JP2001078787A - 新規の遺伝子及びポリペプチドの無細胞合成並びに単離 - Google Patents
新規の遺伝子及びポリペプチドの無細胞合成並びに単離Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 本発明は新規のポリペプチドの製造方法の提
供を課題とする。 【解決手段】 セミランダムヌクレオチド配列を含むイ
ンビトロ発現ユニットを転写等してｍＲＮＡライブラリ
ーを用意し、ポリペプチド鎖がポリソームに結合する条
件下で該ライブラリーを翻訳させ、該ポリソームを対象
のポリペプチドに特異的に反応する対象の物質に接触さ
せ、該対象の物質に特異的に反応するポリソームからｍ
ＲＮＡを単離した対象のポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を発現させて新規ポリペプチドを生産する
方法であって、翻訳段階の際、任意的に前記ポリソーム
から前記ポリペプチド鎖を遊離させ、更に、再分により
前記接触工程において同定し前記ｍＲＮＡを単離し、対
象の遺伝子が単離できるように転写、翻訳、接触、及び
再分による単離を繰り返し、単離遺伝子からｃＤＮＡを
構築して発現させ、新規ポリペプチドを生産する方法を
提供する。
供を課題とする。 【解決手段】 セミランダムヌクレオチド配列を含むイ
ンビトロ発現ユニットを転写等してｍＲＮＡライブラリ
ーを用意し、ポリペプチド鎖がポリソームに結合する条
件下で該ライブラリーを翻訳させ、該ポリソームを対象
のポリペプチドに特異的に反応する対象の物質に接触さ
せ、該対象の物質に特異的に反応するポリソームからｍ
ＲＮＡを単離した対象のポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を発現させて新規ポリペプチドを生産する
方法であって、翻訳段階の際、任意的に前記ポリソーム
から前記ポリペプチド鎖を遊離させ、更に、再分により
前記接触工程において同定し前記ｍＲＮＡを単離し、対
象の遺伝子が単離できるように転写、翻訳、接触、及び
再分による単離を繰り返し、単離遺伝子からｃＤＮＡを
構築して発現させ、新規ポリペプチドを生産する方法を
提供する。
Description
【０００１】技術分野 本発明は一般に生体内における新規の遺伝子及びポリペ
プチドの合成並びに単離に関し、より詳しくはセミラン
ダムＤＮＡ又はＲＮＡ配列を生成及び発現せしめる方
法、これらの配列から新規の遺伝子を単離する方法、並
びに新規のポリペプチドを作り出すためのこれらの遺伝
子の利用の方法に関する。
プチドの合成並びに単離に関し、より詳しくはセミラン
ダムＤＮＡ又はＲＮＡ配列を生成及び発現せしめる方
法、これらの配列から新規の遺伝子を単離する方法、並
びに新規のポリペプチドを作り出すためのこれらの遺伝
子の利用の方法に関する。
【０００２】発明の背景 セミランダム配列からの新規の遺伝子及びポリペプチド
の単離は一般に、対象の (複数の）配列を得るための遺
伝子的に雑多な大量の細胞集団をスクリーンする必要性
によって制限されていた。例えば１０個のアミノ酸のポ
リペプチド鎖は２０10種類又はおよそ１０13種類の順列
が考えられる。もしこの順列のうち１０種が所望する特
性（例えば特異的な抗原に結合する能力）を有していた
場合、１０12個の集団を１つの所望する新規遺伝子を探
す期待のためにスクリーンする。（微生物を介して新規
遺伝子を発現せしめる）常用の方法の利用を介しての特
定の性質に関する大量の新しい配列のスクリーニング
は、この新規遺伝子が生体に明確な増殖又は生存のため
の利点を付与しない限り事実上実施しがたい。実際、従
来技術のもとでは、１０12個の個々の形質転換微生物
を、所望する１新規遺伝子を見つけるためにそれぞれス
クリーンする必要がある。
の単離は一般に、対象の (複数の）配列を得るための遺
伝子的に雑多な大量の細胞集団をスクリーンする必要性
によって制限されていた。例えば１０個のアミノ酸のポ
リペプチド鎖は２０10種類又はおよそ１０13種類の順列
が考えられる。もしこの順列のうち１０種が所望する特
性（例えば特異的な抗原に結合する能力）を有していた
場合、１０12個の集団を１つの所望する新規遺伝子を探
す期待のためにスクリーンする。（微生物を介して新規
遺伝子を発現せしめる）常用の方法の利用を介しての特
定の性質に関する大量の新しい配列のスクリーニング
は、この新規遺伝子が生体に明確な増殖又は生存のため
の利点を付与しない限り事実上実施しがたい。実際、従
来技術のもとでは、１０12個の個々の形質転換微生物
を、所望する１新規遺伝子を見つけるためにそれぞれス
クリーンする必要がある。
【０００３】細胞内に局在する新規の遺伝子生成物を検
出するための本スクリーニング工程において、各形質転
換細胞由来のコロニーはその細胞を開裂せしめるために
処理されなければならない。一般には標準ペトリ皿一枚
当り１０００〜２０００個の細菌コロニーをこのスクリ
ーニング工程のために溶解せしめる（例えばクロロホル
ムにより）。従って、１０12個の形質転換生物のために
は５００，０００から１０億枚のペトリ皿を必要とする
であろう。更に、１０，０００から１００，０００リッ
トルの対数増殖分裂細胞が大量の形質転換可能細胞を製
造するために必要でありうる。
出するための本スクリーニング工程において、各形質転
換細胞由来のコロニーはその細胞を開裂せしめるために
処理されなければならない。一般には標準ペトリ皿一枚
当り１０００〜２０００個の細菌コロニーをこのスクリ
ーニング工程のために溶解せしめる（例えばクロロホル
ムにより）。従って、１０12個の形質転換生物のために
は５００，０００から１０億枚のペトリ皿を必要とする
であろう。更に、１０，０００から１００，０００リッ
トルの対数増殖分裂細胞が大量の形質転換可能細胞を製
造するために必要でありうる。
【０００４】他方、遺伝子生成物が分泌されて細胞の外
側に結合する場合、これはそれらの蛍光化合物又はその
他のマーカーに結合する能力によって検出されうる。こ
れらの場合において、新規の所望するポリペプチドの合
成に関してセルソーターがスクリーンのために利用され
うる。しかしながら、１秒当り５，０００個の細胞の流
速にてさえも、セルソーターで１０12個の細胞をスクリ
ーンするためには６０年以上もかかるであろう。従っ
て、非常に高額且つ時間のかかる現在のスクリーニング
方法は明らかにセミランダム配列からの新規の遺伝子及
びポリペプチドの単離の妨げとなっている。
側に結合する場合、これはそれらの蛍光化合物又はその
他のマーカーに結合する能力によって検出されうる。こ
れらの場合において、新規の所望するポリペプチドの合
成に関してセルソーターがスクリーンのために利用され
うる。しかしながら、１秒当り５，０００個の細胞の流
速にてさえも、セルソーターで１０12個の細胞をスクリ
ーンするためには６０年以上もかかるであろう。従っ
て、非常に高額且つ時間のかかる現在のスクリーニング
方法は明らかにセミランダム配列からの新規の遺伝子及
びポリペプチドの単離の妨げとなっている。
【０００５】上記に簡潔した方法の他に、FieldsとSong
（Nature 340 : 245-246, 1989) は酵母ＧＡＬ４遺伝子
のドメインを用いた、その他のポリペプチドと特異的に
結合するポリペプチドを選択的に得るための方法を紹介
している。しかしながらこのシステムは重要なる制限を
有す。第１にポリペプチド−ポリペプチド結合のみが選
択され、即ちポリペプチド−非ポリペプチド相互作用は
除外される。第２にこの方法が商業適用性を有すために
は、既知及び新規の結合性ポリペプチドはかなり高いレ
ベル且つ「天然」の形態に酵母において発現されなけれ
ばならない。第３に、グリコシル化ポリペプチド又は特
定の改質されたポリペプチドもこの方法により除外され
るであろう。第４に、彼らは物理相互作用のよく解明さ
れている既知のポリペプチドを用いたにもかかわらずコ
ントロールＧＡＬ４活性の４．５％のみを示したことか
ら、ランダム又はセミランダム配列が働くかどうか明白
でない。第５に、FieldsとSongは非常に大きい配列、即
ち、６３３個のアミノ酸のＳＮＦ１タンパク質及び３２
２個のアミノ酸のＳＮＦ４タンパク質であって互いに相
互作用する二次構造を有すものを利用している。第６
に、１０10の多様性のセミランダム配列についてさえ
も、彼の方法を用いることによって極端に大量のＤＮ
Ａ、改質酵素及び感受性酵母細胞の必要性を回避せしめ
た。
（Nature 340 : 245-246, 1989) は酵母ＧＡＬ４遺伝子
のドメインを用いた、その他のポリペプチドと特異的に
結合するポリペプチドを選択的に得るための方法を紹介
している。しかしながらこのシステムは重要なる制限を
有す。第１にポリペプチド−ポリペプチド結合のみが選
択され、即ちポリペプチド−非ポリペプチド相互作用は
除外される。第２にこの方法が商業適用性を有すために
は、既知及び新規の結合性ポリペプチドはかなり高いレ
ベル且つ「天然」の形態に酵母において発現されなけれ
ばならない。第３に、グリコシル化ポリペプチド又は特
定の改質されたポリペプチドもこの方法により除外され
るであろう。第４に、彼らは物理相互作用のよく解明さ
れている既知のポリペプチドを用いたにもかかわらずコ
ントロールＧＡＬ４活性の４．５％のみを示したことか
ら、ランダム又はセミランダム配列が働くかどうか明白
でない。第５に、FieldsとSongは非常に大きい配列、即
ち、６３３個のアミノ酸のＳＮＦ１タンパク質及び３２
２個のアミノ酸のＳＮＦ４タンパク質であって互いに相
互作用する二次構造を有すものを利用している。第６
に、１０10の多様性のセミランダム配列についてさえ
も、彼の方法を用いることによって極端に大量のＤＮ
Ａ、改質酵素及び感受性酵母細胞の必要性を回避せしめ
た。
【０００６】既に開示されている方法に対し、本発明は
新規の遺伝子及びポリペプチドの無細胞スクリーニング
についての方法を詳細する。本方法は大量の形質転換生
物に関連する問題及びFieldsとSongにより開示された方
法の制限を回避せしめ、そして数週間以内に完了しう
る。従って、本方法論は新規の遺伝子生成物の単離にお
ける時間及び費用の実質的な節約を可能とする。
新規の遺伝子及びポリペプチドの無細胞スクリーニング
についての方法を詳細する。本方法は大量の形質転換生
物に関連する問題及びFieldsとSongにより開示された方
法の制限を回避せしめ、そして数週間以内に完了しう
る。従って、本方法論は新規の遺伝子生成物の単離にお
ける時間及び費用の実質的な節約を可能とする。
【０００７】発明の概容 簡単に述べると、本発明は多数の新規なる遺伝子及びポ
リペプチドの合成、スクリーニング並びに選別に関す
る。本方法は一般に以下の段階、（ａ）ＲＮＡポリメラ
ーゼ結合性配列、リボソーム結合性配列及び翻訳開始シ
グナルを含む５′非翻訳領域を含んで成るインビトロ発
現ユニットを作製し、ここで該発現ユニットはｍＲＮＡ
を製造可能であり；（ｂ）１又は複数の種類のセミラン
ダムヌクレオチド配列を該発現ユニットに連結させ；
（ｃ）ＲＮＡを生産するために該発現ユニットとセミラ
ンダムヌクレオチド配列に関連する配列を転写又は複製
せしめ；（ｄ）ポリソームを生産するため、該ポリソー
ムを維持せしめるのに十分な条件のもとで該ＲＮＡを翻
訳せしめ；（ｅ）該ポリソームを対象の物質と結合せし
め；（ｆ）該対象の物質と結合するポリソームを単離せ
しめ；（ｇ）ｍＲＮＡを遊離せしめるために該単離化ポ
リソームを解離せしめ；（ｈ）該遊離化ｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡを回収且つ作製せしめ；そして（ｉ）新規のポリ
ペプチドを生産するために該遺伝子を発現せしめるこ
と、を含んで成る。
リペプチドの合成、スクリーニング並びに選別に関す
る。本方法は一般に以下の段階、（ａ）ＲＮＡポリメラ
ーゼ結合性配列、リボソーム結合性配列及び翻訳開始シ
グナルを含む５′非翻訳領域を含んで成るインビトロ発
現ユニットを作製し、ここで該発現ユニットはｍＲＮＡ
を製造可能であり；（ｂ）１又は複数の種類のセミラン
ダムヌクレオチド配列を該発現ユニットに連結させ；
（ｃ）ＲＮＡを生産するために該発現ユニットとセミラ
ンダムヌクレオチド配列に関連する配列を転写又は複製
せしめ；（ｄ）ポリソームを生産するため、該ポリソー
ムを維持せしめるのに十分な条件のもとで該ＲＮＡを翻
訳せしめ；（ｅ）該ポリソームを対象の物質と結合せし
め；（ｆ）該対象の物質と結合するポリソームを単離せ
しめ；（ｇ）ｍＲＮＡを遊離せしめるために該単離化ポ
リソームを解離せしめ；（ｈ）該遊離化ｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡを回収且つ作製せしめ；そして（ｉ）新規のポリ
ペプチドを生産するために該遺伝子を発現せしめるこ
と、を含んで成る。
【０００８】上記の方法の第１の態様において、この方
法は前記のＲＮＡ又は関連するｃＤＮＡを増幅せしめる
ことによって所望する配列の富んでいるｍＲＮＡにおい
て繰り返すことができうる。その後、所望する遺伝子を
更に純化するために、有意な割合（＞１０-3）の切り捨
て集団（truncated population）を所望する配列が示す
迄、この遺伝子の増幅せしめたサブセットを前記の種々
の段階のサイクルにかけることができうる。主として方
法は遺伝子の集団がほぼ均一となる迄繰り返しうる。
法は前記のＲＮＡ又は関連するｃＤＮＡを増幅せしめる
ことによって所望する配列の富んでいるｍＲＮＡにおい
て繰り返すことができうる。その後、所望する遺伝子を
更に純化するために、有意な割合（＞１０-3）の切り捨
て集団（truncated population）を所望する配列が示す
迄、この遺伝子の増幅せしめたサブセットを前記の種々
の段階のサイクルにかけることができうる。主として方
法は遺伝子の集団がほぼ均一となる迄繰り返しうる。
【０００９】本発明の第２の態様において、新規なるポ
リペプチドを生産するための方法であって、以下の段
階、（ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リボソーム
結合性配列及び翻訳開始シグナルを含む５′非翻訳領域
を含んで成るインビトロ（試験管内）発現ユニットを作
製し、ここで該発現ユニットはｍＲＮＡを生産すること
が可能であり； (ｂ）該発現ユニットに１又は複数のセ
ミランダムヌクレオチド配列を連結せしめ；（ｃ）該発
現ユニットとセミランダムヌクレオチド配列に関連する
配列を転写せしめてＲＮＡを生産せしめ；（ｄ）該ＲＮ
Ａを翻訳せしめて生物学的に活性なポリペプチドを生産
せしめ；（ｅ）該生物学活性ポリペプチドをコード化す
るＲＮＡを再分（subdivide ）せしめ；（ｆ）上記に記
載の段階（ｃ）−（ｅ）の通りに転写、翻訳及び再分せ
しめて対象の遺伝子を単離せしめ；（ｇ）該単離化遺伝
子からｃＤＮＡを作製せしめ；そして（ｈ）新規なるポ
リペプチドを生産するように該ｃＤＮＡを発現せしめる
こと、を含んで成る方法を提供する。
リペプチドを生産するための方法であって、以下の段
階、（ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リボソーム
結合性配列及び翻訳開始シグナルを含む５′非翻訳領域
を含んで成るインビトロ（試験管内）発現ユニットを作
製し、ここで該発現ユニットはｍＲＮＡを生産すること
が可能であり； (ｂ）該発現ユニットに１又は複数のセ
ミランダムヌクレオチド配列を連結せしめ；（ｃ）該発
現ユニットとセミランダムヌクレオチド配列に関連する
配列を転写せしめてＲＮＡを生産せしめ；（ｄ）該ＲＮ
Ａを翻訳せしめて生物学的に活性なポリペプチドを生産
せしめ；（ｅ）該生物学活性ポリペプチドをコード化す
るＲＮＡを再分（subdivide ）せしめ；（ｆ）上記に記
載の段階（ｃ）−（ｅ）の通りに転写、翻訳及び再分せ
しめて対象の遺伝子を単離せしめ；（ｇ）該単離化遺伝
子からｃＤＮＡを作製せしめ；そして（ｈ）新規なるポ
リペプチドを生産するように該ｃＤＮＡを発現せしめる
こと、を含んで成る方法を提供する。
【００１０】本発明の他の態様において、新規なるポリ
ペプチドを生産するための方法であって、以下の段階、
（ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リボソーム結合
性配列及び翻訳開始シグナルを含むインビトロ発現ユニ
ットを作製せしめ、ここで該発現ユニットはｍＲＮＡを
生産可能であり；（ｂ）該発現ユニットに１又は複数の
セミランダムヌクレオチド配列を連結せしめ；（ｃ）該
発現ユニットとセミランダム配列に関連する配列を複製
せしめてＲＮＡを生産せしめ；（ｄ）生物学的に活性な
ポリペプチドを生産せしめるために該ＲＮＡを翻訳せし
め；（ｅ）該生物学的に活性なポリペプチドをコード化
するＲＮＡを再分せしめ；（ｆ）上記の段階（ｄ）−
（ｅ）の通りに翻訳及び再分せしめて対象の遺伝子を単
離せしめ；（ｇ）該単離化遺伝子からｃＤＮＡを作製せ
しめ、そして（ｈ）新規なるポリペプチドを生産するよ
うにｃＤＮＡを発現せしめること、を含んで成る方法を
提供する。
ペプチドを生産するための方法であって、以下の段階、
（ａ）ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リボソーム結合
性配列及び翻訳開始シグナルを含むインビトロ発現ユニ
ットを作製せしめ、ここで該発現ユニットはｍＲＮＡを
生産可能であり；（ｂ）該発現ユニットに１又は複数の
セミランダムヌクレオチド配列を連結せしめ；（ｃ）該
発現ユニットとセミランダム配列に関連する配列を複製
せしめてＲＮＡを生産せしめ；（ｄ）生物学的に活性な
ポリペプチドを生産せしめるために該ＲＮＡを翻訳せし
め；（ｅ）該生物学的に活性なポリペプチドをコード化
するＲＮＡを再分せしめ；（ｆ）上記の段階（ｄ）−
（ｅ）の通りに翻訳及び再分せしめて対象の遺伝子を単
離せしめ；（ｇ）該単離化遺伝子からｃＤＮＡを作製せ
しめ、そして（ｈ）新規なるポリペプチドを生産するよ
うにｃＤＮＡを発現せしめること、を含んで成る方法を
提供する。
【００１１】上記の発現ユニットはＲＮＡポリメラーゼ
結合性配列、リボソーム結合性部位及び翻訳開始シグナ
ルを含んで成る。該発現ユニットは翻訳エンハンサー又
は「活性化」配列、選んだ配列の３′尾部及び適切な制
限部位を更に含んで成りうる。該セミランダムＤＮＡ配
列は天然ＤＮＡの機械的、化学的もしくは酵素的断片化
により、ＤＮＡの化学合成により、又はＤＮＡを直接該
発現ユニット上に重合せしめることにより作られうる。
該対象の物質は表層抗原、リセプタータンパク質、毒
素、有機ポリマー、タンパク質分子の活性部位、中間代
謝物、抗体、金属、ホルモン又はその他の化合物であり
うる。
結合性配列、リボソーム結合性部位及び翻訳開始シグナ
ルを含んで成る。該発現ユニットは翻訳エンハンサー又
は「活性化」配列、選んだ配列の３′尾部及び適切な制
限部位を更に含んで成りうる。該セミランダムＤＮＡ配
列は天然ＤＮＡの機械的、化学的もしくは酵素的断片化
により、ＤＮＡの化学合成により、又はＤＮＡを直接該
発現ユニット上に重合せしめることにより作られうる。
該対象の物質は表層抗原、リセプタータンパク質、毒
素、有機ポリマー、タンパク質分子の活性部位、中間代
謝物、抗体、金属、ホルモン又はその他の化合物であり
うる。
【００１２】上記及びその他の態様は以下の詳細の説明
を参照することによって明らかとなるであろう。 好ましい態様の詳細 本発明は新規なる遺伝子及びポリペプチドの単離に関す
る。このような新規なる遺伝子は本質的に無数の多様性
（diversity ）を有し、そして商業的に重要な特性、例
えば新規なる触媒活性又は特定の物質に選択的に結合す
る能力、を有す新しいポリペプチドをコードしうる。現
存する遺伝子又は化学合成ＤＮＡのセミランダムヌクレ
オチド配列に由来する読み取り枠 (open reading fram
e）を含んで成る新規なる遺伝子が作製されうる。これ
らは現存するプロモーター、エンハンサー、開始コド
ン、プラスミド、リボソーム結合性部位及び／又はター
ミネーターを用いることにより広範囲の生物において発
現されうる。ある場合において、該新規なる遺伝子を大
量生産プロセスの一部としてインビトロにおいて発現せ
しめることは好適でありうる。
を参照することによって明らかとなるであろう。 好ましい態様の詳細 本発明は新規なる遺伝子及びポリペプチドの単離に関す
る。このような新規なる遺伝子は本質的に無数の多様性
（diversity ）を有し、そして商業的に重要な特性、例
えば新規なる触媒活性又は特定の物質に選択的に結合す
る能力、を有す新しいポリペプチドをコードしうる。現
存する遺伝子又は化学合成ＤＮＡのセミランダムヌクレ
オチド配列に由来する読み取り枠 (open reading fram
e）を含んで成る新規なる遺伝子が作製されうる。これ
らは現存するプロモーター、エンハンサー、開始コド
ン、プラスミド、リボソーム結合性部位及び／又はター
ミネーターを用いることにより広範囲の生物において発
現されうる。ある場合において、該新規なる遺伝子を大
量生産プロセスの一部としてインビトロにおいて発現せ
しめることは好適でありうる。
【００１３】上記の通り、本発明は特異的な結合性並び
に／又は生物学的活性を有する新規なるポリペプチドを
コード化する新規なる遺伝子及び遺伝子フラグメントを
作製し、そして単離するための複数段階プロセスを詳細
する。好適な態様において、該プロセスは以下の段階を
含んで成る： １．ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列（即ち、プロモータ
ー又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ開始部位）、リ
ボソーム結合性部位及び翻訳開始シグナルを含む発現ユ
ニットを作製する。この発現ユニットは適当な制限部
位、翻訳エンハンサー又は「活性化」配列、及び選んだ
配列の３′尾部も含むことがありうる。
に／又は生物学的活性を有する新規なるポリペプチドを
コード化する新規なる遺伝子及び遺伝子フラグメントを
作製し、そして単離するための複数段階プロセスを詳細
する。好適な態様において、該プロセスは以下の段階を
含んで成る： １．ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列（即ち、プロモータ
ー又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ開始部位）、リ
ボソーム結合性部位及び翻訳開始シグナルを含む発現ユ
ニットを作製する。この発現ユニットは適当な制限部
位、翻訳エンハンサー又は「活性化」配列、及び選んだ
配列の３′尾部も含むことがありうる。
【００１４】２．次にセミランダムＤＮＡ又はＲＮＡ
を、天然ＤＮＡ，ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ配列の機械
的、化学的又は酵素的断片化により、あるいはヌクレオ
チドの化学合成により作る。このセミランダムＤＮＡ又
はＲＮＡ配列を次に前記の発現ユニットに挿入せしめ
る。他方、このセミランダム配列を該発現ユニット上に
直接重合化せしめてもよい。これによって１０12種又は
それより多くの異なる配列のライブラリーが作られう
る。
を、天然ＤＮＡ，ＲＮＡもしくはｃＤＮＡ配列の機械
的、化学的又は酵素的断片化により、あるいはヌクレオ
チドの化学合成により作る。このセミランダムＤＮＡ又
はＲＮＡ配列を次に前記の発現ユニットに挿入せしめ
る。他方、このセミランダム配列を該発現ユニット上に
直接重合化せしめてもよい。これによって１０12種又は
それより多くの異なる配列のライブラリーが作られう
る。
【００１５】３．次にこの新規なる遺伝子をインビトロ
で転写せしめてオリジナルＤＮＡライブラリーのＲＮＡ
コピーのプールを作る。もしＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
ラーゼが含まれている場合、これらのレプリカーゼをＲ
ＮＡの増幅のために用いうる。 ４．このＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をインビトロで翻訳してポ
リソームを生産する。「ポリソーム」（ＲＮＡ−リボソ
ーム−形成期ポリペプチド複合体）を維持せしめる条件
を、所望のポリペプチドとｍＲＮＡを一緒に保つために
用いる。
で転写せしめてオリジナルＤＮＡライブラリーのＲＮＡ
コピーのプールを作る。もしＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメ
ラーゼが含まれている場合、これらのレプリカーゼをＲ
ＮＡの増幅のために用いうる。 ４．このＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をインビトロで翻訳してポ
リソームを生産する。「ポリソーム」（ＲＮＡ−リボソ
ーム−形成期ポリペプチド複合体）を維持せしめる条件
を、所望のポリペプチドとｍＲＮＡを一緒に保つために
用いる。
【００１６】５．次にこのポリソームを対象の物質、例
えば表層抗原、リセプタータンパク質、毒素、有機ポリ
マー、抗体、中間代謝物、ホルモン及びタンパク質分子
の活性部位と結合させるか、又は生物活性を表示させ
る。 ６．対象の物質と結合しているポリソームは、未結合ポ
リソームの除去により実質的に純化される。このポリソ
ーム複合体を維持する条件のもとでの系列的又はフロー
スルー洗浄は、このポリソームの構造を通じて対象の物
質に結合し続ける所望のｍＲＮＡの度数を実質的に高め
る。
えば表層抗原、リセプタータンパク質、毒素、有機ポリ
マー、抗体、中間代謝物、ホルモン及びタンパク質分子
の活性部位と結合させるか、又は生物活性を表示させ
る。 ６．対象の物質と結合しているポリソームは、未結合ポ
リソームの除去により実質的に純化される。このポリソ
ーム複合体を維持する条件のもとでの系列的又はフロー
スルー洗浄は、このポリソームの構造を通じて対象の物
質に結合し続ける所望のｍＲＮＡの度数を実質的に高め
る。
【００１７】７．次に、このポリソーム複合体からｍＲ
ＮＡを遊離するためにこの結合／活性ポリソームを解離
せしめる。 ８．次に微量ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡコピーを作ることに
より又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ
の直接的な増幅によって回収する。ＤＮＡポリメラーゼ
及び／又は逆転写酵素反応によるｃＤＮＡの増幅はこの
ような微量の豊富な情報（low abundance messages）を
回収することを大いに容易化せしめる。
ＮＡを遊離するためにこの結合／活性ポリソームを解離
せしめる。 ８．次に微量ｍＲＮＡを、ｃＤＮＡコピーを作ることに
より又はＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ
の直接的な増幅によって回収する。ＤＮＡポリメラーゼ
及び／又は逆転写酵素反応によるｃＤＮＡの増幅はこの
ような微量の豊富な情報（low abundance messages）を
回収することを大いに容易化せしめる。
【００１８】９．次に得られるｃＤＮＡをポリペプチド
を生産するために発現させる。ほとんどの場合におい
て、特異的な結合性タンパク質の度数をポリソームの非
特異的な結合性のバックグランドよりも更に高めるため
に段階３−８の反復が好適である。本明細書に詳細の方
法により生産した、（複数の）単離化精製新規遺伝子
は、標準的な発現技術を利用することにより種々の対象
の（複数の）ポリペプチドを作り上げることが可能であ
り、これに陽性であることは所望の生成物をコードする
遺伝子であることが証明される。更に、常用の方法によ
るＤＮＡ及び／又はポリペプチドのシーケンシングが、
新規なるポリペプチドの組成物の同定に利用されうる。
を生産するために発現させる。ほとんどの場合におい
て、特異的な結合性タンパク質の度数をポリソームの非
特異的な結合性のバックグランドよりも更に高めるため
に段階３−８の反復が好適である。本明細書に詳細の方
法により生産した、（複数の）単離化精製新規遺伝子
は、標準的な発現技術を利用することにより種々の対象
の（複数の）ポリペプチドを作り上げることが可能であ
り、これに陽性であることは所望の生成物をコードする
遺伝子であることが証明される。更に、常用の方法によ
るＤＮＡ及び／又はポリペプチドのシーケンシングが、
新規なるポリペプチドの組成物の同定に利用されうる。
【００１９】この新規なる遺伝子によりコード化される
ポリペプチドが単離且つ同定されたなら、この新規なる
（複数の）ポリペプチドの大量生産が、化学合成により
（もしそのアミノ酸配列が比較的短い場合）、又は遺伝
子操作微生物を利用する組換ＤＮＡ法を介して成し遂げ
られうる。他方、大量インビトロ転写及び／又は翻訳法
が商業的な量のポリペプチドの生産のために利用されう
る。
ポリペプチドが単離且つ同定されたなら、この新規なる
（複数の）ポリペプチドの大量生産が、化学合成により
（もしそのアミノ酸配列が比較的短い場合）、又は遺伝
子操作微生物を利用する組換ＤＮＡ法を介して成し遂げ
られうる。他方、大量インビトロ転写及び／又は翻訳法
が商業的な量のポリペプチドの生産のために利用されう
る。
【００２０】オリジナルの単離化新規ポリペプチドの特
異的結合性及び／又は生物学活性を、その他の結合及び
生物学活性に加えて有するハイブリドタンパク質を作る
ため、選ばれたポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列
をより大きい遺伝子（即ち、例えば抗体遺伝子の超可変
性領域の中）に組込むこともできうる。 Ｉ．発現ユニット 該発現ユニットは５′非翻訳領域を含んで成り、そして
更に３′領域を含んで成りうる。この発現ユニットの
５′非翻訳領域はプロモーター又はＲＮＡポリメラーゼ
結合性配列、リボソーム結合性配列及び翻訳開始シグナ
ルを含む。この５′非翻訳領域（頭部）は適当な制限部
位及び翻訳エンハンサー又は「活性化」配列も含みう
る。この３′領域は適当な制限部位及び選ばれた配列の
３′尾部を含みうる。この発現ユニットは当業者によく
知られた方法によって化学合成されうる。他方、これら
の構成要素をこの発現ユニットに集成化せしめる前に、
１又は複数のプラスミドに組み込み、微生物内で増幅せ
しめ、標準的な方法により精製し、そして制限酵素によ
り適当なフラグメントへと切断せしめることができう
る。
異的結合性及び／又は生物学活性を、その他の結合及び
生物学活性に加えて有するハイブリドタンパク質を作る
ため、選ばれたポリペプチドをコード化するＤＮＡ配列
をより大きい遺伝子（即ち、例えば抗体遺伝子の超可変
性領域の中）に組込むこともできうる。 Ｉ．発現ユニット 該発現ユニットは５′非翻訳領域を含んで成り、そして
更に３′領域を含んで成りうる。この発現ユニットの
５′非翻訳領域はプロモーター又はＲＮＡポリメラーゼ
結合性配列、リボソーム結合性配列及び翻訳開始シグナ
ルを含む。この５′非翻訳領域（頭部）は適当な制限部
位及び翻訳エンハンサー又は「活性化」配列も含みう
る。この３′領域は適当な制限部位及び選ばれた配列の
３′尾部を含みうる。この発現ユニットは当業者によく
知られた方法によって化学合成されうる。他方、これら
の構成要素をこの発現ユニットに集成化せしめる前に、
１又は複数のプラスミドに組み込み、微生物内で増幅せ
しめ、標準的な方法により精製し、そして制限酵素によ
り適当なフラグメントへと切断せしめることができう
る。
【００２１】この５′非翻訳領域はプロモーター又はＲ
ＮＡポリメラーゼ結合性配列を含む。効率性の高いプロ
モーター、例えばＴ７，Ｔ３又はＳＰ６ ＲＮＡポリメ
ラーゼに関するそれが以下の理由により本発明に好適で
ある。このようなプロモーターは既知の組成の短いＤＮ
Ａ配列であり、それらに対応するポリメラーゼに非常に
特異的であり、そして活性が高く、ＤＮＡ鋳型当り５０
回以上の転写を可能にするからである。更に、Ｔ７，Ｔ
３及びＳＰ６ポリメラーゼはあらゆるソースから市販さ
れ、そしてよく特徴付けられている転写キットの構成員
である。Ｔ７プロモーターのためのその共通配列はTAAT
ACGACTCACTATAGGGAGA （２３塩基対）である。この配列
が本発明の好適な態様との関連において説明されている
が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのために機能しうる関連す
るＤＮＡ配列及びその他のＲＮＡポリメラーゼのために
適するであろうその他の配列が利用されうることが明白
であろう。一定の態様において、２種のプロモーター、
例えばＴ７及びＳＰ６プロモーターの両方を利用するこ
とを所望することがある。
ＮＡポリメラーゼ結合性配列を含む。効率性の高いプロ
モーター、例えばＴ７，Ｔ３又はＳＰ６ ＲＮＡポリメ
ラーゼに関するそれが以下の理由により本発明に好適で
ある。このようなプロモーターは既知の組成の短いＤＮ
Ａ配列であり、それらに対応するポリメラーゼに非常に
特異的であり、そして活性が高く、ＤＮＡ鋳型当り５０
回以上の転写を可能にするからである。更に、Ｔ７，Ｔ
３及びＳＰ６ポリメラーゼはあらゆるソースから市販さ
れ、そしてよく特徴付けられている転写キットの構成員
である。Ｔ７プロモーターのためのその共通配列はTAAT
ACGACTCACTATAGGGAGA （２３塩基対）である。この配列
が本発明の好適な態様との関連において説明されている
が、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼのために機能しうる関連す
るＤＮＡ配列及びその他のＲＮＡポリメラーゼのために
適するであろうその他の配列が利用されうることが明白
であろう。一定の態様において、２種のプロモーター、
例えばＴ７及びＳＰ６プロモーターの両方を利用するこ
とを所望することがある。
【００２２】このプロモーター領域の下流もしくはその
中に位置するのはリボソーム結合性部位をコードするＤ
ＮＡ配列である。もし原核細胞翻訳方法を用いる場合、
このリボソーム結合性部位は原核細胞リボソーム複合体
（リボソームＲＮＡを含む）に特異的でありうる。しか
しながら、本発明の好適な態様は真核細胞配列及びイン
ビトロ真核細胞翻訳系、例えばウサギ網状赤血球系を利
用する（Krawetz ら、Can. J. Biochem. Cell. Biol. 6
1 : 274-286, 1983 ; Merrick, Meth. Enzymol. 101 :
38, 1983) 。共通翻訳開始配列GCCGCCACCATGG 及びその
他の機能的に関連する配列が脊椎動物のｍＲＮＡに関し
て確立されている（Kozak, Nucleic Acids Res. 15 : 8
125-8148, 1987) 。この配列又は関連する配列はインビ
トロタンパク質合成をもたらすために、新規なる遺伝子
の作製において利用されうる。この開始配列におけるＡ
ＴＧトリプレットはメチオニンに関する翻訳開始コドン
である；インビトロタンパク質合成はこの位置にて開始
するものと予測される。
中に位置するのはリボソーム結合性部位をコードするＤ
ＮＡ配列である。もし原核細胞翻訳方法を用いる場合、
このリボソーム結合性部位は原核細胞リボソーム複合体
（リボソームＲＮＡを含む）に特異的でありうる。しか
しながら、本発明の好適な態様は真核細胞配列及びイン
ビトロ真核細胞翻訳系、例えばウサギ網状赤血球系を利
用する（Krawetz ら、Can. J. Biochem. Cell. Biol. 6
1 : 274-286, 1983 ; Merrick, Meth. Enzymol. 101 :
38, 1983) 。共通翻訳開始配列GCCGCCACCATGG 及びその
他の機能的に関連する配列が脊椎動物のｍＲＮＡに関し
て確立されている（Kozak, Nucleic Acids Res. 15 : 8
125-8148, 1987) 。この配列又は関連する配列はインビ
トロタンパク質合成をもたらすために、新規なる遺伝子
の作製において利用されうる。この開始配列におけるＡ
ＴＧトリプレットはメチオニンに関する翻訳開始コドン
である；インビトロタンパク質合成はこの位置にて開始
するものと予測される。
【００２３】このプロモーターと翻訳開始部位との間
に、その他の既知配列、例えば翻訳エンハンサー又は
「活性化」配列を置くことを所望することがある。例え
ば、Jobling らは（Nucleic Acids Res. 16 : 4483-449
8, 1988)、タバコモザイクウィルス由来の翻訳されない
「リーダー配列」がＳＰ６−生成ｍＲＮＡにおいて「有
意に翻訳を活性化せしめた」ことを示した。彼らはムラ
サキウマゴヤシ（alfalfa）モザイクウィルスＲＮＡ４
の３６個のヌクレオチドの５′非翻訳領域がオオムギ
（barley）アミラーゼ及びヒトインターロイキンｍＲＮ
Ａの翻訳効率を高めることも報告している（Jobling an
d Gehrke, Nature 325 : 622-625, 1987) 。ゴキブリ
（black beetle）ウィルス（ノダウィルス；Nodovirus
）ＲＮＡ２（Friesen とRueckert, J. Virol. 37 : 87
6-886, 1981) 、カブラ（turnip）モザイクウィルス及
びスズメノチャヒキ属（brome ）モザイクウィルスコー
トタンパク質ｍＲＮＡ（Zagorskiら、Biochimie 65 : 1
27-133, 1983) も高い効率で翻訳される。対照的に、一
定の翻訳されないリーダーはＳＰ６ ＲＮＡの発現を強
く抑えた（Jobling ら、前記、1988）。
に、その他の既知配列、例えば翻訳エンハンサー又は
「活性化」配列を置くことを所望することがある。例え
ば、Jobling らは（Nucleic Acids Res. 16 : 4483-449
8, 1988)、タバコモザイクウィルス由来の翻訳されない
「リーダー配列」がＳＰ６−生成ｍＲＮＡにおいて「有
意に翻訳を活性化せしめた」ことを示した。彼らはムラ
サキウマゴヤシ（alfalfa）モザイクウィルスＲＮＡ４
の３６個のヌクレオチドの５′非翻訳領域がオオムギ
（barley）アミラーゼ及びヒトインターロイキンｍＲＮ
Ａの翻訳効率を高めることも報告している（Jobling an
d Gehrke, Nature 325 : 622-625, 1987) 。ゴキブリ
（black beetle）ウィルス（ノダウィルス；Nodovirus
）ＲＮＡ２（Friesen とRueckert, J. Virol. 37 : 87
6-886, 1981) 、カブラ（turnip）モザイクウィルス及
びスズメノチャヒキ属（brome ）モザイクウィルスコー
トタンパク質ｍＲＮＡ（Zagorskiら、Biochimie 65 : 1
27-133, 1983) も高い効率で翻訳される。対照的に、一
定の翻訳されないリーダーはＳＰ６ ＲＮＡの発現を強
く抑えた（Jobling ら、前記、1988）。
【００２４】適切な制限部位をその後の遺伝子操作に役
立てさせるためにこの発現ユニットに含ませることもで
きる。例えば、セクスチュプレットＣＣＡＴＧＧは制限
エンドヌクレアーゼＮｃｏＩのための認識配列である。
リボソーム結合部位の下流に位置するＮｃｏＩ「切断部
位」は逐次の遺伝子操作のための好適なスプライス部位
である。それ故、所望の新規遺伝子の精製後、この発現
ユニットをこの部位にて該新規遺伝子から切り離すこと
ができ、そして新規のポリペプチドのインビボ及び大量
生産発現のためにその他のプロモーターを連結させるこ
とができうる。ＮｃｏＩ部位は２種類のポリペプチドド
メインが一緒となり、そして単一タンパク質として発現
されるハイブリドタンパク質の作製のための好適なクロ
ーニング部位としても利用されうる。
立てさせるためにこの発現ユニットに含ませることもで
きる。例えば、セクスチュプレットＣＣＡＴＧＧは制限
エンドヌクレアーゼＮｃｏＩのための認識配列である。
リボソーム結合部位の下流に位置するＮｃｏＩ「切断部
位」は逐次の遺伝子操作のための好適なスプライス部位
である。それ故、所望の新規遺伝子の精製後、この発現
ユニットをこの部位にて該新規遺伝子から切り離すこと
ができ、そして新規のポリペプチドのインビボ及び大量
生産発現のためにその他のプロモーターを連結させるこ
とができうる。ＮｃｏＩ部位は２種類のポリペプチドド
メインが一緒となり、そして単一タンパク質として発現
されるハイブリドタンパク質の作製のための好適なクロ
ーニング部位としても利用されうる。
【００２５】更に、プラスミドへの新規遺伝子の逐次的
クローニングのために、この５′非翻訳領域に少なくと
も１つの制限エンドヌクレアーゼ部位を有すＤＮＡ配列
を含ませることが最も有利な傾向にある。オクタマー配
列GCGGCCGGC はＮｃｏＩヌクレアーゼにより認識され、
そしてそれらは新規なる遺伝子のコード領域にあること
は稀であるために特に有用である（ＮｃｏＩはランダム
ＤＮＡ全体を一度に６５，５３６塩基対毎に切断すると
予測される）。その他の制限部位も利用されうる；新規
遺伝子コード領域を切断する予測頻度はヌクレオチド組
成又はコード領域のＤＮＡ起源に依存する。一定のパリ
ンドローム配列が翻訳を妨害しうることが理解されるで
あろう；しかしながら、ある配列は翻訳の速度を高める
こともある。
クローニングのために、この５′非翻訳領域に少なくと
も１つの制限エンドヌクレアーゼ部位を有すＤＮＡ配列
を含ませることが最も有利な傾向にある。オクタマー配
列GCGGCCGGC はＮｃｏＩヌクレアーゼにより認識され、
そしてそれらは新規なる遺伝子のコード領域にあること
は稀であるために特に有用である（ＮｃｏＩはランダム
ＤＮＡ全体を一度に６５，５３６塩基対毎に切断すると
予測される）。その他の制限部位も利用されうる；新規
遺伝子コード領域を切断する予測頻度はヌクレオチド組
成又はコード領域のＤＮＡ起源に依存する。一定のパリ
ンドローム配列が翻訳を妨害しうることが理解されるで
あろう；しかしながら、ある配列は翻訳の速度を高める
こともある。
【００２６】この発現ユニットは３′領域も含みうる。
パリンドローム配列を有す既知の３′領域（尾部）を作
製することが少なくとも２つの理由のために所望され
る。第１に、３′制限部位はあらゆるその後のポリペプ
チドコード領域の遺伝子的操作のために好適であろう。
例えばもしＮｏｔＩ部位が５′及び３′領域の両方にお
いて位置する場合、所望のポリペプチドをコードする配
列は更なるクローニングのためのＮｏｔＩ「接着末端」
を伴って切り出されうる。第２、パリンドロームはトラ
ンスロケーション（転位）を妨げる二次構造をもたらす
ことがあり、従って、３′領域におけるパリンドローム
は翻訳の際のリボソームの移動を遅らせうる。この第２
の性質はリボソームがｍＲＮＡから脱離することを防止
するために所望され、そしてそれ故インビトロ翻訳段階
におけるリボソームの数を高める。この３′領域はポリ
−Ａ又はその他のポリヌクレオチド鎖であって、相補的
なホモポリマー配列とのハイブリダイゼーションによ
り、インビトロ翻訳反応におけるその他の成分から該ｍ
ＲＮＡを後に精製するためのものをも含みうる。
パリンドローム配列を有す既知の３′領域（尾部）を作
製することが少なくとも２つの理由のために所望され
る。第１に、３′制限部位はあらゆるその後のポリペプ
チドコード領域の遺伝子的操作のために好適であろう。
例えばもしＮｏｔＩ部位が５′及び３′領域の両方にお
いて位置する場合、所望のポリペプチドをコードする配
列は更なるクローニングのためのＮｏｔＩ「接着末端」
を伴って切り出されうる。第２、パリンドロームはトラ
ンスロケーション（転位）を妨げる二次構造をもたらす
ことがあり、従って、３′領域におけるパリンドローム
は翻訳の際のリボソームの移動を遅らせうる。この第２
の性質はリボソームがｍＲＮＡから脱離することを防止
するために所望され、そしてそれ故インビトロ翻訳段階
におけるリボソームの数を高める。この３′領域はポリ
−Ａ又はその他のポリヌクレオチド鎖であって、相補的
なホモポリマー配列とのハイブリダイゼーションによ
り、インビトロ翻訳反応におけるその他の成分から該ｍ
ＲＮＡを後に精製するためのものをも含みうる。
【００２７】更に、その他のランダムでない配列をこの
発現ユニットに組み込むことがありうる。１つの態様に
おいて、発現されたポリペプチドは非ランダム及びセミ
ランダムアミノ酸配列の両方を含む。コード領域の非ラ
ンダム成分は非ランダム５′非翻訳化領域及び／又は
３′領域を伴って合成且つ製造される。この非ランダム
コード配列は何十億の新規ポリペプチドの中に保存され
ているアミノ酸の鎖（同定又は「ＩＤ」ペプチド）を特
定する。このＩＤペプチドは新規ポリペプチドの定量の
ため、及び新規ポリペプチドの精製のために有用である
（このＩＤペプチドに対する抗体が入手又は生産された
場合）。１つの例は１１個のアミノ酸物質Ｐであって他
のポリペプチドの融合ペプチドとして結合できるもので
ある。抗−物質Ｐ抗体は、物質Ｐを含む融合タンパク質
を検出及び定量するために市販されている。その他の例
は８個のアミノ酸マーカーペプチド「フラグ」（“Ｆｌ
ａｇ”）である（Hoppら、Bio ／Technology 6 : 1204-
1210, 1988) 。
発現ユニットに組み込むことがありうる。１つの態様に
おいて、発現されたポリペプチドは非ランダム及びセミ
ランダムアミノ酸配列の両方を含む。コード領域の非ラ
ンダム成分は非ランダム５′非翻訳化領域及び／又は
３′領域を伴って合成且つ製造される。この非ランダム
コード配列は何十億の新規ポリペプチドの中に保存され
ているアミノ酸の鎖（同定又は「ＩＤ」ペプチド）を特
定する。このＩＤペプチドは新規ポリペプチドの定量の
ため、及び新規ポリペプチドの精製のために有用である
（このＩＤペプチドに対する抗体が入手又は生産された
場合）。１つの例は１１個のアミノ酸物質Ｐであって他
のポリペプチドの融合ペプチドとして結合できるもので
ある。抗−物質Ｐ抗体は、物質Ｐを含む融合タンパク質
を検出及び定量するために市販されている。その他の例
は８個のアミノ酸マーカーペプチド「フラグ」（“Ｆｌ
ａｇ”）である（Hoppら、Bio ／Technology 6 : 1204-
1210, 1988) 。
【００２８】アミノ末端ＩＤペプチドはカルボキシル末
端ＩＤペプチドよりも少なくとも２つの利点を有す。第
１に、Ｎ−末端ＩＤの適当な解読枠を保持する遺伝子構
造体を作製することは容易であり、その理由はセミラン
ダムＤＮＡ又はＲＮＡの長い鎖はＣ末端ＩＤに関する３
つの全ての解読枠において終結する傾向にあるからであ
る。第２に、このＮ−末端ＩＤは形質転換生物において
シグナルペプチドとして働くようにデザインされてお
り、大量生産の際に新規のポリペプチドの分泌を可能に
する。
端ＩＤペプチドよりも少なくとも２つの利点を有す。第
１に、Ｎ−末端ＩＤの適当な解読枠を保持する遺伝子構
造体を作製することは容易であり、その理由はセミラン
ダムＤＮＡ又はＲＮＡの長い鎖はＣ末端ＩＤに関する３
つの全ての解読枠において終結する傾向にあるからであ
る。第２に、このＮ−末端ＩＤは形質転換生物において
シグナルペプチドとして働くようにデザインされてお
り、大量生産の際に新規のポリペプチドの分泌を可能に
する。
【００２９】にもかかわらず、Ｃ−末端ＩＤポリペプチ
ドも利用されうる。１つの好適なＣ−末端ポリペプチド
はポリグリシンであり、これはポリｄＧによりコード化
され、セミランダム配列の解読枠に関係なくＧｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ…を読ませる。このポリペプチドのポリグ
リシン３′末端は形成期ペプチドの不干渉性つなぎ鎖
（noninterfering tether ）として働き、そしてこのセ
ミランダム配列が対象の分子に結合することを大いに高
める。更にこのポリ−ｄＧ配列はｃＤＮＡの第２の鎖を
合成せしめるために利用され、そしてポリＣもしくはポ
リ−ｄＣを有すＲＮＡ又はＤＮＡの精製のために有用で
ありうる。その他の繰り返し配列、例えばGGGCGGGC…
が、全ての解読枠において発現される認識されるペプチ
ド配列をコードするために利用されうる。このＩＤペプ
チドの好ましい型は簡単な化学又は酵素手段によって新
規ポリペプチドから切断されうるものである。
ドも利用されうる。１つの好適なＣ−末端ポリペプチド
はポリグリシンであり、これはポリｄＧによりコード化
され、セミランダム配列の解読枠に関係なくＧｌｙ−Ｇ
ｌｙ−Ｇｌｙ…を読ませる。このポリペプチドのポリグ
リシン３′末端は形成期ペプチドの不干渉性つなぎ鎖
（noninterfering tether ）として働き、そしてこのセ
ミランダム配列が対象の分子に結合することを大いに高
める。更にこのポリ−ｄＧ配列はｃＤＮＡの第２の鎖を
合成せしめるために利用され、そしてポリＣもしくはポ
リ−ｄＣを有すＲＮＡ又はＤＮＡの精製のために有用で
ありうる。その他の繰り返し配列、例えばGGGCGGGC…
が、全ての解読枠において発現される認識されるペプチ
ド配列をコードするために利用されうる。このＩＤペプ
チドの好ましい型は簡単な化学又は酵素手段によって新
規ポリペプチドから切断されうるものである。
【００３０】このＤＮＡ発現ユニットの他に、セミラン
ダムポリペプチド合成のためのＲＮＡ発現ユニットを作
製することがある。このＲＮＡ発現ユニットの１つの考
えられる利点は、このポリソームｍＲＮＡの回収が初期
のｃＤＮＡ段階を行なう必要がないことにある。その代
り、所望の配列を有するｍＲＮＡはＲＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメラーゼ、例えばＱＢ（Ｑベーター）レプリカーゼ
のそれにより増幅されうる（HarunaとSpiegelman, Pro
c. Nat. Acad. Sci. 54 : 579-587, 1965）。この酵素
は３０分において１０億の組換ＲＮＡコピーを作製でき
る（Lizardi ら、Bio ／Technology 6 : 1197-1202, 19
88) 。組換ＲＮＡの増幅のための１つの適当なクローニ
ング法はLizardi らにより詳細されている（前記、198
8）。本発明の目的のため、その他の構成要素、例えば
制限部位、エンハンサー及びＩＤ配列を、このＱＢ Ｒ
ＮＡ鋳型を引き起こすＤＮＡプラスミドに加えることが
できうる。セミランダムコード化配列を標準のＤＮＡ方
法論によってこれらのプラスミド上に挿入せしめること
ができうる。このＱＢレプリカーゼ鋳型が転写される場
合（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより）、セミラ
ンダム遺伝子配列を含むインビトロ複製の可能なＲＮＡ
ライブラリーを作り上げることができうる。他方、類似
のＲＮＡ発現ユニットは、適切なＲＮＡ分子を化学合成
し、それらをＲＮＡリガーゼ例えばＴ４ ＲＮＡリガー
ゼ（市販）であって一本鎖ＲＮＡ及び／又は一本鎖ＤＮ
Ａを結合させるものを介して集成せしめることによって
作製されうる。 II．セミランダムヌクレオチド配列 ＤＮＡ又はＲＮＡのセミランダム配列を該発現ユニット
に連結させる。ＲＮＡ発現ユニット及びセミランダム配
列はＤＮＡ鋳型から作るか又はＤＮＡ発現ユニットと同
様の方法において化学的に合成したＲＮＡもしくはｍＲ
ＮＡのフラグメントから作製されうるため、以下の詳細
はセミランダムＤＮＡの発現ユニットへの連結について
の方法のみを説明する。当業者は容易に、セミランダム
ポリヌクレオチドに連結する発現ユニットのＲＮＡ相当
品を作製することができるであろう。
ダムポリペプチド合成のためのＲＮＡ発現ユニットを作
製することがある。このＲＮＡ発現ユニットの１つの考
えられる利点は、このポリソームｍＲＮＡの回収が初期
のｃＤＮＡ段階を行なう必要がないことにある。その代
り、所望の配列を有するｍＲＮＡはＲＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメラーゼ、例えばＱＢ（Ｑベーター）レプリカーゼ
のそれにより増幅されうる（HarunaとSpiegelman, Pro
c. Nat. Acad. Sci. 54 : 579-587, 1965）。この酵素
は３０分において１０億の組換ＲＮＡコピーを作製でき
る（Lizardi ら、Bio ／Technology 6 : 1197-1202, 19
88) 。組換ＲＮＡの増幅のための１つの適当なクローニ
ング法はLizardi らにより詳細されている（前記、198
8）。本発明の目的のため、その他の構成要素、例えば
制限部位、エンハンサー及びＩＤ配列を、このＱＢ Ｒ
ＮＡ鋳型を引き起こすＤＮＡプラスミドに加えることが
できうる。セミランダムコード化配列を標準のＤＮＡ方
法論によってこれらのプラスミド上に挿入せしめること
ができうる。このＱＢレプリカーゼ鋳型が転写される場
合（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより）、セミラ
ンダム遺伝子配列を含むインビトロ複製の可能なＲＮＡ
ライブラリーを作り上げることができうる。他方、類似
のＲＮＡ発現ユニットは、適切なＲＮＡ分子を化学合成
し、それらをＲＮＡリガーゼ例えばＴ４ ＲＮＡリガー
ゼ（市販）であって一本鎖ＲＮＡ及び／又は一本鎖ＤＮ
Ａを結合させるものを介して集成せしめることによって
作製されうる。 II．セミランダムヌクレオチド配列 ＤＮＡ又はＲＮＡのセミランダム配列を該発現ユニット
に連結させる。ＲＮＡ発現ユニット及びセミランダム配
列はＤＮＡ鋳型から作るか又はＤＮＡ発現ユニットと同
様の方法において化学的に合成したＲＮＡもしくはｍＲ
ＮＡのフラグメントから作製されうるため、以下の詳細
はセミランダムＤＮＡの発現ユニットへの連結について
の方法のみを説明する。当業者は容易に、セミランダム
ポリヌクレオチドに連結する発現ユニットのＲＮＡ相当
品を作製することができるであろう。
【００３１】セミランダムＤＮＡは少なくとも３種の方
法により作られうる。第１は、事実上あらゆる生存起源
由来の天然ＤＮＡを機械的、化学的又は酵素的に断片化
せしめ、そしてＤＮＡリガーゼによって５′非翻訳領域
に連結せしめる。異なったＤＮＡ起源由来のフラグメン
トの混合物を利用できうる。これにより、活性な「読み
取り枠」〔活性がこの分子の最Ｃ末端にない限り、「ナ
ンセンス」（又は「終止」）コドンを有さないタンパク
質の領域（フラグメント）〕の選択的な発現が得られう
る。本発明の１つの態様において、既知の機能をコード
する遺伝子を断片化せしめることがある；得られる断片
を５′非翻訳領域にリゲートせしめ、そしてその後ポリ
ソームアッセイにおいて、活性の発現についてスクリー
ンする。生物学的活性を示す最も小さい遺伝子フラグメ
ントを調べることにより、タンパク質ドメインの分析が
行なわれる。遺伝子フラグメント分析は小さな生物学的
活性ペプチド及びハイブリド治療的タンパク質を作り上
げるために有用であり、そしてもしより小さいサイズが
ペプチドの標的部位への到達に役立つならば、薬剤輸送
のために有利でありうる。
法により作られうる。第１は、事実上あらゆる生存起源
由来の天然ＤＮＡを機械的、化学的又は酵素的に断片化
せしめ、そしてＤＮＡリガーゼによって５′非翻訳領域
に連結せしめる。異なったＤＮＡ起源由来のフラグメン
トの混合物を利用できうる。これにより、活性な「読み
取り枠」〔活性がこの分子の最Ｃ末端にない限り、「ナ
ンセンス」（又は「終止」）コドンを有さないタンパク
質の領域（フラグメント）〕の選択的な発現が得られう
る。本発明の１つの態様において、既知の機能をコード
する遺伝子を断片化せしめることがある；得られる断片
を５′非翻訳領域にリゲートせしめ、そしてその後ポリ
ソームアッセイにおいて、活性の発現についてスクリー
ンする。生物学的活性を示す最も小さい遺伝子フラグメ
ントを調べることにより、タンパク質ドメインの分析が
行なわれる。遺伝子フラグメント分析は小さな生物学的
活性ペプチド及びハイブリド治療的タンパク質を作り上
げるために有用であり、そしてもしより小さいサイズが
ペプチドの標的部位への到達に役立つならば、薬剤輸送
のために有利でありうる。
【００３２】本発明の他の態様において、この「フラグ
メント化」ＤＮＡはｃＤＮＡライブラリー由来のセミラ
ンダムにサイズ化したｃＤＮＡ分子でありうる。インビ
トロでｃＤＮＡを発現させ且つポリソーム選別を用いる
ことにより、抗体、リセプタータンパク質又はその他の
検査用分子との該ポリソームの結合を介して非常に微量
の、部分的もしくはおそらく全長遺伝子さえも単離され
うる。本明細書記載のｃＤＮＡ「フラグメント」の無細
胞発現は、所望のｃＤＮＡクローンを見つける従来の方
法よりも高感度であった。
メント化」ＤＮＡはｃＤＮＡライブラリー由来のセミラ
ンダムにサイズ化したｃＤＮＡ分子でありうる。インビ
トロでｃＤＮＡを発現させ且つポリソーム選別を用いる
ことにより、抗体、リセプタータンパク質又はその他の
検査用分子との該ポリソームの結合を介して非常に微量
の、部分的もしくはおそらく全長遺伝子さえも単離され
うる。本明細書記載のｃＤＮＡ「フラグメント」の無細
胞発現は、所望のｃＤＮＡクローンを見つける従来の方
法よりも高感度であった。
【００３３】セミランダムＤＮＡを作り上げる第２の方
法はＤＮＡを化学合成することである。例えば、約１０
０ヌクレオチドの比較的長いＤＮＡ分子を、それぞれの
位置にてヌクレオチドの混合物により合成することがで
きうる。しかしながら化学合成したＤＮＡからナンセン
スコドンの統計学的問題が明らかとなる。前記の遺伝子
フラグメント及びｃＤＮＡの手法に関しては、活性なる
読み取り枠は現存のタンパク質配列内から見い出せる。
「読み取り枠」は、終止コドンが存在しないことを意味
し、そしてしばしばタンパク質コード領域内由来の配列
を意味する。
法はＤＮＡを化学合成することである。例えば、約１０
０ヌクレオチドの比較的長いＤＮＡ分子を、それぞれの
位置にてヌクレオチドの混合物により合成することがで
きうる。しかしながら化学合成したＤＮＡからナンセン
スコドンの統計学的問題が明らかとなる。前記の遺伝子
フラグメント及びｃＤＮＡの手法に関しては、活性なる
読み取り枠は現存のタンパク質配列内から見い出せる。
「読み取り枠」は、終止コドンが存在しないことを意味
し、そしてしばしばタンパク質コード領域内由来の配列
を意味する。
【００３４】しかしながら、全ての位置にて２０種の共
通アミノ酸全てをコードする十分な多様性を有す化学合
成ＤＮＡは読み取り枠を有す必要がないことが明らかで
あろう。終止コドンは６４種の考えられるＤＮＡトリプ
レットのうちの３種（ＴＡＡ，ＴＡＧ及びＴＧＡ）で表
わされる。完全にランダムなＤＮＡに関して、各位置に
おける４種のヌクレオチド全ての等しい確率により、ナ
ンセンスコドンの確率は３／６４＝４．６８７５％であ
る。３０個のアミノ酸の鎖をコードするランダムＤＮＡ
鎖に関して、その鎖内における少なくとも１個の終止コ
ドンを有す確率は約７６％である。終止コドンは翻訳の
終結及びリボソーム複合体からの形成期ポリペプチドの
遊離をもたらす。従って、ナンセンスコドンの頻度を引
き上げ、且つタンパク質翻訳の際のナンセンスコドンの
通常の効果を回避する手法は好ましく、そして以下に詳
細する。
通アミノ酸全てをコードする十分な多様性を有す化学合
成ＤＮＡは読み取り枠を有す必要がないことが明らかで
あろう。終止コドンは６４種の考えられるＤＮＡトリプ
レットのうちの３種（ＴＡＡ，ＴＡＧ及びＴＧＡ）で表
わされる。完全にランダムなＤＮＡに関して、各位置に
おける４種のヌクレオチド全ての等しい確率により、ナ
ンセンスコドンの確率は３／６４＝４．６８７５％であ
る。３０個のアミノ酸の鎖をコードするランダムＤＮＡ
鎖に関して、その鎖内における少なくとも１個の終止コ
ドンを有す確率は約７６％である。終止コドンは翻訳の
終結及びリボソーム複合体からの形成期ポリペプチドの
遊離をもたらす。従って、ナンセンスコドンの頻度を引
き上げ、且つタンパク質翻訳の際のナンセンスコドンの
通常の効果を回避する手法は好ましく、そして以下に詳
細する。
【００３５】より詳しくは、Ａ，Ｔ，Ｃ及びＧ塩基組成
を好ましい一定のコドンへと操作し、そして特にナンセ
ンスコドンの可能性を引き下げるよう操作する。極端な
場合において、各トリプレットコドンの第３の位置をＣ
及びＴのみによって合成してナンセンスコドンを理論的
に回避する。しかしながら、この場合において２０種の
アミノ酸全てがコードされない。Lim とSauer （Nature
339 : 31-36, 1989)はラムダリプレッサーの新しい領
域の合成において、最初の２つのコドン位置において４
種の塩基全ての等量混合物を、そして第３のコドン位置
にてＣ及びＧの等量混合物を用いた。この組合せは各コ
ドンにて２０種のアミノ酸全てを可能とし、そしてナン
センストリプレットの頻度を１／３２＝３．１２５％に
引き下げた。しかしながら、３０個のアミノ酸における
少なくとも１個のＴＡＧ終止コドンを有す確率は約６１
％である。
を好ましい一定のコドンへと操作し、そして特にナンセ
ンスコドンの可能性を引き下げるよう操作する。極端な
場合において、各トリプレットコドンの第３の位置をＣ
及びＴのみによって合成してナンセンスコドンを理論的
に回避する。しかしながら、この場合において２０種の
アミノ酸全てがコードされない。Lim とSauer （Nature
339 : 31-36, 1989)はラムダリプレッサーの新しい領
域の合成において、最初の２つのコドン位置において４
種の塩基全ての等量混合物を、そして第３のコドン位置
にてＣ及びＧの等量混合物を用いた。この組合せは各コ
ドンにて２０種のアミノ酸全てを可能とし、そしてナン
センストリプレットの頻度を１／３２＝３．１２５％に
引き下げた。しかしながら、３０個のアミノ酸における
少なくとも１個のＴＡＧ終止コドンを有す確率は約６１
％である。
【００３６】本発明の好ましい態様において、全てのコ
ドンにて２０種のアミノ酸全ての高い頻度を可能にしな
がら終止コドンの頻度を引き下げるために、全ての３つ
のコドン位置において等量でない塩基の混合物を用い
た。第１のコドン位置においては等モル量のＣ，Ａ及び
Ｇを用いたが、Ｔはそれらの半分量で用いた。第２のコ
ドン位置にてはＡの量をその他の３種塩基のレベルの半
分に下げた。第３のコドン位置においては、Ｇ及びＣ又
はＧ及びＴのみを等モル量において用いた。この手法の
結果、終止コドンが３０個のアミノ酸の鎖中に存在しな
い可能性が７９％以上となった。この場合において個々
のアミノ酸の比率は全ランダムＤＮＡ手法に比べてわず
かに変化した。しかしながら、ランダム状態と比べてチ
ロシンのみが半分以下の予測頻度で示されるであろう。
ドンにて２０種のアミノ酸全ての高い頻度を可能にしな
がら終止コドンの頻度を引き下げるために、全ての３つ
のコドン位置において等量でない塩基の混合物を用い
た。第１のコドン位置においては等モル量のＣ，Ａ及び
Ｇを用いたが、Ｔはそれらの半分量で用いた。第２のコ
ドン位置にてはＡの量をその他の３種塩基のレベルの半
分に下げた。第３のコドン位置においては、Ｇ及びＣ又
はＧ及びＴのみを等モル量において用いた。この手法の
結果、終止コドンが３０個のアミノ酸の鎖中に存在しな
い可能性が７９％以上となった。この場合において個々
のアミノ酸の比率は全ランダムＤＮＡ手法に比べてわず
かに変化した。しかしながら、ランダム状態と比べてチ
ロシンのみが半分以下の予測頻度で示されるであろう。
【００３７】化学合成ＤＮＡを用いる場合のナンセンス
コドンの存在を更に解決するためには、インビトロ翻訳
段階においてナンセンス抑制ｔＲＮＡを用いることが好
適である。特に、前記の手法はＴＡＧ終止コドン以外の
全てを削除するため、且つ各コドン位置での等量でない
塩基の混合物の結果としてチロシンコドンが過少表現さ
れるため、ＴＡＧ（ｍＲＮＡにおいては事実上ＵＡＧ）
を認識し且つ成長しているポリペプチドの中にチロシン
を挿入せしめるナンセンスサプレッサーが最も所望され
る。このようなチロシン−挿入ナンセンスサプレッサー
は、チロシル−ｔＲＮＡのアンチコドン領域を変えてチ
ロシル−ｔＲＮＡがｍＲＮＡにおける正常のＵＡＵ及び
ＵＡＣチロシンコドンの代りにＵＡＧを読むような状態
にすることによって作られうる。正常チロシル−ｔＲＮ
Ａはチロシンコドンを読むために翻訳段階に含ませるこ
ともできるであろう。その他の２種類のナンセンスコド
ンのためのナンセンスサプレッサーを作ることもでき
る。例えば、ＵＧＡ終止コドンのトリプトファン−又は
ロイシン−挿入サプレッサーが、その他の多数のナンセ
ンスサプレッサーと同様によく特徴付けられている。多
数のナンセンスサプレッサーのヌクレオチド配列が知ら
れている；そしてそれ故、このような分子の作製は当業
者に明らかであろう。
コドンの存在を更に解決するためには、インビトロ翻訳
段階においてナンセンス抑制ｔＲＮＡを用いることが好
適である。特に、前記の手法はＴＡＧ終止コドン以外の
全てを削除するため、且つ各コドン位置での等量でない
塩基の混合物の結果としてチロシンコドンが過少表現さ
れるため、ＴＡＧ（ｍＲＮＡにおいては事実上ＵＡＧ）
を認識し且つ成長しているポリペプチドの中にチロシン
を挿入せしめるナンセンスサプレッサーが最も所望され
る。このようなチロシン−挿入ナンセンスサプレッサー
は、チロシル−ｔＲＮＡのアンチコドン領域を変えてチ
ロシル−ｔＲＮＡがｍＲＮＡにおける正常のＵＡＵ及び
ＵＡＣチロシンコドンの代りにＵＡＧを読むような状態
にすることによって作られうる。正常チロシル−ｔＲＮ
Ａはチロシンコドンを読むために翻訳段階に含ませるこ
ともできるであろう。その他の２種類のナンセンスコド
ンのためのナンセンスサプレッサーを作ることもでき
る。例えば、ＵＧＡ終止コドンのトリプトファン−又は
ロイシン−挿入サプレッサーが、その他の多数のナンセ
ンスサプレッサーと同様によく特徴付けられている。多
数のナンセンスサプレッサーのヌクレオチド配列が知ら
れている；そしてそれ故、このような分子の作製は当業
者に明らかであろう。
【００３８】哺乳類翻訳系のナンセンスサプレッサーは
よく知られている（Burke とMogg，Nucleic Acids Res.
13 : 1317-1326, 1985 ; Caponeら、EMBO J. 4 : 213-
221,1985 ; Diamond ら、Cell 25 : 497-506, 1981 ; H
udziak ら、Cell 31 : 137-146, 1982 ; Laski ら、EMB
O J. 3 : 2445-2452, 1984)。更に、別の研究者は、真
核細胞インビトロ翻訳系におけるナンセンスコドンの
「解読」は、酵母由来のチロシン−挿入ＵＡＧサプレッ
サーｔＲＮＡを含むサプレッサーｔＲＮＡの利用により
可能であることを示した（Capecchiら、Cell 6 : 269-2
77, 1975 ; Gestelandら、Cell 7 : 381-390, 1976) 。
このような酵母サプレッサーによるＵＡＧ終止コドンの
読み過し（readthrough ）はインビトロで７０％ほどの
高さであることが報告されている（Pelham, Nature 272
: 469-471, 1978) 。GellerとRich（Nature 283 : 41-
46, 1980) は、酵母サプレッサーｔＲＮＡより、並びに
細菌性サプレッサーｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼ
より、網状赤血球系におけるナンセンスコドンの抑制に
成功した。従って、翻訳段階の際にリボソームからのポ
リペプチドの早期遊離を引き下げるための本発明におけ
るｔＲＮＡサプレッサーの利用は、当技術的水準の範囲
に属する。更に、Pelham（前記、1978）及びGellerとRi
ch（前記、1980）の両者は真核翻訳系における高レベル
の天然ナンセンスの抑制を詳細している。特にPelham
は、モザイクウィルスにおいて特にＵＡＧコドンが「Ｍ
ｇ2+の超最適濃度」又は報告されている２．１mMのＭｇ
Ｃｌ2 により、現状の４０％近く「解読」（抑制）され
うることを示している。従って、このレベルのマグネシ
ウムイオン（又はそれ以上）はナンセンスコドンの読み
過しを高めるため、そしてそれ故長いセミランダムヌク
レオチド配列の翻訳終結の問題を引き下げるために本発
明において好適に利用される。
よく知られている（Burke とMogg，Nucleic Acids Res.
13 : 1317-1326, 1985 ; Caponeら、EMBO J. 4 : 213-
221,1985 ; Diamond ら、Cell 25 : 497-506, 1981 ; H
udziak ら、Cell 31 : 137-146, 1982 ; Laski ら、EMB
O J. 3 : 2445-2452, 1984)。更に、別の研究者は、真
核細胞インビトロ翻訳系におけるナンセンスコドンの
「解読」は、酵母由来のチロシン−挿入ＵＡＧサプレッ
サーｔＲＮＡを含むサプレッサーｔＲＮＡの利用により
可能であることを示した（Capecchiら、Cell 6 : 269-2
77, 1975 ; Gestelandら、Cell 7 : 381-390, 1976) 。
このような酵母サプレッサーによるＵＡＧ終止コドンの
読み過し（readthrough ）はインビトロで７０％ほどの
高さであることが報告されている（Pelham, Nature 272
: 469-471, 1978) 。GellerとRich（Nature 283 : 41-
46, 1980) は、酵母サプレッサーｔＲＮＡより、並びに
細菌性サプレッサーｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼ
より、網状赤血球系におけるナンセンスコドンの抑制に
成功した。従って、翻訳段階の際にリボソームからのポ
リペプチドの早期遊離を引き下げるための本発明におけ
るｔＲＮＡサプレッサーの利用は、当技術的水準の範囲
に属する。更に、Pelham（前記、1978）及びGellerとRi
ch（前記、1980）の両者は真核翻訳系における高レベル
の天然ナンセンスの抑制を詳細している。特にPelham
は、モザイクウィルスにおいて特にＵＡＧコドンが「Ｍ
ｇ2+の超最適濃度」又は報告されている２．１mMのＭｇ
Ｃｌ2 により、現状の４０％近く「解読」（抑制）され
うることを示している。従って、このレベルのマグネシ
ウムイオン（又はそれ以上）はナンセンスコドンの読み
過しを高めるため、そしてそれ故長いセミランダムヌク
レオチド配列の翻訳終結の問題を引き下げるために本発
明において好適に利用される。
【００３９】化学的手段によってセミランダムＤＮＡを
作り上げることにおいて、選んだコドン位置での異なる
塩基の混合が特定のアミノ酸の偏りのために利用されう
る。例えば、コドンにおける第３の位置でのＧの削減
は、ペプチド中にメチオニン及びトリプトファンが含ま
れる妨げとなる。他の例として、高システイン含有に向
けて偏らせたヌクレオチド混合物は、構造の強化のため
に内在ジスルフィド結合を有す短いペプチドを製造する
ために所望されている。このような頑強ペプチドはその
他の分子とより強く結合しうる。
作り上げることにおいて、選んだコドン位置での異なる
塩基の混合が特定のアミノ酸の偏りのために利用されう
る。例えば、コドンにおける第３の位置でのＧの削減
は、ペプチド中にメチオニン及びトリプトファンが含ま
れる妨げとなる。他の例として、高システイン含有に向
けて偏らせたヌクレオチド混合物は、構造の強化のため
に内在ジスルフィド結合を有す短いペプチドを製造する
ために所望されている。このような頑強ペプチドはその
他の分子とより強く結合しうる。
【００４０】このような人工ヌクレオチドの第２鎖合成
は「ランダムプライミング」及びＤＮＡポリメラーゼに
よる伸長により、並びに／又はポリ−ｄＸ尾部であって
ポリ−ｄＸとプライムするものを含ませることにより、
成し遂げられうる。その他の方法、例えば自己プライミ
ングのための「ヘアーピンループ」を作り上げる末端パ
リンドロームの利用を第２鎖合成のために利用しうる。
１００個のヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ １００μｇは
約１０15個の分子を含む。もしセミランダム合成手法を
利用した場合、このような分子それぞれが異なるポリペ
プチドをコードすることが予測される。従って、非常に
大いなる多様性が実験室レベル量のＤＮＡにおけるコー
ド化潜在能力に存在する。このような１００個のヌクレ
オチドの合成ＤＮＡ分子は例示の目的のためにのみ提供
した；より長い配列も合成されうる。更に、より短い合
成分子を作り上げ、そしてあらゆる長さのセミランダム
配列を作るために互いにリゲートせしめることができう
る。より短い分子はより長い分子よりも合成ＤＮＡの読
み取り枠をよく保存するものと予測され、その理由は化
学合成塩基のそれぞれの付加は１００％でないためであ
る。従って、より短い人工ＤＮＡ分子の利用によってナ
ンセンスコドンがより回避されうる。Ｔ４ＲＮＡリガー
ゼ又はその他の手段が短い一本鎖ＤＮＡを互いに連結せ
しめるために用いられうる。
は「ランダムプライミング」及びＤＮＡポリメラーゼに
よる伸長により、並びに／又はポリ−ｄＸ尾部であって
ポリ−ｄＸとプライムするものを含ませることにより、
成し遂げられうる。その他の方法、例えば自己プライミ
ングのための「ヘアーピンループ」を作り上げる末端パ
リンドロームの利用を第２鎖合成のために利用しうる。
１００個のヌクレオチドの二本鎖ＤＮＡ １００μｇは
約１０15個の分子を含む。もしセミランダム合成手法を
利用した場合、このような分子それぞれが異なるポリペ
プチドをコードすることが予測される。従って、非常に
大いなる多様性が実験室レベル量のＤＮＡにおけるコー
ド化潜在能力に存在する。このような１００個のヌクレ
オチドの合成ＤＮＡ分子は例示の目的のためにのみ提供
した；より長い配列も合成されうる。更に、より短い合
成分子を作り上げ、そしてあらゆる長さのセミランダム
配列を作るために互いにリゲートせしめることができう
る。より短い分子はより長い分子よりも合成ＤＮＡの読
み取り枠をよく保存するものと予測され、その理由は化
学合成塩基のそれぞれの付加は１００％でないためであ
る。従って、より短い人工ＤＮＡ分子の利用によってナ
ンセンスコドンがより回避されうる。Ｔ４ＲＮＡリガー
ゼ又はその他の手段が短い一本鎖ＤＮＡを互いに連結せ
しめるために用いられうる。
【００４１】セミランダムＤＮＡを作るための第３の方
法は、この分子を５′非翻訳領域の３′末端上に直接的
に重合せしめることである。Ｎ−末端ＩＤ配列を用いな
い場合、この重合はＡＴＧ開始配列のすぐ後に、又は好
ましくはＡＴＧＧ配列のすぐ後（共通脊椎動物開始部位
及びＮｃｏＩ部位を共に保有するヶ所）にて起こりう
る。この重合のために最も一般的に利用される酵素は末
端基転移酵素（通常牛甲状腺に由来）であり、これはＤ
ＮＡクローニングのためのホモポリマー領域を作るため
によく利用される。しかしながら、異なるデオキシヌク
レオチド三リン酸を混ぜ合わせることにより、ＤＮＡの
セミランダムヘテロポリマーが遊離３′−ＯＨを有すＤ
ＮＡプライマー上において合成されうる。ここでも、一
定のコドンに偏らせるため及びナンセンスコドンの頻度
を引き下げるため、４種のデオキシヌクレオチド三リン
酸の相対濃度を調節することによって、Ａ，Ｔ，Ｃ及び
Ｇ塩基組成を操作する。特により少量のｄＡＴＰがナン
センスコドン（ＴＡＡ，ＴＡＧ及びＴＧＡ）の頻度を引
き下げうる。Ｅ．コリ（E.coli) ＤＮＡポリメラーゼＩ
がＤＮＡの非鋳型（新規：de novo ）合成の実施におい
て報告され、そして末端基転移酵素の代りに利用されう
る（A. Kornberg, DNA Replication, W.H. Freeman & C
o., San Francisco, Calif., 1980)。その他の酵素又は
化学方法も該発現ユニット上にＤＮＡを直接重合せしめ
うる。第２鎖の合成はランダムプライマー伸長により最
も容易に成し遂げられうるが、しかしその他の方法も同
様の結果を提供しうる。ここでも、ナンセンス抑制ｔＲ
ＮＡの利用がこのセミランダムＤＮＡ配列における終止
コドンの問題の解決に大きく役立つことができうる。 III ．新規遺伝子の転写 もしＤＮＡ発現ユニットをセミランダム配列を伴って用
いると、ｍＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼによって容易に
作り上げられうる。前述した通り、Ｔ７，Ｔ３及びＳＰ
６ ＲＮＡポリメラーゼが市販され、そして非常に有効
である。例として、Ｔ７プロモーターを有すＤＮＡ発現
ユニットをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより、その製造
者の仕様書に従って処理せしめる。およそ５０のｍＲＮ
Ａコピーが各ＤＮＡ分子について３０分で通常合成され
うる。このＤＮＡはＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅに
より分解されうる。もしオリジナルＤＮＡライブラリー
が１０12個の分子の多様性の配列を有す場合、得られる
ｍＲＮＡのプールは同一レベルの多様性を示すがしかし
尚も５０又はそれ以上の異なるＤＮＡ分子のそれぞれの
ＲＮＡコピーを含むであろう。６μｇのＲＮＡライブラ
リーは、３０個のアミノ酸のセミランダムポリペプチド
をそれぞれ発現可能な１０12種の異なるｍＲＮＡの５０
コピーを含みうる。小さな試験管中で６μｇは取り扱い
易いため、標準的な実験器具及び容器が利用されうる。
法は、この分子を５′非翻訳領域の３′末端上に直接的
に重合せしめることである。Ｎ−末端ＩＤ配列を用いな
い場合、この重合はＡＴＧ開始配列のすぐ後に、又は好
ましくはＡＴＧＧ配列のすぐ後（共通脊椎動物開始部位
及びＮｃｏＩ部位を共に保有するヶ所）にて起こりう
る。この重合のために最も一般的に利用される酵素は末
端基転移酵素（通常牛甲状腺に由来）であり、これはＤ
ＮＡクローニングのためのホモポリマー領域を作るため
によく利用される。しかしながら、異なるデオキシヌク
レオチド三リン酸を混ぜ合わせることにより、ＤＮＡの
セミランダムヘテロポリマーが遊離３′−ＯＨを有すＤ
ＮＡプライマー上において合成されうる。ここでも、一
定のコドンに偏らせるため及びナンセンスコドンの頻度
を引き下げるため、４種のデオキシヌクレオチド三リン
酸の相対濃度を調節することによって、Ａ，Ｔ，Ｃ及び
Ｇ塩基組成を操作する。特により少量のｄＡＴＰがナン
センスコドン（ＴＡＡ，ＴＡＧ及びＴＧＡ）の頻度を引
き下げうる。Ｅ．コリ（E.coli) ＤＮＡポリメラーゼＩ
がＤＮＡの非鋳型（新規：de novo ）合成の実施におい
て報告され、そして末端基転移酵素の代りに利用されう
る（A. Kornberg, DNA Replication, W.H. Freeman & C
o., San Francisco, Calif., 1980)。その他の酵素又は
化学方法も該発現ユニット上にＤＮＡを直接重合せしめ
うる。第２鎖の合成はランダムプライマー伸長により最
も容易に成し遂げられうるが、しかしその他の方法も同
様の結果を提供しうる。ここでも、ナンセンス抑制ｔＲ
ＮＡの利用がこのセミランダムＤＮＡ配列における終止
コドンの問題の解決に大きく役立つことができうる。 III ．新規遺伝子の転写 もしＤＮＡ発現ユニットをセミランダム配列を伴って用
いると、ｍＲＮＡはＲＮＡポリメラーゼによって容易に
作り上げられうる。前述した通り、Ｔ７，Ｔ３及びＳＰ
６ ＲＮＡポリメラーゼが市販され、そして非常に有効
である。例として、Ｔ７プロモーターを有すＤＮＡ発現
ユニットをＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより、その製造
者の仕様書に従って処理せしめる。およそ５０のｍＲＮ
Ａコピーが各ＤＮＡ分子について３０分で通常合成され
うる。このＤＮＡはＲＮａｓｅを含まないＤＮａｓｅに
より分解されうる。もしオリジナルＤＮＡライブラリー
が１０12個の分子の多様性の配列を有す場合、得られる
ｍＲＮＡのプールは同一レベルの多様性を示すがしかし
尚も５０又はそれ以上の異なるＤＮＡ分子のそれぞれの
ＲＮＡコピーを含むであろう。６μｇのＲＮＡライブラ
リーは、３０個のアミノ酸のセミランダムポリペプチド
をそれぞれ発現可能な１０12種の異なるｍＲＮＡの５０
コピーを含みうる。小さな試験管中で６μｇは取り扱い
易いため、標準的な実験器具及び容器が利用されうる。
【００４２】ｍＲＮＡの５′末端は真核細胞系における
効率的な翻訳のためにジグアノシン三リン酸「キャッ
プ」（又は類似体）の付加による修飾を必要とする。こ
の５′キャップ化ｍＲＮＡはインビトロ転写（HopeとSt
ruhl, Cell 43 : 177-188, 1985 ）及び／又はインビト
ロ翻訳工程（Krieg と Melton, Nucleic Acids Res. 1
2: 7057-7070, 1984) の際中に作られうる。転写にわた
り情報物をキャップするため、ＧＴＰに対して過剰量の
ジグアノシン三リン酸又はその類似体（例えばｍ７Ｇ
（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ；ベーリンガーマンハイムバ
イオケミカル社）がＲＮＡ重合の間に利用される。この
方法に基づくｍＲＮＡのキャッピングキットはストラタ
ジーン（Stratagene) (California) より市販され、こ
れは得られるＲＮＡの９０％〜９５％をキャップする。
効率的な翻訳のためにジグアノシン三リン酸「キャッ
プ」（又は類似体）の付加による修飾を必要とする。こ
の５′キャップ化ｍＲＮＡはインビトロ転写（HopeとSt
ruhl, Cell 43 : 177-188, 1985 ）及び／又はインビト
ロ翻訳工程（Krieg と Melton, Nucleic Acids Res. 1
2: 7057-7070, 1984) の際中に作られうる。転写にわた
り情報物をキャップするため、ＧＴＰに対して過剰量の
ジグアノシン三リン酸又はその類似体（例えばｍ７Ｇ
（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇ；ベーリンガーマンハイムバ
イオケミカル社）がＲＮＡ重合の間に利用される。この
方法に基づくｍＲＮＡのキャッピングキットはストラタ
ジーン（Stratagene) (California) より市販され、こ
れは得られるＲＮＡの９０％〜９５％をキャップする。
【００４３】もしこの発現ユニットがＱＢレプリカーゼ
系のようにＲＮＡを基礎とする場合、いくつかのＲＮＡ
コピーが、この新規遺伝子構造体がＤＮＡをプラスミド
を含むならばＴ７又はその他のプロモーターにより作ら
れうる（Lizardi ら、前記、1988を参照のこと）。ＲＮ
Ａコピーが存在すると（又は新規遺伝子がＲＮＡレベル
で組立てられる場合）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー
ゼは事実上無数のＲＮＡライブラリーのコピーを作るこ
とができる（１０億のコピーは容易に達成されうる）。
しかしながら、このライブラリーの多様性はそのままで
ある。ＲＮＡファージ、例えばＱＢにより、このライブ
ラリーはＤＮＡ中間体を経る必要なくＲＮＡレベルにて
自己維持（self-sustaining ）しうる。 IV．ＲＮＡの翻訳 複数のインビトロ翻訳法が広く知られている。都合上、
若干の改良を伴ってウサギ網状赤血球又は小麦胚芽系が
利用される。インビトロ翻訳キットは市販されている。
例えばベーリンガーマンハイムバイオケミカル社の「ト
ランスレーションキット、網状赤血球、型Ｉ」（“Tran
slation Kit Reticulocyte, Type I”）は１００種の翻
訳反応のための全ての成分を有する。各反応は２５μｌ
の容量中の約１μｇのｍＲＮＡにて最適である。１μｇ
のｍＲＮＡは前記した通り、４×１０12種以上の新規遺
伝子をコードするのに十分である。従って、比較的少量
において非常に大きい数の新規遺伝子を翻訳可能であ
る。例えば１０13個の８０Ｓリボソームは約６６μｇの
重さのみである。ｍＲＮＡの小さいサイズのため、１情
報当り数個のリボソームでｍＲＮＡを飽和せしめるもの
と予測される。
系のようにＲＮＡを基礎とする場合、いくつかのＲＮＡ
コピーが、この新規遺伝子構造体がＤＮＡをプラスミド
を含むならばＴ７又はその他のプロモーターにより作ら
れうる（Lizardi ら、前記、1988を参照のこと）。ＲＮ
Ａコピーが存在すると（又は新規遺伝子がＲＮＡレベル
で組立てられる場合）、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラー
ゼは事実上無数のＲＮＡライブラリーのコピーを作るこ
とができる（１０億のコピーは容易に達成されうる）。
しかしながら、このライブラリーの多様性はそのままで
ある。ＲＮＡファージ、例えばＱＢにより、このライブ
ラリーはＤＮＡ中間体を経る必要なくＲＮＡレベルにて
自己維持（self-sustaining ）しうる。 IV．ＲＮＡの翻訳 複数のインビトロ翻訳法が広く知られている。都合上、
若干の改良を伴ってウサギ網状赤血球又は小麦胚芽系が
利用される。インビトロ翻訳キットは市販されている。
例えばベーリンガーマンハイムバイオケミカル社の「ト
ランスレーションキット、網状赤血球、型Ｉ」（“Tran
slation Kit Reticulocyte, Type I”）は１００種の翻
訳反応のための全ての成分を有する。各反応は２５μｌ
の容量中の約１μｇのｍＲＮＡにて最適である。１μｇ
のｍＲＮＡは前記した通り、４×１０12種以上の新規遺
伝子をコードするのに十分である。従って、比較的少量
において非常に大きい数の新規遺伝子を翻訳可能であ
る。例えば１０13個の８０Ｓリボソームは約６６μｇの
重さのみである。ｍＲＮＡの小さいサイズのため、１情
報当り数個のリボソームでｍＲＮＡを飽和せしめるもの
と予測される。
【００４４】上記の代表的な翻訳キットのプロトコール
に詳細の通り、ＧＴＰ及びｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ
（５′）Ｇがインビトロ転写ＲＮＡの効率的な翻訳のた
めに必要とされる。ｍＲＮＡキャッピングが転写の際に
既に行なわれている場合でさえも、前記の通りこの翻訳
反応にジグアノシン三リン酸（又はその類似体）及びグ
アニリルトランスフェラーゼ（Krieg とMelton、前記、
1984）を加えることが好都合でありうる。転写の際にキ
ャッピングを行わない場合、この２種の試薬はｍＲＮＡ
の効率的な翻訳に必要でありうる。特にＱＢ構造体が翻
訳される場合、ジグアノシン三リン酸（又はその類似
体）及びグアニリルトランスフェラーゼは翻訳の際にＲ
ＮＡ分子をキャッピングするために必要でありうる。
に詳細の通り、ＧＴＰ及びｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ
（５′）Ｇがインビトロ転写ＲＮＡの効率的な翻訳のた
めに必要とされる。ｍＲＮＡキャッピングが転写の際に
既に行なわれている場合でさえも、前記の通りこの翻訳
反応にジグアノシン三リン酸（又はその類似体）及びグ
アニリルトランスフェラーゼ（Krieg とMelton、前記、
1984）を加えることが好都合でありうる。転写の際にキ
ャッピングを行わない場合、この２種の試薬はｍＲＮＡ
の効率的な翻訳に必要でありうる。特にＱＢ構造体が翻
訳される場合、ジグアノシン三リン酸（又はその類似
体）及びグアニリルトランスフェラーゼは翻訳の際にＲ
ＮＡ分子をキャッピングするために必要でありうる。
【００４５】翻訳の最適化及び特にｍＲＮＡへのリボソ
ームの結合のためにその他の技術も採用されうる。例え
ば、リボヌクレアーゼインヒビター、例えばヘパリンを
加えることが所望されうる。真核細菌系、例えば小麦胚
芽及び網状赤血球翻訳法は原核細胞系と類似の結果をも
たらしうる。原核細胞系はより小さいリボソーム及びよ
り容易に入手できるナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの
利点を有す。更に、原核細胞において転写及び翻訳はし
ばしば同時反応である。原核細胞において転写と翻訳の
組合せが行なわれない場合、ｍＲＮＡの安定性は大きく
下がる。従って、転写及び翻訳の組合さる原核細胞イン
ビトロ発現系が利用されうる。
ームの結合のためにその他の技術も採用されうる。例え
ば、リボヌクレアーゼインヒビター、例えばヘパリンを
加えることが所望されうる。真核細菌系、例えば小麦胚
芽及び網状赤血球翻訳法は原核細胞系と類似の結果をも
たらしうる。原核細胞系はより小さいリボソーム及びよ
り容易に入手できるナンセンスサプレッサーｔＲＮＡの
利点を有す。更に、原核細胞において転写及び翻訳はし
ばしば同時反応である。原核細胞において転写と翻訳の
組合せが行なわれない場合、ｍＲＮＡの安定性は大きく
下がる。従って、転写及び翻訳の組合さる原核細胞イン
ビトロ発現系が利用されうる。
【００４６】前記の通り、本発明の好ましい態様は、サ
プレッサーｔＲＮＡ（特にチロシン−挿入サプレッサ
ー）であって、組換ＤＮＡ工学及び／又は突然変異細胞
系由来のこれらの分子の部分精製により得られるものの
利用にある。放射活性アミノ酸、特にＳ３５−メチオニ
ンはインビトロ翻訳のモニターのため及びその後の段階
における微量のポリソームを追うために有用でありう
る。
プレッサーｔＲＮＡ（特にチロシン−挿入サプレッサ
ー）であって、組換ＤＮＡ工学及び／又は突然変異細胞
系由来のこれらの分子の部分精製により得られるものの
利用にある。放射活性アミノ酸、特にＳ３５−メチオニ
ンはインビトロ翻訳のモニターのため及びその後の段階
における微量のポリソームを追うために有用でありう
る。
【００４７】約３０〜６０分後、翻訳反応においてタン
パク質合成は開始する。任意に付与した翻訳条件のセッ
トについての正確な時間は、放射性活性アミノ酸（例え
ばＳ３５−メチオニン）及びＴＣＡ沈殿計測であってポ
リペプチド合成の指標であるものによって決定される。
タンパク質合成の開始後、最終濃度μｇ／mlでのシクロ
ヘキシミドをｍＲＮＡ上のリボソームの移動の防止のた
めに加える（Lynch, Meth. Enzym. 152 : 248-253, 198
7 ）。このレベルのシクロヘキシミド及び５mMのＭｇ2+
濃度がｍＲＮＡ−８０Ｓリボソーム−形成期ポリペプチ
ド複合体（ポリソーム）の維持のために利用されうる。
その他のリボソームインヒビターも利用されることがあ
り、何故ならシクロヘキシミドは例えば原核細胞リボソ
ーム上では働かないためである。しかしながら、ＧＴＰ
の非存在下において、ポリペプチドのリボソームからの
遊離は通常起きない。 Ｖ．対象の物質へのポリソームの結合 形成期ペプチドが結合しうる潜在化合物のリストは事実
上無限である。このような化合物のカラム、マトリック
ス、フィルター、ビーズ等への結合のためのカプリング
化学剤はこの化合物の性質に大いに依存するであろう。
ある場合において、完全細胞又は細胞画分が細胞成分、
例えばリセプタータンパク質及びその他の膜結合型分子
に結合するペプチドを見つけるために利用されうる。
パク質合成は開始する。任意に付与した翻訳条件のセッ
トについての正確な時間は、放射性活性アミノ酸（例え
ばＳ３５−メチオニン）及びＴＣＡ沈殿計測であってポ
リペプチド合成の指標であるものによって決定される。
タンパク質合成の開始後、最終濃度μｇ／mlでのシクロ
ヘキシミドをｍＲＮＡ上のリボソームの移動の防止のた
めに加える（Lynch, Meth. Enzym. 152 : 248-253, 198
7 ）。このレベルのシクロヘキシミド及び５mMのＭｇ2+
濃度がｍＲＮＡ−８０Ｓリボソーム−形成期ポリペプチ
ド複合体（ポリソーム）の維持のために利用されうる。
その他のリボソームインヒビターも利用されることがあ
り、何故ならシクロヘキシミドは例えば原核細胞リボソ
ーム上では働かないためである。しかしながら、ＧＴＰ
の非存在下において、ポリペプチドのリボソームからの
遊離は通常起きない。 Ｖ．対象の物質へのポリソームの結合 形成期ペプチドが結合しうる潜在化合物のリストは事実
上無限である。このような化合物のカラム、マトリック
ス、フィルター、ビーズ等への結合のためのカプリング
化学剤はこの化合物の性質に大いに依存するであろう。
ある場合において、完全細胞又は細胞画分が細胞成分、
例えばリセプタータンパク質及びその他の膜結合型分子
に結合するペプチドを見つけるために利用されうる。
【００４８】多数のタンパク質及び核酸に対するニトロ
セルロース又は類似の人工表層への結合性はフィルター
又はファイバーの特性である。このような場合におい
て、対象の物質を確立されたプロトコールによって膜に
付着せしめる。牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチ
ン、カゼインもしくは脱脂乳又はその他のタンパク質性
物質を次に過剰量において一般的に加え、すべての「自
由」表層部位に結合させる。例えば抗体の溶液をマイク
ロタイターディッシュ中のニトロセルロースディスク上
に加えることによって抗体をまずニトロセルロースに結
合させる。この抗体をニトロセルロースに吸収させた
後、このニトロセルロースディスクを食塩水を含む新し
いマイクロタイターディッシュに移すことによってこの
ディスクを洗浄する。洗浄後、このディスクを溶液中の
ゼラチンを含むマイクロタイターディッシュに移す。次
にこのディスクを再び食塩水で洗浄する。
セルロース又は類似の人工表層への結合性はフィルター
又はファイバーの特性である。このような場合におい
て、対象の物質を確立されたプロトコールによって膜に
付着せしめる。牛血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチ
ン、カゼインもしくは脱脂乳又はその他のタンパク質性
物質を次に過剰量において一般的に加え、すべての「自
由」表層部位に結合させる。例えば抗体の溶液をマイク
ロタイターディッシュ中のニトロセルロースディスク上
に加えることによって抗体をまずニトロセルロースに結
合させる。この抗体をニトロセルロースに吸収させた
後、このニトロセルロースディスクを食塩水を含む新し
いマイクロタイターディッシュに移すことによってこの
ディスクを洗浄する。洗浄後、このディスクを溶液中の
ゼラチンを含むマイクロタイターディッシュに移す。次
にこのディスクを再び食塩水で洗浄する。
【００４９】ポリソームを対象の物質に結合させる前
に、このポリソーム混合物を前述の通りに過剰量におい
て使用したＢＳＡ、ゼラチン、そして特にタンパク質性
物質（ブロッキングタンパク質）に予備吸収せしめるこ
とが所望されうる。この方法において、ブロッキングタ
ンパク質に結合するか又は任意のタンパク質に非特異的
に結合するポリソームが除去される。この予備吸着段階
は対象の物質に結合するより特異性の高いポリソームを
もたらすであろう。特異的な抗体に結合させるため（上
記の場合と同様に）、この（複数の）予備吸着段階はそ
の他の抗体、好ましくは類似のクラスであるが異なる可
変／超可変領域を有す抗体を含みうる。一般的に抗体と
は結合するが可変／超可変領域には結合しないポリソー
ムをスクリーニングして排除することにより、本発明は
抗イディオタイプ結合タンパク質を選ぶために有用であ
りうる。このような分子は生物学的もしくは酵素的活性
（いくつかの抗−イディオタイプ抗体に見られるよう
に）を有すか、又はワクチンとして有用である。
に、このポリソーム混合物を前述の通りに過剰量におい
て使用したＢＳＡ、ゼラチン、そして特にタンパク質性
物質（ブロッキングタンパク質）に予備吸収せしめるこ
とが所望されうる。この方法において、ブロッキングタ
ンパク質に結合するか又は任意のタンパク質に非特異的
に結合するポリソームが除去される。この予備吸着段階
は対象の物質に結合するより特異性の高いポリソームを
もたらすであろう。特異的な抗体に結合させるため（上
記の場合と同様に）、この（複数の）予備吸着段階はそ
の他の抗体、好ましくは類似のクラスであるが異なる可
変／超可変領域を有す抗体を含みうる。一般的に抗体と
は結合するが可変／超可変領域には結合しないポリソー
ムをスクリーニングして排除することにより、本発明は
抗イディオタイプ結合タンパク質を選ぶために有用であ
りうる。このような分子は生物学的もしくは酵素的活性
（いくつかの抗−イディオタイプ抗体に見られるよう
に）を有すか、又はワクチンとして有用である。
【００５０】対象の物質へのポリソームの結合はＭｇＣ
ｌ2 （５mM）及びＲＮａｓｅインヒビター、例えばヘパ
リンの存在下において成し遂げられうる。更に、特定の
インキュベーションパラメーター（例えば低もしくは高
温度、高もしくは低量の塩、又は異なるpH）が、環境に
依存して条件的に結合するポリペプチドを見い出すのに
利用される。インキュベーション時間は対象の物質の結
合濃度及びこのような物質の性質に依存するであろう。 VI．（複数の）対象の物質に結合するリボソームの単離 ポリソームを対象の物質に選択的に結合させた後、未結
合のポリソームを洗浄により一般的に除去する。この洗
浄液はＭｇＣｌ2 及びおそらくポリソームの非特異的な
結合を減ずるのに役立つゼラチン、ＢＳＡ又はその他の
タンパク質を含むべきである。もし放射性標識アミノ酸
を翻訳において用いる場合、対象の物質に結合する放射
性活性物質のカウントにおいてわずかな検出可能な変化
が見られる迄洗浄（系列的又はフロースルー）を続ける
べきである。もしこのアミノ酸が標識されていない場
合、ポリソーム溶液の少なくとも１０-6希釈が得られる
迄洗浄を続けるべきである。
ｌ2 （５mM）及びＲＮａｓｅインヒビター、例えばヘパ
リンの存在下において成し遂げられうる。更に、特定の
インキュベーションパラメーター（例えば低もしくは高
温度、高もしくは低量の塩、又は異なるpH）が、環境に
依存して条件的に結合するポリペプチドを見い出すのに
利用される。インキュベーション時間は対象の物質の結
合濃度及びこのような物質の性質に依存するであろう。 VI．（複数の）対象の物質に結合するリボソームの単離 ポリソームを対象の物質に選択的に結合させた後、未結
合のポリソームを洗浄により一般的に除去する。この洗
浄液はＭｇＣｌ2 及びおそらくポリソームの非特異的な
結合を減ずるのに役立つゼラチン、ＢＳＡ又はその他の
タンパク質を含むべきである。もし放射性標識アミノ酸
を翻訳において用いる場合、対象の物質に結合する放射
性活性物質のカウントにおいてわずかな検出可能な変化
が見られる迄洗浄（系列的又はフロースルー）を続ける
べきである。もしこのアミノ酸が標識されていない場
合、ポリソーム溶液の少なくとも１０-6希釈が得られる
迄洗浄を続けるべきである。
【００５１】これらの洗浄後、結合しないために所望さ
れる環境、例えば高温、異なるpH、高金属イオン濃度又
は低塩濃度にこのポリソームを移すことにより、条件的
に結合性の新規ペプチドを単離する。この第２（緊張）
条件のもとで結合しないこれらのペプチド（及びそれら
に結合しているポリソームｍＲＮＡ複合体）は溶液中で
遊離し、そして対象の物質に対する潜在的な条件的結合
性因子を代表するであろう。固定化せしめたら、条件的
結合性ペプチドは対象の物質の精製に利用されうる。他
方、条件的結合性ペプチドは環境変化のモニターにおけ
る試薬として働きうる。 VII ．単離化ポリソームの解離 この単離化（結合）ポリソームはＭｇ2+の除去（希釈も
しくはキレート剤を介して）又は多数の方法によるタン
パク質の破壊（プロテアーゼ、クロロホルム等）によっ
て容易に解離しうる。希釈が最も簡単な方法ではある
が、これはその他の方法に比べてポリソームの完全なる
解離をもたらさないことがある。ｍＲＮＡを遊離化させ
るために結合ポリソームをＭｇ2+の含まない溶液に移
す；ＲＮａｓｅインヒビターが所望される。
れる環境、例えば高温、異なるpH、高金属イオン濃度又
は低塩濃度にこのポリソームを移すことにより、条件的
に結合性の新規ペプチドを単離する。この第２（緊張）
条件のもとで結合しないこれらのペプチド（及びそれら
に結合しているポリソームｍＲＮＡ複合体）は溶液中で
遊離し、そして対象の物質に対する潜在的な条件的結合
性因子を代表するであろう。固定化せしめたら、条件的
結合性ペプチドは対象の物質の精製に利用されうる。他
方、条件的結合性ペプチドは環境変化のモニターにおけ
る試薬として働きうる。 VII ．単離化ポリソームの解離 この単離化（結合）ポリソームはＭｇ2+の除去（希釈も
しくはキレート剤を介して）又は多数の方法によるタン
パク質の破壊（プロテアーゼ、クロロホルム等）によっ
て容易に解離しうる。希釈が最も簡単な方法ではある
が、これはその他の方法に比べてポリソームの完全なる
解離をもたらさないことがある。ｍＲＮＡを遊離化させ
るために結合ポリソームをＭｇ2+の含まない溶液に移
す；ＲＮａｓｅインヒビターが所望される。
【００５２】任意の所望する環境のもとで遊離せしめた
条件的結合性ポリソームを、ポリソームを解離せしめて
それらのｍＲＮＡを遊離せしめるのと類似の方法におい
て処理することができうる。 VIII．メッセンジャーＲＮＡの回収及びｃＤＮＡの作製 理論的にもし対象の物質に結合している単一ポリソーム
がｍＲＮＡを保有している場合、この微量ｍＲＮＡはｍ
ＲＮＡのライブラリー全体から単離（回収）されること
ができる。このｍＲＮＡは単離を促進せしめるためのい
くつかの技術によって増幅されることもできうる。
条件的結合性ポリソームを、ポリソームを解離せしめて
それらのｍＲＮＡを遊離せしめるのと類似の方法におい
て処理することができうる。 VIII．メッセンジャーＲＮＡの回収及びｃＤＮＡの作製 理論的にもし対象の物質に結合している単一ポリソーム
がｍＲＮＡを保有している場合、この微量ｍＲＮＡはｍ
ＲＮＡのライブラリー全体から単離（回収）されること
ができる。このｍＲＮＡは単離を促進せしめるためのい
くつかの技術によって増幅されることもできうる。
【００５３】ＤＮＡの単一コピー及び微量ｍＲＮＡにお
けるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の利用はよく報告
されている。（Erlich（編）、PCR Technology, Stockt
on Press, New York, N.Y., 1989 ; M.A. Innis ら
（編）、PCR Protocols : A Guide to Methods and App
lication, Academic Press, San Diego, Calif., 1989
;H.A. Erlich （編）、Polymerase Chain Reaction :
Current Communications in Molecular Biology, Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,1989
、を参照のこと）。簡単に述べると、微量ｍＲＮＡを
まず標準の方法によりｃＤＮＡ合成にかける。５′及び
３′領域の配列は既知であるため、特定のプライマーを
ｃＤＮＡ合成のために利用できうる。第２に、単一ｃＤ
ＮＡを特定のプライマーの利用（ｃＤＮＡ合成に利用す
るものと同一のプライマーさえも利用できる）を介して
次に増幅せしめる。ＰＣＲのために利用するプライマー
はオリジナルの発現ユニットの５′及び３′領域を保有
する配列を含むことができ、ここでプロモーター（例え
ばＴ７ポリメラーゼ認識配列）及び３′領域を保有する
配列が所望される。この方法において発現ユニットを再
生せしめることにより、転写−翻訳−ポリソーム選別の
繰り返しラウンドを、実質的に全ての選別遺伝子が結合
性ペプチドをコードするようにする迄行うことができ
る。ＲＮＡファージ、例えばＱＢ、を基礎とする発現ユ
ニットに関しては、微量ｍＲＮＡの回収及び増幅は容易
化され、その理由は適当なレプリカーゼを利用すること
により各ｍＲＮＡは１０億以上のコピーを複製可能であ
るからである。 IX．新規遺伝子の発現 新規遺伝子を単離且つシーケンス化せしめたら、それら
又は関連する配列を当業界によく知られる方法により
（１）クローン化し、（２）化学的に再生し、（３）突
然変異せしめ、そして（４）発現させる。新規ポリペプ
チドの大量生産は遺伝子操作微生物を用いる組換ＤＮＡ
法を介して成し遂げられうる。新規の結合性ペプチドの
インビトロ合成のために多彩なる真核及び原核発現系が
存在する。前記した適当なＮｃｏＩ部位又はその他の制
限部位が、この新規遺伝子のコード領域を所望のプロモ
ーターに接続させるために利用できうる。その他の遺伝
子スプライシング法が同様に存在していることが当業者
に明らかであろう。微生物における新規遺伝子の適切な
発現のためにこの遺伝子の３′末端に翻訳終止コドン及
び転写終結配列を加えることができうる。この遺伝子操
作配列を次にプラスミド又はベクターに移し入れ、そし
て形質転換、形質導入、感染、エレクトロポレーショ
ン、マイクロインジェクション又はその他の類似の方法
により所望の宿主細胞に移し入れる。得られる遺伝子生
成物を定量且つ精製するためにこの新規ペプチド配列を
微生物から分泌されるようにシグナルペプチドに連結せ
しめること及び／又は本明細書詳細の通りにＩＤペプチ
ドを含ませることができる。この新規ペプチド又は関連
する配列を、遺伝子操作生物において同様に発現するハ
イブリド又は融合タンパク質を形成せしめるためにその
他の翻訳化配列に連結させることができうる。他方、商
業的な量のポリペプチドを生産するために大量インビト
ロ転写及び翻訳法が利用されうる。
けるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の利用はよく報告
されている。（Erlich（編）、PCR Technology, Stockt
on Press, New York, N.Y., 1989 ; M.A. Innis ら
（編）、PCR Protocols : A Guide to Methods and App
lication, Academic Press, San Diego, Calif., 1989
;H.A. Erlich （編）、Polymerase Chain Reaction :
Current Communications in Molecular Biology, Cold
Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.,1989
、を参照のこと）。簡単に述べると、微量ｍＲＮＡを
まず標準の方法によりｃＤＮＡ合成にかける。５′及び
３′領域の配列は既知であるため、特定のプライマーを
ｃＤＮＡ合成のために利用できうる。第２に、単一ｃＤ
ＮＡを特定のプライマーの利用（ｃＤＮＡ合成に利用す
るものと同一のプライマーさえも利用できる）を介して
次に増幅せしめる。ＰＣＲのために利用するプライマー
はオリジナルの発現ユニットの５′及び３′領域を保有
する配列を含むことができ、ここでプロモーター（例え
ばＴ７ポリメラーゼ認識配列）及び３′領域を保有する
配列が所望される。この方法において発現ユニットを再
生せしめることにより、転写−翻訳−ポリソーム選別の
繰り返しラウンドを、実質的に全ての選別遺伝子が結合
性ペプチドをコードするようにする迄行うことができ
る。ＲＮＡファージ、例えばＱＢ、を基礎とする発現ユ
ニットに関しては、微量ｍＲＮＡの回収及び増幅は容易
化され、その理由は適当なレプリカーゼを利用すること
により各ｍＲＮＡは１０億以上のコピーを複製可能であ
るからである。 IX．新規遺伝子の発現 新規遺伝子を単離且つシーケンス化せしめたら、それら
又は関連する配列を当業界によく知られる方法により
（１）クローン化し、（２）化学的に再生し、（３）突
然変異せしめ、そして（４）発現させる。新規ポリペプ
チドの大量生産は遺伝子操作微生物を用いる組換ＤＮＡ
法を介して成し遂げられうる。新規の結合性ペプチドの
インビトロ合成のために多彩なる真核及び原核発現系が
存在する。前記した適当なＮｃｏＩ部位又はその他の制
限部位が、この新規遺伝子のコード領域を所望のプロモ
ーターに接続させるために利用できうる。その他の遺伝
子スプライシング法が同様に存在していることが当業者
に明らかであろう。微生物における新規遺伝子の適切な
発現のためにこの遺伝子の３′末端に翻訳終止コドン及
び転写終結配列を加えることができうる。この遺伝子操
作配列を次にプラスミド又はベクターに移し入れ、そし
て形質転換、形質導入、感染、エレクトロポレーショ
ン、マイクロインジェクション又はその他の類似の方法
により所望の宿主細胞に移し入れる。得られる遺伝子生
成物を定量且つ精製するためにこの新規ペプチド配列を
微生物から分泌されるようにシグナルペプチドに連結せ
しめること及び／又は本明細書詳細の通りにＩＤペプチ
ドを含ませることができる。この新規ペプチド又は関連
する配列を、遺伝子操作生物において同様に発現するハ
イブリド又は融合タンパク質を形成せしめるためにその
他の翻訳化配列に連結させることができうる。他方、商
業的な量のポリペプチドを生産するために大量インビト
ロ転写及び翻訳法が利用されうる。
【００５４】最後に、この新規ペプチドのアミノ酸配列
が短いならば、通常の有用な技術がポリペプチドの大量
化学合成を可能にする。新規ペプチドの化学合成はイン
ビトロ及びインビボ（生体内）発現系に勝る利点を有
す。これらの利点の中で、化学合成は（１）よりよく定
義され、従って合成のためのより再現性のある系であ
り、（２）ＤＮＡ及びＲＮＡの夾雑起源を有さず、
（３）ヌクレアーゼ、プロテアーゼ及びその他の改質酵
素の夾雑起源を有さず、そして（４）合成の後に比較的
純粋な生成物を提供する。 Ｘ．特定のポリソームについての反復純化 バックグランド、即ち、対象の物質へのポリソームの非
特異的結合の量に依存して、所望のポリペプチドをコー
ドする配列の度数を高めるために任意の回数の前述した
翻訳−転写−結合−回収のサイクルを選びうる。例え
ば、もし各サイクルが所望の新規遺伝子の度数を１０4
倍高めるなら、１０-12 の度数にてオリジナルライブラ
リーに存在する配列の単離のためには３回のサイクルが
十分でありうる。各サイクルは１〜３日で完了する；そ
してこの方法の多数の段階は自動化ワークステーション
又はロボットにより行なわれることがある。従って、所
望の結合活性のための多数のサイクルは通常１週間以内
に成し遂げられうる。 ＸＩ．ポリソーム結合を伴わない翻訳化生成物の活性に
ついてのスクリーニング 本発明の１態様は遺伝子の単離のためのポリソーム結合
を必要としない。その代りに、新規ポリペプチドがリボ
ソームから遊離することがもたらされる完了時迄インビ
トロ翻訳を進行させる。これはナンセンスコドンの利用
又はリボソームのｍＲＮＡの末端からの「脱離」により
成し遂げられる。この新しいペプチドは、この翻訳生成
物の濃縮のためにゲル濾過及び／もしくは遠心、並びに
／又はその他の手段により、リボソーム及びその他の翻
訳反応の成分から分離できうる。次にこのペプチド混合
物に生物学又は酵素活性を表現させる。例えば、成長因
子に欠く組織培養細胞を処理することにより、このペプ
チドをミトゲン活性についてアッセイする。
が短いならば、通常の有用な技術がポリペプチドの大量
化学合成を可能にする。新規ペプチドの化学合成はイン
ビトロ及びインビボ（生体内）発現系に勝る利点を有
す。これらの利点の中で、化学合成は（１）よりよく定
義され、従って合成のためのより再現性のある系であ
り、（２）ＤＮＡ及びＲＮＡの夾雑起源を有さず、
（３）ヌクレアーゼ、プロテアーゼ及びその他の改質酵
素の夾雑起源を有さず、そして（４）合成の後に比較的
純粋な生成物を提供する。 Ｘ．特定のポリソームについての反復純化 バックグランド、即ち、対象の物質へのポリソームの非
特異的結合の量に依存して、所望のポリペプチドをコー
ドする配列の度数を高めるために任意の回数の前述した
翻訳−転写−結合−回収のサイクルを選びうる。例え
ば、もし各サイクルが所望の新規遺伝子の度数を１０4
倍高めるなら、１０-12 の度数にてオリジナルライブラ
リーに存在する配列の単離のためには３回のサイクルが
十分でありうる。各サイクルは１〜３日で完了する；そ
してこの方法の多数の段階は自動化ワークステーション
又はロボットにより行なわれることがある。従って、所
望の結合活性のための多数のサイクルは通常１週間以内
に成し遂げられうる。 ＸＩ．ポリソーム結合を伴わない翻訳化生成物の活性に
ついてのスクリーニング 本発明の１態様は遺伝子の単離のためのポリソーム結合
を必要としない。その代りに、新規ポリペプチドがリボ
ソームから遊離することがもたらされる完了時迄インビ
トロ翻訳を進行させる。これはナンセンスコドンの利用
又はリボソームのｍＲＮＡの末端からの「脱離」により
成し遂げられる。この新しいペプチドは、この翻訳生成
物の濃縮のためにゲル濾過及び／もしくは遠心、並びに
／又はその他の手段により、リボソーム及びその他の翻
訳反応の成分から分離できうる。次にこのペプチド混合
物に生物学又は酵素活性を表現させる。例えば、成長因
子に欠く組織培養細胞を処理することにより、このペプ
チドをミトゲン活性についてアッセイする。
【００５５】該新規ペプチドの全体又はサブセット内に
生物学もしくは酵素活性が観察されるなら、この活性を
コードする遺伝子は、オリジリナルライブラリー又はこ
のライブラリーのＲＮＡコピーを再分せしめ、そしてこ
の再分体における活性についてスクリーニングすること
により見い出すことができうる。適切な再分後、この所
望遺伝子を（例えば）１０００種類以下の配列を含むプ
ールへと単離化せしめることができうる。理論上、この
所望遺伝子は再分により完全に単離できうる（たった１
つの遺伝子を含むプール）。ＰＣＲ、ＱＢレプリカーゼ
又はその他の方法（前記の通り）により、所望の配列
は、インビトロ転写及び翻訳が生物学／酵素活性を有す
高い純度のペプチド溶液を提供するレベル迄増幅されう
る。１〜１０-3の度数で、この対象の遺伝子を常用の方
法を用いて単離且つ適切な発現系にクローン化せしめる
ことが容易にできうる。 ＸII．新規遺伝子及びペプチドの無細胞同定 予測の結合性又は生物学活性を有す新規遺伝子を単離さ
せた後、この精製配列が対象の活性をコードするかを、
ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを増幅せしめて大量インビトロ
翻訳のために十分なｍＲＮＡが生産されているかによっ
て確認する。この精製配列の翻訳生成物はアッセイ可能
な活性を有すほぼ均一なポリペプチドであるべきであ
る。この遺伝子及び／又はポリペプチドは新規ポリペプ
チドの組成を確定する現存の方法によりシーケンス化さ
れうる。他方、この精製遺伝子を増幅及び発現のために
微生物の中にクローン化せしめることもできうる。その
後、新規遺伝子及びポリペプチドについての生物学／結
合活性及び配列同定を確定しうる。 ＸIII ．新規ハイブリドタンパク質の作製 新規遺伝子についての核酸配列が決定された後、該新規
ペプチドの特性及びその他の所望する性質を有すハイブ
リドタンパク質を作るために該配列をより大きい遺伝子
の中に組入れる。この方法により作られうる１つのクラ
スのハイブリドタンパク質は細胞への特異的な結合性及
び細胞障害性能力により特徴付けられる。例えば、細胞
表層リセプター結合性ペプチドをＤＮＡスプライシング
法を介してリシン又はその他の毒素に連結させることが
できる。このタイプのハイブリドタンパク質は、病原体
及び腫瘍細胞を含む異なる細胞タイプを選択的に殺傷す
るために用いられうる。このハイブリドタンパク質をコ
ードする遺伝子は完全合成されうるか、又は適当な遺伝
子フラグメントの互いのスプライシングにより得られう
る。この遺伝子は種々の発現系において発現されうる。
生物学もしくは酵素活性が観察されるなら、この活性を
コードする遺伝子は、オリジリナルライブラリー又はこ
のライブラリーのＲＮＡコピーを再分せしめ、そしてこ
の再分体における活性についてスクリーニングすること
により見い出すことができうる。適切な再分後、この所
望遺伝子を（例えば）１０００種類以下の配列を含むプ
ールへと単離化せしめることができうる。理論上、この
所望遺伝子は再分により完全に単離できうる（たった１
つの遺伝子を含むプール）。ＰＣＲ、ＱＢレプリカーゼ
又はその他の方法（前記の通り）により、所望の配列
は、インビトロ転写及び翻訳が生物学／酵素活性を有す
高い純度のペプチド溶液を提供するレベル迄増幅されう
る。１〜１０-3の度数で、この対象の遺伝子を常用の方
法を用いて単離且つ適切な発現系にクローン化せしめる
ことが容易にできうる。 ＸII．新規遺伝子及びペプチドの無細胞同定 予測の結合性又は生物学活性を有す新規遺伝子を単離さ
せた後、この精製配列が対象の活性をコードするかを、
ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを増幅せしめて大量インビトロ
翻訳のために十分なｍＲＮＡが生産されているかによっ
て確認する。この精製配列の翻訳生成物はアッセイ可能
な活性を有すほぼ均一なポリペプチドであるべきであ
る。この遺伝子及び／又はポリペプチドは新規ポリペプ
チドの組成を確定する現存の方法によりシーケンス化さ
れうる。他方、この精製遺伝子を増幅及び発現のために
微生物の中にクローン化せしめることもできうる。その
後、新規遺伝子及びポリペプチドについての生物学／結
合活性及び配列同定を確定しうる。 ＸIII ．新規ハイブリドタンパク質の作製 新規遺伝子についての核酸配列が決定された後、該新規
ペプチドの特性及びその他の所望する性質を有すハイブ
リドタンパク質を作るために該配列をより大きい遺伝子
の中に組入れる。この方法により作られうる１つのクラ
スのハイブリドタンパク質は細胞への特異的な結合性及
び細胞障害性能力により特徴付けられる。例えば、細胞
表層リセプター結合性ペプチドをＤＮＡスプライシング
法を介してリシン又はその他の毒素に連結させることが
できる。このタイプのハイブリドタンパク質は、病原体
及び腫瘍細胞を含む異なる細胞タイプを選択的に殺傷す
るために用いられうる。このハイブリドタンパク質をコ
ードする遺伝子は完全合成されうるか、又は適当な遺伝
子フラグメントの互いのスプライシングにより得られう
る。この遺伝子は種々の発現系において発現されうる。
【００５６】本発明の好ましい態様は、抗体並びに抗体
様遺伝子の可変及び超可変領域を、対象の物質に対する
結合活性をコードする新規遺伝子配列により置換するこ
とである。この方法において、対象の抗原に対するより
広い多様性が可能である；そしてスクリーニングプロセ
スは同一の抗原に対するモノクローナル抗体についての
生産方法よりもより効率的且つ時間がかからないプロセ
スでありうる。このような「特注」（“custom”）ハイ
ブリド抗体遺伝子は、新しい特異性又は性質を有す活性
抗体を生産せしめるよう多数の生物において発現されう
る。 ＸIV．本発明のその他の商業的利用 診断検査における本発明の適用はモノクローナル／ポリ
クローナル抗体の利用に匹敵し、そしてより好都合であ
り、その理由は第１に本明細書記載の新規ポリペプチド
の単離はかなり短い時間で行われることにある（１週間
に対して抗体は数ヶ月）。更に、その他の利用も見られ
る。この新規ポリペプチドは抗体よりもかなり小さい分
子である。従って、該新規ペプチドの合成、精製及び／
又は製造は抗体に比べて容易であり、且つ安価である。
このより小さいサイズは安定化、製剤化及び標的分子へ
の到達にも役立ちうる。
様遺伝子の可変及び超可変領域を、対象の物質に対する
結合活性をコードする新規遺伝子配列により置換するこ
とである。この方法において、対象の抗原に対するより
広い多様性が可能である；そしてスクリーニングプロセ
スは同一の抗原に対するモノクローナル抗体についての
生産方法よりもより効率的且つ時間がかからないプロセ
スでありうる。このような「特注」（“custom”）ハイ
ブリド抗体遺伝子は、新しい特異性又は性質を有す活性
抗体を生産せしめるよう多数の生物において発現されう
る。 ＸIV．本発明のその他の商業的利用 診断検査における本発明の適用はモノクローナル／ポリ
クローナル抗体の利用に匹敵し、そしてより好都合であ
り、その理由は第１に本明細書記載の新規ポリペプチド
の単離はかなり短い時間で行われることにある（１週間
に対して抗体は数ヶ月）。更に、その他の利用も見られ
る。この新規ポリペプチドは抗体よりもかなり小さい分
子である。従って、該新規ペプチドの合成、精製及び／
又は製造は抗体に比べて容易であり、且つ安価である。
このより小さいサイズは安定化、製剤化及び標的分子へ
の到達にも役立ちうる。
【００５７】この新規ポリペプチドは、（１）これらを
定量可能な活性（例えばペルオキシダーゼもしくはその
他の酵素活性）を有す生物学的に活性なペプチドに融合
させる、（２）現存している抗体に結合するものと分っ
ている前記のＩＤペプチドとそれらを合成せしめる、
（３）これらを放射性活性標識せしめる、（４）マーカ
ー、例えば蛍光色素もしくは金属性物質を化学的に付加
せしめるか、又は（５）上記の任意の組合せにより、同
定可能でありうる。この新規ポリペプチドの診断利用に
おいて特異性を高めるため、２種以上の異なるポリペプ
チドを利用できうる。更に、新規ポリペプチドを、抗原
又は基質への競合的な結合性に基づく診断検査における
競合的結合性構成要素として利用しうる。
定量可能な活性（例えばペルオキシダーゼもしくはその
他の酵素活性）を有す生物学的に活性なペプチドに融合
させる、（２）現存している抗体に結合するものと分っ
ている前記のＩＤペプチドとそれらを合成せしめる、
（３）これらを放射性活性標識せしめる、（４）マーカ
ー、例えば蛍光色素もしくは金属性物質を化学的に付加
せしめるか、又は（５）上記の任意の組合せにより、同
定可能でありうる。この新規ポリペプチドの診断利用に
おいて特異性を高めるため、２種以上の異なるポリペプ
チドを利用できうる。更に、新規ポリペプチドを、抗原
又は基質への競合的な結合性に基づく診断検査における
競合的結合性構成要素として利用しうる。
【００５８】本発明によって作られる新規ポリペプチド
の他の利点は、それらが強い免疫応答を引き出すことの
ないであろう多数のクラスの分子と結合しうることにあ
り、その理由はいくつかの分子は抗体の形成を誘発する
ほど複雑でない、又は生物に内在する成分に似すぎてい
るためである。更に、診断結合性アッセイにおける新規
ポリペプチドの利用は、伝統的な抗体を基礎とする方法
よりもより広い目的を有しうる。
の他の利点は、それらが強い免疫応答を引き出すことの
ないであろう多数のクラスの分子と結合しうることにあ
り、その理由はいくつかの分子は抗体の形成を誘発する
ほど複雑でない、又は生物に内在する成分に似すぎてい
るためである。更に、診断結合性アッセイにおける新規
ポリペプチドの利用は、伝統的な抗体を基礎とする方法
よりもより広い目的を有しうる。
【００５９】オリジナルの状態で単離した又は融合タン
パク質の一部としての本発明の新規ポリペプチドは治療
的にも利用されうる。例えば、一定の毒素に結合せしめ
るために新規ポリペプチドを選んだ場合、これは該毒素
を中和することもある。もし新規ポリペプチドを細胞膜
上のウィルスリセプター部位又はウィルス結合メカニズ
ムに結合させた場合、細胞の感染化は小さくなりうる。
先に述べた通り、毒素の他に新規ポリペプチド認識配列
を保有する融合タンパク質が疾患性又は悪性細胞を選択
的に殺傷せしめるのに用いられうる。感染又は悪性細胞
への新規配列の結合は、細胞−ペプチド複合体に対する
免疫応答の引き金となることがあり、従って患者の抑制
に有用でありうる。
パク質の一部としての本発明の新規ポリペプチドは治療
的にも利用されうる。例えば、一定の毒素に結合せしめ
るために新規ポリペプチドを選んだ場合、これは該毒素
を中和することもある。もし新規ポリペプチドを細胞膜
上のウィルスリセプター部位又はウィルス結合メカニズ
ムに結合させた場合、細胞の感染化は小さくなりうる。
先に述べた通り、毒素の他に新規ポリペプチド認識配列
を保有する融合タンパク質が疾患性又は悪性細胞を選択
的に殺傷せしめるのに用いられうる。感染又は悪性細胞
への新規配列の結合は、細胞−ペプチド複合体に対する
免疫応答の引き金となることがあり、従って患者の抑制
に有用でありうる。
【００６０】実施例 以下の実施例は例示であって限定ではない。これらの実
施例において、夾雑活性物質を含まない（使用する際
に）標準試薬及び緩衝液を利用した。リボヌクレアーゼ
及びＰＣＲ生成物の夾雑を回避する注意を払うことが好
ましい。実施例１ 新規遺伝子ライブラリーの合成 新規遺伝子ライブラリーを作るための配列及び手法は当
業者による慎重な計画を必要とする。発現ユニットの
５′非翻訳領域はＲＮＡポリメラーゼ部位、リボソーム
結合部位、開始コドン及び選ばれた５′非翻訳配列を含
む。本実施例において利用したポリメラーゼ結合部位は
Ｔ７プロモーター、TAATACGACTCACTATAGGGAGA （２３−
ｍｅｒ）であり、これは該発現ユニットの５′末端に位
置する。Ｔ７プロモーターより合成したＲＮＡの翻訳の
ために、ウサギ網状赤血球系を利用した。従って、この
リボソーム結合部位は真核細胞非翻訳領域についての共
通配列の少なくとも一部を含むべきである。参照論文に
おいて、Kozak （前記、1987）は非常に短い非翻訳領域
（１０個のヌクレオチド以下）はタンパク質合成を効率
的に開始せしめないものと述べている。ここでは３６個
のヌクレオチドの選択した非翻訳領域を利用している。
この非翻訳領域は成体ウサギヘモグロビン（アルファー
−グロブリン）の天然（３６塩基付）上流配列：A CACTTCTGG TCCAGTCCGACTGAGAAGGAACCACCATG G に由来し、ここで下線部のＡＴＧはメチオニン開始コド
ンでの翻訳の開始位置を示す（Baralle, Nature 267 :
279-281, 1977 ）。ウサギアルファー−グロブリン非翻
訳配列を選んだ理由は、（１）これはウサギ網状赤血球
系における好適な基質であると期待され、そして（２）
これはKozak のモデルｍＲＮＡの重要な「モチーフ」含
むからである。
施例において、夾雑活性物質を含まない（使用する際
に）標準試薬及び緩衝液を利用した。リボヌクレアーゼ
及びＰＣＲ生成物の夾雑を回避する注意を払うことが好
ましい。実施例１ 新規遺伝子ライブラリーの合成 新規遺伝子ライブラリーを作るための配列及び手法は当
業者による慎重な計画を必要とする。発現ユニットの
５′非翻訳領域はＲＮＡポリメラーゼ部位、リボソーム
結合部位、開始コドン及び選ばれた５′非翻訳配列を含
む。本実施例において利用したポリメラーゼ結合部位は
Ｔ７プロモーター、TAATACGACTCACTATAGGGAGA （２３−
ｍｅｒ）であり、これは該発現ユニットの５′末端に位
置する。Ｔ７プロモーターより合成したＲＮＡの翻訳の
ために、ウサギ網状赤血球系を利用した。従って、この
リボソーム結合部位は真核細胞非翻訳領域についての共
通配列の少なくとも一部を含むべきである。参照論文に
おいて、Kozak （前記、1987）は非常に短い非翻訳領域
（１０個のヌクレオチド以下）はタンパク質合成を効率
的に開始せしめないものと述べている。ここでは３６個
のヌクレオチドの選択した非翻訳領域を利用している。
この非翻訳領域は成体ウサギヘモグロビン（アルファー
−グロブリン）の天然（３６塩基付）上流配列：A CACTTCTGG TCCAGTCCGACTGAGAAGGAACCACCATG G に由来し、ここで下線部のＡＴＧはメチオニン開始コド
ンでの翻訳の開始位置を示す（Baralle, Nature 267 :
279-281, 1977 ）。ウサギアルファー−グロブリン非翻
訳配列を選んだ理由は、（１）これはウサギ網状赤血球
系における好適な基質であると期待され、そして（２）
これはKozak のモデルｍＲＮＡの重要な「モチーフ」含
むからである。
【００６１】アルファー−グロブリン配列はインビトロ
遺伝子発現のための以下の方法において改質される。第
１に、５′のＡ（上記の下線部）をＧにより置換してｍ
ＲＮＡのキャッピングに役立たせる（Green ら、Cell 3
2 : 681-694, 1983 ）。第２に、Ｇ（アルファー−グロ
ブリン配列における下線部）をＡと交換し、ベーター−
グロブリンｍＲＮＡに比べてタンパク質合成の開始を６
０％引き下げるものと考えられている（Baralle 、前
記、1977）アルファー−グロブリンの非翻訳領域におけ
る予測される二次構造をなくすことに役立たせる。この
第２の変化は５′非翻訳領域において適当なるＧＡＴＣ
制限部位をも作り上げる。コード領域のＡＴＧＧを含む
得られるリーダー配列は従って以下の通りである：G CACTTCTGA TCCAGTCCGACTGAGAAGGAACCACCATG G このリーダー配列をＴ７プロモーターのすぐ下流に置い
た。
遺伝子発現のための以下の方法において改質される。第
１に、５′のＡ（上記の下線部）をＧにより置換してｍ
ＲＮＡのキャッピングに役立たせる（Green ら、Cell 3
2 : 681-694, 1983 ）。第２に、Ｇ（アルファー−グロ
ブリン配列における下線部）をＡと交換し、ベーター−
グロブリンｍＲＮＡに比べてタンパク質合成の開始を６
０％引き下げるものと考えられている（Baralle 、前
記、1977）アルファー−グロブリンの非翻訳領域におけ
る予測される二次構造をなくすことに役立たせる。この
第２の変化は５′非翻訳領域において適当なるＧＡＴＣ
制限部位をも作り上げる。コード領域のＡＴＧＧを含む
得られるリーダー配列は従って以下の通りである：G CACTTCTGA TCCAGTCCGACTGAGAAGGAACCACCATG G このリーダー配列をＴ７プロモーターのすぐ下流に置い
た。
【００６２】３′領域は、（１）特定−プライマー依存
性ＤＮＡ合成のための選ばれた配列、（２）形成期ポリ
ペプチドに、対象の物質を結合させるための自由空間を
提供するポリグリシンつなぎ鎖をコードするＧＧＧに富
む領域、及び（３）適当な制限部位を含み、結果として
のＲＮＡ二次構造はｍＲＮＡから脱離するリボソームの
トランスロケーションを妨げうる。このポリグリシン領
域はグリシンに関する２０個のコドンを含んで成り；ほ
とんどのグリシンコドンは隣り合うＧＧＧトリプレット
であり、これは全ての解読枠においてグリシンをコード
する。しかしながら、いくつかのグリシンコドンはＤＮ
Ａ鎖を適当な記録体（register）に保つためのＧＧＴ又
はＧＧＡである。ＢａｍＨＩについての制限部位（GGAT
CC）及びＮｏｔＩについてのそれ（GCGGCCGC）はこの遺
伝子の３′末端の非常に近くに置くように選んだ；ｍＲ
ＮＡにおいてこれらの配列はヘアピンループを形成する
ものと予測される。ＮｏｔＩ配列による第２鎖の自己プ
ライミング（ヘアピンループの）を防止するため、３′
末端にＡＡＡＡを付加した。従って３′領域は（ＧＧＧ
又はＧＧＴ／Ａ）２０の一般配列、それに続くGGATCCGC
GGCCGCAAAAを有す。この領域に特異的な配列を以下に挙
げる。
性ＤＮＡ合成のための選ばれた配列、（２）形成期ポリ
ペプチドに、対象の物質を結合させるための自由空間を
提供するポリグリシンつなぎ鎖をコードするＧＧＧに富
む領域、及び（３）適当な制限部位を含み、結果として
のＲＮＡ二次構造はｍＲＮＡから脱離するリボソームの
トランスロケーションを妨げうる。このポリグリシン領
域はグリシンに関する２０個のコドンを含んで成り；ほ
とんどのグリシンコドンは隣り合うＧＧＧトリプレット
であり、これは全ての解読枠においてグリシンをコード
する。しかしながら、いくつかのグリシンコドンはＤＮ
Ａ鎖を適当な記録体（register）に保つためのＧＧＴ又
はＧＧＡである。ＢａｍＨＩについての制限部位（GGAT
CC）及びＮｏｔＩについてのそれ（GCGGCCGC）はこの遺
伝子の３′末端の非常に近くに置くように選んだ；ｍＲ
ＮＡにおいてこれらの配列はヘアピンループを形成する
ものと予測される。ＮｏｔＩ配列による第２鎖の自己プ
ライミング（ヘアピンループの）を防止するため、３′
末端にＡＡＡＡを付加した。従って３′領域は（ＧＧＧ
又はＧＧＴ／Ａ）２０の一般配列、それに続くGGATCCGC
GGCCGCAAAAを有す。この領域に特異的な配列を以下に挙
げる。
【００６３】セミランダム配列は、完全に詳細した５′
非翻訳領域及び３′領域セグメントと塩基対合並びにリ
ゲーションを受ける既知の５′及び３′末端により合成
した。この目的を成し遂げるため、このセミランダム遺
伝子を、５′非翻訳領域の相補鎖上のオクタマーCCATGG
TGと塩基対合しうる５′CACCATG G を伴って合成せしめ
た。開始（最初の）コドンＡＴＧはセミランダム配列の
翻訳のために不可欠である。その後のＧは第２のコドン
の第１位であり、そしてこれはＮｃｏＩ部位をこの遺伝
子の前端に保存するために不変である。この第２コドン
の残り及びそれに続く２８個のコドンはナンセンストリ
プレットを減らすために最初に説明した法則に従って合
成する。即ち、第１のコドン位置において、等モル量の
Ｃ，Ａ及びＧを用いるが、利用するＴの量は半分のみに
する。第２のコドン位置において、Ａの量をその他の三
種の塩基のレベルの半分に減らす。第３のコドン位置に
おいて、Ｇ及びＣのみを等モル量において用いる。
非翻訳領域及び３′領域セグメントと塩基対合並びにリ
ゲーションを受ける既知の５′及び３′末端により合成
した。この目的を成し遂げるため、このセミランダム遺
伝子を、５′非翻訳領域の相補鎖上のオクタマーCCATGG
TGと塩基対合しうる５′CACCATG G を伴って合成せしめ
た。開始（最初の）コドンＡＴＧはセミランダム配列の
翻訳のために不可欠である。その後のＧは第２のコドン
の第１位であり、そしてこれはＮｃｏＩ部位をこの遺伝
子の前端に保存するために不変である。この第２コドン
の残り及びそれに続く２８個のコドンはナンセンストリ
プレットを減らすために最初に説明した法則に従って合
成する。即ち、第１のコドン位置において、等モル量の
Ｃ，Ａ及びＧを用いるが、利用するＴの量は半分のみに
する。第２のコドン位置において、Ａの量をその他の三
種の塩基のレベルの半分に減らす。第３のコドン位置に
おいて、Ｇ及びＣのみを等モル量において用いる。
【００６４】コドン３０を合成せしめた後、GGTGGGGGを
付加する。この配列は２個のグリシン残基をコードし、
そして３′領域のセミランダム配列であってその反応の
鎖に相補性のCCCCCACC突出しを有す配列をリゲートせし
めるために用いる。この合成の結果物は、事実上３０個
のアミノ酸ポリペプチドをコードする配列（メチオニン
より始まる）であり、そしてポリグリシンつなぎ鎖を有
す。このトリプレットの鎖に終止コドンのない確率はお
よそ８０％である。逐次の翻訳の際に部分精製した酵母
チロシン挿入ＵＡＧサプレッサーｔＲＮＡを用いること
により（Pelham、前記、1978）、９０％のセミランダム
配列が全長ポリペプチドをコードするものと予測され
る。
付加する。この配列は２個のグリシン残基をコードし、
そして３′領域のセミランダム配列であってその反応の
鎖に相補性のCCCCCACC突出しを有す配列をリゲートせし
めるために用いる。この合成の結果物は、事実上３０個
のアミノ酸ポリペプチドをコードする配列（メチオニン
より始まる）であり、そしてポリグリシンつなぎ鎖を有
す。このトリプレットの鎖に終止コドンのない確率はお
よそ８０％である。逐次の翻訳の際に部分精製した酵母
チロシン挿入ＵＡＧサプレッサーｔＲＮＡを用いること
により（Pelham、前記、1978）、９０％のセミランダム
配列が全長ポリペプチドをコードするものと予測され
る。
【００６５】合成のための特定のオリゴヌクレオチドを
以下に挙げる： Ｉ．Ｔ７プロモーター及び「グロビン」リーダー（遺伝
子合成及びＰＣＲのため）： ５′TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCACTTCTGATCCAGTCCGACTG
AGAAGGAAC ３′−OHII．抗−Ｔ７プロモーター及び「グ
ロビン」リーダー（遺伝子合成のため）： ５′CCATGGTGGTTCCTTCTCAGTCGGACTGGATCAGAAGCTCTCCCTA
TAGTGAGTCGTATTA ３′−OH（５′は、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼによりリン酸化） III ．セミランダム遺伝子（遺伝子合成のため）： ５′CACCATGG…前記のセミランダム…GGTGGGGG３′−OH
（５′はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸
化） IV．ポリグリシン及び３′制限部位（遺伝子合成のた
め）： ５′TGGGGGTGGTGGGGGGGGGGGGGGAGGAGGGGGGGGGGGAGGGGGA
GGTGGTGGATCCGCGGCCGCAAAA３′−OH（５′は、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化） Ｖ．抗−ポリ−グリシン及び３′部位（遺伝子合成のた
め）： ５′TTTTGCGGCCGCGGATCCACCACCTCCCCCTCCCCCCCCCCCTCCT
CCCCCCCCCCCCCCACCACCCCCACCCCCACC３′−OH VI．抗−ポリ−グリシン及び３′部位（ｃＤＮＡ合成及
びＰＣＲのため） ５′TTTTGCGGCCGCGGATCCACCACCTCCC３′−OH 配列Ｉ及びIIを等モル量において標準ＴＥ緩衝液中に混
合し、そして６５℃で５〜１０分間加熱せしめる。相補
性の配列（５′非翻訳領域を含んで成る）を１時間又は
それより長く５０°〜６０℃でアニール化させ、室温迄
ゆっくり冷却せしめ、そしてこれらをその後０°〜４℃
で保存した。配列IV及びＶを、二本鎖３′領域の形成の
ために同様に処理した。この二重鎖はそれぞれ８個の塩
基の一本鎖突出し配列を有し、これは配列III の既知の
末端と相補する。
以下に挙げる： Ｉ．Ｔ７プロモーター及び「グロビン」リーダー（遺伝
子合成及びＰＣＲのため）： ５′TAATACGACTCACTATAGGGAGAGCACTTCTGATCCAGTCCGACTG
AGAAGGAAC ３′−OHII．抗−Ｔ７プロモーター及び「グ
ロビン」リーダー（遺伝子合成のため）： ５′CCATGGTGGTTCCTTCTCAGTCGGACTGGATCAGAAGCTCTCCCTA
TAGTGAGTCGTATTA ３′−OH（５′は、Ｔ４ポリヌクレオ
チドキナーゼによりリン酸化） III ．セミランダム遺伝子（遺伝子合成のため）： ５′CACCATGG…前記のセミランダム…GGTGGGGG３′−OH
（５′はＴ４ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸
化） IV．ポリグリシン及び３′制限部位（遺伝子合成のた
め）： ５′TGGGGGTGGTGGGGGGGGGGGGGGAGGAGGGGGGGGGGGAGGGGGA
GGTGGTGGATCCGCGGCCGCAAAA３′−OH（５′は、Ｔ４ポリ
ヌクレオチドキナーゼによりリン酸化） Ｖ．抗−ポリ−グリシン及び３′部位（遺伝子合成のた
め）： ５′TTTTGCGGCCGCGGATCCACCACCTCCCCCTCCCCCCCCCCCTCCT
CCCCCCCCCCCCCCACCACCCCCACCCCCACC３′−OH VI．抗−ポリ−グリシン及び３′部位（ｃＤＮＡ合成及
びＰＣＲのため） ５′TTTTGCGGCCGCGGATCCACCACCTCCC３′−OH 配列Ｉ及びIIを等モル量において標準ＴＥ緩衝液中に混
合し、そして６５℃で５〜１０分間加熱せしめる。相補
性の配列（５′非翻訳領域を含んで成る）を１時間又は
それより長く５０°〜６０℃でアニール化させ、室温迄
ゆっくり冷却せしめ、そしてこれらをその後０°〜４℃
で保存した。配列IV及びＶを、二本鎖３′領域の形成の
ために同様に処理した。この二重鎖はそれぞれ８個の塩
基の一本鎖突出し配列を有し、これは配列III の既知の
末端と相補する。
【００６６】等モル量のＩ／II二本鎖、IV／Ｖ二本鎖及
びセミランダム配列III をＴ４ ＤＮＡリガーゲによ
り、リガーゼ緩衝液中で１３°〜１５℃にて一夜リゲー
トせしめた。所望のリゲーション生成物を選別するため
にこのリゲーション混合物を１．５％のアガロースゲル
上で泳動させ、これはおよそ２００塩基対であった（も
し完全に二本鎖であるなら２３３bpであるがそうではな
かった）。この「２００bp」ＤＮＡバンドをＮＡ４５紙
（Ｓ＆Ｓ）によりゲル精製するか又は任意の複数のプロ
トコールにより精製した。全量２．５μｇ（約１０13個
のＤＮＡ分子を示す）又はそれより多くが所望される。
びセミランダム配列III をＴ４ ＤＮＡリガーゲによ
り、リガーゼ緩衝液中で１３°〜１５℃にて一夜リゲー
トせしめた。所望のリゲーション生成物を選別するため
にこのリゲーション混合物を１．５％のアガロースゲル
上で泳動させ、これはおよそ２００塩基対であった（も
し完全に二本鎖であるなら２３３bpであるがそうではな
かった）。この「２００bp」ＤＮＡバンドをＮＡ４５紙
（Ｓ＆Ｓ）によりゲル精製するか又は任意の複数のプロ
トコールにより精製した。全量２．５μｇ（約１０13個
のＤＮＡ分子を示す）又はそれより多くが所望される。
【００６７】新規遺伝子の完全二本鎖合成がＤＮＡポリ
メラーゼ、クレノウにより、標準方法によって成し遂げ
られる。この二本鎖３′領域はセミランダム配列の「第
２鎖」の合成のためのプライマーを提供する。新しく合
成されたＤＮＡを配列IIに連結させるためにＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼが利用され、これによってこの第２鎖におけ
るニックは補完される。このＤＮＡライブラリーをフェ
ノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿さ
せる。
メラーゼ、クレノウにより、標準方法によって成し遂げ
られる。この二本鎖３′領域はセミランダム配列の「第
２鎖」の合成のためのプライマーを提供する。新しく合
成されたＤＮＡを配列IIに連結させるためにＴ４ ＤＮ
Ａリガーゼが利用され、これによってこの第２鎖におけ
るニックは補完される。このＤＮＡライブラリーをフェ
ノール／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿さ
せる。
【００６８】完全に二本鎖となったＤＮＡ分子１０μｇ
は４×１０13の配列多様性を有す。翻訳可能なｍＲＮＡ
を得るために、次にこのライブラリーをＴ７ ＲＮＡポ
リメラーゼによって転写する。しかしながら、ＤＮＡコ
ピーを作らない限り、各転写によってこのＤＮＡライブ
ラリーは消費される。このＤＮＡライブラリーを複製さ
せるため、２００−μｌ反応におけるＰＣＲ増幅のため
に１００ngのこのアリコートを５００−μｌの試験管そ
れぞれに分配した。PCR Technology、頁１８〜１９（Er
lich、前記、1989）に従い、２００−μｌ ＰＣＲ反応
それぞれは、各アリコートにおいて約５．２μｇのＤＮ
Ａ、又は約５０倍のＤＮＡの二本鎖を生成する。このア
リコートをプールした。プールしたサンプルは各セミラ
ンダム配列のコピーを平均５０個含み、従ってＴ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼによる各翻訳についての多様性の大い
なる損失を伴わずに繰り返し利用されうる（例えば、５
０回）。もしこのライブラリーがＰＣＲにより複製され
る場合、前記のクレノウ補完及びリゲーション段階は不
必要となり、なぜならＴａｑポリメラーゼはギャップ及
びニック−トランスレーションＤＮＡにおける補完が可
能であるからである（D.H. Gelfand, PCR Workshop, So
ciety of Industrial Microbiology Meeting, Seattle,
Wash., 1989) 。ニックトランスレーションの後、この
遺伝子は二本鎖となり、そしてＰＣＲ増幅させることが
可能となる。
は４×１０13の配列多様性を有す。翻訳可能なｍＲＮＡ
を得るために、次にこのライブラリーをＴ７ ＲＮＡポ
リメラーゼによって転写する。しかしながら、ＤＮＡコ
ピーを作らない限り、各転写によってこのＤＮＡライブ
ラリーは消費される。このＤＮＡライブラリーを複製さ
せるため、２００−μｌ反応におけるＰＣＲ増幅のため
に１００ngのこのアリコートを５００−μｌの試験管そ
れぞれに分配した。PCR Technology、頁１８〜１９（Er
lich、前記、1989）に従い、２００−μｌ ＰＣＲ反応
それぞれは、各アリコートにおいて約５．２μｇのＤＮ
Ａ、又は約５０倍のＤＮＡの二本鎖を生成する。このア
リコートをプールした。プールしたサンプルは各セミラ
ンダム配列のコピーを平均５０個含み、従ってＴ７ Ｒ
ＮＡポリメラーゼによる各翻訳についての多様性の大い
なる損失を伴わずに繰り返し利用されうる（例えば、５
０回）。もしこのライブラリーがＰＣＲにより複製され
る場合、前記のクレノウ補完及びリゲーション段階は不
必要となり、なぜならＴａｑポリメラーゼはギャップ及
びニック−トランスレーションＤＮＡにおける補完が可
能であるからである（D.H. Gelfand, PCR Workshop, So
ciety of Industrial Microbiology Meeting, Seattle,
Wash., 1989) 。ニックトランスレーションの後、この
遺伝子は二本鎖となり、そしてＰＣＲ増幅させることが
可能となる。
【００６９】ＤＮＡライブラリーのＰＣＲ増幅のための
オリゴヌクレオチドプライマーの例は、配列Ｉ及びVIに
おいて前記した。一般に、２５〜３０塩基のオリゴヌク
レオチドをＰＣＲ増幅のために用いる；しかしながら、
より長いプライマーが利用されうる。これらのプライマ
ーは有意な同一性又は相補性３′末端を分ち合わないこ
とが重要である。配列Ｉ及びVIは相補性であり末端を有
し、そして広範囲にわたる明らかに同一性の領域を有さ
ない。
オリゴヌクレオチドプライマーの例は、配列Ｉ及びVIに
おいて前記した。一般に、２５〜３０塩基のオリゴヌク
レオチドをＰＣＲ増幅のために用いる；しかしながら、
より長いプライマーが利用されうる。これらのプライマ
ーは有意な同一性又は相補性３′末端を分ち合わないこ
とが重要である。配列Ｉ及びVIは相補性であり末端を有
し、そして広範囲にわたる明らかに同一性の領域を有さ
ない。
【００７０】更に、これら新規遺伝子配列の翻訳後のｍ
ＲＮＡはＴ７プロモーター配列を欠損する。配列VIは第
１鎖ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして利用され
る。この方法において、翻訳のその後のラウンドは選ば
れた新規遺伝子配列において可能である。ＰＣＲ増幅は
もし得られるｃＤＮＡが比較的微量である場合に必要と
なりうる。
ＲＮＡはＴ７プロモーター配列を欠損する。配列VIは第
１鎖ｃＤＮＡ合成のためのプライマーとして利用され
る。この方法において、翻訳のその後のラウンドは選ば
れた新規遺伝子配列において可能である。ＰＣＲ増幅は
もし得られるｃＤＮＡが比較的微量である場合に必要と
なりうる。
【００７１】実施例２ 新規遺伝子の転写 実施例１に詳細のＤＮＡライブラリー（又はそれらの配
列の代表的な部分）をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより
転写せしめた。このＤＮＡ ２．５μｇはほぼ１０13種
のポリペプチドをコードする。このＤＮＡはストラタジ
ーンのｍＣＡＰ（商標）キットによって転写の際にキャ
ップする（製造者の仕様書に従って）。約５〜１０μｇ
のｍＲＮＡが期待される。一般にＴ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼにより、このレベルのほぼ１０倍のＲＮＡが合成さ
れる；しかしながら、キャッピング反応のための条件は
この場合においてｍＲＮＡの製造を制限する。このＤＮ
Ａを、このキットに付いているＤＮａｓｅＩにより除去
した。キャッピングせしめたＲＮＡをフェノール／クロ
ロホルム抽出し、そしてエタノールにより沈殿させた。
このＲＮＡを１０μｌのＴＥに再懸濁せしめ、そして０
°〜４℃で保存した。
列の代表的な部分）をＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより
転写せしめた。このＤＮＡ ２．５μｇはほぼ１０13種
のポリペプチドをコードする。このＤＮＡはストラタジ
ーンのｍＣＡＰ（商標）キットによって転写の際にキャ
ップする（製造者の仕様書に従って）。約５〜１０μｇ
のｍＲＮＡが期待される。一般にＴ７ ＲＮＡポリメラ
ーゼにより、このレベルのほぼ１０倍のＲＮＡが合成さ
れる；しかしながら、キャッピング反応のための条件は
この場合においてｍＲＮＡの製造を制限する。このＤＮ
Ａを、このキットに付いているＤＮａｓｅＩにより除去
した。キャッピングせしめたＲＮＡをフェノール／クロ
ロホルム抽出し、そしてエタノールにより沈殿させた。
このＲＮＡを１０μｌのＴＥに再懸濁せしめ、そして０
°〜４℃で保存した。
【００７２】実施例３ 新規遺伝子の翻訳 キャップせしめたｍＲＮＡをベーリンガーマンハイムバ
イオケミカル社のウサギ網状赤血球キットにより、２０
種全てのアミノ酸をそれぞれ３１２．５μmol／ｌにて
翻訳した。実施例２からのキャッピング化ｍＲＮＡを各
反応液に、反応液当り０．５μｇにて加え、そしてこの
製造者のプロトコールに従って処理せしめた。３０℃に
て約６０分後、シクロヘキシミドを最終濃度１μｇ／ml
にて加えた。ＭｇＣｌ2 を５mMとなるように調整し、そ
してヘパリンを０．２mg／mlとなる迄加えた。この反応
液をプールし、そしてLynch （前記、1987）に従い、不
連続スクロース勾配にかけた。このポリソームを−７０
℃で凍結せしめるか、又は直ちに使用した。
イオケミカル社のウサギ網状赤血球キットにより、２０
種全てのアミノ酸をそれぞれ３１２．５μmol／ｌにて
翻訳した。実施例２からのキャッピング化ｍＲＮＡを各
反応液に、反応液当り０．５μｇにて加え、そしてこの
製造者のプロトコールに従って処理せしめた。３０℃に
て約６０分後、シクロヘキシミドを最終濃度１μｇ／ml
にて加えた。ＭｇＣｌ2 を５mMとなるように調整し、そ
してヘパリンを０．２mg／mlとなる迄加えた。この反応
液をプールし、そしてLynch （前記、1987）に従い、不
連続スクロース勾配にかけた。このポリソームを−７０
℃で凍結せしめるか、又は直ちに使用した。
【００７３】実施例４ 対象の物質としての抗体の固定化 新規の結合性ペプチドについて選別するために抗体が利
用されうる。抗体の超可変／可変領域に結合するペプチ
ド（「抗−イディオタイプペプチド」）は、イムノゲン
として利用されるオリジナルエピトープのように働く。
この新規抗−イディオタイプペプチドはオリジナルエピ
トープを擬態するため、これらのペプチドはワクチンと
して有用である、及び／又は生物学的活性を表現し、あ
たかもこの抗−イディオタイプ抗体は生物学的（時折触
媒）活性を有すものと示される。
用されうる。抗体の超可変／可変領域に結合するペプチ
ド（「抗−イディオタイプペプチド」）は、イムノゲン
として利用されるオリジナルエピトープのように働く。
この新規抗−イディオタイプペプチドはオリジナルエピ
トープを擬態するため、これらのペプチドはワクチンと
して有用である、及び／又は生物学的活性を表現し、あ
たかもこの抗−イディオタイプ抗体は生物学的（時折触
媒）活性を有すものと示される。
【００７４】有用な抗体の例は抗−フィブロネクチン、
抗−神経成長因子、抗−ＣＤ４及び抗−腫瘍壊死因子で
あり、これらは全てベーリンガーマンハイムバイオケミ
カル社より入手できる。一般に、リセプター分子、成長
因子、表層抗原及び生物学活性ペプチド、並びに毒素及
び疾病のための中和抗体が、抗−イディオタイプ結合性
ペプチドであって、相乗もしくは拮抗特性を有すか又は
ワクチンとして働くものを単離せしめるためのよい候補
である。
抗−神経成長因子、抗−ＣＤ４及び抗−腫瘍壊死因子で
あり、これらは全てベーリンガーマンハイムバイオケミ
カル社より入手できる。一般に、リセプター分子、成長
因子、表層抗原及び生物学活性ペプチド、並びに毒素及
び疾病のための中和抗体が、抗−イディオタイプ結合性
ペプチドであって、相乗もしくは拮抗特性を有すか又は
ワクチンとして働くものを単離せしめるためのよい候補
である。
【００７５】これらの抗体をミリポア（株）由来のイモ
ビロン（商標）ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリ
ド）膜に、Pluskal ら（BioTechniques 4 : 272-283, 1
986 ）に従って固定した。例えば、抗−フィブロネクチ
ン抗体（クローン３Ｅ３由来；ベーリンガーマンハイム
バイオケミカル社）を、１００％のメタノールで「湿潤
化」させた０．５cm×０．５cmのＰＶＤＦ四辺形（squa
re）上に吸収させ、そして１０mMのトリス緩衝液pH７．
４中の０．９％（Ｗ／Ｖ）のＮａＣｌ（食塩水緩衝液）
により２回洗浄する。必要な抗体の量は所望する抗−イ
ディオタイプペプチドの結合パラメーターに依存する；
イモビロンＰＶＤＦはＩｇＧを１７２μｇ／cm2 結合せ
しめると報告されている。便宜上、食塩緩衝液中の抗−
フィブロネクチンＩｇＧ１ １μｇをＰＶＤＦ四辺形上
に、室温で少なくとも２時間インキュベートすることに
よって吸収させた。次にこのＰＶＤＦを食塩緩衝液で２
回洗浄した。次いでこの膜を、食塩緩衝液中に５％（Ｗ
／Ｖ）のゼラチンを含む「ブロッキング溶液」により、
室温にて少なくとも２時間インキュベートし、これによ
りゼラチンはＰＶＤＦの未結合化部位に吸着される。次
いでこの膜を食塩緩衝液中の０．１％のゼラチンにより
２回洗浄した。同様の処理を１０μｇの抗−ケラチン抗
体（クローンＡＥ１由来、ベーリンガーマンハイムバイ
オケミカル社）によって行い、これは下記のコントロー
ルＩｇＧ１である。
ビロン（商標）ＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリ
ド）膜に、Pluskal ら（BioTechniques 4 : 272-283, 1
986 ）に従って固定した。例えば、抗−フィブロネクチ
ン抗体（クローン３Ｅ３由来；ベーリンガーマンハイム
バイオケミカル社）を、１００％のメタノールで「湿潤
化」させた０．５cm×０．５cmのＰＶＤＦ四辺形（squa
re）上に吸収させ、そして１０mMのトリス緩衝液pH７．
４中の０．９％（Ｗ／Ｖ）のＮａＣｌ（食塩水緩衝液）
により２回洗浄する。必要な抗体の量は所望する抗−イ
ディオタイプペプチドの結合パラメーターに依存する；
イモビロンＰＶＤＦはＩｇＧを１７２μｇ／cm2 結合せ
しめると報告されている。便宜上、食塩緩衝液中の抗−
フィブロネクチンＩｇＧ１ １μｇをＰＶＤＦ四辺形上
に、室温で少なくとも２時間インキュベートすることに
よって吸収させた。次にこのＰＶＤＦを食塩緩衝液で２
回洗浄した。次いでこの膜を、食塩緩衝液中に５％（Ｗ
／Ｖ）のゼラチンを含む「ブロッキング溶液」により、
室温にて少なくとも２時間インキュベートし、これによ
りゼラチンはＰＶＤＦの未結合化部位に吸着される。次
いでこの膜を食塩緩衝液中の０．１％のゼラチンにより
２回洗浄した。同様の処理を１０μｇの抗−ケラチン抗
体（クローンＡＥ１由来、ベーリンガーマンハイムバイ
オケミカル社）によって行い、これは下記のコントロー
ルＩｇＧ１である。
【００７６】実施例５ 抗体に結合性のポリソーム 形成期セミランダムペプチドを有すポリソームを１mlの
反応液においてインキュベートした。それぞれはＰＳ緩
衝液（０．９％のＮａＣｌ，１０mMのトリスpH７．４、
１％のゼラチン、１５mMのＭｇＣｌ2 、０．２mg／mlの
ヘパリン及び１μｇ／mlのシクロヘキシミド）並びに実
施例４に記載の１０μｇの抗−ケラチンＩｇＧ１を有す
ＰＶＤＦ四辺形を含んだ。この予備吸着段階は緩かな撹
拌を伴って０°〜４℃にて４時間にわたり行い、ゼラチ
ン及びＩｇＧ１と非特異的に結合するポリソームを排除
した。この抗−ケラチンＰＶＤＦ四辺形を宝石用ピンセ
ットで取り出し、そして抗−フィブロネクチンＰＶＤＦ
四辺形と交換した。この混合物を、同一条件のもとで更
に４時間インキュベートし、特異的なポリソームを抗−
フィブロネクチン抗体の可変／超可変領域に結合させ
た。この抗−フィブロネクチンＰＶＤＦ四辺形を取り出
し、そしてそれらを新鮮なＰＳ緩衝液に系列的に３回移
し換えることにより洗浄した。
反応液においてインキュベートした。それぞれはＰＳ緩
衝液（０．９％のＮａＣｌ，１０mMのトリスpH７．４、
１％のゼラチン、１５mMのＭｇＣｌ2 、０．２mg／mlの
ヘパリン及び１μｇ／mlのシクロヘキシミド）並びに実
施例４に記載の１０μｇの抗−ケラチンＩｇＧ１を有す
ＰＶＤＦ四辺形を含んだ。この予備吸着段階は緩かな撹
拌を伴って０°〜４℃にて４時間にわたり行い、ゼラチ
ン及びＩｇＧ１と非特異的に結合するポリソームを排除
した。この抗−ケラチンＰＶＤＦ四辺形を宝石用ピンセ
ットで取り出し、そして抗−フィブロネクチンＰＶＤＦ
四辺形と交換した。この混合物を、同一条件のもとで更
に４時間インキュベートし、特異的なポリソームを抗−
フィブロネクチン抗体の可変／超可変領域に結合させ
た。この抗−フィブロネクチンＰＶＤＦ四辺形を取り出
し、そしてそれらを新鮮なＰＳ緩衝液に系列的に３回移
し換えることにより洗浄した。
【００７７】実施例６ ポリソーム由来の抗−イディオタイプペプチドをコード
する新規遺伝子の回収 洗浄せしめた抗体−結合ポリソームを保有するＰＶＤＦ
膜を、０．１mMのＥＤＴＡ １００μｌを含む試験管に
移し、そして室置で５〜１０分間ゆっくり振騰させてポ
リソームを解離及びｍＲＮＡを遊離させた。このＰＶＤ
Ｆを取り出し、０．１mMのＥＤＴＡの新鮮な試験管に移
し、そして０°〜４℃で一夜又はそれ以上長く（予備品
として）保存した。この第１のＥＤＴＡ処理から遊離し
たｍＲＮＡを逆転写せしめた；そして得られるｃＤＮＡ
を若干の改良を伴ってPCR Technology（前記、1989）、
頁９１に従って増幅せしめた。ｃＤＮＡをプライムする
ためにランダムヘキサマーを用いる代りに、既知の３′
領域に相補する配列（例えば下流プライマーとしての、
先に挙げた配列VI）をｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ反応の両
方のために用いた。この逆転写酵素段階は、適当なその
他の試薬の相対量を有すＰＣＲ緩衝液１００μｌ（２０
μｌ反応の代りに）中で行った。逆転写酵素反応後、こ
の混合物を２０μｌのアリコートに分けた。そして各ア
リコートを、PCR Technologyに詳細の通りに、配列Ｉ又
は類似のＤＮＡ上流プライマーを用いて増幅させた。Ｐ
ＣＲ増幅後、５つのアリコートをプールし、フェノール
／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿させた。
このｃＤＮＡを次にＴＥに再懸濁させ、そして０°〜４
℃で保存した。
する新規遺伝子の回収 洗浄せしめた抗体−結合ポリソームを保有するＰＶＤＦ
膜を、０．１mMのＥＤＴＡ １００μｌを含む試験管に
移し、そして室置で５〜１０分間ゆっくり振騰させてポ
リソームを解離及びｍＲＮＡを遊離させた。このＰＶＤ
Ｆを取り出し、０．１mMのＥＤＴＡの新鮮な試験管に移
し、そして０°〜４℃で一夜又はそれ以上長く（予備品
として）保存した。この第１のＥＤＴＡ処理から遊離し
たｍＲＮＡを逆転写せしめた；そして得られるｃＤＮＡ
を若干の改良を伴ってPCR Technology（前記、1989）、
頁９１に従って増幅せしめた。ｃＤＮＡをプライムする
ためにランダムヘキサマーを用いる代りに、既知の３′
領域に相補する配列（例えば下流プライマーとしての、
先に挙げた配列VI）をｃＤＮＡ合成及びＰＣＲ反応の両
方のために用いた。この逆転写酵素段階は、適当なその
他の試薬の相対量を有すＰＣＲ緩衝液１００μｌ（２０
μｌ反応の代りに）中で行った。逆転写酵素反応後、こ
の混合物を２０μｌのアリコートに分けた。そして各ア
リコートを、PCR Technologyに詳細の通りに、配列Ｉ又
は類似のＤＮＡ上流プライマーを用いて増幅させた。Ｐ
ＣＲ増幅後、５つのアリコートをプールし、フェノール
／クロロホルム抽出し、そしてエタノール沈殿させた。
このｃＤＮＡを次にＴＥに再懸濁させ、そして０°〜４
℃で保存した。
【００７８】選別したＤＮＡをＴ７ ＲＮＡポリメラー
ゼにより転写し、そして前記した網状赤血球系において
翻訳させた。この場合において、所望する配列はオリジ
ナルのＤＮＡライブラリーと比較して大いに増幅され
る。プログラムされたワークステーションにより大いに
補助されながらのこのサイクルを繰り返すことにより、
所望する新規遺伝子は常用のクローニング及び発現方法
が実施できるレベル迄濃縮される。更に、遺伝子の低ポ
アゾン分布への希釈により、単独の新規遺伝子が単離、
増幅、転写及びこの遺伝子生成物の特異的な結合能力を
示すよう翻訳されうる。結合性が示されたなら、この単
離遺伝子及びポリペプチドを同定のためにシーケンス化
する。
ゼにより転写し、そして前記した網状赤血球系において
翻訳させた。この場合において、所望する配列はオリジ
ナルのＤＮＡライブラリーと比較して大いに増幅され
る。プログラムされたワークステーションにより大いに
補助されながらのこのサイクルを繰り返すことにより、
所望する新規遺伝子は常用のクローニング及び発現方法
が実施できるレベル迄濃縮される。更に、遺伝子の低ポ
アゾン分布への希釈により、単独の新規遺伝子が単離、
増幅、転写及びこの遺伝子生成物の特異的な結合能力を
示すよう翻訳されうる。結合性が示されたなら、この単
離遺伝子及びポリペプチドを同定のためにシーケンス化
する。
【００７９】この新規なる結合ペプチドの配列がわかっ
た後、本明細書に記載の通り、このペプチドの操作及び
大量合成のために多数の方法が存在する。実施例７ 結合性ペプチドに関する結合アッセイ 結合性ペプチドをコードする新規遺伝子を選別後、増幅
せしめた回収ｃＤＮＡのプールを遺伝子の存在について
アッセイした。ＩＤ配列をセミランダムＤＮＡ配列と一
緒に発現させるために意識的に含ませている場合、ペプ
チドの既知の部分に対するＥＬＩＳＡ又はその他の免疫
学的アッセイをペプチドの新規部分の対象の物質への結
合性の検出のために用いる。しかしながら、ＩＤ配列が
ない場合及び／又は結合特異性の確認が所望される場
合、ペプチドに対する競合アッセイが行なわれる。競合
ＥＬＩＳＡ試験を含む競合アッセイは、本発明により作
られた種々のｃＤＮＡプールにおける結合性配列の存在
についてモニターするために用いる。
た後、本明細書に記載の通り、このペプチドの操作及び
大量合成のために多数の方法が存在する。実施例７ 結合性ペプチドに関する結合アッセイ 結合性ペプチドをコードする新規遺伝子を選別後、増幅
せしめた回収ｃＤＮＡのプールを遺伝子の存在について
アッセイした。ＩＤ配列をセミランダムＤＮＡ配列と一
緒に発現させるために意識的に含ませている場合、ペプ
チドの既知の部分に対するＥＬＩＳＡ又はその他の免疫
学的アッセイをペプチドの新規部分の対象の物質への結
合性の検出のために用いる。しかしながら、ＩＤ配列が
ない場合及び／又は結合特異性の確認が所望される場
合、ペプチドに対する競合アッセイが行なわれる。競合
ＥＬＩＳＡ試験を含む競合アッセイは、本発明により作
られた種々のｃＤＮＡプールにおける結合性配列の存在
についてモニターするために用いる。
【００８０】１例は、抗−シュードモナス（Pseudomona
s ）外毒素（抗−ＰＥ）抗体に結合するペプチドをコー
ド化する遺伝子に関するｃＤＮＡプールのスクリーニン
グである。抗−ＰＥ抗体に結合性のポリソームについて
の２ラウンドの選別後、得られるｃＤＮＡプールの異な
るアリコートを標準的な条件のもとで、約２００ngのＤ
ＮＡから出発して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（３０ユ
ニット）を有す２００−μｌ反応においてそれぞれ転写
せしめた。このｍＲＮＡ生成物をフェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール抽出し、そして酢酸ナトリ
ウム及びエタノールにより−２０℃で沈殿させた。この
沈殿物をそれぞれ遠心し、そして１６μｌの蒸留水に再
懸濁させ、ヌクレアーゼを除去するためにジエチルプロ
カーボネートにより処理せしめた。
s ）外毒素（抗−ＰＥ）抗体に結合するペプチドをコー
ド化する遺伝子に関するｃＤＮＡプールのスクリーニン
グである。抗−ＰＥ抗体に結合性のポリソームについて
の２ラウンドの選別後、得られるｃＤＮＡプールの異な
るアリコートを標準的な条件のもとで、約２００ngのＤ
ＮＡから出発して、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（３０ユ
ニット）を有す２００−μｌ反応においてそれぞれ転写
せしめた。このｍＲＮＡ生成物をフェノール／クロロホ
ルム／イソアミルアルコール抽出し、そして酢酸ナトリ
ウム及びエタノールにより−２０℃で沈殿させた。この
沈殿物をそれぞれ遠心し、そして１６μｌの蒸留水に再
懸濁させ、ヌクレアーゼを除去するためにジエチルプロ
カーボネートにより処理せしめた。
【００８１】再懸濁せしめたｍＲＮＡを６５℃で５分間
加熱し、その後氷の上に置いた。このｍＲＮＡを小麦胚
芽キット（ベーリンガーマンハイムバイオケミカル社）
により、製造者の推奨に従って翻訳した。各ＲＮＡサン
プルを、２５マイクロキューリーの３５Ｓ−メチオニン
及び０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビターを有す５０μ
ｌの翻訳反応液中において発現させる。この反応を３０
℃で１５〜６０分間行なった。この翻訳の終了時にこの
サンプルをそれぞれ等分した。その半分は競合基質を含
ませずに対象の物質と結合させ、他の半分は過剰量の競
合基質の存在下において対象の物質と結合させるために
用いた。この場合において、この対象の物質は抗−ＰＥ
抗体である。この競合基質は、毒性タンパク質配列に由
来し、抗体に競合することで知られる１４個のアミノ酸
のペプチド（ＰＥペプチドである）。このペプチド配列
は、Val −Glu −Arg −Leu −Leu −Gln −Ala −His
−Arg −Gln −Leu −Glu −Glu −Arg である。Woznia
k ら、Proc. Natl. Acad.Sci., 85 : 8880-8884 (1988)
。
加熱し、その後氷の上に置いた。このｍＲＮＡを小麦胚
芽キット（ベーリンガーマンハイムバイオケミカル社）
により、製造者の推奨に従って翻訳した。各ＲＮＡサン
プルを、２５マイクロキューリーの３５Ｓ−メチオニン
及び０．５μｌのＲＮａｓｅインヒビターを有す５０μ
ｌの翻訳反応液中において発現させる。この反応を３０
℃で１５〜６０分間行なった。この翻訳の終了時にこの
サンプルをそれぞれ等分した。その半分は競合基質を含
ませずに対象の物質と結合させ、他の半分は過剰量の競
合基質の存在下において対象の物質と結合させるために
用いた。この場合において、この対象の物質は抗−ＰＥ
抗体である。この競合基質は、毒性タンパク質配列に由
来し、抗体に競合することで知られる１４個のアミノ酸
のペプチド（ＰＥペプチドである）。このペプチド配列
は、Val −Glu −Arg −Leu −Leu −Gln −Ala −His
−Arg −Gln −Leu −Glu −Glu −Arg である。Woznia
k ら、Proc. Natl. Acad.Sci., 85 : 8880-8884 (1988)
。
【００８２】競合アッセイは９６−穴平底マイクロタイ
ターディッシュ中において氷上で行った。標準１／４イ
ンチホールパンチによりイモビロンＰＶＤＦディスクを
作り、そして“Ａ”と表示したウェルに入れた。５０μ
ｌのメタノールを“Ａ”におけるディスクに加え、この
膜を湿らし且つ殺菌した。このディスクをピンセットに
より、１０mMのＭｇＣｌ2 を含んだ２００μｌの食塩緩
衝液（ＴＳＭ緩衝液）を含むウェル“Ｂ”に移した。こ
のディスクをウェル“Ｃ”であってこれも２００μｌの
ＴＳＭを含むウェルに移すことによって更に洗浄した。
次にこれらを、３μｌの抗−ＰＥ抗体（４．６μｇ／μ
ｌ）を含んだＴＳＭ ２５μｌを含むウェル“Ｄ”に移
した。抗体をゆっくり振騰させながら（プラットホーム
シェーカー上で５０〜１００RPM ）氷上で３時間にわた
りディスクに吸着せしめた。その後、２％の無ヌクレア
ーゼＢＳＡ ７５μｌを“Ｄ”に加え、そして１時間１
００RPM にて吸着させた。
ターディッシュ中において氷上で行った。標準１／４イ
ンチホールパンチによりイモビロンＰＶＤＦディスクを
作り、そして“Ａ”と表示したウェルに入れた。５０μ
ｌのメタノールを“Ａ”におけるディスクに加え、この
膜を湿らし且つ殺菌した。このディスクをピンセットに
より、１０mMのＭｇＣｌ2 を含んだ２００μｌの食塩緩
衝液（ＴＳＭ緩衝液）を含むウェル“Ｂ”に移した。こ
のディスクをウェル“Ｃ”であってこれも２００μｌの
ＴＳＭを含むウェルに移すことによって更に洗浄した。
次にこれらを、３μｌの抗−ＰＥ抗体（４．６μｇ／μ
ｌ）を含んだＴＳＭ ２５μｌを含むウェル“Ｄ”に移
した。抗体をゆっくり振騰させながら（プラットホーム
シェーカー上で５０〜１００RPM ）氷上で３時間にわた
りディスクに吸着せしめた。その後、２％の無ヌクレア
ーゼＢＳＡ ７５μｌを“Ｄ”に加え、そして１時間１
００RPM にて吸着させた。
【００８３】このディスクを０．１％のＢＳＡを含んだ
ＴＳＭ ２００μｌ中で（ウィルス“Ｅ”と“Ｆ”）、
各ウェルにおいて３０分間にわたり２回洗浄し、そして
ペプチド結合のための準備ができた。ウェル“Ｇ”にお
いて、２６μｌのＴＳＭと０．１％のＢＳＡを、前述し
た２５μｌの各翻訳反応液（小麦胚芽系５０μｌの半
分）と混ぜた。半数の各“Ｇ”ウェルに１μｌのＰＥペ
プチド（ＴＳＭ中で１mg／ml）を加え、新規の放射性活
性標識化ペプチドの抗体への結合を競争的に阻害せしめ
た；これらのウェルを「＋ペプチド」と表示した。コン
トロールの“Ｇ”ウェルに１μｌのＴＳＭを加え、そし
てこれらのウェルを「無ペプチド」と表示した。ディス
クを適当な“Ｇ”ウェルに入れ、そしてペプチドをこの
固定化抗体に結合させるために氷上で１００RPM にて３
時間インキュベートせしめた。
ＴＳＭ ２００μｌ中で（ウィルス“Ｅ”と“Ｆ”）、
各ウェルにおいて３０分間にわたり２回洗浄し、そして
ペプチド結合のための準備ができた。ウェル“Ｇ”にお
いて、２６μｌのＴＳＭと０．１％のＢＳＡを、前述し
た２５μｌの各翻訳反応液（小麦胚芽系５０μｌの半
分）と混ぜた。半数の各“Ｇ”ウェルに１μｌのＰＥペ
プチド（ＴＳＭ中で１mg／ml）を加え、新規の放射性活
性標識化ペプチドの抗体への結合を競争的に阻害せしめ
た；これらのウェルを「＋ペプチド」と表示した。コン
トロールの“Ｇ”ウェルに１μｌのＴＳＭを加え、そし
てこれらのウェルを「無ペプチド」と表示した。ディス
クを適当な“Ｇ”ウェルに入れ、そしてペプチドをこの
固定化抗体に結合させるために氷上で１００RPM にて３
時間インキュベートせしめた。
【００８４】結合反応の後、各ディスクを２００μｌの
新鮮ＴＳＭ中で段階的に８回、０℃にて洗浄した。各洗
浄は１０分間のインキュベーションによった。各ディス
クの結合放射性活性はエコシント（Ecoscint）の１mlの
カクテルを有す液体シンチレーションカウンターで測定
した。以下の表は、ポリソームの抗−ＰＥ抗体への結合
に由来する、ｃＤＮＡの種々のアリコートにおける競合
アッセイの結果を示す。
新鮮ＴＳＭ中で段階的に８回、０℃にて洗浄した。各洗
浄は１０分間のインキュベーションによった。各ディス
クの結合放射性活性はエコシント（Ecoscint）の１mlの
カクテルを有す液体シンチレーションカウンターで測定
した。以下の表は、ポリソームの抗−ＰＥ抗体への結合
に由来する、ｃＤＮＡの種々のアリコートにおける競合
アッセイの結果を示す。
【００８５】 サンプル ＣＰＭ ３５Ｓ−ＭＥＴ ＷＥ１＋ペプチド ６９６９ ＷＥ１、無ペプチド ８３３７ ＷＥ２＋ペプチド ６１６３ ＷＥ２、無ペプチド ７６９３ ＷＰ１＋ペプチド ５７９２ ＷＰ１、無ペプチド ６３０３ ＷＰ２＋ペプチド ５８４５ ＷＰ２、無ペプチド ６３９８ 各場合において、競合するＰＥペプチドは無ペプチドコ
ントロールに比べて、選別したｃＤＮＡプールの放射性
活性標識化翻訳生成物の結合量を低めた。この結果は、
抗−ＰＥ抗体に結合性のペプチドをコードする遺伝子配
列の存在を示唆する。これらＤＮＡの単離及び特徴付け
は、個々の遺伝子をプラスミド、例えばｐＵＣ１８、ｐ
ＵＣ１９、ブルースクリプト及びその他の有用なベクタ
ーにクローニングすることによって行なわれる。
ントロールに比べて、選別したｃＤＮＡプールの放射性
活性標識化翻訳生成物の結合量を低めた。この結果は、
抗−ＰＥ抗体に結合性のペプチドをコードする遺伝子配
列の存在を示唆する。これらＤＮＡの単離及び特徴付け
は、個々の遺伝子をプラスミド、例えばｐＵＣ１８、ｐ
ＵＣ１９、ブルースクリプト及びその他の有用なベクタ
ーにクローニングすることによって行なわれる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考）
Claims (13)
- 【請求項１】 ｍＲＮＡライブラリーを提供するため
に、ＲＮＡポリメラーゼ結合性配列、リボソーム結合性
配列及び翻訳開始シグナルを含む５′非翻訳領域と、１
又は複数のセミランダムヌクレオチド配列とを含んで成
るインビトロ発現ユニットを転写又は複製せしめ；ポリ
ペプチド鎖がポリソームに結合していることを維持する
条件のもとで該ｍＲＮＡライブラリーを翻訳せしめ；該
ポリソームを対象のポリペプチドと特異的に反応するこ
とのできる対象の物質に接触せしめ、そして該対象の物
質に特異的に反応するポリソームからｍＲＮＡを単離す
ること、 を含んで成る対象のポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を単離する方法により単離したヌクレオチド配
列を発現させることにより新規ポリペプチドを生産する
ための方法であって、前記翻訳段階の際、前記条件は任
意的に前記ポリソームから前記ポリペプチド鎖を遊離さ
せるものであり、そして更に、 再分により前記接触工程において同定された前記ポリペ
プチドをコードするｍＲＮＡを単離し；対象の遺伝子が
単離できるように転写、翻訳、接触、及び再分による単
離を繰り返し；前記単離した遺伝子からｃＤＮＡを構築
し；そして新規ポリペプチドを生産するために前記該ｃ
ＤＮＡを発現せしめること、 を含んで成る方法。 - 【請求項２】 前記のＲＮＡを再分する段階の後に、前
記の生物学的に活性なポリペプチドに関連する新規遺伝
子配列をポリメラーゼ連鎖反応又はＲＮＡ依存性ＲＮＡ
ポリメラーゼにより増幅せしめる請求項１に記載の方
法。 - 【請求項３】 前記発現ユニットが、開始コドンに位置
する選ばれたアミノ末端同定用ペプチドをコードする配
列又は選ばれたカルボキシ末端同定用ペプチドをコード
する配列を更に含んで成る、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 前記発現ユニットが、制限部位、パリン
ドローム配列、同定用ペプチドをコードする配列、特異
的プライマー依存性ＤＮＡ合成のための配列、ポリＡ+
またはその他ホモポリマーポリヌクレオチド配列より選
ばれた選定の配列の３′領域を更に含んで成る、請求項
１記載の方法。 - 【請求項５】 前記発現ユニットが、インビボでの新規
遺伝子の発現を可能とするために利用される制限部位を
更に含んで成る、請求項１記載の方法。 - 【請求項６】 前記発現ユニットがＴ７，Ｔ３又はＳＰ
６ポリメラーゼのためのプロモーター配列を含む請求項
１記載の方法。 - 【請求項７】 前記のセミランダムヌクレオチド配列が
天然ＤＮＡもしくはｃＤＮＡを、機械的、化学的又は酵
素的にフラグメント化せしめることにより作られる請求
項１記載の方法。 - 【請求項８】 前記のヌクレオチドを化学的に合成する
段階が、（１）実質的に等モル量のＣ，Ａ及びＧ、並び
に該実質的に等モル量の半分量のみのＴを第１コドン位
置において利用し；（２）実質的に等モル量のＣ，Ｔ及
びＧ、並びに該実質的に等モル量の半分量のみのＡを第
２コドン位置において利用し；そして（３）実質的に等
モル量のＣ及びＧ又はＴ及びＧを第３コドン位置におい
て利用することを含んで成る請求項７記載の方法。 - 【請求項９】 前記の翻訳の段階が、ナンセンス抑制ｔ
ＲＮＡの存在下において行なわれる請求項１記載の方
法。 - 【請求項１０】 前記の対象の物質が、表層抗原、リセ
プタータンパク質、毒素、有機ポリマー、中間代謝物、
タンパク質分子の活性部位、ホルモン、抗体、抗体の可
変及び／又は超可変領域、並びに汚染物質より成る群か
ら選ばれる請求項１記載の方法。 - 【請求項１１】 前記ｃＤＮＡを発現せしめる段階が、
ヌクレオチド配列のインビトロ転写及び／もしくは翻
訳、又は遺伝子操作された微生物の中で合成するために
発現ベクターの中にこのヌクレオチド配列をクローニン
グせしめることを含んで成る、請求項１記載の方法。 - 【請求項１２】 ランダム又はセミランダムポリヌクレ
オチド分子のライブラリーから特定の核酸配列を有する
ポリヌクレオチド分子を同定するための方法であって：
無細胞ポリヌクレオチドライブラリーを用意する、ここ
でその個々のメンバーは１又は複数のランダムヌクレオ
チド又はセミランダム配列を含んで成る；結合アッセイ
で、このランダム又はセミランダムポリヌクレオチドラ
イブラリーから特定のポリヌクレオチド分子を選別す
る；そしてこの特定のポリヌクレオチド分子を増幅し、
次いでその核酸配列を決定すること；を含んで成る方
法。 - 【請求項１３】 前記の特定のポリヌクレオチド分子が
ＲＮＡである、請求項１２記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US41735789A | 1989-10-05 | 1989-10-05 | |
| US07/417357 | 1989-10-05 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02514372A Division JP3127158B2 (ja) | 1989-10-05 | 1990-10-04 | 新規の遺伝子及びポリペチドの無細胞合成並びに単離 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001078787A true JP2001078787A (ja) | 2001-03-27 |
Family
ID=23653670
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02514372A Expired - Lifetime JP3127158B2 (ja) | 1989-10-05 | 1990-10-04 | 新規の遺伝子及びポリペチドの無細胞合成並びに単離 |
| JP2000240298A Pending JP2001078787A (ja) | 1989-10-05 | 2000-08-08 | 新規の遺伝子及びポリペプチドの無細胞合成並びに単離 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP02514372A Expired - Lifetime JP3127158B2 (ja) | 1989-10-05 | 1990-10-04 | 新規の遺伝子及びポリペチドの無細胞合成並びに単離 |
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| KR (3) | KR0185192B1 (ja) |
| AT (1) | ATE168416T1 (ja) |
| AU (1) | AU638762B2 (ja) |
| CA (1) | CA2067194C (ja) |
| DE (1) | DE69032483T2 (ja) |
| DK (1) | DK0494955T3 (ja) |
| ES (1) | ES2118066T3 (ja) |
| WO (1) | WO1991005058A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
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| US5747334A (en) * | 1990-02-15 | 1998-05-05 | The University Of North Carolina At Chapel Hill | Random peptide library |
| US5962219A (en) * | 1990-06-11 | 1999-10-05 | Nexstar Pharmaceuticals, Inc. | Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: chemi-selex |
| US5843701A (en) * | 1990-08-02 | 1998-12-01 | Nexstar Pharmaceticals, Inc. | Systematic polypeptide evolution by reverse translation |
| US5795747A (en) * | 1991-04-16 | 1998-08-18 | Evotec Biosystems Gmbh | Process for manufacturing new biopolymers |
| DE4112440C1 (ja) * | 1991-04-16 | 1992-10-22 | Diagen Institut Fuer Molekularbiologische Diagnostik Gmbh, 4000 Duesseldorf, De | |
| AU2313392A (en) * | 1991-08-01 | 1993-03-02 | University Research Corporation | Systematic polypeptide evolution by reverse translation |
| US5783384A (en) * | 1992-01-13 | 1998-07-21 | President And Fellows Of Harvard College | Selection of binding-molecules |
| US5643873A (en) * | 1992-05-06 | 1997-07-01 | Affymax Technologies N.V. | Peptides and compounds that bind selectins including endothelial leukocyte adhesion molecule 1 |
| US5648458A (en) * | 1992-05-06 | 1997-07-15 | Affymax Technologies N.V. | Peptides and compounds that bind to ELAM-1 |
| US5728802A (en) * | 1992-05-06 | 1998-03-17 | Affymax Technologies N.V. | Peptides and compounds that bind selectins including endothelium leukocyte adhesion molecule 1 (ELAM-1) |
| AU4843893A (en) * | 1992-09-02 | 1994-03-29 | Scripps Research Institute, The | Coupled isothermal polynucleotide amplification and translation system |
| AU8124694A (en) * | 1993-10-29 | 1995-05-22 | Affymax Technologies N.V. | In vitro peptide and antibody display libraries |
| US5922545A (en) * | 1993-10-29 | 1999-07-13 | Affymax Technologies N.V. | In vitro peptide and antibody display libraries |
| US5525735A (en) * | 1994-06-22 | 1996-06-11 | Affymax Technologies Nv | Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds |
| US5525734A (en) * | 1994-06-22 | 1996-06-11 | Affymax Technologies N.V. | Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds |
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| EP0789783B1 (en) * | 1994-09-21 | 2002-05-08 | Cytogen Corporation | Antigen binding peptides (abtides) from peptide libraries |
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| US6341256B1 (en) | 1995-03-31 | 2002-01-22 | Curagen Corporation | Consensus configurational bias Monte Carlo method and system for pharmacophore structure determination |
| US20010053523A1 (en) * | 1995-06-02 | 2001-12-20 | M&E Biotech A/S. | Method for identification of biologically active peptides and nucleic acids |
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| US8207093B2 (en) | 1997-01-21 | 2012-06-26 | The General Hospital Corporation | Selection of proteins using RNA-protein fusions |
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