CN110283798A - 一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种基因重组蛋白Tat‑hMsrA的纯化方法，其包括如下步骤：获取表达融合蛋白Trx‑Tat‑hMsrA的大肠杆菌菌液；将大肠杆菌菌液离心，菌体沉淀重悬，超声破碎，再离心，得包涵体沉淀；将包涵体沉淀重悬于洗涤液中，采用高压均质机剪切，得破碎液；其中，洗涤液为包含盐酸胍、正十二醇肌氨酸、半胱氨酸和溶菌酶的磷酸缓冲液；将破碎液离心，弃去上清液，向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液，得混合溶液；将向混合溶液中加入复性溶液，复性，得复性混合物；将复性混合物经柱层析洗脱，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat‑hMsrA，即得。该基因重组蛋白Tat‑hMsrA的纯化方法可获得活性较高的Tat‑hMsrA。

Description

一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法。
背景技术
蛋氨酸亚砜还原酶A(MrsA)是一种很强的抗氧化酶。细胞穿透肽Tat安全无毒，可穿透细胞、血脑屏障，两者结合获得的人源性重组蛋白Tat-hMrsA可有望用于化妆品、保健品和药品中。
论文“蛋氨酸亚砜还原酶A对线粒体氧化应激损伤的保护作用及基因重组Tat-hMsrA中试工艺研究”中指出：使用基因工程的方法构建pet32a-Tat-hMsrA质粒，并从BL21(DE3)、gammi、rosseta、gold筛选最合适的宿主菌BL21(DE3)，然后进行蛋白的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，发现目标蛋白主要在包涵体表达，需要进行目标蛋白的变性和复性。但是从包涵体得到纯化目标蛋白，检测后无活性。
发明内容
基于此，有必要提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，可获得有活性的Tat-hMsrA。
本发明解决上述技术问题的技术方案如下：
本发明提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，包括如下步骤：
S1，获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液；
S2，将所述大肠杆菌菌液离心，菌体沉淀重悬，超声破碎，再离心，得包涵体沉淀；
S3，将所述包涵体沉淀重悬于洗涤液中，采用高压均质机剪切，得破碎液；其中，所述洗涤液为包含盐酸胍、正十二醇肌氨酸、半胱氨酸和溶菌酶的磷酸缓冲液；
S4，将所述破碎液离心，弃去上清液，向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液，得混合溶液；
S5，将向所述混合溶液中加入复性溶液，复性，得复性混合物；
S6，将所述复性混合物经柱层析洗脱，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA，即得。
优选地，在步骤S3中，所述洗涤液为包含4-8mol/L盐酸胍、0.1-0.5mg/mL正十二醇肌氨酸、0.5-1.5mg/mL半胱氨酸和0.5-1.5mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液，所述包涵体沉淀和所述洗涤液的体积比1:(5-20)。
更优选地，所述洗涤液为包含5-6mol/L盐酸胍、0.3-0.4mg/mL正十二醇肌氨酸、0.6-0.8mg/mL半胱氨酸和0.8-1.0mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液。
优选地，在步骤S5中，所述复性溶液为包含0.5-1.5mg/mL溶菌酶、0.5-1.5mg/L葡萄糖和0.5-2.0mg/mL复合氨基酸的磷酸缓冲液。
更优选地，在步骤S5中，所述复性溶液为包含0.7-1.0mg/mL溶菌酶、0.8-1.2mg/L葡萄糖和1.0-1.5mg/mL复合氨基酸的磷酸缓冲液。
优选地，所述高压均质机剪切的工艺参数为：转速500-2000r/min，时间60-180min。
优选地，在步骤S6中，所述柱层析依次包括凝胶排阻层析和离子交换层析。
更优选地，所述离子交换柱层析采用交联葡聚糖凝胶柱，并依次采用0、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰。
上述任一项所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法所制备的Tat-hMsrA。
本发明的有益效果是：
与现有技术相比，本发明的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法可获得有活性的Tat-hMsrA。
附图说明
图1为实施例3获得的目标基因重组蛋白Tat-hMsrA的SDS-PAGE图。
具体实施方式
以下结合具体实施例进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
一实施方式的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，包括如下步骤：
S1，获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
在本步骤中，按照博士学位论文“蛋氨酸亚砜还原酶A对线粒体氧化应激损伤的保护作用及基因重组Tat-hMsrA中试工艺研究”中第三部分-基因重组Tat-hMsrA的中试路线研究中公开的如下实验方法获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
S2，将步骤S1大肠杆菌菌液离心，菌体沉淀重悬，超声破碎，再离心，得包涵体沉淀。
S3，将包涵体沉淀重悬于洗涤液中，采用高压均质机剪切，得破碎液。其中，洗涤液为包含盐酸胍、正十二醇肌氨酸、半胱氨酸和溶菌酶的磷酸缓冲液。
优选地，洗涤液为包含4-8mol/L盐酸胍、0.1-0.5mg/mL正十二醇肌氨酸、0.5-1.5mg/mL半胱氨酸和0.5-1.5mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液，包涵体沉淀和洗涤液的体积比1:(5-20)。
S4，将破碎液离心，弃去上清液，向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液，得混合溶液。
S5，将向混合溶液中加入等体积的复性溶液，复性，得复性混合物。
优选地，性溶液为包含0.5-1.5mg/mL溶菌酶、0.5-1.5mg/L葡萄糖和0.5-2.0mg/mL复合氨基酸的磷酸缓冲液。
S6，将复性混合物经柱层析洗脱，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA，即得。
采用本实施方式的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法可获得有活性的Tat-hMsrA。
下面结合具体实施例进行举例说明。
实施例1
本实施提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，包括如下步骤：
S1，获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
在本步骤中，按照博士学位论文“蛋氨酸亚砜还原酶A对线粒体氧化应激损伤的保护作用及基因重组Tat-hMsrA中试工艺研究”中第三部分-基因重组Tat-hMsrA的中试路线研究中公开的如下实验方法获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
S2，将步骤S1的大肠杆菌菌液于4℃、8000g条件下离心，得菌体沉淀，再采用pH7.0的磷酸缓冲液重悬，冰浴条件下超声破碎，再于4℃、18000g条件下离心，得上清液和包涵体沉淀。
S3，将包涵体沉淀重悬于洗涤液中，采用高压均质机剪切，温度4℃条件下，转速1800r/min，时间80min，得破碎液。其中，洗涤液为包含8mol/L盐酸胍、0.1mg/mL正十二醇肌氨酸、1.5mg/mL半胱氨酸和0.5mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液，包涵体沉淀和洗涤液的体积比1:20。
S4，将步骤S3获得的破碎液和步骤S2获得的上清液合并，于4℃、20000g离心，弃去上清液，向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液，得混合溶液。
S5，将向混合溶液中加入等体积的复性溶液，复性，得复性混合物。其中，复性溶液为包含0.5mg/mL溶菌酶、1.5mg/L葡萄糖和0.5mg/mL复合氨基酸(含常规18种氨基酸)的磷酸缓冲液。
S6，将复性混合物经凝胶排阻层析和离子交换层析洗脱，离子交换柱层析采用交联葡聚糖凝胶柱G-100，并依次采用0、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰(始终采用SDS-PAGE监控)，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA，进行活性测试。
实施例2
本实施提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，包括如下步骤：
S1，获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
在本步骤中，按照博士学位论文“蛋氨酸亚砜还原酶A对线粒体氧化应激损伤的保护作用及基因重组Tat-hMsrA中试工艺研究”中第三部分-基因重组Tat-hMsrA的中试路线研究中公开的如下实验方法获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
S2，将步骤S1的大肠杆菌菌液于4℃、8000g条件下离心，得菌体沉淀，再采用pH7.0的磷酸缓冲液重悬，冰浴条件下超声破碎，再于4℃、18000g条件下离心，得上清液和包涵体沉淀。
S3，将包涵体沉淀重悬于洗涤液中，采用高压均质机剪切，温度4℃条件下，转速600r/min，时间150min，得破碎液。其中，洗涤液为包含4mol/L盐酸胍、0.5mg/mL正十二醇肌氨酸、0.5mg/mL半胱氨酸和1.5mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液，包涵体沉淀和洗涤液的体积比1:5。
S4，将步骤S3获得的破碎液和步骤S2获得的上清液合并，于4℃、20000g离心，弃去上清液，向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液，得混合溶液。
S5，将向混合溶液中加入等体积的复性溶液，复性，得复性混合物。其中，复性溶液为包含1.5mg/mL溶菌酶、0.5mg/L葡萄糖和2.0mg/mL复合氨基酸(含常规18种氨基酸)的磷酸缓冲液。
S6，将复性混合物经凝胶排阻层析和离子交换层析洗脱，离子交换柱层析采用交联葡聚糖凝胶柱G-100，并依次采用0、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰(始终采用SDS-PAGE监控)，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA，进行活性测试。
实施例3
本实施提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，包括如下步骤：
S1，获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
在本步骤中，按照博士学位论文“蛋氨酸亚砜还原酶A对线粒体氧化应激损伤的保护作用及基因重组Tat-hMsrA中试工艺研究”中第三部分-基因重组Tat-hMsrA的中试路线研究中公开的如下实验方法获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
S2，将步骤S1的大肠杆菌菌液于4℃、8000g条件下离心，得菌体沉淀，再采用pH7.0的磷酸缓冲液重悬，冰浴条件下超声破碎，再于4℃、18000g条件下离心，得上清液和包涵体沉淀。
S3，将包涵体沉淀重悬于洗涤液中，采用高压均质机剪切，温度4℃条件下，转速1200r/min，时间120min，得破碎液。其中，洗涤液为包含5.5mol/L盐酸胍、0.3mg/mL正十二醇肌氨酸、1.0mg/mL半胱氨酸和1.0mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液，包涵体沉淀和洗涤液的体积比1:12。
S4，将步骤S3获得的破碎液和步骤S2获得的上清液合并，于4℃、20000g离心，弃去上清液，向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液，得混合溶液。
S5，将向混合溶液中加入等体积的复性溶液，复性，得复性混合物。其中，复性溶液为包含1.0mg/mL溶菌酶、1.0mg/L葡萄糖和1.3mg/mL复合氨基酸(含常规18种氨基酸)的磷酸缓冲液。
S6，将复性混合物经凝胶排阻层析和离子交换层析洗脱，离子交换柱层析采用交联葡聚糖凝胶柱G-100，并依次采用0、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰(始终采用SDS-PAGE监控)，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA，进行活性测试。
本实施例中步骤S6中目标洗脱峰的SDS-PAGE监控图如图1所示，由图1可以看出，目标蛋白Tat-hMsrA的纯度较高。
对比例1
本实施提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，包括如下步骤：
S1，获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
在本步骤中，按照博士学位论文“蛋氨酸亚砜还原酶A对线粒体氧化应激损伤的保护作用及基因重组Tat-hMsrA中试工艺研究”中第三部分-基因重组Tat-hMsrA的中试路线研究中公开的如下实验方法获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
S2，将步骤S1的大肠杆菌菌液于4℃、8000g条件下离心，得菌体沉淀，再采用pH7.0的磷酸缓冲液重悬，冰浴条件下超声破碎，再于4℃、18000g条件下离心，得上清液和包涵体沉淀。
S3，将包涵体沉淀重悬于洗涤液中，采用高压均质机剪切，温度4℃条件下，转速1200r/min，时间120min，得破碎液。其中，洗涤液为包含5.5mol/L盐酸胍和1.0mg/mL半胱氨酸的磷酸缓冲液，包涵体沉淀和洗涤液的体积比1:12。
S4，将步骤S3获得的破碎液和步骤S2获得的上清液合并，于4℃、20000g离心，弃去上清液，向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液，得混合溶液。
S5，将向混合溶液中加入等体积的复性溶液，复性，得复性混合物。其中，复性溶液为包含1.0mg/mL溶菌酶和1.3mg/mL复合氨基酸(含常规18种氨基酸)的磷酸缓冲液。
S6，将复性混合物经凝胶排阻层析和离子交换层析洗脱，离子交换柱层析采用交联葡聚糖凝胶柱G-100，并依次采用0、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰(始终采用SDS-PAGE监控)，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA，进行活性测试。
对比例2
本实施提供一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，包括如下步骤：
S1，获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
在本步骤中，按照博士学位论文“蛋氨酸亚砜还原酶A对线粒体氧化应激损伤的保护作用及基因重组Tat-hMsrA中试工艺研究”中第三部分-基因重组Tat-hMsrA的中试路线研究中公开的如下实验方法获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液。
S2，将步骤S1的大肠杆菌菌液于4℃、8000g条件下离心，得菌体沉淀，再采用pH7.0的磷酸缓冲液重悬，冰浴条件下超声破碎，再于4℃、18000g条件下离心，得上清液和包涵体沉淀。
S3，将包涵体沉淀重悬于洗涤液中，采用高压均质机剪切，温度4℃条件下，转速1200r/min，时间120min，得破碎液。其中，洗涤液为包含1.0mg/mL半胱氨酸和1.0mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液，包涵体沉淀和洗涤液的体积比1:12。
S4，将步骤S3获得的破碎液和步骤S2获得的上清液合并，于4℃、20000g离心，弃去上清液，向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液，得混合溶液。
S5，将向混合溶液中加入等体积的复性溶液，复性，得复性混合物。其中，复性溶液为包含1.0mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液。
S6，将复性混合物经凝胶排阻层析和离子交换层析洗脱，离子交换柱层析采用交联葡聚糖凝胶柱G-100，并依次采用0、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰(始终采用SDS-PAGE监控)，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA，进行活性测试。
分别对实施例1至3、对比例1和2制备获得的目标蛋白Tat-hMsrA进行活性测试，蛋白活性测定采用CN102094068A的专利所述的方法，统计结果见下表1：
表1实施例1至3以及对比例1和2的蛋白活性汇总表
由表1可以明显看出，与对比例1和2相比，采用实施例1至3的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法可整体获得活性较高的重组基因蛋白Tat-hMsrA，可达电泳纯90％以上。
以上实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1，获取表达融合蛋白Trx-Tat-hMsrA的大肠杆菌菌液；
S2，将所述大肠杆菌菌液离心，菌体沉淀重悬，超声破碎，再离心，得包涵体沉淀；
S3，将所述包涵体沉淀重悬于洗涤液中，采用高压均质机剪切，得破碎液；其中，所述洗涤液为包含盐酸胍、正十二醇肌氨酸、半胱氨酸和溶菌酶的磷酸缓冲液；
S4，将所述破碎液离心，弃去上清液，向蛋白沉淀中加入肠激酶酶切缓冲液，得混合溶液；
S5，将向所述混合溶液中加入复性溶液，复性，得复性混合物；
S6，将所述复性混合物经柱层析洗脱，超滤浓缩，冷冻干燥，收集目标蛋白Tat-hMsrA，即得。
2.根据权利要求1所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，其特征在于，在步骤S3中，所述洗涤液为包含4-8mol/L盐酸胍、0.1-0.5mg/mL正十二醇肌氨酸、0.5-1.5mg/mL半胱氨酸和0.5-1.5mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液，所述包涵体沉淀和所述洗涤液的体积比1:(5-20)。
3.根据权利要求2所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，其特征在于，所述洗涤液为包含5-6mol/L盐酸胍、0.3-0.4mg/mL正十二醇肌氨酸、0.6-0.8mg/mL半胱氨酸和0.8-1.0mg/mL溶菌酶的磷酸缓冲液。
4.根据权利要求2所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，其特征在于，在步骤S5中，所述复性溶液为包含0.5-1.5mg/mL溶菌酶、0.5-1.5mg/L葡萄糖和0.5-2.0mg/mL复合氨基酸的磷酸缓冲液。
5.根据权利要求4所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，其特征在于，在步骤S5中，所述复性溶液为包含0.7-1.0mg/mL溶菌酶、0.8-1.2mg/L葡萄糖和1.0-1.5mg/mL复合氨基酸的磷酸缓冲液。
6.根据权利要求1所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，其特征在于，所述高压均质机剪切的工艺参数为：转速500-200r/min，时间60-180min。
7.根据权利要求1至6任一项所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，其特征在于，在步骤S6中，所述柱层析依次包括凝胶排阻层析和离子交换层析。
8.根据权利要求7所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法，其特征在于，所述离子交换柱层析采用交联葡聚糖凝胶柱，并依次采用0、0.1mol/L、0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L的氯化钠溶液进行梯度洗脱，收集目标洗脱峰。
9.权利要求1至8任一项所述的基因重组蛋白Tat-hMsrA的纯化方法所制备的Tat-hMsrA。
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