JP2002515224A

JP2002515224A - 連続的ｉｎｖｉｔｒｏ進化

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Publication number: JP2002515224A
Application number: JP2000548452A
Authority: JP
Inventors: グレゴリー・コイア; ピーター・ジョン・ハドソン; ピーター・イリエイズ; ロバート・アレクサンダー・イアヴィング
Original assignee: ダイアテック・ピーティワイ・リミテッド
Priority date: 1998-05-08
Filing date: 1999-05-07
Publication date: 2002-05-28
Anticipated expiration: 2019-05-07
Also published as: WO1999058661A1; JP2010119396A; EP1075513A1; US6562622B1; JP4519318B2; EP1075513A4; CA2328515A1; DE69942701D1; AUPP344598A0; EP1075513B8; CA2328515C; ES2351275T3; ATE478947T1; EP1075513B1

Abstract

(57)【要約】従来のアフィニティー成熟法に固有の数、ライブラリーサイズ、及び時間消費工程の制限を避ける、タンパク質のin vitro進化のための新規なＣＩＶＥ法の提供。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、翻訳系において標的結合タンパク質を突然変異させ選択する方法、
及びこの方法における使用のためのポリヌクレオチド構築物に関する。本発明の
方法は、診断上及び治療上の有用性を有する分子の生産に適用できる。

【０００２】

【従来の技術】

タンパク質のin vitro進化は、周知の遺伝子配列に突然変異を導入し、突然変
異体配列のライブラリーを生産すること、該配列を翻訳し、突然変異体タンパク
質を生産すること、次いで所望の特性を有する突然変異体タンパク質を選択する
ことを含む。この方法は、改良された診断上及び治療上の有用性を有するタンパ
ク質を生産する可能性を有する。しかしながら不幸にも、この方法の可能性は、
突然変異体及びライブラリーの生産のために現在利用可能な方法における不完全
性によって制限されている。

【０００３】例えば、独特の個々の遺伝子及びそれらがコードするタンパク質の大きなライ
ブラリー（例えば１０¹⁰のライブラリーサイズを超えるもの）の生産は、翻訳効
率の制限のため、ファージディスプレー系では困難であると理解されている。更
なる欠点は、ファージディスプレー系を利用する方法（図１）が、突然変異、増
幅、選択及び更なる突然変異のいくつかの連続的な工程を必要とする点である(I
rving等, 1996; Krebber等, 1995; Stemmer, 1994; Winter等, 1994)。

【０００４】選択されたタンパク質のアフィニティー成熟、特に抗体のアフィニティー成熟
のために今日使用されている方法の例が、表１に示される。全てのこれらの方法
は、遺伝子の突然変異、引き続きコード化タンパク質のディスプレーと選択に依
存する。選択された特定の突然変異体は、生じた遺伝子ライブラリーにおける多
様性を決定する。in vitroストラテジー（表１）は、ファージディスプレーライ
ブラリーを形成する際の突然変異化遺伝子のトランスフォーメーションの効率に
よって厳しく制限される。一つのin vivoサイクリング法（表１のＮｏ．１）に
おいて、大腸菌突然変異細胞は、組換え抗体遺伝子の突然変異のためのビヒクル
となった。突然変異化ＤＮＡＱ遺伝子を有する大腸菌突然変異化細胞ＭＵＴＤ５
−ＦＩＴ(Irving等, 1996)は、Ｓ−３０抽出物のソースとして使用でき、それ故
プルーフリーディングエラーの結果として複製の間ＤＮＡ中への突然変異の導入
を促す。しかしながら、突然変異速度は、必要とされる速度と比較して低い。例
えば、２０のアミノ酸の完全な順列を有する２０の残基を突然変異化するために
、１×１０²⁶のライブラリーサイズを必要とし、それは現在利用可能なファージ
ディスプレー方法体系では非常に困難な作業である。

【０００５】表１：アフィニティー成熟ストラテジー

【表１】 1) Irving等(1996); 2a) Krebber等(1995); 2b) Duenas及びBorrebaeck (1994);
3) Stemmer(1994); Stemmer等(1995); 4) Yang等(1995); 5a) Barbas等(1994);
5b) Winter等(1994); 6) Gram等(1992)

【０００６】それ故、継続的に進化（突然変異）され、所望の遺伝子が選択される突然変異
体の複雑なライブラリーのin vitro生産を可能にする選択法は、タンパク質のア
フィニティー突然変異（増大）の改良された手段を生ずるであろう。

【０００７】 in vitro結合転写及び翻訳系興味ある遺伝子を含むＤＮＡプラスミドは、Ｔ７プロモーターのようなコント
ロールエレメントによって制御される場合、転写のための鋳型として機能できる
ことが周知である。結合セルフリー系が、ｍＲＮＡを同時に転写し、ｍＲＮＡを
ペプチドに翻訳するために使用できることも周知である(Baranov等, 1993; Kudi
licki等, 1992; Kolosov等, 1992; Morozov等, 1993; Ryabova等, 1989,1994; S
pirin 1990; US 5556769; US 5643768; He及びTaussig 1997)。セルフリー系の
ソースは一般的に、原核生物について大腸菌Ｓ−３０抽出物(Mattheakis 1994;
Zubay 1973)であり、真核生物についてウサギ網状赤血球溶解物である。転写／
翻訳結合系は、原核生物セルフリー抽出物(Mattheakis等 1994)及び真核生物セ
ルフリー抽出物(US 5492817; US 5665563)を含むものが報告されており(US 5492
817; US 5665563)、それらは有効な転写及び翻訳のための異なる必要性を有する
。さらに、原核生物及び真核生物系における翻訳化タンパク質の正確なホールデ
ィングのための必要性が存在する。原核生物について、タンパク質ジスルフィド
イソメラーゼ（ＰＤＩ）及びシャペロンが必要とされ得る。一般的に原核生物に
おいては、翻訳化タンパク質は、リボソームからの放出の後ホールディングされ
る；しかしながら、リボソームに付着した（つながれた）新たに翻訳されたタン
パク質の正確なホールディングのため、Ｃ末端アンカーが必要であろう。アンカ
ーは、新たに翻訳されたタンパク質ドメインをリボソームに結合するためのポリ
ペプチドスペーサーである。該アンカーは、イムノグロブリン定常領域のような
完全なタンパク質ドメインでもよい。これとは全く対照的に、真核生物系におい
ては、タンパク質は合成と同時にホールディングされ、原核生物ＰＤＩ及びシャ
ペロンの添加は必要ない。しかしながらアンカーは、リボソームに結合した（つ
ながれた）新たに翻訳されたタンパク質から空間を空けるため、及び該タンパク
質の正確なホールディングのため、真核生物においても有用であろう。

【０００８】セルフリー結合系においてde novoで合成されたポリペプチドは、例えば停止
コドンの不存在下では該ポリペプチドはリボソームから放出されないため、リボ
ソームの表面にディスプレーされている。ｍＲＮＡリボソームタンパク質複合体
は、選択の目的のために使用できる。この系は、ファージディスプレー及び選択
の方法を模倣し、図１に示される。リボソーム上での最適なディスプレーのため
に必要とされる特性は、Hanes及びPluckthun (1997)によって記載されている。
これらの特性は、停止コドンの除去を含む。しかしながら停止コドンの除去は、
ｓｓｒＡｔＲＮＡ様構造によってコードされる新たに翻訳されたタンパク質の
Ｃ末端にプロテアーゼ感受性部位の付加を引き起こす。これは、アンチセンスｓ
ｓｒＡオリゴヌクレオチドを含ませることによって防止できる(Keiler等 1996)
。

【０００９】ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼＱβバクテリオファージは、大腸菌ファージＱβの一本鎖ゲノムを複製するた
めに有効なレプリカーゼを有するＲＮＡファージである（ＲＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼを、レプリカーゼまたはシンセターゼと称する）。Ｑβレプリカーゼ
はエラーを生じがちであり、１０³−１０⁴塩基対とin vivoで計算されたＲＮＡ
中に突然変異を導入する。Ｑβレプリカーゼの正確性は低く、強力に偏ってその
鋳型を複製する(Rohde等 1995)。これらの教示は、長期間に亘る複製により、所
望のタンパク質の合成に適さない突然変異された鎖の蓄積を導くことを示す。＋
及び−鎖の両者が、レプリカーゼの鋳型として機能する；しかしながら、ウイル
スのゲノムについて、＋鎖はＱβレプリカーゼによって結合され、相補的な鎖（
−）の鋳型として使用される。ＲＮＡの複製が生じるために、レプリカーゼは、
十分に定義されている特異的なＲＮＡ配列／構造エレメントを必要とする(Brown
及びGold 1995; Brown及びGold 1996)。組換えＲＮＡの０．１４フェムトグラム
を含む反応により、３０分で１２９ナノグラムが生産される(Lizardi等 1988)。

【００１０】ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、適合可能な鋳型上に対数増幅的にＲＮＡ
を複製することが周知である。適合可能な鋳型は、ＭＤＶ−１ＲＮＡに示され
たような二次構造を有するＲＮＡ分子である(Nishihara,T等 1983)。この点で、
ベクターは、複製のために必要とされる配列及び二次構造（ＭＤＶ−１ＲＮＡ
）を有し、ＱβゲノムＲＮＡと同様な態様でin vitroで複製されるため、増幅可
能なｍＲＮＡを構成するものとして記載されている。ＭＤＶ−１ＲＮＡ配列（
Ｑβレプリカーゼに対する天然で生じる鋳型）は、ＱβレプリカーゼによるＲＮ
Ａの増幅と適合可能な数多くの天然の鋳型の一つである(US-4786600)；それは、
組み込まれたｍＲＮＡの配列の安定性を増大する、ほとんどのファージＲＮＡの
末端に存在する構造と同様な末端のｔＲＮＡ様構造を有する。プラスミドの直線
化により、該プラスミドは、さらなる組換えＭＤＶ−１ＲＮＡの合成のための
鋳型として機能するようになる(Lizardi等 1988)。本分野での教示により、外来
遺伝子のＱβレプリカーゼによる長期化した複製は、ＭＤＶ−１ＲＮＡのよう
な天然で生じる鋳型の一つ内のＲＮＡとして組み込まれることを必要とすること
が示される。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】

本発明者は、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、進化した（突然変異化され
た）ｍＲＮＡ分子のライブラリーの作製と同様な態様で、複製の間合成されたｍ
ＲＮＡ分子内に突然変異を導入することを見出した。これらの突然変異化ｍＲＮ
Ａ分子は、挿入及び欠失並びに点突然変異のためサイズにおいて様々であり、相
当するタンパク質が、例えばリボソーム、ｍＲＮＡ、及びde novo合成されたタ
ンパク質をコードするｍＲＮＡを含む３成分複合体上にディスプレーされるよう
に、in vitroで翻訳され得る。本発明者はまた、リボソームディスプレー法によ
って生産されたタンパク質の大きな割合が、正確にホールディングされた機能的
な形態を有する条件を同定した。さらに本発明者は、ファージＱβレプリカーゼ
が、ｍＲＮＡ内に突然変異を取り込んでＲＮＡ鋳型を増幅するための真核生物結
合転写／翻訳系において機能できる条件を同定した。

【００１２】本発明の好ましい転写／翻訳系におけるｍＲＮＡ分子は、連続的なin vitro進
化（ＣＩＶＥ）法を導く複製／突然変異／翻訳の連続した周期的な方法に存在す
る。

【００１３】このＣＩＶＥ法は、従来のアフィニティー成熟法に固有の数、ライブラリーサ
イズ、及び時間消費工程の制限を避ける、タンパク質のin vitro進化のための新
規な方法を提供する。

【００１４】

【課題を解決するための手段】

従って、第一の特徴点として、本発明は、以下の工程を含む標的分子に結合す
るタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法を提供する：（ａ）タンパク質をコードする複製可能なｍＲＮＡ分子を、ＲＮＡのリボヌクレ
オシド三リン酸前駆体とＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼと共にインキュベーシ
ョンし、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、突然変異を導入するようにｍＲＮ
Ａ分子を複製し、それによって突然変異体ｍＲＮＡ分子の集団を生産する工程；
（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質
の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後
に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それに
よって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標
的分子にさらし、それに結合した突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を回収
することによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を選択す
る工程；及び（ｄ）任意に該複合体からｍＲＮＡ分子を放出する工程。第二の特徴点として、本発明は、以下の工程を含む、標的分子に結合するタン
パク質の突然変異、合成及び選択のための方法を提供する；（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質
の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後
に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それに
よって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標
的分子にさらすことによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合
体を選択する工程；（ｄ）工程（ａ）で使用された複製可能なｍＲＮＡ分子が、工程（ｃ）で選択さ
れた複合体から得られたｍＲＮＡである条件で、工程（ａ）から（ｃ）を一回以
上繰り返す工程；（ｅ）標的分子に結合する突然変異体タンパク質複合体を回収する工程；及び（ｆ）任意に複合体からｍＲＮＡ分子を放出または回収する工程。

【００１５】工程（ｄ）で得られたｍＲＮＡは、翻訳系から精製または単離することなく工
程（ａ）から（ｃ）を通じてリサイクルされてもよい。

【００１６】一つの実施態様として、工程（ｄ）から得たｍＲＮＡは、該ｍＲＮＡが工程（
ｃ）で得られた複合体に付着する間、工程（ａ）を経てリサイクルされる。別の
実施態様として、ｍＲＮＡは、リサイクルの前に工程（ｃ）で得られた複合体か
ら放出される。ｍＲＮＡは、いずれかの適切な機構によって複合体から放出され
てもよい。該機構には、インキュベーションの温度を上昇させること、または複
合体を完全なままにするために使用される化合物の濃度を変化することが含まれ
得る。

【００１７】本発明の文脈において、ｍＲＮＡは、連続的な手動の工程によって、工程（ａ
）から（ｃ）を通じてリサイクルされてもよい。しかしながら好ましい実施態様
として、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、単一または複数の区画を設
けた反応容器において同時に実施され、リサイクルが該容器内で自動的に生じる
。

【００１８】本発明の文脈において、ｍＲＮＡは、連続的な手動の工程によって、工程（ａ
）から（ｃ）を通じてリサイクルされてもよい。しかしながら好ましい実施態様
として、工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）及び（ｄ）は、単一の反応容器において同
時に実施され、リサイクルが該容器内で自動的に生じる。

【００１９】第二の特徴点の別の実施態様として、工程（ｄ）から得たｍＲＮＡは単離され
る。単離されたｍＲＮＡは、ｃＤＮＡに転写されてもよい。生じたｃＤＮＡを、
コード化タンパク質の発現に適したベクター内にクローン化してもよい。

【００２０】いずれかの適切な複合体が、翻訳したタンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ
に結合するために使用されてもよい。例えば該複合体は、タンパク質ディスプレ
ーのために適したミトコンドリアまたは他の細胞オルガネラであってもよい。リ
ボソーム複合体は好ましくは、少なくとも一つのリボソーム、少なくとも一つの
ｍＲＮＡ分子、及び少なくとも一つの翻訳したポリペプチドを含む。この複合体
は、翻訳したタンパク質の「リボソームディスプレー」を可能にする。翻訳に引
き続いて３成分のリボソーム複合体を完全なままに維持するために適した条件は
周知である。例えば、コードする配列の３’末端からの翻訳停止コドンの欠失ま
たは省略により、完全な３成分リボソーム複合体の維持が生ずる。スパルソマイ
シンまたは類似化合物は、リボソーム複合体の解離を防止するために加えられて
もよい。マグネシウム塩の特異的な濃度を維持すること、及びＧＴＰ濃度を下げ
ることもまた、完全なリボソーム複合体の維持に寄与するであろう。

【００２１】本発明の好ましい実施態様は、リサイクルバッチプロセス、好ましくは連続的
フロープロセスにおける結合した複製−翻訳−選択を含むことは、当業者に予測
されるであろう（例えば図４参照）。翻訳または転写−翻訳のための連続したフ
ロー装置及び方法は、本分野で周知であり、材料の組成または反応器の温度のよ
うな条件を変化させることによって、本発明の方法に適用できる。いくつかの系
及びその操作方法が、Spirin. A.S. (1991)にレビューされており、それは参考
としてここに取り込まれる。さらなる関連文献には、Spirin等 (1988); Rattat
等 (1990); Baranov等 (1989); Ryabova等 (1989);及びKigawa等 (1991)が含ま
れ、その全てが参考としてここに取り込まれる。

【００２２】用語、「翻訳系」は、リボソーム、可溶性酵素、トランスファーＲＮＡ、並び
に外因性ｍＲＮＡ分子によってコードされるタンパク質を合成可能なエネルギー
再生産系を含む混合物を意味する。

【００２３】好ましい実施態様として、該翻訳系は、セルフリー翻訳系である。この実施態
様に従った翻訳は、いずれかの特定のセルフリー翻訳系に制限されない。該系は
、真核生物、原核生物またはその組み合わせから由来してもよい、粗抽出物、部
分的に精製された抽出物または高度に精製された抽出物が使用されてもよい。合
成構成成分は、天然の構成成分に置換されてもよい。数多くの代替物が利用可能
であり、文献に記載されている。例えば、Spirin (1990B)を参照。この文献は、
参考としてここに取り込まれる。セルフリー翻訳系はまた、商業的に入手可能で
ある。本発明の一つの実施態様として、セルフリー翻訳系は、大腸菌からのＳ−
３０抽出物を利用する。別の実施態様として、セルフリー翻訳系は、網状赤血球
溶解物、好ましくはウサギ網状赤血球溶解物を利用する。

【００２４】該翻訳系はまた、タンパク質ホールディングを増大する化合物を含んでもよい
。この目的のために、本発明者は、リボソームディスプレー法によって生産され
るタンパク質の高い割合がホールディングされた機能的な形態で生産される条件
を同定した。これらの条件は、０．１ｍＭから１０ｍＭの間の濃度で翻訳系に対
して還元及び／または酸化したグルタチオンの添加を含む。好ましくは該翻訳系
は、２ｍＭから５ｍＭの間の濃度で酸化したグルタチオンを含む。好ましくは翻
訳系は、約２ｍＭの濃度で酸化したグルタチオンを、及び０．５ｍＭから５ｍＭ
の間の濃度で還元したグルタチオンを含む。

【００２５】本発明の別の実施態様として、該翻訳系は、細胞または細胞内の区画より成る
またはそれらを含む。該細胞は、真核生物または原核生物から由来してもよい。

【００２６】本分野で周知の数多くのＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ（またはレプリカー
ゼ若しくはＲＮＡシンセターゼとして周知である）が単離されており、本発明の
方法における使用に適している。これらの例として、バクテリオファージＲＮＡ
ポリメラーゼ、植物ウイルスＲＮＡポリメラーゼ及び動物ウイルスＲＮＡポリメ
ラーゼが含まれる。本発明の好ましい実施態様として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリ
メラーゼは、比較的高い頻度で複製されたＲＮＡ分子内に突然変異を導入し、好
ましくはその頻度は、１０⁴塩基対に少なくとも１個の突然変異、より好ましく
は１０³塩基対に一つの突然変異である。より好ましい実施態様として、ＲＮＡ
配向性ＲＮＡポリメラーゼは、Ｑβレプリカーゼ、Ｃ型肝炎ＲｄＲｐ、水疱性口
内炎ウイルスＲｄＲｐ、カブ黄色モザイクウイルスレプリカーゼ(Deiman等 (199
7))、並びにＲＮＡバクテリオファージファイ６ＲＮＡ依存性ＲＮＡ(Qjala及び
Bamford (1995)より成る群から選択される。最も好ましくは、ＲＮＡ配向性ＲＮ
Ａポリメラーゼは、Ｑβポリメラーゼである。

【００２７】ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、精製タンパク質として転写／翻訳系に含
まれてもよい。別法として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、本発明の第一
または第二の特徴点の方法の工程（ａ）と同時に、若しくは工程（ａ）、（ｂ）
及び（ｃ）と同時に発現される、遺伝子鋳型の形態で含まれてもよい。

【００２８】さらなる好ましい実施態様として、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼは、標的
分子と融合または会合されてもよい。理論的に根拠付けられることを望まないが
、ある場合、翻訳タンパク質の結合親和性は、ｍＲＮＡ分子に対するレプリカー
ゼの親和性より高くてもよい。標的分子／ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ融合
構築物に対する突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の結合は、ＲＮＡ配向性
ＲＮＡポリメラーゼの近傍にｍＲＮＡを配置するであろう。これは、興味あるｍ
ＲＮＡ分子の好ましいさらなる複製及び突然変異を生ずるであろう。

【００２９】各種のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって複製されるＲＮＡ鋳型が本分
野で周知であり、本発明における使用に適した複製可能なｍＲＮＡを生産するた
めのベクターとして機能できる。Ｑβレプリカーゼに対する周知の鋳型は、ＲＱ
１３５ＲＮＡ、ＭＤＶ−１ＲＮＡ、ミクロバリアントＲＮＡ、ナノバリアント
ＲＮＡ、ＣＴ−ＲＮＡ、及びＲＱ１２０ＲＮＡを含む。これもＱβレプリカー
ゼによって複製されるＱβ ＲＮＡは、シストロンを含み、該シストロンの生産
物がタンパク質合成を調節するため、好ましくはない。好ましいベクターは、Ｍ
ＤＶ−１ＲＮＡ及びＲＱ１３５ＲＮＡを含む。両者の配列が印刷されている。
Kramer等 (1978)（ＭＤＶ−１ＲＮＡ）及びMunishkin等 (1991)（ＲＱ１３５）
を参照。これら両者が参考としてここに取り込まれる。それらは、周知のＤＮＡ
合成法によってＤＮＡ形態に作製される。

【００３０】本発明の第一の特徴点の好ましい実施態様として、該方法はさらに、複製可能
なｍＲＮＡを生産するためにＤＮＡ構築物を転写する工程を含む。組換えｍＲＮ
ＡをコードするＤＮＡは、プラスミドの形態で存在し得るが、そうである必要は
ない。プラスミドと、遺伝子配列が組み込まれている複製可能なＲＮＡをコード
する配列の末端または近傍で該プラスミドを切断するエンドヌクレアーゼを使用
することが好ましい。直線化は個別に実施でき、または転写−複製−翻訳と結び
つけることができる。しかしながら好ましくは、直線状ＤＮＡは、多くの利用可
能なＤＮＡ複製のいずれか一つ、最も好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ
）によって生産される。いくつかの系について、エンドヌクレアーゼを含まない
非直線化プラスミドが好ましい。適切なプラスミドは、例えばＴ７ＲＮＡポリ
メラーゼまたはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼのようなバクテリオファージＲＮＡ
ポリメラーゼによる組換えプラスミドのin vitro転写によってＲＮＡを生産する
ための方法に関する、Melton等 (1984a,b)の以下の教示に従って調製されてもよ
い。例えばMelton等 (1984a)及びMelton等 (1984b)を参照。これらの文献は参考
としてここに取り込まれる。転写は、複製可能なＲＮＡをコードする配列の第一
のヌクレオチドで開始するのが好ましい。

【００３１】さらに好ましい実施態様として、転写は、本発明の第一または第二の特徴点に
従った方法の工程（ａ）、（ｂ）、（ｃ）で、単一または複数の区画の反応容器
若しくは反応器中で同時に実施される。

【００３２】標的分子は、ＤＮＡ分子、タンパク質、レセプター、細胞表面分子、代謝産物
、抗体、ホルモン、細菌またはウイルスのような、興味あるいずれかの化合物（
またはその断片）であってもよい。

【００３３】好ましい実施態様として、標的分子はマトリックスに結合され、複合体（翻訳
タンパク質をディスプレーする）を含む反応混合物に加えられる。標的分子は、
例えば磁性ビーズのようなマトリックス上に皮膜されてもよい。磁性ビーズは、
Dynabeadであってもよい。翻訳タンパク質は、標的分子に競合的に結合すると予
測されるであろう。より高い親和性を有するタンパク質は好ましくは、より低い
親和性分子を交換するであろう。かくして、本発明の方法は、興味ある標的分子
に対して改良された結合親和性を示す突然変異タンパク質の選択を可能にする。

【００３４】本発明者はまた、ＭＤＶ−１鋳型のような天然に存在するレプリカーゼの鋳型
から由来する最小の配列が、Ｑβレプリカーゼの結合に対して十分であるという
驚くべき発見をなした。この発見に基づいて、複製可能なｍＲＮＡの転写に適し
た新規な構築物が開発された。

【００３５】従って、本発明の第一及び第二の特徴点の好ましい実施態様として、該方法は
さらに、複製可能なｍＲＮＡ分子を生じるためにＤＮＡ構築物を転写することを
含み、該ＤＮＡ構築物は以下のものを含む；（ｉ）該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント及びリボ
ソーム結合部位を含む非翻訳領域；（ｉｉ）標的分子に結合するタンパク質をコードするオープンリーディングフレ
ーム；並びに（ｉｉｉ）該オープンリーディングフレームの上流に位置するステム−ループ構
造。

【００３６】第三の特徴点として、本発明は以下のものを含むＤＮＡ構築物を提供する；（ｉ）該ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント及びリボ
ソーム結合部位を含む非翻訳領域；（ｉｉ）非翻訳領域の下流に位置するクローニング部位；並びに（ｉｉｉ）該クローニング部位の上流に位置するレプリカーゼ結合配列。

【００３７】ここで使用される用語、「レプリカーゼ結合配列」は、レプリカーゼ（特にレ
プリカーゼホロ酵素）によって認識される「ループ様」二次構造のようなポリヌ
クレオチド配列を指す。好ましくは、レプリカーゼ結合配列は、レプリカーゼ分
子に対する全長ＲＮＡ鋳型を含まない。例えば好ましくは、用語、「レプリカー
ゼ結合配列」は、全長ＭＤＶ−１ＲＮＡまたはＲＱ１３５ＲＮＡ鋳型を含まな
い。

【００３８】好ましい実施態様として、レプリカーゼ結合配列は、１５から５０ヌクレオチ
ドの長さ、より好ましくは２０から４０ヌクレオチドの長さである。好ましくは
レプリカーゼ結合配列は、Ｑβレプリカーゼによって認識される。

【００３９】さらに好ましい実施態様として、レプリカーゼ結合配列の配列は、以下の配列
を含むまたは以下の配列より成る： GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCG。

【００４０】さらに好ましい実施態様として、第二のレプリカーゼ結合配列が、クローニン
グ部位の下流に含まれる。

【００４１】いずれかの適したリボソーム結合部位が、本発明の構築物において使用されて
もよい。原核生物及び真核生物リボソーム結合配列は、原核生物または真核生物
系の何れが使用されるかに依存して取り込まれてもよい。好ましい原核生物リボ
ソーム結合部位は、ＭＳ２ウイルスのものである。

【００４２】さらに好ましい実施態様として、ＤＮＡ構築物は、翻訳開始配列を含む。好ま
しくは翻訳開始配列はＡＴＧである。

【００４３】いずれかの興味ある遺伝子が、ＤＮＡ構築物のクローニング部位内に挿入でき
ることは、当業者によって予測される。好ましい実施態様として、興味ある遺伝
子は、（ｉ）標的結合タンパク質のライブラリー、または（ｉｉ）単一の標的結
合タンパク質についてコードするヌクレオチド配列であり、ここで該標的はタン
パク質、ＤＮＡ、細胞表面分子、レセプター、抗体、ホルモン、ウイルス、また
は他の分子若しくは複合体若しくはその誘導体のいずれかを含む。

【００４４】アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、興味ある遺伝子にフレー
ム中の３’に融合されてもよい。アンカードメインは、該分子の正確なホールデ
ィング及びその同型結合パートナーの接近が可能なリボソームからの十分な距離
に、翻訳されたタンパク質を興味ある遺伝子から離すのに十分な長さを有するい
ずれかのポリペプチド配列であってもよい。好ましくは該ポリペプチドは、複製
可能な鋳型のものを模倣した相当するＲＮＡ二次構造を有する。好ましい実施態
様として、該ポリペプチドはイムノグロブリン定常ドメインである。好ましくは
該ポリペプチドは、定常軽鎖ドメインである。定常軽鎖ドメインは、マウス抗体
１Ｃ３の第一の定常軽鎖領域であってもよい。好ましくは定常ドメインは、図５
ａに示される配列によってコードされる。別法として該ポリペプチドは、ヒトＩ
ｇＭ定常ドメインであってもよい。別の実施態様として、アンカーは、以下のも
のより成る群から選択されてもよい：オクタペプチド「ＦＬＡＧ」エピトープ、
ＤＹＫＤＤＤＤＫ、または任意に翻訳終結（停止）ヌクレオチド配列が引き続く
ポリヒスチジン６タグ。翻訳終結（停止）ヌクレオチド配列は、ＴＡＡまたはＴ
ＡＧであってもよい。本発明のいくつかの構築物において、放出因子による認識
、引き続きタンパク質放出を妨げるために、停止コドンは存在しない。これらの
構築物において、アンチセンスｓｓｒＡオリゴヌクレオチド配列は、引き続く３
’非翻訳領域中のＣ末端プロテアーゼ部位の付加を妨げるために加えられてもよ
い。

【００４５】第四の特徴点として、本発明は、本発明の第二の特徴点に従ったＤＮＡ構築物
を含む複製可能なｍＲＮＡ転写産物を生産するためのキットを提供する。

【００４６】好ましい実施態様として、該キットは、以下のものから選択される少なくとも
一つの他のさらなる構成成分を含む：（ｉ）ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＱβレプリカーゼ、または
ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼのためのＤＮＡ若しくはＲＮＡ鋳型；（ｉｉ）セルフリー翻訳系；（ｉｉｉ）ＤＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはバクテリオファージポ
リメラーゼ；（ｉｖ）リボヌクレオシド三リン酸；並びに（ｖ）制限酵素。

【００４７】本明細書を通じて、もし文脈が他のものを必要としなければ、用語「含む」ま
たはその変異型「含む」若しくは「含んでいる」は、述べられているエレメント
または数字またはエレメントの群または数字類を含むものを企図するように理解
されるが、いずれかの他のエレメントまたは数字またはエレメントの群または数
字類を排除するものとは解されない。

【００４８】

【発明の実施の形態】

本発明の好ましい態様として、タンパク質の連続的一工程進化のための系は、
以下の構成成分を含む：

【００４９】発現ユニット：本発明における使用のための好ましい発現ユニットは、図２に表される。この
発現ユニットは、ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するために、Ｔ７またはＳＰ
６プロモーターのようなコントロールエレメントを５’非翻訳領域内に有する３
’及び５’非翻訳領域を含む。コンセンサスＤＮＡ配列は、そのポリメラーゼに
特異的である：Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼに対するＴ７プロモーター配列は、TAA
TACGACTCACTATAGGGAGAである。Ｔ７プロモーター配列は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼ結合配列として機能し得る（即ち、それはＱβレプリカーゼに対する
結合配列として機能し得る）。しかしながら好ましくは、該構築物は、プロモー
ター部位に対する３’側に５’非翻訳領域中に位置するＱβレプリカーゼの結合
のためのステムループ構造を含む。好ましくは第二のステムループ構造は、コー
ド配列の下流に含まれ、好ましくは発現ユニットの翻訳終結部位の３’側で約１
ｋｂである。好ましいステムループ構造の配列は、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUU
CGである。

【００５０】リボソーム結合部位は、プロモーターの下流の次の領域である。いくつかのリ
ボソーム結合部位のいずれかが、この位置で使用できる。原核生物及び真核生物
リボソーム結合配列が、真核生物または原核生物結合系の何れが使用されるかに
依存して取り込まれ得る。一つの好ましい原核生物結合部位は、ＭＳ２ウイルス
のものである。翻訳開始配列ＡＴＧが好ましくは使用され、それはアミノ酸メチ
オニンをコードする；これは、in vitro翻訳の開始部位である。

【００５１】興味ある遺伝子（ヌクレオチド配列）興味ある遺伝子が、標準的な遺伝学的方法のいずれかによって非翻訳領域に結
合され得ることは、当業者に予測されるであろう。興味ある遺伝子は、遺伝子３
’末端までにオープンリーディングフレーム（停止コドンではない）を有するい
ずれかのヌクレオチド配列を含み、さらに本発明の目的のため、アンカー（スペ
ーシング）配列の末端を含む。

【００５２】好ましい実施態様として、興味ある遺伝子は、ｉ）標的結合タンパク質のライ
ブラリー、またはｉｉ）単一の標的結合タンパク質をコードするヌクレオチド配
列であり、この場合標的は、タンパク質、ＤＮＡ、細胞表面分子、レセプター、
抗体、ホルモン、ウイルス、または他の分子若しくは複合体若しくはその誘導体
のいずれかを含む。アンカードメインをコードするヌクレオチド配列は、興味あ
る遺伝子の３’及びフレーム中に融合されてもよい。アンカードメインは、分子
の正確なホールディング及び同型結合パートナーへの接近を可能にするためにリ
ボソームから十分な距離で、興味ある遺伝子から翻訳されたタンパク質を離す十
分な長さの一連のポリペプチド配列のいずれかであってもよい。好ましい実施態
様として、アンカーは、オクタペプチド「ＦＬＡＧ」エピトープ：DYKDDDDKまた
はヒト若しくはネズミ抗体定常ドメインのいずれかをコードする配列である。好
ましくはアンカーは、定常ドメイン１Ｃ３のようなマウスモノクローナル抗体か
ら由来する定常ドメインである（図５ａ参照）。さらに好ましいアンカーは、ヒ
トＩｇＭ抗体から由来する定常領域である（図５ｂ参照）。

【００５３】アンカー配列には、例えばTAAまたはTAGといった翻訳終止（停止）ヌクレオチ
ド配列が引き続くであろう。しかしながら、ある構成においては、放出因子によ
る認識及び引き続くタンパク質の放出を妨げるために、停止コドンが存在しない
ことが考慮され得る。これらにおいて、アンチセンスｓｓｒＡオリゴヌクレオチ
ド配列が、引き続く３’非翻訳領域中のＣ末端プロテアーゼ部位の付加を妨げる
ために加えられる。スパルソマイシン、他の類似化合物の添加または温度の減少
もまた、ｍＲＮＡ及びde novo合成タンパク質からのリボソームの放出を妨げる
。

【００５４】発現システム発現ユニットのための転写／複製／突然変異は、ウサギ網状赤血球溶解物系(H
e及びTaussig, 1997)または大腸菌Ｓ−３０転写翻訳混合物(Mattheakis等, 1994
; Zubay, 1997)の使用によって達成され得る。例えば、Ｔ７プロモーターを使用
したＤＮＡ発現ユニット（上述詳述）を、製造者の説明書に従ってＴ７ＲＮＡ
ポリメラーゼで処理する。生じたＲＮＡライブラリーは、コード化遺伝子の多様
性を反映する。複製及び突然変異のために添加されたＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
ラーゼは、複製のために加えられ、突然変異が精製酵素として提供され、または
別法としてＴ７若しくはＳＰ６のようなプロモーターの制御の下でプラスミド内
に別個の発現系としてコードされる。好ましい酵素はＱβレプリカーゼであるが
、同様な性質を有するいずれかの酵素が使用されてもよい。この工程は、Ｑβプ
ロテアーゼによる突然変異を通じたライブラリーの複雑性の増大を提供する。真
核生物細胞におけるｍＲＮＡ合成のため、ｍＲＮＡは好ましくはキャップされ、
それはジグアノシン三リン酸の過剰量の添加によって達成される；しかしながら
、商業的な供給者Promega及びNovagenから得たウサギ網状赤血球系は、キャップ
した化合物の添加を不要にする系中の構成成分を有する。転写／翻訳混合物また
は結合系は、いずれかの細胞から抽出でき、最も一般的に使用されるものは、コ
ムギ麦芽、ＨｅＬａ細胞のような哺乳動物細胞、大腸菌及びウサギ網状赤血球で
ある。結合転写翻訳系は、大腸菌突然変異細胞ＭＵＴＤ５−ＦＩＴ(Irving等, 1
996)から抽出でき、それは突然変異化ＤＮＡＱ遺伝子を有し、それ故プルーフリ
ーディングエラーの結果として複製の間ＤＮＡ内に導入されるさらなるランダム
な突然変異を可能にする。一つの好ましい転写／翻訳混合物は、ウサギ網状赤血
球溶解物である。結合系に対するＧＳＳＧの添加は、ディスプレーされたタンパ
ク質の正確なホールディングを増大し、それ故カウンターレセプターまたは抗原
に対する後の結合及び選択を促進する。

【００５５】Ｑβレプリカーゼによる突然変異Ｑβレプリカーゼは、ランダムな突然変異を取り込んだ高レベルのｍＲＮＡの
複製及び生産のために系中に含まれる（図３参照）。複数コピーの一本鎖ＲＮＡ
鋳型が、Ｑβレプリカーゼによる突然変異で単一の標準的構成成分に複製される
；しかしながら、両方の鎖は、等温条件の下で鋳型として同等に効果的である。

【００５６】本分野の教示により、Ｑβのようなファージから由来する全長ＲＮＡ中に存在
する複合体並びに二次及び三次構造が、タンパク質開始部位へのリボソームの接
近を制限することが示されている。しかしながら我々は、より小さいＲＮＡ配列
が、レプリカーゼの結合に適しており、それ故全長鋳型の代わりに使用できるこ
とを見出した。好ましい配列は、シュードノットとして周知である小さな合成Ｒ
ＮＡ(Brown及びGold 1995;1996)であり、それはＱβレプリカーゼによる増幅と
適合的である。本発明の文脈において、シュードノットの使用は、ＲＮＡ及びそ
れに融合した配列のＱβレプリカーゼ増幅に必要かつ十分な結合部位を維持する
一方で、タンパク質開始部位へのリボソームの接近の問題を解消できる。

【００５７】翻訳及びリボソームディスプレーウサギ網状赤血球溶解物及びコムギ麦芽のような真核生物、または大腸菌のよ
うな原核生物のいずれかであるいくつかのin vitro翻訳法が周知である。これら
は商業的に入手可能であり、または周知の印刷された方法によって生産できる。
突然変異化ｍＲＮＡの翻訳は、好ましくはde novo合成タンパク質をコードする
特異的なｍＲＮＡを含む３成分リボソーム複合体中のリボソームに結合した、タ
ンパク質分子のライブラリーを生ずる(Mattheakis等, 1994)。タンパク質及びリ
ボソームからのｍＲＮＡの解離を妨げるためのいくつかの方法が周知である。例
えばスパルソマイシンまたは類似化合物が加えられてもよい；スパルソマイシン
は、研究された全ての生物においてペプチジルトランスフェラーゼを阻害し、リ
ボソームとの不活性な複合体の形成によって機能するであろう(Ghee等, 1996)。
高濃度のマグネシウム塩を維持すること、及びＧＴＰレベルを低下することもま
た、リボソーム／ｍＲＮＡ／タンパク質複合体を維持するのに寄与するであろう
；発現ユニットの構造に関しては、上述した。３成分リボソーム複合体を維持す
る好ましい手段は、コード配列の末端の翻訳停止コドンの省略である。

【００５８】さらに、二つの系における分子の正確なホールディングのための好ましい必要
性が存在する。原核生物については、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｐ
ＤＩ）及びシャペロンが、正確なホールディングを確実にするＣ末端アンカード
メインと並んで使用され得る。後者は、原核生物タンパク質がホールディングの
前にリボソームから放出されるために必要とされ(Ryabova等, 1997)、それ故ペ
プチドがリボソームに結合される場合に、全体のタンパク質はリボソームから距
離を取ることが必要とされる。これとは対照的に、真核生物系においては、タン
パク質は合成されながらホールディングされ、原核生物ＰＤＩ及びシャペロンを
加える必要はない；しかしながら我々は、ＧＳＳＧの特定の範囲の濃度の添加が
、３成分リボソーム複合体上での正確にホールディングされたタンパク質の増大
したディスプレーによるライブラリー選択に対して有益であることを見出した。

【００５９】選択及び競合的結合ＲＮＡ複製の連続的な周により、翻訳によってタンパク質のライブラリーを生
産するＲＮＡ分子のライブラリーが生じる。標的分子結合マトリックス（例えば
抗原皮膜Dynabead）が、３成分リボソーム複合体を捕獲するために反応に加えら
れる。ライブラリー中の個々のメンバーは、マトリックス(Dynabead)上に固定化
された抗原に対して競合する。より高い親和性を有する分子は、より低い親和性
分子に置換するであろう。該方法の終結時に、マトリックス(Dynabead)に結合し
た複合体（ｍＲＮＡ／リボソーム／タンパク質）は回収され得る。ｃＤＮＡが複
合体中のｍＲＮＡから合成され、コード化遺伝子配列からの高レベル発現に適し
たベクター中にクローン化される。

【００６０】リサイクリングフリーシステム(Spirin等, 1988)は、基質（リボソームを含む
）の供給を確実にするための一定温度のチェンバー及び試薬並びに必須でない物
質の除去を使用する連続的in vitro進化（ＣＩＶＥ）システムに適用できるであ
ろう。以下のものを含む全てのＣＩＶＥの工程は、このチェンバー内で生じ得る
：結合転写及び翻訳、突然変異化複製、３成分リボソーム複合体の表面へのde n
ovo合成タンパク質のディスプレー、及び最高の親和性の結合を有するものを選
択するための抗原に対する３成分リボソーム複合体上のディスプレーされたタン
パク質の競合的結合（図４）。非結合試薬、物質及びディスプレーされたタンパ
ク質は、洗浄緩衝液ですすぐことによって除去され、結合３成分リボソーム複合
体は、温度の上昇及び緩衝液からのマグネシウムの削除によって解離する。この
次に、洗浄緩衝液工程を除いて上述の全ての工程を実施するために必要な全ての
試薬の添加が行われる。スパルソマイシンまたは類似化合物の添加のようなタン
パク質及びリボソームからのｍＲＮＡの解離を妨げる方法が利用可能であり、マ
グネシウム塩の特異的濃度の維持及びＧＴＰレベルの低下は、反応温度の減少ま
たは停止コドンの削除と並んでリボソーム／ｍＲＮＡ／タンパク質複合体の維持
に寄与するであろう。連続的フロー性能と組み合わせた温度が制御される容器を
使用することによって、選択されたリボソームから得たｍＲＮＡは、リボソーム
から解離でき、スパルソマイシン、Ｍｇ等のようなリボソーム／ｍＲＮＡ／タン
パク質複合体の維持に重要な試薬の濃度を変化させて、さらに複製、突然変異、
及び翻訳されるであろう。図４は、上記装置の設計を表す。

【００６１】本発明は、以下の非制限的な実施例を参考としてより十分に記載されるであろ
う。

【００６２】

【実施例】

実施例１組換えＱβレプリカーゼ：発現と精製クローニング及び発現Ｑβレプリカーゼコード配列を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを使用するin vitr
oでの転写による感染性ＲＮＡの調製を可能にするようにデザインされた、つま
りファージＱβのＲＮＡゲノムのｃＤＮＡコピーである、ｐＢＲ３２２ベース構
築物であるプラスミドｐＢＲＴ７ＱβからＰＣＲによって増幅した(Barrera等,
1993に略記されている）。ｐＢＲＴ７Ｑβの配列は、図６に示されている。ヌク
レオチド番号１は、Ｑβレプリカーゼセンス鎖の第一のヌクレオチドである。Ｑ
βレプリカーゼを増幅するためのプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチ
ドは、酵素ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによる制限酵素切断のための部位をコードし
、その配列は図１１に示されている。

【００６３】ＰＣＲ産物を、この目的のために利用可能な商業的な製品のいずれか一つを使
用して精製した（例えばBresatec)。精製ＤＮＡを、標準的な分子生物学的方法
を使用して、ベクターｐＧＣ（図７）のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位内にクロー
ン化した。ベクターｐＧＣ及びそれからの組換えタンパク質の発現は、文献に記
載されており、参考としてここに取り込まれる(Coia等, 1996)。ＰＣＲ増幅及び
ベクターへのＱβレプリカーゼ遺伝子のクローニング及び酵素の発現のための大
腸菌へのトランスフォーメーションの方法は、培養培地に１ｍＭのイソプロピル
チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を加えることによって誘導されるｐＧＣ中のＱβ
レプリカーゼ遺伝子の発現というように、当業者に周知である。

【００６４】プロモーターＰＬでのｐＢＲ３２２ベースベクター中のＱβレプリカーゼ遺伝
子の発現及び精製は、以下に詳述されるように実施した。rep14 Billeter株を、
Christof Biebricher, Max Planck, Gottingenによって入手した。該大腸菌株を
、２％栄養ブロス、１．５％酵母抽出物、０．５％ＮａＣｌ、０．４％グリセリ
ン、１００ｍｇ／ｌアンピシリン中の２０ｌ発酵器において、３０℃で良好なエ
アレーションで光学密度２（６６０ｎＭ）に生育させた。温度を３７℃に上昇さ
せた後、エアレーションを５時間継続した。細胞を氷上で凍結し、遠心分離によ
って回収した（約１８０ｇの湿潤細胞重量が得られる）。

【００６５】Ｑβレプリカーゼの精製緩衝液Ａ：０．０５ＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．８）、１ｍＭメルカ
プトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセリン、１００ｍｇ／ｌアンピシリン。緩衝液Ｂ：０．０５ＭＨＥＰＥＳ．Ｎａ緩衝液（ｐＨ７．０）、１ｍＭメルカ
プトエタノール、２０％ｖ／ｖグリセリン。５０ｇの回収された大腸菌を、１００ｍｌの０．０５ＭＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩
衝液（ｐＨ８．７）、１ｍＭメルカプトエタノールで、高速ブレンダーでホモゲ
ナイズした。リゾチーム及びＥＤＴＡを、それぞれ１００μｇ／ｍｌ及び０．５
ｍＭの最終濃度で加え、該溶液を０℃で３０分穏やかに攪拌した。１２ｍｌの８
％デオキシコール酸ナトリウム、０．２４ｍｌのフェニルスルホニルフルオリド
（プロパノール−２中に２０ｍｇ／ｍｌ）、０．１５ｍｌのバシトラシン（１０
ｍｇ／ｍｌ）、０．１５ｍｌの０．１Ｍベンズアミジン、３．３ｍｌの１０％Ｔ
ｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００を加え、溶液を１０ｍＭの最終濃度にＭｇＣｌ₂で調節
した。高い粘性を高速度でブレンドすることによって減少した。固体のＮａＣｌ
を、０．５Ｍの最終濃度で加え、４．８ｍｌの０．３％ポリエチレンイミド（ｐ
Ｈ８）を攪拌しながら加えた。０℃で２０分の攪拌の後、懸濁液を１０，０００
ｒｐｍで３０分遠心分離した（ＧＳＡローター）。上清を５当量のＴｒｉｓ．Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．７）で希釈した後、１ｍＭメルカプトエタノール、１００ｍｌＤ
ＥＡＥセルローススラリー(緩衝液Ａで平衡化されたWhatman DE52）を加え、０
℃で２０分ゆっくりと攪拌した。攪拌しないで４０分のインキュベーションの後
、上清を沈殿物からデキャントし、廃棄した。沈殿物を緩衝液Ａ中に懸濁し、１
ｃｍの直径のガラスカラムに注ぎ、４００ｍｌのＴｒｉｓ．ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ
８．７）、１ｍＭメルカプトエタノールで洗浄し、２５０ｍｌの緩衝液Ａ＋１８
０ｍＭＮａＣｌで溶出し、分画を回収した。該分画を、次の結合アッセイで使用
するＱβレプリカーゼの存在についてアッセイした。

【００６６】酵素配置アッセイ：Ｑβレプリカーゼに対するビオチニル化ＲＮＡの結合これは、正に荷電された膜に維持されている酵素に結合するビオチンラベル化
ＲＮＡに依存する複製酵素を検出するように開発された非放射性活性アッセイで
ある：一方で、同じ条件の下で遊離ビオチンラベル化ＲＮＡは、膜に維持されな
い。ＤＮＡ及びＲＮＡは、製造者の説明書に従ってソラレン−ビオチン(Ambion)
でラベルされた。次いでラベル化ＲＮＡを、Ｑβレプリカーゼの配置を検出する
ために以下のアッセイに示されたようにカラム溶出物（サンプル分画）に加えた
。

【００６７】以下の物質をエッペンドルフチューブ中で混合した：１０μｌカラム溶出分画１０μｌ０．５Ｍ１２０ｍＭＭｇＣｌ₂を含むＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４
）１０μｌ２ｍＭＡＴＰ１０μｌ５ｍＭＡＴＰ１０μｌ〜１００ｎｇ／ｍｌソラレン−ビオチンラベル化プローブＲＮＡ５０μｌ水反応混合物を３７℃で１分インキュベーションした。反応混合物を、ナイロン膜、例えばハイボンドＮにドットブロットし（酵素Ｑ
βレプリカーゼに結合したＲＮＡまたはＤＮＡのみが、膜に維持されるであろう
）、１２ｍＭＭｇＣｌ₂を含む５０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌｐＨ７．４で洗浄し、
自動セットでStratalinker中でナイロン膜にＵＶ架橋した。BrightStar Biodete
ctキットを、ナイロン膜上に付着したビオチニル化核酸の検出のために使用した
。図１２は、ＤＥ５２カラムからの溶出分画のアッセイを示す。

【００６８】活性分画をプールし、一当量の緩衝液Ａで希釈し、緩衝液Ａ＋０．１ＭＮａ
Ｃｌに平衡化されたDEAE-Sepharose FFの３５ｍｌカラムに適用した。酵素を、
緩衝液Ａ中の０．１−０．４ＭＮａＣｌの直線勾配で溶出した。活性分画をプ
ールし、固体の（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄（３９ｇ／１００ｍｌ溶液）の添加により酵素
を沈降し、遠心分離によって回収し、４ｍｌの緩衝液Ｂに溶解した。

【００６９】酵素を、伝導率が緩衝液Ｂ＋０．２ＭＮａＣｌのもの未満になるまで希釈し
、緩衝液Ｂで平衡化されたFractogel EMD SO3の１００ｍｌカラムに適用し、緩
衝液Ｂ中の０．２−０．８ＭＮａＣｌの直線勾配（５００ｍｌで２回）で溶出
した。約０．６５ＭＮａＣｌで溶出された活性ピークをプールし、固体の（Ｎ
Ｈ₄）₂ＳＯ₃（３９ｇ／１００ｍｌ溶液）で沈降し、遠心分離によって回収し、
１０ｍｌの緩衝液Ａ＋５０％グリセリン中に溶解した。溶液を−８０℃で貯蔵し
た。

【００７０】以下の工程は、Sumper & Luce (1975)に従ってスモールスケールで実施された
。４ｍｇのＱβレプリカーゼを、緩衝液Ａ（希釈され塩を除去するように透析さ
れた）で平衡化されたQAE-Sephadex〜A-25の１．６×１４．５ｃｍカラムに適用
し、緩衝液Ａ中の０．０５−０．２５ＭＮａＣｌの２×２００ｍｌ勾配で溶出
した。二つのきれいに分離されたコアとホロ酵素のピークをプールし、緩衝液Ａ
で１：１に希釈し、QAE-Sephadexカラムに適用した。コアについて２ｍｌ、ホロ
酵素について６ｍｌをそれぞれ緩衝液Ａ＋５０％グリセリンで洗浄し、レプリカ
ーゼを緩衝液Ａ＋５０％グリセリン＋０．２Ｍ（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄で濃縮形態に溶
出した。活性分画を−８０℃で貯蔵した。ＲＮＡによる装置のコンタミネーショ
ンを避けるように注意を払った。

【００７１】実施例２真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中へのＱβレプリカーゼのクローニングＱβレプリカーゼコード配列を、真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１（図
９）中にクローン化し、ｐＣＤＮＡＱβと名付けられたベクターを生産した。こ
のベクターを、結合転写／翻訳系及び付随する標的ＲＮＡの複製／突然変異にお
けるin situでのＱβレプリカーゼの発現のために使用した。真核生物発現ベク
ターｐＣＤＮＡ３．１中のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位内へのクローニング
のためのＱβレプリカーゼのＰＣＲ増幅でのプライマーとして使用されるオリゴ
ヌクレオチドの配列は、以下のものであった： #5352 5'TCTGCAGAATTCGCCGCCACCATGTCTAAGACAGCATCTTCG #5350 5'TTTATAATCTGCGGCCGCTTACGCCTCGTGTAGAGACGC

【００７２】Ｑβレプリカーゼｂサブユニットのコード配列を、標準的な分子生物学的方法
によってｐＣＤＮＡ３．１中にクローン化した(Sambrook等, 1989)。クローン化
配列を、ＤＮＡ配列分析によって確認した。ウサギ網状赤血球結合転写／翻訳系
におけるＱβレプリカーゼの発現に引き続き、結合転写翻訳キット(Promega及び
Novagen)の商業的供給者並びにTranscend(Promega)の供給者によって示唆された
ように、標準的転写／翻訳反応におけるde novo合成Ｑβレプリカーゼ内に取り
込まれたビオチニル化リシン(TRANSCEND, Promega)の検出を実施した。結合反応
のインキュベーション工程の完成時に、２０μｌの反応物を、２ｍｌの１０×Ｓ
ＤＳサンプル緩衝液で９０℃に加熱し、サンプルをＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）にかけた。これに引き続きウエスタンブロッテ
ィングを実施し、de novo合成ビオチニル化Ｑβレプリカーゼバンドを、TRANSCE
NDキット検出試薬で検出した。この発現の結果が、図１２のゲルのスキャンに示
されており、Ｑβレプリカーゼがゲルの正確なサイズでビオチニル化バンドによ
って示されるように合成されていることが確認できる。

【００７３】次いで我々は、１Ｃ３鋳型で結合転写／翻訳反応を実施したが、同じ反応でｐ
ｃＤＮＡ３．１からＱβレプリカーゼを発現した。発現ベクターｐＣＤＮＡＱβ
からin situで合成されたＱβレプリカーゼは、０．５ｍＭ塩化マグネシウムの
存在下で結合系で１Ｃ３ｓｃＦｖの増大した合成を生じた：これは上述のよう
にビオチニル化リシンの取り込みによって測定された（図１２ｂ）。塩化マグネ
シウムの存在は、転写／翻訳因子に対するＱβレプリカーゼの活性の依存性をゆ
るめることが以前に示されている。

【００７４】実施例３転写のためのＤＮＡ鋳型のＰＣＲによる構築ＤＮＡ配列を、ＦＴＳ−１熱シークエンサー(Corbett Research)、ＰＥ２４０
０(PerkinElmer)またはRobocylcer勾配９６(Stratagene)のいずれかを使用して
、製造者の説明書に従ってＴａｑ、Ｔｔｈ、Ｔｆｌ、ＰｗｏまたはＰｆｕポリメ
ラーゼを用いて、標準的かつ十分に記載された方法（特異的にデザインされたオ
リゴヌクレオチドプライマー、スプライスオーバーラップ伸長、制限酵素切断等
を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ））によって増幅した。使用されるオ
リゴヌクレオチドプライマーのリストは、図１１に示されている。生産物をBres
aClean(Bresa)を使用してゲル精製し、または結合転写及び翻訳反応に直接使用
した。

【００７５】ＤＮＡ配列を、構築物の３’末端に伸長を提供する、ベクターｐＧＣ０３８Ｃ
Ｌ（図７ａ）またはｐＧＣＣＨ（図７ｂ）のいずれか中にクローン化されてい
る開始鋳型から増幅した。この伸長は、マウスモノクローナル（１Ｃ３；配列は
図５ａ）から由来する定常領域、またはヒトＩｇＭ抗体（配列は図５ｂ）から由
来する定常領域のいずれかであった。増幅のために使用される正方向の（センス
）プライマー（抗ＧｌｙＡｓｃＦｖについてN5266；抗ＨｅｐＢｓｃＦｖにつ
いてN5517またはN5384, N5344及びN5343）は、転写開始部位、並びに翻訳開始部
位及びリボソーム結合部位を提供した。逆方向の（アンチセンス）プライマー（
マウス定常領域についてN5267；ヒト定常領域についてN5385）は、ｍＲＮＡ−リ
ボソーム−タンパク質複合体を会合したままにするために、停止コドンを含まな
かった。正方向及び逆方向のプリマーの両者は、生産断片のクローニングを可能
にする制限酵素部位（特異的にそれぞれＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ）を提供した。

【００７６】ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼに対するいくつかのプロモーター配列のいず
れかが、転写に向けるために使用され得る；しかしながら、以下の配列が好まし
い二つのものであった（これらは翻訳開始配列を含む：以下参照）：ａ） GCGCGAATACGACTCACTATAGAGGGACAAACCGCCATGGCC ｂ） GCAGCTAATACGACTCACTATAGGAACAGACCACCATGGCC

【００７７】これらの配列は、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを、結合転写／翻訳
系の二つの選択的なフォーマットでＲＮＡ転写産物を生産させるように向けた。

【００７８】リボソーム結合部位をコードする配列は周知であり、グリコホリンに結合する
ｓｃＦｖ（１Ｃ３；図５ｃ）またはＢ型肝炎表面抗原を結合するｓｃＦｖ（４Ｃ
２；図５ｄ）のいずれかをコードするリボソームディスプレーに対する興味ある
分子の配列のいずれか一つの上流で、鋳型中に含まれている。同じ配列は、リボ
ソームディスプレーのために興味あるいずれかの他の配列の上流で、鋳型中に含
まれている（例えばＣＴＬＡ−４ベースライブラリー配列）。

【００７９】実施例４ウサギ網状赤血球溶解物セルフリー系における結合転写／翻訳及びリボソームデ
ィスプレー転写及び翻訳を、０．５ｍＭ酢酸マグネシウム、０．０２ｍＭメチオニン及び
３ｍＭ酸化グルタチオン（ＧＳＳＧ）を含むＴＮＴＴ７結合転写／翻訳系(Prom
ega)を使用して、Siliconized Rnase-フリー０．５ｍｌチューブ(Ambion)で実施
し（以下の実施例６参照）、混合物を６０℃で９０分インキュベーションした。
いくつかの反応においては、１０ｍＭまでの還元グルタチオンもまた加えた。Ｑ
βポリメラーゼを含む反応において、混合物はまた、０．５ｍＭの最終濃度まで
塩化マグネシウムを含んだ。転写及び翻訳の後、混合物をＰＢＳで希釈し、ＤＮ
アーゼＩで処理していずれかの残存する開始ＤＮＡ鋳型を除去した。これは、４
０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ７．５）、６ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＮａＣｌ及びＤ
ＮアーゼＩ(Promega)の添加、引き続き３０℃でさらに２０分のインキュベーシ
ョンにより達成された。

【００８０】実施例５ Dynabeadを使用する抗原に対するリボソーム３成分複合体ディスプレータンパク
質の選択トシル活性化Magneticビーズ(Dynal)を、製造者の説明書に従ってグリコホリ
ンＡ（ＧｌｙＡ；Sigma)、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨｅｐＢＳＡ；BiosPacific, Em
eryville, CA USA)またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ；Sigma)に結合した。ス
トレプタビジン磁性ビーズを使用する場合、これらは製造者の説明書に従って、
EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin(Pierce)を使用してビオチニル化されている抗原
（上述）に結合された（製造者の説明書に従って）。

【００８１】特異的に結合するｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質複合体を選択するために
、２−３μｌの抗原結合（トシル活性化またはストレプタビジン皮膜化）磁性ビ
ーズを、最終翻訳混合物に加え、ビーズの鎮静を避けるために穏やかに攪拌しな
がら室温で９０分プレートシェイカー(Raytek Instruments)に配置した。磁性粒
子回収器(Dynal)を使用してビーズを回収し、これらを、１％Ｔｗｅｅｎ及び５
ｍＭ酢酸マグネシウムを含む冷却リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）ｐＨ７．４で
３回洗浄した。次いでビーズを冷却滅菌水で１回洗浄し、最後に１０μｌの滅菌
水に懸濁した。

【００８２】選択された複合体からのｃＤＮＡの合成のため、２μｌの最終ビーズ懸濁液を
、製造者の説明書に従ってAccess RT-PCRシステム(Promega)またはTitan One-チ
ューブRT-PCRシステム(Boehringer Mannheim)のいずれかを使用してＲＴ−ＰＣ
Ｒ反応に使用した。この反応に使用されるプライマーは、オリジナル正方向（セ
ンス）プライマー（開始鋳型ＤＮＡ；抗ＧｌｙＡｓｃＦｖについてN5266；抗Ｈ
ｅｐＢｓｃＦｖについてN5517またはN5384, N5344及びN5343を生産するために
使用される）、並びにオリジナルプライマーの上流の逆方向（アンチセンス）プ
ライマー（マウス定常領域構築物についてN5268及びN5269；ヒト定常領域構築物
についてN5386及びN5387）を含んだ。ある場合、より短いプライマー（抗Ｇｌｙ
ＡｓｃＦｖ定常軽鎖領域構築物についてN5941及びN5942）を、パンニングされ
たＲＮＡ鋳型を回収するために使用した。

【００８３】選択のさらなるサイクルのため、このＤＮＡをゲル精製し（ある場合単純に希
釈し）、開始ＤＮＡ鋳型を生産するためにオリジナルのＰＣＲに存在している正
方向及び逆方向のプライマーを使用して、さらなるＰＣＲにおいて取り込ませた
。次いでこの新たな鋳型は、適切な開始部位を含み、第一の選択中の鋳型と同じ
長さを有するために、上述のようにさらなる選択において使用することができた
。

【００８４】上述の方法が、特異的な分子を選択するために使用できることを示すために、
ＧｌｙＡに特異的に結合するマウス定常軽鎖領域に融合された一本鎖Ｆｖ（ｓｃ
Ｆｖ）を、Ｔ７転写開始部位及びリボソーム結合部位の付加を可能にするプライ
マーを使用して増幅した。この鋳型（Ｔ７−ｓｃＦｖ）を、上述のような結合転
写／翻訳反応で使用し、次いで三つに分割し、ＨｅｐＢＳＡ、ＧｌｙＡまたは
ＢＳＡ結合磁性ビーズのそれぞれと混合した。ビーズを洗浄し（上述の通り）、
回収されたｍＲＮＡ−リボソーム−タンパク質複合体を、ｃＤＮＡの合成のため
に使用した。この実験の結果は、各レーンにおいて正確なサイズを有する生産物
の存在を示した。ＨｅｐＢＳＡ及びＢＳＡレーンで観察された非特異的結合は
、おそらく翻訳の間で合成された生産物の凝集のためであろう。網状赤血球溶解
物を使用して合成された生産物の一定割合のみが正確にホールディングされ活性
形態であることは、他者によって観察されている。この問題は、以下の実施例６
で説明する。

【００８５】この実験から得られたＧｌｙＡ特異的生産物をゲル精製し、さらなる周の選択
のためのよりたくさんの鋳型を合成するためにＰＣＲによって再増幅した。第二
の周のパンニングにより、ＧｌｙＡ結合磁性ビーズでプローブされたサンプル中
に特異的な生産物が優勢に示された。このことは、第二の周の選択によって、回
収された生産物がＧｌｙＡに特異的であることを示した。

【００８６】実施例６酸化及び／または還元グルタチオンを加える効果 in vitro転写及び翻訳の間でより高い割合の正確にホールディングされた生産
物を誘導する試みにおいて、各種の濃度の還元または酸化グルタチオンのそれぞ
れを反応混合物に加えた。これらの反応に使用される鋳型は、抗ＧｌｙＡＴ７
−ｓｃＦｖであり（上述の通り）、選択をＧｌｙＡ結合磁性ビーズを使用して実
施した。この実験は、回収された生産物の量が、５ｍＭまで増大する濃度の酸化
グルタチオンで増加することを示した。１０ｍＭまでのさらなる増加は、回収さ
れた生産物の収率に有害な効果を有した。約２ｍＭの酸化グルタチオンの濃度が
、ほとんどの転写及び翻訳において含まれた。

【００８７】すでに２ｍＭの酸化グルタチオンを含む反応に対して５ｍＭ及び１０ｍＭの還
元グルタチオンのさらなる添加が、５ｍＭのグルタチオンの添加によりコントロ
ールパンニングに対してＧｌｙＡパンニングから回収された生産物の増大した量
を導くディスプレーされた抗ＧｌｙＡｓｃＦｖのより適したホールディングを
生ずるようであることを示したことが、後者の結果により明らかにされた。還元
グルタチオンの濃度を０．５ｍＭまでさらに減少することは、同様な効果を示し
た。

【００８８】実施例７リボソーム上での突然変異ｖ−ドメイン（ＣＴＬＡ−４）ライブラリーのディス
プレーリボソームディスプレーが、ポリペプチドライブラリーから結合エレメントを
選択するために使用できることを示すため、ＣＴＬＡ４突然変異体のライブラリ
ーを、定常重鎖ドメインの付加が可能であるプラスミドｐＧＣＣＨ（図７ｂ）
にライゲートし、次いでこのライブラリーをプライマーN5659とN5385を使用する
ＰＣＲによって増幅した（図１１）。プライマーN5659を、必要な上流転写及び
翻訳開始配列を加えるために使用した。次いでこのＰＣＲＤＮＡを、実施例４
に記載された方法を使用する結合セルフリー翻訳系における転写及び翻訳のため
の鋳型として使用した。突然変異体ＣＴＬＡリボソーム複合体の結合を示すため
に、Ｂ型肝炎抗原（ＨＢＳＡ）、グリコホリンＡ（ＧｌｙＡ）及びウシ血清アル
ブミン（ＢＳＡ）皮膜Dynabeadを使用してパンニングを実施した。次いで結合複
合体に付着したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによって回収した。パンニング、選択及
び回収のために使用された方法は、上記された（実施例５）。

【００８９】ＣＴＬＡ４ベース突然変異体のサイズにほぼ相当する生産物を回収し、それは
ＣＴＬＡ４ライブラリーが、ＨＢＳＡ、ＧｌｙＡ及びＢＳＡを特異的に結合する
タンパク質をコードするＤＮＡを含むことを示した。これらの生産物を、可溶性
産物のＤＮＡシークエンシング及び発現のために、ベクターｐＧＣＣＨ（図７
ｂ）内にクローン化した。標準法を使用するシークエンシング(BigDye Teminato
r Cycle Sequencing; PE Applied Biosystems CA)は、ＣＴＬＡ４ベース特異的
インサートが存在することを示した。さらに、ＥＬＩＳＡを使用する実験は、特
異的な反応性タンパク質が、組換え培養物によって発現されていることを示した
。これらのアッセイにおいて、ＧｌｙＡ皮膜Dynabeadを使用したパンニング及び
ＧｌｙＡ皮膜プレートを使用したＥＬＩＳＡによるスクリーニングによって単離
された組換え体が、ＢＳＡ皮膜Dynabeadを使用したパンニングによって単離され
た同様に試験された組換え体より、強いシグナルを与えた。

【００９０】実施例８結合転写及び翻訳中にＱβレプリカーゼを含ませる効果生産物の収率の増大、及びin vitro翻訳の間の生産物中の突然変異の速度の増
大の両者を試みるために、Ｑβレプリカーゼ（二つの形態のいずれか）を、反応
混合物に加えた。レプリカーゼは、精製レプリカーゼタンパク質、または結合転
写／翻訳反応の間に同時に合成できるＴ７転写プロモーター（ｐＣＤＮＡＱβ）
の制御の下の遺伝子鋳型のそれぞれとして含まれた。この反応のために使用され
る鋳型は、再び抗ＧｌｙＡＴ７−ｓｃＦｖ（上述の通り）であり、選択はＧｌ
ｙＡ結合磁性ビーズを使用して実施された。これらの実験は、回収されたＧｌｙ
Ａ反応性生産物の量が、精製Ｑβレプリカーゼの付加により増大し（Ｑβレプリ
カーゼを含まないコントロールに対して）、より少ない量でＱβレプリカーゼコ
ードゲノム鋳型（ｐＣＤＮＡＱβ）の付加により増大することを示した。

【００９１】突然変異がｓｃＦｖ配列中に挿入されているかどうかを測定するために、各レ
ーンから得た主生産物をゲル単離し、精製した。ＤＮＡをＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ
で切断し、同時に切断したｐＧＣベクターにライゲートし、標準的なプロトコー
ルを使用して大腸菌にトランスフォームした。ＤＮＡを各シリーズから得た組換
え体から単離し、各シリーズから得た６のランダムなクローンを、標準的な方法
を使用してＤＮＡシークエンシングにかけた(BigDye Terminator Cycle Sequenc
ing; PE Applied Biosystems CA)。各レーンに対しおよそ２８０塩基対をシーク
エンスし、図１４はこれらの配列中の突然変異中の数と位置を示す。この実験は
、Ｑβレプリカーゼの存在下での転写及び翻訳の後、増大した数の突然変異の導
入を示した（使用された形態のそれぞれで）。

【００９２】実施例９人工的Ｑβ配列の添加Ｑβレプリカーゼ活性の効率を増大する試みにおいて、特異的Ｑβ結合部位を
、ＰＣＲによって抗ＧｌｙＡＴ７−ｓｃＦｖ鋳型の５’および３’末端の両者
に加えた。この新しい鋳型（プライマーN5904及びN5910（センス）並びにN5909
（アンチセンス）で増幅された；図１１）を、精製Ｑβレプリカーゼタンパク質
、または結合転写／翻訳反応の間同時に合成できるＴ７転写プロモーターの制御
の下での遺伝子鋳型としてのいずれかで、Ｑβレプリカーゼを含む結合転写／翻
訳反応において使用した。ＨｅｐＢ、ＧｌｙＡまたはＢＳＡ結合磁性ビーズを使
用する選択を実施し、生産物をＲＴ−ＰＣＲの後に回収した。人工Ｑβステムル
ープ配列の存在は、（ｉ）結合転写、翻訳及び選択に対して負の影響を有さず、
（ｉｉ）ほとんどの場合選択の後のＲＴ−ＰＣＲによって回収された生産物の量
を増大した。

【００９３】実施例１０結合転写／翻訳ウサギ網状赤血球系における、Ｑβレプリカーゼによる抗グリコ
ホリンｓｃＦｖ転写産物の複製リボソームディスプレーのためのＴ７−１Ｃ３及びＴ７−４Ｃ２ｓｃＦｖ鋳
型を、実施例３に記載されたように構築し、以下の条件の下で結合転写／翻訳に
かけた。標準的な結合転写／翻訳反応を、Ｑβレプリカーゼの添加によって修飾
した（実施例１に記載されたように精製されたもの）。標準的な２０μｌ反応物
において、２０μｇ／ｍｌの酵素の１ｍｌを加えた。以前に我々は、結合系にお
いて抗ＧｌｙＡ１Ｃ３ｓｃＦｖと抗Ｈｅｐｂ４Ｃ２ｓｃＦｖの複製に対する
Ｑβレプリカーゼの効果を比較し、１ｍｌのこのサンプルが最適な複製を提供す
ることを観察した。塩化マグネシウムを、０．５ｍＭの最終濃度で加え、これは
転写／翻訳因子に対する必要性を減少することが印刷されたレポートに示されて
いる。反応を３７℃で２時間継続させた。３０℃で２０分での４０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、６ｍＭＭｇＣｌ₂、１０ｍＭＮａＣｌ中のＤＮＡア
ーゼＩ切断によってＤＮＡ鋳型を除去した後、複製転写産物をＲＴ−ＰＣＲによ
って分析した。ＤＮＡアーゼＩ及び他のタンパク質を除去するために、標準的な
フェノール抽出を使用した。サンプルをエタノール沈降し、ＲＮＡ沈降物をＲＮ
Ａアーゼを含まない水中に溶解した。各鋳型に特異的なプライマー（実施例３参
照）を使用してＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲでアッセイし、ＰＣＲ生成物（ＤＮＡ）を
アガロースゲル電気泳動によって比較した。ＤＮＡバンドを、エチジウムブロマ
イドで染色することによって顕視化した。アガロースゲルを、ゲルプロ分析器の
商業的なソフトウェアーでデジタル化したイメージをスキャンすることによって
デンシトメトリーにかけた。図１３は、アガロースゲルのデンシトメータートレ
ースを示し、これから精製Ｑβレプリカーゼを含むサンプル中で、生産された鋳
型の量の増大が存在することが示される。

【００９４】実施例１１Ｔ７ポリメラーゼ転写産物からの、Ｑβレプリカーゼによる抗グリコホリンｓｃ
Ｆｖ及び抗Ｂ型肝炎ｓｃＦｖの複製及び突然変異；Ｑβレプリカーゼは、ＲＮＡ
依存性ＲＮＡ複製の間で転写産物を突然変異する。上述の実施例において記載された結合転写／翻訳反応に、Ｑβレプリカーゼ精
製酵素を補い、Ｔ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより転写された抗Ｇｌ
ｙＡ１Ｃ３ｓｃＦｖＲＮＡを複製し突然変異した。転写／複製／突然変異／
翻訳インキュベーションに引き続き、サンプルをＤＮＡアーゼＩで処理し、この
酵素を実施例１０に記載されたように除去した。次いで精製ＲＮＡを、実施例３
に記載された反応において抗ＧｌｙＡｓｃＦｖ特異的プライマーと共に、ＲＴ
−ＰＣＲ反応のための鋳型として使用した。これらの反応で使用された熱安定性
ポリメラーゼは、製造者の説明書に従って使用される高性能vent, pfuポリメラ
ーゼ酵素の一つである。ＰＣＲ反応生産物を、上述の商業的に入手可能なキット
の一つで精製し、精製ＤＮＡを、商業的に入手可能なプラスミドpCRscriptにラ
イゲートし、標準的な分子生物学的方法を使用してコンピーテント大腸菌XL1Blu
e細胞にトランスフォームした。トランスフォーメーション反応物を、X-galを含
むＹＴアガープレート上に配置した。一晩のインキュベーションの後、コロニー
（複数クローニング部位にＤＮＡ挿入物を含むプラスミドを有する大腸菌）を拾
い、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＹＴブロスの５ｍｌ中で３７℃で一
晩生育させた。ＤＮＡを、製造者の説明書に従って、商業的なキット(Quiagen)
で培養物のそれぞれから抽出した。精製ＤＮＡを、ＤＮＡシークエンシングによ
り分析した：シークエンシングの結果が図１６に記載されている。この表は、突
然変異体の数分のサンプリングを表す配列のランダムなサンプル中の突然変異と
、全体のＱβレプリカーゼ複製／突然変異反応の配列変化を示す。

【００９５】図１２鋳型ＲＮＡの予測二次構造ＲＮＡ鋳型についてＱβレプリカーゼによって好まれるＲＮＡ配列及び推定の
二次構造が報告されている(Zamora等, 1995)。これらまたは関連する好ましい構
造が、連続的in vitro進化のための鋳型中に存在するかどうかを測定するために
、上流非翻訳配列、Ｔ７プロモーター配列、１Ｃ３遺伝子をコードする配列、定
常軽鎖アンカー領域遺伝子、抗ｈｅｐｂ４Ｃ２ｓｃＦｖ遺伝子及びＩｇＭヒト
定常重鎖アンカー領域遺伝子を、Ｍｆｏｌｄプログラムで分析し(Zucker等, 199
1)、Ｑβレプリカーゼが好む構造と比較した（図８に示されている）。この比較
から、１Ｃ３ｓｃＦｖは、ＣＬアンカー領域と同様に、ＱβレプリカーゼのＭ
部位構造を模倣した内部ＲＮＡ二次構造を有することが同定され、Zamora等, 19
95によって報告された好ましい合成配列との類似性が示された。これは、Ｑβレ
プリカーゼによる抗Ｈｅｐｂ４Ｃ２ｓｃＦＶＣＨ３のものに対して、ＧｌｙＡ
１Ｃ３ｓｃＦｖ CL鋳型の好ましい複製を説明する（実施例３参照）。それ故
、この領域をコードするＲＮＡは、Ｑβレプリカーゼ複製、並びにこの領域とそ
の遺伝学的融合物の関連する突然変異を促進し増大するために、ＣＬ領域遺伝子
は、結合転写／翻訳ディスプレーといずれかの突然変異誘発のためのディスプレ
ーされた分子に対するアンカー領域として提案される。

【００９６】実施例１３ pLysN-NS5B(83kDa, pI〜9.05)のための発現プロトコール pLysN-NS5Bは、Ｔ７プロモーターを有する細菌（細胞質性）発現ベクターであ
る。NS5Bは、非構造的ＨｅｐＣＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼである。NS5B
を、Gly-Ser-Gly-Ser-Glyリンカー、１０のHis残基並びにAsp-Asp-Asp-Asp-Lys
リンカーが引き続くもの(GSGSGH10D4K)によって分離されたＮ末端でLysN部分に
融合する。

【００９７】このプラスミドを、大腸菌株HMS174(DE3)pLysS中にトランスフォームし、1YT/
Amp_100μg/ml／クロラムフェニコール_34μg/mlアガープレートで３７℃で培養し
た。単一のコロニーを選択し、ブロス1YT/Amp_100μg/ml／クロラムフェニコール _34μg/ml 中で３７℃で一晩培養した。発現のため、一晩の開始培養物を、１２０
ｒｐｍで２Ｌ攪拌フラスコ中で３７℃で1YT/Amp_100μg/ml／クロラムフェニコー
ル_34μg/ml中にＡ６００＝０．１に希釈してサブカルチャーした。培養物を、Ａ
６００が０．８−１．０になるまで生育させ、次いで１ｍＭＩＰＴＧで誘導し
、Ａｍｐ１００μｇ／ｍｌを補い、３７℃で４−５時間発現を進行させた。

【００９８】培養物を回収し、事前に冷やしたローターで４℃で５０００ｇで遠心分離した
。回収された培養物の湿潤重量を測定し、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
約３−４グラムが、細胞培養物のリットル当たり生産された（湿潤重量）。

【００９９】溶解及び精製プロトコール HepC RdRp(NS5B)の抽出を、細胞を溶解し、引き続き従来のタンパク質化学法
によって達成した。

【０１００】凍結した細胞ペレットに対し、細胞ペレットのグラム当たり４℃で５ｍｌの緩
衝液Ｃ（新たに作製された）を加えた。培養物が完全に懸濁されるまで、混合物
を磁性ビーズを使用して４℃で攪拌した。次いで培養物を、各破壊の間で１分の
間隔で、それぞれ１０秒間の１１回の破壊を使用してソニケートし、ソニケーシ
ョン工程の間で磁性ビーズを使用した攪拌を継続した。ソニケートされた細胞を
、４℃で２０分の７５０００ｇで遠心分離し、上清（溶解物）を回収した。

【０１０１】３０％の飽和ＡｍＳＯ₄を溶解物に加え、次いで１５分間１００００ｇで遠心
分離した。これは、いくらかの細菌タンパク質を除去するように機能した。ペレ
ットを捨て、上清に５０％の飽和ＡｍＳＯ₄を加え、１５分間１００００ｇで再
び遠心分離した。これは、高い割合の大腸菌タンパク質からNS5Bを沈降するよう
に機能した。上清を捨て、ペレットを緩衝液Ｃの初めの量の半分に再懸濁した。
これを４℃で一晩緩衝液Ｃにおいて透析した。

【０１０２】各工程から得た等量物を、ＳＤＳＰＡＧＥで分析し、〜90kDaのHepC RdRpバ
ンドの部分的精製を確認した。

【０１０３】透析抽出物を、緩衝液Ｃで事前に平衡化されたHyper D"S"樹脂を有するカチオ
ン交換カラムに乗せた。次いでカラムを、安定なベースラインが得られるまで緩
衝液Ｃで洗浄した。１ＭＮａＣｌでの緩衝液Ｃの段階的勾配で溶出を実施した
。NS5Bは、６００ｍＭのＮａＣｌ濃度に相当する５０％のＮａＣｌ比で溶出する
ことが見出された。

【０１０４】溶出分画を１０％ＳＤＳＰＡＧＥで分析し、精製を確認した。NS5Bはこの工
程により、マイナーなより小さい分子量の混在タンパク質を含む９０％の均一性
まで精製された。

【０１０５】精製NS5Bを、５０％の飽和ＡｍＳＯ₄で濃縮し、ペレットを再溶解するのに十
分な緩衝液Ｃ（ＴｒｉｓｐＨ７．４を有する）中に再懸濁した。次いでこれを
同じ緩衝液で透析し、ＡｍＳＯ₄を除去した。

【０１０６】この純度のNS5Bは、緩衝液Ｃ（Ｔｒｉｓ）中の予備的Superose 12カラムでの
サイズ排除クロマトグラフィーによるさらなる精製が、任意ではあるが必要とさ
れない程度であった。

【０１０７】緩衝液（ソニケーション、溶解、溶出、透析）緩衝液Ｃ５０ｍＭ^★★★Na-PO4 pH6.8 Na2HPO4 ２．３２ｍｌ（またはTris pH6.8 NaH2PO4について置換２．６９ｍｌ）１００ｍＭＮａＣｌ０．５８４４ｇ１０％グリセリン１０ｍｌ１０ｍＭｂ−メルカプトエタノール７０μｌ０．０２％ＮａＮ３８０μｌ０．２５Ｍショ糖８．５６ｇ０．１％界面活性剤（β−オクチルグルコピラノシド）０．１ｇ１ｍＭ Pefe-Bloc ０．１ｇ Complete^TM錠剤(No EDTA) ２錠Ｈ２Ｏ１００ｍｌまで

【０１０８】精製タンパク質のＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（１２．５％アク
リルアミド）及びタンパク質のクマシーブルー染色により、約７０ｋＤａの単一
のバンドが示された。

【０１０９】 HepC RdRp(NS5B)を数多くのプロトコールによってアッセイした。最も単純な
方法は、Novagen Large Scale Transcription Kit(TB069)に依存する。このプロ
トコールの修正した形態は、成功して使用されている。この方法は、以下のよう
に略記される。

【０１１０】Ｔ７／Ｔ３／ＳＰ６プロモーターの上流で切断された二本鎖ＤＮＡ鋳型を、Ｒ
ＮＡ鋳型を作製するためにＴ７ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの存在下で使
用する。次いで同じ混合物中でHepC RdRp(NS5B)は、Ｔ７ポリメラーゼによって
生産されたＲＮＡを増幅する。

【０１１１】ＤＮＡ鋳型（０．５μｇ／ｍｌ）１μｌ（０．５ｎｇ）ＡＴＰ（２０ｍＭ）１０μｌＣＴＰ（２０ｍＭ）１０μｌＧＴＰ（２０ｍＭ）１０μｌＵＴＰ（２０ｍＭ）１０μｌ５×転写緩衝液（４００ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、６０ｍＭＭｇＣｌ２、５０ｍＭＮａＣｌ）２０μｌ１ＭＤＴＴ（１Ｍ）１μｌＴ７ポリメラーゼ（１００Ｕ／ｍｌ）１μｌ HepC RdRp(NS5B) ｘμｌヌクレアーゼを含まない水ｙμｌ

【０１１２】この方法は、キット中のコントロールＤＮＡ鋳型、並びにＴ７プロモーターの
上流で成功して切断されたプラスミドＤＮＡを利用する。使用されるＤＮＡの量
は、０．１ｎｇ程度の低さがうまくいくであろう。使用されるＴ７ポリメラーゼ
の量は、０．１μｌ程度の低さである。

【０１１３】興味深いことに、これらの実験においてHepC RdRp(NS5B)は、オリゴヌクレオ
チドプライマーの不存在下でｄｓＤＮＡを与える能力、及びＲＮＡを増幅する能
力を有することが示されている。

【０１１４】実施例１４真核生物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．１中への、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポ
リメラーゼコード配列のクローニングＣ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼコード配列（図１０）を、結合転写
／翻訳系におけるin situ発現、並びに標的ＲＮＡの同時的複製／突然変異のた
めに、ベクターｐＣＤＮＡ３．１（図９）内にクローン化した。真核生物発現ベ
クターｐＣＤＮＡ３．１中のＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限部位内へのクローニン
グのための、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰＣＲ増幅におけるプ
ライマーとして使用されるオリゴヌクレオチドの配列は以下のものである： 5' GTGGTGGAATTCGCCGCCACCTCTATGTCGTACTCTTGGACC 5' GCACGGGCTTGGGCGATAATCCGCCGGCGAGCTCAGATC

【０１１５】図１７に示されたベクターからＣ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼのＰ
ＣＲ増幅において、上述のオリゴヌクレオチドを使用した点を除いて、実施例２
に記載されたものと同様のストラテジーを使用して、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮ
ＡポリメラーゼをｐｃＤＮＡ３．１ベクター（ｐＣＤＮＡＨＥＰＣと命名）内に
クローン化した。Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、in situで合成
されていることを示すために使用された方法は、実施例２に記載されたものと全
く同じであった。ｐＣＤＮＡＨＥＰＣ中のＣ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラ
ーゼ鋳型を使用する結合反応から生じた結果は、図１８に示された。この図に示
された結果は、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｔ７ポリメラーゼ
単独よりも多くの量の転写産物（スキャンｂ）を生ずることを示す。ここでバン
ドは、より強い強度を有し、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含まな
いバンドよりも広く、ＲＮＡに対する効果を示す。

【０１１６】数多くの変形例及び／または修飾が、広く記載された本発明の精神または範囲
から離れることなく、特異的な実施態様に示されたような本発明になすことがで
きることは、当業者によって予測されるであろう。従って本実施態様は、あらゆ
る点において説明的なものであり、制限するものではないと考慮される。

【０１１７】

【参考文献】

【０１１８】

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、連続的in vitro進化（ＣＩＶＥ）法におけるａ）ファ
ージディスプレー及びｂ）リボソームディスプレーのためのアフィニティー成熟
サイクルを示す図である。

【図２】図２は、ＣＩＶＥのための興味ある遺伝子（ヌクレオチド配列
）を含む発現ユニットを図式的に表す図である。発現ユニットは、転写開始配列
（Ｔ７プロモーター）に沿って上流のリボソーム結合部位（ＲＢＳ）及び翻訳開
始部位（ＡＴＧ）を有する、興味ある遺伝子を含む。該構築物はまた、下流のス
ペーサー配列を含む。

【図３】図３は、in vitroアフィニティー成熟の連続的サイクリング性
質を示すＣＩＶＥ法を図式的に表す図である。該方法は、連続的に進化（成熟）
し、所望の遺伝子が選択される突然変異体の複合体ライブラリーのin vitro生産
を可能にする：本発明の好ましい転写／翻訳系におけるｍＲＮＡ分子は、連続的
in vitro進化（ＣＩＶＥ）を導く再複製／突然変異／翻訳の連続的サイクリング
工程中に存在する。

【図４】図４は、ＣＩＶＥ法に適した反応容器を表す図である。

【図５】図５は、ａ）マウスモノクローナル抗体１Ｃ３の第一の定常軽
鎖領域；ｂ）ヒトＩｇＭ抗体の第三の定常重鎖領域；ｃ）抗グリコホリン（１Ｃ
３）ｓｃＦｖ；ｄ）抗Ｂ型肝炎表面抗原（４Ｃ２）ｓｃＦｖのヌクレオチド配列
を示す図である。

【図６】図６は、ＱβバクテリオファージゲノムのｃＤＮＡコピーを含
むプラスミドｐＢＲＴ７ＱベータのＤＮＡ配列を示す図である。

【図７】図７は、in vitro転写及び翻訳に使用される鋳型のＰＣＲ合成
のために使用される、（ａ）ｐＧＣ０３８ＣＬ（抗グリコホリンｓｃＦｖ（１Ｃ
３）及びマウス定常軽鎖領域を含む）及び（ｂ）ｐＧＣＣＨ（ヒト定常重鎖領
域を含む）のプラスミドを図式的に表す図である。これらのプラスミドは、下流
スペーサー配列を提供するために使用された。ほとんどの場合、興味ある遺伝子
は、ｐＧＣＣＨのＳｆｉＩ及びＮｏｔＩ部位にクローン化された。

【図８】図８は、ステムループ構造を形成するＲＮＡ断片の配列を示す
図である。

【図９】図９は、ウサギ網状赤血球に結合した転写／翻訳系における、
Ｑβレプリカーゼ及びＣ型肝炎ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの発現
のための真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１を示す図である。

【図１０】図１０は、Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー
ゼのＤＮＡ配列を示す図である。

【図１１】図１１は、in vitro結合転写／翻訳反応用の鋳型ＤＮＡを生
産するためのＰＣＲ反応におけるプライマーとして使用されるオリゴヌクレオチ
ドのＤＮＡ配列を示す図である。鋳型の生産及びパンニング後の生産物の回収の
両者のために使用されるオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列である。配列は
数字が付され、５’から３’で記載されている。

【図１２】図１２は、ウサギ網状赤血球結合転写／翻訳系におけるＱβ
レプリカーゼの発現を示す図である。

【図１３】図１３は、抗ＧｌｙＡ１Ｃ３タンパク質合成の結合転写／
翻訳に対するＱβレプリカーゼの効果を示す図である。

【図１４】図１４は、結合転写／翻訳においてＱβレプリカーゼを含ま
せる効果を示す図である。選択された突然変異体の配列中の突然変異の表を示す
。この図は、６のランダムなクローンから得られた配列の２８０のヌクレオチド
中に見出される突然変異の位置及びタイプを示す。これらは、Ｑβレプリカーゼ
の不存在下、精製Ｑβの存在下、またはプラスミドｐＣＤＮＡＱβの存在下のい
ずれかで、転写及び翻訳の後のＧｌｙＡ皮膜Dynabeadに対する抗ＧｌｙＡｓｃ
Ｆｖのパンニングから回収された。「検出突然変異」のカラムにおいて、「なし
」は、突然変異が見出されないことを意味する：突然変異はＡｘＢの形態で示さ
れ、Ａは野生型ヌクレオチドであり、ｘは配列中の位置数であり（図５ｃに示さ
れる）、そしてＢは観察された突然変異化ヌクレオチドである。

【図１５】図５は、結合転写／翻訳ウサギ網状赤血球系：デンシトメー
タースキャニングにおいてＱβレプリカーゼによる抗グリコホリンｓｃＦｖ転写
産物の複製を示す図である。

【図１６】図１６は、Ｔ７ポリメラーゼ転写産物からのＱβレプリカー
ゼによる抗グリコホリンｓｃＦｖ及び抗Ｂ型肝炎ｓｃＦｖの複製及び突然変異の
ＤＮＡ配列分析を示す図である。

【図１７】図１７は、Ｃ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含む
ベクターを示す図である。

【図１８】図１８は、抗ＧｌｙＡ１Ｃ３ｓｃＦｖＲＮＡの複製に対
する、結合転写／翻訳系において発現されるＣ型肝炎ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
ラーゼの効果を示す図である。エチジウムブロマイドで染色しスキャンしたＲＴ
−ＰＣＲ産物のアガロースゲル電気泳動を示す。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１１年１０月６日（１９９９．１０．６）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ピーター・イリエイズオーストラリア・ヴィクトリア・3104・ノース・バルウィン・ロバート・ストリート・14 (72)発明者ロバート・アレクサンダー・イアヴィングオーストラリア・ヴィクトリア・3170・マルグレイヴ・ハニーサックル・アヴェニュ・11

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）タンパク質をコードする複製可能なｍＲＮＡ分子を、
ＲＮＡのリボヌクレオシド三リン酸前駆体とＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼと
共にインキュベーションし、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、突然変異を導
入するようにｍＲＮＡ分子を複製し、それによって突然変異体ｍＲＮＡ分子の集
団を生産する工程；（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質
の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後
に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それに
よって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標
的分子にさらし、それに結合した突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を回収
することによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体を選択す
る工程；及び（ｄ）任意に該複合体からｍＲＮＡ分子を放出する工程；を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法
。
【請求項２】（ａ）タンパク質をコードする複製可能なｍＲＮＡ分子を、
ＲＮＡのリボヌクレオシド三リン酸前駆体とＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼと
共にインキュベーションし、ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、突然変異を導
入するようにｍＲＮＡ分子を複製し、それによって突然変異体ｍＲＮＡ分子の集
団を生産する工程；（ｂ）工程（ａ）で得られた突然変異体ｍＲＮＡ分子を、突然変異体タンパク質
の集団の合成を生ずる条件の下で翻訳系と共にインキュベーションし、翻訳の後
に、突然変異体タンパク質をそれをコードするｍＲＮＡ分子に結合させ、それに
よって突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を形成する工程；（ｃ）工程（ｂ）で得られた突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合体の集団を標
的分子にさらすことによって、一つ以上の突然変異体タンパク質／ｍＲＮＡ複合
体を選択する工程；（ｄ）工程（ａ）で使用された複製可能なｍＲＮＡ分子が、工程（ｃ）で選択さ
れた複合体から得られたｍＲＮＡである条件で、工程（ａ）から（ｃ）を一回以
上繰り返す工程；（ｅ）標的分子に結合する突然変異体タンパク質複合体を回収する工程；及び（ｆ）任意に複合体からｍＲＮＡ分子を放出または回収する工程；を含む、標的分子に結合するタンパク質の突然変異、合成及び選択のための方法
。
【請求項３】工程（ｄ）が一回より多く繰り返される、請求項２記載の方
法。
【請求項４】突然変異体タンパク質が、それをコードするｍＲＮＡ分子に
リボソーム複合体を経て結合される、請求項１から３のいずれか一項記載の方法
。
【請求項５】工程（ａ）から（ｄ）が、単一または複数の区画の容器のい
ずれかにおいて同時に実施され、複数の区画の容器が区画の間で液体の輸送を可
能にする、請求項１から４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、（ｉ）１０⁴塩基対中に少なくとも一つの点突然変異の頻度で複製されたＲＮＡ
分子中に突然変異を導入する；または（ｉｉ）１０^-4の頻度で少なくとも一つの挿入または欠失を導入する；請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、（ｉ）１０³塩基対中に少なくとも一つの点突然変異の頻度で複製されたＲＮＡ
分子中に突然変異を導入する；または（ｉｉ）１０^-3の頻度で少なくとも一つの挿入または欠失を導入する；請求項１から５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｑβレプリカーゼ、Ｃ
型肝炎ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、水疱性口内炎ウイルスＲＮＡ配向性Ｒ
ＮＡポリメラーゼ、カブ黄色モザイクウイルスレプリカーゼ、並びにＲＮＡバク
テリオファージファイ６ＲＮＡ依存性ＲＮＡより成る群から選択される、請求
項１から７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼが、Ｑβレプリカーゼであ
る、請求項１から８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】翻訳系が、セルフリー翻訳系である、請求項１から９のい
ずれか一項記載の方法。
【請求項１１】セルフリー翻訳系が、大腸菌由来のＳ−３０抽出物を含む
、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】セルフリー翻訳系が、網状赤血球溶解物を含む、請求項１
０記載の方法。
【請求項１３】翻訳系が、０．１ｍＭから１０ｍＭの間の全体の濃度で、
酸化及び／または還元グルタチオンを含む、請求項１から１２のいずれか一項記
載の方法。
【請求項１４】グルタチオン濃度が、２ｍＭから７ｍＭの間である、請求
項１３記載の方法。
【請求項１５】翻訳系が、約２ｍＭの濃度で酸化グルタチオンを、０．５
ｍＭから５ｍＭの間の濃度で還元グルタチオンを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】複製可能なｍＲＮＡ分子が、ＲＱ１３５ＲＮＡ、ＭＤＶ
−１ＲＮＡ、ミクロバリアントＲＮＡ、ナノバリアントＲＮＡ、ＣＴ−ＲＮＡ
、及びＲＱ１２０ＲＮＡより成る群から選択された鋳型に由来する、請求項１
から１５のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】複製可能なｍＲＮＡ分子が、ＭＤＶ−１ＲＮＡ及びＲＱ
１３５ＲＮＡから選択された鋳型を含むベクターに由来する、請求項１から１
６のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】ＤＮＡ鋳型を転写して、複製可能なｍＲＮＡを生産する工
程をさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】ＤＮＡ鋳型が、直線状ＤＮＡ分子である、請求項１８記載
の方法。
【請求項２０】ＤＮＡ鋳型が：（ｉ）ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロールエレメント、及びリボ
ソーム結合部位を含む非翻訳領域；（ｉｉ）標的分子に結合するタンパク質をコードするオープンリーディングフレ
ーム；並びに（ｉｉｉ）オープンリーディングフレームの上流に位置するステムループ構造；
を含む、請求項１８または１９記載の方法。
【請求項２１】ステムループ構造が、レプリカーゼ結合配列である、請求
項２０記載の方法。
【請求項２２】レプリカーゼ結合配列が、１５から５０ヌクレオチドの長
さである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】レプリカーゼ結合配列が、２０から４０ヌクレオチドの長
さである、請求項２１記載の方法。
【請求項２４】レプリカーゼ結合配列が、Ｑβレプリカーゼによって認識
される、請求項２１から２３のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】レプリカーゼ結合配列が、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCG
の配列を含む、請求項２１から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】第二のステムループ構造が、オープンリーディングフレー
ムの下流に含まれる、請求項２０から２４のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】リボソーム結合部位が、ＭＳ２ウイルスから由来する、請
求項２０から２６のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】ポリペプチドをコードする配列が、オープンリーディング
フレームの３’及びフレーム中に融合される、請求項２０から２７のいずれか一
項記載の方法。
【請求項２９】ポリペプチドが、イムノグロブリン定常領域である、請求
項２８記載の方法。
【請求項３０】イムノグロブリン定常ドメインが、マウス抗体１Ｃ３の定
常軽鎖ドメインである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】標的分子が、ＤＮＡ分子、タンパク質、レセプター、細胞
表面分子、代謝産物、抗体、ホルモン、細菌またはウイルスから選択される、請
求項１から３０のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２】標的分子が、マトリックスに結合する、請求項１から３１
のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３】マトリックスが、磁性ビーズを含む、請求項３２記載の方
法。
【請求項３４】（ｉ）ＤＮＡのｍＲＮＡへの転写を促進するコントロール
エレメント、及びリボソーム結合部位を含む非翻訳領域；（ｉｉ）非翻訳領域の下流に位置するクローニング部位；並びに（ｉｉｉ）該クローニング部位の上流に位置するレプリカーゼ結合配列；を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項３５】レプリカーゼ結合配列が、１５から５０ヌクレオチドの長
さである、請求項３４記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３６】レプリカーゼ結合配列が、２０から４０ヌクレオチドの長
さである、請求項３５記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３７】レプリカーゼ結合配列が、Ｑβレプリカーゼによって認識
される、請求項３４から３６のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３８】レプリカーゼ結合配列が、GGGACACGAAAGCCCCAGGAACCUUUCG
の配列を含む、請求項３７記載のＤＮＡ構築物。
【請求項３９】第二のレプリカーゼ結合配列が、クローニング部位の下流
に含まれる、請求項３４から３８のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４０】リボソーム結合部位が、ＭＳ２ウイルスから由来する、請
求項３４から３９のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４１】ポリペプチドをコードする配列が、クローニング部位に対
して３’に位置する、請求項３４から４０のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４２】ポリペプチドが、イムノグロブリン定常領域である、請求
項４１記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４３】イムノグロブリン定常ドメインが、マウス抗体１Ｃ３の定
常軽鎖ドメインである、請求項４２記載のＤＮＡ構築物。
【請求項４４】請求項３４から４３のいずれか一項記載のＤＮＡ構築物を
含む、複製可能なｍＲＮＡ転写産物を生産するためのキット。
【請求項４５】（ｉ）ＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはＱβ
レプリカーゼ、またはＲＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ若し
くはＲＮＡ鋳型；（ｉｉ）セルフリー翻訳系；（ｉｉｉ）ＤＮＡ配向性ＲＮＡポリメラーゼ、好ましくはバクテリオファージポ
リメラーゼ；（ｉｖ）リボヌクレオシド三リン酸；並びに（ｖ）一つ以上の制限酵素；より成る群から選択される少なくとも一つの構成成分をさらに含む、請求項４４
記載のキット。