JPH05503000A

JPH05503000A - 新規の遺伝子及びポリペチドの無細胞合成並びに単離

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Publication number: JPH05503000A
Application number: JP2514372A
Authority: JP
Inventors: カワサキ，グレン
Original assignee: Optein Inc
Current assignee: Optein Inc
Priority date: 1989-10-05
Filing date: 1990-10-04
Publication date: 1993-05-27
Anticipated expiration: 2016-01-22
Also published as: DE69032483D1; EP0494955A4; CA2067194C; EP0494955B1; WO1991005058A1; ES2118066T3; KR100204360B1; US5643768A; CA2067194A1; ATE168416T1; AU638762B2; JP3127158B2; KR0185192B1; KR920703839A; JP2001078787A; US5658754A; AU6537390A; KR100204359B1; DE69032483T2; EP0494955A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】、並で３３１豊 ■１本発明は一般に生体内における新規の遺伝子及びポリペプチドの合成並びに単離に関し、より詳しくはセミランダムＤＮＡ又はＲＮＡ配列を生成及び発現せしめる方法、これらの配列から新規の遺伝子を単離する方法、並びに新規のポリペプチドを作り出すためのこれらの遺伝子の利用の方法に関する。

発１図りＬ最セミランダム配列からの新規の遺伝子及びポリペプチドの単離は一般に、対象の（複数の）配列を得るための遺伝子的に雑多な大量の細胞集団をスクリーンする必要性によって制限されていた。例えば１０個のアミノ酸のポリペプチド鎖は２０１０種類又はおよそ１０１３種類の順列が考えられる。もしこの順列のうち１０種が所望する特性（例えば特異的な抗原に結合する能力）を有していた場合、１０′２個の集団を１つの所望する新規遺伝子を探す期待のためにスクリーンする。

（微生物を介して新規遺伝子を発現せしめる）常用の方法の利用を介しての特定の性質に関する大量の新しい配列のスクリーニングは、この新規遺伝子が生体に明確な増殖又は生存のための利点を付与しない限り事実上実施しがたい。実際、従来技術のもとでは、１０Ｉ２個の個々の形質転換微生物を、所望する１新規遺伝子を見つけるためにそれぞれスクリーンする必要がある。

細胞内に局在する新規の遺伝子生成物を検出するための本スクリーニング工程において、各形質転換細胞由来のコロニーはその細胞を開裂せしめるために処理されなければならない。一般には標準ペトリ皿一枚当り１０００−２０００個の細菌コロニーをこのスクリーニング工程のために溶解せしめる（例えばクロロホルムにより）。従って、１０Ｉ２個の形質転換生物のためには５００，０００から１０億枚のベトリ皿を必要とするであろう。更に、１０，０００から１００，０ＯＯＩＪツトルの対数増殖分裂細胞が大量の形質転換可能細胞を製造するために必要でありうる。

他方、遺伝子生成物が分泌されて細胞の外側に結合する場合、これはそれらの蛍光化合物又はその他のマーカーに結合する能力によって検出されうる。これらの場合において、新規の所望するポリペプチドの合成に関してセルソーターがスクリーンのために利用されうる。しかしながら、１秒当り５．０００個の細胞の流速にてさえも、セルソーターで１０１２個の細胞をスクリーンするためには６０年以上もかかるであろう。従って、非常に高額且つ時間のかかる現在のスクリーニング方法は明らかにセミランダム配列からの新規の遺伝子及びポリペプチドの単離の妨げとなっている。

上記に簡潔した方法の他に、ＦｉｅｌｄｓとＳｏｎｇ　（Ｎａｔｕｒｅ　３４０　：２４５−２４６．１９８９）は酵母ＧＡＬ４遺伝子のドメインを用いた、その他のポリペプチドと特異的に結合するポリペプチドを選択的に得るための方法を紹介している。しかしながらこのシステムは重要なる制限を有す。第１にポリペプチドーポリペプチド結合のみが選択され、即ちポリペプチド−非ポリペプチド相互作用は除外される。第２にこの方法が商業適用性を有すためには、既知及び新規の結合性ポリペプチドはかなり高いレベル且つ「天然」の形態に酵母において発現されなければならない。第３に、グリコジル化ポリペプチド又は特定の改質されたポリペプチドもこの方法により除外されるであろう。第４に、彼らは物理相互作用のよく解明されている既知のポリペプチドを用いたにもかかわらずコントロールＧＡＬ４活性の４．５％のみを示したことから、ランダム又はセミランダム配列が働くかどうか明白でない。第５に、ＦｉｅｌｄｓとＳｏｎｇは非常に大きい配列、即ち、６３３個のアミノ酸のＳＮＦ　１タンパク質及び３２２個のアミノ酸の５ＮＦ４タンパク質であって互いに相互作用する二次構造を有すものを利用している。第６に、１０Ｉ０の多様性のセミランダム配列についてさえも、彼の方法を用いることによって極端に大量のＤＮＡ、改質酵素及び怒受性酵母細胞の必要性を回避せしめた。

既に開示されている方法に対し、本発明は新規の遺伝子及びポリペプチドの無細胞スクリーニングについての方法を詳細する。本方法は大量の形質転換生物に関連する問題及びＦｉｅｌｄｓとＳｏｎｇにより開示された方法の制限を回避せしめ、そして数週間以内に完了しうる。従って、本方法論は新規の遺伝子生成物の単離における時間及び費用の実質的な節約を可能とする。

発明の概容簡単に述べると、本発明は多数の新規なる遺伝子及びポリペプチドの合成、スクリーニング並びに選別に関する。本方法は一般に以下の段階、（ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リポソーム結合性配列及び翻訳開始シグナルを含む５′非翻訳領域を含んで成るインビトロ発現ユニットを作製し、ここで該発現ユニットはｍＲＮＡを製造可能であり；　（ｂ）１又は複数の種類のセミランダムヌクレオチド配列を該発現ユニ７）に連結させ；　（ｃ）ＲＮＡを生産するために該発現ユニットとセミランダムヌクレオチド配列に関連する配列を転写又は複製せしめ；　（ｄ）ポリソームを生産するため、該ポリソームを維持せしめるのに十分な条件のもとて該ＲＮＡを翻訳せしめ；　（ｅ）該ポリソームを対象の物質と結合せしめ；　（ｆ）該対象の物質と結合するポリソームを単離せしめ；（ｇ）ｍＲＮＡを遊離せしめるために該単離化ポリソームを解離せしめ；　（ｈ）該遊離化ｍ　ＲＮ　ＡからｃＤＮＡを回収且つ作製せしめ；そして（ｉ）新規のポリペプチドを生産するために該遺伝子を発現せしめること、を含んで成る。

上記の方法の第１のＵ様において、この方法は前記のＲＮＡ又は関連するｃＤＮＡを増幅せしめることによって所望する配列の冨んでいるｍＲＮＡにおいて繰り返すことができうる。その後、所望する遺伝子を更に純化するために、有意な割合（＞１０−’）の切り捨て集団（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を所望する配列が示す迄、この遺伝子の増幅せしめたサブセントを前記の種々の段階のサイクルにかけることができうる。

主として方法は遺伝子の集団がほぼ均一となる迄繰り返しうる。

本発明の第２の態様において、新規なるポリペプチドを生産するための方法であって、以下の段階、（ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リポソーム結合性配列及び翻訳開始シグナルを含む５′非翻訳領域を含んで成るインビトロ（試験管内）発現ユニットを作製し、ここで該発現ユニットはｍＲＮＡを生産することが可能であり；　（ｂ）該発現ユニットに１又は複数のセミランダムヌクレオチド配列を連結せしめ；　（Ｃ）該発現ユニットとセミランダムヌクレオチド配列に関連する配列を転写せしめてＲＮＡを生産せしめ；　（ｄ）該ＲＮＡを翻訳せしめて生物学的に活性なポリペプチドを生産せしめ；　（ｅ）該生物学活性ポリペプチドをコード化するＲＮＡを再分（ｓｕｂｄｉｖｉｄｅ）せしめ；　（ｆ）上記に記載の段階（ｃ）−（ｅ）の通りに転写、翻訳及び再分せしめて対象の遺伝子を単離せしめ；　（ｇ）該単離化遺伝子からｃＤＮＡを作製せしめ；そして（ｈ）新規なるポリペプチドを生産するように該ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを発現せしめること、を含んで成る方法を提供する。

本発明の他の態様において、新規なるポリペプチドを生産するための方法であって、以下の段階、（ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リポソーム結合性配列及び翻訳開始シグナルを含むインビトロ発現ユニットを作製せしめ、ここで該発現ユニットはｍＲＮＡを生産可能であり；　（ｂ）該発現ユニットに１又は複数のセミランダムヌクレオチド配列を連結せしめ；　（Ｃ）該発現ユニットとセミランダム配列に関連する配列を複製せしめてＲＮＡを生産せしめ：　（ｄ）生物学的に活性なポリペプチドを生産せしめるために該ＲＮＡを翻訳せしめ；　（ｅ）該生物学的に活性なポリペプチドをコード化するＲＮＡを再分せしめ；　（ｆ）上記の段階（ｄ）−（ｅ）の通りに翻訳及び再分せしめて対象の遺伝子を単離せしめ：　（ｇ）該単離化遺伝子からｃＤＮＡを作製せしめ、そして（ｈ）新規なるポリペプチドを生産するようにｃＤＮＡを発現せしめること、を含んで成る方法を提供する。

上記の発現ユニットはＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リポソーム結合性部位及び翻訳開始シグナルを含んで成る。該発現ユニットは翻訳エンハンサ−又は「活性化」配列、選んだ配列の３′尾部及び適切な制限部位を更に含んで成りうる。

該セミランダムＤＮＡ配列は天然ＤＮＡの機械的、化学的もしくは酵素的断片化により、ＤＮＡの化学合成により、又はＤＮＡを直接該発現ユニット上に重合せしめることにより作られうる。該対象の物質は表層抗原、リセプタータンパク質、毒素、有機ポリマー、タンパク質分子の活性部位、中間代謝物、抗体、金属、ホルモン又はその他の化合物でありうる。

上記及びその他の態様は以下の詳細の説明を参照することによって明らかとなるであろう。

好ましい態様の詳細本発明は新規なる遺伝子及びポリペプチドの単離に関する。

このような新規なる遺伝子は本質的に無数の多様性（ｄｉｖｅｒ−ｓ　ｉ　ｔｙ）を有し、そして商業的に重要な特性、例えば新規なる触媒活性又は特定の物質に選択的に結合する能力、ををす新しいポリペプチドをコードしうる。現存する遺伝子又は化学合成りＮＡのセミランダムヌクレオチド配列に由来する読み取り枠（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）を含んで成る新規なる遺伝子が作製されうる。これらは現存するプロモーター、エンハンサ−１開始コドン、プラスミド、リポソーム結合性部位及び／又はターミネータ−を用いることにより広範囲の生物において発現されうる。ある場合において、該新規なる遺伝子を大量生産プロセスの一部としてインビトロにおいて発現せしめることは好適でありうる。

上記の通り、本発明は特異的な結合性並びに／又は生物学的活性を有す新規なるポリペプチドをコード化する新規なる遺伝子及び遺伝子フラグメントを作製し、そして単離するための複数段階プロセスを詳細する。好適な態様において、該プロセスは以下の段階を含んで成る：１、ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列（即ち、プロモーター又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ開始部位）、リポソーム結合性部位及び翻訳開始シグナルを含む発現ユニットを作製する。この発現ユニットは適当な制限部位、翻訳エンハンサ −又は「活性化」配列、及び選んだ配列の３′尾部も含むことがありうる。

２、次にセミランダムＤ　Ｎ　Ａ又はＲＮＡを、天然ＤＮＡ。

ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ配列の機械的、化学的又は酵素的断片化により、あるいはヌクレオチドの化学合成により作る。

このセミランダムＤＮＡ又はＲＮＡ配列を次に前記の発現ユニットに挿入せしめる。他方、このセミランダム配列を該発現ユニット上に直接重合化せしめてもよい。これによって１０′２種又はそれより多くの異なる配列のライブラリーが作られうる。

３、　次にこの新規なる遺伝子をインビトロで転写せしめてオリジナルＤＮＡライブラリーのＲＮＡコピーのプールを作る。もしＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼが含まれている場合、これらのレプリカーゼをＲＮＡの増幅のために用いうる。

４、　このＲＮＡ　（ｍＲＮＡ）をインビトロで翻訳してポリソームを生産する。「ポリソーム、（ＲＮＡ−リポソーム−形成期ポリペプチド複合体）を維持せしめる条件を、所望のポリペプチドとｍＲＮＡを一緒に保つために用いる。

５、　次シここのポリソームを対象の物質、例えば表層抗原、リセブタータンバク質、毒素、有機ポリマー、抗体、中間代謝物、ホルモン及びタンパク質分子の活性部位と結合させるか、又は生物活性を表示させる。

６、　対象の物質と結合しているポリソームは、未結合ポリソームの除去により実質的に純化される。このポリソーム複合体を維持する条件のもとての系列的又はフロースルー洗浄は、このポリソームの構造を通じて対象の物質に結合し続ける所望のｍＲＮＡの度数を実質的に高める。

７、　次に、このポリソーム複合体からｍＲＮＡを遊離するためにこの結合／活性ポリソームを解離せしめる。

８、　次に微量ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡコピーを作ることにより又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡの直接的な増幅によって回収する。ＤＮＡポリメラーゼ及び／又は逆転写酵素反応によるｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの増幅はこのような微量の豊富な情報（ｌｏｗ　ａｂｕｎｄａｎｃｅ　ｍｅｓｓａｇｅｓ）を回収することを大いに容易化せしめる。

９、　次に得られるｃＤＮＡをポリペプチドを生産するために発現させる。

はとんどの場合において、特異的な結合性タンパク質の度数をポリソームの非特異的な結合性のバックグランドよりも更に高めるために段階３−８の反復が好適である。

本明細書に詳細の方法により生産した、（複数の）単離化精製新規遺伝子は、標準的な発現技術を利用することにより種々の対象の（複数の）ポリペプチドを作り上げることが可能であり、これに陽性であることは所望の生成物をコードする遺伝子であることが証明される。更に、常用の方法によるＤＮＡ及び／又はポリペプチドのシーケンシングが、新規なるポリペプチドの組成物の同定に利用されうる。

この新規なる遺伝子によりコード化されるポリペプチドが単離且つ同定されたなら、この新規なる（複数の）ポリペプチドの大量生産が、化学合成により（もしそのアミノ酸配列が比較的短い場合）、又は遺伝子操作微生物を利用する組換ＤＮＡ法を介して成し遂げられうる。他方、大量インビトロ転写及び／又は翻訳法が商業的な量のポリペプチドの生産のために利用されうる。

オリジナルの単離化新規ポリペプチドの特異的結合性及び／又は生物学活性を、その他の結合及び生物学活性に加えて有するバイブリドタンパク質を作るため、選ばれたポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列をより大きい遺伝子（即ち、例えば抗体遺伝子の超可変性領域の中）に組込むこともできうる。

■３発発現ユニット発現ユニットは５′非翻訳頭域を含んで成り、そして更に３′領域を含んで成りうる。この発現ユニフトの５′非翻訳領域はプロモーター又はＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リポソーム結合性配列及び翻訳開始シグナルを含む。この５′ 非翻訳領域（頭部）は適当な制限部位及び翻訳エンハンサ−又は「活性化」配列も含みうる。この３′領域は適当な制限部位及び選ばれた配列の３′尾部を含みうる。この発現ユニットは当業者によく知られた方法によって化学合成されうる。

他方、これらの構成要素をこの発現ユニットに集成化せしめる前に、１又は複数のプラスミドに組み込み、微生物内で増幅せしめ、標準的な方法により精製し、そして制限酵素により適当なフラグメントへと切断せしめることができうる。

この５′非翻訳領域はプロモーター又はＲＮＡポリメラーゼ結合性配列を含む。

効率性の高いプロモーター、例えばＴ７．Ｔ３又はＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼに関するそれが以下の理由により本発明に好適である。このようなプロモーターは既知の組成の短いＤＮＡ配列であり、それらに対応するポリメラーゼに非常に特異的であり、そして活性が高（、ＤＮＡ鋳型当り５０回以上の転写を可能にするからである。

更に、Ｔ７．Ｔ３及びＳＰ６ボリメラーゼはあらゆるソースから市販され、そしてよく特徴付けられている転写キットの構成員である。Ｔ７プロモーターのためのその共通配列はＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ　（２３塩基対）である。この配列が本発明の好適な態様との関連において説明されているが、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼのために機能しうる関連するＤＮＡ配列及びその他のＲＮＡポリメラーゼのために適するであろうその他の配列が利用されうることか明白であろう。一定の態様において、２種のプロモーター、例えばＴ７及びＳＰ６プロモーターの両方を利用することを所望することがある。

このプロモーター領域の下流もしくはその中に位置するのはリポソーム結合性部位をコードするＤＮＡ配列である。もし原核細胞翻訳方法を用いる場合、このリポソーム結合性部位は原核細胞リポソーム複合体（リポソームＲＮＡを含む）に特異的でありうる。しかしながら、本発明の好適な態様は真核細胞配列及びインビトロ真核細胞翻訳系、例えばウサギ網状赤血球系を利用する（Ｋｒａｗｅｔｚら、Ｃａｎ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃｅ１ｌ　。

紅旦、　６１　：　２７４　２８６．１９８３；　Ｍｅｒｒｉｃｋ、　Ｍｅ旦」旦り虹、　１０１　：３８、１９８３）。共通翻訳開始配列ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ及びその他の機能的に関連する配列がを椎動物のｍＲＮＡに関して確立されている（Ｋｏｚａｋ、　Ｎ　ｅｉｃ　’　１５　：　８１２５−８１４８゜１９８７）。この配列又は関連する配列はインビトロタンパク質合成をもたらすために、新規なる遺伝子の作製において利用されうる。この開始配列におけるＡＴＧトリプレットはメチオニンに関する翻訳開始コドンである；インビトロタンパク質合或はこの位置にて開始するものと予測される。

このプロモーターと翻訳開始部位との間に、その他の既知配列、例えば翻訳エンハンサ−又は「活性化」配列を置くことを所望することがある。例えば、Ｊｏｂｌｉｎｇらは（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ　Ｒｅｓ、Ｈし４４８３−４４９８．１９８８）　、タバコモザイクウィルス由来の翻訳されない「リーダー配列」が５Ｐ６−生成ｍＲＮＡにおいて［有意に翻訳を活性化せしめた」ことを示した。

彼らはムラサキウマゴヤシ（ａｌｆａｌｆａ）モザイクウィルスＲＮＡ４の３６個のヌクレオチドの５′非翻訳領域がオオムギ（ｂａｒｌｅｙ）アミラーゼ及びヒトインターロイキンｍＲＮＡの翻訳効率を高めることも報告している（Ｊｏｂｌｉｎｇ　ａｎｄ　Ｇｅｈｒｋｅ。

Ｎａｔｕｒｅ　３２５　：　６２２　６２５．１９８７）。ゴキブリ　（ｂｌａｃｋ　ｂｅｅｔｌｅ）ウィルス　（ノダウィルス；　Ｎｏｄｏｖｉｒｕｓ）　ＲＮ　Ａ　２　（Ｆｒｉｅｓｅｎとウィルスコートタンパクｉｉ　ｍ　ＲＮ　Ａ　（Ｚａｇｏｒｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ６５：　１２７−１３３．１９８３）も高い効率で翻訳される。対照的に、一定の翻訳されないリーダーはＳＦ３　ＲＮＡの発現を強く抑えたＵｏｂｌｉｎｇら、前記、１９８８）。

適切な制限部位をその後の遺伝子操作に役立てさせるためにこの発現ユニフトに含ませることもできる。例えば、セクスチュプレットＣＣＡＴＧＧは制限エンドヌクレアーゼＮｃｏｌのための認識配列である。リポソーム結合部位の下流に位置するＮｃｏＩｒ切断部位」は逐次の遺伝子操作のための好適なスプライス部位である。それ故、所望の新規遺伝子の精製後、この発現ユニフトをこの部位にて該新規遺伝子から切り離すことができ、そして新規のポリペプチドのインビボ及び大量生産発現のためにその他のプロモーターを連結させることができうる。Ｎｃｏ１部位は２種類のポリペプチドドメインが一緒となり、そして単一タンパク質として発現されるバイブリドタンパク質の作製のための好適なりローニング部位としても利用されうる。

更に、プラスミドへの新規遺伝子の逐次的クローニングのために、この５′非翻訳領域に少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ部位を有すＤＮＡ配列を含ませることが最も有利な傾向にある。オクタマー配列ＧＣＧＧＣＣＧＧＣはＮｏｔＩヌクレアーゼにより認識され、そしてそれらは新規なる遺伝子のコード領域にあることは稀であるために特に有用である（ＮｏｔｌはランダムＤＮＡ全体を一度に６５，５３６塩基対毎に切断すると予測される）。その他の制限部位も利用されうる；新規遺伝子コード領域を切断する予測頻度はヌクレオチド組成又はコード領域のＤＮＡ起源に依存する。一定のパリンドローム配列が翻訳を妨害しうることが理解されるであろう；しかしながら、ある配列は翻訳の速度を高めることもある。

この発現ユニットは３′領域も含みうる。パリンドローム配列を有す既知の３′ 領域（尾部）を作製することが少な（とも２つの理由のために所望される。第１に、３′制限部位はあらゆるその後のポリペプチドコード領域の遺伝子的操作のために好適であろう。例えばもしＮｏｔＩ部位が５′及び３′領域の両方において位１する場合、所望のポリペプチドをコードする配列は更なるクローニングのためのＮｏｔＩ「接着末端」を伴って切り出されうる。第２、パリンドロームはトランスロケーション（転位）を妨げる二次構造をもたらすことがあり、従って、３′領域におけるパリンドロームは翻訳の際のリポソームの移動を遅くらせうる。この第２の性質はリポソームがｍＲＮＡから脱離することを防止するために所望され、そしてそれ故インビトロ翻訳段階におけるリポソームの数を高める。

この３′領域はポリ−Ａ又はその他のポリヌクレオチド鎖であって、相補的なホモポリマー配列とのハイブリダイゼーションにより、インビトロ翻訳反応におけるその他の成分から該ｍＲＮＡを後に精製するためのものをも含みうる。

更に、その他のランダムでない配列をこの発現ユニットに組み込むことがありうる。１つの態様において、発現されたポリペプチドは非ランダム及びセミランダムアミノ酸配列の両方を含む。コード領域の非ランダム成分は非ランダム５′非翻訳化領域及び／又は３′領域を伴って合成且つ製造される。この非ランダムコード配列は何十億の新規ポリペプチドの中に保存されているアミノ酸の鎖（同定又はｒｌＤ、ペプチド）を特定する。このＩＤペプチドは新規ポリペプチドの定量のため、及び新規ポリペプチドの精製のために有用である（このＩＤペプチドに対する抗体が入手又は生産された場合）。１つの例は１１個のアミノ酸物質Ｐであって他のポリペプチドの融合ペプチドとして結合できるものである。抗−物質Ｐ抗体は、物質Ｐを含む融合タンパク質を検出及び定量するために市販されている。その他の例は８個のアミノ酸マーカーペプチド「フラグ」　（“Ｆｌａｇ ”）である（Ｈｏｐｐら、旦シタ愁山虱国江　６　：　１２０４−１２１０．１９８８）。

アミノ末端１Ｄペプチドはカルボキシル末端ＩＤペプチドよりも少なくとも２つの利点を有す。第１に、Ｎ−末端ＩＤの適当な解読枠を保持する遺伝子構造体を作製することは容易であり、その理由はセミランダムＤＮＡ又はＲＮＡの長い鎖はＣ末端ＩＤに関する３つの全ての解読枠において終結する傾向にあるからである。第２に、このＮ−末端ＩＤは形質転換生物においてシグナルペプチドとして働くようにデザインされており、大量生産の際に新規のポリペプチドの分泌を可能にする。

にもかかわらず、Ｃ−末端ＩＤポリペプチドも利用されうる。１つの好適なＣ− 末端ポリペプチドはポリグリシンであり、これはポリｄＧによりコード化され、セミランダム配列の解読枠に関係なくｃｒｙ−ｃｒｙ−ｃｒｙ・・・を読ませる。

このポリペプチドのポリグリシン３′末端は形成期ペプチドの不干渉性つなぎ鎖（ｎｏｎｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ　ｔｅｔｈｅｒ）として働き、そしてこのセミランダム配列が対象の分子に結合することを大いに高める。更にこのポリーｄＧ配列はｃ　Ｄ　Ｎ　Ａの第２の鎖を合成せしめるために利用され、そしてポリＣもしくはポリ−ｄＣを有すＲＮＡ又はＤＮＡの精製のために有用でありうる。その他の繰り返し配列、例えばＧＧＧＣＧＧＧＣ・・・が、全ての解読枠において発現される認識されるペプチド配列をコードするために利用されうる。このＩＤペプチドの好ましい型は簡単な化学又は酵素手段によって新規ポリペプチドから切断されうるちのである。

このＤＮＡ発現ユニットの他に、セミランダムポリペプチド合成のためのＲＮＡ発現ユニットを作製することがある。

このＲＮＡ発現ユニットの１つの考えられる利点は、このポリソームｍＲＮＡの回収が初期のｃＤＮＡ段階を行なう必要がないことにある。その代り、所望の配列を有すｍＲＮＡはＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、例えばＱＢ　（Ｑヘーター）レプリカーゼのそれにより増幅されうる（ＨａｒｕｎａとＳｐｉｅｇｅｌ− ｉａｎ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、５４　：　５７９　５８７．１９６５）。この酵素は３０分において１０億の組換ＲＮＡコピーを作製できる（Ｌｉｚａｒｄｉら、Ｂｉｏ乙初９回剣旦ｕ６　：　１１９７−１２０２．　１９８８）　。

組換ＲＮＡの増幅のだめの１つの適当なりローユング法はＬｉｚａｒｄｉ　らにより詳細されている　（前記、１９８８）。本発明の目的のため、その他の構成要素、例えば制限部位、エンハンサ−及びＩＤ配列を、このＱＢ　ＲＮＡ鋳型を引き起こすＤＮＡプラスミドに加えることができうる。セミランダムコード化配列を標準のＤＮＡ方法論によってこれらのプラスミド上に挿入せしめることができうる。このＱＢレプリカーゼ鋳型が転写される場合（例えばＴ７　ＲＮＡポリメラーゼにより）、セミランダム遺伝子配列を含むインビトロ複製の可能なＲＮＡライブラリーを作り上げることができうる。他方、類似のＲＮＡ発現ユニットは、適切なＲＮＡ分子を化学合成し、それらをＲＮＡリガーゼ例えばＴ４　ＲＮＡリガーゼ（市販）であって一本ｔＪｉ　ＲＮ　Ａ及び／又は一本ｔｊｆ　Ｄ　Ｎ　Ａを結合させるものを介して集成せしめることによって作製されうる。

■、セミランダムヌクレオチド配列ＤＮＡ又はＲＮ　Ａのセミランダム配列を該発現ユニットに連結させる。ＲＮＡ発現ユニット及びセミランダム配列はＤＮＡ鋳型から作るか又はＤＮＡ発現ユニットと同様の方法において化学的に合成したＲＮＡもしくはｍＲＮＡのフラグメントから作製されうるため、以下の詳細はセミランダムＤＮＡの発現ユニットへの連結についての方法のみを説明する。当業者は容易に、セミランダムポリヌクレオチドに連結する発現ユニットのＲＮＡ相当品を作製することができるであろう。

セミランダムＤＮＡは少なくとも３種の方法により作られうる。第１は、事実上あらゆる生存起源由来の天然ＤＮＡを機械的、化学的又は酵素的に断片化せしめ、そしてＤ　Ｎ　Ａ　ＩＪガーゼによって５′非翻訳領域に連結せしめる。異なったＤＮＡ起源由来のフラグメントの混合物を利用できうる。これにより、活性な「読み取り枠」　〔活性がこの分子の最Ｃ末端にない限り、「ナンセンス」　（又は「終止」）コドンを有さないタンパク質の領域（フラグメント）］の選択的な発現が得られうる。本発明の１つの態様において、既知の機能をコードする遺伝子を断片化せしめることがある；得られる断片を５′非翻訳領域にリゲートせしめ、そしてその後ポリソームアッセイにおいて、活性の発現についてスクリーンする。

生物学的活性を示す最も小さい遺伝子フラグメントを調べることにより、タンパク質ドメインの分析が行なわれる。遺伝子フラグメント分析は小さな生物学的活性ペプチド及びバイブリド治療的タンパク質を作り上げるために有用であり、そしてもしより小さいサイズがペプチドの標的部位への到達に役立つならば、薬剤輸送のために有利でありうる。

本発明の他の態様において、この「フラグメント化」ＤＮＡはｃＤＮＡライブラリー由来のセミランダムにサイズ化したｃＤＮＡ分子でありうる。インビトロでｃ　Ｄ　Ｎ　Ａを発現させ且つポリソーム選別を用いることにより、抗体、リセプタータンパク質又はその他の検査用分子との該ポリソームの結合を介して非常に微量の、部分的もしくはおそらく全長遺伝子さえも単離されうる。本明細書記載のｃＤＮＡｒフラグメンｌ−Ｊの無細胞発現は、所望のｃＤＮＡクローンを見つける従来の方法よりも高怒度であった。

セミランダムＤＮＡを作り上げる第２の方法はＤＮＡを化学合成することである。例えば、約１００ヌクレオチドの比較的長いＤＮＡ分子を、それぞれの位Ｉにてヌクレオチドの混合物により合成することができうる。しかしながら化学合成したＤＮＡからナンセンスコドンの統計学的問題が明らかとなる。前記の遺伝子フラグメント及びｃＤＮＡの手法に関しては、活性なる読み取り枠は現存のタンパク質配列内から見い出せる。「読み取り枠」は、終止コドンが存在しないことを意味し、そしてしばしばタンパク質コード領域内由来の配列を意味する。

しかしながら、全ての位置にて２０種の共通アミノ酸全てをコードする十分な多様性を有す化学合成りＮＡは読み取り枠を有す必要がないことが明らかであろう。終止コドンは６４種の考えられるＤＮＡｌ−リプレットのうちの３種（ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡ）で表わされる。完全にランダムなりＮＡに関して、各位置おける４種のヌクレオチド全ての等しい確率により、ナンセンスコドンの確率は３／６４　＝４．６８７５％である。３０個のアミノ酸の鎖をコードするランダムＤＮＡ頓に関して、その領内における少なくとも１個の終止コドンを有す確率は約７６％である。終止コドンは翻訳の終結及びリポソーム複合体からの形成期ポリペプチドの遊離をもたらす。従って、ナンセンスコドンの頻度を引き上げ、且つタンパク質翻訳の際のナンセンスコドンの通常の効果を回避する手法は好ましく、そして以下に詳細する。

より詳しくは、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ塩基組成を好ましい一定のコドンへと操作し、そして特にナンセンスコドンの可能性を引き下げるよう操作する。極端な場合において、各トリプレットコドンの第３の位置をＣ及びＴのみによって合成してナンセンスコドンを理論的に回避する。しかしながら、この場合において２０種のアミノ酸全てがコードされない。Ｌｉｍと５ａｕｅｒ　（Ｎａｔｕｒｅ　３３９　：　３１−３６．１９８９）はラムダリプレッサーの新しい領域の合成において、最初の２つのコドン位置において４種の塩基全ての等量混合物を、そして第３のコドン位置にてＣ及びＧの等量混合物を用いた。この組合せは各コドンにて２０種のアミノ酸全てを可能とし、そしてナンセンストリブレットの頻度を１／３２＝３．１２５％に引き下げた。しかしながら、３０個のアミノ酸における少なくとも１個のＴＡＧ終止コドンを有す確率は約６１％である。

本発明の好ましい態様において、全てのコドンにて２０種のアミノ酸全ての高い頻度を可能にしながら終止コドンの頻度を引き下げるために、全ての３つのコドン位置において等量でない塩基の混合物を用いた。第１のコドン位置においては等モル量のＣ，Ａ及びＧを用いたが、Ｔはそれらの半分量で用いた。第２のコドン位置にてはＡの量をその他の３種塩基のレベルの半分に下げた。第３のコドン位置においては、Ｇ及びＣ又はＧ及びＴのみを等モル量において用いた。この手法の結果、終止コドンが３０個のアミノ酸の鎖中に存在しない可能性が７９％以上となった。この場合において個々のアミノ酸の比率は全ランダムＤＮＡ手法に比べてわずかに変化した。しかしながら、ランダム状態と比べてチロシンのみが半分以下の予測頻度で示されるであろう。

化学合成りＮＡを用いる場合のナンセンスコドンの存在を更に解決するためには、インビトロ翻訳段階においてナンセンス抑制ｔＲＮＡを用いることが好適である。特に、前記のンコドンが過少表現されるため、ＴＡＧ　（ｍＲＮＡにおいては事実上ＵＡＧ）を認識し且つ成長しているポリペプチドの中にチロシンを挿入せしめるナンセンスサプレッサーが最も所望される。このようなチロシン−挿入ナンセンスサプレッサーは、チロシル−ｔＲＮＡのアンチコドン領域を変えてチロシル−ｔＲＮＡがｍＲＮＡにおける正常のＵＡＵ及びＵＡＣチロシンコドンの代りにＵＡＧを読むような状態にすることによって作られうる。正常チロシル− ｔＲＮＡはチロシンう。その他の２種類のナンセンスコドンのためのナンセンスサプレッサーを作ることもできる。例えば、ＵＧＡ終止コドンのトリプトファン −又はロイシン−挿入サプレッサーが、その他の多数のナンセンスリプレッサーと同様によく特徴付けられている。多数のナンセンスサプレッサーのヌクレオチド配列が知られている；そしてそれ故、このような分子の作製は当業者に明らかであろう。

哺乳類翻訳系のナンセンスサプレッサーはよ（知られている（ＢｕｒｋｅとＭｏｇｇ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、１３　：　１３１７−１３２６＋１９８５　；　Ｃａｐｏｎｅら、ＥＭＢＯＪ、土：　２１３　２２１．　１９８５　ＨＤｉａｍｏｎｄら、釦旦　２５　：　４９７　５０６．１９８１　ＨＨｕｄｚｉａｋら、如旦　３１　：　１３７−１４６．　１９８２　；　Ｌａ５ｋｉら、ＥＭＢＯＪ、３　：２４４５−２４５２．　１９８４）。

更に、別の研究者は、真核細胞インビトロ翻訳系におけるナンセンスコドンの「解読」は、酵母由来のチロシン−挿入ＵＡ（１，サプレッサーｔＲＮＡを含むサプレッサーｔＲＮＡの利用により可能であることを示した（Ｃａｐｅｃｃｈｉら、釦旦旦：２６９−２７７、１９７５　；　Ｇｅ５ｔｅｌａｎｄら、釦旦工：３８１−３９０．１９７６）。

このような酵母サプレッサーによるＵＡＧ終止コドンの読み過しくｒｅａｄ　ｔｈｒｏｕｇｈ）はインビトロで７０％はどの高さであることが報告されている（Ｐｅｌｈａｍ、　Ｎａｔｕｒｅ　２７２　：　４６９−４７Ｌ１９７８）。Ｇｅ１ｌｅｒとＲｉｃｈ　（Ｎａｔｕｒｅ　２８３　：　４１−４６．１９８０）は、酵母サプレッサーｔＲＮＡより、並びに細菌性サプレッサーｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼより、網状赤血球系におけるナンセンスコドンの抑制に成功した。従って、翻訳段階の際にリポソームからのポリペプチドの早期遊離を引き下げるための本発明におけるｔＲＮＡサプレッサーの利用は、当技術的水準の範囲に属する。更に、Ｐｅｌｈａｍ　（前記、１９７Ｂ）及びＧｅ１ｌｅｒとＲｉｃｈ　（前記、１９８０）の両者は真核翻訳系における高レベルの天然ナンセンスの抑制を詳細している。特にＰｅｌｈａｍは、モザイクウィルスにおいて特にＵＡＧコドンが「Ｍ　ｇ　ｚｏの超最適濃度」又は報告されている２、１ｎ＋ＭのＭｇＣＩｚにより、現状の４０％近く「解読」　（抑制）されうろことを示している。従って、このレベルのマグネシウムイオン（又はそれ以上）はナンセンスコドンの読み通しを高めるため、そしてそれ故長いセミランダムヌクレオチド配列の翻訳終結の問題を引き下げるために本発明において好適に利用される。

化学的手段によってセミランダムＤＮＡを作り上げることにおいて、選んだコドン位置での異なる塩基の混合が特定のアミノ酸の偏りのために利用されうる。例えば、コドンにおける第３の位置でのＧの削減は、ペプチド中にメチオニン及びトリプトファンが含まれる妨げとなる。他の例として、高システィン含有に向けて偏らせたヌクレオチド混合物は、構造の強化のために内在ジスルフィド結合を有す短いペプチドを製造するために所望されている。このような頑強ペプチドはその他の分子とより強く結合しうる。

このような人工ヌクレオチドの第２鎖合成は「ランダムプライミング」及びＤＮＡポリメラーゼによる伸長により、並びに／又はポリーｄＸ尾部であってポリ− ｄ　Ｘとプライムするものを含ませることにより、成し遂げられうる。その他の方法、例えば自己プライミングのための「ヘアービンループ」を作り上げる末端パリンドロームの利用を第２鎖合成のために利用しうる。１００個のヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ１００μｇは約１０′５個の分子を含む。もしセミランダム合成手法を利用した場合、このような分子それぞれが異なるポリペプチドをコードすることが予測される。従って、非常に大いなる多様性が実験室レベル量のＤＮＡにおけるコード化潜在能力に存在する。このような１００個のヌクレオチドの合成り　Ｎ　Ａ分子は例示の目的のためにのみ提供した；より長い配列も合成されうる。更に、より短い合成分子を作り上げ、そしてあらゆる長さのセミランダム配列を作るために互いにリゲートせしめることができうる。より短い分子はより長い分子よりも合成りＮＡの読み取り枠をよく保存するものと予測され、その理由は化学合成塩基のそれぞれの付加は１００％でないためである。従って、より短い人よりＮＡ分子の利用によってナンセンスコドンがより回避されうる。Ｔ４ＲＮＡリガーゼ又はその他の手段が短い一本鎖ＤＮＡを互いに連結せしめるために用いられうる。

セミランダムＤＮＡを作るための第３の方法は、この分子を５′非翻訳領域の３ ′末端上に直接的に重合せしめることである。Ｎ−末端ＩＤ配列を用いない場合、この重合はＡＴＧ開始配列のすぐ後に、又は好ましくはＡＴＧＧ配列のすぐ後（共通を椎動物開始部位及びＮｃｏＩ部位を共に保有するケ所）にて起こりうる。この重合のために最も一般的に利用される酵素は末端基転移酵素（通常中甲状腺に由来）であり、これはＤＮＡクローニングのためのホモポリマー領域を作るためによく利用される。しかしながら、異なるデオキシヌクレオチド三リン酸を混ぜ合わせることにより、ＤＮＡのセミランダムヘテロポリマーが遊離３’　− ＯＨを有すＤＮＡプライマー上において合成されうる。ここでも、一定のコドンに偏らせるため及びナンセンスコドンの頻度を引き下げるため、４種のデオキシヌクレオチド三リン酸の相対濃度を調節することによって、Ａ、Ｔ、Ｃ及びＧ塩基組成を操作する。特により少量のｄＡＴＰがナンセンスコドン（ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡ）の頻度を引き下げうる。呈、　ＤＩＪ　（Ｅ、ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼＩがＤＮＡの非鋳型（新規：　ｄｅ　ｎｏｖｏ）合成の実施において報告され、そして末端基転移酵素の代りに利用されうる（Ａ、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ、　ＤＮＡ　Ｒｅ　ｌ１ｃａｔｉｏｎ、　Ｗ、Ｈ，Ｆｒｅｅｍａｎ＆　Ｃｏ、、　Ｓａｎ　Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、　Ｃａ１ｉｆ、、　１９８０）　６その他の酵素又は化学方法も該発現ユニット上にＤ　Ｎ　Ａを直接重合せしめうる。

第２鎖の合成はランダムプライマー伸長により最も容易に成し遂げられうるが、しかしその他の方法も同様の結果を提供しうる。ここでも、ナンセンス抑制ｔＲＮＡの利用がこのセミランダムＤＮＡ配列における終止コドンの問題の解決に大きく役立つことができうる。

■、新規遺伝子の転写もしＤＮＡ発現ユニットをセミランダム配列を伴って用いると、ｍＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼによって容易に作り上げられうる。前述した通り、Ｔ７．Ｔ３及びＳＦ３　ＲＮＡポリメラーゼが市販され、そして非常に有効である。例として、Ｔ７プロモーターを有すＤＮＡ発現ユニットをＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより、その製造者の仕様書に従って処理せしめる。およそ５０のｍＲＮＡコピーが各ＤＮＡ分子について３０分で通常合成されうる。このＤＮＡはＲＮａ　ｓ　ｅを含まないＤＮａ　Ｓ　ｅにより分解されうる。もしオリジナルＤＮＡライブラリーが１０１２個の分子の多様性の配列を有す場合、得られるｍ　ＲＮ　Ａのプールは同一レベルの多様性を示すがしかし尚も５０又はそれ以上の異なるＤＮＡ分子のそれぞれのＲＮＡコピーを含むであろう。６μｇのＲＮＡライブラリーは、３０個のアミノ酸のセミランダムポリペプチドをそれぞれ発現可能な１０′２種の異なるｍＲＮＡの５０コピーを含みうる。小さな試験管中で６μｇは取り扱い易いため、標準的な実験器具及び容器が利用されうる。

ｍＲＮＡの５′末端は真核細胞系における効率的な翻訳のためにジグアノシン三リン酸「キャンプ」　（又は類似体）の付加による修飾を必要とする。この５′ キシンプ化ｍＲＮＡはインビトロ転写（Ｈｏｐｅと５ｔｒｕｈｌ、　Ｃａ旦　４３：　１７７−１８８゜１９８５）及び／又はインビトロ翻訳工程（Ｋｒｉｅｇと門ｅｌｔｏｎ、　Ｎｕｃ−Ｉｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　１２　：　７０５７−７０７０．１９８４）の際中に作られうる。転写にわたり情報物をキャンプするため、ＣＴＰに対して過剰量のジグアノシン三リン酸又はその類似体（例えばｍ７Ｇ　（５’　）　ｐＰ　Ｐ　（５’　）Ｇ　；ベーリンガーマンハイムハイオケミカル社）がＲＮＡ重合の間に利用される。この方法に基づ＜ｍＲＮＡのキャッピングキットはストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）　（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）より市販され、これは得られるＲＮＡの９０％−９５％をキャップする。

もしこの発現ユニットがＱＢレプリカーゼ系のようにＲＮＡを基礎とする場合、い（つかのＲＮＡコピーが、この新規遺伝子構造体がＤＮＡをプラスミドを含むならばＴ７又はその他のプロモーターにより作られうる（Ｌｉｚａｒｄｉら、前記、１９８８を参照のこと）。ＲＮＡコピーが存在すると（又は新規遺伝子がＲＮＡレヘレベル立てられる場合）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは事実上無数のＲＮＡライブラリーのコピーを作ることができる（１０億のコピーは容易に達成されうる）。しかしながら、このライブラリーの多様性はそのままである。

ＲＮＡファージ、例えばＱＢにより、このライブラリーはＤＮＡ中間体を経る必要なくＲＮＡレヘレベル自己維持（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｉｎｇ）　Ｌ／うる。

ＩＶ、ＲＮＡの翻訳複数のインビトロ翻訳法が広く知られている。都合上、若干の改良を伴ってウサギ網状赤血球又は小麦胚芽系が利用さうる。インビトロ翻訳キットは市販されている。例えばへ−リンガーマンハイムハイオケミカル社の「トランスレーションキット、網状赤血球、型Ｉ　Ｊ　（”Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ、　Ｒｅｔｉｃｕ−１ｏｃｙｔｅ、　Ｔｙｐｅ　Ｉ”）は１００種の翻訳反応のための全ての成分を有する。各反応は２５μｍの容量中の約１μｇのｍＲＮＡにて最適である。１μｇのｍＲＮＡは前記した通り、４×１０１２種以上の新規遺伝子をコードするのに十分である。従って、比較的少量において非常に大きい数の新規遺伝子を翻訳可能である。例えば１０１３個の８ＯＳリポソームは約６６μｇの重さのみである。ｍＲＮＡの小さいサイズのため、１情報当り数個のリポソームでｍＲＮＡを飽和せしめるものと予測される。

上記の代表的な翻訳キットのプロトコールに詳細のＪす、ＧＴＰ及びｍ７Ｇ　（５’　）ＰＰＰ　（５’　）Ｇがインビトロ転写ＲＮＡの効率的な翻訳のために必要とされる。ｍＲＮＡキャッピングが転写の際に既に行なわれている場合でさえも、前記の通りこの翻訳反応にジグアノシン三リン酸（又はその類似体）及びグアニリルトランスフェラーゼ（ＫｒｉｅｇとＭｅｌｔｏｎ。

前記、１９８４）を加えることが好都合でありうる。転写の際にキャッピングを行わない場合、この２種の試薬はｍＲＮＡの効率的な翻訳に必要でありうる。特にＱＢ構造体が翻訳される場合、ジグアノシン三リン酸（又はその類似体）及びグアニリルトランスフエラーゼは翻訳の際にＲＮＡ分子をキシ。

ピングするために必要でありうる。

翻訳の最適化及び特にｍＲＮＡへのリポソームの結合のためにその他の技術も採用されうる。例えば、リボヌクレアーゼインヒビター、例えばヘパリンを加えることが所望されうる。真核細菌系、例えば小麦胚芽及び網状赤血球翻訳法は原核細胞系と類似の結果をもたらしうる。原核細胞系はより小さいリポソーム及びより容易に入手できるナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの利点を有す。更に、原核細胞において転写及び翻訳はしばしば同時反応である。原核細胞において転写と翻訳の組合せが行なわれない場合、ｍＲＮＡの安定性は大きく下がる。従って、転写及び翻訳の組合さる原核細胞インビトロ発現系が利用されうる。

前記の通り、本発明の好ましい態様は、サプレッサーｔＲＮＡ（特にチロシン− 挿入サプレッサー）であって、組換ＤＮＡ工学及び／又は突然変異細胞系由来のこれらの分子の部分精製により得られるものの利用にある。放射活性アミノ酸、特に３３５−メチオニンはインビトロ翻訳のモニターのため及びその後の段階における微量のポリソームを追うために有用でありうる。

約３０−６０分後、翻訳反応においてタンパク質合成は開始する。任意に付与した翻訳条件のセントについての正確な時間は、放射性活性アミノ酸（例えば３３５−メチオニン）及びＴＣＡ沈殿計測であってポリペプチド合成の指標であるものによって決定される。タンパク質合成の開始後、最終濃度μｇ／ｎ＋１でのシクロへキシミドをｍ　ＲＮ　Ａ上のリポソームの移動の防止のために加える（Ｌｙｎｃｈ、　Ｍｅｔｈ、Ｅ旦ｙｐ、　１ｍ　：　２４８２５３、１９８７）。このレベルのシクロへキシミド及び５ｍＭのＭ　ｇ　Ｚ　’濃度がｍＲＮＡ−８ＯＳリポソーム−形成期ポリペプチド複合体（ポリソーム）の維持のために利用されうる。その他のリポソームインヒビターも利用されることがあり、何故ならシクロへキシミドは例えば原核細胞リポソーム上では働かないためである。しかしながら、ＧＴＰの非存在下において、ポリペプチドのリポソームからの遊離は通常起きない。

■、対象の物質へのポリソームの結合形成期ペプチドが結合しうる潜在化合物のリストは事実上無限である。このような化合物のカラム、マトリックス、フィルター、ビーズ等への結合のためのカプリング化学剤はこの化合物の性質に大いに依存するであろう。ある場合において、完全細胞又は細胞画分が細胞成分、例えばりセブタータンパク質及びその他の膜結合型分子に結合するペプチドを見つけるために利用されうる。

多数のタンパク質及び核酸に対するニトロセルロース又は類似の人工表層への結合性はフィルター又はファイバーの特性である。このような場合において、対象の物質を確立されたプロトコールによって膜に付着せしめる。牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、カゼインもしくは脱脂乳又はその他のタンパク質性物質を次に過剰量において一般的に加え、すべての「自由」表層部位に結合させる。

例えば抗体の溶液をマイクロタイターディツシュ中のニトロセルロースディスり上に加えることによって抗体をまずニトロセルロースに結合させる。この抗体をニトロセルロースに吸収させた後、このニトロセルロースディスクを食塩水を含む新しいマイクロタイターディツシュに移すことによってこのディスクを洗浄する。洗浄後、このディスクを溶液中のゼラチンを含むマイクロタイターディツシュに移す。次にこのディスクを再び食塩水で洗浄する。

ポリソームを対象の物質に結合させる前に、このポリソーム混合物を前述の通りに過剰量において使用したＢＳＡ、ゼラチン、そして特にタンパク質性物質（ブロンキングタンパク質）に予備吸収せしめることが所望されうる。この方法において、ブロッキングタンパク質に結合するか又は任意のタンパク質に非特異的に結合するポリソームが除去される。この予備吸着段階は対象の１７１賞に結合するより特異性の高いポリソームをもたらすであろう。特異的な抗体に結合させるため（上記の場合と同様に）、この（複数の）予備吸着段階はその他の抗体、好ましくは類似のクラスであるが異なる可変／超可変領域を有す抗体を含みうる。

一般的に抗体とは結合するが可変／超可変領域には結合しないポリソームをスクリーニングして排除することにより、本発明は抗イデイオタイプ結合タンパク質を選ぶために有用でありうる。このような分子は生物学的もしくは酵素的活性（いくつかの抗−イディオタイプ抗体に見られるように）を存すか、又はワクチンとして有用である。

対象の物質へのポリソームの結合はＭｇＣＩｚ　（５ｍＭ）及びＲＮａ　ｓ　ｅインヒビター、例えばヘパリンの存在下において成し遂げられうる。更に、特定のインキュベーションパラメーター（例えば低もしくは高温度、高もしくは低量の塩、又は異なるｐＨ）が、環境に依存して条件的に結合するポリペプチドを見い出すのに利用される。インキュベーション時間は対象の物質の結合濃度及びこのような物質の性質に依存するであろう。

■、（複数の）対象の物質に結合するポリソームの単離ポリソームを対象の物質に選択的に結合させた後、未結合のポリソームを洗浄により一般的に除去する。

この洗浄液はＭｇＣ１□及びおそらくポリソームの非特異的な結合を減するのに役立つゼラチン、ＢＳＡ又はその他のタンパク質を含むべきである。もし放射性標識アミノ酸を翻訳において用いる場合、対象の物質に結合する放射性活性物質のカウントにおいてわずかな検出可能な変化が見られる迄洗浄（系列的又はフロースルー）を続けるべきである。もしこのアミノ酸が標識されていない場合、ポリソーム溶液の少なくとも１ｏ−６希釈が得られる迄洗浄を続けるべきである。

これらの洗浄後、結合しないために所望される環境、例えば高温、異なるｐＨ１高金属イオン濃度又は低塩濃度にこのポリソームを移すことにより、条件的に結合性の新規ペプチドを単離する。この第２（緊張）条件のもとで結合しないこれらのペプチド（及びそれらＬこ結合しているリポソームｍＲＮＡ複合体）は溶液中で遊離し、そして対象の物質に対する潜在的な条件的結合性因子を代表するであろう。固定化せしめたら、条件的結合性ペプチドは対象の物質の精製に利用されうる。他方、条件的結合性ペプチドは環境変化のモニターにおける試薬として働きうる。

■、単離化ポリソームの解離この単離化（結合）ポリソームはＭ　ｇ　２−の除去（希釈もしくはキレート剤を介して）又は多数の方法によるタンパク質の破壊（プロテアーゼ、クロロホルム等）によって容易に解離しうる。希釈が最も簡単な方法ではあるが、これはその他の方法に比べてポリソームの完全なる解離をもたらさないことがある。ｍ　ＲＮ　Ａを遊離化させるために結合ポリソームをＭｇ−２の含まない溶液に移す；ＲＮａｓｅインヒビターが所望される。

任意の所望する環境のもとて遊離せしめた条件的結合性ポリソームを、ポリソームを解離せしめてそれらのｍＲＮＡを遊離せしめるのと類似の方法において処理することができうる。

■、メソセンジャーＲＮＡの回収及びｃＤＮＡの作製理論的にもし対象の物質に結合している単一ポリソームがｍＲＮＡを保有している場合、この微量ｍＲＮＡはｍ　ＲＮ　Ａのライブラリー全体から単離（回収）されることができる。

このｍＲＮＡは単離を促進せしめるためのいくつかの技術によって増幅されることもできうる。

ＤＮＡの単一コピー及び微１１ｍＲＮＡにおけるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の利用はよく報告されている。（Ｅｒｌｉｃｈ（ｍ）、ＰＣＲＴｅｃｈｎｏｌｏ　、　５ｔｏｃｋｔｏｎ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、　Ｎ、Ｙ、。

１９８９　；　Ｍ、Ａ、Ｉｎｎ１ｓ　ら　（り、　ＰＣＲＰｒｏｔｏｃｏｌｓ：　Ａ　Ｇｕｉｄｅ　ｔ。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　Ａ　１ｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ　Ｄｉｅｇｏ。

ＣａＬｉｆ、、　１９８９　；Ｉ（、Ａ、Ｅｒ１ｉｃｈ　（Ｗ）＋　Ｐｏｔ　ｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃ−ｔｉｏｎ　：　Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｉｏ　、ＣｏｒｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ、　Ｎ、Ｙ、＋　１９８９＋を参照のこと）。闇単に述べると、微量ｍＲＮＡをまず標準の方法によりｃＤＮＡ合成にかける。５′及び３′領域の配列は既知であるため、特定のプライマーをｃＤＮＡ合成のために利用できうる。第２に、単−ｃＤＮＡを特定のプライマーの利用（ｃＤＮＡ合成に利用するものと同一のプライマーさえも利用できる）を介して次に増幅せしめる。ＰＣＨのために利用するプライマーはオリジナルの発現ユニットの５′及び３′領域を保有する配列を含むことができ、ここでプロモーター（例えばＴ７ポリメラーゼ認認識列）及び３′領域を保有する配列が所望される。この方法において発現ユニットを再生せしめることにより、転写−翻訳−ポリソーム選別の繰り返しラウンドを、実質的に全ての選別遺伝子が結合性ペプチドをコードするようにする迄行うことができる。ＲＮＡファージ、例えばＱＢ、を基礎とする発現ユニットに関しては、微量ｍ　ＲＮ　Ａの回収及び増幅は容易化され、その理由は適当なレプリカーゼを利用することにより各ｍＲＮＡは１ｏ億以上のコピーを複製可能であるからである。

■、新規遺伝子の発現新規遺伝子を単離且つシーケンス化せしめたら、それら又は関連する配列を当業界によく知られる方法により（１）りローン化し、（２）化学的に再生し、（３）突然変異せしめ、そして（４）発現させる。新規ポリペプチドの大量生産は遺伝子操作微生物を用いる組換ＤＮＡ法を介して成し遂げられうる。新規の結合性ペプチドのインビトロ合成のために多彩なる真核及び原核発現系が存在する。前記した適当なＮｃｏ　１部位又はその他の制限部位が、この新規遺伝子のコード領域を所望のプロモーターに接続させるために利用できうる。その他の遺伝子スプライシング法が同様に存在していることが当業者に明らかであろう。微生物における新規遺伝子の適切な発現のためにこの遺伝子の３′末端に翻訳終止コドン及び転写終結配列を加えることができうる。この遺伝子操作配列を次にプラスミド又はベクターに移し入れ、そして形質転換、形質導入、感染、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション又はその他の類似の方法により所望の宿主細胞に移し入れる。得られる遺伝子生成物を定量且つ精製するためにこの新規ペプチド配列を微生物から分泌されるようにシグナルペプチドに連結せしめること及び／又は本明細書詳細の通りにＴＤペプチドを含ませることができる。この新規ペプチド又は関連する配列を、遺伝子操作生物において同様に発現するバイブリド又は融合タンパク質を形成せしめるためにその他の翻訳化配列に連結させることができうる。他方、商業的な量のポリペプチドを生産するために大量インビトロ転写及び翻訳法が利用されうる。

最後に、この新規ペプチドのアミノ酸配列が短いならば、通常の有用な技術がポリペプチドの大量化学合成を可能にする。新規ペプチドの化学合成はインビトロ及びインビボ（生体内）発現系に勝る利点を有す。これらの利点の中で、化学合成は（１）よりよく定義され、従って合成のためのより再現性のある系であり、（２）ＤＮＡ及びＲＮＡの夾雑起源を有さす、（３）ヌクレアーゼ、プロテアーゼ及びその他の改質酵素の夾雑起源を有さす、そして（４）合成の後に比較的純粋な生成物を提供する。

的結合の量に依存して、所望のポリペプチドをコードする配列の度数を高めるために任意の回数の前述した翻訳−転写御粘合一回収のサイクルを選びうる。例えば、もし各サイクルが所望の新規遺伝子の度数を１０４倍高めるなら、１０−【２の度数にてオリジナルライブラリーに存在する配列の単離のためには３回のサイクルが十分でありうる。各サイクルは１〜３日で完了する；そしてこの方法の多数の段階は自動化ワークステーション又はロボットにより行なわれることがある。

従って、所望の結合活性のための多数のサイクルは通常１週間以内に成し遂げられうる。

Ｘｌ、ポリソーム結合を伴わない翻訳化生成物の活性についてのスクリーニング本発明の１態様は遺伝子の単離のためのポリソーム結合を必要としない。その代りに、新規ポリペプチドがリポソームから遊離することがもたらされる完了時迄インビトロ翻訳を進行させる。これはナンセンスコドンの利用又はリポソームのｍＲＮＡの末端からの「脱離」により成し遂げられる。この新しいペプチドは、この翻訳生成物の濃縮のためにゲル濾過及び／もしくは遠心、並びに／又はその他の手段により、リポソーム及びその他の翻訳反応の成分から分離できうる。

次にこのペプチド混合物に生物学又は酵素活性を表現させる。

例えば、成長因子に欠く組織培養細胞を処理することにより、このペプチドをミトゲン活性についてアッセイする。

該新規ペプチドの全体又はサブセント内に生物学もしくは酵素活性が観察されるなら、この活性をコードする遺伝子は、オリシリナルライブラリー又はこのライブラリーのＲＮＡコピーを再分せしめ、そしてこの再分体における活性についてスクリーニングすることにより見い出すことができうる。適切な再分後、この所望遺伝子を（例えば）１０００種類以下の配列を含むプールへと単離化せしめることができうる。理論上、この所望遺伝子は再分により完全に単離できうる（たった１つの遺伝子を含むプール）。ＰＣＲ，ＱＢレプリカーゼ又はその他の方法（前記の通り）により、所望の配列は、インビトロ転写及び翻訳が生物学／酵素活性を有す高い純度のペプチド溶液を提供するレベル迄増幅されうる。１〜１Ｏ −３の度数で、この対象の遺伝子を常用の方法を用いて単離且つ適切な発現系にクローン化せしめることが容易にできうる。

Ｘ■、新規遺伝子及びペプチドの無細胞同定予測の結合性又は生物学活性を有す新規遺伝子を単離させた後、この精製配列が対象の活性をコードするかを、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを増幅せしめて大量インビトロ翻訳のために十分なｍＲＮＡが生産されているかによって確認する。この精製配列の翻訳生成物はアッセイ可能な活性を有すほぼ均一なポリペプチドであるべきである。この遺伝子及び／又はポリペプチドは新規ポリペプチドの組成を確定する現存の方法によりシーケンス化されうる。他方、この精製遺伝子を増幅及び発現のために微生物の中にクローン化せしめることもできうる。その後、新規遺伝子及びポリペプチドについての生物学／結合活性及び配列同定を確定しうる。

Ｘ■、新規バイブリドタンパク質の作製新規遺伝子についての核酸配列が決定された後、該新規ペプチドの特性及びその他の所望する性質を有すバイブリドタンパク質を作るために該配列をより大きい遺伝子の中に組入れる。この方法により作られうる１つのクラスのバイブリドタンパク質は細胞への特異的な結合性及び細胞障害性能力により特徴付けられる。例えば、細胞表層リヤブタ−結合性ペプチドをＤＮＡスプライシング法を介してリジン又はその他の毒素に連結させることができる。このタイプのバイブリドタンパク質は、病原体及び腫瘍細胞を含む異なる細胞タイプを選択的に殺傷するために用いられうる。このバイブリドタンパク質をコードする遺伝子は完全合成されうるか、又は適当な遺伝子フラグメントの互いのスプライシングにより得られうる。この遺伝子は種々の発現系において発現されうる。

本発明の好ましい態様は、抗体並びに抗体様遺伝子の可変及び超可変領域を、対象の物質に対する結合活性をコードする新規遺伝子配列により置換することである。この方法におい、て、対象の抗原に対するより広い多様性が可能である；そしてスクリーニングプロセスは同一の抗原に対するモノクローナル抗体についての生産方法よりもより効率的且つ時間がかからないプロセスでありうる。このような「特注」じｃｕｓ−ｔｏＩ１１″）バイブリド抗体遺伝子は、新しい特異性又は性質を有す活性抗体を生産せしめるよう多数の生物において発現されうる。

ＸＩＶ、本発明のその他の商業的利用診断検査における本発明の適用はモノクローナル／ポリクローナル抗体の利用に匹敵し、そしてより好都合であり、その理由は第１に本明細書記載の新規ポリペプチドの単離はかなり短い時間で行われることにある（１週間に対して抗体は数ケ月）。更に、その他の利点も見られる。この新規ポリペプチドは抗体よりもかなり小さい分子である。従って、該新規ペプチドの合成、精製及び／又は製造は抗体に比べて容易であり、且つ安価である。このより小さいサイズは安定化、製剤化及び標的分子への到達にも役立ちうる。

この新規ポリペプチドは、（１）これらを定量可能な活性（例えばペルオキシダーゼもしくはその他の酵素活性）を存す生物学的に活性なペプチドに融合させる、（２）現存している抗体に結合するものと分っている前記のＩＤペプチドとそれらを合成せしめる、（３）これらを放射性活性標識せしめる、（４）マーカー、例えば蛍光色素もしくは金属性物質を化学的に付加せしめるか、又は（５）上記の任意の組合せにより、同定可能でありうる。この新規ポリペプチドの診断利用において特異性を高めるため、２種以上の異なるポリペプチドを利用できうる。更に、新規ポリペプチドを、抗原又は基質への競合的な結合性に基づく診断検査における競合的結合性構成要素として利用しうる。

本発明によって作られる新規ポリペプチドの他の利点は、それらが強い免疫応答を引き出すことのないであろう多数のクラスの分子と結合しうることにあり、その理由はい（つかの分子は抗体の形成を誘発するほど複雑でない、又は生物に内在する成分に似すぎているためである。更に、診断結合性アッセイにおける新規ポリペプチドの利用は、伝統的な抗体を基礎とする方法よりもより広い目的を有しうる。

オリジナルの状態で単離した又は融合タンパク質の一部としての本発明の新規ポリペプチドは治療的にも利用されうる。

例えば、一定の毒素に結合せしめるために新規ポリペプチドを選んだ場合、これは該毒素を中和することもある。もし新規ポリペプチドを細胞膜上のウィルスリセプタ一部位又はウィルス結合メカニズムに結合させた場合、細胞の感染化は小さくなりうる。先に述べた通り、毒素の他に新規ポリペプチド認識配列を保有する融合タンパク質が疾患性又は悪性細胞を選択的に殺傷せしめるのに用いられうる。感染又は悪性細胞への新規配列の結合は、細胞−ペプチド複合体に対する免疫応答の引き金となることがあり、従って疾患の抑制に有用でありうる。

！施■ 以下の実施例は例示であって限定ではない。これらの実施例において、夾雑活性物質を含まない（使用する際に）標準試薬及び緩衝液を利用した。リボヌクレアーゼ及びＰＣＲ生成物の夾雑を回避する注意を払うことが好ましい。

実施■土！Ｌ規」−一　−イブラリ−の４新規遺伝子ライブラリーを作るための配列及び手法は当業者による慎重な計画を必要とする。発現ユニットの５′非翻訳領域はＲＮＡポリメラーゼ部位、リポソーム結合部位、開始コドン及び選ばれた５′非翻訳配列を含む。本実施例において利用したポリメラーゼ結合部位はＴ７プロモーター、ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ　（２３−ｍ　ｅ　ｒ　）であり、これは該発現ユニットの５′末端に位置する。Ｔ７プロモーターより合成したＲＮＡの翻訳のために、ウサギ網状赤血球系を利用した。従って、このリポソーム結合部位は真核細胞非翻訳領域についての共通配列の少なくとも一部を含むべきである。

参照論文において、Ｋｏｚａｋ　（前記、１９８７）は非常に短い非翻訳領域（１０個のヌクレオチド以下）はタンパク質合成を効率的に開始せしめないものと述べている。ここでは３６個のヌクレオチドの選択した非翻訳領域を利用している。この非翻訳領域は成体ウサギヘモグロビン（アルファー−グロブリン）の天然（３６塩基付）上流配列：ＡＣＡＣＴＴＣＴＧＧＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣ，へｊ四ＧＧに由来し、ここで下線部のＡＴＧはメチオニン開始コドンでの翻訳の開始位１を示す（Ｂａｒａｌｌｅ、　Ｎａｔｕｒｅ　２６７　：　２７９−２８１゜１９７７）。ウサギアルファー−グロブリン非翻訳配列を選んだ理由は、（１）これはウサギ網状赤血球系における好適な基質であると期待され、そして（２）これはＫｏｚａｋのモデルｍＲＮＡの重要な「モチーフ」含むからである。

アルファー−グロブリン配列はインビトロ遺伝子発現のための以下の方法において改質される。第１に、５′のＡ（上記の下線部）を旦により置換してｍＲＮＡのキャッピングに役立たせる（Ｇｒｅｅｎら、並旦　３２：　６８１−６９４．１９８３）。第２に、Ｇ（アルファー−グロブリン配列における下線部）をＡと交換し、ベーター−グロブリンｍ　ＲＮ　Ａに比べてタンパク質合成の開始を６０％引き下げるものと考えられている（Ｂａｒａｌｌｅ、前記、１９７７）アルファー−グロブリンの非翻訳領域における予測される二次構造をなくすことに役立たせる。この第２の変化は５′非翻訳領域において適当なるＧＡＴＣ制限部位をも作り上げる。コード領域のＡＴＧＧを含む得られるリーダー配列は従って以下の通りである：ＧＣＡＣＴＴＣＴＧ八ＴＣＣＡＧＴＣＣへＡＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣＣＡＣＣ工Ｇこのリーダー配列をＴ７プロモーターのすぐ下流に置いた。

３′領域は、（１）特定−プライマー依存性ＤＮＡ合成のための選ばれた配列、（２）形成期ポリペプチドに、対象の物質を結合させるための自由空間を提供するポリグリシンつなぎ鎖をコードするＧＧＧに冨む領域、及び（３）適当な制限部位を含み、結果としてのＲＮＡ二次構造はｍＲＮＡから脱離するリポソームのトランスロケーションを妨げうる。このポリグリシン領域はグリシンに関する２０個のコドンを含んで成り；はとんどのグリシンコドンは隣り合うＧＧＧトリブレットであり、これは全ての解読枠においてグリシンをコードする。しかしながら、いくつかのグリシンコドンはＤＮＡ鎖を適当な記録体（ｒｅｇｉｓｔｅｒ）に保つためのＧＧＴ又はＧＧＡである。ＢａｍＨＩについての制限部位（ＧＧＡＴＣＣ）及びＮｏｔＩについてのそれ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）はこの遺伝子の３′ 末端の非常に近くに置くように選んだ；ｍＲＮＡにおいてこれらの配列はヘアピンループを形成するものと予測される。

ＮｏｔＩ配列による第２鎖の自己ブライミング（ヘアピンループの）を防止するため、３′末端にＡＡＡＡを付加した。

従って３′領域は（ＧＧＧ又はＧＧＴ／Ａ）２０の一般配列、それに続＜　ＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡを有す。この領域に特異的な配列を以下に挙げる。

セミランダム配列は、完全に詳細した５′非翻訳領域及び３′領域セグメントと塩基対合並びにリゲーションを受ける既知の５′及び３′末端により合成した。

この目的を成し遂げるため、このセミランダム遺伝子を、５′非翻訳領域の相補鎖上のオクタマーＣＣＡＴＧＧＴＧと塩基対合しうる５　’　ＣＡＣＣｖＩＧを伴って合成せしめた。開始（最初の）コドンＡＴＣはセミランダム配列の翻訳のために不可欠である。その後のＧは第２のコドンの第１位であり、そしてこれはＮｃｏＩ部位をこの遺伝子の前端に保存するために不変である。この第２コドンの残り及びそれに続く２８個のコドンはナンセンストリブレンドを減らすために最初に説明した法則に従って合成する。

即ち、第１のコドン位置において、等モル量のＣ，Ａ及びＧを用いるが、利用するＴの量は半分のみにする。第２のコドン位置において、Ａの量をその他の三種の塩基のレベルの半分に減らす。第３のコドン位置において、Ｇ及びＣのみを等モル量において用いる。

コドン３０を合成せしめた後、ＧＧＴＧＧＧＧＧを付加する。この配列は２個のグリシン残基をコードし、そして３′領域のセミランダム配列であってその反対の鎖に相補性のＣＣＣＣＣＡＣＣ突出しを有す配列をリゲートせしめるために用いる。この合成の結果物は、事実上３０個のアミノ酸ポリペプチドをコードする配列（メチオニンより始まる）であり、そしてポリグリシンつなぎ鎖を有す。このトリプレットの鎖に終止コドンのない確率はおよそ８０％である。逐次の翻訳の際に部分精製した酵母チロシン挿入ＵＡＧサプレッサーｔＲＮＡを用いることにより（Ｐｅｌｈａｎ＋、前記、１９７８）　、９０％のセミランダム配列が全長ポリペプチドをコードするものと予測される。

合成のための特定のオリゴヌクレオチドを以下に挙げる：１、Ｔ７プロモーター及び「グロビン」リーダー（遺伝子合成及びＰＣＨのため）：５　’　ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＧＣＡＣＴＴＣＴＧＡＴＣＣＡＧＴＣＣＧＡＣＴＧＡＧＡＡＧＧＡＡＣ３’　−０ＨＵ、抗−Ｔ７プロモーター及び「グロビン」リーダー（遺伝子合成のため）：５　’　ＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＣＣＴＴＣＴＣＡＧＴＣＧＧＡＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＣＴＣＣＣＴＡＴＡＧＴＧＡＧＴＣＧＴＡＴＴＡ　３　’　−ＯＨ（５’は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化） ■、セミランダム遺伝子（遺伝子合成のため）：５　’　ＣＡＣＣＡＴＧＧ・・・前記のセミランダム・・・ＧＧＴＧＧＧＧＧ　３　’　−０Ｈ（５′はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化）■、ポリグリシン及び３′制限部位（遺伝子合成のため）：５　’　ＴＧＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＴＣＣＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＡ八３’−０Ｈ（５’　は、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化）■、抗−ボリーグリシン及び３′部位（遺伝子合成のため）＝５　’　ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＣＣ３’　−ＯＨ■、抗−ポリ−グリシン及び３′部位（ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲのため）５　’　ＴＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＣＣＣ３’　− ＯＨ配列Ｉ及び■を等モル量において標準ＴＥ緩衝液中に混合し、そして６５° Ｃで５〜１０分間加熱せしめる。相補性の配列（５′非翻訳領域を含んで成る）を１時間又はそれより長く５０°−６０°Ｃでアニール化させ、室温迄ゆっくり冷却せしめ、そしてこれらをその後０°−４°Ｃで保存した。配列■及びＶを、二本鎖３′領域の形成のために同様に処理した。

この二重鎖はそれぞれ８個の塩基の一本鎖突出し配列を有し、これは配列■の既知の末端と相補する。

等モル量のＩ／■二本鎖、ＩＶ　／　Ｖ二本鎖及びセミランダム配列■をＴ４　ＤＮＡリガーゼにより、リガーゼ媛衝液中で１３°−１５°Ｃにて一夜すゲートセしめた。所望のリゲーション生成物を選別するためにこのリゲーション混合物を１．５％のアガロースゲル上で泳動させ、これはおよそ２００塩基対であった（もし完全に二本鎖であるなら２３３ｂｐであるがそうではなかった）。この’ ２００ｂｌ）Ｊ　ＤＮＡハンドをＮＡ４５紙（Ｓ＆Ｓ）によりゲル精製するか又は任意の複数のプロトコールにより精製した。全量２．５μｇ（約１０１３個のＤＮＡ分子を示す）又はそれより多くが所望される。

新規遺伝子の完全二本鎖合成がＤＮＡポリメラーゼ、フレノウにより、標準方法によって成し遂げられる。この二本鎖３′領域はセミランダム配列の「第２鎖」の合成のためのプライマーを提供する。新しく合成されたＤＮＡを配列■に連結させるためにＴ４　ＤＮＡリガーゼが利用され、これによってこの第２鎖におけるニックは補完される。このＤＮＡライブラリーをフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿させる。

完全に二本鎖となったＤＮＡ分子１０μｇは４×１０＋３の配列多様性を有す。

翻訳可能なｍＲＮＡを得るために、次にこのライブラリーをＴ７　ＲＮＡポリメラーゼによって転写する。しかしながら、ＤＮＡコピーを作らない限り、各転写によってこのＤＮＡライブラリーは消費される。このＤＮＡライブラリーを複製させるため、２００−μＩ反応におけるＰＣＲ増幅のために１１００ｎのこのアリコートを５００−μｍの試験管それぞれに分配した。匹しハ堕赳並■、頁１８ −１９　（Ｅｒ１ｉｃｈ、前記、１９８９）に従い、２００−μｌ　ＰＣＲ反応それぞれは、各アリコートにおいて約５．２μｇのＤＮＡ、又は約５０倍のＤＮＡの二本鎖を生成する。このアリコートをプールした。プールしたサンプルは各セミランダム配列のコピーを平均５０個含み、従ってＴ７　ＲＮＡポリメラーゼによる各翻訳についての多様性の大いなる損失を伴わずに繰り返し利用されうる（例えば、５０回）。もしこのライブラリーがＰＣＨにより複製される場合、前記のフレノウ補完及びリゲーシゴン段階は不必要となり、なぜならＴａｑポリメラーゼはギャップ及びニック−トランスレーションＤＮＡにおける補完が可能であるからである（Ｄ、Ｈ，Ｇｅ１ｆａｎｄ、　ＰＣＲＷｏｒ−ｋｓｈｏｐ、　５ｏｃｉｅｔｙ　ｏｆ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｍｅｅｔｉｎｇ、　５ｅａ−ｔｔｌｅ、　ＩＡａｓｈ、、　１９８９）。ニックトランスレーションの後、この遺伝子は二本鎖となり、そしてＰＣＲ増幅させることが可能となる。

ＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅のためのオリゴヌクレオチドプライマーの例は、配列■及び■において前記した。一般に、２５−３０塩基のオリゴヌクレオチドをＰＣＲ増幅のために用いる；しかしながら、より長いプライマーが利用されうる。これらのプライマーは有意な同−性又は相補性３′末端を分ち合わないことが重要である。配列■及び■は相補性であり末端を有し、そして広範囲にわたる明らかに同一性の領域を有さない。

更に、これら新規遺伝子配列の翻訳後のｍＲＮＡはＴ７プロモーター配列を欠損する。配列■は第１鎖ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして利用される。この方法において、翻訳のその後のラウンドは選ばれた新規遺伝子配列において可能である。ＰＣＲ増幅はもし得られるｃＤＮＡが比較的微量である場合に必要となりうる。

！施撚Ｉ頁反遺伝ヱ■転亙実施例１に詳細のＤＮＡライブラリー（又はそれらの配列の代表的な部分）をＴ７　ＲＮＡポリメラーゼにより転写せしめた。このＤＮＡ２．５μｇはほぼ１０１３種のポリペプチドをコードする。このＤＮＡはストラタジーンのｍＣＡＰ（商標）キットによって転写の際にキャップする（製造者の仕様書に従って）。約５−１０μｇのｍＲＮＡが期待される。

一般にＴ７　ＲＮＡポリメラーゼにより、このレベルのほぼ１０倍のＲＮＡが合成される；しかしながら、キャンピング反応のための条件はこの場合においてｍＲＮＡの製造を制限する。このＤＮＡを、このキットに付いているＤＮａ　ｓ　ｅ　Ｉにより除去した。キャンピングせしめたＲＮＡをフェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノールにより沈殿させた。

このＲＮＡを１０μＩのＴＥに再懸濁せしめ、そして０°−４°Ｃで保存した。

叉施拠盈ｌ腹這倣玉■■訳ギャップせしめたｍＲＮＡをヘーリンガーマンハイムハイオケミカル社のウサギ網状赤血球キットにより、２０種全てのアミノ酸をそれぞれ３１２．５μｎ＋ｏｌ　／　ｌにて翻訳した。

実施例２からのキャンピング化ｍＲＮＡを各反応液に、反応液当り０．５μｇにて加え、そしてこの製造者のプロトコールに従って処理せしめた。３０°Ｃにて約６０分後、シクロヘキシミドを最終濃度１μｇ／ｍｌにて加えた。Ｍ　ｇ　ＣＩ　ｚを５ｍＭとなるように調整し、そしてヘパリンを０．２ｍｇ／ｍｌとなる迄加えた。この反応液をプールし、そしてＬｙｎｃｈ　（前記、１９８７）に従い、不連続スクロース勾配にかけた。このポリソームを一７０°Ｃで凍結せしめるか、又は直ちに使用した。

ｌ施班土・　の　としての　の　ヒ新規の結合性ペプチドについて選別するために抗体が利用されうる。抗体の超可変／可変領域に結合するペプチド（「抗−ｉｄペプチド」）は、イムノゲンとして利用されるオリジナルエピトープのように働く。この新規抗−ｉｄペプチドはオリジナルエピトープを擬態するため、これらのペプチドはワクチンとして有用である、及び／又は生物学的活性を表現し、あたかもこの抗−ｉｄ抗体は生物学的（時折触媒）活性を有すものと示される。

有用な抗体の例は抗−フィブロネクチン、抗−神経成長因子、抗−ＣＤ４及び抗 −腫瘍壊死因子であり、これらは全てベーリンガーマンハイムバイオケミカル社より人手できる。

一般に、リセプター分子、成長因子、表層抗原及び生物学活性ペプチド、並びに毒素及び疾病のための中和抗体が、抗−ｉｄ結合性ペプチドであって、相乗もしくは拮抗特性を有すか又はワクチンとして働（ものを単離せしめるためのよい候補である。

これらの抗体をミリポア（株）由来のイモピロン（商標）ＰＶＤＦ　（ポリビニリデンジフルオリド）膜に、Ｐｌｕｓｋａｌら（Ｌ垣工加出り竺　土：　２７２ −２８３．１９８６）に従って固定した。

例えば、抗−フィブロネクチン抗体（クローン３Ｅ３由来；ヘーリンガーマンハイムハイオケミカル社）を、１００％のメタノールで「湿潤化」させた０、５ｃｏ＋Ｘ０．５ｃｍのＰＶＤＦ四辺形（ｓｑｕａｒｅ）上に吸収させ、そしてｌｏｍＭのトリス緩衝液ｐＨ７，４中の０．９％（Ｗ／Ｖ）のＮａＣ１（食塩水緩衝液）により２回洗浄する。必要な抗体の量は所望する抗−ｉｄペプチドの結合パラメーターに依存する；イモピロンＰＶＤＦはＩｇＧを１７２　ｕ　ｇ　／ｃｍ２結合せしめると報告されている。便宜上、食塩緩衝液中の抗−フィブロネクチンＩｇ０１　１μｇをＰＶＤＦ四辺形上に、室温で少なくとも２時間インキュベートすることによって吸収させた。次にこのＰＶＤＦを食塩緩衝液で２回洗浄した。次いでこの膜を、食塩緩衝液中に５％（Ｗ／Ｖ）のゼラチンを含む「ブロッキング溶液」により、室温にて少なくとも２時間インキュベートし、これによりゼラチンはＰＶＤＦの未結合化部位に吸着される。次いでこの膜を食塩緩衝液中の０．１％のゼラチンにより２回洗浄した。同様の処理を１０μｇの抗−ケラチン抗体（クローン３Ｅ３由来、ベーリンガーマンハイムバイオケミカル社）によって行い、これは下記のコントロールＩｇＧ１である。

１１Ａ工に　Ａ　のポリソーム形成期セミランダムペプチドを有すポリソームを１ｍｌの反応液においてインキュベートした。それぞれはＰＳ緩衝液（０，９％のＮａＣｌ、１０ｍＭのトリスｐＨ１，４，１％のゼラチン、１５ｍＭのＭｇＣ１２，０，２ｍｇ／ｍｌのヘパリン及び１μｇ／ｍｌのシクロへキシミド）並びに実施例４に記載の１０μｇの抗−ケラチンＩｇＧ１を有すＰＶＤＦ四辺形を含んだ。この予備吸着段階は緩かな撹拌を伴ってＯｏ−４°Ｃにて４時間にわたり行い、ゼラチン及びＩｇＧ１と非特異的に結合するポリソームを排除した。この抗−ケラチンＰＶＤＦ四辺形を宝石用ピンセットで取り出し、そして抗−フィブロネクチンＰＶＤＦ四辺形と交換した。この混合物を、同一条件のもとて更に４時間インキュベートし、特異的なポリソームを抗−フィブロネクチン抗体の可変／超可変領域に結合させた。この抗−フィブロネクチンＰＶＤＦ四辺形を取り出し、そしてそれらを新鮮なＰＳ緩衝液に系列的に３回移し換えることにより洗浄した。

災施開五ボ１ソーム　の　−ＩＤペプチド　コード　る　′　−子！壮り収洗浄せしめた抗体−結合ポリソームを保有するＰＶＤＦ膜を、Ｑ、１ｍＭのＥＤＴＡ　１００μｌを含む試験管に移し、そして室温で５−１０分間ゆっくり振騰させてポリソームを解離及びｍＲＮＡを遊離させた。このＰＶＤＦを取り出し、０．１ｍＭのＥＤＴＡの新鮮な試験管に移し、そして０°　−４゛Ｃで一夜又はそれ以上長く（予備品として）保存した。この第１のＥＤＴＡ処理から遊離したｍＲＮＡを逆転写せしめた；そして得られるｃＤＮＡを若干の改良を伴ってＰＣＲＴｅｃｈｎｏ一旦■（前記、１９８９）　、頁９１に従って増幅せしめた。ｃＤＮＡをプライムするためにランダムヘキサマーを用いる代りに、既知の３′領域に相補する配列（例えば下流プライマーとしての、先に挙げた配列■）をｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ反応の両方のために用いた。この逆転写酵素段階は、適当なその他の試薬の相対量を有すＰＣＲ緩衝液１００μｌ　（２０μｌ反応の代りに）中で行った。逆転写酵素反応後、この混合物を２０μｌのアリコートに分けた。そして各アリコートを、匹ＲＴｅ並匹並藍に詳細の通りに、配列■又は類似のＤＮＡ上流プライマーを用いて増幅させた。ＰＣＲ増幅後、５つのアリコートをプールし、フェノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿させた。このｃＤＮＡを次にＴＥに再懸濁させ、そして０°−４°Ｃで保存した。

選別したＤＮＡをＴ７　ＲＮＡポリメラーゼにより転写し、そして前記した網状赤血球系において翻訳させた。この場合において、所望する配列はオリジナルのＤＮＡライブラリーと比較して大いに増幅される。プログラムされたワークステーションにより大いに補助されながらのこのサイクルを繰り返すことにより、所望する新規遺伝子は常用のクローニング及び発現方法が実施できるレベル迄濃縮される。更に、遺伝子の低ボアシン分布への希釈により、単独の新規遺伝子が単離、増幅、転写及びこの遺伝子生成物の特異的な結合能力を示すよう翻訳されうる。結合性が示されたなら、この単離遺伝子及びポリペプチドを同定のためにシーケンス化する。

この新規なる結合ペプチドの配列がわかった後、本明細書に記載の通り、このペプチドの操作及び大量合成のために多数の方法が存在する。

１１拠１猪金１で１で」′に　する　ムアッセイ結合性ペプチドをコードする新規遺伝子を選別後、増幅せしめた回収ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａのプールを遺伝子の存在について＃アッセイした。ＩＤ配列をセミランダムＤＮＡ配列と一緒に発現させるために意識的に含ませている場合、ペプチドの既知の部分に対するＥＬＩＳＡ又はその他の免疫学的アッセイをペプチドの新規部分の対象の物質への結合性の検出のために用いる。しかしながら、ＩＤ配列がない場合及び／又は結合特異性の確認が所望される場合、ペプチドに対する競合アッセーイが行なわれる。競合ＥＬＩＳＡ試験を含む競合アッセイは、本発明により作られた種々のｃＤＮＡプールにおける結合性配列の存在についてモニターするために用いる。

１例は、抗−シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）外毒素（抗−ＰＥ）抗体に結合するペプチドをコード化する遺伝子に関するｃＤＮＡプールのスクリーニングである。抗−ＰＥ抗体に結合性のポリソームについての２ラウンドの選別後、得られるｃ　Ｄ　Ｎ　Ａブールの異なるアリコートを標準的な条件のもとで、約２００ｎｇのＤＮＡから出発して、Ｔ７　ＲＮＡポリメラーゼ（３０ユニツト）を有す２００−μｍ反応においてそれぞれ転写せしめた。このｍＲＮＡ生成物をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール抽出し、そして酢酸ナトリウム及びエタノールにより一２０°Ｃで沈殿させた。この沈殿物をそれぞれ遠心し、そして１６μｌの蒸留水に再懸濁させ、ヌクレアーゼを除去するためにジエチルプロカーボネートにより処理せしめた。

再懸濁せしめたｍＲＮＡを６５°Ｃで５分間加熱し、その復水の上に置いた。このｍＲＮＡを小麦胚芽キット（ベーリンガーマンハイムハイオケミカル社）により、製造者の推奨に従って翻訳した。各ＲＮＡサンプルを、２５マイクロキユーリーの３５３−メチオニン及び０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビターを有す５０ μｍの翻訳反応液中において発現させる。

この反応を３０°Ｃで１５−６０分間行った。この翻訳の終了時にこのサンプルをそれぞれ等分した。その半分は競合基質を含ませずに対象の物質と結合させ、他の半分は過剰量の競合基質の存在下において対象の物質と結合させるために用いた。この場合において、この対象の物質は抗−ＰＥ抗体である。この競合基質は、毒性タンパク質配列に由来し、抗体に競合することで知られる１４個のアミノ酸のペプチド（ＰＥペプチドである）。このペプチド配列は、Ｖａｌ　−Ｇｌｕ　−Ａｒｇ−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｎ　−Ａｌａ　−Ｈｌｓ　−Ａｒｇ　 −Ｇｉｎ　−Ｌｅｕ　−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇである。　Ｗｏｚｎｉａｋら、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、＋顕：　８８８０−８８８４　（１９８８）。

競合アッセイは９６−穴平底マイクロタイターディツシュ中において氷上で行った。標準１／４インチホールパンチによりイモピロンＰＶＤＦディスクを作り、そして”Ａ”と表示したウェルに入れた。５０μｍのメタノールを“Ａ”におけるディスクに加え、この膜を湿らし且つ殺菌した。このディスクをビンセットにより、１０ｍＭのＭｇＣ１ｇを含んだ２００μｍの食塩緩衝液（７３Ｍ緩衝液）を含むウェル゛Ｂ”に移した。このディスクをウェル“Ｃ゛°であってこれも２００μＩのＴＳＭを含むウェルに移すことによって更に洗浄した。

次にこれらを、３μＩの抗−ＰＥ抗体（４，６μｇ／μｍ）を含んだＴＳＭ　２５μＩを含むウェル“Ｄ”に移した。抗体をゆっくり振騰させながら（プラットホームシェーカー上で５０−１０　ＯＲＰＭ）氷上で３時間にわたりディスクに吸着せしめた。その後、２％の無ヌクレアーゼＢＳＡ７５μｌを”Ｄ”に加え、そして１時間１００１？ＰＭにて吸着させた。

このディスクを０，１％のＢＳＡを含んだＴＳＭ　２００μｍ中で（ウィルス゛ °Ｅ”と“Ｆ”）、各ウェルにおいて３０分間にわたり２回洗浄し、そしてペプチド結合のための準備ができた。ウェル“Ｇｎにおいて、２６μｌのＴＳＭと０．１％のＢＳＡを、前述した２５μｍの各翻訳反応液（小麦胚芽系５０μｌの半分）と混ぜた。半数の各“Ｇ”ウェルにｌμｌのＰＥペプチド（ＴＳＭ中で１ｍｇ／ｍｌ）を加え、新規の放射性活性標識化ペプチドの抗体への結合を競争的に阻害せしめた；これらのウェルを「＋ペプチド」と表示した。

コントロールの“Ｇ“ウェルに１μＩのＴＳＭを加え、そしてこれらのウェルを［無ペプチドコと表示した。ディスクを適当な“Ｇパウエルに入れ、そしてペプチドをこの固定化抗体に結合させるために氷上で１１００ＲＰにて３時間インキュベートせしめた。

結合反応の後、各ディスクを２００μｌの新鮮ＴＳＭ中で段階的に８回、０゛Ｃにて洗浄した。各洗浄は１０分間のインキュベーションによった。各ディスクの結合放射性活性はエコシフ　ト（Ｅｃｏｓｃｉｎｔ）の１ｍｌのカクテルを有す液体シンチレーシゴンカウンターで測定した。以下の表は、ポリソームの抗−ＰＥ抗体への結合に由来する、ｃＤＮＡの種々のアリコートにおける競合アンセイの結果を示す。

サンプル　ＣＰＭ　３５Ｓ−ＭＥＴＷＥＩ＋ペプチド　６９６９ＷＥＩ、無ペプチド　８３３７ＷＥ２＋ペプチド　６１６３ＷＥ２、無ペプチド　７６９３ＷＰＩ＋ペプチド　５７９２ＷＰＩ、無ペプチド　６３０３ＷＰ２＋ペプチド　５８４５ＷＰ２、無ペプチド　６３９８各場合において、競合するＰＥペプチドは無ペプチドコントロールに比べて、選別したｃＤＮＡプールの放射性活性標識化翻訳生成物の結合量を低めた。この結果は、抗−ＰＥ抗体に結合性のペプチドをコードする遺伝子配列の存在を示唆する。これらＤＮＡの単離及び特徴付けは、個々の遺伝子をプラスミド、例えばｐＵｃ１８．ｐＵｃ１９、ブルースクリプト及びその他の有用なヘクターにクローニングすることによって行なわれる。

国際調査報告ｐＣＴ／Ｉ’Ｔ、’ＨＮ／ｎｅｌＲＱ”１ｒＰｒｌ＋ｌ：　ｒ１２Ｘ’　ＩｊＩ／ｎｎ：　ｒ１２＼’　Ｆ／ｉｎ、　ｒ−ｎ７ｋ　７／（ＩＱ；　ＣＱ７１（＋５７１２響ｊ、ｒＬ：　Ｊｌへ／１７２．１；　’１Ｆ＋／２７・　５］０／１ ’＋ｎ

Claims

【特許請求の範囲】

１．新規ポリペプチドの生産のための方法であって、以下の段階（ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リボソーム結合性配列及び翻訳開始シグナルを含む５′非翻訳領域を含んで成り、ｍＲＮＡを生産することができるインビトロ発現ユニットを作製し；（ｂ）該発現ユニットに１又は複数のセミランダムヌクレオチド配列を連結せしめ；（ｃ）ｍＲＮＡを生産するために、該発現ユニット及びセミランダムヌクレオチド配列に関連する配列を転写又は複製せしめ；（ｄ）ポリソームを生産するために、該ポリソームを維持するのに十分な条件のもとで該ＲＮＡを翻訳せしめ；（ｅ）該ポリソームを対象の物質に結合せしめ；（ｆ）該対象の物質に結合している該ポリソームを単離せしめ；（ｇ）ｍＲＮＡを遊離させるために該単離化ポリソームを解離せしめ；（ｈ）該ｍＲＮＡを回収せしめ；（ｉ）該回収ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作製せしめ；そして（ｊ）新規ポリペプチドを生産するために該ｃＤＮＡを発現せしめること、を含んで成る方法。
２．請求項１に記載の方法であって、前記のｍＲＮＡの回収及びｃＤＮＡの作製の段階の後に、ポリメラーゼ連鎖反応によって該ｃＤＮＡを増幅せしめる方法。
３．請求項１に記載の方法であって、前記のセミランダムヌクレオチド配列がデオキシリボ核酸を含んで成る方法。
４．請求項１に記載の方法であって、前記のセミランダムヌクレオチド配列がリボ核酸を含んで成る方法。
５．請求項１に記載の方法であって、前記の発現ユニットか少なくとも１つのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む方法。
６．請求項５に記載の方法であって、前記のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＱ−ベーターレプリカーゼである方法。
７．請求項１に記載の方法であって、前記の回収の段階の後にｍＲＮＡを増幅せしめる方法。
８．請求項７に記載の方法であって、前記の増幅の段階が、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによる二本鎖配列の合成を含んで成る方法。
９．請求項８に記載の方法であって、前記のＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼがＱ−ベーターレプリカーゼである方法。
１０．請求項１に記載の方法であって、前記の単離の段階が、前記の対象の物質に結合しないポリソームを、系列的希釈又はフロースルー洗浄段階によって除去せしめることを含んで成る方法。
１１．請求項１に記載の方法であって、前記のポリソームの単離段階の後に、該ポリソームが前記の対象の物質から遊離するように選んだ緊張条件のもとに該ポリソームを暴露せしめる方法。
１２．請求項１１に記載の方法であって、前記のポリソームの暴露の段階が、該ポリソームの温度を高めること、塩濃度を下げること又は金属イオン濃度を高めることを含んで成る方法。
１３．新規ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リボソーム結合性配列及び翻訳開始シグナルを含む５′非翻訳領域を含んで成り、ｍＲＮＡを生産することができるインビトロ発現ユニットを作製せしめ；（ｂ）該発現ユニットに１又は複数のセミランダムヌクレオチド配列を連結せしめ；（ｃ）ＲＮＡを生産するために該発現ユニット及びセミランダムヌクレオチド配列に関連する配列を転写せしめ；（ｄ）生物学的に活性なポリペプチドを生産するために該ＲＮＡを翻訳せしめ；（ｅ）該生物学的に活性なポリペプチドをコード化するＲＮＡを再分せしめ；（ｆ）段階（ｃ）−（ｅ）に記載の通りに転写、翻訳及び再分せしめて、対象の遺伝子を単離せしめ；（ｇ）該単離化遺伝子からｃＤＮＡを作製せしめ；そして（ｈ）新規ポリペプチドを生産するために該ｃＤＮＡを発現せしめること、を含んで成る方法。
１４．新規ポリペプチドを生産するための方法であって、（ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リボソーム結合性配列及び翻訳開始シグナルを含む５′非翻訳領域を含んで成り、ｍＲＮＡを生産することができる発現ユニットを作製せしめ；（ｂ）該発現ユニットに１又は複数のセミランダムヌクレオチド配列を連結せしめ；（ｃ）ｍＲＮＡを生産するために該発現ユニット及びセミランダムヌクレオチド配列に関連する配列を複製せしめ；（ｄ）生物学的に活性なポリペプチドを生産するために該ＲＮＡを翻訳せしめ；（ｅ）該生物学的に活性なポリペプチドをコード化するＲＮＡを再分せしめ；（ｆ）段階（ｄ）−（ｅ）に記載の通りに翻訳及び再分せしめて対象の遺伝子を単離せしめ；（ｇ）該単離化遺伝子からｃＤＮＡを作製せしめ；そして（ｈ）新規ポリペプチドを生産するために該ｃＤＮＡを発現せしめること、を含んで成る方法。
１５．請求項１４に記載の方法であって、前記のＲＮＡを再分する段階の後に、前記の生物学的に活性なポリペプチドに関する新規遺伝子配列をポリメラーゼ連鎖反応又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより増幅せしめる方法。
１６．請求項１，１３又は１４に記載の方法により生産するポリペプチド。
１７．請求項１．１３又は１４に記載の方法であって、前記のリボソーム結合性部位が真核細胞性、原核細胞性又はウィルス性リボソーム結合性配列を含んで成る方法。
１８．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記のリボソーム結合性配列が、脊椎動物共通翻訳開始配列ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧ又は機能的に関連する配列を含んで成る方法。
１９．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の発現ユニットが選ばれるアミノ末端ＩＤペプチドをコードする配列を更に含んで成り、該配列が開始コドンに位置する方法。
２０．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の発現ユニットが選ばれる配列の３′領域を更に含んで成り、ここで該選ばれる配列は前記の新規遺伝子の増幅、クローン化、複製、精製及び単離を高める配列より成る群から選ばれる方法。
２１．請求項２０に記載の方法であって、前記の３′領域が、リボソームトランスロケーションの妨げのために採用するパリンドローム配列を含む方法。
２２．請求項２０に記載の方法であって、前記の３′領域がＣ末端ＩＤ配列を含む方法。
２３．請求項２２に記載の方法であって、前記のＣ末端ＩＤ配列が繰り返し配列を含んで成る方法。
２４．請求項２２に記載の方法であって、前記のＣ末端ＩＤ配列が抗体に結合できるペプチドをコードする方法。
２５．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の発現ユニットが、インビボで前記の新規遺伝子を発現させるために適合する制限部位を更に含んで成る方法。
２６．請求項２５に記載の方法であって、前記の制限部位の少なくとも１つが配列ＣＣＡＴＧＧを含んで成り、該配列が翻訳の開始する位置にある方法。
２７．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の発現ユニットがＴ７，Ｔ３又はＳＰ６ポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む方法。
２８．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記のセミランダムヌクレオチド配列が天然ＤＮＡもしくはＲＮＡを、機械的、化学的又は酵素的にフラグメント化せしめることにより作られる方法。
２９．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記のセミランダムヌクレオチド配列が、遺伝子配列を形成せしめるために化学的にヌクレオチドを合成せしめることにより作られる方法。
３０．請求項２９に記載の方法であって、前記のヌクレオチドを合成的に合成する段階が、（１）実質的に等モル量のＣ，Ａ及びＧ、並びに該実質的に等モル量の半分量のみのＴを第１コドン位置において利用し；（２）実質的に等モル量のＣ，Ｔ及びＧ、並びに該実質的に等モル量の半分量のみのＡを第２コドン位置において利用し；そして（３）実質的に等モル量のＣ及びＧ又はＴ及びＧを第３コドン位置において利用することを含んで成る方法。
３１．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の連結の段階が、前記のヌクレオチドを前記の発現ユニットの５′非翻訳領域の３′末端上に直接重合せしめることを更に含んで成る方法。
３２．請求項１又は１３に記載の方法であって、前記の転写の段階が、ジグアノシン三リン酸又はその類似体の存在下において前記の配列を転写せしめることを含んで成る方法。
３３．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の翻訳の段階が、ジグアノシン三リン酸又はその類似体及びグアニリルトランスフェラーゼの存在下において前記の配列を翻訳することを含んで成る方法。
３４．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の翻訳の段階か、ナンセンス抑制ｔＲＮＡの存在下において行なわれる方法。
３５．請求項３４に記載の方法であって、前記のナンセンス抑制ｔＲＮＡが、チロシン挿入性ナンセンス抑制ｔＲＮＡである方法。
３６．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の対象の物質が、表層抗原、リセプタータンパク質、毒素、有機ポリマー、中間代謝物、タンパク質分子の活性部位、ホルモン、抗体及び汚染物質より成る群から選ばれる方法。
３７．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の対象の物質が抗体の可変／超可変領域である方法。
３８．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の対象の物質がリセプタータンパク質である方法。
３９．請求項３８に記載の方法であって、前記のリセブタータンパク質が成長因子リセプタータンパク質である方法。
４０．請求項３９に記載の方法であって、前記の成長因子リセプタータンパク質がインスリン及び表皮成長因子より成る群から選ばれる方法。
４１．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記の対象の物質がウィルス表層抗原、ウィルスリセプタータンパク質及びＣＤ４より成る群から選ばれる方法。
４２．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記のｃＤＮＡを発現せしめる段階が、該ｃＤＮＡのヌクレオチド配列に基づくアミノ酸配列を化学的に合成することを含んで成る方法。
４３．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記のｃＤＮＡを発現せしめる段階が、遺伝子的に操作した微生物における合成のために、発現ベクターに前記のヌクレオチド配列をクローン化せしめることを含んで成る方法。
４４．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記のｃＤＮＡを発現せしめる段階が、前記のヌクレオチド配列のインビトロ転写及び／又は翻訳を含んで成る方法。
４５．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記のｃＤＮＡを発現せしめる段階が、該ｃＤＮＡによりコード化されるポリペプチドと実質的に相同性のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を合成し、該ヌクレオチド配列によりコード化されるポリペプチドが前記の対象の物質に結合する前記のポリソームの結合性領域と実質的に同一であることを含んで成る方法。
４６．請求項１，１３又は１４に記載の方法であって、前記のｃＤＮＡが、毒素、酵素、生物学的に活性なペプチド及び抗体と結合できるペプチドをコード化する配列より成る群から選ばれる、選ばれたその他のヌクレオチド配列と連結している方法。
４７．対象のポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を単離するための方法であって、ｍＲＮＡライブラリーを提供するために、ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リボソーム結合性配列、翻訳開始シグナル及び１又は複数のセミランダムヌクレオチド配列を含む５′非翻訳領域を含んで成るインビトロ発現ユニットを転写せしめ；ポリペプチド鎖の結合しているポリソームを維持する条件のもとで該ｍＲＮＡを翻訳せしめ；該ポリソームを対象の物質に接触せしめ、そして該対象の物質に特異的に結合しているポリソームからｍＲＮＡを単離すること、を含んで成る方法。