WO2006123445A1 - タンパク質の表示方法 - Google Patents

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WO2006123445A1
WO2006123445A1 PCT/JP2005/018680 JP2005018680W WO2006123445A1 WO 2006123445 A1 WO2006123445 A1 WO 2006123445A1 JP 2005018680 W JP2005018680 W JP 2005018680W WO 2006123445 A1 WO2006123445 A1 WO 2006123445A1
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WO
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trna
mrna
cell extract
anticodon
stop codon
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Application number
PCT/JP2005/018680
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English (en)
French (fr)
Inventor
Yasuhiro Aoyama
Shinsuke Sando
Atsushi Ogawa
Original Assignee
Kyoto University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kyoto University filed Critical Kyoto University
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Publication of WO2006123445A1 publication Critical patent/WO2006123445A1/ja

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression

Definitions

  • the present invention relates to a protein display method and a kit used therefor.
  • ribosome display a polypeptide synthesized in a complex of mRNA and ribosome is bound to mRNA so that each polypeptide is tagged with mRNA, and the polypeptide is displayed by mRNA.
  • mRNA differs from a polypeptide in that it can be easily sequenced using a sequencer, etc., and nucleic acid is easy to amplify because it is easy to amplify because it is easy to amplify. It is.
  • test protein or test substance when an mRNA-tagged protein in a human sample is reacted with a test protein or test substance, the test protein or test substance and a specific protein in the sample are bound and separated. The At this time, identification of the protein takes time and effort, but the corresponding protein can be easily identified by reading the base sequence of the mRNA bound thereto. In this manner, a protein that specifically binds to a test protein or a test substance can be screened.
  • Patent Document 1 discloses:
  • a method is disclosed.
  • Patent Document 1 does not display full-length polypeptides capable of isolating polysomes on which polypeptides of various lengths are displayed.
  • a DNA library encoding the scFv of an antibody is amplified by PCR, and has a T7 promoter, a ribosome binding site, a stem-loop, and a 3-terminal artificial linker, and does not contain a termination codon. Producing a template and transcribing it into RNA;
  • Non-Patent Document 3 clarifies the suppression mechanism of the translation system using mRNA in which the serine codon of mRNA encoding the esterase derived from Alicyclobacillus 'acidocardarius' is replaced with the termination codon UAG. The method of doing is disclosed. Furthermore, he teaches that mRNA translation can be suppressed more effectively by inactivating RF1 using an antibody against the release factor RF1, which separates the ribozyme from the polypeptide chain.
  • Non-Patent Document 3 does not describe that the mechanism of suppression of the translation system was elucidated, and that the full-length polypeptide and the corresponding mRNA were linked. .
  • Patent Literature l WO 91/05058
  • Non-Patent Document 1 Proc.Natl.Acad.Sci.USA, Vol.94,4937-4942,1997
  • Non-Patent Document 2 Pro Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 91, 9022-9026, 1994
  • Non-Patent Document 3 FEBS Letters, Vol.579,2156-2160,2005
  • An object of the present invention is to provide a method for displaying a protein contained in a sample by being physically linked to mRNA encoding the protein, and a kit used therefor.
  • the entire length of the protein corresponding to at least the coding sequence of the natural mRNA is displayed externally so as to be extruded. In this way, at least the full length of the protein corresponding to the coding sequence of the natural mRNA can be displayed without separating the ribosome from the conjugate of protein and mRNA.
  • the present invention has been completed based on the above findings, and provides the following protein display method and kit.
  • Item 1 A cell extract is used to translate mRNA in a sample. At this time, at least one type of stop codon is skipped, and a complex containing a conjugate of the mRNA and the resulting protein is translated.
  • a method for displaying a protein comprising a step of obtaining a body.
  • Item 2 When translating the mRNA in the sample using the cell extract, at least one mutant tRNA in which the anticodon of the amino acid tRNA is replaced with an anticodon corresponding to the stop codon is added, so that at least Item 2.
  • Item 3 The method according to Item 2, wherein all stop codons are skipped by covering mutant tRNAs so as to correspond to all stop codons.
  • Item 4 Mutant tRNA force Aminoacyl-Aminoacylated by tRNA synthetase Item 4. The method according to Item 2 or 3, wherein
  • Item 5 The method according to Item 4, wherein the mutant tRNA is paired with an aminoacyl-tRNA synthetase that does not have an anticodon site as a recognition site.
  • mutant tRNA mutant tRNA was replaced with ⁇ Nchikodon the anticodon of leucine tRNA for stop codon mutations tRNA substituted on anticodon anticodon serine tRNA for a stop codon, a stop codon anticodon of cysteine tRNA Item 6.
  • Item 7 The method according to any one of Items 2 to 6, wherein a cell extract in which at least one termination factor does not function is used as the cell extract.
  • Item 8 Cell extract strength with at least one terminator not functioning Reconstructed cell extract without at least one terminator, at least one terminator was inactivated Item 8.
  • Item 9 When translating mRNA in a sample using a cell extract, at least one kind of termination is obtained by using a cell extract that does not function at least one termination factor as the cell extract. Item 2. The method according to Item 1, wherein codons are skipped.
  • Item 10 Cell extract strength in which at least one termination factor does not function Reconstructed cell extract that does not contain at least one termination factor, cell extract in which at least one termination factor is inactivated Item 10.
  • Item 11 The method according to Item 9 or 10, wherein a cell extract in which all termination factors do not function is used.
  • Item 12 The method according to any one of Items 1 to 11, further comprising a step of extracting mRNA from the sample before the mRNA translation step.
  • Item 13 The method according to Item 12, further comprising the step of adding an arbitrary nucleic acid sequence to the 3 and ends of the extracted mRNA after the mRNA extraction step and before the mRNA translation step.
  • Item 14 cell extract and at least one mutant t RNA and protein display kit comprising substituted on anticodon corresponding anticodon of the tRNA amino acid to a stop codon
  • Item 15 The kit according to Item 14, further comprising a cell extract in which at least one termination factor does not function.
  • Item 16 A protein table comprising 3 cell extracts in which at least one termination factor does not function.
  • Item 17 The following mutant tRNA of (1), (2), or (3)
  • the elongation of the further polypeptide proceeds by skipping the termination codon and corresponds to at least the coding sequence of the natural mRNA.
  • the full length of the protein can also be exposed to the ribosome tunneling force.
  • the synthesized full-length protein does not leave the mRNA, and a conjugate of the protein and the mRNA encoding it can be obtained.
  • mRNA has a high reading sensitivity because it can be read easily and can be easily amplified by RT-PCR.
  • a protein is displayed by binding a tag of mRNA encoding the protein to the protein. By skipping all three stop codons, all proteins contained in the sample can be displayed.
  • a conjugate of protein and mRNA is usually obtained as a complex with ribosome. Therefore, in order to present the full length of the protein corresponding to at least the coding sequence of mRNA, the ability to extend the peptide chain beyond the coding sequence or the operation of separating the ribosome from the protein-mRNA conjugate is required. I need it. By skipping the stop codon as in the present invention, it is possible to display the full length of the protein corresponding to at least the coding sequence of the natural mRNA without complicated and special operations.
  • Fig. 2 is a diagram showing the length of 3'-UTR necessary for full-length display of the protein coding region of mRNA.
  • FIG. 4 shows that the stop codons UAA, UGA, and UAG were skipped, and that full-length protein presentation can be performed using the natural DHFR 3′-UTR sequence.
  • mRNA in a sample is translated using a cell extract, and at this time, at least one type of stop codon is skipped, and the resulting mRNA is translated and A second step of obtaining a complex comprising the conjugate of [0040]
  • a test sample such as blood Test sample force It is preferable to use the extracted mRNA.
  • Methods for extracting mRNA are well known, and can be extracted, for example, with Qiagen RNeasy Kit.
  • mRNA can be extracted as total RNA containing other RNAs and used as is for in vitro translation in the second step, but only mRNA is extracted to avoid the possibility of contaminating RNA inhibiting translation. It is more preferable to purify mRNA.
  • the method for extracting total RNA is well known, and for example, the method described in Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1; 25 (17): 3465-70.
  • the prokaryotic ribosome varies depending on the cell type, but if the length of the 3 'adjacent region of the protein coding region of mRNA is 75 bases or more, the protein The entire region of the coding sequence goes out of the ribosome tunneling force.
  • Prokaryotic 3'-UTR is usually about 100 to 300 bases, so even if natural mRNA is used as it is, most of the length of the protein corresponding to the coding sequence of natural mRNA is almost outside the ribosome tunneling force. Get out.
  • eukaryotic ribosomes have different forces depending on the cell type. If the length of the 3 'adjacent region of the mRNA protein code region is 70-80 bases or more, the total length of the protein coding region is the ribosome tunneling force. It is thought to go out. Since the 3'-UTR of eukaryotic cells is usually about 200 to 1000 bases, even if natural mRNA is used as it is, it is usually the case that the total length of the protein corresponding to the coding sequence of natural mRNA is at least the ribosome tunnel. Go outside.
  • the extracted mRNA may be directly subjected to in vitro translation!
  • an arbitrary nucleotide sequence may be further added to the 3 ′ end of the extracted mRNA.
  • the full-length protein coding region of mRNA can be pushed out of the ribosome.
  • the nucleotide sequence to be added include poly A by polyadenylyl enzyme.
  • the mRNA and the cell extract are mixed, and the mRNA is translated into protein by the translation system contained in the cell extract. Main departure In the light, by skipping the stop codon on the mRNA, the synthesized protein does not leave the mRNA at the position of the stop codon!
  • skip the stop codon means that the full-length protein is pushed out without stopping the elongation of the polypeptide at the position of the stop codon. It means that the protein (polypeptide chain) does not leave the complex of mRNA and ribosome by codon signal. For example, by introducing an amino acid or a modified amino acid at a position corresponding to the stop codon of the polypeptide chain extending on the mRNA, or when the termination factor does not function, the polypeptide synthesis is stopped, and Removal of the polypeptide chain due to complex forces with the ribosome is prevented.
  • the cell extract if the sample mRNA is derived from a eukaryotic cell, the eukaryotic cell extract may be used. If the sample mRNA is derived from a prokaryotic cell, a prokaryotic cell extract is used. That's fine. It is preferable to use cell extracts of the same species as the species from which the sample mRNA is derived.
  • mutant tRNA in which an anticodon of tRNA that transports by binding amino acids is replaced with an anticodon corresponding to the termination codon is added to the mixture of mRNA and cell extract, the elongation of the extended polypeptide chain is terminated.
  • This mutant tRNA binds the amino acid at the position corresponding to the codon.
  • the termination factor does not function and the polypeptide chain is separated from the mRNA force. Absent.
  • the mutant tRNA may be any one that is aminoacylated by an endogenous or artificially mutated aminoacyl-tRNA synthetase.
  • a tRNA paired with an aminoacyl-tRNA synthetase can be used without using the anticodon site as a recognition site.
  • an anticodon-mutated mutant tRNA can also be efficiently converted to an aminoacyl-tRNA synthetase.
  • Specific examples include leucine tRNA synthetase (in particular, leucine 5tRNA synthetase), serine tRNA synthetase (in particular, serine 3tRNA synthetase), cysteine tRNA synthetase, and alanine tRNA synthetase.
  • the mutant tRNA is a tRNA that binds an amino acid, wherein the anticodon is UUA (anticodon of stop codon UAA), and the anticodon is CUA (anticodon of stop codon UAG) And one or more anticodons of UCA (anticodon of stop codon UGA) may be used. Also, by using all of the anticodons that are UUA, CUA, and UCA, it is possible to skip all stop codons.
  • the mutant tRNA may bind any amino acid.
  • those that carry non-charged amino acids such as glycine, alanine, noline, leucine, isoleucine, proline, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, serine, thread nin, cysteine, methionine, asparagine, gnoretamine.
  • the stop codon can be skipped efficiently.
  • leucine tRNA especially leucine 5tRNA
  • serine tRNA especially serine 3tRNA
  • cysteine tRNA and mutant tRNA with modified anticodons of alanine tRNA are preferred in terms of skipping efficiency.
  • Mutant tRNA may be a mixture of those carrying multiple types of amino acids, or only one carrying one type of amino acid.
  • the mutant tRNA can be prepared, for example, by a run-off in vitro transcription method, and specifically, can be prepared according to the method described in the Examples.
  • the mutant tRNA is not limited to a natural tRNA mutant that carries amino acids, and may carry amino acid homologues.
  • An example of a misacylic tRNA is a tRNA in which naphthylalanin is bound to the 3 ′ end.
  • mutant tRNAs that carry natural amino acids have the advantage that they can be reused after the amino acids are transferred to the peptide chain.
  • the termination codon can be skipped.
  • Examples of the cell extract in which the termination factor does not function include a reconstructed cell extract. Reconstructed cell extracts from which termination factors have been removed and other components necessary for translation are available are commercially available from, for example, Post Genome Institute.
  • a cell extract obtained by inactivating a termination factor by adding an antibody or an antibody against the termination factor can also be used.
  • Abutama that binds to a termination factor can be prepared, for example, by the in vitro selection method described in Annu Rev Biochem. 1999; 68: 611-47.
  • the antibody against the termination factor may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody. These can be prepared by well-known methods (for example, Current protocols in Molecular Biology edit. Ausuoei et al. (1987) Publish. John Wiley and bons. Section 11.12-11.13; Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al. (1987) Publis h. John Wiley and Sons. Section 11.4- ⁇ ⁇ .11).
  • a cell extract of a cell line in which the termination factor is deficient or mutated can also be used.
  • E. coli XAC30 strain termination factor 1 (RF1) deficient strain is known.
  • tRNA is further added to a cell extract containing a small amount of termination factor so as to contain an excessive amount of tRNA relative to the termination factor, misreading occurs, and as a result, the termination factor does not function. It becomes an extract.
  • RF1 recognizes stop codons UAG and UAA
  • RF2 recognizes stop codons UGA and UAA. Therefore, if a cell extract that does not function RF1 is used V, UAG can be skipped, and if cell extract that does not function RF2 UGA can be skipped and all stop codons can be skipped using a cell extract that does not work for both.
  • the function of RF3 has not been elucidated.
  • eukaryotic cells recognize all three types of termination factor codons called eRF. Therefore, if a cell extract that does not function eRF is used, all stop codons are skipped.
  • At least one mutant tRNA can be used, and a cell extract in which at least one terminator does not function can be used, thereby more reliably reading the stop codon. Can be skipped. In this case, it is desirable to use a mutant tRNA that skips a specific stop codon and a cell extract that does not function as a termination factor that recognizes the stop codon.
  • the translation of mRNA is performed by mixing and incubating mRNA, a cell extract, and amino acids constituting the protein.
  • amino acids 20 kinds of amino acids that usually constitute proteins may be used, but commercially available cell extracts usually contain these amino acids.
  • the termination codon can be skipped by methods such as adding a mutant tRNA to this mixture or using a cell extract that does not function as a termination factor.
  • Incubation may be performed, for example, at about 25 to 50 ° C for about 10 to 240 minutes. This usually synthesizes the full length of all proteins.
  • a protein having a protein bound to a part or all of the ribosome constituting the polysome is usually obtained.
  • each protein-mRNA-ribosome complex in the polysome is separated from each other, and the sequence of the mRNA is read using a sequencer.
  • the sequence of the mRNA is read using a sequencer.
  • mini-protein SPR300 system (Bio-Rad) was used for gel electrophoresis, and Trans-Blot SD system (Bio-Rad) was used for blotting.
  • the enzyme was purchased commercially.
  • the reconstructed two prokaryotic cell-free translation system Classic 1 was purchased from the Post Genome Institute.
  • the RF1 (+) cell extract contains a sufficient amount of RF1 and a low amount of RF2.
  • the RF1 (A) cell extract is low in both RF1 and RF2.
  • pDHFR encoding E. coli DHFR was distributed by Dr. Y. Shimizu of Post Genome Institute.
  • the first PCR consisted of 4 pmol forward and reverse primers, 20 ng pDHFR, 4 nmol of 1.25 U Pfo Ultra HF DNA polymerase (Stratagene), 4 nmol of each dNTPs (TOYOBO), and 10 X Pfo Ultra HF reaction buffer. A 20 ⁇ L reaction mixture containing 2 ⁇ L was used. After the PCR reaction, amplification products were subjected to agarose gel electrophoresis.
  • the second PCR was performed using primers (5, -d (GAA) with 4 pmol of T7 promoter (underlined).
  • Reverse primer 5 CCGCCGCTCCAGAATCTC-3 '(SEQ ID NO: 2) Second PCR
  • Reverse primer 5 CCGCCGCTCCAGAATCTC-3 '(SEQ ID NO: 4)
  • Reverse primer 5 CCGCCGCTCCAGAATCTC-3 '(SEQ ID NO: 8)
  • Reverse primer 5 TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3 '(SEQ ID NO: 1
  • Reverse primer 5 TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3 '(SEQ ID NO: 1 2)
  • Reverse primer 5 and 5 TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3 '(SEQ ID NO: 1 6)
  • Reverse primer 5 and TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3 '(SEQ ID NO: 1 8)
  • Reverse primer 5 TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA-3 '(SEQ ID NO: 20)
  • the DNA variants used for the synthesis of mRNA containing the naturally occurring 3'-UTR of Example 2 used in Example 2 are further divided into a third PCR (for 75 nucleotides), a fourth PCR (147 nucleosides). Amplified by PCR) or 5th PCR (for 219 nucleotides).
  • the primers used for these PCRs are shown below. T7 (+) UAG (+) UAG (+) template
  • Reverse primer 5 CCGCCGCTCCAGAATCTC-3 '(SEQ ID NO: 22)
  • Reverse primer 5 -GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAACTAA
  • Reverse primer 5 AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGA CCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC-3 '(SEQ ID NO: 26)
  • Reverse primer 5 -CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAAC CGGCATAAGGATTTGGC GGAAG-3 '(SEQ ID NO: 28)
  • Reverse primer 5 -CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACC TATTTTGTC-3 '(SEQ ID NO: 30)
  • Reverse primer 5 CCGCCGCTCCAGAATCTC-3 '(SEQ ID NO: 32)
  • Reverse primer 5 -GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAAACCC
  • Reverse primer 5 AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGA CCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC-3 '(SEQ ID NO: 36)
  • Reverse primer 5 -CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAAC CGGCATAAGGATTTGGC GGAAG-3 '(SEQ ID NO: 38)
  • Reverse primer 5 -CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACC TATTTTGTC-3 '(SEQ ID NO: 40)
  • the PCR primers used to prepare the truncated DNA used in Example 3 are shown below.
  • the T7 promoter and T7 tag sequence are underlined.
  • the anticodon sequence is double underlined.
  • Source primer 5 -GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAATTAA
  • Reverse primer 5 AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGA CCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC-3 '(SEQ ID NO: 46)
  • Reverse primer 5 -CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAAC GGAAG-3 '(SEQ ID NO: 48)
  • Reverse primer 5 -CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACC
  • Reverse primer 5 CCGCCGCTCCAGAATCTC-3 '(SEQ ID NO: 52)
  • Reverse primer 5 -GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAATCAA
  • Reverse primer 5 AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGA CCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC-3 '(SEQ ID NO: 56)
  • Reverse primer 5 -CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAAC GGAAG-3 '(SEQ ID NO: 58)
  • Reverse primer 5 -CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACC
  • Reverse primer 5 CCGCCGCTCCAGAATCTC-3 '(SEQ ID NO: 62)
  • Reverse primer 5 -GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAACTAA
  • Reverse primer 5 AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGA CCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC-3 '(SEQ ID NO: 66)
  • Forward primer 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3 ′ (SEQ ID NO: 67)
  • Reverse primer 5 -CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAAC
  • Reverse primer 5 -CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACC
  • RNAs were obtained by run-off transcription of vertical DNA using T7-MEGAshortscript Kit (Ambion). Briefly, a solution containing 3 ⁇ L of the final PCR product was added to 10 L of a 7-transcription mixture and incubated at 37 ° C. for 2 hours. 1 U DNase I was added to the reaction mixture and the mixture was incubated for an additional 15 minutes. MRNAs that had been polyadhered using Poly A tailing kit (Ambion) and mRNAs that were not subjected to such adlation were purified using RNeasy MinElute Cleanup Kit (QIAGEN).
  • the concentration of purified mRNAs was determined by measuring absorbance at 260 nm.
  • sample loading buffer 125 mM Tris-HCl (pH 6.8), 4% (w / v) SDS, 20% (w / v) glycerol, 0.002% ( w / v) Mixed with bromophenol blue, 10% (v / v) 2-mercaptoethanol, and 1.5 ⁇ L of water, incubated at 95 ° C for 5 minutes and subjected to 15% SDS-PAGE
  • Sub-threshold ie read-through efficiency, is a serial dilution of the full length DHFR of T7 (+) UAG (-) UAA (+) ⁇ type (10, 20, 40, 60, 80, 100%) was used as an internal standard, and the density of the band was evaluated using Image J s oftware (NIH).
  • the mixture was gently inverted upside down at 4 ° C for 30 minutes, transferred to an empty filter column (Microspin Columns, Amersham) and filtered by centrifugation. Wash the remaining agarose 5 times with 200 ⁇ L ice-cold selection buffer (1,000 L total), and finally 92.2 mM ⁇ +, 300 mM Na +, 30 mM EDTA, 0.05% Tween20 And 200 ⁇ L of elution buffer (Phosphate®, pH 7.2) containing 2% Block Ace. The resulting suspension was gently inverted upside down for 10 minutes at room temperature. MRNAs released from the PRM complex or polysome were eluted by centrifugation.
  • the eluted mRNAs were purified using RNeasy MinElute Cleanup Kit. The yield was determined by measuring the UV absorbance at 260 ⁇ m. Amplification of these recovered mRNAs by RT-PCR was performed using a QIAGEN One-Step RT-PCR kit (QIAGEN). The following primers were used.
  • Reverse primer 5 CCGCCGCTCCAGAATCTC-3 '(SEQ ID NO: 72)
  • the E. coli suppressor tRNA Leu5 was prepared by run-off in vitro transcription.
  • Type DNA consists of 20 pmol forward primer (5, -d (TAA TAC GAC TCA CTA TAG CCC GGA TGG TGG AAT CGG TAG ACA) -3 '(SEQ ID NO: 73)), 20 pmol reverse primer (5 d (TGG TAC CCG GAG CGG GAC TTG AAC CCG CAC AGC G CG AAC) -3, (SEQ ID NO: 74)), 100 ftnol cage DNA (5-, d (TG GTA CCC GGA GC G GGA CTT GAA CCC GCA CAG CGC GAA CGC CGA GGG ATT TAG AAT C CC TTG TGT CTA CCG ATT CCA CCA TCC GGG C) -3, (SEQ ID NO: 75)), 1.25 U Pfo Ultra HF DNA polymerase (Stratagene), 10 nmol of each d
  • In vitro transcription consists of 2,500 U T7 RNA polymerase (TOYOBO), 2 ⁇ mol of each NTPs (Fermentas) ⁇ 5 ⁇ mol GMP (Sigma), 1 U inorganic pyrophosphate (Calbiochem— Novabio chem) , Using a 500 L reaction mixture containing 80 U RNase inhibitor (TOYOBO), 18 ⁇ L PCR solution of caged DNA, and 50 ⁇ L 10 X reaction buffer (18 hours at 37 ° C). The The transcribed tRNA was purified using denaturing PAGE (8%), then ethanol precipitated and dissolved in 500 ⁇ L of water. The obtained tRNA was further purified by passing continuously through Microcon YM-30 (Milllipore) and G-25 Microspin Columns (Amersham).
  • E.coli savrepressor tRNA SeriJ in the same manner as tRNA Leu5
  • E.coli suppressor tRNA SeriJ as in the preparation of tRNA u5
  • a plasmid encoding yeast tRNA Phe- CA was obtained from Dr. M. Endo of Osaka University.
  • Translation reaction consisted of 55 L Fokl linear plasmid solution, 2 ⁇ mol of each NTPs (Fermentas), 5 ⁇ mol GMP (Sigma), 80 U RNase inhibitor (TOYO BO), 1 U inorganic pyro Phosphate (Calbiochem-Novabiochem), 2,200 U T7 RNA polymerase (TOYOBO), and 10 ⁇ L of 10 ⁇ reaction buffer (containing 400 mM Tris-HC1 (pH 8.0), 200 mM MgCl, 50 mM DTT, 500 ⁇ Performed with reaction solution of L. Mixing
  • the ligation reaction consisted of 10 ⁇ g tRNA Phe -CA, 12 pmol L
  • reaction solution 55 mM Hepes—Na (pH 7.5), 15 mM MgCl, 3.3 mM D) containing phthalyl pdCpA (dissolved in DMSO) and 50 U T4 RNA ligase (Tak ara)
  • the base sequences of the suppressor tRNA Sef (Fig. 3b) are shown in SEQ ID NOs: 85, 86, and 87, respectively.
  • the first and second mutant mRNAs are those in which a T7 tag is inserted between the start codon and the DHFR coding region, and a stop codon UAG is inserted before or after that. UAG is recognized by the termination factor RF1.
  • the stop codon after DHFR was deleted (first and second from the top in Figure la).
  • a T7 tag is inserted between the start codon and the DHFR coding region, and a stop codon UAG is inserted before or after that to terminate after the DHFR coding region.
  • the codon UAA is present as it is (3rd and 4th from the top of Fig. La).
  • U AA is recognized by the termination factor RF2.
  • the fifth mutant mRNA has a T7 tag inserted between the start codon of the natural mRNA of DHFR and the DHFR coding region (fifth from the top of Fig. La). The stop codon UAA after the DHFR coding region is intact.
  • the translation system includes leucine 5tRNA (tRNA Leu5 ) derived from E. coli or yeast.
  • TRNA which was combined with naphthylalanine instead of phealalanine (Nap-yeast-tRNA Phe ), was added. These pair anticodons with the stop codon UAG.
  • Fig. Lc shows the results of western blotting after isolating the protein using T7 antibody.
  • Lanes 10 and 14 are the results using the mutant tRNA Nap-tRN A Phe
  • lanes 11 and 15 are the results using the mutant tRNA tRNA Leu5.
  • the other lanes are the results when no such mutant tRNA is used.
  • stop codon U AG is present upstream of DHFR, using a cell extract with reduced RF1 and using a mutant tRNA, the stop codon UAG is efficiently read out and DHFR synthesis is performed. The amount increased (comparison between lane 9 and lanes 10, 11; comparison between lane 13 and lanes 14, 15).
  • Fig. Id shows the amount of mRNA recovered after selection of polysomes formed during translation using a T7 tag antibody.
  • T7 (+) UAG (+) STOP (-) and UAG (+) T7 (+) STOP (-) type when the suppressor tRNA tRNA Leu5 is used, RF1
  • DHFR E. coli dihydrofolate reductase
  • Fig. 2a The upper part of Fig. 2a is the natural DHFR mRNA. This is because the stop codon is UAA, 3, — there is also a UAA sequence in the UTR.
  • the force shown in the middle of FIG. 2a is the first pseudo-natural mRNA, and the T7 tag sequence was inserted immediately after the DHFR code region and immediately before the stop codon.
  • the T7 tag When the T7 tag is accessible, it indicates that the preceding DHFR is also accessible, that is, displayed.
  • the two stop codon sequences were replaced from UAA to UAG to facilitate skipping. 3'—The length of UTR is 219nt.
  • the lower part of Fig. 2a shows the second pseudo-natural mRNA, with the first stop codon sequence deleted and 3, the second stop codon sequence UAA present in UTR encoding leucine. Replaced with UUA. This is a positive control that does not have a stop codon without using a mutant tRNA, so that a conjugate of mRNA and DHFR protein can be obtained.
  • the length of one UTR is 75 nt (nucleotide) (corresponding to 25 amino acids), 147 nt (corresponding to 49 amino acids), and 219 nt (corresponding to 73 amino acids). Each changed one was produced. This is to examine the length of the 3′-UTR, which is a spacer necessary to display the DHFR code region outside the ribosome tunnel.
  • DHFR was detected when the length of 3'—UTR was 147 nt or more (lanes 3, 5, and 7). This is thought to be because the T7 tag is pushed out of the ribosome tunneling force. This indicates that the entire length of DHFR existing upstream of the T7 tag is pushed out of the ribosome tunnel force.
  • the yield of mRNA is 3 with respect to the total amount of mRNA, when the -UTR length is 147 nt. 1.5%, 4% for 219nt, and 2.5% for polyA 219nt.
  • T7 (+) UAG (+) UAG (+) (219 nt) is a force with two stop codons.
  • This saddle type is in the presence of the suppressor tRNA tRNA Leu5 and RF1 ( ⁇ ) Conditions
  • the stop codon on the natural DHFR mRNA of E. coli is UAA. There is another UAA in the 3'-UTR of DHFR.
  • the three types of saddle type mRNA shown in FIG. 3a were used to replace the tRNA SertJ anticodon with the one corresponding to the stop codon tRNA power UAA, UGA (opal), and UAG (amber) It was shown that it is possible to skip all the stop codons of, and that a full-length protein display using the 3′-UTR of natural DHFR mRNA is possible.
  • T7 (+) UAA (+) UAA (+) (222) in Fig. 3a is a wild-type DHFR inserted with a T7 promoter and a T7 tag.
  • T7 (+) UGA (+) UGA (+) (222) is a T7 (+) UAA (+) UAA (+) (222) in which two stop codons UAA are replaced with UGA. .
  • T7 (+) UAG (+) UAG (+) (222) is the same as T7 (+) UAA (+) UAA (+) (222) except that two stop codons UAA are replaced with UGA. is there.
  • the type 5 mRNA—the length of the UTR is 222 nucleotides (nt).
  • a T7 promoter and T7 tag were inserted into E. coli DHFR, and the two termini were A truncated mRNA lacking the stop codon UAA was constructed, and this mRNA was translated in the same manner as described above using a reconstructed translation system containing RF1 and RF2.
  • the length of the 3'-UTR of the truncated T7 (+) Stop (-) without this stop codon is 222 nucleotides.
  • the recovery rate of mRNA was 4% as shown in FIG. 3d.
  • the suppressor tRNA Sei "had almost the same skipping efficiency as the three stop codons without the stop codon. Also, only the first stop codon that functions as a terminator is used. The second stop codon is also effectively skipped, which is 81 nucleotides (corresponding to 27 amino acids) between them, but is 26 amino acids in length, following the ORF region! Because the whole T7 tag is not displayed enough!

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Abstract

　細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳し、このとき、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばして、ｍＲＮＡとそれが翻訳されて生じるタンパク質との結合体を含む複合体を得る工程を含むタンパク質の表示方法。細胞抽出液を用いてサンプル中のｍＲＮＡを翻訳するに際して、アミノ酸のｔＲＮＡのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した少なくとも１種の変異ｔＲＮＡを加えることにより、少なくとも１種の終止コドンを読み飛ばすことができる。

Description

明 細 書
タンパク質の表示方法
技術分野
[0001] 本発明は、タンパク質の表示方法、及びそれに用いるキットに関する。
背景技術
[0002] リボソームディスプレイは、 mRNAとリボソームとの複合体において合成されるポリ ペプチドを mRNAと結合させておくことにより、各ポリペプチドに mRNAのタグが付 いた状態とし、 mRNAによりポリペプチドを表示する方法である。これは、 mRNAは、 ポリペプチドと異なりシークェンサ一などを用いて容易に配列を決定できること、及び 核酸は増幅が容易であるため微量しか存在しなくても配列を決定し易いことを利用し たものである。
[0003] 例えば、ヒトサンプルに含まれる全タンパク質に mRNAのタグを付したものを被験 タンパク質又は被験物質と反応させると、被験タンパク質又は被験物質とサンプル中 の特定タンパク質とが結合して、分離される。このとき、タンパク質の同定は手間がか かるが、それに結合した mRNAの塩基配列を読み取ることにより、対応するタンパク 質を簡単に同定できる。このようにして、被験タンパク質又は被験物質と特異的に結 合するタンパク質をスクリーニングすることができる。
[0004] このような目的タンパク質の表示ないしはスクリーニング方法として、特許文献 1は
(a) RNAポリメラーゼ結合部位、リボソーム結合部位、及び翻訳開始シグナルを含 む 5 '非翻訳領域を含む in vitro発現ュ-ットであって mRNAを合成できるものを構築 し、
(b) ランダムな核酸配列をこの発現ユニットに付着させ、
(c) この発現ユニット及びランダムな核酸配列と関連した配列を転写又は複製して R NAを生産し、
(d) この RNAを翻訳して、ポリソームを維持できる条件下でポリソームを生産し、
(e) このポリノームに被験物質を結合させ、 (D 被験物質に結合したポリソームを単離し、
(g) 単離したポリソームを破壊し、
(h) mRNAを回収し、
(0 回収した mRNAから cDNAを構築し、
(j) cDNAを発現させて新規ポリペプチドを生産する
方法を開示している。
[0005] しかし、特許文献 1の方法では、様々な長さのポリペプチドが提示されたポリソーム が単離できる力 全長ポリペプチドが表示されるわけではない。
[0006] また、非特許文献 1は、
(a) 抗体の scFvをコードする DNAライブラリーを PCRで増幅して、 T7プロモーター 、リボソーム結合部位、ステム-ループ、及び 3末端人工リンカ一を有し、かつ、終止コ ドンを含まな 、DNAテンプレートを生産し、それを RNAに転写する工程と、
(b) mRNAを in vitroでリボソーム複合体を安定ィ匕させる因子の存在下に翻訳し、リ ポソーム上での scFv抗体の折り畳みを改善する工程と、
(c) 天然 scFvを固定ィ匕抗原に結合させることにより、翻訳混合物から所望のリボソ一 ム複合体を選択する工程と、
(d) EDTAで結合したリボソーム複合体を乖離させ、全複合体を抗原で特異的に溶 出する工程と、
(e) 複合体から RNAを単離する工程と、
(D 単離した mRNAを逆転写して cDNAとし、 cDNAを PCRで増幅する工程と を含む方法を開示している。この方法は、スクリーニングの対象力 抗体の scFvをコ ードする DNAライブラリーに限定され、ヒトの全タンパク質をスクリーニングできるもの ではない。また、 3'末端に人工のリンカ一を添加し、さらに終止コドンを除去する必要 があるため、天然の mRNAを直接利用することができな!/、。
[0007] また、非特許文献 2は、
(a) ランダム NNKコドン領域を含む合成 DNAライブラリーを in vitroで転写 '翻訳す る工程と、
(b) クロラムフエ-コールでタンパク合成を停止させて、ポリソームを分離する工程と、 (c) ァフィ-ティ選択できる固定ィ匕されたレセプターが存在するゥエルにポリソームを 入れる工程と、
(d) 結合したポリソームを EDTAで乖離させて、 mRNAを回収する工程と、
(D mRNAを cDNAに逆転写する工程と、
(g) cDNAを PCRで増幅する工程と
を含む方法を開示している。しかし、この方法では、終止コドンに到達する前にクロラ ムフエ-コールでタンパク合成を停止させるため、全長タンパク質が表示されず、全 長タンパク質につ 、てァフィ-ティ選択を行えな 、。
[0008] また、非特許文献 3は、アリサイクロバチルス'ァシドカルダリウス由来のエステラー ゼをコードする mRNAのセリンコドンを終止コドンの UAGに置換した mRNAを用 ヽ て、翻訳システムの抑制メカニズムを解明する方法を開示している。さらに、リボソ一 ムとポリペプチド鎖とを分離させる開放因子 RF1に対する抗体を用いて RF1を失活さ せることにより、 mRNAの翻訳を一層効果的に抑制できることを教えている。
[0009] しかし、非特許文献 3では、翻訳システムの抑制メカニズムの解明を行って 、るにす ぎず、全長ポリペプチドと対応する mRNAとが連結したものが得られたことは記載さ れていない。
特許文献 l :WO 91/05058
非特許文献 1： Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.94,4937-4942,1997
非特許文献 2 : Pro Natl.Acad.Sci.USA, Vol.91, 9022- 9026,1994
非特許文献 3 : FEBS Letters,Vol.579,2156-2160,2005
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0010] 本発明は、サンプル中に含まれるタンパク質をそれらをコードする mRNAと物理的 に連結した状態にすることにより表示する方法、及びそれに用いるキットを提供するこ とを課題とする。
課題を解決するための手段
[0011] 上記課題を解決するために本発明者らは研究を重ね、以下の知見を得た。
(0 サンプル中の mRNAを、細胞抽出液を用いて in vitroで翻訳するに際して、ァミノ 酸の tRNAのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した変異 tRN Aを翻訳系に加えることにより、終止コドンが読み飛ばされて、合成されたタンパク質 が mRNAから離れない。これにより、 mRNAと対応タンパク質との結合物が得られる
(ii) サンプル力も抽出された mRNAを、細胞抽出液を用いて in vitroで翻訳するに 際して、終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることにより、終止コドンが読み飛 ばされて、合成されたタンパク質が mRNAから離れない。これにより、 mRNAと対応 タンパク質との結合物が得られる。
(iii) mRNAはリボソームと複合した状態でポリペプチド鎖を伸長するため、ポリぺプ チド鎖の伸長途中の部分、及び mRNAのポリペプチド鎖伸長途中の部分はリボソ一 ムトンネルに覆われていて、外部に表示されない。終止コドンを読み飛ばすことにより 、コード配列を越えて終止コドン及び 3'— UTRに対してペプチド鎖が伸長するため
、天然 mRNAの少なくともコード配列に対応するタンパク質の全長がリボソームトンネ ルカ 押し出されるようにして外部に表示される。このようにして、タンパク質と mRNA との結合物からリボソームを分離しなくても、少なくとも天然 mRNAのコード配列に対 応するタンパク質の全長を表示することができる。
[0012] 本発明は上記知見に基づき完成されたものであり、下記のタンパク質の表示方法 及びキットを提供する。
[0013] 項 1. 細胞抽出液を用いてサンプル中の mRNAを翻訳し、このとき、少なくとも 1 種の終止コドンを読み飛ばして、 mRNAとそれが翻訳されて生じるタンパク質との結 合体を含む複合体を得る工程を含むタンパク質の表示方法。
[0014] 項 2. 細胞抽出液を用いてサンプル中の mRNAを翻訳するに際して、アミノ酸 の tRNAのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した少なくとも 1 種の変異 tRNAをカ卩えることにより、少なくとも 1種の終止コドンを読み飛ばす項 1に 記載の方法。
[0015] 項 3. 全ての終止コドンに対応するように変異 tRNAをカ卩えることにより、全ての 終止コドンを読み飛ばす項 2に記載の方法。
[0016] 項 4. 変異 tRNA力 アミノアシルー tRNA合成酵素によりアミノアシル化される ものである項 2又は 3に記載の方法。
[0017] 項 5. 変異 tRNAは、アンチコドン部位を認識サイトとしないアミノアシルー tRN A合成酵素と対をなすものである項 4に記載の方法。
[0018] 項 6. 変異 tRNAとして、ロイシン tRNAのアンチコドンを終止コドンに対するァ ンチコドンに置換した変異 tRNA、セリン tRNAのアンチコドンを終止コドンに対する アンチコドンに置換した変異 tRNA、システィン tRNAのアンチコドンを終止コドンに 対するアンチコドンに置換した変異 tRNA、及びァラニン tRNAのアンチコドンを終 止コドンに対するアンチコドンに置換した変異 tRNAからなる群より選ばれる少なくと も 1種を用いる項 2〜5の 、ずれかに記載の方法。
[0019] 項 7. 細胞抽出液として、少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を 用いる項 2〜6の 、ずれかに記載の方法。
[0020] 項 8. 少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液力 少なくとも 1種の終 結因子を含まない再構築された細胞抽出液、少なくとも 1種の終結因子が不活性ィ匕 された細胞抽出液、又は過剰量の tRNAを含む細胞抽出液である項 7に記載の方 法。
[0021] 項 9. 細胞抽出液を用いてサンプル中の mRNAを翻訳するに際して、細胞抽出 液として、少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることにより、少 なくとも 1種の終止コドンを読み飛ばす項 1に記載の方法。
[0022] 項 10. 少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液力 少なくとも 1種の 終結因子を含まない再構築された細胞抽出液、少なくとも 1種の終結因子を不活性 化した細胞抽出液、又は過剰量の tRNAを含む細胞抽出液である項 9に記載の方 法。
[0023] 項 11. 全ての終結因子が機能しない細胞抽出液を用いる項 9又は 10に記載の 方法。
[0024] 項 12. mRNA翻訳工程の前に、さらに、サンプルから mRNAを抽出する工程 を含む項 1〜11のいずれかに記載の方法。
[0025] 項 13. mRNA抽出工程の後であって mRNA翻訳工程の前に、さらに、抽出さ れた mRNAの 3，末端に任意の核酸配列を付加する工程を含む項 12に記載の方法 [0026] 項 14. 細胞抽出液と、アミノ酸の tRNAのアンチコドンを終止コドンに対応する アンチコドンに置換した少なくとも 1種の変異 tRNAとを備えるタンパク質表示用キット
[0027] 項 15. さらに、少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を備える項 1 4に記載のキット。
[0028] 項 16. 少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を備えるタンパク質 表 用3 rット。
[0029] 項 17. 以下の (1)、（2)、又は (3)の変異 tRNA
(1) セリン tRNAのアンチコドンを CUAに置換した終止コドン UAG読み飛ばし用の 変異 tRNA。
(2) セリン tRNAのアンチコドンを UCAに置換した終止コドン UGA読み飛ばし用の 変異 tRNA。
(3) セリン tRNAのアンチコドンを UUAに置換した終止コドン UAA読み飛ばし用の 変異 tRNA。
発明の効果
[0030] 本発明の方法によれば、サンプル中の mRNAを in vitroで翻訳するに際して終止コ ドンを読み飛ばすことによりさらなるポリペプチドの伸長が進行し、天然 mRNAの少 なくともコード配列に対応するタンパク質の全長をリボソームトンネル力も露出させるこ とができる。さらに、合成された全長タンパク質が mRNAカゝら離脱せず、タンパク質と それをコードする mRNAとの結合物が得られる。
[0031] タンパク質がリボソームトンネル力 外部に全長表示されることにより、リボソームの 除去などの特別な操作を行うことなぐ所望の性質を有するタンパク質をスクリーニン グすることができる。例えば、特定ィ匕合物や特定タンパク質と相互作用するタンパク 質をスクリーニングすることができるようになる。また、特定化合物と相互作用するタン ノ^質を検出することにより、その化合物による副作用の原因となる蛋白質を予測で きる可能性がある。
[0032] また、 mRNAのタンパク質コード領域の塩基配列を読み取ることにより、対応タン ノ ク質のアミノ酸配列を読み取ることができる。 mRNAは塩基配列の読み取りが簡単 であり、また RT— PCRなどの方法で簡単に増幅できるため読み取り感度が高い。
[0033] このように、本発明方法では、タンパク質にそれをコードする mRNAのタグを結合 することによりタンパク質を表示する。 3種の終止コドンを全て読み飛ばすことにより、 サンプル中に含まれる全てのタンパク質を表示することができる。
[0034] タンパク質と mRNAとの結合物は、通常リボソームとの複合体として得られる。従 つて、 mRNAの少なくともコード配列に対応するタンパク質の全長を提示するために は、コード配列を越えてペプチド鎖を伸長する力、又は、タンパク質と mRNAとの結 合物からリボソームを分離する操作が必要になる。本発明のように終止コドンを読み 飛ばすことにより複雑かつ特別な操作をすることなぐ少なくとも天然 mRNAのコード 配列に対応するタンパク質の全長を表示することができる。
図面の簡単な説明
[0035] [図 l]tRNA u5 、又は Z及び RF ( Δ )細胞抽出液の使用により、終止コドン UAGの
CUA
読み飛ばしが行われたことを示す図である。
[0036] [図 2]mRNAのタンパク質コード領域の全長表示のために必要な 3'—UTRの長さを 示す図である。
[0037] [図 3]tRNASeriJ 、 tRNASerU 、 tRNASerCUAと、 RFs ( Δ )細胞抽出液との使用により、そ
UUA UCA
れぞれ終止コドン UAA、 UGA、 UAGの読み飛ばしが行われたことを示し、かつ、天 然 DHFRの 3'— UTR配列でも全長タンパク質提示が実施可能であることを示す図 である。
発明を実施するための最良の形態
[0038] 以下、本発明を詳細に説明する。
mタンパク皙の表示 法
[0039] 本発明のタンパク質の表示方法は、細胞抽出液を用いてサンプル中の mRNAを 翻訳し、このとき、少なくとも 1種の終止コドンを読み飛ばして、 mRNAとそれが翻訳 されて生じるタンパク質との結合体を含む複合体を得る第 2工程とを含む方法である mRNAの [0040] mRNAは、血液のような被験サンプルに含まれたままで翻訳に供することもできる 力 被験サンプル力 抽出した mRNAを用いることが好ましい。 mRNAの抽出方法 は周知であり、例えば Qiagen社 RNeasy Kitにより抽出することができる。また、 mRNA を、その他の RNAを含む totalRNAとして抽出し、そのまま第 2工程での in vitro翻 訳に供することもできるが、夾雑 RNAが翻訳を阻害する可能性を避けるため、 mRN Aのみ抽出することが好ましぐ mRNAを精製することがより好ましい。 totalRNAの 抽出方法は周知であり、例えば Nucleic Acids Res. 1997 Sep 1;25(17):3465- 70.に記 載の方法に従えばよい。
[0041] 後述する実施例において示されるように、原核細胞のリボソームは、細胞種によつ て異なるが、 mRNAのタンパク質コード領域の 3'隣接領域の長さが 75塩基以上で あれば、タンパク質コード配列の全領域がリボソームトンネル力 外に出る。原核細胞 の 3'—UTRは、通常 100〜300塩基程度であるため、天然の mRNAをそのまま用 いても、ほとんどは、少なくとも天然 mRNAのコード配列に対応するタンパク質の全 長がリボソームトンネル力 外部に出る。
[0042] また、真核細胞のリボソームは、細胞種によって異なる力 mRNAのタンパク質コー ド領域の 3'隣接領域の長さが 70〜80塩基以上であれば、タンパク質コード領域の 全長がリボソームトンネル力 外に出ると考えられる。真核細胞の 3'— UTRは、通常 200〜 1000塩基程度であるため、天然の mRNAをそのまま用いても、通常は、少な くとも天然 mRNAのコード配列に対応するタンパク質の全長がリボソームトンネルか ら外部に出る。
[0043] 従って、抽出した mRN Aをそのまま in vitro翻訳に供してもよ!、が、抽出した mRN Aの 3'末端にさらに任意のヌクレオチド配列を付加してもよぐこれにより一層確実に 、 mRNAの全長タンパク質コード領域をリボソームの外部に押し出すことができる。 付加するヌクレオチド配列としては、例えばポリアデニルイ匕酵素によるポリ Aなどが挙 げられる。
in vitro翻訳
細胞抽出液を用 V、て mRNAを翻訳するに当たつては、 mRNAと細胞抽出液とを 混合し、細胞抽出液に含まれる翻訳系により mRNAをタンパク質に翻訳する。本発 明では、 mRNA上の終止コドンを読み飛ばすことにより、合成されたタンパク質が終 止コドンの位置で mRNAから離脱しな!、ようにする。
[0044] 通常のタンパク質合成においては、伸長しつつあるポリペプチド鎖の終止コドンに 対応する位置にアミノ酸が導入されず、さらに終結因子の働きによりタンパク質がリボ ノームと mRNAとの複合体力 離脱する。
[0045] 本発明にお 、て「終止コドンを読み飛ばす」とは、終止コドンの位置でポリべプチ ドの伸長が終止せず引き続き伸長することにより全長タンパク質がリボソームトンネル 力も押し出されるとともに、終止コドンのシグナルによりタンパク質 (ポリペプチド鎖）が mRNAとリボソームとの複合体から離脱しないことをいう。例えば、 mRNA上で伸長 しているポリペプチド鎖の終止コドンに対応する位置にアミノ酸又は修飾されたァミノ 酸を導入すること、又は終結因子が機能しないことにより、ポリペプチド合成の停止、 及び mRNAとリボソームとの複合体力 のポリペプチド鎖の離脱が妨げられる。
[0046] 本発明では、終止コドンのシグナルによるポリペプチド合成の停止、及びポリぺプ チド鎖の脱離が完全に妨げられる場合だけでなぐ概ね 50%以上妨げられる場合に 、「終止コドンが読み飛ばされた」と判断する。
[0047] 真核細胞及び原核細胞の双方にぉ 、て、 UAA、 UAG、及び UGAの 3種のコド ンが終止コドンとして機能する。 3種全ての終止コドンを読み飛ばすことができるよう にして、各 3' UTRに存在する終止コドンを読み飛ばすことにより、サンプル中の総タ ンパク質に mRNAのタグを付けて表示することができる。
[0048] 細胞抽出液は、サンプル mRNAが真核細胞由来のものであれば真核細胞の抽出 液を用いればよぐサンプル mRNAが原核細胞由来のものであれば原核細胞の抽 出液を用いればよい。サンプル mRNAが由来する生物種と近縁の生物種、特に同じ 生物種の細胞抽出液を用いることが好ま U、。
変異 tRNA
[0049] 例えば、アミノ酸を結合して運搬する tRNAのアンチコドンを終止コドンに対応する アンチコドンに置換した変異 tRNAを、 mRNAと細胞抽出液との混合物に加えれば 、伸長しているポリペプチド鎖の終止コドンに対応する位置にこの変異 tRNAがァミノ 酸を結合する。これにより、終結因子が機能せず、ポリペプチド鎖は mRNA力 離れ ない。この変異 tRNAは、内在性若しくは人為的に変異させたアミノアシルー tRNA 合成酵素によりアミノアシルイ匕されるものであればよい。例えば、アンチコドン部位を 認識サイトとしな 、アミノアシル一 tRNA合成酵素と対をなす tRNAを用いることがで きる。この場合、アンチコドン変異した変異 tRNAもアミノアシル— tRNA合成酵素に 効率よくァシルイ匕されることが可能である。具体的にはロイシン tRNA合成酵素（中で も、ロイシン 5tRN A合成酵素）、セリン tRNA合成酵素（中でも、セリン 3tRNA合成 酵素）、システィン tRNA合成酵素、ァラニン tRNA合成酵素等が挙げられる。
[0050] 本発明方法では、変異 tRNAとして、アミノ酸を結合する tRNAにお 、て、アンチコ ドンが UUA (終止コドン UAAのアンチコドン）であるもの、アンチコドンが CUA (終止 コドン UAGのアンチコドン）であるもの、及びアンチコドンが UCA (終止コドン UGA のアンチコドン)ものの 1種以上を使用すればよい。また、アンチコドンが UU Aである もの、 CU Aであるもの、及び UCAであるものの全てを用いることにより、全ての終止 コドンを読み飛ばすことができる。
[0051] 変異 tRNAは、いずれのアミノ酸を結合するものであってもよい。中でも、グリシン、 ァラニン、ノ リン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フエ二ルァラニン、チロシン、トリプ トフアン、セリン、スレ才ニン、システィン、メチォニン、ァスパラギン、グノレタミンのよう な電荷を有さないアミノ酸を運搬するものを用いることにより、終止コドンを効率的に 読み飛ばすことができる。特に、ロイシン tRNA (中でも、ロイシン 5tRNA)、セリン tR NA (中でも、セリン 3tRNA)、システィン tRNA、ァラニン tRNAのアンチコドンを改 変した変異 tRNA力 読み飛ばし効率の点で好ま 、。
[0052] 変異 tRNAは、 1種のアミノ酸を運ぶもののみを使用してもよぐ複数種のアミノ酸 を運ぶものを混合して用いてもょ 、。
[0053] 変異 tRNAは、例えばラン オフ in vitro転写法により作製することができ、具体的 には実施例に記載の方法に準じて作製することができる。
[0054] また、変異 tRNAは、アミノ酸を運搬する天然 tRNAの変異体に限らず、アミノ酸の ホモログを運搬するものであってもよい。ミスァシルイ匕 tRNAとして、例えば、 3 '末端 にナフチルァラニンが結合した tRNAが挙げられる。但し、天然のアミノ酸を運搬する 変異 tRNAは、そのアミノ酸をペプチド鎖に移した後は再利用できるというメリットがあ る。
ra が しない糸田 tt 夜
[0055] 細胞抽出液として、終結因子が機能しないものを用いることによつても、終止コドン を読み飛ばすことができる。
[0056] 終結因子が機能しない細胞抽出液としては、例えば、再構築細胞抽出液が挙げら れる。終結因子を除去し翻訳に必要なその他の成分を添加した再構築細胞抽出液 は例えばポストゲノム社（Post Genome Institute)から市販されている。
[0057] また、終結因子に対するアブタマ一又は抗体等を加えて終結因子を失活させた 細胞抽出液を用いることもできる。終結因子に結合するアブタマ一は、例えば Annu R ev Biochem. 1999;68:611-47.に記載の in vitroセレクション法により作製することがで きる。また、終結因子に対する抗体は、ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体で もよい。これらは、周知の方法で作製することができる（例えば Current protocols in M olecular Biology edit. Ausuoei et al.(1987) Publish. John Wiley and bons. section 11 .12〜11.13 ; Current protocols in Molecular Biology edit. Ausubel et al.(1987) Publis h. John Wiley and Sons. Section 11.4〜丄丄 .11)。
[0058] さらに、終結因子が欠損又は変異した細胞株の細胞抽出液を用いることもできる 。原核細胞では、例えば E. coli XAC30株力 終結因子 1 (RF1)欠損株として知ら れている。
[0059] また、終結因子が少ない細胞抽出液にさらに tRNAを添加して終結因子に対して 過剰量の tRNAを含むようにすれば、ミスリーディングが起こり、結果として終結因子 が機能しな 、細胞抽出液となる。
[0060] 本発明方法では、終結因子の 1種以上が機能しない細胞抽出液を用いればよい 力 全ての種類の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることにより、全ての終止 コドンを読み飛ばすことができる。
[0061] 終結因子は、原核細胞の代表例としての大腸菌 (E. coli)では、 RF1、 RF2、及び R F3の 3種が知られている。 RF1は終止コドンの UAG及び UAAを認識し、 RF2は終 止コドンの UGA及び UAAを認識する。従って、 RF1が機能しない細胞抽出液を用 V、れば UAGを読み飛ばすことができ、 RF2が機能しな 、細胞抽出液を用いれば、 UGAを読み飛ばすことができ、双方が機能しない細胞抽出液を用いれば、全ての 終止コドンを読み飛ばすことができる。なお、 RF3の機能は解明されていない。
[0062] また、真核細胞では、 eRFと呼ばれる終結因子力 3種全ての終止コドンを認識す る。従って、 eRFが機能しない細胞抽出液を用いれば、全ての終止コドンが読み飛 ばされる。
[0063] 終止コドンを読み飛ばすために、少なくとも 1種の変異 tRNAを用いるとともに、少 なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることもでき、これにより一層 確実に終止コドンを読み飛ばすことができる。この場合、特定の終止コドンを読み飛 ばす変異 tRNAを用いるとともに、その終止コドンを認識する終結因子が機能しな!ヽ 細胞抽出液を用いることが望まし 、。
r.n.
[0064] mRNAの翻訳は、 mRNAと細胞抽出液とタンパク質を構成するアミノ酸とを混合し てインキュベートすることにより行う。アミノ酸としては、通常タンパク質を構成する 20 種のアミノ酸を用いればよいが、市販の細胞抽出液には通常これらのアミノ酸が添カロ されている。前述したように、この混合物にさらに変異 tRNAを添加する方法、終結 因子が機能しない細胞抽出液を用いる方法などにより、終止コドンを読み飛ばすこと ができる。
[0065] インキュベートは、例えば 25〜50°C程度で、 10〜240分間程度行えばよい。これ により、通常、全てのタンパク質の全長が合成される。
mRNAの読み取り
[0066] 本発明方法により、通常、ポリソームを構成するリボソームの一部又は全部にタンパ ク質が結合したものが得られる。これを、 EDTA処理することにより、ポリソーム中の各 タンパク質—mRNA—リボソーム複合体を互いに分離し、 mRNAの配列をシークェ ンサーを用いて読み取ればよ 、。複合体を分離した場合には全長配列を読み取るこ とも可能である。なお、 mRNAの部分配列の読み取りによりそれがコードするタンパ ク質を同定できる場合は、必ずしもポリソーム力 mRNAを分離しなくてょ 、。
実施例
[0067] 以下、本発明を実施例を示してより詳細に説明するが、本発明はこれらに限定され るものではない。
[0068] 以下の実施例にお!、て、ゲル電気泳動は Mini Protein SPR300 system (Bio- Rad)を 用い、ブロッテイングは Trans-Blot SD system (Bio-Rad)を用いた。酵素は市販品を 購入した。
[0069] 再構築された 2種の原核生物の細胞フリーの翻訳システム Classic 1は、 Post Gen ome Instituteから購入した。 RF1(+)細胞抽出液は、十分量の RF1を含み、 RF2量が少 ないものである。 RF1( A)細胞抽出液は RF1及び RF2の双方が少ないものである。
<鎳型 DNAの調製 >
¾施例 ίの鶬型 DNAの調製
[0070] E. coli DHFRをコードする pDHFRは、 Post Genome Instituteのドクター Y.Shimizuか ら分与された。 1回目の PCRは、 4pmolのフォワードプライマー及びリバースプライマー 、 20ngの pDHFR、 1.25Uの Pfo Ultra HF DNAポリメラーゼ（Stratagene)の 4nmol、各 d NTPs (TOYOBO)の 4nmol、及び 10 X Pfo Ultra HF反応バッファーの 2 μ Lを含む 20 μ Lの反応混合物を用いて行った。 PCR反応の後、増幅産物のァガロースゲル電気 泳動を行った。
[0071] 2回目の PCRを、 4 pmolの T7プロモーター（下線部）を有するプライマー（5， - d(GAA
ATT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ACC ACA ACG GTT TCC CTC TAG
3)、 4 pmolのリバースプライマー、 20 ftnol以下の 1回目の PCR産物、 1.25 Uの Pfo U1 tra HF DNAポリメラーゼ， 4 nmolの各 dNTPs、 2 μ Lの 10 X Pfo Ultra HF反応バッファ 一を含む 20 Lの反応混合物を用いて行った。これらの PCRに用いたプライマーを以 下に示す。
T7(+)UAG(+)Stop (-)テンプレート
1回目の PCR
フォワードプライマー： 5し AAGGAGATATACCAATGGCTAGCATGACTGGTGGAC AGC AAATGGGTTAGATC AGTCTGATTGC- 3 ' (配列番号 1 )
リバースプライマー： 5し CCGCCGCTCCAGAATCTC- 3' (配列番号 2) 2回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACG 配列番号 3)
リバースプライマー： 5し CCGCCGCTCCAGAATCTC- 3' (配列番号 4)
UAG(+)T7(+)Stop (-)テンプレート
1回目の PCR
フォワードプライマー： 5し AAGGAGATATACCAATGTAGATGGCTAGCATGACTG GTGGACAGCAAATGGGTATCAGTCTGATTGCGGCGTTAG- 3' (配列番号 5) リバースプライマー： 5し CCGCCGCTCCAGAATCTC- 3' (配列番号 6)
2回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACG 配列番号 7)
リバースプライマー： 5し CCGCCGCTCCAGAATCTC- 3' (配列番号 8)
T7(+)UAG(+)UAA(+)テンプレート
1回目の PCR
フォワードプライマー： 5し AAGGAGATATACCAATGGCTAGCATGACTGGTGGAC
AGCAAATGGGTTAGATCAGTCTGATTGC- 3' (配列番号 9)
リバースプライマー： 5し TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA- 3' (配列番号 1
0)
2回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACG 配列番号 11)
リバースプライマー： 5し TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA- 3' (配列番号 1 2)
UAG(+)T7(+)UAA(+)テンプレート 1回目の PCR
フォワードプライマー： 5し AAGGAGATATACCAATGTAGATGGCTAGCATGACTG GTGGACAGCAAATGGGTATC AGTCTGATTGCGGCGTTAG- 3' (配列番号 13) リバースプライマー： 5し TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA- 3' (配列番号 1 4)
2回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACG 配列番号 15)
リバースプライマー： 5し TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA- 3' (配列番号 1 6)
T7(+)UAG(-)UAA(+)テンプレート
1回目の PCR
フォワードプライマー： 5し AAGGAGATATACCAATGGCTAGCATGACTGGTGGAC AGCAAATGGGTATC AGTCTGATTGCGGCGTTAG- 3' (配列番号 17)
リバースプライマー： 5し TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA- 3' (配列番号 1 8)
2回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACG 配列番号 19)
リバースプライマー： 5し TATTCATTACCGCCGCTCCAGAATCTCA- 3' (配列番号 2 0)
実施例 2の鎳型 DNAの調製
実施例 2で用いた天然に存在する配列の 3' - UTRを含む mRNAの合成のための DN Aの铸型は、さらに 3回目の PCR( 75ヌクレオチドのため)、 4回目の PCR (147ヌクレオ チドのため)、又は 5回目の PCR(219ヌクレオチドのため)で増幅した。これらの PCRに 用 、たプライマーを以下に示す。 T7(+)UAG(+)UAG(+)テンプレート
1回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— AAGGAGATATACCAATGATCAGTCTGATTG— 3' (配列 番号 21)
リバースプライマー： 5し CCGCCGCTCCAGAATCTC- 3' (配列番号 22)
2回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACG 配列番号 23)
リバースプライマー： 5 -GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAACTAA
AAGC-3' (配列番号 24)
3回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 25)
リバースプライマー： 5し AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGA CCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC- 3' (配列番号 26)
4回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 27)
リバースプライマー： 5 -CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAAC CGGCATAAGGATTTGGC GGAAG-3' (配列番号 28)
5回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 29)
リバースプライマー： 5 -CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACC TATTTTGTC- 3' (配列番号 30)
T7(+)UAG (-) Leu(+)テンプレート
1回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— AAGGAGATATACCAATGATCAGTCTGATTG— 3' (配列 番号 31)
リバースプライマー： 5し CCGCCGCTCCAGAATCTC- 3' (配列番号 32)
2回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACG 配列番号 33)
リバースプライマー： 5 -GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAAACCC
C-3' (配列番号 34)
3回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 35)
リバースプライマー： 5し AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGA CCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC- 3' (配列番号 36)
4回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 37)
リバースプライマー： 5 -CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAAC CGGCATAAGGATTTGGC GGAAG-3' (配列番号 38)
5回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 39)
リバースプライマー： 5 -CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACC TATTTTGTC- 3' (配列番号 40)
実施例 3の鎳型 DNAの調製
実施例 3で用いた铸型 DNAを調製するために用いた PCRプライマーを以下に示 す。 T7プロモーター及び T7タグ配列には下線を付している。また、アンチコドン配列 には 2重下線を付している。
T7(+)UAA(+)UAA(+)(222)テンプレート
1回目の PCR
フォワードプライマ一： 5 '-AAGGAGATATACCAATGATCAGTCTGATTG-3 ' (配列 番号 41)
リバースプライマー 5し CCGCCGCTCCAGAATCTC- 3' (配列番号 42)
2回目の PCR
フォワードプライマ一： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACG
3' ( 配列番号 43)
ースプライマー: 5 -GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAATTAA
AAGC-3' (配列番号 44)
3回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3' (配列番号 45)
リバースプライマー： 5し AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGA CCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC- 3' (配列番号 46)
4回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3' (配列番号 47)
リバースプライマー： 5 -CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAAC GGAAG-3' (配列番号 48)
5回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 49)
リバースプライマー： 5 -CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACC
TATTTTGTC- 3' (配列番号 50)
T7(+)UGA (+) UGA(+)(222)テンプレート
1回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— AAGGAGATATACCAATGATCAGTCTGATTG— 3' (配列 番号 51)
リバースプライマー： 5し CCGCCGCTCCAGAATCTC- 3' (配列番号 52)
2回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACG 配列番号 53)
リバースプライマー： 5 -GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAATCAA
AAGC-3' (配列番号 54)
3回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 55)
リバースプライマー： 5し AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGA CCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC- 3' (配列番号 56)
4回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 57)
リバースプライマー： 5 -CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAAC GGAAG-3' (配列番号 58)
5回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 59)
リバースプライマー： 5 -CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACC
TATTTTGTC-3' (配列番号 60)
T7(+)UAG (+) UAG(+)(222)テンプレート
1回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— AAGGAGATATACCAATGATCAGTCTGATTG— 3' (配列 番号 61)
リバースプライマー： 5し CCGCCGCTCCAGAATCTC- 3' (配列番号 62)
2回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACG 配列番号 63)
リバースプライマー： 5 -GCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTCTATACAAAACTAA
AAGC-3' (配列番号 64)
3回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 65)
リバースプライマー： 5し AACACAGCCTGATATAGGAAGGCCGGATAAGACGCGA CCGGCGTCGCATCCGGCGCTAGCCGTAAATTC- 3' (配列番号 66)
4回目の PCR
フォワードプライマー： 5'— GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG— 3' (配列番号 67) リバースプライマー： 5 -CTGGGAAGATAAACAGTATTTTGTCCAGCCGTCGAAC
GGAAG-3' (配列番号 68)
5回目の PCR
フォワードプライマー： 5 -GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAG-3' (配列番号 69)
リバースプライマー： 5 -CAAAGGTACGCCGGAAGGTATATACGCGCTGGATACC
TATTTTGTC- 3' (配列番号 70)
<鎳型 mRNAの In vitro転写〉
[0073] 铸型 mRNAsを、 T7- MEGAshortscript Kit (Ambion)を用いて、铸型 DNAのラン一 オフ転写により得た。簡単に説明すると、 3 μ Lの最終 PCR産物を含む溶液を Τ7-転 写混合物 10 Lにカ卩え、これを 37 °Cで 2時間インキュベートした。この反応混合物に 1 Uの DNase Iを加え、混合物をさらに 15分間インキュベートした。 Poly A tailing kit ( Ambion)を用いたポリアデ-ル化を行った mRNAs及びこのようなアデ-ル化を行わな かった mRNAsを RNeasy MinElute Cleanup Kit (QIAGEN)を用いて精製した。
[0074] 精製した mRNAsの濃度を 260nmの吸収を測定することにより決定した。
< mRNA鏡型の翻訳 ·ウェスタンブロッテイング解析 >
Figure imgf000023_0001
[0075] T7(+)UAG (+) UAA(+), UAG(+)T7(+)UAA(+),又は T7(+)UAG (-) UAA(+)の 1 μ gの翻 訳を、 2.5 μ §の 1^ を含む12.5 しの1^1(+)翻訳システム又は RF1( A)翻訳システ ムを用いて 37 °Cで 10分間行った。反応溶液の 1 μ Lを 2.5 μ Lのサンプルローデイン グバッファー (125 mM Tris-HCl (pH 6.8)、 4% (w/v) SDS、 20% (w/v)グリセロール、 0. 002% (w/v)ブロモフエノールブルー、 10% (v/v) 2-メルカプトエタノール、及び 1.5 μ L の水と混合した。混合溶液を 95°Cで 5分間インキュベートし、 15% SDS-PAGEに供した
[0076] ウェスタンブロッテイングを PVDFメンブレン (Hybond™- P, Amersham)を用いて行つ た。 T7タグを結合したタンパク質は、抗 T7-HRP複合体抗体（Novagen)、及び ECL PI us Western Blotting Detection Reagent (Amersham)を用いて可視ィ匕した
[0077] サブレッシヨン、即ち読み飛ばし (リードスルー）効率は、 T7(+)UAG (-) UAA (+)铸 型の全長 DHFRの段階希釈物 (10, 20, 40, 60, 80, 100%)を内部標準とし、 Image J s oftware (NIH)を用いてバンドの濃さを評価することにより行った。
く PRM (ポリノーム)複合体の形成 ·Τ7タグによる撰択>
[0078] 铸型 mRNAの 2 μ gの翻訳を、上記のようにして、 25 μ Lの RF1(+)翻訳システム又は RF1( A)翻訳システムを用い、サプレッサー tRNAの 5 μ gとともに、 37 °Cで 10分間行つ た。この溶液に、 92.2 mMの K+、 300 mMの Na+、 50 mMの Mg2+、 0.05 %の Tween20 (WAKO)、及び 2%の Block Ace (大日本製薬社)を含む 455 μ Lの氷冷した選択バッ ファー（リン酸カリウム、 ρΗ 7.3)を加え、次いで Lの抗 Τ7-タグ抗体 (Novagen)を 添加した。この混合物を 4 °Cで 30分間穏やかに上下反転させ、空のフィルターカラム (Microspin Columns, Amersham)に移し、遠心によりろ過した。フィルター上に残った ァガロースを 200 μ Lの氷冷選択バッファー（合計 1,000 L)で 5回洗い、最後に、 92. 2 mMの Κ+、 300 mMの Na+、 30 mMの EDTA、 0.05 %の Tween20、及び 2%の Block Aceを含む 200 μ Lの溶出バッファー（Phosphate- Κ, pH 7.2)に再懸濁した。得られ た懸濁液を穏やかに、室温で 10分間上下反転させた。 PRM複合体又はポリソームか ら脱離した mRNAsを遠心により溶出させた。
[0079] 溶出した mRNAsを RNeasy MinElute Cleanup Kitを用いて精製した。収率は 260η mにおける UV吸光度を測定することにより決定した。これらの回収した mRNAの RT-P CRによる増幅は QIAGEN One-Step RT- PCRキット (QIAGEN)を用いて行った。プラ イマ一は下記のものを用いた。
フォワードプライマー：
ATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACCA-3' (ユニバーサル）（配列番 号 71)
リバースプライマー： 5し CCGCCGCTCCAGAATCTC- 3' (配列番号 72)
<tRNA— の調製 >
CUA
[0080] E. coliのサプレッサー tRNALeu5 は、ラン オフ in vitro転写により調製した。铸 型 DNAは、 20 pmolのフォワードプライマー（5，- d(TAA TAC GAC TCA CTA TAG CCC GGA TGG TGG AAT CGG TAG ACA)- 3' (配列番号 73) )、 20 pmolのリバ一 スプライマー（5 d(TGG TAC CCG GAG CGG GAC TTG AAC CCG CAC AGC G CG AAC)- 3，（配列番号 74) )、 100 ftnolの铸型 DNA (5， - d(TG GTA CCC GGA GC G GGA CTT GAA CCC GCA CAG CGC GAA CGC CGA GGG ATT TAG AAT C CC TTG TGT CTA CCG ATT CCA CCA TCC GGG C)- 3，（配列番号 75) )、 1.25 Uの Pfo Ultra HF DNAポリメラーゼ (Stratagene)、 10 nmolの各 dNTPs (TOYOBO)、 及び の 10 X Pfo Ultra HF反応バッファーを含む 20 Lの反応混合物を用いた PCRにより行った。得られた PCR溶液は精製せずに転写反応に用いた。
[0081] In vitro転写は、 2,500 Uの T7 RNAポリメラーゼ (TOYOBO)、 2 μ molの各 NTPs (F ermentas)ゝ 5 μ molの GMP (Sigma), 1Uの無機ピロフォスフェイト (Calbiochem— Novabio chem)、 80 Uの RNase阻害剤 (TOYOBO)、铸型 DNAの 18 μ Lの PCR溶液、及び 50 μ L の 10 X反応バッファー（37 °Cで 18時間）を含む 500 Lの反応混合物を用いて行つ た。転写された tRNAを変性 PAGE (8%)を用いて精製し、次いでエタノール沈殿を行 い、 500 μ Lの水に溶解させた。得られた tRNAをさらに連続的に Microcon YM-30 (Mi llipore)及び G- 25 Microspin Columns (Amersham)に通すことにより精製した。
<tRNA— の調製 >
UUA
[0082] 前述した tRNALeu5 の調製方法にお!、て、フォワードプライマーとして、 5， -G TA
CUA
A TAC GAC TCA CTA TA GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC- 3，（配列 番号 76),リノくースプライマーとして 5，— TGG CGG AGA GAG GGG GAT TTG AAC CCC CGG TAG AGT TGC C- 3，（配列番号 77),铸型 DNAとして 5，- GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC GGA CCG GTC TTT AAA ACC GGA GTA GGG GC A ACT CTA CCG GGG GTT CAA ATC CCC CTC TCT CCG CCA- 3，（配列番号 78)を用いた他は、 tRNALeu5 の調製と同様にして， E.coliサブレッサー tRNASeriJ を
CUA UUA
調製した。
<tRNA— の調製 >
UCA
[0083] 前述した tRNALeu5 の調製方法にお!、て、フォワードプライマーとして、 5， -G TA
CUA
A TAC GAC TCA CTA TA GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC- 3，（配列 番号 79),リノくースプライマーとして 5，—TGG CGG AGA GAG GGG GAT TTG AAC CCC CGG TAG AGT TGC C- 3，（配列番号 80),铸型 DNAとして 5，- GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC GGA CCG GTC TTC AAA ACC GGA GTA GGG GC A ACT CTA CCG GGG GTT CAA ATC CCC CTC TCT CCG CCA- 3，（配列番号 81)を用いた他は、 tRNALeu5 の調製と同様にして， E.coliサブレッサー tRNASeriJ を
CUA UCA
調製した。
<tRNA— - の調製 >
CUA
[0084] 前述した tRNALeu5 の調製方法にお!、て、フォワードプライマーとして、 5， -G TA
CUA
A TAC GAC TCA CTA TA GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC- 3，（配列 番号 82),リノくースプライマーとして 5，—TGG CGG AGA GAG GGG GAT TTG AAC CCC CGG TAG AGT TGC C- 3，（配列番号 83),铸型 DNAとして 5，- GGA GAG ATG CCG GAG CGG CTG AAC GGA CCG GTC TCT AAA ACC GGA GTA GGG GC A ACT CTA CCG GGG GTT CAA ATC CCC CTC TCT CCG CCA- 3，（配列番号 84)を用いた他は、 tRNA u5 の調製と同様にして， E.coliサブレッサー tRNASeriJ を
CUA CUA
調製した。
< NaDでミスァシル化された酵母 tRNA^ の調製 >
CUA
[0085] 酵母の tRNAPhe -CAをコードするプラスミドは、大阪大学のドクター M. Endoから
CUA
分与された。 110 μ Lの 1 X反応バッファーに溶解した 30 μ gのプラスミドに 20 unitsの F okl (NEB)を添カ卩した。この反応溶液を 37 °Cで 6時間インキュベートし、次いで 65 °C で 20分間インキュベートした。翻訳反応は、 55 Lの Fokl直線ィ匕プラスミドの溶液、 2 μ molの各 NTPs (Fermentas)、 5 μ molの GMP (Sigma), 80 Uの RNase阻害剤（TOYO BO)、 1 Uの無機ピロフォスフェイト (Calbiochem- Novabiochem)、 2,200 Uの T7 RNA ポリメラーゼ（TOYOBO)、及び 10 μ Lの 10 X反応バッファー（400 mM Tris- HC1 (pH 8.0)、 200 mM MgCl、 50 mM DTTを含む、 500 μ Lの反応溶液を用いて行った。混合
2
物を 37 °Cで 8時間インキュベートし、転写された酵母 tRNAPhe - CAを QIAGEN DNA
CUA
/RNAキットを用いて精製した。連結反応は、 10 μ gの tRNAPhe - CA、 12 pmolの Lナ
CUA
フチルァラ-ル pdCpA(DMSOに溶解させたもの）、及び 50 Uの T4 RNAリガーゼ（Tak ara)を含む 20 μ Lの反応溶液 (55 mM Hepes— Na (pH 7.5)、 15 mM MgCl、 3.3 mM D
2 TT、 1 mM ATP)を用いて行った。混合物を 4 °Cで 2時間インキュベートし、次いで 40 μ Lの 0.45 Μ酢酸カリウム水溶液（ρΗ 5.0)で希釈した。この溶液をフエノール Ζクロ ロフオルム Ζイソアミリアルコール（25/24/1)で抽出し、再度クロロフオルムで抽出し、 さらにエタノール沈殿した。精製した Nap-tRNAPhe を、使用するまで、 1 mM酢酸カリ
CUA
ゥム水溶液（pH 5.0)に懸濁した。
[0086] サプレッサー tRNALeu5 (図 lb) サプレッサー tRNAPhe (図 lb)、及び 3種の
CUA 、 CUA
サプレッサー tRNASef (図 3b)の塩基配列を、それぞれ配列番号 85、 86、及び 87に 示す。
実施例 tRNA1^ を用いた終止コドンの読み飛ばし)
CUA
[0087] 大腸菌のジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR)をコードする天然 mRNAから、以下の 5つの変異 mRNAを作製した。この天然 mRNAの終止コドンは、 UAAである。
[0088] 第 1、第 2の変異 mRNAは、開始コドンと DHFRコード領域との間に T7タグを挿入 し、さらにその前、又は後に終止コドンの UAGを挿入したものである。 UAGは、終結 因子の RF1により認識される。 DHFRの後の終止コドンは削除した（図 laの上から 1 番目、 2番目）。
[0089] 第 3、第 4の変異 mRNAは、開始コドンと DHFRコード領域との間に T7タグを挿入 し、さらにその前、又は後に終止コドンの UAGを挿入し、 DHFRコード領域の後ろの 終止コドン UAAはそのまま存在させたものである（図 laの上から 3番目、 4番目）。 U AAは、終結因子 RF2により認識される。
[0090] 第 5の変異 mRNAは、 DHFRの天然 mRNAの開始コドンと DHFRコード領域との 間に T7タグを挿入したものである（図 laの上から 5番目）。 DHFRコード領域の後ろ の終止コドン UAAはそのまま存在する。
[0091] これらの铸型 mRNAを、 RF1を含む細胞抽出液 (RF + )、及び RF1が減少した再 構築細胞抽出液 (RF Δ )をそれぞれ用いて in vitro翻訳を行った。
[0092] また、翻訳系に、 E. coli由来のロイシン 5tRNA(tRNALeu5 )、又は酵母由来の
CUA
tRNAであって、フエ-ルァラニンに代えてナフチルァラニンが結合したもの（Nap— yeast -tRNAPhe )を添カ卩した。これらは、アンチコドンを、終止コドンの UAGに対
CUA
合できる CUAに置換した変異 tRNAである。これらの tRNAを図 lbに示す。 [0093] 終止コドンの読み飛ばし効率は、終止コドン位置に導入されるアミノ酸の種類と終 結因子のレベルに依存すると考えられる。また、疎水性のナフチルァラニンを運搬す る tRNAを用いることにより読み飛ばし効率が向上すると考えられる。
[0094] 得られたタンパク質溶液力も T7抗体を用いてタンパク質を単離し、ウェスタンプロ ットを行った結果を図 lcに示す。レーン 10及び 14は、変異 tRNAである Nap— tRN APhe を用い、レーン 11及び 15は変異 tRNAの tRNALeu5 を用いた結果である
CUA CUA
。その他のレーンは、このような変異 tRNAを用いない場合の結果である。
[0095] RF1が減少した細胞抽出液を用いた場合、 DHFRの上流に終止コドン UAGが 存在せず、 DHFRの下流に終止コドン UAAが存在する铸型 mRNA (T7 ( + ) UAG (一） UAA ( + )では、铸型 mRNAの用量依存的にタンパク質量が増大しており、 D HFRが生成している（レーン 1〜7)。また、この铸型 mRNAでは、終結因子 RF1の 有無（量の多少）にかかわらず同様に DHFRが生成した (レーン 7と 17とを比較)。こ のことは、 UAA終止コドンを認識してタンパク質合成を終結させるのに十分な量の R F1及び RF2が細胞抽出液中に存在することを示している。
[0096] また、終止コドンの UAGが DHFRコード領域の上流に存在する T7 ( + ) UAG ( + ) UAA ( + )及び UAG ( + ) T7 ( + ) UAA ( + )では、 RFl ( + )の細胞抽出液を用 ヽ た場合は、 DHFRは合成されていない（レーン 18, 19)。このように、 RF1 (+ )の条 件下では、終止コドン U AGが認識されている。
[0097] また、 DHFRの上流に終止コドン U AGが存在する場合は、 RF1が減少した細胞 抽出液を用い、かつ変異 tRNAを用いることにより、終止コドン UAGが効率良く読み 飛ばされて、 DHFR合成量が増大した（レーン 9とレーン 10, 11との比較；レーン 13 とレーン 14, 15との比較）。
[0098] 全長タンパク質量の回復は、 Nap— tRNAPhe の存在下で、 T7 ( + ) UAG ( + )
CUA
11^ ( + )では34% (レーン10)、11八0 ( + )丁7 ( + ) 1；^ ( + )では35% (レーン1
4)である。また、ロイシンを運搬する tRNALeu5 の存在下では、 T7 ( + ) UAG ( + )
CUA
11^ ( + )では61% (レーン11)、11八0 ( + )丁7 ( + ) 1；^ ( + )では86% (レーン1
5)である。
[0099] このように、これらのサプレッサー tRNAは、 UAG終止コドンを読み飛ばし、その下 流の DHFR配列が翻訳された。
[0100] 次に、末端に UAA終止コドンが存在しない铸型を用いた翻訳について説明する。
図 Idは、翻訳の際に形成したポリソームを T7タグ抗体を用いてセレクション後、回収 した mRNA量を示す図である。 T7 ( + ) UAG ( + ) STOP ( - )及び UAG ( + ) T7 ( + ) STOP (―)の铸型では、サプレッサー tRNAの tRNALeu5 を用いたとき、 RF1
CUA
( Δ )の条件下で、 T7タグの付!、た DHFRmRNAが回収された。
[0101] これらの回収量は、全1111^^\量に対して、丁7 ( + ) 1；八0 ( + ) 3丁0? (—）では約 28%、 UAG ( + )T7 ( + ) STOP (—）では約 26%であった（レーン 4, 6)。 DHFRの 上流に UAGが存在せず、通常の細胞抽出液を用い、かつ変異 tRN Aを用いないポ シティブコントロール（レーン 1)では収量約 35%であった。この対照に対して、 T7 ( + ) UAG ( + ) STOP ( )の読み飛ばし効率は約 80%、 UAG ( + ) T7 ( + ) STOP ( -)の読み飛ばし効率は約 71%であった。
[0102] RF ( A )の細胞抽出液を用い、かつサプレッサー tRNAを用いることにより、 UAG 読み飛ばしが極めて効率的に行われたことが分かる。
上記の結果は、 UAG終止コドンの読み飛ばしにより T7タグは、抗体がアクセスでき る程度にリボソームトンネル力 押し出されたこと、及び DHFRタンパク質と mRNA铸 型とは共に存在したことを示して 、る。
例 2
ItRNA— 用いた擬天然 mRNA 鶬型 する全長タンパク皙の表示)
CUA
[0103] 図 2aに示すように、大腸菌のジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR)をコードする天然 mRNAから、 2種の擬天然 mRNAを作製した。
[0104] 図 2aの上段は天然の DHFRmRNAである。これは、終止コドンが UAAであり、 3， — UTR中にも UAA配列が存在する。
[0105] 図 2aの中段に示すの力 第 1の擬天然 mRNAであり、 T7タグ配列を、 DHFRコ ード領域の直後であって終止コドンの直前に挿入した。 T7タグにアクセス可能なとき は、先行する DHFRにもアクセス可能であり、即ち表示されていることを示す。また、 読み飛ばしを容易にするために、 2つある終止コドン配列を UAAから UAGに置き換 えた。 3'— UTRの長さは 219ntである。 [0106] 図 2aの下段に示すのが第 2の擬天然 mRNAであり、第 1の終止コドン配列を削除 し、 3，—UTR中に存在する第 2の終止コドン配列 UAAをロイシンをコードする UUA に置き換えた。これは、変異 tRNAを用いなくても終止コドンがないため、 mRNAと D HFRタンパク質との結合物が得られるポジティブコントロールである。
[0107] さらに、第 2の擬天然 mRNAについて、 3，一UTRの長さを 75nt (ヌクレオチド） (2 5アミノ酸に対応）、 147nt (49アミノ酸に対応）、及び 219nt (73アミノ酸に対応）に 変化させたものをそれぞれ作製した。これは、リボソームトンネルカゝら外部に DHFRコ ード領域を表示するために必要なスぺーサ一である 3 '— UTRの長さを調べるため である。
[0108] さらに、第 2の擬天然 mRNAのうち、 3，一UTRの長さが 219ntであるものに代えて 、ポリ Aを付加することにより 219nt以上の長さにしたものを作製した。ポリ Aの付カロは 、 E. coliのポリ Aポリメラーゼを使用して行った。
[0109] これらの铸型 mRNAについて、サプレッサー tRNAの非存在下、及び tRNALeu5
CU
の存在下のそれぞれで翻訳を行った。また、 RF ( + )及び RF ( A )細胞抽出液をそ
A
れぞれ用いた翻訳を行った。
[0110] T7タグに対する抗体で mRNA铸型を単離し、電気泳動した後、 UV照射により mR NAを定量した。結果を図 2bに示す。
[0111] T7 ( + ) UAG ( ) LEU ( + )では終止コドンが存在しな!、ため、 RF1 ( + )の条件 下でも DHFRは生成する。 DHFRコード領域の 3，—UTRの長さが 75ntの場合は、 DHFRは検出されなかった（レーン 1)。これは、 T7タグがリボソームトンネルから外に 押し出されておらず、 T7抗体によって铸型 mRNAが釣り上げられな力つたためと考 えられる。 T7抗体がリボソームトンネルから押し出されていないため、その上流の DH FRがリボソームトンネル力も押し出されている力否かは不明である。
[0112] これに対して、 3'— UTRの長さが 147nt以上の場合は、 DHFRは検出された（レ ーン 3, 5, 7)。これは T7タグがリボソームトンネル力 外に押し出されているからと考 えられる。このことは、 T7タグの上流に存在する DHFRの全長がリボソームトンネル 力 外に押し出されて 、ることを示して 、る。
[0113] mRNAの収量は、全添カ卩 mRNA量に対して、 3，—UTRの長さが 147ntの場合 は 1. 5%、 219ntの場合は 4%、ポリ Aの 219ntの場合は 2. 5%であった。
[0114] 次に、 T7 ( + ) UAG ( + ) UAG ( + ) (219nt)は、終止コドンを 2個有する力 この 铸型は、サプレッサー tRNAである tRNALeu5 の存在下で、かつ RF1 ( Δ )の条件
CUA
下で、終止コドンを読み飛ばした（図 2bのレーン 10)。铸型 mRNAの収率は 4. 3% であった。 3，— UTRの 219ntの長さは、 2個の終止コドンが存在する場合にも十分 な長さであることが分かる。
実施例 3
itRNA— ^tRNA— 、及び tRNA2^ を用いた終止コドンの読み飛ばし)
UUA UCA CUA
[0115] E.coliの天然 DHFRの mRNA上の終止コドンは UAA (オーカ一）である。また、 DHFR の 3'— UTR中には、さらにもう一つの UAAが存在する。本実施例では、図 3aに示す 3 種の铸型 mRNAを用いて、 tRNASertJのアンチコドンを終止コドンに対応するものに置 換したサブレッサー tRNA力 UAA、 UGA (オパール）、及び UAG (アンバー）の全て の終止コドンを読み飛ばすことが可能であること、また、天然 DHFR mRNAの 3'— UT Rを利用した全長蛋白質ディスプレーが可能であることを示した。
[0116] 図 3a中の T7(+)UAA(+)UAA(+)(222)は、野生型の DHFRに T7プロモーターと T7タ グを揷入したものである。また、 T7(+)UGA(+)UGA(+)(222)は、この T7(+)UAA(+)UAA( +)(222)において、 2つの終止コドン UAAを UGAに置換したものである。また、 T7(+)UA G(+)UAG(+)(222)は、この T7(+)UAA(+)UAA(+)(222)において、 2つの終止コドン UAA を UGAに置換したものである。いずれの铸型 mRNAも 5，—UTRの長さは 222ヌクレオ チド (nt)である。
[0117] また、铸型 T7(+)UAA(+)UAA(+)(222)の翻訳はサプレッサー tRNASa" の存在下で
UUA
行！、、錄型 T7(+)UGA(+)UGA(+)(222)の翻訳はサプレッサー tRNASer の存在下で行
UCA
V、、錄型 T7(+)UAG(+)UAG(+)(222)の翻訳はサプレッサー tRNASer の存在下で行つ
CUA
た。
[0118] 図 3cに示すように、 mRNAに対するタンパク質の回収率は、終止コドン UAAでは 2.
6%、終止コドン UGAでは 3.7%、終止コドン UAGでは 3.1%であった (図 3c、レーン 2, 4, 6)。
[0119] また、対照として、 E.coli DHFRに T7プロモーター、 T7タグを挿入し、かつ 2つの終 止コドン UAAを欠失させた铸型 mRNAを構築し、この mRNAに対して、 RF1及び RF2を 含む再構築された翻訳システムを用いて、上記と同様にして翻訳を行った。この終止 コドンを有さな ヽ铸型 T7(+)Stop (-)の 3'- UTRの長さは 222ヌクレオチドである。 mRNA の回収率は、図 3dに示すように 4%であった。
[0120] このように、サプレッサー tRNASei"の、 3種の終止コドンの読み飛ばし効率は、終止 コドンがない場合とほぼ同程度であった。また、ターミネータ一として機能する第 1の 終止コドンだけでなぐ第 2の終止コドンも効率的に読み飛ばされたと考えられる。こ れは、両者の間が 81ヌクレオチド (27アミノ酸に相当）離れているところ、 26アミノ酸の 長さでは ORF領域に続!、て T7タグの全体が十分に表示されな!、からである。
[0121] 一方、サプレッサー tRNAの非存在下では、 RF1及び RF2の減少下においても、い ずれの铸型も回収されな力つた（図 3d、レーン 2)。

Claims

請求の範囲
[1] 細胞抽出液を用いてサンプル中の mRNAを翻訳し、このとき、少なくとも 1種の終止 コドンを読み飛ばして、 mRNAとそれが翻訳されて生じるタンパク質との結合体を含 む複合体を得る工程を含むタンパク質の表示方法。
[2] 細胞抽出液を用いてサンプル中の mRNAを翻訳するに際して、アミノ酸の tRNAの アンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドンに置換した少なくとも 1種の変異 tR
NAをカ卩えることにより、少なくとも 1種の終止コドンを読み飛ばす請求項 1に記載の 方法。
[3] 全ての終止コドンに対応するように変異 tRNAをカ卩えることにより、全ての終止コドン を読み飛ばす請求項 2に記載の方法。
[4] 変異 tRNA力 アミノアシルー tRNA合成酵素によりアミノアシル化されるものである 請求項 2に記載の方法。
[5] 変異 tRNAは、アンチコドン部位を認識サイトとしないアミノアシル— tRNA合成酵素 と対をなすものである請求項 4に記載の方法。
[6] 変異 tRNAとして、ロイシン tRNAのアンチコドンを終止コドンに対するアンチコドンに 置換した変異 tRNA、セリン tRNAのアンチコドンを終止コドンに対するアンチコドン に置換した変異 tRNA、システィン tRNAのアンチコドンを終止コドンに対するアンチ コドンに置換した変異 tRNA、及びァラニン tRNAのアンチコドンを終止コドンに対す るアンチコドンに置換した変異 tRNAからなる群より選ばれる少なくとも 1種を用いる 請求項 2〜5の 、ずれかに記載の方法。
[7] 細胞抽出液として、少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いる請求 項 2に記載の方法。
[8] 少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液が、少なくとも 1種の終結因子を含 まない再構築された細胞抽出液、少なくとも 1種の終結因子が不活性化された細胞 抽出液、又は過剰量の tRNAを含む細胞抽出液である請求項 7に記載の方法。
[9] 細胞抽出液を用いてサンプル中の mRNAを翻訳するに際して、細胞抽出液として、 少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を用いることにより、少なくとも 1種 の終止コドンを読み飛ばす請求項 1に記載の方法。
[10] 少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液が、少なくとも 1種の終結因子を 含まない再構築された細胞抽出液、少なくとも 1種の終結因子を不活性ィ匕した細胞 抽出液、又は過剰量の tRNAを含む細胞抽出液である請求項 9に記載の方法。
[11] 全ての終結因子が機能しない細胞抽出液を用いる請求項 9に記載の方法。
[12] mRNA翻訳工程の前に、さらに、サンプルから mRNAを抽出する工程を含む請求 項 1に記載の方法。
[13] mRNA抽出工程の後であって mRNA翻訳工程の前に、さら〖こ、抽出された mRNA の 3'末端に任意の核酸配列を付加する工程を含む請求項 12に記載の方法。
[14] 細胞抽出液と、アミノ酸の tRNAのアンチコドンを終止コドンに対応するアンチコドン に置換した少なくとも 1種の変異 tRNAとを備えるタンパク質表示用キット。
[15] さらに、少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を備える請求項 14に記 載のキット。
[16] 少なくとも 1種の終結因子が機能しない細胞抽出液を備えるタンパク質表示用キット。
[17] 以下の (1)、（2)、又は (3)の変異 tRNA
(1) セリン tRNAのアンチコドンを CUAに置換した終止コドン UAG読み飛ばし用の 変異 tRNA。
(2) セリン tRNAのアンチコドンを UCAに置換した終止コドン UGA読み飛ばし用の 変異 tRNA。
(3) セリン tRNAのアンチコドンを UUAに置換した終止コドン UAA読み飛ばし用の 変異 tRNA。
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