的基因；3—下游同源臂；4—重叠片段；5—原菌PCR片段；6—目的菌PCR片段；
图9为本发明中 pykF敲除电泳图；其中，M—1kb Maker；1—上游同源臂；2—下游同源臂；3—重叠片段；4—原菌PCR片段；5—目的菌PCR片段；
图10为本发明中实施例2发酵过程图；
图11本发明中在大肠杆菌中构建的L-肌氨酸合成代谢途径。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种新型高效的亚胺还原酶，所述亚胺还原酶来源于Brevibacterium linensATCC9172，其编码基因dpkA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
一株无质粒、以廉价碳源为底物高效合成L-肌氨酸的基因工程菌，所述基因工程菌为大肠杆菌Escherichia coli SAR，该大肠杆菌Escherichia coli SAR是以大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325为宿主，通过以下改造获得：在其基因组上整合单拷贝的亚胺还原酶基因dpkA，该基因由T7启动子控制；单拷贝柠檬酸合酶基因gltA，该基因由trc启动子控制；敲除乙醛酸循环抑制基因iclR；敲除苹果酸合酶基因aceB；单拷贝异柠檬酸裂解酶基因aceA，该基因由trc启动子控制；单拷贝膜结合转氢酶基因pntAB，该基因由trc启动子控制；敲除2-酮酸还原酶基因ycdW；单拷贝磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc，该基因由trc启动子控制；敲除丙酮酸激酶基因pykF。
较优地，所述亚胺还原酶基因dpkA来源于Brevibacterium linens ATCC 9172，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
较优地，所述柠檬酸合酶基因gltA来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
较优地，所述异柠檬酸裂解酶基因aceA来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
较优地，所述膜结合转氢酶基因pntAB来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
较优地，所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.5。
如上所述的无质粒、以廉价碳源为底物高效合成L-肌氨酸的基因工程菌的构建方法，所述方法采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对大肠杆菌进行定向改造，具体包括如下步骤：
Figure 767716DEST_PATH_IMAGE001
为了引入L-肌氨酸的合成代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上的mbhA位点单拷贝来源于Brevibacterium linens ATCC 9172的亚胺还原酶基因dpkA，其序列为SEQ ID NO.1，该基因经过密码子优化并且由T7启动子控制；
Figure 922754DEST_PATH_IMAGE002
为了增强草酰乙酸到柠檬酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上ylbE位点单拷贝内源的柠檬酸合酶基因gltA，其序列为SEQ ID NO .2，该基因由trc启动子控制；
Figure 864165DEST_PATH_IMAGE003
为了菌株在正常培养条件下开启乙醛酸循环，对大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上iclR位点进行基因敲除；
Figure 712036DEST_PATH_IMAGE004
为了阻断乙醛酸到苹果酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上aceB位点进行基因敲除；
Figure 89796DEST_PATH_IMAGE005
为了增强异柠檬酸到乙醛酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上yeeP位点单拷贝内源的异柠檬酸裂解酶基因aceA，其序列为SEQ ID NO .3，该基因由trc启动子控制；
Figure 782946DEST_PATH_IMAGE006
为了增强NADH到NADPH的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上yghE位点单拷贝内源的膜结合转氢酶基因pntAB，其序列为SEQ ID NO .4，该基因由trc启动子控制；
Figure 578863DEST_PATH_IMAGE007
为了阻断乙醛酸到乙醇酸的代谢，对大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上ycdW位点进行基因敲除；
Figure 332056DEST_PATH_IMAGE008
为了增强磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上yeeL位点单拷贝内源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc，其序列为SEQID NO .5，该基因由trc启动子控制；
Figure 229736DEST_PATH_IMAGE009
为了减少磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸的代谢，对大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上pykF位点进行基因敲除；
其中，步骤
Figure 726576DEST_PATH_IMAGE001
至
Figure 642579DEST_PATH_IMAGE009
的构建顺序不分先后，根据需求进行调整即可。可以如图11所示。
如上所述的无质粒、以廉价碳源为底物高效合成L-肌氨酸的基因工程菌在L-肌氨酸生产方面中的应用。
利用如上所述的基因工程菌发酵生产L-肌氨酸的方法，具体步骤如下：
发酵培养：将基因工程菌的种子液按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2，温度维持在36.5-37.5℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加700-800g/L的葡萄糖溶液继续培养，并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜3g/L，当OD600＝40时，开始以20-25mL/h的流速流加1.5-1.6mol/L的甲胺盐酸盐溶液，流加量为75mL/L培养基，发酵周期28-32h，即得L-肌氨酸；
发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠3-5g/L，KH2PO41-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
具体地，相关制备及检测实施例如下：
实施例1：基因工程菌株大肠杆菌Escherichia coli SAR的构建：
1基因编辑的方法
本发明中采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑方法参照文献(MetabolicEngineering ,2015,31:13-21.)进行，该方法所用的两个质粒分别为pGRB与pREDCas9。其中pREDCas9携带gRNA质粒消除系统，λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB质粒，以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。
2菌株构建的具体过程
2.1将PT7-dpkA（含有dpkA基因和T7启动子的片段）整合在假基因mbhA位点处
以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其mbhA基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-mbhA-S(SEQ ID NO.6)、UP-mbhA-A(SEQ ID NO.7)和下游同源臂引物DN-mbhA-S(SEQ ID NO.8)、DN-mbhA-A(SEQ ID NO.9)，并PCR扩增其上、下游同源臂片段；根据dpkA基因设计引物dpkA-S(SEQ ID NO.10)、dpkA-A(SEQ ID NO.11)，并扩增dpkA基因片段(SEQ IDNO.1)。启动子PT7则设计在上游同源臂的下游引物和dpkA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得dpkA基因的整合片段(mbhA基因上游同源臂-PT7-dpkA-mbhA-基因下游同源臂)，构建pGRB-mbhA使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-mbhA-S(SEQ ID NO.12)和gRNA-mbhA-A(SEQ ID NO.13)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-mbhA。将整合片段和pGRB-mbhA电转化至含有pREDCas9的E.coli ATCC27325感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-mbhA，最终获得菌株E.coli SAR1。
PT7-dpkA片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图1。其中上游同源臂长度为682bp，dpkA基因片段长度为1006bp，下游同源臂长度为720bp，重叠片段的长度为2457bp，PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度应为2457bp，原菌扩增出来的片段长度应为1837bp。
2.2将Ptrc-gltA(含有gltA基因和trc启动子的片段)整合在假基因位点ylbE处
以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其ylbE基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-ylbE-S(SEQ ID NO.14)、UP-ylbE-A(SEQ ID NO.15)和下游同源臂引物DN-ylbE-S(SEQ ID NO.16)、DN-ylbE-A(SEQ ID NO.17)，并扩增ylbE基因的上、下游同源臂；根据gltA基因设计引物gltA-S(SEQ ID NO.18)、gltA-A(SEQ ID NO.19)，并扩增gltA基因片段(SEQ ID NO.2)。启动子Ptrc则设计在ylbE基因上游同源臂的下游引物和gltA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得gltA基因的整合片段(ylbE基因上游同源臂-Ptrc-gltA-ylbE基因下游同源臂)，构建pGRB-ylbE使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-ylbE-S(SEQ ID NO.20)和gRNA-ylbE-A(SEQ ID NO.21)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ylbE。将整合片段和pGRB-ylbE电转化至含有pREDCas9载体的E.coli SAR1感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ylbE及pREDCas9，最终获得菌株E.coli SAR2。
Ptrc-gltA整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图2。其中，上游同源臂的长度应为601bp，gltA基因片段长度应为1407bp，下游同源臂的长度应为547bp，整合片段的总长应为2474bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2474bp，原菌PCR扩增片段长度应为2184bp。
2.3将iclR基因敲除
以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其iclR基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-iclR-S(SEQ ID NO.22)、UP-iclR-A(SEQ ID NO.23)和下游同源臂引物DN-iclR-S(SEQ ID NO.24)、DN-iclR-A(SEQ ID NO.25)，并扩增iclR基因的上、下游同源臂；上述片段通过重叠PCR的方法获得iclR基因敲除的片段(iclR基因上游同源臂-iclR基因下游同源臂)，构建pGRB-iclR使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-iclR-S(SEQ ID NO.26)和gRNA-iclR-A(SEQ ID NO.27)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-iclR。将整合片段和pGRB-iclR电转化至含有pREDCas9载体的E.coli SAR2感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-iclR及pREDCas9，最终获得菌株E.coli SAR3。
iclR基因敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图3。其中，上游同源臂的长度应为595bp，下游同源臂的长度应为532bp，基因敲除片段的总长应为1086bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1086bp，原菌PCR扩增片段长度应为1745bp。
2.4将aceB基因敲除
以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其aceB基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-aceB-S(SEQ ID NO.28)、UP-aceB-A(SEQ ID NO.29)和下游同源臂引物DN-aceB-S(SEQ ID NO.30)、DN-aceB-A(SEQ ID NO.31)，并扩增aceB基因的上、下游同源臂；上述片段通过重叠PCR的方法获得aceB基因敲除的片段(aceB基因上游同源臂-aceB基因下游同源臂)，构建pGRB-aceB使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-aceB-S(SEQ ID NO.32)和gRNA-aceB-A(SEQ ID NO.33)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-aceB。将整合片段和pGRB-aceB电转化至含有pREDCas9载体的E.coli SAR3感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-aceB及pREDCas9，最终获得菌株E.coli SAR4。
aceB基因敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图4。其中，上游同源臂的长度应为538bp，下游同源臂的长度应为586bp，基因敲除片段的总长应为1082bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1082bp，原菌PCR扩增片段长度应为2397bp。
2.5将Ptrc-aceA(含有aceA基因和trc启动子的片段)整合在假基因位点yeeP处
以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其yeeP基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-yeeP-S(SEQ ID NO.34)、UP-yeeP-A(SEQ ID NO.35)和下游同源臂引物DN-yeeP-S(SEQ ID NO.36)、DN-yeeP-A(SEQ ID NO.37)，并扩增yeeP基因的上、下游同源臂；根据aceA基因设计引物aceA-S(SEQ ID NO.38)、aceA-A(SEQ ID NO.39)，并扩增aceA基因片段(SEQ ID NO.3)。启动子Ptrc则设计在yeeP基因上游同源臂的下游引物和aceA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得aceA基因的整合片段(yeeP基因上游同源臂-Ptrc-aceA-yeeP基因下游同源臂)，构建pGRB-yeeP使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yeeP-S(SEQ ID NO.40)和gRNA-yeeP-A(SEQ ID NO.41)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yeeP。将整合片段和pGRB-yeeP电转化至含有pREDCas9载体的E.coli SAR4感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yeeP及pREDCas9，最终获得菌株E.coli SAR5。
Ptrc-aceA整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图5。其中，上游同源臂的长度应为568bp，aceA基因片段长度应为1428bp，下游同源臂的长度应为576bp，整合片段的总长应为2491bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2491bp，原菌PCR扩增片段长度应为1396bp。
2.6将Ptrc-pntAB(含有pntAB基因和trc启动子的片段)整合在假基因位点yghE处
以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其yghE基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-yghE-S(SEQ ID NO.42)、UP-yghE-A(SEQ ID NO.43)和下游同源臂引物DN-yghE-S(SEQ ID NO.44)、DN-yghE-A(SEQ ID NO.45)，并扩增yghE基因的上、下游同源臂；根据pntAB基因设计引物pntAB-S(SEQ ID NO.46)、pntAB-A(SEQ ID NO.47)，并扩增pntAB基因片段(SEQ ID NO.4)。启动子Ptrc则设计在yghE基因上游同源臂的下游引物和pntAB基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得pntAB基因的整合片段(yghE基因上游同源臂-Ptrc-pntAB-yghE基因下游同源臂)，构建pGRB-yghE使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yghE-S(SEQ ID NO.48)和gRNA-yghE-A(SEQ ID NO.49)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yghE。将整合片段和pGRB-yghE电转化至含有pREDCas9载体的E.coli SAR5感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yghE及pREDCas9，最终获得菌株E.coli SAR6。
Ptrc-pntAB整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图6。其中，上游同源臂的长度应为559bp，pntAB基因片段长度应为3050bp，下游同源臂的长度应为549bp，整合片段的总长应为4087bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为4087bp，原菌PCR扩增片段长度应为1547bp。
2.7将ycdW基因敲除
以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其ycdW基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-ycdW-S(SEQ ID NO.50)、UP-ycdW-A(SEQ ID NO.51)和下游同源臂引物DN-ycdW-S(SEQ ID NO.52)、DN-ycdW-A(SEQ ID NO.53)，并扩增ycdW基因的上、下游同源臂；上述片段通过重叠PCR的方法获得ycdW基因敲除的片段(ycdW基因上游同源臂-ycdW基因下游同源臂)，构建pGRB-ycdW使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-ycdW-S(SEQ ID NO.54)和gRNA-ycdW-A(SEQ ID NO.55)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-ycdW。将整合片段和pGRB-ycdW电转化至含有pREDCas9载体的E.coli SAR6感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-ycdW及pREDCas9，最终获得菌株E.coli SAR7。
ycdW基因敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图7。其中，上游同源臂的长度应为642bp，下游同源臂的长度应为1428bp，基因敲除片段的总长应为2024bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为2024bp，原菌PCR扩增片段长度应为2604bp。
2.8将Ptrc-ppc(含有ppc基因和trc启动子的片段)整合在假基因位点yeeL处
以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其yeeL基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-yeeL-S(SEQ ID NO.56)、UP-yeeL-A(SEQ ID NO.57)和下游同源臂引物DN-yeeL-S(SEQ ID NO.58)、DN-yeeL-A(SEQ ID NO.59)，并扩增yeeL基因的上、下游同源臂；根据ppc基因设计引物ppc-S(SEQ ID NO.60)、ppc-A(SEQ ID NO.61)，并扩增ppc基因片段(SEQ ID NO.5)。启动子Ptrc则设计在yeeL基因上游同源臂的下游引物和ppc基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得ppc基因的整合片段(yeeL基因上游同源臂-Ptrc-ppc-yeeL基因下游同源臂)，构建pGRB-yeeL使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yeeL-S(SEQ ID NO.62)和gRNA-yeeL-A(SEQ ID NO.63)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-yeeL。将整合片段和pGRB-yeeL电转化至含有pREDCas9载体的E.coli SAR7感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-yeeL及pREDCas9，最终获得菌株E.coli SAR8。
Ptrc-ppc整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图8。其中，上游同源臂的长度应为533bp，ppc基因片段长度应为2770bp，下游同源臂的长度应为581bp，整合片段的总长应为3813bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为3813bp，原菌PCR扩增片段长度应为1613bp。
2.9将pykF基因敲除
以E.coli ATCC27325基因组为模板，根据其pykF基因的上、下游序列设计上游同源臂引物UP-pykF-S(SEQ ID NO.64)、UP-pykF-A(SEQ ID NO.65)和下游同源臂引物DN-pykF-S(SEQ ID NO.66)、DN-pykF-A(SEQ ID NO.67)，并扩增pykF基因的上、下游同源臂；上述片段通过重叠PCR的方法获得pykF基因敲除的片段(pykF基因上游同源臂-pykF基因下游同源臂)，构建pGRB-pykF使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-pykF-S(SEQ ID NO.68)和gRNA-pykF-A(SEQ ID NO.69)的退火制得，与线性化的pGRB载体重组后获得重组的pGRB-pykF。将整合片段和pGRB-pykF电转化至含有pREDCas9载体的E.coli SAR8感受态细胞中，将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养后利用PCR验证阳性重组子，再消除用于基因编辑的pGRB-pykF及pREDCas9，最终获得菌株E.coli SAR。
pykF基因敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见图9。其中，上游同源臂的长度应为471bp，下游同源臂的长度应为429bp，基因敲除片段的总长应为856bp。PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为856bp，原菌PCR扩增片段长度应为2180bp。
3 .菌株构建过程中用到的引物
菌株构建过程中所涉及的所有引物见下表：
SEQ ID NO. 引物 序列（5’-3’）
6 UP-<i>mbhA</i>-S GCCAGCACGAACATAATCCC
7 UP-<i>mbhA</i>-A TAAAGTTAAACAAAATTATTTCTAGACCCTATAGTGAGTCGTATTACACGGTGGCAGGTTTTGG
8 DN-<i>mbhA</i>-S TGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGGACCAAAAGTGCGTCCGATAC
9 DN-<i>mbhA</i>-A CGGCGTAATCACAAACTGGC
10 <i>dpkA</i>-S TAGGGTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCATGACGAACGAACCGGACC
11 <i>dpkA</i>-A AGACCCGTTTAGAGGCCCCAAGGGGTTATGCTAGTTATTCGAACAGACTGCGGATG
12 gRNA-<i>mbhA</i>-S AGTCCTAGGTATAATACTAGTTACCGGGCATACCGATGCGAGTTTTAGAGCTAGAA
13 gRNA-<i>mbhA</i>-A TTCTAGCTCTAAAACTCGCATCGGTATGCCCGGTAACTAGTATTATACCTAGGACT
14 UP-<i>ylbE</i>-S ACCCAACCTTACGCAACCAG
15 UP-<i>ylbE</i>-A AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAATTGTTCGATAACCGCAGCAT
16 DN-<i>ylbE</i>-S AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATCGCTGGCGTGCTTTGAA
17 DN-<i>ylbE</i>-A GGCGTAACTCAGCAGGCAG
18 <i>gltA</i>-S TCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGGCTGATACAAAAGCAAAACTC
19 <i>gltA</i>-A CACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAACGCTTGATATCGCTTTTAAAG
20 gRNA-<i>ylbE</i>-S AGTCCTAGGTATAATACTAGTACACTGGCTGGATGTGCAACGTTTTAGAGCTAGAA
21 gRNA-<i>ylbE</i>-A TTCTAGCTCTAAAACGTTGCACATCCAGCCAGTGTACTAGTATTATACCTAGGACT
22 UP-<i>iclR</i>-S CGTGGAGTTGAAGGTGTTGGT
23 UP-<i>iclR</i>-A TCCTTCGCCGCTTTAATCACCGGCAATCCACTCCAGTAATT
24 DN-<i>iclR</i>-S AATTACTGGAGTGGATTGCCGGTGATTAAAGCGGCGAAGGA
25 DN-<i>iclR</i>-A TAATAGAGGCGTCGCCAGCT
26 gRNA-<i>iclR</i>-S AGTCCTAGGTATAATACTAGTACGGAACTGGCGCAACAAGCGTTTTAGAGCTAGAA
27 gRNA-<i>iclR</i>-A TTCTAGCTCTAAAACGCTTGTTGCGCCAGTTCCGTACTAGTATTATACCTAGGACT
28 UP-<i>aceB</i>-S GAGCTGGCGTAGTCACGGTAA
29 UP-<i>aceB</i>-A TTCGCTGGCAATGACTTTCACAGAAGTTTATTGCGTTGTGGC
30 DN-<i>aceB</i>-S GCCACAACGCAATAAACTTCTGTGAAAGTCATTGCCAGCGAA
31 DN-<i>aceB</i>-A GCACGACGGAAGGTGTTGTT
32 gRNA-<i>aceB</i>-S AGTCCTAGGTATAATACTAGTCCAGCTCAAGCCCAATCCAGGTTTTAGAGCTAGAA
33 gRNA-<i>aceB</i>-A TTCTAGCTCTAAAACCTCGCGGCCAGATACGCATGACTAGTATTATACCTAGGACT
34 UP-<i>yeeP</i>-S GGTCAGGAGGTAACTTATCAGCG
35 UP-<i>yeeP</i>-A AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAAATGGCAGGGCTCCGTTTT
36 DN-<i>yeeP</i>-S AAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATGAACTGGATTTTCTTCTGAACCTGT
37 DN-<i>yeeP</i>-A ACGATGTCAGCAGCCAGCA
38 <i>aceA</i>-S TCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAAAACCCGTACACAACAAATT
39 <i>aceA</i>-A CACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAGAACTGCGATTCTTCAGTGG
40 gRNA-<i>yeeP</i>-S AGTCCTAGGTATAATACTAGTACAGAATATTCGCGAAAAAAGTTTTAGAGCTAGAA
41 gRNA-<i>yeeP</i>-A TTCTAGCTCTAAAACTTTTTTCGCGAATATTCTGTACTAGTATTATACCTAGGACT
42 UP-<i>yghE</i>-S GTCAGGCACTGGCGAAAGAT
43 UP-<i>yghE</i>-A AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACGCAAGCCATAAACCCACA
44 DN-<i>yghE</i>-S CTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATTTCCGACATCGAAATGCGT
45 DN-<i>yghE</i>-A AGGCGTTGTTGTGGCAGATT
46 <i>pntAB</i>-S TCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGCGAATTGGCATACCAAGA
47 <i>pntAB</i>-A ACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTACAGAGCTTTCAGGATTGCATC
48 gRNA-<i>yghE</i>-S AGTCCTAGGTATAATACTAGTGCTGAAAAAATATCGCCCACGTTTTAGAGCTAGAA
49 gRNA-<i>yghE</i>-A TTCTAGCTCTAAAACGTGGGCGATATTTTTTCAGCACTAGTATTATACCTAGGACT
50 UP-<i>ycdW</i>-S TCCTTCAGCCACTCGGACAC
51 UP-<i>ycdW</i>-A GATAGCAGGAATCCTGATGCTTTATGGATGCGATAATCGTCAAAAC
52 DN-<i>ycdW</i>-S GTTTTGACGATTATCGCATCCATAAAGCATCAGGATTCCTGCTATC
53 DN-<i>ycdW</i>-A ATTATCCGTTGCAGTTATGAGTGA
54 gRNA-<i>ycdW</i>-S AGTCCTAGGTATAATACTAGTTTGCTCAGAGTCTGCAAACCGTTTTAGAGCTAGAA
55 gRNA-<i>ycdW</i>-A TTCTAGCTCTAAAACGGTTTGCAGACTCTGAGCAAACTAGTATTATACCTAGGACT
56 UP-<i>yeeL</i>-S TTCATCGGGACGAGTGGAGA
57 UP-<i>yeeL</i>-A AATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACATTATACGAGCCGGATGATTAATTGTCAACCATAGCATCGCCAATCTGA
58 DN-<i>yeeL</i>-S CTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCCTGAGTAGGACAAATACCCAAAGGTGAAGATAAAGCC
59 DN-<i>yeeL</i>-A CATTCCCTCTACAGAACTAGCCCT
60 <i>ppc</i>-S TCCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGAACGAACAATATTCCGCAT
61 <i>ppc</i>-A ACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGTTAGCCGGTATTACGCATACCT
62 gRNA-<i>yeeL</i>-S AGTCCTAGGTATAATACTAGTAACACAGCAATACGGTACGCGTTTTAGAGCTAGAA
63 gRNA-<i>yeeL</i>-A TTCTAGCTCTAAAACGCGTACCGTATTGCTGTGTTACTAGTATTATACCTAGGACT
64 UP-<i>pykF</i>-S ACTGACAACTTCGGCACCAGA
65 UP-<i>pykF</i>-A CAGATGCGGTGTTAGTAGTGCCTCTTCAGATTCGGTTTTCGGTC
66 DN-<i>pykF</i>-S GACCGAAAACCGAATCTGAAGAGGCACTACTAACACCGCATCTG
67 DN-<i>pykF</i>-A AACCTGCCAGCAGAGTAGAACC
68 gRNA-<i>pykF</i>-S AGTCCTAGGTATAATACTAGTCGCAACGTGATGAGCAAAACGTTTTAGAGCTAGAA
69 gRNA-<i>pykF</i>-A TTCTAGCTCTAAAACGTTTTGCTCATCACGTTGCGACTAGTATTATACCTAGGACT
实施例2:菌株E.coli SAR摇瓶发酵生产L-肌氨酸
菌株E.coli SAR在5L发酵罐上的发酵实验：
斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12h，转茄形瓶继续培养12h；
种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养6h；
发酵培养：按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，装液量为60％(v培养基/v发酵罐)，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在36.5-37.5℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加800g/L的葡萄糖溶液继续培养，并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜3g/L，当OD600＝40时开始以25mL/h的流速流加1.6mol/L的甲胺盐酸盐溶液流加量为75mL/L培养基，发酵周期30h；
斜面培养基组成为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl2.5g/L，琼脂25g/L，其余为水，pH 7.0；
种子培养基组成为：葡萄糖25/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨5g/L，KH2PO4 5g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，其余为水，pH 7.0。
发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母提取物4g/L，胰蛋白胨5g/L，柠檬酸钠5g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，其余为水，pH 7.0。
5L发酵罐发酵30h后L-肌氨酸的产量可达10g/L。发酵过程曲线见图10。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种用于L-肌氨酸生产的基因工程菌及构建方法与应用
<160> 69
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1005
<212> DNA/RNA
<213> Brevibacterium linens ATCC 9172(Unknown)
<400> 1
atgacgaacg aaccggaccg catcagcttc gacgatctgg ttagcgccat tcaagccaaa 60
ctggtggccg cgggtgccag tccaagtgtt gccgaagttc tggcgacgaa ttgcgccacg 120
tgcgaacgcg atggcacgct gagccacggt gtgttccgtg ttgccggcta tctggatagt 180
ctgacccgtg gttgggccga tggtgccgcc gaaccgaata tcgatgttgt gggcccgagc 240
tacatccgta tcgatggccg caatggtttc gcgcaaccag cgctggccga agcccgtcca 300
accattgatg aggccctcgc ggaaagtggt gttgccgtta tcgcgctgcg cagcacgcat 360
cactttagcg cgctgtggcc agatctggag agcttcgccc gcgaaggccg cgttgccatg 420
ggtatgattg cgagcggcaa actggccgtt gttccggaag gtgccacccg cccagttttc 480
agcaccaacc cgtttggctt tgccacccca gttgcgggtg ccgacccaat tgtgttcgac 540
ttcagtacca gcagcatgag ccacggcgat ctgcaactgc tgcgtgccga aggtcgcgat 600
gttccggttg gcaccggcgt tgatagcacg ggtgccgatg ccaccgaccc aaatgccatt 660
ctggatggtg gcggcattcg tccaattggc ggccataaag gcgcgctgct cagcttcatg 720
attgaaaccc tcgccgccgg tctgacgggt ggtgcgttca cctacgaaat tgatgccgaa 780
gcgccggaag gtgcgcacac ctttcgcacc ggccagctgt ttatcgtgat cgacccagaa 840
cgtggcggta atgatgcgta tctgggtcgt gttcgcgaat tcgtggaaat gctgcgcgat 900
gccggtatgg atcgtcaacc gggcgatcgc cgttacgcca atcgtgcgga agcggccgtt 960
cgcggtatcc cagtgacgga taccatccgc agtctgttcg aataa 1005
<210> 2
<211> 1284
<212> DNA/RNA
<213> 大肠杆菌Escherichia coli ATCC 27325(Unknown)
<400> 2
atggctgata caaaagcaaa actcaccctc aacggggata cagctgttga actggatgtg 60
ctgaaaggca cgctgggtca agatgttatt gatatccgta ctctcggttc aaaaggtgtg 120
ttcacctttg acccaggctt cacttcaacc gcatcctgcg aatctaaaat tacttttatt 180
gatggtgatg aaggtatttt gctgcaccgc ggtttcccga tcgatcagct ggcgaccgat 240
tctaactacc tggaagtttg ttacatcctg ctgaatggtg aaaaaccgac tcaggaacag 300
tatgacgaat ttaaaactac ggtgacccgt cataccatga tccacgagca gattacccgt 360
ctgttccatg ctttccgtcg cgactcgcat ccaatggcag tcatgtgtgg tattaccggc 420
gcgctggcgg cgttctatca cgactcgctg gatgttaaca atcctcgtca ccgtgaaatt 480
gccgcgttcc gcctgctgtc gaaaatgccg accatggccg cgatgtgtta caagtattcc 540
attggtcagc catttgttta cccgcgcaac gatctctcct acgccggtaa cttcctgaat 600
atgatgttct ccacgccgtg cgaaccgtat gaagttaatc cgattctgga acgtgctatg 660
gaccgtattc tgatcctgca cgctgaccat gaacagaacg cctctacctc caccgtgcgt 720
accgctggct cttcgggtgc gaacccgttt gcctgtatcg cagcaggtat tgcttcactg 780
tggggacctg cgcacggcgg tgctaacgaa gcggcgctga aaatgctgga agaaatcagc 840
tccgttaaac acattccgga atttgttcgt cgtgcgaaag acaaaaatga ttctttccgc 900
ctgatgggct tcggtcaccg cgtgtacaaa aattacgacc cgcgcgccac cgtaatgcgt 960
gaaacctgcc atgaagtgct gaaagagctg ggcacgaagg atgacctgct ggaagtggct 1020
atggagctgg aaaacatcgc gctgaacgac ccgtacttta tcgagaagaa actgtacccg 1080
aacgtcgatt tctactctgg tatcatcctg aaagcgatgg gtattccgtc ttccatgttc 1140
accgtcattt tcgcaatggc acgtaccgtt ggctggatcg cccactggag cgaaatgcac 1200
agtgacggta tgaagattgc ccgtccgcgt cagctgtata caggatatga aaaacgcgac 1260
tttaaaagcg atatcaagcg ttaa 1284
<210> 3
<211> 1305
<212> DNA/RNA
<213> 大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325(Unknown)
<400> 3
atgaaaaccc gtacacaaca aattgaagaa ttacagaaag agtggactca accgcgttgg 60
gaaggcatta ctcgcccata cagtgcggaa gatgtggtga aattacgcgg ttcagtcaat 120
cctgaatgca cgctggcgca actgggcgca gcgaaaatgt ggcgtctgct gcacggtgag 180
tcgaaaaaag gctacatcaa cagcctcggc gcactgactg gcggtcaggc gctgcaacag 240
gcgaaagcgg gtattgaagc agtctatctg tcgggatggc aggtagcggc ggacgctaac 300
ctggcggcca gcatgtatcc ggatcagtcg ctctatccgg caaactcggt gccagctgtg 360
gtggagcgga tcaacaacac cttccgtcgt gccgatcaga tccaatggtc cgcgggcatt 420
gagccgggcg atccgcgcta tgtcgattac ttcctgccga tcgttgccga tgcggaagcc 480
ggttttggcg gtgtcctgaa tgcctttgaa ctgatgaaag cgatgattga agccggtgca 540
gcggcagttc acttcgaaga tcagctggcg tcagtgaaga aatgcggtca catgggcggc 600
aaagttttag tgccaactca ggaagctatt cagaaactgg tcgcggcgcg tctggcagct 660
gacgtgacgg gcgttccaac cctgctggtt gcccgtaccg atgctgatgc ggcggatctg 720
atcacctccg attgcgaccc gtatgacagc gaatttatta ccggcgagcg taccagtgaa 780
ggcttcttcc gtactcatgc gggcattgag caagcgatca gccgtggcct ggcgtatgcg 840
ccatatgctg acctggtctg gtgtgaaacc tccacgccgg atctggaact ggcgcgtcgc 900
tttgcacaag ctatccacgc gaaatatccg ggcaaactgc tggcttataa ctgctcgccg 960
tcgttcaact ggcagaaaaa cctcgacgac aaaactattg ccagcttcca gcagcagctg 1020
tcggatatgg gctacaagtt ccagttcatc accctggcag gtatccacag catgtggttc 1080
aacatgtttg acctggcaaa cgcctatgcc cagggcgagg gtatgaagca ctacgttgag 1140
aaagtgcagc agccggaatt tgccgccgcg aaagatggct ataccttcgt atctcaccag 1200
caggaagtgg gtacaggtta cttcgataaa gtgacgacta ttattcaggg cggcacgtct 1260
tcagtcaccg cgctgaccgg ctccactgaa gaatcgcagt tctaa 1305
<210> 4
<211> 2932
<212> DNA/RNA
<213> 大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325(Unknown)
<400> 4
atgcgaattg gcataccaag agaacggtta accaatgaaa cccgtgttgc agcaacgcca 60
aaaacagtgg aacagctgct gaaactgggt tttaccgtcg cggtagagag cggcgcgggt 120
caactggcaa gttttgacga taaagcgttt gtgcaagcgg gcgctgaaat tgtagaaggg 180
aatagcgtct ggcagtcaga gatcattctg aaggtcaatg cgccgttaga tgatgaaatt 240
gcgttactga atcctgggac aacgctggtg agttttatct ggcctgcgca gaatccggaa 300
ttaatgcaaa aacttgcgga acgtaacgtg accgtgatgg cgatggactc tgtgccgcgt 360
atctcacgcg cacaatcgct ggacgcacta agctcgatgg cgaacatcgc cggttatcgc 420
gccattgttg aagcggcaca tgaatttggg cgcttcttta ccgggcaaat tactgcggcc 480
gggaaagtgc caccggcaaa agtgatggtg attggtgcgg gtgttgcagg tctggccgcc 540
attggcgcag caaacagtct cggcgcgatt gtgcgtgcat tcgacacccg cccggaagtg 600
aaagaacaag ttcaaagtat gggcgcggaa ttcctcgagc tggattttaa agaggaagct 660
ggcagcggcg atggctatgc caaagtgatg tcggacgcgt tcatcaaagc ggaaatggaa 720
ctctttgccg cccaggcaaa agaggtcgat atcattgtca ccaccgcgct tattccaggc 780
aaaccagcgc cgaagctaat tacccgtgaa atggttgact ccatgaaggc gggcagtgtg 840
attgtcgacc tggcagccca aaacggcggc aactgtgaat acaccgtgcc gggtgaaatc 900
ttcactacgg aaaatggtgt caaagtgatt ggttataccg atcttccggg ccgtctgccg 960
acgcaatcct cacagcttta cggcacaaac ctcgttaatc tgctgaaact gttgtgcaaa 1020
gagaaagacg gcaatatcac tgttgatttt gatgatgtgg tgattcgcgg cgtgaccgtg 1080
atccgtgcgg gcgaaattac ctggccggca ccgccgattc aggtatcagc tcagccgcag 1140
gcggcacaaa aagcggcacc ggaagtgaaa actgaggaaa aatgtacctg ctcaccgtgg 1200
cgtaaatacg cgttgatggc gctggcaatc attctttttg gctggatggc aagcgttgcg 1260
ccgaaagaat tccttgggca cttcaccgtt ttcgcgctgg cctgcgttgt cggttattac 1320
gtggtgtgga atgtatcgca cgcgctgcat acaccgttga tgtcggtcac caacgcgatt 1380
tcagggatta ttgttgtcgg agcactgttg cagattggcc agggcggctg ggttagcttc 1440
cttagtttta tcgcggtgct tatagccagc attaatattt tcggtggctt caccgtgact 1500
cagcgcatgc tgaaaatgtt ccgcaaaaat taaggggtaa catatgtctg gaggattagt 1560
tacagctgca tacattgttg ccgcgatcct gtttatcttc agtctggccg gtctttcgaa 1620
acatgaaacg tctcgccagg gtaacaactt cggtatcgcc gggatggcga ttgcgttaat 1680
cgcaaccatt tttggaccgg atacgggtaa tgttggctgg atcttgctgg cgatggtcat 1740
tggtggggca attggtatcc gtctggcgaa gaaagttgaa atgaccgaaa tgccagaact 1800
ggtggcgatc ctgcatagct tcgtgggtct ggcggcagtg ctggttggct ttaacagcta 1860
tctgcatcat gacgcgggaa tggcaccgat tctggtcaat attcacctga cggaagtgtt 1920
cctcggtatc ttcatcgggg cggtaacgtt cacgggttcg gtggtggcgt tcggcaaact 1980
gtgtggcaag atttcgtcta aaccattgat gctgccaaac cgtcacaaaa tgaacctggc 2040
ggctctggtc gtttccttcc tgctgctgat tgtatttgtt cgcacggaca gcgtcggcct 2100
gcaagtgctg gcattgctga taatgaccgc aattgcgctg gtattcggct ggcatttagt 2160
cgcctccatc ggtggtgcag atatgccagt ggtggtgtcg atgctgaact cgtactccgg 2220
ctgggcggct gcggctgcgg gctttatgct cagcaacgac ctgctgattg tgaccggtgc 2280
gctggtcggt tcttcggggg ctatcctttc ttacattatg tgtaaggcga tgaaccgttc 2340
ctttatcagc gttattgcgg gtggtttcgg caccgacggc tcttctactg gcgatgatca 2400
ggaagtgggt gagcaccgcg aaatcaccgc agaagagaca gcggaactgc tgaaaaactc 2460
ccattcagtg atcattactc cggggtacgg catggcagtc gcgcaggcgc aatatcctgt 2520
cgctgaaatt actgagaaat tgcgcgctcg tggtattaat gtgcgtttcg gtatccaccc 2580
ggtcgcgggg cgtttgcctg gacatatgaa cgtattgctg gctgaagcaa aagtaccgta 2640
tgacatcgtg ctggaaatgg acgagatcaa tgatgacttt gctgataccg ataccgtact 2700
ggtgattggt gctaacgata cggttaaccc ggcggcgcag gatgatccga agagtccgat 2760
tgctggtatg cctgtgctgg aagtgtggaa agcgcagaac gtgattgtct ttaaacgttc 2820
gatgaacact ggctatgctg gtgtgcaaaa cccgctgttc ttcaaggaaa acacccacat 2880
gctgtttggt gacgccaaag ccagcgtgga tgcaatcctg aaagctctgt aa 2932
<210> 5
<211> 2652
<212> DNA/RNA
<213> 大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325(Unknown)
<400> 5
atgaacgaac aatattccgc attgcgtagt aatgtcagta tgctcggcaa agtgctggga 60
gaaaccatca aggatgcgtt gggagaacac attcttgaac gcgtagaaac tatccgtaag 120
ttgtcgaaat cttcacgcgc tggcaatgat gctaaccgcc aggagttgct caccacctta 180
caaaatttgt cgaacgacga gctgctgccc gttgcgcgtg cgtttagtca gttcctgaac 240
ctggccaaca ccgccgagca ataccacagc atttcgccga aaggcgaagc tgccagcaac 300
ccggaagtga tcgcccgcac cctgcgtaaa ctgaaaaacc agccggaact gagcgaagac 360
accatcaaaa aagcagtgga atcgctgtcg ctggaactgg tcctcacggc tcacccaacc 420
gaaattaccc gtcgtacact gatccacaaa atggtggaag tgaacgcctg tttaaaacag 480
ctcgataaca aagatatcgc tgactacgaa cacaaccagc tgatgcgtcg cctgcgccag 540
ttgatcgccc agtcatggca taccgatgaa atccgtaagc tgcgtccaag cccggtagat 600
gaagccaaat ggggctttgc cgtagtggaa aacagcctgt ggcaaggcgt accaaattac 660
ctgcgcgaac tgaacgaaca actggaagag aacctcggct acaaactgcc cgtcgaattt 720
gttccggtcc gttttacttc gtggatgggc ggcgaccgcg acggcaaccc gaacgtcact 780
gccgatatca cccgccacgt cctgctactc agccgctgga aagccaccga tttgttcctg 840
aaagatattc aggtgctggt ttctgaactg tcgatggttg aagcgacccc tgaactgctg 900
gcgctggttg gcgaagaagg tgccgcagaa ccgtatcgct atctgatgaa aaacctgcgt 960
tctcgcctga tggcgacaca ggcatggctg gaagcgcgcc tgaaaggcga agaactgcca 1020
aaaccagaag gcctgctgac acaaaacgaa gaactgtggg aaccgctcta cgcttgctac 1080
cagtcacttc aggcgtgtgg catgggtatt atcgccaacg gcgatctgct cgacaccctg 1140
cgccgcgtga aatgtttcgg cgtaccgctg gtccgtattg atatccgtca ggagagcacg 1200
cgtcataccg aagcgctggg cgagctgacc cgctacctcg gtatcggcga ctacgaaagc 1260
tggtcagagg ccgacaaaca ggcgttcctg atccgcgaac tgaactccaa acgtccgctt 1320
ctgccgcgca actggcaacc aagcgccgaa acgcgcgaag tgctcgatac ctgccaggtg 1380
attgccgaag caccgcaagg ctccattgcc gcctacgtga tctcgatggc gaaaacgccg 1440
tccgacgtac tggctgtcca cctgctgctg aaagaagcgg gtatcgggtt tgcgatgccg 1500
gttgctccgc tgtttgaaac cctcgatgat ctgaacaacg ccaacgatgt catgacccag 1560
ctgctcaata ttgactggta tcgtggcctg attcagggca aacagatggt gatgattggc 1620
tattccgact cagcaaaaga tgcgggagtg atggcagctt cctgggcgca atatcaggca 1680
caggatgcat taatcaaaac ctgcgaaaaa gcgggtattg agctgacgtt gttccacggt 1740
cgcggcggtt ccattggtcg cggcggcgca cctgctcatg cggcgctgct gtcacaaccg 1800
ccaggaagcc tgaaaggcgg cctgcgcgta accgaacagg gcgagatgat ccgctttaaa 1860
tatggtctgc cagaaatcac cgtcagcagc ctgtcgcttt ataccggggc gattctggaa 1920
gccaacctgc tgccaccgcc ggagccgaaa gagagctggc gtcgcattat ggatgaactg 1980
tcagtcatct cctgcgatgt ctaccgcggc tacgtacgtg aaaacaaaga ttttgtgcct 2040
tacttccgct ccgctacgcc ggaacaagaa ctgggcaaac tgccgttggg ttcacgtccg 2100
gcgaaacgtc gcccaaccgg cggcgtcgag tcactacgcg ccattccgtg gatcttcgcc 2160
tggacgcaaa accgtctgat gctccccgcc tggctgggtg caggtacggc gctgcaaaaa 2220
gtggtcgaag acggcaaaca gagcgagctg gaggctatgt gccgcgattg gccattcttc 2280
tcgacgcgtc tcggcatgct ggagatggtc ttcgccaaag cagacctgtg gctggcggaa 2340
tactatgacc aacgcctggt agacaaagca ctgtggccgt taggtaaaga gttacgcaac 2400
ctgcaagaag aagacatcaa agtggtgctg gcgattgcca acgattccca tctgatggcc 2460
gatctgccgt ggattgcaga gtctattcag ctacggaata tttacaccga cccgctgaac 2520
gtattgcagg ccgagttgct gcaccgctcc cgccaggcag aaaaagaagg ccaggaaccg 2580
gatcctcgcg tcgaacaagc gttaatggtc actattgccg ggattgcggc aggtatgcgt 2640
aataccggct aa 2652
<210> 6
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> UP-mbhA-S(Unknown)
<400> 6
gccagcacga acataatccc 20
<210> 7
<211> 64
<212> DNA/RNA
<213> UP-mbhA-A(Unknown)
<400> 7
taaagttaaa caaaattatt tctagaccct atagtgagtc gtattacacg gtggcaggtt 60
ttgg 64
<210> 8
<211> 55
<212> DNA/RNA
<213> DN-mbhA-S(Unknown)
<400> 8
tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttggaccaa aagtgcgtcc gatac 55
<210> 9
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> DN-mbhA-A(Unknown)
<400> 9
cggcgtaatc acaaactggc 20
<210> 10
<211> 65
<212> DNA/RNA
<213> dpkA-S(Unknown)
<400> 10
tagggtctag aaataatttt gtttaacttt aagaaggaga tataccatga cgaacgaacc 60
ggacc 65
<210> 11
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> dpkA-A(Unknown)
<400> 11
agacccgttt agaggcccca aggggttatg ctagttattc gaacagactg cggatg 56
<210> 12
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-mbhA-S(Unknown)
<400> 12
agtcctaggt ataatactag ttaccgggca taccgatgcg agttttagag ctagaa 56
<210> 13
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-mbhA-A(Unknown)
<400> 13
ttctagctct aaaactcgca tcggtatgcc cggtaactag tattatacct aggact 56
<210> 14
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> UP-ylbE-S(Unknown)
<400> 14
acccaacctt acgcaaccag 20
<210> 15
<211> 76
<212> DNA/RNA
<213> UP-ylbE-A(Unknown)
<400> 15
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaattgt 60
tcgataaccg cagcat 76
<210> 16
<211> 80
<212> DNA/RNA
<213> DN-ylbE-S(Unknown)
<400> 16
aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60
aatcgctggc gtgctttgaa 80
<210> 17
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> DN-ylbE-A(Unknown)
<400> 17
ggcgtaactc agcaggcag 19
<210> 18
<211> 84
<212> DNA/RNA
<213> gltA-S(Unknown)
<400> 18
tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60
atggctgata caaaagcaaa actc 84
<210> 19
<211> 88
<212> DNA/RNA
<213> gltA-A(Unknown)
<400> 19
caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60
ttgttaacgc ttgatatcgc ttttaaag 88
<210> 20
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-ylbE-S(Unknown)
<400> 20
agtcctaggt ataatactag tacactggct ggatgtgcaa cgttttagag ctagaa 56
<210> 21
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-ylbE-A(Unknown)
<400> 21
ttctagctct aaaacgttgc acatccagcc agtgtactag tattatacct aggact 56
<210> 22
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> UP-iclR-S(Unknown)
<400> 22
cgtggagttg aaggtgttgg t 21
<210> 23
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> UP-iclR-A(Unknown)
<400> 23
tccttcgccg ctttaatcac cggcaatcca ctccagtaat t 41
<210> 24
<211> 41
<212> DNA/RNA
<213> DN-iclR-S(Unknown)
<400> 24
aattactgga gtggattgcc ggtgattaaa gcggcgaagg a 41
<210> 25
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> DN-iclR-A(Unknown)
<400> 25
taatagaggc gtcgccagct 20
<210> 26
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-iclR-S(Unknown)
<400> 26
agtcctaggt ataatactag tacggaactg gcgcaacaag cgttttagag ctagaa 56
<210> 27
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-iclR-A(Unknown)
<400> 27
ttctagctct aaaacgcttg ttgcgccagt tccgtactag tattatacct aggact 56
<210> 28
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> UP-aceB-S(Unknown)
<400> 28
gagctggcgt agtcacggta a 21
<210> 29
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> UP-aceB-A(Unknown)
<400> 29
ttcgctggca atgactttca cagaagttta ttgcgttgtg gc 42
<210> 30
<211> 42
<212> DNA/RNA
<213> DN-aceB-S(Unknown)
<400> 30
gccacaacgc aataaacttc tgtgaaagtc attgccagcg aa 42
<210> 31
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> DN-aceB-A(Unknown)
<400> 31
gcacgacgga aggtgttgtt 20
<210> 32
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-aceB-S(Unknown)
<400> 32
agtcctaggt ataatactag tccagctcaa gcccaatcca ggttttagag ctagaa 56
<210> 33
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-aceB-A(Unknown)
<400> 33
ttctagctct aaaacctcgc ggccagatac gcatgactag tattatacct aggact 56
<210> 34
<211> 23
<212> DNA/RNA
<213> UP-yeeP-S(Unknown)
<400> 34
ggtcaggagg taacttatca gcg 23
<210> 35
<211> 74
<212> DNA/RNA
<213> UP-yeeP-A(Unknown)
<400> 35
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaaatgg 60
cagggctccg tttt 74
<210> 36
<211> 88
<212> DNA/RNA
<213> DN-yeeP-S(Unknown)
<400> 36
aaagactggg cctttcgttt tatctgttgt ttgtcggtga acgctctcct gagtaggaca 60
aatgaactgg attttcttct gaacctgt 88
<210> 37
<211> 19
<212> DNA/RNA
<213> DN-yeeP-A(Unknown)
<400> 37
acgatgtcag cagccagca 19
<210> 38
<211> 84
<212> DNA/RNA
<213> aceA-S(Unknown)
<400> 38
tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60
atgaaaaccc gtacacaaca aatt 84
<210> 39
<211> 86
<212> DNA/RNA
<213> aceA-A(Unknown)
<400> 39
caccgacaaa caacagataa aacgaaaggc ccagtctttc gactgagcct ttcgttttat 60
ttgttagaac tgcgattctt cagtgg 86
<210> 40
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-yeeP-S(Unknown)
<400> 40
agtcctaggt ataatactag tacagaatat tcgcgaaaaa agttttagag ctagaa 56
<210> 41
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-yeeP-A(Unknown)
<400> 41
ttctagctct aaaacttttt tcgcgaatat tctgtactag tattatacct aggact 56
<210> 42
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> UP-yghE-S(Unknown)
<400> 42
gtcaggcact ggcgaaagat 20
<210> 44
<211> 75
<212> DNA/RNA
<213> UP-yghE-A(Unknown)
<400> 44
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaacgca 60
agccataaac ccaca 75
<210> 44
<211> 77
<212> DNA/RNA
<213> DN-yghE-S(Unknown)
<400> 44
ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaattt 60
ccgacatcga aatgcgt 77
<210> 45
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> DN-yghE-A(Unknown)
<400> 45
aggcgttgtt gtggcagatt 20
<210> 46
<211> 81
<212> DNA/RNA
<213> pntAB-S(Unknown)
<400> 46
tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60
atgcgaattg gcataccaag a 81
<210> 47
<211> 82
<212> DNA/RNA
<213> pntAB-A(Unknown)
<400> 47
acaaacaaca gataaaacga aaggcccagt ctttcgactg agcctttcgt tttatttgtt 60
acagagcttt caggattgca tc 82
<210> 48
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-yghE-S(Unknown)
<400> 48
agtcctaggt ataatactag tgctgaaaaa atatcgccca cgttttagag ctagaa 56
<210> 49
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-yghE-A(Unknown)
<400> 49
ttctagctct aaaacgtggg cgatattttt tcagcactag tattatacct aggact 56
<210> 50
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> UP-ycdW-S(Unknown)
<400> 50
tccttcagcc actcggacac 20
<210> 51
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> UP-ycdW-A(Unknown)
<400> 51
gatagcagga atcctgatgc tttatggatg cgataatcgt caaaac 46
<210> 52
<211> 46
<212> DNA/RNA
<213> DN-ycdW-S(Unknown)
<400> 52
gttttgacga ttatcgcatc cataaagcat caggattcct gctatc 46
<210> 53
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> DN-ycdW-A(Unknown)
<400> 53
attatccgtt gcagttatga gtga 24
<210> 54
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-ycdW-S(Unknown)
<400> 54
agtcctaggt ataatactag tttgctcaga gtctgcaaac cgttttagag ctagaa 56
<210> 55
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-ycdW-A(Unknown)
<400> 55
ttctagctct aaaacggttt gcagactctg agcaaactag tattatacct aggact 56
<210> 56
<211> 20
<212> DNA/RNA
<213> UP-yeeL-S(Unknown)
<400> 56
ttcatcggga cgagtggaga 20
<210> 57
<211> 76
<212> DNA/RNA
<213> UP-yeeL-A(Unknown)
<400> 57
aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg gatgattaat tgtcaaccat 60
agcatcgcca atctga 76
<210> 58
<211> 80
<212> DNA/RNA
<213> DN-yeeL-S(Unknown)
<400> 58
ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc ggtgaacgct ctcctgagta ggacaaatac 60
ccaaaggtga agataaagcc 80
<210> 59
<211> 24
<212> DNA/RNA
<213> DN-yeeL-A(Unknown)
<400> 59
cattccctct acagaactag ccct 24
<210> 60
<211> 82
<212> DNA/RNA
<213> ppc-S(Unknown)
<400> 60
tccggctcgt ataatgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagacc 60
atgaacgaac aatattccgc at 82
<210> 61
<211> 80
<212> DNA/RNA
<213> ppc-A(Unknown)
<400> 61
acaaacaaca gataaaacga aaggcccagt ctttcgactg agcctttcgt tttatttgtt 60
agccggtatt acgcatacct 80
<210> 62
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-yeeL-S(Unknown)
<400> 62
agtcctaggt ataatactag taacacagca atacggtacg cgttttagag ctagaa 56
<210> 63
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-yeeL-A(Unknown)
<400> 63
ttctagctct aaaacgcgta ccgtattgct gtgttactag tattatacct aggact 56
<210> 64
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> UP-pykF-S(Unknown)
<400> 64
actgacaact tcggcaccag a 21
<210> 65
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> UP-pykF-A(Unknown)
<400> 65
cagatgcggt gttagtagtg cctcttcaga ttcggttttc ggtc 44
<210> 66
<211> 44
<212> DNA/RNA
<213> DN-pykF-S(Unknown)
<400> 66
gaccgaaaac cgaatctgaa gaggcactac taacaccgca tctg 44
<210> 67
<211> 22
<212> DNA/RNA
<213> DN-pykF-A(Unknown)
<400> 67
aacctgccag cagagtagaa cc 22
<210> 68
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-pykF-S(Unknown)
<400> 68
agtcctaggt ataatactag tcgcaacgtg atgagcaaaa cgttttagag ctagaa 56
<210> 69
<211> 56
<212> DNA/RNA
<213> gRNA-pykF-A(Unknown)
<400> 69
ttctagctct aaaacgtttt gctcatcacg ttgcgactag tattatacct aggact 56

Claims (10)

1.一种亚胺还原酶，其特征在于：所述亚胺还原酶来源于Brevibacterium linensATCC9172，其编码基因dpkA的核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
2.一种合成L-肌氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述基因工程菌为大肠杆菌Escherichia coli SAR，该大肠杆菌Escherichia coli SAR是以大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325为宿主，通过以下改造获得：在其基因组上整合单拷贝的亚胺还原酶基因dpkA，该基因由T7启动子控制；单拷贝柠檬酸合酶基因gltA，该基因由trc启动子控制；敲除乙醛酸循环抑制基因iclR；敲除苹果酸合酶基因aceB；单拷贝异柠檬酸裂解酶基因aceA，该基因由trc启动子控制；单拷贝膜结合转氢酶基因pntAB，该基因由trc启动子控制；敲除2-酮酸还原酶基因ycdW；单拷贝磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc，该基因由trc启动子控制；敲除丙酮酸激酶基因pykF。
3.根据权利要求2所述的合成L-肌氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述亚胺还原酶基因dpkA来源于Brevibacterium linens ATCC 9172，其核苷酸序列为SEQ ID NO.1。
4.根据权利要求2所述的合成L-肌氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述柠檬酸合酶基因gltA来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC 27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
5.根据权利要求2所述的合成L-肌氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述异柠檬酸裂解酶基因aceA来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.3。
6.根据权利要求2所述的合成L-肌氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述膜结合转氢酶基因pntAB来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325，其核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
7.根据权利要求2所述的合成L-肌氨酸的基因工程菌，其特征在于：所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc来源于大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325，其核苷酸序列为SEQ IDNO.5。
8.如权利要求2至7任一项所述的合成L-肌氨酸的基因工程菌的构建方法，其特征在于：所述方法采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对大肠杆菌进行定向改造，具体包括如下步骤：
Figure 25535DEST_PATH_IMAGE001
为了引入L-肌氨酸的合成代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上的mbhA位点单拷贝来源于Brevibacterium linens ATCC 9172的亚胺还原酶基因dpkA，其序列为SEQ ID NO.1，该基因经过密码子优化并且由T7启动子控制；
Figure 394200DEST_PATH_IMAGE002
为了增强草酰乙酸到柠檬酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上ylbE位点单拷贝内源的柠檬酸合酶基因gltA，其序列为SEQ ID NO .2，该基因由trc启动子控制；
Figure 694731DEST_PATH_IMAGE003
为了菌株在正常培养条件下开启乙醛酸循环，对大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上iclR位点进行基因敲除；
Figure 215974DEST_PATH_IMAGE004
为了阻断乙醛酸到苹果酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上aceB位点进行基因敲除；
Figure 310969DEST_PATH_IMAGE005
为了增强异柠檬酸到乙醛酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上yeeP位点单拷贝内源的异柠檬酸裂解酶基因aceA，其序列为SEQ ID NO .3，该基因由trc启动子控制；
Figure 166929DEST_PATH_IMAGE006
为了增强NADH到NADPH的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上yghE位点单拷贝内源的膜结合转氢酶基因pntAB，其序列为SEQ ID NO .4，该基因由trc启动子控制；
Figure 271151DEST_PATH_IMAGE007
为了阻断乙醛酸到乙醇酸的代谢，对大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上ycdW位点进行基因敲除；
Figure 630588DEST_PATH_IMAGE008
为了增强磷酸烯醇丙酮酸到草酰乙酸的代谢，在大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上yeeL位点单拷贝内源的磷酸烯醇丙酮酸羧化酶基因ppc，其序列为SEQID NO .5，该基因由trc启动子控制；
Figure 411332DEST_PATH_IMAGE009
为了减少磷酸烯醇式丙酮酸到丙酮酸的代谢，对大肠杆菌Escherichia coli ATCC27325基因组上pykF位点进行基因敲除；
其中，步骤
Figure 489009DEST_PATH_IMAGE001
至
Figure 131343DEST_PATH_IMAGE009
的构建顺序不分先后，根据需求进行调整即可。
9.如权利要求2至7任一项所述的合成L-肌氨酸的基因工程菌在L-肌氨酸生产方面中的应用。
10.利用如权利要求2至7任一项所述的基因工程菌发酵生产L-肌氨酸的方法，其特征在于：具体步骤如下：
发酵培养：将基因工程菌的种子液按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，发酵过程中控制pH稳定在6.8-7.2，温度维持在36.5-37.5℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加700-800g/L的葡萄糖溶液继续培养，并维持发酵培养基中的葡萄糖浓度＜3g/L，当OD600＝40时，开始以20-25mL/h的流速流加1.5-1.6mol/L的甲胺盐酸盐溶液，流加量为75mL/L培养基，发酵周期28-32h，即得L-肌氨酸；
发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠3-5g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
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