CN106632648A - 一种助表达序列及其无细胞表达adcy2蛋白系统 - Google Patents

一种助表达序列及其无细胞表达adcy2蛋白系统 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种助表达序列及其无细胞表达ADCY2蛋白系统，属于生物技术领域。该助表达序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID1所示。该助表达序列主要应用于多次跨膜蛋白的无细胞表达。本发明的一种助表达序列及其在无细胞表达ADCY2蛋白中的应用方法，能解决无细胞蛋白表达量低的问题。

Description

一种助表达序列及其无细胞表达ADCY2蛋白系统
技术领域
本发明涉及无细胞表达领域，具体涉及一种助表达序列及其无细胞表达ADCY2蛋白系统。
背景技术
结构和功能分析需要大量的膜蛋白样本，但是一个瓶颈是如何大批量高效的获得膜蛋白。在无细胞表达系统生产蛋白复杂性降低带来了转录翻译流程的高效运转。采用助表达序列的策略可以基于翻译起始的优化带来无细胞表达效率的快速提高。高频使用稀有密码子以及不利起始翻译已被确定为蛋白质生物合成的主要限制步骤，在mRNA的5'端区域，如核糖体结合位点涉及高风险的二级结构的形成可以减缓甚至阻止启动程序，高频的稀有密码子可能造成翻译停顿，错配的氨基酸，甚至过早终止事件，但这样的问题可以由合成基因表达的优化来解决。
腺苷酸环化酶，简称ADCY，是膜整合蛋白，12次跨膜糖蛋白，是G蛋白的效应物，能催化ATP生成cAMP，引起细胞应答。腺苷酸环化酶广泛分布于哺乳动物的细胞膜中，此酶催化ATP生成cAMP并释放焦磷酸。腺苷酸环化酶主要分布于细胞质膜、核膜和内质网膜上。腺苷酸环化酶(ADCY)是G蛋白偶联受体(GPCRs)下游的关键信号分子。基本上标准的无细胞是无法表达出完整的蛋白分子的，所以需要对无细胞表达条件进行改进。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供助表达序列及其无细胞表达ADCY2蛋白系统，能解决无细胞蛋白表达量低的问题。
本发明通过以下技术方案实现：一种助表达序列及其无细胞表达ADCY2蛋白系统，所述助表达序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID1所示。
作为进一步优选的，所述助表达序列主要应用于多次跨膜蛋白的无细胞表达。
本发明还提供了一种如上述所述的助表达序列的无细胞表达ADCY2蛋白系统，所述表达体系包括如下成分：HEPES-KOH缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸钾、醋酸铵、醋酸镁、亚叶酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大肠杆菌抽提物；将含助表达序列表达质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。
作为进一步优选的，所述表达质粒是由将待表达的ADCY2蛋白基因进行密码子优化后与助表达序列的基因和组氨酸标签进行连接，设计引物并引入双酶切位点，将连接得到的目的片段克隆到含T7启动子的表达载体pET28a上获得；
作为进一步优选的，所述ADCY2基因进行密码子优化后的序列如序列表2所示。
作为进一步优选的，通过SOE-PCR方法以及平端连接方法在ADCY2基因密码子优化后的片段的N端连接助表达序列的基因片段、C端连接组氨酸标签。
本发明的有益效果为：本发明通过在ADCY2基因上添加助表达序列进行无细胞表达，蛋白表达量高，解决了无细胞蛋白表达量低的问题。
附图说明
图1为实施例1的ADCY2无细胞表达后的蛋白纯化电泳图；
图2为对比例1的ADCY2无细胞表达后的蛋白纯化电泳图。
具体实施方式
下面结合附图和实施方式对本发明做进一步的详细说明。以下实施例仅是范例性的，仅用以对本发明的技术方案做更进一步的详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不偏离本发明技术方案的精神和范围内，对技术方案进行的修改或者替换均应涵盖在本发明的权利要求保护范围内。
本发明通过以下技术方案实现：一种助表达序列及其无细胞表达ADCY2蛋白系统，所述助表达序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID1所示。
作为进一步优选的，所述助表达序列主要应用于多次跨膜蛋白的无细胞表达。
本发明还提供了一种如上述所述的助表达序列的无细胞表达ADCY2蛋白系统，其特征在于：所述表达体系包括如下成分：HEPES-KOH缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸钾、醋酸铵、醋酸镁、亚叶酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大肠杆菌抽提物；将含助表达序列表达质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。
作为进一步优选的，所述表达质粒是由将待表达的ADCY2蛋白基因进行密码子优化后与助表达序列的基因和组氨酸标签进行连接，设计引物并引入双酶切位点，将连接得到的目的片段克隆到含T7启动子的表达载体pET28a上获得；
作为进一步优选的，所述ADCY2基因进行密码子优化后的序列如序列表2所示。
作为进一步优选的，通过SOE-PCR方法以及平端连接方法在ADCY2基因密码子优化后的片段的N端连接助表达序列的基因片段、C端连接组氨酸标签。
ADCY2基因进行密码子优化后的序列如序列表2所示。通过SOE-PCR方法以及平端连接方法在ADCY2基因密码子优化后的片段的N端连接助表达序列的基因片段、C端连接组氨酸标签，三段序列连接成整个序列，作为PCR反应的模板，ADCY2基因和助表达序列还含有蛋白酶酶切位点序列，所述蛋白酶酶切位点序列为凝血酶酶切位点或肠激酶酶切位点；
设计引入NcoⅠ酶切位点的上游引物(5’-ATGCTCCATGGATCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’)和引入XhoⅠ酶切位点的下游引物(5’-GGGCCCTCGAGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATG-3’)，以连接目的片段为模板，加入DNA聚合酶和10倍的DNA聚合酶缓冲液进行PCR扩增反应，扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验后，进行DNA纯化，纯化后的待表达基因片段进行双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，DNA纯化试剂盒纯化回收，将含酶切位点的待表达基因片段与线性pET28a质粒混合，加入T4DNA连接酶、10×T4DNA连接酶缓冲液，连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，取阳性克隆菌株进行DNA测序，对经测序确证的、含pET28a重组质粒的菌落进行质粒提纯，得到pET28a-ADCY2质粒。
所述表达时为半连续性物质交换反应，将表达体系中包括如下反应液成分：57mMHEPES-KOH缓冲液(pH8.2)、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mMcAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、33μg/ml T7 RNA聚合酶、500μM氨基酸、2％PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、和24％大肠杆菌抽提物；取300μl反应液于透析管中，加入6.7μg/ml pET28a-ADCY2质粒；供应试剂包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/mL亚叶酸、500μM氨基酸、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2％PET8000、24％大肠杆菌抽提物；供应试剂装于离心管中；将装有反应液的透析管置于离心管中进行无细胞蛋白表达，通过SDS-PAGE来检测ADCY2的表达情况。
实施例1
1.对ADCY2基因进行密码子优化，优化后的密码子序列见序列表2，在密码子优化后序列的ADCY2基因的N段添加助表达序列B-tag(ATCCAGCGTACTCCAAAGATTCAGGTTTACTCACGTCATCCAGCAGAGAATGGAAAGTCAAATTTCCTGAATTGCTAT；氨基酸序列为IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCY)，C端添加10×his(丝氨酸)标签(CATCATCATCATCATCATCATCATCATCAT；HHHHHHHHHH)，基因合成整个序列，作为基因克隆的模板。
2.取上述合成的含B-tag和10×his标签目的片段作为PCR反应的模板，设计引入NcoⅠ酶切位点的上游引物(5’-ATGCTCCATGGATCCAGCGTACTCCAAAGATT-3’)和引入XhoⅠ酶切位点的下游引物(5’-GGGCCCTCGAGATGATGATGATGATGATGATGATGATGATG-3’)。分别取4.0μL模板、2μL 10μmol/L的上游和下游引物、1.0μL DNA聚合酶(5U/μL)、10μL 10×DNA聚合酶缓冲液、5.0μL dNTP混合作为PCR反应体系。用无菌水将反应液调至50μL，于95℃条件下预变性处理2min，然后分别在94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最终72℃终延伸5min，整个PCR反应体系共进行35个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验后，进行DNA纯化。纯化后的ADCY2片段进行双酶切，反应体系如下：30μL添加了酶切位点的ADCY2片段、5μL 10×缓冲液、1μL NcoⅠ(20U/μL)、lμL XhoⅠ(20U/μL)，用无菌水将反应液调至50μL后，于37℃下保温1h，然后在65℃条件下处理20min进行热失活。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，DNA纯化试剂盒纯化回收。另一方面，将pET28a质粒载体转化大肠杆菌DH5α，培养过夜后提取质粒，并进行双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性质粒条带进行纯化回收。
3.pET28a-ADCY2重组表达载体的构建：将上述含酶切位点的ADCY2片段与线性pET28a质粒按2:1比例、在45℃下保温5min后，置于冰浴中冷却，冷却后分别加入1μL T4DNA连接酶、2μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液，l6℃保温16h。连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经37℃培养过夜后，挑选3～5个菌落做PCR验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于DNA测序。对经测序确证的、含pET28a-ADCY2重组质粒的菌落进行质粒提纯。
4.无细胞蛋白半连续反应表达体系的合成，反应液包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液(pH8.2)、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、33μg/ml T7RNA聚合酶、500μM氨基酸、2％PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、和24％大肠杆菌抽提物；取300μl反应液于D-TubeTM透析管中，加入6.7μg/ml pET28a-ADCY2质粒；取4.5mL供应试剂装于50mL离心管中，供应试剂包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/mL亚叶酸、500μM氨基酸、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2％PET8000、24％大肠杆菌抽提物；将装有反应液的透析管置于离心管中进行无细胞蛋白表达，通过SDS-PAGE来检测ADCY2的表达情况。
对比例1
1.取含ADCY2基因的克隆片段作为PCR反应的模板，设计引入NcoⅠ酶切位点的上游引物(5’-ATGCTCCATGGATGTGGCAGGAGGCG-3’)和引入XhoⅠ酶切位点的下游引物(5’-GGGCCCTCGAGGGATGCCACGTTGCTCTGGG-3’)。分别取4.0μL模板、2μL 10μmol/L的上游和下游引物、1.0μL DNA聚合酶(5U/μL)、10μL 10×DNA聚合酶缓冲液、5.0μL dNTP混合作为PCR反应体系。用无菌水将反应液调至50μL，于95℃条件下预变性处理2min，然后分别在94℃变性30s、65℃退火30s、72℃延伸30s、最终72℃终延伸5min，整个PCR反应体系共进行35个循环。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检验后，进行DNA纯化。纯化后的ADCY2片段进行双酶切，反应体系如下：30μL添加了酶切位点的ADCY2片段、5μL 10×缓冲液、1μL NcoⅠ(20U/μL)、lμLXhoⅠ(20U/μL)，用无菌水将反应液调至50μL后，于37℃下保温1h，然后在65℃条件下处理20min进行热失活。经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，DNA纯化试剂盒纯化回收。另一方面，将pET28a质粒载体转化大肠杆菌DH5α，培养过夜后提取质粒，并进行双酶切，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检验后，切下线性质粒条带进行纯化回收。
2.pET28a-ADCY2重组表达载体的构建：将上述含酶切位点的ADCY2片段与线性pET28a质粒按2:1比例、在45℃下保温5min后，置于冰浴中冷却，冷却后分别加入1μL T4DNA连接酶、2μL 10×T4 DNA连接酶缓冲液，l6℃保温16h。连接液转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，经37℃培养过夜后，挑选3～5个菌落做PCR验证，进一步进行酶切鉴定，阳性克隆用于DNA测序。对经测序确证的、含pET28a-ADCY2重组质粒的菌落进行质粒提纯。
3.无细胞蛋白半连续反应表达体系的合成，反应液包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液(pH8.2)、1.2mM ATP、0.85mM GTP、0.85mM UTP、0.85mM CTP、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/ml亚叶酸、33μg/ml T7 RNA聚合酶、500μM氨基酸、2％PET8000、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、和24％大肠杆菌抽提物；取300μl反应液于D-TubeTM透析管(3.5kDa)中，加入6.7μg/ml pET28a-ADCY2质粒；取4.5mL供应试剂装于50mL离心管中，供应试剂包括如下成分：57mM HEPES-KOH缓冲液、0.64mM cAMP、200mM谷氨酸钾、80mM醋酸铵、15mM醋酸镁、34μg/mL亚叶酸、500μM氨基酸、33mM磷酸烯醇式丙酮酸、2％PET8000、24％大肠杆菌抽提物；将装有反应液的透析管置于离心管中进行无细胞蛋白表达，通过SDS-PAGE来检测ADCY2的表达情况。
实施例1的ADCY2无细胞表达后的蛋白纯化电泳图如图1所示，对比例1的ADCY2无细胞表达后的蛋白纯化电泳图如图2所示。由图1和图2可知，通过添加本发明的助表达序列后ADCY2无细胞表达明显，且表达量高。
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ggtcgtcaga acgaatacta ctgccgtctg gacttcctgt ggaaaaacaa attcaaaaaa 2520
gaacgtgaag aaatcgaaac tatggaaaac ctgaaccgtg ttctgctgga aaacgttctg 2580
ccggctcacg ttgctgaaca cttcctggct cgttctctga aaaacgaaga actgtaccac 2640
cagtcttacg actgcgtttg cgttatgttc gcttctatcc cggacttcaa agaattctac 2700
accgaatctg acgttaacaa agaaggtctg gaatgcctgc gtctgctgaa cgaaatcatc 2760
gctgacttcg acgacctgct gtctaaaccg aaattctctg gtgttgaaaa aatcaaaacc 2820
atcggttcta cctacatggc tgctaccggt ctgtctgctg ttccgtctca ggaacactct 2880
caggaaccgg aacgtcagta catgcacatc ggtactatgg ttgaattcgc tttcgctctg 2940
gttggtaaac tggacgctat caacaaacac tctttcaacg acttcaaact gcgtgttggt 3000
atcaaccacg gtccggttat cgctggtgtt atcggtgctc agaaaccgca gtacgacatc 3060
tggggtaaca ccgttaacgt tgcttctcgt atggactcta ccggtgttct ggacaaaatc 3120
caggttaccg aagaaacctc tctggttctg cagaccctgg gttacacctg cacctgccgt 3180
ggtatcatca acgttaaagg taaaggtgac ctgaaaacct acttcgttaa caccgaaatg 3240
tctcgttctc tgtctcagtc taacgttgct tct 3273

Claims (6)

1.一种助表达序列，其特征在于：所述助表达序列的氨基酸序列如序列表SEQ ID1所示。
2.如权利要求1所述的助表达序列，其特征在于：所述助表达序列主要应用于多次跨膜蛋白的无细胞表达。
3.一种如权利要求1～2所述的助表达序列的无细胞表达ADCY2蛋白系统，其特征在于：所述表达体系包括如下成分：HEPES-KOH缓冲液、ATP、GTP、UTP、CTP、cAMP、谷氨酸钾、醋酸铵、醋酸镁、亚叶酸、T7RNA聚合酶、氨基酸、PET8000、磷酸烯醇式丙酮酸、大肠杆菌抽提物；将含助表达序列表达质粒加入无细胞蛋白表达体系中进行表达。
4.如权利要求3所述的助表达序列的无细胞表达ADCY2蛋白系统，其特征在于：所述表达质粒是由将待表达的ADCY2蛋白基因进行密码子优化后与助表达序列的基因和组氨酸标签进行连接，设计引物并引入双酶切位点，将连接得到的目的片段克隆到含T7启动子的表达载体pET28a上获得。
5.如权利要求4所述的助表达序列的无细胞表达ADCY2蛋白系统，其特征在于：所述ADCY2基因进行密码子优化后的序列如序列表2所示。
6.如权利要求5所述的助表达序列的无细胞表达ADCY2蛋白系统，其特征在于：通过SOE-PCR方法以及平端连接方法在ADCY2基因密码子优化后的片段的N端连接助表达序列的基因片段、C端连接组氨酸标签。
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