CN111019963B - 无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了一种无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法。所述无细胞表达rhUTI蛋白系统包括如下成分：无细胞蛋白表达体系、表达质粒；所述无细胞蛋白表达体系包括细胞提取物、补充体系；所述补充体系包括：第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体；所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因。

Description

无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体涉及无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法。
背景技术
人尿胰蛋白酶抑制剂(human Urinary trypsin inhibitor，以下简称为hUTI)最初是从新鲜人尿中提取的一种能抑制多种蛋白水解酶活力的糖蛋白，也称为乌司他丁或尿抑素。
hUTI存在于正常的人的尿液和血液中，由a-microglobulin precursor(AMBP)基因编码，含有两个Kunitz型结构域，对胰蛋白酶(trypsin)、胰凝乳蛋白酶(chymotrypsin)、纤溶酶(plasmin)等在内的多种蛋白酶具有较强的抑制作用。此外hUTI还可通过抑制脂多糖诱导的细胞因子合成发挥抗炎作用；对肿瘤细胞浸润和转移具有抑制作用。
1909年，Beuer和Reich首次报道了人体尿液中存在胰蛋白酶抑制剂。1985年从人尿中提取的hUTI首次在日本上市，其主要适应症为胰腺炎和休克所致的急性循环衰竭。1999年广东天普生化医药公司在国内推出“注射用尿抑素”，填补了国内的空白。目前，临床上hUTI被广泛用于治疗急性胰腺炎、慢性胰腺炎的急性发作、急性循环衰竭、弥散性血管内凝血(DIC)，肿瘤、休克和外科手术中辅助用药，防治顺铂化疗时对肾功能的损伤，AIDS的辅助治疗以及先兆流产的预防和治疗等。
目前，市场上商业化的hUTI制剂产品都从人尿中提取。研究表明，利用大肠杆菌(E.coli)表达的重组人尿胰蛋白酶抑制剂(Recombinant Human Urinary trypsininhibitor，rhUTI)也同样对胰蛋白酶具有抑制作用。由于利用基因工程技术表达重组蛋白可以避免从尿液中提取蛋白存在的来源限制、样品污染、后提取工艺复杂等，目前已成为研究热点。然而，目前利用基因工程手段从E.coli中获得的rhUTI产量低，难以满足商业化要求。
发明内容
针对现有技术的不足，本申请采用下述技术方案：
本申请的第一个方面提供了一种无细胞表达rhUTI蛋白系统，所述无细胞表达rhUTI蛋白系统包括如下成分：
无细胞蛋白表达体系、表达质粒；
所述无细胞蛋白表达体系包括细胞提取物、补充体系；
所述补充体系包括：第一缓冲液或其功能等同体、镁盐或其功能等同体、钾盐或其功能等同体、草酸盐或其功能等同体、氨基酸或氨基酸混合物或其功能等同体、核苷酸混合物或其功能等同体；
所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述细胞提取物选自大肠杆菌细胞提取物、酵母细胞提取物、小麦胚芽提取物、昆虫细胞提取物、兔网织红细胞提取物、CHO细胞提取物中的任意一种或几种的任意组合。
优选地，所述第一缓冲液的摩尔浓度为2～100mM；或/和
所述镁盐中含有的镁离子的摩尔浓度为0.5～20mM；或/和
所述钾盐中含有的钾离子的摩尔浓度为100～350mM；或/和
所述草酸盐的摩尔浓度为0.5～10mM；或/和
所述氨基酸或氨基酸混合物的摩尔浓度为1～3mM；或/和
所述核苷酸混合物的摩尔浓度为0.5～1.5mM。
优选地，所述第一缓冲液为磷酸盐缓冲液；或/和
所述镁盐为谷氨酸镁或/和醋酸镁；或/和
所述钾盐为谷氨酸钾或/和醋酸钾；或/和
所述草酸盐为草酸钾或/和草酸钠；或/和
所述氨基酸或氨基酸混合物为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸二十种氨基酸中的至少一种或多种的混合；或/和
所述核苷酸混合物为核苷三磷酸NTP或核苷酸NMP。
优选地，所述核苷三磷酸NTP包括如下任一组合：
组合A：腺苷三磷酸ATP、鸟苷三磷酸GTP、尿苷三磷酸UTP和胞苷三磷酸CTP；
组合B：腺苷三磷酸ATP和鸟苷三磷酸GTP。
优选地，所述核苷酸NMP包括如下任一组合：
组合C：腺嘌呤核苷酸AMP、鸟嘌呤核苷酸GMP、尿嘌呤核苷酸UMP和胞嘌呤核苷酸CMP；
组合D：腺嘌呤核苷酸AMP和鸟嘌呤核苷酸GMP。
优选地，所述补充体系还包括全氟化碳乳剂或其功能等同体。
优选地，所述全氟化碳乳剂选自Fluosol、乳剂二号、Perftoran、Oxypherol、Oxyfluor、TherOx、(Oxygent)AF0144、FlutecPP9中的任意一种或多种的组合。
优选地，所述密码子优化的rhUTI基因的N端还含有增强表达序列。
优选地，所述增强表达序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2序列为：
TTCAGTCAGCGGAAGGAGATCACGGATGGGTAGTAGTCACCACCACCACCACCATTCGTCG。
本发明的第二个方面提供了一种无细胞表达rhUTI蛋白系统生产rhUTI蛋白的方法，至少包括如下步骤：
表达质粒的构建；
配制无细胞蛋白表达体系；
纯化获得的蛋白。
优选地，所述表达质粒的构建的步骤如下：
将待表达的蛋白基因进行密码子优化后，与增强表达序列一起通过Gibson组装连接到表达载体中，将其转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选重组子测序，获得表达质粒。
优选地，所述配制无细胞蛋白表达体系的步骤如下：
将表达质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。
优选地，所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因，所述基因序列如SEQ IDNO.1所示。
优选地，所述密码子优化的rhUTI基因的N端还含有增强表达序列。
优选地，所述增强表达序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，SEQ ID NO.2序列为：
TTCAGTCAGCGGAAGGAGATCACGGATGGGTAGTAGTCACCACCACCACCACCATTCGTCG。
优选地，所述表达所需要的温度为15-37℃，所需要的时间为2-24h。
更优选地，所述表达所需要的温度为20-30℃，所需要的时间为8-20h。
再进一步优选地，所述表达所需要的温度为25℃，所需要的时间为18h。
本申请实施例采用的上述至少一个技术方案能够达到以下有益效果：
1、本申请使用无细胞蛋白合成系统大大简便了操作过程且降低了成本，通过密码子优化和添加增强表达的序列大大提高了重组rhUTI蛋白在无细胞蛋白表达系统中的表达量。
2、本申请采用基因工程技术，成功获得重组rhUTI蛋白，可以避免传统方法中出现的原料来源有限、采集困难及纯化过程复杂，除此之外还存在样品污染等潜在风险。
3、采用本申请的方法可以大大降低生产成本，简化生产工艺。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1：实施例1表达质粒图谱；
图2：实施例2表达质粒图谱；
图3：左侧的Marker为蛋白质分子量标准，中间的1为实施例1rhUTI纯化样品SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果图，考马斯亮蓝染色后，无法观察到rhUTI的表达，；右侧的2为银染结果图，黑色线标出了银染图中的rhUTI蛋白；
图4：左侧的Marker为蛋白质分子量标准，中间的1为实施例2rhUTI纯化样品SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果图；右侧的2为银染结果图，黑色线标出了银染图中rhUTI蛋白；
图5：对比例rhUTI纯化样品SDS-PAGE电泳考马斯亮蓝染色结果图。左起Marker为蛋白质分子量标准；1号为0.5mM IPTG、25℃诱导；2号为0.5mM IPTG、30℃诱导；3号为1mMIPTG、25℃诱导；4号为1mM IPTG、30℃诱导。图中虚线为电泳泳道分隔示意线
具体实施方式
为使本申请的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请具体实施例及相应的附图对本申请技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅是本申请一部分，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
除非特别定义，否则所有于此所用的技术及科学名词均与本领域技术人员所通常理解的意义相同。若于本文中所用定义与其他公开文献中所载定义有所矛盾或不一致，则应以此处所用的定义为准。
如本文中所用者，术语「选自」(slected from)、「由…构成」(composed of)与「包含」(comprising)同义。如本文中所用者，术语「包含」(comprises,comprising)、「包括」(includes,including)、「具有」(has,having)、「含有」(contains,containing)、或其任何其他变型，是意欲涵盖非排他性的涵括。例如，含有清单列出的复数元素的一组合物、制程、方法、制品或装置不一定仅限于清单上所列出的这些元素而已，而是可以包括未明确列出但却是所述组合物、制程、方法、制品或装置固有的其他元素。
当量、浓度、或其他数值或参数给出了范围、优选范围或上优选值与下优选值之列举时，应将其理解为特定公开由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值之任何配对所形成之所有范围，无论该些范围是否分别公开。例如，当叙述一个范围为「1至5」时，所叙述之范围应被理解为包括范围「1至4」、「1至3」、「1至2」、「1至2与4至5」、「1至3与5」等等。若本说明书中叙述一个数值范围，则除非另有说明，该范围意欲包括其端点以及该范围内的所有整数和小数。
此外，除非另有明确说明，「或」意指包括性的「或」而非指排除性的「或」。例如，条件A「或」B满足于下述情况之任何一种：A成立(或存在)且B不成立(或不存在)、A不成立(或不存在)且B成立(或存在)、以及A和B两者皆成立(或存在)。
同样地，除非上下文明确说明，否则位于本文的元素或成份之前的不定冠词「一」、「一个」及「一种」旨在非限制性地说明所述元素或成份的实例数目(即出现数)。因此，「一」、「一个」及「一种」应理解为包括一个或至少一个，且所述元素或成分的单数词形也包括复数形式。
术语[无细胞表达]，利用细胞抽提物，添加表达模板质粒，在体外环境中进行蛋白表达。
术语[hUTI蛋白]，人尿胰蛋白酶抑制剂(human Urinary trypsin inhibitor，以下简称为hUTI)。
术语[rhUTI蛋白]，重组人尿胰蛋白酶抑制剂(Recombinant HumanUrinarytrypsin inhibitor，以下简称为rhUTI)。
mM代表毫摩尔每升。
具体实施例
实施例1
表达质粒的构建
在GeneBank中查找人尿胰蛋白酶抑制剂的cDNA，在不改变氨基酸序列的前提下，按照大肠杆菌密码子偏好性对hUTI基因进行密码子优化，优化后的核苷酸序列见SEQ IDNO.1。
以pIJ8660F1：5’-CACCACTAATGATGACCGGCTGCAGC-3’和pIJ8660R1：5’-ACCCATATGGACACTCCTTACTTAGATTAAACAAAATTATTTGTAGAG-3’为上下游引物(分别引入了SEQ ID NO.1的5’和3’同源互补区段)，以环状质粒载体pIJ8660为模板进行PCR扩增。分别取1.0μL模板、2.5μL 10μM的上游和下游引物、25μL PCR聚合酶Q5High-Fidelity 2X Master Mix(NEB,USA)、无菌水将反应液定容至50μL。98℃条件下预变性处理30s，然后分别在98℃变性10s、57℃退火30s、72℃延伸2min、72℃终延伸2min，整个PCR反应体系共进行35个循环。扩增产物经DpnI酶处理消除模板后，经1％琼脂糖凝胶电泳检验后进行DNA切胶纯化，获得线性质粒pIJ8660a。
根据线性质粒pIJ8660a的5’和3’端序列，在hUTI密码子优化后的序列SEQ IDNO.1的3’和5’端分别引入与之同源区段，获得序列SEQ ID NO.3，按照序列表SEQ ID.3所示的序列进行DNA合成获得其DNA片段。
将PCR扩增获得的线性质粒pIJ8660a，与DNA合成获得的SEQ ID NO.3进行Gibson组装：10μL Gibson Assembly Master Mix(2X)(NEB,USA)，上述线性质粒pIJ8660a和SEQID NO.3片段按摩尔比1:3的比例加入，使用无菌水将反应液定容至20μL，50℃下保温1h。
将上述获得的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经37℃培养16h后，挑取阳性克隆经测序验证正确后获得表达质粒pIJ8660-rhUTI(图谱如图1所示)。
配制无细胞蛋白表达体系
将获得的重组质粒进行无细胞蛋白表达，所述表达系统成分如下：10mM磷酸盐缓冲液、1.2mM ATP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.85mM GTP、280mM谷氨酸钾、8mM谷氨酸镁、2.7mM草酸钾、2mM氨基酸混合物、体积比25％的大肠杆菌抽提物；将重组质粒pIJ8660-rhUTI加入无细胞表达体系中，取300μL反应液于96孔细胞培养板中，于25℃孵育过夜，离心，分离上清和沉淀，上清中含有表达的rhUTI蛋白。
纯化获得的蛋白
rhUTI蛋白纯化：取50μL镍珠，6000g离心30s，去除上清；用25μL 1×PBS重悬镍珠，6000g离心30s重复洗涤2次，向获得的反应物上清加入50μL洗涤的镍珠，4℃在摇床上缓慢摇动1h，以充分结合带His标签的目的蛋白。1h后离心弃上清，加入100μL 20mM咪唑洗涤(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑)重悬凝胶，离心弃上清，重复洗涤5次；加入50μL500mM咪唑洗脱液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，500mM咪唑)，轻轻重悬凝胶，离心收集上清液。上清液中即为纯化获得的目的蛋白。
对获得的目的蛋白进行脱盐处理：用分子量为3K的超滤管进行超滤，使用1×PBS将超滤管平衡两次后，向超滤管中加入上述含目的蛋白的洗脱液，并用1×PBS定容至500μL，4℃，14000g离心5min，去除下层滤液；重复10次，第10次4℃，14000g离心30min，去除下层滤液；取一干净的收集管，超滤管倒放，4℃，1000g离心2min，收集管中的即为脱盐浓缩的目的蛋白。
对获得的目的蛋白进行SDS-PAGE来检测rhUTI的表达情况。
实施例1中rhUTI无细胞表达蛋白的纯化电泳图如图3所示，考马斯亮蓝结果图(显示在图3中间的1)无法观察到rhUTI蛋白的条带，但通过银染可以观察到rhUTI蛋白的条带(显示在图3右侧的2)。
实施例2
表达质粒的构建
在GeneBank中查找人尿胰蛋白酶抑制剂的cDNA，在不改变氨基酸序列的前提下，按照大肠杆菌密码子偏好性对hUTI基因进行密码子优化，优化后的核苷酸序列见SEQ IDNO.1；
以pIJ8660F2：5’-CAAGCTTTGACCGGCTGCAGCCC-3’和pIJ8660R2：5’-TTCTAGAGGCTGTTTCGTCCTCACG-3’为上下游引物(分别引入了SEQ ID NO.1的3’端和SEQ IDNO.2的5’端同源互补区段)，以环状质粒载体pIJ8660为模板进行PCR扩增。分别取1.0μL模板、2.5μL 10μM的上游和下游引物、25μL PCR聚合酶Q5High-Fidelity 2X Master Mix(NEB,USA)、无菌水将反应液定容至50μL。98℃条件下预变性处理30s，然后分别在98℃变性10s、57℃退火30s、72℃延伸2min、72℃终延伸2min，整个PCR反应体系共进行35个循环。扩增产物经DpnI酶处理消除模板后，经1％琼脂糖凝胶电泳检验后进行DNA切胶纯化，获得线性质粒pIJ8660b。
根据增强表达序列SEQ ID NO.2的3’端序列和线性质粒pIJ8660b的5’端序列，在hUTI密码子优化后的序列SEQ ID NO.1两端分别引入与之同源互补区段获得序列SEQ IDNO.4。
根据hUTI密码子优化后的序列SEQ ID NO.1的5’端序列和线性质粒pIJ8660b的3’端序列，在增强表达序列SEQ ID NO.2两端分别引入同源互补区段获得序列SEQ ID NO.5。按照序列表SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的序列进行DNA合成获得其DNA片段。
将PCR扩增获得的线性质粒pIJ8660b，与DNA合成获得的SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5进行Gibson组装：10μL Gibson Assembly Master Mix(2X)(NEB,USA)，线性质粒pIJ8660b、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5片段按摩尔比1:3:5的比例加入，使用无菌水将反应液定容至20μL，50℃下保温1h。
将获得的连接产物转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经37℃培养16h后，挑取阳性克隆经测序验证正确后获得表达质粒pIJ8660-en-rhUTI(图谱如图2所示)。
配制无细胞蛋白表达体系
将获得的重组质粒进行无细胞蛋白表达，所述表达系统成分如下：10mM磷酸盐缓冲液、1.2mM ATP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.85mM GTP、280mM谷氨酸钾、8mM谷氨酸镁、2.7mM草酸钾、2mM氨基酸混合物、体积比25％的大肠杆菌抽提物；将重组质粒pIJ8660-en-rhUTI加入无细胞表达体系中，取300μL反应液于96孔细胞培养板中，于25℃孵育过夜，离心，分离上清和沉淀，上清中含有表达的rhUTI蛋白。
纯化获得的蛋白
rhUTI蛋白纯化：取50μL镍珠，6000g离心30s，去除上清；用25μL 1×PBS重悬镍珠，6000g离心30s重复洗涤2次，向获得的反应物上清加入50μL洗涤的镍珠，4℃在摇床上缓慢摇动1h，以充分结合带His标签的目的蛋白。1h后离心弃上清，加入100μL 20mM咪唑洗涤液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑)重悬凝胶，离心弃上清，重复洗涤5次；加入50μL500mM咪唑洗脱液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，500mM咪唑)，轻轻重悬凝胶，离心收集上清液。上清液中即为纯化获得的带His标签的目的蛋白。
对获得的目的蛋白进行脱盐处理：用分子量为3K的超滤管进行超滤，使用1×PBS将超滤管平衡两次后，向超滤管中加入上述含目的蛋白的洗脱液，并用1×PBS定容至500μL，4℃，14000g离心5min，去除下层滤液；重复10次，第10次4℃，14000g离心30min，去除下层滤液；取一干净的收集管，超滤管倒放，4℃，1000g离心2min，收集管中的即为脱盐浓缩的目的蛋白。
对获得的目的蛋白进行SDS-PAGE来检测rhUTI的表达情况。
实施例2中rhUTI无细胞表达蛋白的纯化电泳图如图4所示。通过添加本发明的增强表达序列后实施例2rhUTI无细胞的表达量较实施例1大大提高。
对比例1：
使用大肠杆菌细胞内表达重组人尿胰蛋白酶抑制剂(有细胞表达)
表达菌株的构建
取实施例2中序列测定正确的表达质粒，转化E.coli BL21(DE3)，涂布于相应抗生素的LB平板，37℃培养16h。挑取平板上的单克隆转接入5mL含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜。
rhUTI蛋白的表达与纯化鉴定
以1:100的比例将过夜培养物接种至50mL新鲜含相应抗生素的LB液体培养基，37℃震荡培养至OD600到达0.6，加入IPTG诱导过夜(IPTG浓度及诱导温度见表1)。收集培养物，4℃5000g离心5min，收集菌体，加入10mL1×PBS重悬，将细菌悬液置于冰浴中以40％裂解率超声10min(3s裂解，3s间歇)至菌液澄清透亮，4℃12000g离心5min，将裂解上清移至新的15mL离心管中备用。
rhUTI蛋白纯化
取200μL镍珠，6000g离心30s，去除上清；用200μL 1×PBS重悬镍珠，6000g离心30s重复洗涤2次，将洗涤好的镍珠加入裂解液上清中，4℃缓慢震荡结合1h；6000g离心15min，弃上清。加入400μL 20mM咪唑洗涤液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，20mM咪唑)重悬凝胶，离心弃上清，重复洗涤5次；加入200μL 500mM咪唑洗脱液(50mM NaH2PO4，300mM NaCl，500mM咪唑)，轻轻重悬凝胶，离心收集上清液。上清液中即为纯化获得的带His标签的目的蛋白。
对获得的目的蛋白进行脱盐处理：用分子量为3K的超滤管进行超滤，使用1×PBS将超滤管平衡两次后，向超滤管中加入上述含目的蛋白的洗脱液，并用1×PBS定容至500μL，4℃，14000g离心5min，去除下层滤液；重复10次，第10次4℃，14000g离心30min，去除下层滤液；取一干净的收集管，超滤管倒放，4℃，1000g离心2min，收集管中的即为脱盐浓缩的目的蛋白。
对纯化获得的样品进行SDS-PAGE检测rhUTI的表达情况(见表1)。
表1：rhUTI在E.coli BL21(DE3)体内诱导条件
Figure BDA0002346592990000121
结果如图5所示，左起Marker为蛋白质分子量标准；1号为0.5mM IPTG、25℃诱导；2号为0.5mM IPTG、30℃诱导；3号为1mM IPTG、25℃诱导；4号为1mM IPTG、30℃诱导，均无法观察到可溶性rhUTI蛋白的表达。
生物活性的检测
按照《中国药典》2015年版乌司他丁溶液效价测定方法进行，以从人尿中提取的hUTI作为对照，结果显示：从人尿中提取的hUTI的效价为3600U/mg，实施例1组表达的rhUTI蛋白浓度0.05mg/mL，实施例2重组表达的rhUTI蛋白浓度0.1mg/mL，对比例无可溶rhUTI表达，实施例1和实施例2的活性均为4000U/mg(见表2)。
表2：rhUTI产量及活性测定结果
产量(mg/mL) 活性(U/mg)
实施例1 0.05 4000
实施例2 0.1 4000
对比例 0 0
综上所述，本申请使用大肠杆菌无细胞蛋白合成系统大大简便了操作过程且降低了成本，通过密码优化和添加增强表达的序列大大提高了重组hUTI蛋白在大肠杆菌无细胞蛋白表达系统中的表达量。
以上所述仅为本申请的实施例而已，并不用于限制本申请。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的权利要求书所请的范围之内。
Figure BDA0002346592990000131
Figure BDA0002346592990000141
Figure BDA0002346592990000151
序列表
<110> 苏州珀罗汀生物技术有限公司
<120> 无细胞表达rhUTI蛋白系统及生产rhUTI蛋白的方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
gctgttctgc cgcaggaaga agaaggttct ggtggtggtc agctggttac cgaagttacc 60
aaaaaagaag actcttgcca gctgggttac tctgctggtc cgtgcatggg tatgacctct 120
cgttacttct acaacggtac ctctatggct tgcgaaacct tccagtacgg tggttgcatg 180
ggtaacggta acaacttcgt taccgaaaaa gaatgcctgc agacctgccg taccgttgct 240
gcttgcaacc tgccgatcgt tcgtggtccg tgccgtgctt tcatccagct gtgggctttc 300
gacgctgtta aaggtaaatg cgttctgttc ccgtacggtg gttgccaggg taacggtaac 360
aaattctact ctgaaaaaga atgccgtgaa tactgcggtg ttccgggtga cggtgacgaa 420
gaactgctgt aa 432
<210> 2
<211> 61
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
ttcagtcagc ggaaggagat cacggatggg tagtagtcac caccaccacc accattcgtc 60
g 61
<210> 3
<211> 491
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
taaggagtgt ccatatgggt gctgttctgc cgcaggaaga agaaggttct ggtggtggtc 60
agctggttac cgaagttacc aaaaaagaag actcttgcca gctgggttac tctgctggtc 120
cgtgcatggg tatgacctct cgttacttct acaacggtac ctctatggct tgcgaaacct 180
tccagtacgg tggttgcatg ggtaacggta acaacttcgt taccgaaaaa gaatgcctgc 240
agacctgccg taccgttgct gcttgcaacc tgccgatcgt tcgtggtccg tgccgtgctt 300
tcatccagct gtgggctttc gacgctgtta aaggtaaatg cgttctgttc ccgtacggtg 360
gttgccaggg taacggtaac aaattctact ctgaaaaaga atgccgtgaa tactgcggtg 420
ttccgggtga cggtgacgaa gaactgctgg gcagcagcgg ccaccaccac caccaccact 480
aatgatgacc g 491
<210> 4
<211> 466
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
gccatatggc tgttctgccg caggaagaag aaggttctgg tggtggtcag ctggttaccg 60
aagttaccaa aaaagaagac tcttgccagc tgggttactc tgctggtccg tgcatgggta 120
tgacctctcg ttacttctac aacggtacct ctatggcttg cgaaaccttc cagtacggtg 180
gttgcatggg taacggtaac aacttcgtta ccgaaaaaga atgcctgcag acctgccgta 240
ccgttgctgc ttgcaacctg ccgatcgttc gtggtccgtg ccgtgctttc atccagctgt 300
gggctttcga cgctgttaaa ggtaaatgcg ttctgttccc gtacggtggt tgccagggta 360
acggtaacaa attctactct gaaaaagaat gccgtgaata ctgcggtgtt ccgggtgacg 420
gtgacgaaga actgctgtaa ggatccgaat tcaagctttg accggc 466
<210> 5
<211> 124
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
acgaaacagc ctctagaaat aattttgttc agtcagcgga aggagatcac ggatgggtag 60
tagtcaccac caccaccacc attcgtcggg cctggtgccg cgcggcagcc atatggctgt 120
tctg 124

Claims (9)

1.一种无细胞表达rhUTI蛋白系统，其特征在于，所述无细胞表达rhUTI蛋白系统包括如下成分：
无细胞蛋白表达体系、表达质粒；
所述无细胞蛋白表达体系包括细胞提取物、补充体系；
所述补充体系包括：第一缓冲液、镁盐、钾盐、草酸盐、氨基酸混合物、核苷酸混合物；
所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因，所述基因序列如SEQ ID NO:1所示；
所述细胞提取物选自大肠杆菌细胞提取物、酵母细胞提取物、小麦胚芽提取物、昆虫细胞提取物、兔网织红细胞提取物、CHO细胞提取物中的任意一种或几种的任意组合；
所述第一缓冲液为浓度为2~100 mmoL/L的磷酸盐缓冲液；
所述镁盐为谷氨酸镁或/和醋酸镁，其中含有的镁离子浓度为0.5~20 mmoL/L；
所述钾盐为谷氨酸钾或/和醋酸钾，其中含有的钾离子浓度为100~350 mmoL/L；
所述草酸盐为草酸钾或/和草酸钠，并且所述草酸盐的浓度为0.5~10 mmoL/L；
所述氨基酸混合物为甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸和组氨酸的混合，并且所述氨基酸混合物的浓度为1~3 mmoL/L；
所述核苷酸混合物为核苷三磷酸NTP或核苷酸NMP，并且所述核苷酸混合物的浓度为0.5~1.5 mmoL/L；
所述核苷三磷酸NTP包括如下任一组合：
组合A：腺苷三磷酸ATP、鸟苷三磷酸GTP、尿苷三磷酸UTP和胞苷三磷酸CTP；
组合B：腺苷三磷酸ATP和鸟苷三磷酸GTP；
所述核苷酸NMP包括如下任一组合：
组合C：腺嘌呤核苷酸AMP、鸟嘌呤核苷酸GMP、尿嘌呤核苷酸UMP和胞嘌呤核苷酸CMP；
组合D：腺嘌呤核苷酸AMP和鸟嘌呤核苷酸GMP；
所述密码子优化的rhUTI基因的N端还含有增强表达序列，所述增强表达序列的核苷酸序列为：
TTCAGTCAGCGGAAGGAGATCACGGATGGGTAGTAGTCACCACCACCACCACCATTCGTCG。
2.根据权利要求1所述的无细胞表达rhUTI蛋白系统，其特征在于，所述补充体系还包括全氟化碳乳剂。
3.根据权利要求2所述的无细胞表达rhUTI蛋白系统，其特征在于，所述全氟化碳乳剂选自Fluosol、乳剂二号、Perftoran、Oxypherol、Oxyfluor、TherOx、(Oxygent)AF0144、FlutecPP9中的任意一种或多种的组合。
4.利用权利要求1-3任意一项所述无细胞表达rhUTI蛋白系统生产rhUTI蛋白的方法，其特征在于，至少包括如下步骤：
表达质粒的构建；
配制无细胞蛋白表达体系；
纯化获得的蛋白。
5.如权利要求4所述的生产rhUTI蛋白的方法，其特征在于，所述表达质粒的构建的步骤如下：
将待表达的蛋白基因进行密码子优化后，与增强表达序列一起通过Gibson组装连接到表达载体中，将其转化至大肠杆菌感受态细胞中，筛选重组子测序，获得表达质粒。
6.如权利要求4所述的生产rhUTI蛋白的方法，其特征在于，所述配制无细胞蛋白表达体系的步骤如下：
将表达质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。
7.如权利要求4所述的生产rhUTI蛋白的方法，其特征在于，所述表达质粒含有密码子优化的rhUTI基因，所述基因序列如SEQ ID NO:1所示。
8.如权利要求4所述的生产rhUTI蛋白的方法，其特征在于，所述密码子优化的rhUTI基因的N端还含有增强表达序列，所述增强表达序列的核苷酸序列为：
TTCAGTCAGCGGAAGGAGATCACGGATGGGTAGTAGTCACCACCACCACCACCATTCGTCG。
9.如权利要求4所述的生产rhUTI蛋白的方法，其特征在于，所述表达所需要的温度为15-37℃，所需要的时间为2-24h。
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