RS62630B9 - Modulatori aktivnosti komplementa - Google Patents

Description

Opis

UPUĆIVANJE NA POVEZANE PRIJAVE

[0001] Ova prijava zahteva prioritet U.S. Privremene prijave patenta br.62/108,772 podnete 28. januara 2015., pod nazivom Modulation of Complement Activity, Međunarodne prijave br. PCT/US2015/035473 podnete 12. juna 2015., pod nazivom Modulation of Complement Activity i U.S. Privremene prijave patenta br.62/185,298 podnete 26. juna 2015., pod nazivom Modulation of Complement Activity.

LISTA SEKVENCI

[0002] Ova prijava sadrži Listu sekvenci koja je elektronski dostavljena u ASCII formatu. Pomenuta ASCII kopija, kreirana 28. januara 2016., naziva se 2011-1007PCT SL.txt i veličine je 125781 bajtova.

OBLAST PRONALASKA

[0003] Ovaj pronalazak odnosi se na jedinjenja, uključujući polipeptide, koja su korisna kao modulatori aktivnosti komplementa i njihovu upotrebu kao terapeutika.

POZADINA PRONALASKA

[0004] Imuni odgovor kičmenjaka sastoji se od komponenata adaptivnog i urođenog imuniteta. Dok je adaptivni imuni odgovor selektivan za određene patogene i sporo reaguje, komponente urođenog imunog odgovora prepoznaju širok opseg patogena i reaguju brzo nakon infekcije. Jedna takva komponenta urođenog imunog odgovora je sistem komplemenata.

[0005] Sistem komplemenata uključuje oko 20 cirkulišući proteini, koji se primarno sintetizuju u jetri. Komponente ovog određenog imunog odgovora prvo su nazvane "komplement" zbog zapažanja da su dopunili odgovor antitela u uništavanju bakterija. Ovi proteini ostaju u neaktivnom obliku pre aktiviranja kao odgovora na infekciju. Aktivacija se odvija putem proteolitičkog cepanja pokrenutog prepoznavanjem patogena i dovodi do uništavanje patogena. Takva tri puta poznata su u sistemu komplemenata, a nazivaju se klasični put, put lektina i alternativni put. Klasični put aktivira se kada se IgG ili IgM molekul veže za površinu patogena. Put lektina se pokreće proteinom lektinom koji vezuje manan, a koji prepoznaje ostatke šećera ćelijskog zida bakterija. Alternativni put ostaje aktivan na niskim nivoima u odsustvu bilo kojih specifičnih stimulanasa. Dok se sva tri puta razlikuju s obzirom na događaje iniciranja, sva tri puta konvergiraju sa cepanjem komponente komplementa C3. C3 se cepa na dva proizvoda koji se nazivaju C3a i C3b. Od njih, C3b postaje kovalentno vezan za površinu patogena dok C3a deluje kao difuzioni signal za promovisanje zapaljenja i regrutovanje cirkulišućih imunih ćelija. Za površinu vezan C3b obrazuje kompleks sa drugim komponentama za iniciranje kaskade reakcija između kasnijih komponenata sistema komplemenata. Zbog zahteva za površinskim vezivanjem, aktivnost komplementa ostaje lokalizovana i minimizira uništavanje neciljanih ćelija.

[0006] C3b vezan za patogen olakšava uništavanje patogena na dva načina. Na jednom putu, C3b prepoznaje se direktno od strane fagocitnih ćelija i dovodi do nestajanja patogena. Na drugom putu, C3b vezan za patogen inicira obrazovanje kompleksa koji napada membranu (MAC). U prvoj fazi, C3b kompleksi sa drugim komponentama komplemenata za obrazovanje kompleksa C5-konvertaze. Zavisno od početnog puta aktivacije komplementa, komponente ovog kompleksa mogu da se razlikuju. C5-konvertaza obrazovana kao rezultat klasičnog puta komplementa obuhvata C4b i C2a pored C3b. Kada se obrazuje alternativnim putem, C5-konvertaza obuhvata dve podjedinice C3b kao i jednu Bb komponentu.

[0007] Komponenta komplementa C5 cepa se bilo kojim kompleksom C5-konvertaze na C5a i C5b. C5a, slično kao C3a, difunduje u krvotoku i promoviše zapaljenje, delujući kao hemoatraktant za zapaljenske ćelije. C5b ostaje vezan za površinu ćelije gde pokreće obrazovanje MAC interakcijama sa C6, C7, C8 i C9. MAC je hidrofilna pora koja pokriva membranu i promoviše slobodan protok fluida u i van ćelije, pri čemu je uništava.

[0008] Značajna komponenta celokupne imunološke aktivnosti je sposobnost imunog sistema da razlikuje sopstvene i strane ćelije. Patologija nastaje kada imuni sistem ne može da napravi ovu razliku. U slučaju sistema komplemenata, ćelije kičmenjaka eksprimiraju proteine koji ih štite od dejstava kaskade komplementa. Ovo osigurava da se mete sistema komplemenata ograniče na patogene ćelije. Mnogi poremećaji i bolesti povezane sa komplementom povezane su sa abnormalnim uništavanjem sopstvenih ćelija kaskadom komplementa. U jednom primeru, subjekti koji boluju od paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH) ne mogu da sintetizuju funkcionalne verzije regulatornih proteina komplemenata CD55 i CD59 na hematopoetskim matičnim ćelijama. Ovo rezultuje hemolizom posredovanom komplementom i nizom nishodnih komplikacija. Ostali poremećaji i bolesti povezane sa komplementom uključuju, ali nisu ograničene na, autoimune bolesti i poremećaje, neurološke bolesti i poremećaje, bolesti i poremećaje krvi i infektivne bolesti i poremećaje. Eksperimentalni dokazi ukazuju da se mnogi poremećaji povezani sa komplementom ublažavaju inhibicijom aktivnosti komplementa. Prema tome, postoji potreba za razvojem jedinjenja i postupaka za selektivno blokiranje uništavanja ćelija posredovanog komplementom i za lečenje povezanih indikacija. Ovaj pronalazak zadovoljava ovu potrebu obezbeđivanjem ovde opisanih polipeptida i povezanih postupaka za njihovu upotrebu.

[0009] WO 2013/126006 A1 se odnosi na polipeptide koji se vezuju za humani C5 i na upotrebu tih polipeptida u terapiji.

[0010] Hillmen (2006); NEJM 355(12):1233-1243 i Legendre (2013); NEJM 368(23):2169-2181 opisuju upotrebu Ekulizumaba za lečenje PNH i HUS.

SUŠTINA PRONALASKA

[0011] Ovaj pronalazak obezbeđuje polipeptid koji se sastoji od SEQ ID NO: 194 ili SEQ ID NO: 184 za upotrebu u postupku lečenja poremećaja povezanog sa C5-komplementom, pri čemu postupak obuhvata davanje polipeptida u dozi od oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg, pri čemu je hemoliza kod subjekta smanjena za najmanje 50% u odnosu na prethodno primećene nivoe hemolize kod pomenutog subjekta.

[0012] Ostali aspekti ovog pronalaska obezbeđeni su u patentnim zahtevima.

OPIS NACRTA

[0013]

Fig.1 je linijski grafikon koji prikazuje rezultate enzimskog imunotesta (EIA) za detekciju C5a u supernatantu iz ispitivanja hemolize humanih crvenih krvnih zrnaca (RBC) sa povećanjem koncentracija inhibitora R3002 (SEQ ID NO: 3) i R3008 (SEQ ID NO: 9). Nivoi C5a su u uzajamnoj vezi sa aktivnošću komplementa i zbog toga su indikator sposobnosti ispitivanih jedinjenja da inhibiraju aktivnost komplementa. Supernatant iz ispitivanja hemolize je razblažen 1:50 i ispitani su C5a nivoi. C5a nivoi su smanjeni u humanim uzorcima supernatanta iz ispitivanja hemolize sa povećanjem nivoa bilo kojeg ispitivanog inhibitora. R3002 (SEQ ID NO: 3) imao je IC50od 5.4 nM, dok je R3008 (SEQ ID NO: 9) imao IC50od 54.5 nM. Kao što se ovde koristi, pojam "IC50" odnosi se na polovinu maksimalne inhibitorne koncentracije, vrednost korišćena da naznači količinu inhibitora potrebnu da se data reakcija ili proces smanji za pola.

Fig.2 je linijski grafikon koji prikazuje rezultate EIA za detekciju kompleksa koji napada membranu (MAC) u supernatantu iz ispitivanja hemolize humanih RBC sa povećanjem koncentracija R3008 (SEQ ID NO: 9). Nivoi MAC su u uzajamnoj vezi sa aktivnošću komplementa i zbog toga su indikator sposobnosti R3008 (SEQ ID NO: 9) da inhibira aktivnost komplementa. Supernatant iz ispitivanja hemolize je razblažen 1:5 i ispitani su MAC nivoi. MAC nivoi su opadali u uzorcima supernatanta iz ispitivanja hemolize sa povećanjem nivoa ispitanog inhibitora sa IC50od 33 nM.

Fig.3 je linijski grafikon koji prikazuje kompetitivne podatke fluorescentne polarizacije (FP) za predmete ispitivanja R3003 (SEQ ID NO: 4), R3011 (SEQ ID NO: 31), R3014 (SEQ ID NO: 55), R3023 (SEQ ID NO: 104), R3043 (SEQ ID NO: 50) i R3050 (SEQ ID NO: 23). FP omogućava merenje vezivanja u homogenom rastvoru. Izveden je kompetitivni test vezivanja u kojem je 25 nM rastvor jedinjenja R3076 (SEQ ID NO: 40), koji ima fluorescentnu oznaku, kombinovan sa povećanjem količina predmeta ispitivanja i izmerene su promene FP (u mili-jedinicama polarizacije; mP). Smanjenje mP nivoa je u uzajamnoj vezi sa uspešnom kompeticijom za C5 od strane predmeta ispitivanja. Prikazani su proseci dva nezavisna eksperimenta izvedena u triplikatu (+/- standardna devijacija). Od predmeta ispitivanja, R3003 (SEQ ID NO: 4) je bio najpotentniji, dok R3023 (SEQ ID NO: 104), kontrolni polipeptid, nije pokazao aktivnost pri najvećoj ispitivanoj koncentraciji.

Fig.4 je linijski grafikon koji prikazuje rezultate ispitivanja na cinomolgus majmunu. Prikazane su promene koncentracije R3152 (SEQ ID NO: 153) u plazmi (kružići) nakon jedne 3 mg/kg IV doze kod cinomolgus majmuna. Takođe su prikazane promene hemolitičke aktivnosti (kvadratići) u istim vremenskim tačkama.

Fig.5 je linijski grafikon koji prikazuje rezultate praćenja jedinjenja u plazmi nakon intravenskog (IV; kvadratići) ili subkutanog (SC; kružići) davanja od 2 mg/kg R3152 (SEQ ID NO: 153) kod mužjaka Sprague-Dawley pacova. Praćenje je obuhvatalo određivanje kombinovanih koncentracija R3152 (SEQ ID NO: 153) u plazmi kao i njegovog ekvipotentnog C-terminalno deamidiranog metabolita, R3201 (SEQ ID NO: 211.)

Fig.6A i 6B su linijski grafikoni koji prikazuju farmakokinetike jedinjenja ovog otkrivanja kod pacova. Mužjacima Sprague-Dawley pacova (n=3) je intravenski ubrizgana jedna doza od 2 mg/kg. Uzorci krvi su uzeti u naznačenim vremenskim tačkama, prerađeni u plazmu i analizirani za naznačeno jedinjenje pomoću LC-MS (Fig.6A). Crni kružići označavaju rezultate sa R3176 (SEQ ID NO: 177) (nelipidovano jedinjenje), a otvoreni kružići označavaju rezultate sa R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 lipidovano jedinjenje). Mužjacima Sprague-Dawley pacova (n=3) takođe je subkutano ubrizgana jedna doza od 15 mg/kg. Uzorci krvi su uzeti u naznačenim vremenskim tačkama, prerađeni u plazmu i analizirani za naznačeno jedinjenje pomoću LC-MS (Fig.6B). Crni kružići označavaju rezultate sa R3176 (SEQ ID NO: 177) (nelipidovano jedinjenje), a otvoreni kružići označavaju rezultate sa R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 lipidovano jedinjenje).

Fig.7 je dijagram rasejanja koji predstavlja efekte R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 lipidovano jedinjenje) ili anti-C5 monoklonalnog antitela slično kao EKULIZUMAB® na inhibiciju hemolize putem trombinom indukovanog komplementa.

Fig.8 je linijski grafikon koji prikazuje rezultate iz analize rezonancije površinskih plazmona C5 vezivanja sa R3183 (SEQ ID NO: 184).

Fig.9 je linijski grafikon koji prikazuje rezultate C5a imunotesta sa supernatantom iz ispitivanja hemolize humanih crvenih krvnih zrnaca.

Fig.10 je linijski grafikon koji prikazuje rezultate imunotesta obrazovanja kompleksa koji napada membranu (MAC) izvedenog na supernatantu iz ispitivanja hemolize humanih crvenih krvnih zrnaca.

Fig.11A i 11B su linijski grafikoni koji prikazuju rezultate humanih ispitivanja hemolize. Fig.11A je linijski grafikon koji poredi inhibiciju između EKULIZUMAB® i R3183 (SEQ ID NO: 184). Fig.11B je linijski grafikon koji prikazuje rezultate ispitivanja hemolize sa R3183 (SEQ ID NO: 184) u prisustvu humanog seruma ili seruma nehumanog primata.

Fig.12A i B su linijski grafikoni koji prikazuju rezultate od davanja jedinjenja u životinjskim modelima. Fig.12A je linijski grafikon koji prikazuje rezultate R3183 davanja u nekom životinjskom modelu. Fig.12B je linijski grafikon koji prikazuje rezultate R3183 davanja u nekom životinjskom modelu.

Fig.13 je dijagram rasejanja koji prikazuje kombinovane podatke iz farmakokinetičkih i farmakodinamičkih ispitivanja.

Fig.14 je grafikon sa stubićima koji prikazuje rezultate ispitivanja hemolize.

DETALJAN OPIS

[0014] Tehničke informacije date u nastavku mogu u nekim aspektima prevazići obim ovog pronalaska, koji je isključivo definisan priloženim patentnim zahtevima. Dodatne tehničke informacije su date kako bi se ovaj pronalazak stavio u širi tehnički kontekst i radi ilustrovanja mogućih povezanih tehničkih razvoja. Takve dodatne tehničke informacije koje ne potpadaju unutar obima priloženih patentnih zahteva, nisu deo ovog pronalaska."

[0015] Ovo otkrivanje odnosi se na otkriće novih C5 modulatornih jedinjenja i postupaka njihove upotrebe. Takva jedinjenja mogu da uključuju, ali nisu ograničena na, polipeptide (npr. ciklični polipeptidi, peptidomimetici i ciklični peptidomimetici), male molekule, antitela, fragmente antitela i aptamere. U nekim slučajevima, C5 modulatorna jedinjenja su polipeptidi korisni u dijagnozi i/ili lečenju bolesti u kojima je poželjna inhibicija aktivacije komplementa. U nekim slučajevima, polipeptidi ovog otkrivanja specifično vezuju komponentu komplementa C5. U daljim slučajevima, polipeptidi ovog otkrivanja smanjuju komplementom posredovanu ćelijsku lizu (npr., hemoliza crvenih krvnih zrnaca) sprečavanjem cepanje C5 na C5a i C5b fragmente.

Definicije

[0016] Biološki sistem: Kao što se ovde koristi, pojam "biološki sistem" odnosi se na ćeliju, grupu ćelija, tkivo, organ, grupu organa, organelu, put biološke signalizacije (npr., receptorom aktiviran put signalizacije, naelektrisanjem aktiviran put signalizacije, metabolički put, ćelijska signalizacija put, itd.), grupu proteina, grupu nukleinskih kiselina ili grupu molekula (uključujući, ali ne ograničavajući se na biomolekule) koji izvodi najmanje jednu biološku funkciju ili biološki zadatak unutar ćelijskih membrana, ćelijskih kompartmenata, ćelija, ćelijskih kultura, tkiva, organa, sistema organa, organizama, višećelijskih organizama ili bilo kojih bioloških entiteta. U nekim slučajevima, biološki sistemi su putevi ćelijske signalizacije koji obuhvataju unutarćelijske i/ili vanćelijski biomolekule signalizacije. U nekim slučajevima, biološki sistemi obuhvataju proteolitičke kaskade (npr., kaskada komplementa).

[0017] Kontrolni sistem: Kao što se ovde koristi, pojam "kontrolni sistem" odnosi se na biološki sistem koji se ne leči i koristi se samo za poređenje sa biološkim sistemom koji se ili koji je bio lečen ili tretiran na neki drugi način.

[0018] Nishodni događaj: Kao što se ovde koristi, pojam "nishodno" ili "nishodni događaj," odnosi se na bilo koji događaj koji se odvija nakon i kao rezultat nekog drugog događaja. U nekim slučajevima, nishodni događaji su događaji koji se javljaju nakon i kao rezultat C5 cepanja i/ili aktivacije komplementa. Takvi događaji mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na stvaranje proizvoda C5 cepanja, aktivaciju MAC, hemolizu i bolest povezanu sa hemolizom (npr., PNH).

[0019] Uzorak: Kao što se ovde koristi, pojam "uzorak" odnosi se na alikvot ili deo uzet od izvora i/ili obezbeđen za analizu ili obradu. U nekim slučajevima, uzorak je iz nekog biološkog izvora kao što je tkivo, ćelija ili sastavni deo (npr. neka telesna tečnost, uključujući ali ne ograničavajući se na krv, sluz, limfnu tečnost, sinovijalnu tečnost, cerebrospinalnu tečnost, pljuvačku, amnionsku tečnost, amnionsku krv iz pupčane vrpce, urin, vaginalnu tečnost i spermu). U nekim slučajevima, uzorak može da bude ili obuhvata homogenat, lizat ili ekstrakt pripremljen od celog organizma ili podskupa njegovih tkiva, ćelija ili sastavnih delova, ili frakciju ili njen deo, uključujući ali ne ograničavajući se na, na primer, plazmu, serum, spinalnu tečnost, limfnu tečnost, spoljne delove kože, respiratorni, crevni i genitourinarni trakt, suze, pljuvačku, mleko, krvne ćelije, tumore, organe. U nekim slučajevima, uzorak je ili obuhvata neku podlogu, kao što je hranljivi bujon ili gel, koji može da sadrži ćelijske komponente, kao što su proteini ili molekul nukleinske kiseline. U nekim slučajevima, "primarni" uzorak je alikvot izvora. U nekim slučajevima, primarni uzorak podvrgava se jednoj ili više faza obrade (npr., razdvajanje, prečišćavanje, itd.) da bi se pripremio uzorak za analizu ili drugu upotrebu.

[0020] Subjekat: Kao što se ovde koristi, pojam "subjekat" odnosi se na bilo koji organizam kojem se jedinjenje u skladu sa ovim pronalaskom može dati, npr., u eksperimentalne, dijagnostičke, profilaktičke, i/ili terapijske svrhe. Uobičajeni subjekti uključuju životinje (npr., sisari kao što su miševi, pacovi, zečevi, svinjski subjekti, ne-humani primati i ljudi.)

I. Jedinjenja i kompozicije

[0021] U nekim slučajevima, ovo otkrivanje obezbeđuje jedinjenja i kompozicije za modulaciju aktivnosti komplementa. U nekim slučajevima, jedinjenja uključuju C5 modulatorna jedinjenja. Takva jedinjenja mogu da uključuju, ali nisu ograničena na polipeptide (npr. ciklični polipeptidi, peptidomimetici i ciklični peptidomimetici). Kao što se ovde koristi, "mimetik" odnosi se na molekul koji pokazuje neka od svojstava ili karakteristika drugog molekula. "Peptidomimetik" ili "polipeptidni mimetik" je mimetik kod kojeg molekul sadrži strukturne elemente koji se ne nalaze kod prirodnih polipeptida (tj., polipeptidi koji se sastoje samo od 20 proteinogenih aminokiselina). U nekim slučajevima, peptidomimetici mogu da rekapituliraju ili imitiraju biološko dejstvo(a) prirodnog peptida. Peptidomimetik može u mnogo čemu da se razlikuje od prirodnih polipeptida, uključujući, ali ne ograničavajući se na promene u strukturi kičme i prisustvu aminokiselina koje se ne javljaju u prirodi. U nekim slučajevima, peptidomimetici mogu da uključuju aminokiseline sa bočni lancima koji se ne nalaze među poznatih 20 proteinogenih aminokiselina, premošćavajuće ostatke koji nisu na bazi polipeptida korišćene da bi se izvela ciklizacija između krajeva ili unutrašnjih delova molekula, supstitucije vodonika u amidnoj vezi metil grupama (N-metilacija) ili drugim alkil grupama, zamenu peptidne veze nekom hemijskom grupom ili vezom koja je otporna na hemijska ili enzimska tretiranja, N- i C-terminalne modifikacije i konjugacija sa ne-peptidnim nastavkom (kao što je polietilen glikol, lipidi, ugljeni hidrati, nukleozidi, nukleotidi, nukleozidne baze, razni mali molekuli ili fosfatne ili sulfatne grupe).

[0022] Neki polipeptidi ovog pronalaska mogu biti ciklični. Ciklični polipeptidi uključuju bilo koje polipeptide koje, kao deo njihove strukture, imaju jednu ili više cikličnih karakteristika kao što su petlja, premošćavajući ostatak i/ili unutrašnja veza. Kao što se ovde koristi, pojam "premošćavajući ostatak" odnosi se na jednu ili više komponenata mosta obrazovanog između dve susedne ili nesusedne aminokiseline, neprirodne aminokiseline ili ne-aminokiseline u polipeptidu. Premošćavajući ostaci mogu biti bilo koje veličine ili sastava. U nekim načinima ostvarivanja, premošćavajući ostaci mogu da obuhvataju jednu ili više hemijskih veza između dve susedne ili nesusedne aminokiseline, neprirodnih aminokiselina, ne-aminokiselinskih ostataka ili njihovih kombinacija. U nekim načinima ostvarivanja, takve hemijske veze mogu biti između jedne ili više funkcionalnih grupa na susednim ili nesusednim aminokiselinama, neprirodnim aminokiselinama, ne-aminokiselinskim ostacima ili njihovim kombinacijama. Premošćavajući ostaci mogu da obuhvataju jednu ili više karakteristika uključujući, ali ne ograničavajući se na amidnu vezu (laktam), disulfidnu vezu, tioetarsku vezu, aromatični prsten, triazolni prsten i ugljovodonični lanac. U nekim načinima ostvarivanja, premošćavajući ostaci obuhvataju amidnu vezu između funkcionalnosti amina i funkcionalnosti karboksilata, svaka prisutna u bočnom lancu aminokiselinskog, neprirodnog aminokiselinskog ili ne-aminokiselinskog ostatka. U nekim načinima ostvarivanja, funkcionalnosti amina ili karboksilata su deo ne-aminokiselinskog ostatka ili neprirodnog aminokiselinskog ostatka. U nekim slučajevima, premošćavajući ostaci mogu da obuhvataju veze obrazovane između ostataka koji mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na (S)-2-amino-5azidopentansku kiselinu (ovde se takođe naziva "X02"), (S)-2-aminohept-6-ensku kiselinu (ovde se takođe naziva "X30"), (S)-2-aminopent-4-insku kiselinu (ovde se takođe naziva "X31") i (S)-2-aminopent-4-ensku kiselinu (ovde se takođe naziva "X12".) Premošćavajući ostaci mogu da se obrazuju reakcijama ciklizacije pomoću olefin metateze. U nekim slučajevima, takvi premošćavajući ostaci mogu da se obrazuju između X12 i X30 ostataka. U nekim načinima ostvarivanja, premošćavajući ostatak obuhvata disulfidnu vezu obrazovanu između dva ostatka koja sadrže tiol. U nekim načinima ostvarivanja, premošćavajući ostatak obuhvata jednu ili više tioetarskih veza. Takve tioetarske veze, mogu da uključuju one koje se nalaze u ciklo-tioalkilnim jedinjenjima. Ove veze se obrazuju u hemijskoj reakciji ciklizacije između N-terminalnih modifikovanih grupa hlorosirćetne kiseline (ovde se takođe naziva "X35") i cisteinskih ostataka. U nekim slučajevima, premošćavajući ostaci obuhvataju jedan ili više triazolnih prstena. Takvi triazolni prstenovi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na one obrazovane reakcijom ciklizacije između X02 i X31. U nekim slučajevima, premošćavajući ostaci obuhvataju ostatke koji nisu na bazi proteina ili polipeptida, uključujući, ali ne ograničavajući se na ciklične prstenove (uključujući, ali ne ograničavajući se na strukture aromatičnog prstena (npr. ksilili)). Takvi premošćavajući ostaci mogu se uvesti reakcijom sa reagensima koji sadrže višestruko reaktivne halogenide, uključujući, ali ne ograničavajući se na poli(bromometil)benzene, poli(bromometil)piridin, poli(bromometil)alkilbenzene i/ili (E)-1,4-dibromobut-2-en. U nekim slučajevima, premošćavajući ostaci uključuju, ali nisu ograničeni na sledeće strukture:

gde je svako X nezavisno N ili CH, tako da ni jedan prsten ne sadrži više od 2 N; pri čemu je svako Z nezavisno odsutno ili odabrano od neke veze, NR, O, S, CH2, C(O)NR, NRC(O), S(O)vNR i NRS(O)v; svako m je nezavisno odabrano od 0, 1,2 i 3; svako v je nezavisno odabrano od 1 i 2; svako R je nezavisno odabrano od H i C1-C6; i svaki premošćavajući ostatak je vezan za polipeptid nekom nezavisno odabranom vezom ili C1-C6razmaknicom.

[0023] U određenim slučajevima, polipeptidi su pretvaraju u makrociklične obrazovanjem kovalentnih veza između atoma prisutnih u linearnom polipeptidu i atoma premošćavajućeg ostatka. Ovaj premošćavajući ostatak služi u svrhu hemijskog povezivanja dva reaktivna mesta na linearnom polipeptidu da bi se dobio ciklični polipeptidni proizvod. Ovo otkrivanje uključuje polipeptide ciklizovane na gorepomenuti način, a koji obuhvataju premošćavajući ostatak koji sadrži aromatični, 6-člani prsten. U ovim slučajevima, atomi linearnog polipeptida koji obrazuju određene hemijske veze sa premošćavajućim ostatkom mogu biti heteroatomi (uključujući, ali ne ograničavajući se na, azot, kiseonik i sumpor), ili zasićeni ili nezasićeni atomi ugljenika. U svakom slučaju, atomi polipeptidnog bočnog lanca mogu biti vezani direktno za atom ugljenika unutar aromatičnog prstena premošćavajućeg ostatka. U alternativnim oblicima, atomi polipeptidnog bočnog lanca mogu biti vezani za zasićenu -CH2-grupu koja je, s druge strane, direktno vezana za atom ugljenika unutar aromatičnog prstena premošćavajućeg ostatka. U određenim slučajevima, aromatični, 6-člani prsten unutar premošćavajućeg ostatka je benzen, kao u sledećim strukturama gde Z može biti odabrano od NH, S, O i (CH)2:

[0024] U alternativnim oblicima aromatičnog, 6-članog prstena koji obuhvata premošćavajući ostatak je heterocikličan i sadrži jedan ili više atoma azota. U ovim slučajevima, aromatični heterocikl može biti piridin, koji sadrži jedan atom azota u aromatičnom prstenu [npr. bilo koja od struktura dole gde Z može

1

biti odabrano od NH, S, O i (CH)2]:

[0025] Aromatični heterocikli mogu alternativno biti piridazin, koji sadrže dva susedna atoma azota u 1,2-orijentaciji unutar aromatičnog prstena [npr. bilo koja od struktura dole gde Z može biti odabrano od NH, S, O i (CH)2]:

[0026] U drugim slučajevima, aromatični heterocikl može biti pirimidin, koji sadrži dva atoma azota u 1,3-orijentaciji unutar aromatičnog prstena [npr. bilo koja od struktura dole gde Z može biti odabrano od NH, S, O i (CH)2]:

[0027] Alternativno, aromatični heterocikl može biti pirazin, koji sadrži dva atoma azota u 1,4-orijentaciji unutar aromatičnog prstena [npr. bilo koja od struktura dole gde Z može biti odabrano od NH, S, O i (CH)2]:

[0028] U alternativnim oblicima, polipeptidi postaju makrociklični kao rezultat obrazovanja kovalentnih veza između atoma linearnog polipeptida i atoma premošćavajućeg ostatka koji se sastoji od heterocikličnog, aromatičnog, 5-članog prstena. U ovim slučajevima, atomi linearnog polipeptida koji obrazuje određene hemijske veze sa premošćavajućim ostatkom mogu biti heteroatomi (uključujući, ali ne ograničavajući se na, azot, kiseonik i sumpor), ili zasićeni ili nezasićeni atomi ugljenika. U svakom slučaju, atomi polipeptidnog bočnog lanca mogu biti vezani direktno za atom ugljenika ili atom azota unutar aromatičnog prstena premošćavajućeg ostatka. U alternativnim oblicima, atomi polipeptidnog bočnog lanca mogu biti vezani za zasićenu -CH2- grupu koja je, s druge strane, direktno vezana za atom ugljenika ili atom azota unutar aromatičnog prstena premošćavajućeg ostatka. U određenim slučajevima, heterociklični, aromatični, 5-člani prsten unutar premošćavajućeg ostatka je 1,2,3-triazol. U ovim slučajevima, aromatični prsten može da bude supstituisan na položajima 1 i 4 hemijskom funkcionalnošću linearnog polipeptida koji se vezuje. Alternativno, 1,2,3-triazolna osnova može da bude supstituisana na položajima 1 i 4 -CH2- grupama koje su direktno vezane za atome linearnog polipeptida koji se povezuje [npr. bilo koje od struktura dole gde Z može da bude odabrano od NH, S, O i (CH)2]:

[0029] U drugim slučajevima, heterociklični, aromatični, 5-člani prsten koji obuhvata premošćavajući ostatak je pirazol. U ovim slučajevima, aromatični prsten može da se supstituiše ili na položajima 1 i 3 ili na položajima 1 i 4 hemijskom funkcionalnošću linearnog polipeptida koji su vezani. Alternativno, pirazolna osnova može da bude zamenjena ili na položajima 1 i 3 ili na položajima 1 i 4 -CH2- grupama koje su direktno vezane za atome linearnog polipeptida koji se vezuje [npr. bilo koja od struktura dole gde Z može biti odabrano od NH, S, O i (CH)2]:

[0030] Osim ukoliko nije drugačije definisano, svi tehnički i naučni pojmovi korišćeni ovde imaju isto značenje kao ga obično razume prosečan stručnjak u oblasti kojoj ovaj pronalazak pripada.

Polipeptidi kao lekovi

[0031] Na osnovu njihove veličine i složenosti, polipeptidi mogu da obrazuju brojne, visoko specifične kontakte sa njihovim biološkim metama i mogu da pokazuju visok nivo selektivnosti za tačnu ili željenu metu u poređenju sa blisko povezanom metom unutar iste porodice. Neciljani efekti (poznati takođe kao neželjena dejstva) često izazivaju da visoko efikasni lekovi ne dobije regulatorno odobrenje zbog bezbednosnih razloga.

[0032] Brojni polipeptidi (uključujući, ali ne ograničavajući se na peptidomimetike, razvijeni su u

1

efektivne lekove. Ovi uključuju, ali nisu ograničeni na, insulin, glukagonu sličan peptid 1 (GLP-1), somatostatin, vazopresin, ciklosporin A i slično. Terapijski polipeptid može da bude identičan molekulu koji se javlja u prirodi (tj. onaj koji cirkuliše kod ljudi i smatra se "divljim tipom" u ljudskoj populaciji). U mnogim drugim slučajevima, polipeptid nije pogodan ili suboptimalan za terapijsku upotrebu zbog kratkog cirkulišućeg poluživota koji je često zbog metaboličke nestabilnosti u telu. U ovim slučajevima, koristi se modifikovan ili varijantni oblik polipeptida (peptidomimetik) koji rezultuje poboljšanim farmakokinetičkim i farmakodinamičkim ponašanjem. U drugim slučajevima, polipeptid dobijen iz nekog prirodnog izvora ima ekvivalentni mehanizam dejstva i poželjan farmaceutski profil i može da se koristi kao terapija. Na primer, eksenatid, sintetička verzija eksedina-4, ima biološka svojstva slična humanom glukagonu sličanom peptidu-1 (GLP-1) ali poboljšane farmakokinetike, i odobren je od strane FDA za lečenje šećerne bolesti tipa 2. Kao drugi primer, kalcitonin lososa, kalcitonin ekstrahovan iz ultimobranhijalnih žlezda lososa, podseća na humani kalcitonin ali je aktivniji od humanog kalcitonina i može da se koristi za lečenje postmenopauzne osteoporoze, hiperkalcemija, Padžetova bolest, metastaze kosti i fantomski bol u ekstremitetima.

[0033] Polipeptidi su obično ograničeni na neoralne puteve davanja. U skoro svim slučajevima, polipeptidi mora se isporučiti injekcijom, jer čak i veoma mali polipeptidi (npr., polipeptidi sa 4-10 aminokiselinskih ostataka) ne mogu ili slabo mogu da prođu kroz ćelijske membrane koje oblažu intestinalni trakt. Za efikasnu oralnu dostupnost, lekovi obično treba da prođu kroz luminalne i bazolateralne membrane crevnih epitelijalnih ćelija da bi ušli u sistemsku cirkulaciju. Slaba propustljivost membrane i nedostatak oralne biodostupnosti polipeptida značajno ograničava njihovu terapijsku upotrebu.

[0034] Na efektivnost polipeptida kao leka može da utiče njegova proteolitička stabilnost. Unutar tela, polipeptidi mogu da se modifikuju ili razgrade enzimima, koji mogu da ograniče njihovu efektivnost u interakciji sa predviđenom metom.

[0035] Metabolička stabilnost polipeptida je značajna jer je povezana sa njihovom globalnom fleksibilnošću, intramolekularnim fluktuacijama, raznim unutrašnji dinamički procesima kao i mnogim biološkim funkcijama. Metabolička stabilnost polipeptida može biti kritična u razvoju farmaceutskih, uticajnih parametara kao što su, ali ne ograničavajući se na, klirens, poluživot i biodostupnost lekova.

[0036] Održavanjem datog nivoa terapijskog polipeptida unutar tela ili krvotok može biti otežan zbog efluksa. Brzina efluksa polipeptida iz tela može da varira i treba da se prati pri razmatranju davanja terapijskih polipeptida.

[0037] Ostaje značajna medicinska potreba za inhibitorima aktivacije komplementa ili inhibitorima aktivnosti komplementa i formulacijama inhibitora koji su visoko potentni i visoko specifični.

Otkriće peptidomimetika

[0038] Peptidomimetici mogu da se identifikuju raznim sredstvima. U nekim slučajevima peptid ili sekvenca koja se javlja u prirodi i nalazi u prirodnom proteinu koristi se kao polazna tačka. U ovim slučajevima, polazna peptidna sekvenca izabrana je jer je poznato da fizički uzajamno deluje sa željenim ciljnim molekulom. Prirodni peptid može biti izabran jer je agonist ili antagonist za receptor, inhibira neki enzim ili podešava neki kanal. Sekvenca prirodnog proteina može da se odabere jer obuhvata domen koji učestvuje u interakciji sa drugim proteinom ili nekim drugim molekulom kod ljudi ili životinje. U mnogim slučajevima, strukturni podaci o interakciji proteina mogu se dobiti iz javnih baza podataka (npr. the RCSB Protein Data Bank; H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000) The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242) i specifični region proteina koji uzajamno deluje sa željenom metom može da se identifikuje na osnovu kristalografskih podataka o kompleksu proteina. U drugim slučajevima, polipeptidi koji odgovaraju različitim delovima proteina mogu se pripremiti i ispitati za vezivanje za metu od interesa. Kada se identifikuju, hemijske modifikacije se uvode da bi se poboljšala njihova stabilnost i potencija, pri čemu dobijeni peptidomimetik ima poboljšane farmakokinetičke ili farmakodinamičke parametre.

[0039] U drugim slučajevima, polipeptid se izoluje jednim od nekoliko postupaka za izolovanje polipeptidnih sekvenci iz biblioteka polipeptida na osnovu njihovih afiniteta za specifične ciljne proteine, nukleinske kiseline, ugljene hidrate, lipide ili cele ćelije. Takvi postupci uključuju fagni prikaz, mRNK prikaz, prikaz ribozoma, DNK prikaz, DNK-kodirani sklop i dvohibridni skrining, kao i njihove modifikacije (vidi, npr., Takashashi, T.T et al. (2003). Trends in Biochem. Sci.28(3): 159-165; Kay, B.K. et al. (2001). Methods. 24:240-246; He, M i Taussig, M (2002). Briefs in Functional Genomics and Proteomics.1(2): 204-212; Rothe, A. et al. (2006). The FASEB Journal.20(10): 1599-1610; pri čemu su svi uključeni ovde referencom u celini.)

[0040] Polipeptidi mogu da usvoje trodimenzionalne strukture koje mogu da se vezuju za druge biološke molekule sa određenim stepenima afiniteta i specifičnosti. Neki će se vezati sa veoma visokim afinitetom i specifičnošću. Biblioteka nasumičnih polipeptidnih sekvenci biće naseljena molekulima raznih trodimenzionalnih struktura. Da bi se izolovao polipeptid sa konformacijom koja uzajamno deluje sa specifičnim ciljnim proteinom, pojedinačne sekvence iz biblioteke mogu da se pripreme i ispitaju ili pregledaju za njihov afinitet prema meti. Međutim, za veoma velike biblioteke (>10<6>članova), nije izvodljiv pregled pojedinačnih sekvenci za afinitet vezivanja. Da bi se prevazišlo ovo ograničenje, razvijene su brojne tehnike za selekciju novih polipeptida od ekstremno velikih, složenih mešavina zahvaljujući njihovom afinitetu vezivanja za neku metu. Budući da je predviđeno da će polipeptidi sa visokim afinitetom vezivanja biti prisutni sa veoma malom učestalošću unutar populacije, ovi postupci selekcije oslanjaju se na održavanje fizičke veze između polipeptida i genetičkog materijala (uopšteno nukleinska kiselina kao što je DNK ili RNK) koji kodira polipeptid tako da selekcija polipeptida automatski uključuje odabir nukleinske kiseline koja ga kodira. Nukleinska kiselina koja kodira odabrani polipeptid

1

može se pojačati i sekvencirati da bi se otkrila sekvenca i nukleinskih kiselinai i polipeptida. U jednom pristupu, fagni prikaz (vidi Cwirla, S.E. et al. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.87:6378-6382; Dower, W.J. i Cwirla, S.E. U.S. Patent br.5,427,908 i 5,580,717), svaki nasumični polipeptidni član biblioteke prikazan je na površini bakteriofagne čestice kao deo fuzionog proteina između polipeptida i jednog od proteina omotača faga. Fagna čestica obezbeđuje vezu između polipeptida i kodirajuće DNK njhovom kolokalizacijom unutar istog fizičkog entiteta, a kodirajuća DNK može se naknadno pojačati infekcijom bakterija odabranim fagom. U drugom pristupu, prikaz ribozoma (vidi Kawasaki, G.H. U.S. Patent br. 5,658,754 i 5,643,768), mešavina molekula informacione RNK (mRNK) prenosi se in vitro na način kojim se proizvodi, za svaku mRNK u mešavini, stabilizovan kompleks ribozoma, mRNK i novo sintetizovani polipeptid koji je isturen iz ribozoma. Stabilizovanje kompleksa dozvoljava da se drže zajedno, dok se polipeptidi pregledaju za vezivanje za metu od interesa. mRNK koja kodira odabrane polipeptidi može da se pojača pomoću reakcije lančane polimerizacije (PCR), i zatim karakteriše, npr., sekvenciranjem.

[0041] U još nekom drugom pristupu, mRNK prikaz (vidi Szostak, J.W. i Roberts, R.W., U.S. Patent br. 6,258,558), svaki mRNK molekul u biblioteci je modifikovan kovalentnim dodavanjem puromicin-sličnog ostatka na njegovom 3' kraju. Puromicin-sličan ostatak je aminoacil-tRNK analog stabla akceptora koji funkcioniše kao peptidil akceptor, i može da se doda rastućem polipeptidnom lancu aktivnošću peptidil transferaze ribozoma koji prevodi mRNK. Tokom in vitro translacije, mRNK i kodirani polipeptid postaju kovalentno vezani preko puromicin-sličnog ostatka, stvarajući RNK-peptidno spajanje. Nakon izbora fuzionog molekula vezivanjem njegove polipeptidne komponente za metu, RNK komponenta odabranog fuzionog molekula može da se pojača pomoću PCR, i zatim karakteriše. Razvijeno je nekoliko drugih postupaka za proizvodnju fizičke veze između polipeptida i nukleinske kiseline koja ga kodira, da bi se olakšala selekcija i amplifikacija (vidi Yanagawa, H., Nemoto, N., Miyamoto, E., i Husimi, Y., U.S. Patent br. 6,361,943; Nemoto, H., Miyamoto-Sato, E., Husimi, H., i Yanagawa, H. (1997). FEBS Lett.414:405-408; Gold, L., Tuerk, C., Pribnow, D., i Smith, J.D., U.S. Patent br.5,843,701 i 6,194,550; Williams, R.B., U.S. Patent br.6,962,781; Baskerville, S. i Bartel, D.P. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9154-9159; Baskerville, D.S. i Bartel, D.P., U.S. Patent br.6,716,973; Sergeeva, A. et al. (2006). Adv. Drug Deliv. Rev.58:1622-1654).

[0042] mRNK prikaz je posebno koristan postupak za stvaranje velikih biblioteka polipeptida. Prema tome, ovde su obezbeđeni postupci selekcije polipeptida (ili mRNK koja kodira polipeptid) koji uzajamno deluje sa proteinom komplementa C5. Biblioteka će uopšteno da sadrži najmanje 10<2>članova, poželjnije najmanje 10<6>članova, a poželjnije najmanje 10<9>članova (npr., bilo koji od mRNK-polipeptidnih kompleksa). U nekim slučajevima, biblioteka će da uključuje najmanje 10<12>članova ili najmanje 10<14>članova. Uopšteno, članovi će se međusobno razlikovati; međutim, očekuje se da će postojati neki stepen redundancije u bilo kojoj biblioteci. Biblioteka može postojati kao jedna mešavina svih članova, ili može biti podeljena na nekoliko pulova držanih u odvojenim kontejnerima ili bunarčićima, pri čemu

1

svaki sadrži podskup biblioteke, ili biblioteka može biti kolekcija kontejnera ili bunarčića na ploči, pri čemu svaki kontejner ili bunarčić sadrži samo jedan ili nekoliko članova biblioteke.

[0043] Svaka mRNK u biblioteci poželjno obuhvata sekvencu inicijacije translacije, početni kodon i varijabilni region koji kodira polipeptid (npr., protein ili kratki peptid) koji je generisan, na primer, nasumičnim ili polu-nasumičnim sklapanjem nukleotida, i varira od mRNK do mRNK u biblioteci (iako će verovatno postojati neki stepen redundancije unutar biblioteke). Sekvenca inicijacije translacije, početni kodon i varijabilni region koji kodira polipeptid mogu biti flankirani poznatim, fiksnim sekvencama koje mogu da se koriste za PCR amplifikaciju mRNK, npr., nakon selekcije. Druge fiksne sekvence koje mogu biti prisutne uključuju one koje odgovaraju sekvencama koje kodiraju aminokiseline koje mogu da učestvuju u hemijskim ili enzimskim reakcijama umrežavanja, tako da proizvedeni polipeptid može da se modifikuje ili derivatizuje nakon translacije, ili da kodiraju fiksnu C-terminalnu ekstenziju kao što je polipeptidna oznaka koja može da olakša prečišćavanje fuzija peptida-mRNK.

[0044] Kada se generiše biblioteka mRNK derivatizovane puromicinom, biblioteka može da se prevede. Dobijeni polipeptidi (npr., prikazani polipeptidi) biće povezani sa njihovim odgovarajućim mRNK kao što su ovde opisane (npr., kao mRNK-polipeptidni kompleks).

[0045] Brojni in vitro sistemi translacije opisani su u literaturi. Najčešći sistemi koriste zečije retikulocitne lizate, ekstrakte pšeničnih klica ili E. coli ekstrakte, koji su dostupni iz brojnih komercijalnih izvora u obliku kompleta (npr., Ambion, Austin, TX; Promega, Madison, WI; Novagen/EMD Chemicals, Gibbstown, NJ; Qiagen, Valencia, CA).

[0046] Za razliku od fagnog prikaza ili drugih sistema koji se oslanjaju na translaciju unutar ćelija, mRNK prikaz može da se prilagodi da direktno proizvodi biblioteke peptidomimetika izvođenjem in vitro translacije sa neprirodnim ili nestandardnim aminokiselinama.20 prirodnih proteinogenih aminokiselina identifikovano je i ovde se označava ili slovom ili troslovnim oznakama kao što sledi: asparaginska kiselina (Asp:D), izoleucin (Ile:I), treonin (Thr:T), leucin (Leu:L), serin (Ser:S), tirozin (Tyr:Y), glutaminska kiselina (Glu:E), fenilalanin (Phe:F), prolin (Pro:P), histidin (His:H), glicin (Gly:G), lizin (Lys:K), alanin (Ala:A), arginin (Arg:R), cistein (Cys:C), triptofan (Trp:W), valin (Val:V), glutamin (Gln:Q) metionin (Met:M), asparagin (Asn:N). Aminokiseline koje se javljaju u prirodi postoje u svojim levorotirajućim (L) stereoizomernim oblicima. Aminokiseline koje se ovde pominju su L-stereoizomeri osim gde je drugačije naznačeno.

[0047] Neprirodne aminokiseline imaju bočne lance ili druge karakteristike koje se ne javljaju kod 20 gorepomenutih aminokiselina koje se javljaju u prirodi i uključuju, ali nisu ograničeni na: N-metil aminokiseline, N-alkil aminokiseline, alfa, alfa supstituisane aminokiseline, beta-aminokiseline, alfahidroksi aminokiseline, D-aminokiseline, i druge neprirodne aminokiseline poznate u tehnici (vidi, npr., Josephson et al., (2005) J. Am. Chem. Soc.127: 11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl.

1

Acad. Sci. USA 100: 6353-6357; Subtelny et al., (2008) J. Am. Chem. Soc.130: 6131-6136; Hartman, M.C.T. et al. (2007) PLoS ONE 2:e972; i Hartman et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4356-4361).

[0048] U suštini može da se koristi bilo koja aminokiselina koja, kada je vezana za odgovarajuću tRNK, može da se sastavi u polimer prirodnim ili mutantnim ribozomima (vidi Sando, S. et al., (2007) J. Am. Chem. Soc.129:6180-6186; Dedkova, L. et al. (2003) J. Am. Chem. Soc.125: 6616-6617; Josephson, K., Hartman, M.C.T., i Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc.127:11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6353-6357; Subtelny, A.O., Hartman, M.C.T., i Szostak, J.W. (2008) J. Am. Chem. Soc.130:6131-6136; i Hartman, M.C.T. et al. (2007) PLoS ONE 2:e972).

[0049] Kada su poželjne neprirodne aminokiseline, može da bude od prednosti korišćenje prečišćenog sistema translacije kom nedostaju endogene aminoacilovane tRNK (Shimizu, Y. et al. (2001) Nat. Biotech.

19:751-755; Josephson, K., Hartman, M.C.T., i Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc.127: 11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6353-6357). Ako se neprirodne aminokiseline koriste sa in vitro sistemom translacije na bazi lizata ili ekstrakta, može da bude poželjno da se iscrpi ekstrakt endogenih tRNK, kao što je prethodno opisano (vidi Jackson, R.J., Napthine, S., i Brierley, I. (2001) RNA 7:765-773). Sistem na bazi prečišćenih E. coli faktora translacije je komercijalno dostupan (PUREXPRESS™; New England Biolabs, Ipswich, MA). Ovi sistemi su posebno korisni za translaciju sa neprirodnim aminokiselinama da bi se proizveli peptidomimetici.

[0050] Kada se koriste prirodne aminokiseline sa in vitro sistemom translacije na bazi lizata ili ekstrakta, translacija zavisi od enzimskog naelektrisanja aminokiselina na tRNK pomoću tRNK sintetaza, od kojih su sve komponente ekstrakata. Alternativno, in vitro sistemi translacije koji koriste prečišćene faktore translacije i ribozome, ili tRNK-osiromašene ekstrakte, zahtevaju da su obezbeđene aminoacilovane tRNK. U ovim primerima, prečišćene ili in vitro sintetizovane tRNK mogu biti naelektrisane aminokiselinama pomoću hemijskih (vidi Frankel, A., Millward, S.W., i Roberts, R.W. (2003) Chem. Biol.

10:1043-1050) ili enzimskih procedura (Josephson, K., Hartman, M.C.T., i Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc.127: 11727-11735; Murakami, H. et al. (2006) Nat. Methods 3:357-359).

[0051] Brojne objave opisuju izdvajanje mRNK-prikazanih polipeptida iz kompleksa translacije, i oni su pogodni za upotrebu u ovde opisanim postupcima (Liu, R. et al. (2000). Methods Enzymol.318:268-293; Baggio, R. et al. (2002). J. Mol. Recognit.15:126-134; U.S. Pat. br.6,261,804). Izdvajanje mRNK-prikazanih polipeptida može da se olakša upotrebom raznih "oznaka" koje su uključene u polipeptid translacijom fiksnih sekvencu sekvence koja kodira polipeptid i koje se vezuju za specifične supstrate ili molekule. Brojni reagensi za hvatanje takvih oznaka su komercijalno dostupni, uključujući reagense za hvatanje His-oznake, FLAG-oznake, oznake glutation-S-transferaze (GST), strep-oznake, HSV-oznake, T7-oznake, S-oznake, DsbA-oznake, DsbC-oznake, Nus-oznake, myc-oznake, hemaglutinin (HA)-oznake ili Trx-oznake (Novagen, Gibbstown, NJ; Pierce, Rockford, IL). mRNK-prikazani polipeptidi mogu takođe da se izoluju vezivanjem poliA kraja na mRNK za polidT smolu, ili kombinacije poliA kraja i His-oznake.

1

[0052] Nakon izvođenja in vitro reakcije translacije, a pre faze selekcije, mRNK deo funkcionalizovane RNK je obično obrnuto transkribovan da bi se proizveo hibridni molekul RNK-DNK. Ovo služi da bi se RNK zaštitila od razgradnje, i takođe se sprečava savijanje RNK u sekundarnu strukturu koja može da se veže za metu selekcije, što bi dovelo do izbora neodgovarajućih proizvoda (npr., selekcija RNK aptamera pre nego polipeptidnih aptamera).

[0053] Nakon in vitro translacije i izolacije fuzija polipeptida-mRNK, polipeptidni ostatak može da se modifikuje intramolekularnim ili intermolekularnim umrežavanjem, hemijskom konjugacijom, enzimskim cepanjem, skraćivanjem ili produžavanjem dodatnim aminokiselinskim monomerima. Jedan način za postizanje ovoga je ugradnjom neprirodnih aminokiselina sa reaktivnim bočnim lancima u polipeptide koji čine biblioteku. Nakon translacije, novoobrazovani polipeptidi mogu da reaguju sa molekulima koji reaguju specifično sa reaktivnim bočnim lancem ugrađene aminokiseline. Na primer, aminokiselina sa terminalnim bočnim lancem alkina može da se ugradi u biblioteku polipeptida i naknadno reaguje sa azido šećerom, stvarajući biblioteku prikazanih polipeptida sa šećerima vezanih na položajima alkinilnih bočnih lanaca (Josephson, K., Hartman, M.C.T., i Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc.127: 11727-11735). Razni reaktivni bočni lanci mogu da se koriste za takvu post-translacionu konjugaciju, uključujući amine, karboksilne grupe, azide, terminalne alkine, alkene i tiole.

[0054] Jedna posebno korisna modifikacija je na bazi umrežavanja aminokiselina za proizvodnju cikličnih struktura. Ciklični regioni u polipeptidu sadrže rigidni domen, koji smanjuje konformacionu savitljivost i stepene slobode rotacije, što dovodi do veoma visokog afinitetnog vezivanja za ciljne proteine. Brojni postupci za ciklizaciju polipeptida su dostupni stručnjacima u tehnici. Obično, hemijska reaktivnost specifičnih aminokiselinskih bočnih lanaca i/ili karboksilnih ili amino krajeva polipeptida se koristi za umrežavanje dva mesta polipeptida radi proizvodnje cikličnog molekula. U jednom postupku, tiol grupa cisteinskog ostatka umrežena je sa drugim cisteinskim ostatkom da bi se obrazovala disulfidna veza. U nekim slučajevima, tiol grupe cisteinskih ostataka reaguju sa bromometil grupama molekula poli(bromometil)benzena radi obrazovanja stabilnih veza (vidi Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem 6:821-824). Molekuli poli(bromometil)benzena mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, 1,2-bis(bromometil)benzen, 1,3-bis(bromometil)benzen i 1,4-bis(bromometil)benzen. Molekuli bis-, trisi tetrakis(bromometil)benzena, na primer, mogu da se koriste za generisanje premošćavajućih ostataka radi proizvodnje polipeptida sa jednom, dve ili tri petlje, tim redom. Bromometil grupe molekula poli(bromometil)benzena mogu biti raspoređeni na benzenskom prstenu na susednim atomima ugljenika prstena (orto- ili o-), pri čemu atom ugljenika prstena razdvaja dve grupe (meta- ili m-) ili na suprotnim atomima ugljenika prstena (para- ili p-). U nekim slučajevima, m-bis(bromometil)benzen (ovde se takođe naziva m-dibromoksilen) koristi se u obrazovanju cikličnih polipeptida. U nekim slučajevima, o-bis(bromometil)benzen (ovde se takođe naziva o-dibromoksilen) ili pbis(bromometil)benzen (ovde se takođe naziva p-dibromoksilen) koriste se u obrazovanju cikličnih

1

polipeptida. U nekim slučajevima, tiol grupe cisteinskih ostataka reaguju sa drugim reagensima koji obuhvataju jednu ili više bromo funkcionalnih grupa radi obrazovanja stabilnih veza. Takvi reagensi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na poli(bromometil)piridine (uključujući, ali ne ograničavajući se na 2,6-bis(bromometil)piridin), poli(bromometil)alkilbenzene (uključujući, ali ne ograničavajući se na 1,2-bis(bromometil)-4-alkilbenzen) i/ili (E)-1,4-dibromobut-2-en.

[0055] U drugom primernom postupku, amino grupa bočnog lanca i terminalna amino grupa umrežavaju se sa disukcinimidil glutaratom (vidi Millward, S.W. et al., J. Am. Chem. Soc.127:14142-14143, 2005). U drugim pristupima, ciklizacija se postiže obrazovanjem tioetarske veze između dva mesta na polipeptidu (vidi Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem 6:821-824). Enzimski postupak oslanja se na reakciju između (1) cisteina i (2) dehidroalanin ili dehidrobutirin grupe, katalizovan lantibiotičkom sintetazom, da bi se stvorila tioetarska veza (vidi Levengood, M.R. i Van der Donk, W.A., Bioorg. i Med. Chem. Lett. 18:3025-3028, 2008). Dehidro funkcionalna grupa takođe može da se generiše hemijski oksidacijom aminokiselinskih bočnih lanaca koji sadrže selen ugrađenih tokom translacije (vidi Seebeck, F.P. i Szostak, J.W. J. Am. Chem. Soc.2006).

[0056] Biblioteka fuzija mRNK-polipeptida (ovde se takođe naziva biblioteka mRNK prikaza) generisana pomoću prethodno opisanih postupaka, a koje mogu ili ne moraju da se podvrgnu posttranslacionoj modifikaciji (kao što je ciklizacija polipeptida, kao što je prethodno opisano), mogu da se podvrgnu fazi izbora serije da bi se izolovali oni kompleksi koji prikazuje željene polipeptide.

[0057] Obično, C5 je konjugovan sa čvrstim supstratom, kao što je agaroza ili sintetička polimerna perla. Brojni postupci dostupni su za imobilizaciju C5 na čvrsti nosač. U jednom posebno korisnom postupku, C5 se konjuguje sa biotinom, a perle streptavidina koriste se za imobilizaciju proteina. Perle koje obuhvataju imobilisani C5 umešavaju se sa bibliotekom mRNK prikaza i inkubiraju u uslovima (npr., temperatura, jonska jačina, dvovalentni katjoni i molekuli kompetitivnog vezivanja) koji omogućavaju vezivanje specifičnih članova biblioteke za metu. Alternativno, biotinilovani enzim može biti slobodan u rastvoru i, nakon vezivanja za odgovarajući polipeptid, fuzije mRNK-polipeptida vezane za C5 hvataju se odgovarajućim modifikovanim perlama.

[0058] Uslovi vezivanja mogu da variraju da bi se promenila strogost izbora. Na primer, niske koncentracije agensa kompetitivnog vezivanja mogu da se dodaju kako bi se osiguralo da odabrani polipeptidi imaju relativno veći afinitet. Alternativno, može se odabrati da period inkubacije bude veoma kratak, tako da će se izolovati samo polipeptidi sa velikim konbrzinama (brzina vezivanja). Na ovaj način, uslovi inkubacije imaju značajnu ulogu u određivanju svojstava odabranih polipeptida. Negativne selekcije mogu takođe da se koriste. U ovom slučaju, izbor da se uklone polipeptidi sa afinitetom prema supstratu za koji je vezana meta (npr., Sefaroza) izvodi se nanošenjem prikazane biblioteke na perle supstrata kojima nedostaje ciljni protein. Ovom fazom mogu da se uklone mRNK i njeni kodirani polipeptidi koji nisu specifični za ciljni protein. Značajne su brojne reference koje opisuju kako izvesti

2

eksperimente selekcije. (Vidi, npr., U.S. Patent br.6,258,558, Smith, G.P. i Petrenko, V.A., (1997) Chem. Rev.97:391-410; Keefe, A.D. i Szostak, J.W. (2001) Nature 15:715-718; Baggio, R. et al. (2002) J. Mol. Recog.15:126-134 i Sergeeva, A. et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev.58:1622-1654).

[0059] Očekuje se da je učestalost sa kojom su vezujući molekuli prisutni u biblioteci nasumičnih sekvenci veoma niska. Prema tome, u početnoj fazi selekcije, trebalo bi da se izdvoji veoma malo polipeptida koji ispunjavaju kriterijume selekcije (i njihove povezane mRNK). Obično, selekcija se ponavlja sa mRNK odabranim u prvoj rundi selekcije. Ovo se postiže pomoću PCR kojim se pojačavaju mRNK ili odgovarajuće cDNK odabrane u prvoj rundi, praćeno in vitro transkripcijom da bi se proizvela nova biblioteka mRNK. Koriste se PCR prajmeri koji odgovaraju 5' i 3' krajevima mRNK u biblioteci. Obično, 5' prajmer prostiraće se u 5' pravcu dalje od kraja mRNK tako da se bakterijski promoter, kao što je T7 promoter, dodaje na 5' kraj svakog amplifikovanog molekula. Jednom kada se pojača, dvolančana DNK može da se koristi u in vitro reakciji transkripcije da bi se generisala mRNK za naknadnu rundu selekcije.

[0060] Postupak selekcije obično uključuje veći broj rundi ili ciklusa, u kojima se pul odabranih molekula postepeno obogaćuje u specifičnom skupu sekvenci na kraju svake runde. Uslovi selekcije mogu biti isti za svaku rundu, ili se uslovi mogu menjati, na primer, da bi se povećala strogost selekcije u kasnijim rundama. Napredovanje selekcije može da se prati upotrebom izotopski-obeleženih aminokiselina, kao što je<35>S metionin. Količina radioobeleženog polipeptida vezanog za metu meri se u svakoj rundi, a progresivno povećanje izdvojenih radiooznake je indikativ progresivnog obogađivanja RNK molekulima koji kodiraju polipeptide sa afinitetom vezivanja za metu. Nakon bilo koje runde, PCR proizvodi mogu da se kloniraju i sekvenciraju. Uopšteno, kloniranje i sekvenciranje izvodi se nakon svake runde u kojima su merljive (npr. >2% preko pozadine do perli koje nemaju imobilisani C5) količine radioobeleženog polipeptida izdvajaju u pulu vezanom za metu. Sekvence koje se nalaze u višestrukim izolatima su kandidati za kodiranje polipeptida koji se vezuju specifično za metu. Alternativno, visoko propusno sekvenciranje hiljada klonova može se izvesti nakon prve ili naknadnih rundi. Sekvence koje povećavaju učestalost između, na primer, trećih i četvrtih runda su kandidati za kodiranje polipeptida koji se vezuju specifično za metu. Polipeptid kodiran bilo kojom sekvencom mogu se prevesti ili sintetizovati i ispitati za afinitet vezivanja za originalni ciljni protein korišćen u selekciji.

[0061] Biblioteke i postupci mogu da se koriste za optimizovanje funkcije ili svojstava polipeptida. U jednom pristupu, mutagena PCR (Keefe, A.D. i Szostak, J.W. (2001). Nature 15:715-718) koristi se za uvođenje varijacije sekvence u biblioteku kada se populacija obogati polipeptidima sa određenim nivoom afiniteta vezivanja. Alternativno, jedna RNK sekvenca koja kodira polipeptid sa definisanim svojstvima vezivanja može da se replikuje, ali sa definisanim nivoom mutacija, ili mutagena PCR može se izvesti za proizvodnju pula mutantnih molekula. Nakon in vitro translacije očekuje se da dobijena mešavina mRNK molekula proizvedenih iz takvog pula kodira polipeptide sa nizom poboljšanih, sličnih ili smanjenih afiniteta u odnosu na polaznu sekvencu, i može da se očekuje da se selekcijom izvedenom na mRNK iz takvog pula identifikuju polipeptidi sa poboljšanim afinitetom ako se koristi odgovarajući strogi režim tokom selekcije.

[0062] U drugom pristupu, optimizacija se izvodi na direktan način. Sekvenca koja kodira polipeptid sa ustanovljenim svojstvima vezivanja ili funkcionalnim svojstvima podvrgava se mutagenezi usmerenoj na mesto, čime se proizvode serije sekvenci, gde svaka sekvenca ima jedan kodon zamenjen, na primer, kodonom alanina. Broj sekvenci u skupu je jednak broju aminokiselinskih ostataka koje treba mutirati. Nakon in vitro translacije, polipeptidni proizvod svakog "alanin skenirajućeg" mutanta ispituje se za svojstva vezivanja ili funkcionalna svojstva. Mesta na kojima supstitucija alanina utiče na vezivanje ili funkciju polipeptida smatraju se kritičnim ostacima. Slično tome, N-metil skeniranje može se izvesti, tako da se svaki ostatak zameni sa N-metil derivatom, a položaji u polipeptidnoj kičmi, koji mogu da tolerišu N-metil supstitucije, mogu da se identifikuju.

[0063] Alternativno, sekvence mogu se objediniti, podvrgnuti jednoj ili više rundi visoko stroge selekcije, a izoluje se pul sekvenci koje predstavljaju polipeptide sa visokim afinitetom vezivanja. Kritični ostaci identifikuju se nakon DNK sekvenciranja izdvojene DNK kao oni koji ne mogu da se supstituišu ostatkom alanina bez gubitka aktivnosti. Kada se identifikuju kritični ostaci, proizvodi se pul mRNK molekula koji kodiraju širok spektar prirodnih (ili neprirodnih) aminokiselina na svakom kritičnom položaju. Dobijeni pul podrvrgava se jednoj ili više rundi veoma stroge selekcije (sa odgovarajućom mešavinom tRNK koja ima prirodne ili neprirodne aminokiseline), a sekvence koje predstavljaju polipeptide vezivanja visokog afiniteta izoluju se nakon in vitro translacije. Na ovaj način, optimalni polipeptid može da se identifikuje. Budući da optimalna sekvenca ne mora nužno da se identifikuje kombinovanjem optimalnih ostataka na pojedinačnim mestima, korisno je testiranje mutacija na višestrukim mestima u kombinaciji.

[0064] Takođe se i skeniranje alanina i N-metila mogu izvesti pomoću pristupa hemijske sinteze, kao što je sinteza polipeptida na čvrstoj fazi (vidi npr., Coin, I et al. (2007); Nature Protocols 2(12):3247-56).

[0065] Kada se identifikuje pul, populacija ili podskup polipeptida, mogu se proceniti za njihovu terapijske ili dijagnostičke primene, uključujući poboljšana farmakokinetička i/ili farmakodinamička svojstva.

[0066] U jednom slučaju, polipeptidi se ocenjuju za jedan ili više od ciljnog afiniteta vezivanja, aktivnosti u biohemijskim testovima ili testovima na bazi ćelije, rezistencije na proteaze, in vitro ili in

vivo propustljivosti, svojstava vezanih za pogodnost za upotrebu kao farmaceutskog agensa kao što je vezivanje proteina u plazmi, metabolizam (u mikrozomima, hepatocitima ili plazmi), inhibiciju P-glikoproteina (Pgp) i inhibiciju citohroma P450. Polipeptidi se takođe mogu podvrgnuti testiranju za oralnu biodostupnost, toksičnost, inhibiciju humanog etar-a-go-go povezanog genskog proizvoda (hERG), poluživot u cirkulaciji, druge farmakokinetičke i farmakodinamičke parametre i efikasnost životinjskih modela bolesti.

Polipeptidi

[0067] Prema ovom otkrivanju, kada se identifikuje jedan polipeptid ili pul kandidatnih polipeptidnih molekula, oni se podvrgavaju jednoj ili više rundi optimizacije odnosa strukture i aktivnosti (SAR) pomoću standardnih hemijskih tehnika i tehnika sinteze polipeptida. Takva optimizacija može da uključuje razmatranja kao što su izbegavanje naelektrisanih polarnih bočnih lanaca (Asp, Glu, Arg, Lys) koji mogu da inhibiraju prodiranje u ćeliju, izbegavanje bočnih lanaca koji predstavljaju metaboličke obaveze (Tyr, Met, Trp, Cys), poboljšanje rastvorljivosti, izbegavanje nepotrebne molekulske mase, izbegavanje rotirajućih veza i izmenu lipofilnosti.

[0068] Polipeptidi mogu da obuhvataju od oko 10 do oko 18 aminokiselina ili aminokiselinskih varijanti. U nekim slučajevima, takvi polipeptidi obuhvataju cikličnu petlju.

Aminokiselinske varijante

[0069] Kao što se ovde koristi, pojam "aminokiselina" uključuje ostatke prirodnih aminokiselina kao i neprirodnih aminokiselina. Pojam takođe uključuje aminokiseline koje nose konvencionalnu amino zaštitnu grupu (npr. acetil ili benziloksikarbonil), kao i prirodne i neprirodne aminokiseline zaštićene na karboksilnom kraju (npr., kao (C1-C6) alkil, fenil ili benzil estar ili amid; ili kao alfa-metilbenzil amid). Druge pogodne amino i karboksi zaštitne grupe poznate su stručnjacima u tehnici (vidi na

primer, Greene, T. W.; Wutz, P G. M., Protecting Groups In Organic Synthesis; drugo izdanje, 1991, New York, John Wiley & sons, Inc., i dokumentima navedenim u njemu). Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu takođe da uključuju modifikovane aminokiseline.

[0070] Neprirodne aminokiseline korisne za optimizaciju polipeptida i/ili polipeptidnih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na 1,2,3,4-tetrahidroizokvinolin-1-karboksilnu kiselinu, 1-amino-2,3-hidro-1H-inden-1-karboksilnu kiselinu, homolizin, homoarginin, homoserin, 2-aminoadipinsku kiselinu, 3-aminoadipinsku kiselinu, beta-alanin, aminopropansku kiselinu, 2-aminobutirnu kiselinu, 4-aminobutirnu kiselinu, 5-aminopentansku kiselinu, 5-aminoheksansku kiselinu, 6-aminokaproinsku kiselinu, 2-aminoheptansku kiselinu, 2-aminoizobutirnu kiselinu, 3-aminoizobutirnu kiselinu, 2-aminopimelnu kiselinu, dezmozin, 2,3-diaminopropansku kiselinu, N-etilglicin, N-etilasparagin, homoprolin, hidroksilizin, alo-hidroksilizin, 3-hidroksiprolin, 4-hidroksiprolin, izodezmozin, alo-izoleucin, N-metilpentilglicin, naftilalanin, ornitin, pentilglicin, tioprolin, norvalin, terc-butilglicin, fenilglicin, azatriptofan, 5-azatriptofan, 7-azatriptofan, 4-fluorofenilalanin, penicilamin, sarkozin, homocistein, 1-aminociklopropankarboksilnu kiselinu, 1-aminociklobutankarboksilnu kiselinu, 1-aminociklopentankarboksilnu kiselinu, 1-aminocikloheksankarboksilnu kiselinu, 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-karboksilnu kiselinu, (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propionsku kiselinu, ciklopentilglicin, cikloheksilglicin, ciklopropilglicin, η-ω-metil-arginin, 4-hlorofenilalanin, 3-hlorotirozin, 3-fluorotirozin, 5-

2

fluorotriptofan, 5-hlorotriptofan, citrulin, 4-hloro-homofenilalanin, homofenilalanin, 4-aminometilfenilalanin, 3-aminometil-fenilalanin, oktilglicin, norleucin, traneksamsku kiselinu, 2-amino pentansku kiselinu, 2-amino heksansku kiselinu, 2-amino heptansku kiselinu, 2-amino oktansku kiselinu, 2-amino nonansku kiselinu, 2-amino dekansku kiselinu, 2-amino undekansku kiselinu, 2-amino dodekansku kiselinu, aminovalerijansku kiselinu, i 2-(2-aminoetoksi)sirćetnu kiselinu, pipekolnu kiselinu, 2-karboksi azetidin, heksafluoroleucin, 3-Fluorovalin, 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbuternu kiselinu, 3-fluoroizoleucin, 4-fluoroizoleucin, 5-fluoroizoleucin, 4-metil-fenilglicin, 4-etil-fenilglicin, 4-izopropil-fenilglicin, (S)-2-amino-5-azidopentansku kiselinu (ovde se takođe naziva "X02"), (S)-2-aminohept-6-ensku kiselinu (ovde se takođe naziva "X30"), (S)-2-aminopent-4-insku kiselinu (ovde se takođe naziva "X31"), (S)-2-aminopent-4-ensku kiselinu (ovde se takođe naziva "X12"), (S)-2-amino-5-(3-metilgvanidino) pentansku kiselinu, (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propionsku kiselinu, (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propionsku kiselinu, (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oksazol-5-il)buternu kiselinu, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-terc-leucinol, (R)-3-metilbutan-2-amin, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amin, i (S)-N,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amin, (S)-2-amino-3-(oksazol-2-il)propionsku kiselinu, (S)-2-amino-3-(oksazol-5-il)propionsku kiselinu, (S)-2-amino-3-(1,3,4-oksadiazol-2-il)propionsku kiselinu, (S)-2-amino-3-(1,2,4-oksadiazol-3-il)propionsku kiselinu, (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propionsku kiselinu, i (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propionsku kiselinu, (S)-2-amino-3-(oksazol-2-il)buternu kiselinu, (S)-2-amino-3-(oksazol-5-il) buternu kiselinu, (S)-2-amino-3-(1,3,4-oksadiazol-2-il) buternu kiselinu, (S)-2-amino-3-(1,2,4-oksadiazol-3-il) buternu kiselinu, (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il) buternu kiselinu, i (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il) buternu kiselinu, 2-(2'MeOfenil)-2-amino sirćetnu kiselinu, tetrahidro 3-izokvinolinkarboksilnu kiselinu i njihove stereoizomere (uključujući, ali bez ograničenja na D i L izomere).

[0071] Dodatne neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida ili polipeptidnih kompozicija uključuju, ali nisu ograničene na fluorisane aminokiseline kod kojih je jedan ili više atoma ugljenika vezanih za atome vodonika zamenjeno fluorom. Broj uključenih atoma fluora može da bude u opsegu od 1 do, a uključujući sve atome vodonika. Primeri takvih aminokiselina uključuju, ali nisu ograničeni na 3-fluoroprolin, 3,3-difluoroprolin, 4-fluoroprolin, 4,4-difluoroprolin, 3,4-difluroprolin, 3,3,4,4-tetrafluoroprolin, 4-fluorotriptofan, 5-flurotriptofan, 6-fluorotriptofan, 7-fluorotriptofan i njihove stereoizomere.

[0072] Dalje neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida ili polipeptidnih kompozicija uključuju, ali nisu ograničene na one koje su disupstituisane na α-ugljeniku. One uključuju aminokiseline u kojima su dva supstituenta na α-ugljeniku ista, na primer α-amino izobutirna kiselina i 2-amino-2-etil buterna kiselina, kao i one gde su supstituenti različiti, na primer α-metilfenilglicin i αmetilprolin. Dalje, supstituenti na α-ugljeniku mogu zajedno da obrazuju prsten, na primer 1-aminociklopentankarboksilna kiselina, 1- aminociklobutankarboksilna kiselina, 1aminocikloheksankarboksilna kiselina, 3-aminotetrahidrofuran-3-karboksilna kiselina, 3-aminotetrahidropiran-3-karboksilna kiselina, 4-aminotetrahidropiran-4-karboksilna kiselina, 3-aminopirolidin-3-karboksilna kiselina, 3-aminopiperidin-3-karboksilna kiselina, 4-aminopiperidinnne-4-karboksilix kiselina i njihovi stereoizomeri.

[0073] Dodatne neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida ili polipeptidnih kompozicija uključuju, ali nisu ograničene na analoge triptofana u kojima je sistem indolnog prstena zamenjen drugim 9- ili 10-članim bicikličnim sistemom prstena koji obuhvata 0,1,2,3 ili 4 heteroatoma nezavisno odabrana od N,O ili S. Svaki sistem prstena može biti zasićen, delimično nezasićen ili potpuno nezasićen. Sistem prstena može biti supstituisan sa 0,1,2,3, ili 4 supstituenta na bilo kom zamenljivom atomu. Svaki supstituent je nezavisno odabran od H, F, Cl, Br, CN, COOR, CONRR', okso, OR, NRR'. Svako R i R' je nezavisno odabrano od H, C1-C20 alkila, C1-C20 alkil-O-C1-20 alkila.

[0074] U nekim slučajevima, analozi triptofana (ovde se takođe nazivaju "triptofanski analozi") koji su korisni u optimizaciji polipeptida ili polipeptidnih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na 5-fluorotriptofan [(5-F)W], 5-metil-O-triptofan [(5-MeO)W], 1-metiltriptofan [(1-Me-W) ili (1-Me)W], D-triptofan (D-Trp), azatriptofan (uključujući, ali ne ograničavajući se na 4-azatriptofan, 7-azatriptofan i 5-azatriptofan,) 5-hlorotriptofan, 4-fluorotriptofan, 6-fluorotriptofan, 7-fluorotriptofan i njihove stereoizomere. Osim tamo gde je naznačeno suprotno, pojam "azatriptofan" i njegova skraćenica, "azaTrp," kao što se ovde koristi, odnosi se na 7-azatriptofan.

[0075] Modifikovani aminokiselinski ostaci korisni za optimizaciju polipeptida i/ili polipeptidnih kompozicija uključuju, ali nisu ograničeni na one koji su hemijski blokirani, povratni ili nepovratni, ili hemijski modifikovani na njihovoj N-terminalnoj amino grupi ili njihovim grupama bočnog lanca, ili hemijski modifikovani u amidnoj kičmi, kao na primer, N-metilovani, D (neprirodnih aminokiselina) i L (prirodnih aminokiselina) stereoizomeri ili ostaci u kojima su funkcionalne grupe bočnog lanca hemijski modifikovane u drugu funkcionalnu grupu. Na primer, modifikovane aminokiseline uključuju, bez ograničenja, metionin sulfoksid; metionin sulfon; asparaginska kiselina-(beta-metil estar), modifikovanu aminokiselinu asparaginske kiseline; N-etilglicin, modifikovanu aminokiselinu glicina; ili alanin karboksamid, i modifikovanu aminokiselinu alanina. Neprirodne aminokiseline mogu se nabaviti od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Bachem (Torrance, CA) ili drugih dobavljača. Neprirodne aminokiseline mogu dalje da uključuju bilo koju od onih navedenih u Tabeli 2 u US objavi patenta US 2011/0172126.

[0076] U nekim slučajevima, aminokiselinske sekvence polipeptida i/ili polipeptidnih kompozicija mogu da obuhvataju samo aminokiseline koje se javljaju u prirodi.

[0077] Polipeptidi mogu da obuhvataju aminokiseline i koje se javljaju i koje se ne javljaju u prirodi i/ili modifikovane aminokiseline ili mogu isključivo da obuhvataju aminokiseline koje se ne javljaju u prirodi.

2

Polipeptidne varijante

[0078] Bilo koji molekul na bazi aminokiselina (prirodnih ili neprirodnih) može se nazvati "polipeptid" i ovaj pojam obuhvata "peptide", "peptidomimetike" i "proteine." Polipeptidi su takođe kategorija proteina i tradicionalno se smatraju da su veličine koja iznosi od oko 4 do oko 50 aminokiselina.

Dipeptidi, oni koji imaju dva aminokiselinska ostatka, su kategorija polipeptida kao što su tripeptidi (polipeptidi koji obuhvataju tri aminokiseline). Polipeptidi veći od oko 50 aminokiselina uopšteno se nazivaju "proteini." Polipeptidne sekvence mogu biti linearne ili ciklične. Na primer, ciklični polipeptid može se pripremiti ili može da se dobije obrazovanjem disulfidnih veza između dva cisteinska ostatka u sekvenci. Polipeptid može da se ciklizuje preko karboksilnog kraja, amino kraja ili preko bilo koje druge odgovarajuće tačke vezivanja, kao što je, na primer, preko sumpora cisteina ili bilo kog bočnog lanca aminokiselinskog ostatka ili druge veze uključujući, ali ne ograničavajući se na, maleimidnu vezu, amidnu vezu, estarsku vezu, etarsku vezu, tiol etarsku vezu, hidrazonsku vezu ili acetamidnu vezu. U nekim slučajevima, ciklični polipeptidi obrazuju se kada molekul deluje kao premošćavajući ostatak za vezivanje dva ili više regiona polipeptida.

[0079] Pojam "varijanta aminokiselinske sekvence" odnosi se na polipeptide sa nekim razlikama u njihovim aminokiselinskim sekvencama u poređenju sa početnom, referentnom ili urođenom sekvencom. Varijante aminokiselinskih sekvenci mogu imati supstitucije, delecije i/ili umetanja na određenim položajima unutar aminokiselinske sekvence. Obično, varijante će imati najmanje oko 70% homologije sa urođenom ili polaznom sekvencom, a poželjno, one će biti najmanje oko 80%, poželjnije najmanje oko 90% homologne urođenoj ili polaznoj sekvenci.

[0080] "Homologija" kao što se primenjuje na aminokiselinske sekvence definiše se kao procenat ostataka u kandidatnoj aminokiselinskoj sekvenci koji su identični ostacima u aminokiselinskoj sekvenci druge sekvence nakon poravnanja sekvenci i uvođenja praznina, po potrebi, radi postizanja maksimalnog procenta homologije. Postupci i računarski programi za poravnanje dobro su poznati u tehnici. Podrazumeva se da homologija zavisi od izračunavanja procenta identiteta ali se može razlikovati vrednost zbog praznina i korekcija uvedenih u račun.

[0081] "Homolozi", kao što se primenjuje na aminokiselinske sekvence, znači odgovarajuća sekvenca drugih vrsta koje imaju suštinski identitet sa drugom sekvencom drugih vrsta.

[0082] "Analozi" treba da uključuju varijante aminokiselinskih sekvenci koje se razlikuju po jednoj ili više izmena aminokiselina, npr., supstitucije, adicije ili delecije aminokiselinskih ostataka koji su i dalje zadržali jedno ili više od svojstava matičnog ili polaznog polipeptida.

[0083] Ovo otkrivanje razmatra nekoliko vrsta kompozicija koje uključuju polipeptide uključujući varijante i derivati. One uključuju supstitucione, insercione, delecione i kovalentne varijante i derivate. Pojam "derivat" koristi se kao sinonim za pojam "varijanta" i odnosi se na molekul koji je modifikovan ili izmenjen na bilo koji način u odnosu na referentni molekul ili polazni molekul.

2

[0084] Kao takvi, ovde su opisani polipeptidi koji sadrže supstitucije, umetanja i/ili adicije, delecije i kovalentne modifikacije. Na primer, oznake sekvenci ili aminokiseline, kao što je jedan ili više lizina, mogu se dodati polipeptidnim sekvencama (npr., na N-terminalnim ili C-terminalnim krajevima). Oznake sekvenci mogu da se koriste za prečišćavanje ili lokalizaciju polipeptida. Lizini mogu da se koriste za povećanje rastvorljivosti polipeptida ili da bi se omogućile modifikacije specifične za mesto, kao što su, ali ne ograničavajući se na, biotinilacija ili PEGilacija. U nekim slučajevima, polipeptidi mogu biti destiobiotinilovan. Kao što se ovde koristi, polipeptid koji je destiobiotinilovan mogu da obuhvataju ostatak destiobiotina (Dtb) konjugovan sa epsilon-amino grupom lizinskog ostatka. Takvi lizinski ostaci mogu biti C-terminalni ostaci u nekim slučajevima. Alternativno, aminokiselinski ostaci koji se nalaze u karboksi i amino terminalnim regionima aminokiselinske sekvence polipeptida mogu opciono da se obrišu, obezbeđujući skraćene sekvence. Određene aminokiseline (npr., C-terminalni ili N-terminalni ostaci) mogu alternativno da se obrišu zavisno od upotrebe sekvence, kao na primer, ekspresija sekvence kao dela veće sekvence, koja je rastvorljiva, ili povezana sa čvrstim nosačem.

[0085] "Supstitucione varijante" kada se odnose na polipeptide su one koje imaju najmanje jedan aminokiselinski ostatak u urođenoj ili polaznoj sekvenci uklonjen i umetnutu neku drugu aminokiselinu na njegovo mesto na istom položaju. Supstitucije mogu biti pojedinačne, gde je samo jedna aminokiselina u molekulu zamenjena, ili mogu biti višestruke, gde su dve ili više aminokiselina zamenjene u istom molekulu.

[0086] Kao što se ovde koristi pojam "konzervativna aminokiselina supstitucija" odnosi se na supstituciju neke aminokiseline koja je normalno prisutna u sekvenci nekom drugom aminokiselinom slične veličine, naelektrisanja ili polariteta. Primeri konzervativnih supstitucija uključuju supstituciju nepolarnog (hidrofobnog) ostatka kao što su izoleucin, valin i leucin drugim nepolarnim ostatkom. Slično, primeri konzervativnih supstitucija uključuju supstituciju jednog polarnog (hidrofilnog) ostatka drugim kao što je između arginina i lizina, između glutamina i asparagina, i između glicina i serina. Pored toga, supstitucija baznog ostatka kao što je lizin, arginin ili histidin drugim, ili supstitucija jednog kiselog ostatka kao što je asparaginska kiselina ili glutaminska kiselina drugim kiselim ostatkom su dodatni primeri konzervativnih supstitucije. Primeri nekonzervativnih supstitucija uključuju supstituciju nepolarnog (hidrofobnog) aminokiselinskog ostatka kao što je izoleucin, valin, leucin, alanin, metionin polarnim (hidrofilnim) ostatkom kao što je cistein, glutamin, glutaminska kiselina ili lizin i/ili polarnog ostatka nepolarnog ostatka.

[0087] "Izosteri" su jedan od dva ili više molekula koji pokazuju neku sličnost bioloških svojstava kao rezultat što imaju isti broj ukupnih ili valentnih elektrona u istom rasporedu i koji se sastoje od različitih atoma, ne nužno od istog broja atoma. Postoje dve klase izostera, klasični i neklasični. Klasični izosteri imaju isti broj atoma i/ili isti broj valentnih elektrona dok su neklasični izosteri molekuli koji proizvode slični biološki efekat in vivo ali nemaju isti broj atoma i/ili valentnih elektrona.

2

[0088] Prema ovom otkrivanju, "izosteri peptidne veze" su definisani kao izosteri koji imaju svojstva koja liče na peptidne veze. Izosteri peptidne veze mogu biti linearnog tipa koji obuhvata najmanje jednu zamenu peptidne veze ili mogu biti ciklični i da obuhvataju amin i funkciju karboksilne kiseline. Takva zamena može biti bilo kojim ostatkom koji poboljšava fizičko-hemijska, strukturna ili funkcionalna svojstva molekula. Zamena peptidne veze može da poveća metaboličku stabilnost polipeptida i smanji ili poveća fleksibilnost. Izosteri peptidne veze opisani ovde mogu biti izosteri mono-, di-, tri-, tetra-, penta-, seksta-, septa-, okta-, nona- ili deka-peptidne veze, što znači da može da bude zamenjeno najmanje 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ili 10 peptidnih veza. Neograničavajući primeri linearnih izostera dipeptidne veze za amidne (peptidne) veze uključuju tioamid, sulfonamid, sulfonat, fosfonamid, fosfonat fosfotioat, fosfinat, alkan, 1 ili 2 hidroksietilen, dihidroksiletilen, C-C jednostruku vezu (alkan), C-C dvostruku vezu (alken), C-C trostruku vezu (alkin), C-O vezu (metilenoksi), O-N ili N-O vezu,(metilenmino), triazol, hidrazid, urea, keton, uretansku vezu, (di)haloalken, metilenmerkapto, metilenamino, trifluoroetilamino, hidrazid, amidoksi i druge poznate stručnjacima u tehnici.

[0089] Izosteri peptidne veze mogu takođe da budu ciklični molekuli koji su dekorisani aminom i funkcijom karboksilne kiseline. Neograničavajući primeri cikličnih izostera peptidne veze sa različitim veličinama prstena uključuju karbacikle, azacikle i oksacikle. Azacikli mogu biti na bazi alkaloidnog jezgra koje obrazuje izoster biciklične strukture. Primer azacikličnog izostera uključuje izoster na osnovu triazolnog prstena obrazovanog bakrom katalizovanom cikloadicijom azid-alkina. Ciklični izosteri peptidne veza ovde opisani mogu biti bi-, tri-, tetra-, penta-seksta-, septa-, okta- nona- deka-peptidni ciklični izosteri.

[0090] "Insercione varijante" kada se odnose na polipeptide su one sa jednom ili više aminokiselina umetnutih neposredno uz aminokiselinu na određenom položaju u urođenoj ili polaznoj sekvenci.

"Neposredno uz" aminokiselinu znači vezan ili za alfa-karboksi ili za alfa-amino funkcionalnu grupu te aminokiseline.

[0091] "Delecione varijante" kada se odnose na polipeptide su one sa uklonjenom jednom ili više aminokiselina u urođenoj ili polaznoj aminokiselinskoj sekvenci. Obično će delecione varijante imati jednu ili više aminokiselina obrisanih u određenom regionu molekula.

[0092] "Skraćene varijante" kada se odnose na polipeptide su one kod kojih je jedna ili više aminokiselina u urođenoj ili polaznoj aminokiselinskoj sekvenci uklonjeno iz bilo kog kraja polipeptida.

[0093] Polipeptidi se mogu modifikovati adicijom jedne ili više konjugatnih grupa. U nekim slučajevima, polipeptidi mogu da se daju u kombinaciji sa jednim ili više dodatnih molekula.

[0094] Kao što se ovde koristi, "konjugat" se odnosi na bilo koji molekul ili ostatak pridodat drugom molekulu. Konjugati mogu da budu ili mogu da ne budu na bazi polipeptida (aminokiselina). Konjugati mogu da obuhvataju lipide, male molekule, RNK, DNK, polipeptide, polimere ili njihove kombinacije. Funkcionalno, konjugati mogu da služe kao ciljajući molekuli ili mogu da služe kao nosač za dostavljanje

2

u ćeliju, organ ili tkivo. Konjugati su obično kovalentne modifikacije uvedene reagovanjem ciljnih aminokiselinskih ostataka ili krajeva polipeptida sa organskim agensom za derivatizaciju koji može da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima. Takve modifikacije su u okviru uobičajenih veština u ovoj tehnici i izvode se bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0095] Postupak konjugacije može da uključuje PEGilaciju, lipidaciju, albuminaciju, biotinilaciju, destiobiotinilaciju, dodavanje drugih repova polipeptidnih lanaca ili kalemljenje na Fc domene antitela, CDR regione netaknutih antitela, ili domene antitela proizvedene bilo kojim brojem sredstava. Konjugat može da uključuje sidra uključujući ostatak holestarol oleata, ostatak holestaril laurata, ostatak αtokoferola, fitolni ostatak, oleatni ostatak ili ostatak nezasićenog estra holestarola ili lipofilna jedinjenja odabrana od acetanilida, anilida, aminokvinolina, benzhidril jedinjenja, benzodiazepina, benzofurana, kanabinoida, cikličnih polipeptida, dibenzazepina, digitalis glikozida, ergot alkaloida, flavonoida, imidazola, kvinolina, makrolida, naftalena, opijata (kao što su, ali ne ograničavajući se na, morfinane ili drugi psihoaktivni lekovi), oksazine, oksazole, fenilalkilamine, piperidine, policiklične aromatične ugljovodonike, pirolidine, pirolidinone, stilbene, sulfoniluree, sulfone, triazole, tropane i vinka alkaloide. Lipidovani polipeptidi mogu da uključuju C-terminalne lipidovane polipeptide. U nekim slučajevima, polipeptidi su lipidovani sa zasićenim ili nezasićenim C12, C14, C16, C18 ili C20.

[0096] Kao što se ovde koristi, pojam "kovalentni derivat" kada se odnosi na polipeptid uključuje modifikaciju urođenog ili polaznog polipeptida sa organskim proteinskim ili ne-proteinskim agensom za derivatizaciju i/ili post-translacionu modifikaciju. Kovalentne modifikacije se tradicionalno uvode reagovanjem ciljanih aminokiselinskih ostataka polipeptida sa organskim agensom za derivatizaciju koji može da reaguje sa odabranim bočnim lancima ili terminalnim ostacima ili uz pomoć mehanizma posttranslacionih modifikacija koji funkcioniše u odabranim rekombinantnim ćelijama domaćina. Dobijeni kovalentni derivati su korisni u programima usmerenim na identifikovanje ostataka značajnih za biološku aktivnost, za imunotestove ili za pripremu anti-proteinskih za imunoafinitetno prečišćavanje rekombinantnog proteina. Takve modifikacije su u okviru uobičajenih veština u ovoj tehnici i izvode se bez nepotrebnog eksperimentisanja.

[0097] Određene post-translacione modifikacije rezultat su dejstva rekombinantnih ćelija domaćina na eksprimiran polipeptid. Glutaminil i asparaginil ostaci se često post-translaciono deamidiraju do odgovarajućih glutamil i aspartil ostataka. Alternativno, ovi ostaci se deamidiraju u blago kiselim uslovima. Bilo koji oblik ovih ostataka može biti prisutan u polipeptidima proizvedenim u skladu sa ovim otkrivanjem.

[0098] Druge post-translacione modifikacije uključuju hidroksilaciju prolina i lizina, fosforilaciju hidroksilnih grupa tirozinil, seril ili treonil ostataka, metilaciju alfa-amino grupa bočnih lanaca lizina, arginina i histidina (Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, pp.79-86).

2

[0099] Kovalentne modifikacije specifično uključuju vezivanje ne-proteinskih polimera za polipeptide. Ne-proteinski polimeri mogu da uključuju hidrofilni sintetički polimer, tj., polimer koji se inače ne nalazi u prirodi. Međutim, korisni su polimeri koji postoje u prirodi i koji se proizvode rekombinantnim ili in vitro postupcima, kao i polimeri koji se izoluju iz prirode. Hidrofilni polivinilni polimeri koji padaju su opisani, npr. polivinil alkohol i polivinilpirolidon. Polipeptidi mogu biti vezani za razne ne-proteinske polimere, kao što su polietilen glikol, polipropilen glikol ili polioksialkileni, na način koji je naveden u U.S. Pat. br.4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 ili 4,179,337.

[0100] "Karakteristike" koje se odnose na polipeptide definisane su kao različite komponente molekula zasnovane na aminokiselinskoj sekvenci. Karakteristike polipeptida ovog otkrivanja uključuju površinske manifestacije, lokalni konformacioni oblik, savijanja, petlje, polu-petlje, domene, polu-domene, mesta, krajeve ili bilo koju njihovu kombinaciju.

[0101] Kao što se ovde koristi kada se odnosi na polipeptide pojam "savijen" odnosi se na dobijenu konformaciju aminokiselinske sekvence pri minimiziranju energije. Savijanje može da se javi na sekondarnom ili tercijarnom nivou postupka savijanja. Primeri savijanja na sekundarnom nivou uključuju beta ravni i alfa helikse. Primeri tercijarnih savijanja uključuju domene i regione obrazovane usled agregacije ili separacije fizičko-hemijskih različitih regiona. Regioni obrazovani na ovaj način uključuju hidrofobne i hidrofilne džepove, i slično.

[0102] Kao što se ovde koristi pojam "okret" kao što se odnosi na konformaciju proteina znači krivinu koja menja orijentaciju kičme polipeptida i može da uključuje jedan, dva, tri ili više aminokiselinskih ostataka.

[0103] Kao što se ovde koristi kada se odnosi na polipeptide pojam "petlja" odnosi se na strukturnu karakteristiku polipeptida koja može da služi da preokrene pravac kičme polipeptida. Kada se petlja nalazi u polipeptidu i menja samo pravac kičme, može da obuhvata četiri ili više aminokiselinskih ostataka. Oliva et al. identifikovali su najmanje 5 klasa proteinskih petlji (Oliva, B. et al., J Mol Biol.1997 Mar 7;266(4):814-30).

[0104] Petlje mogu biti otvorene ili zatvorene. Zatvorene petlje ili "ciklične" petlje mogu da obrazuju kada su dve aminokiseline vezane preko premošćavajućeg ostatka. Ciklična petlja obuhvata aminokiseline duž polipeptida prisutne između premošćenih aminokiselina. Ciklične petlje mogu da obuhvataju 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više aminokiselina.

[0105] Kao što se ovde koristi kada se odnosi na polipeptide pojam "polu-petlja" odnosi se na deo neke identifikovane petlje koja ima najmanje polovinu broja aminokiselinskih ostataka kao petlja od koje je dobijena. Podrazumeva se da petlje ne moraju uvek da sadrže paran broj aminokiselinskih ostataka. Prema tome, u tim slučajevima gde petlja sadrži ili je identifikovana da obuhvata neparan broj aminokiselina, polu-petlja petlje sa neparnim brojem, će obuhvatati deo celog broja ili deo sledećeg celog broja petlji (broj aminokiselina petlje/2+/-0.5 aminokiselina). Na primer, petlja identifikovana kao petlja sa 7 aminokiselina može proizvesti polu-petlje od 3 aminokiselina ili 4 aminokiselina (7/2=3.5+/-0.5 što je jednako 3 ili 4).

[0106] Kao što se ovde koristi kada je reč o proteinima, pojam "region" se odnosi na zonu ili opšte područje. U nekim slučajevima, kada se odnosi na protein, region može da obuhvata linearnu sekvencu aminokiselina duž proteina ili može da obuhvata specifičnu sekundarnu ili tercijarnu strukturu i/ili jednu ili više karakteristika ili domena proteina.

[0107] Kao što se ovde koristi, pojam "domen," kada se odnosi na proteine, odnosi se na motiv polipeptida koji ima jednu ili više strukturnih (kao što su sekundarne ili tercijarne strukture) ili funkcionalni karakteristika ili svojstava koji se mogu identifikovati (npr., kapacitet vezivanja, koji služi kao mesto za interakciju protein-protein.)

[0108] Kao što se ovde koristi, pojam "polu-domen," kada se odnosi na proteine, odnosi se na deo identifikovanog domena koji ima najmanje polovinu broja aminokiselinskih ostataka kao domen od kojeg je dobijen. Podrazumeva se da domeni ne moraju uvek da sadrže paran broj aminokiselinskih ostataka. Prema tome, u onim slučajevima gde domen sadrži ili je identifikovan da obuhvata neparan broj aminokiselina, polu-domen domena sa neparnim brojem obuhvataće deo celog broja ili sledeći deo celog broja domena (broj aminokiselina domena/2+/-0.5 aminokiselina). Na primer, domen identifikovan kao domen sa 7 aminokiselina mogao bi da proizvede polu-domene sa 3 aminokiseline ili 4 aminokiseline (7/2=3.5+/-0.5 što je 3 ili 4). Takođe se podrazumeva da se poddomeni mogu identifikovati unutar domena ili polu-domena, pri čemu ovi poddomeni poseduju manje od svih od strukturnih ili funkcionalnih svojstava identifikovanih u domenima ili polu-domenima od kojih su dobijeni. Takođe se podrazumeva da aminokiseline koje obuhvataju bilo koje od vrsta domena ovde ne moraju biti susedne duž kičme polipeptida (tj., nesusedne aminokiseline mogu da se savijaju strukturno radi proizvodnje domena, polu-domena ili poddomena).

[0109] Kao što se ovde koristi kada se odnosi na polipeptide pojam "mesto" kada se odnosi na aspekte bazirane na aminokiselinama koristi se sinonimno sa "aminokiselinskim ostatkom" i "bočnim lancem aminokiselina." Mesto predstavlja položaj unutar polipeptida koji može biti modifikovan, izmanipulisan, izmenjen, derivatizovan ili promenjen u okviru molekula na bazi polipeptida.

[0110] Kao što se ovde koriste pojmovi "krajevi" ili "kraj" kada se odnose na polipeptide odnosi se na kraj nekog polipeptida. Takav kraj nije samo ograničen na prvo ili krajnje mesto polipeptida već može da uključuje dodatne aminokiseline u terminalnim regionima. Molekuli na bazi polipeptida mogu da se okarakterišu kao da imaju i N-kraj i C-kraj. Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida su u nekim slučajevima izrađeni od višestrukih polipeptidnih lanaca spojenih disulfidnim vezama ili nekovalentnim silama (multimeri, oligomeri). Ove vrste proteina imaće više N- i C-krajeva. Alternativno, krajevi polipeptida mogu da budu modifikovani tako da počinju ili se završavaju, u zavisnosti od slučaja, ostatkom koji nije na bazi polipeptida kao što je neki organski konjugat.

1

[0111] Polipeptidi mogu da uključuju neki terminalni region. Kao što se ovde koristi, "terminalni region" je terminalni region aminokiselina koje mogu da uključuju cistein. Terminalni region može biti N- i/ili C-terminalni region. U nekim slučajevima, terminalni regioni mogu da budu povezani sa matičnim polipeptidima preko premošćavajućeg ostatka. Kao što se ovde koristi, "matični polipeptid" odnosi se na deo polipeptida koji ne uključuje terminalni region. Terminalni region može da bude razdvojen od matičnog polipeptida sa 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više ostataka. Dodati ostaci mogu biti odabrani od, ali bez ograničenja na, bilo koje prirodne ili neprirodne aminokiseline, N-metilovanog oblika bilo koje prirodne ili neprirodne aminokiseline, D-stereoizomera bilo koje prirodne ili neprirodne aminokiseline norvalina, terc-butilglicina, fenilglicina, azatriptofana, 7-azatriptofana, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, sarkozina, homocisteina, 1-aminociklopropankarboksilne kiseline, 1-aminociklobutankarboksilne kiseline, 1-aminociklopentankarboksilne kiseline, 1-aminocikloheksankarboksilne kiseline, 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-karboksilne kiseline, aminoizobutirne kiseline, (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propionske kiseline, ciklopentilglicina, cikloheksilglicina, ciklopropilglicina, η-ω-metil-arginina, 4-hlorofenilalanina, 3-hlorotirozina, 3-fluorotirozina, 5-fluorotriptofana, 5-hlorotriptofana, citrulina, 4-hloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4-aminometil-fenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, oktilglicina, norleucina, traneksamske kiseline, 2-amino pentanske kiseline, 2-amino heksanske kiseline, 2-amino heptanske kiseline, 2-amino oktanske kiseline, 2-amino nonanske kiseline, 2-amino dekanske kiseline, 2-amino undekanske kiseline, 2-amino dodekanske kiseline, aminovalerijanske kiseline i 2-(2-aminoetoksi)sirćetne kiseline, pipekolne kiseline, 2-karboksi azetidina, heksafluoroleucina, 3-Fluorovalina, 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbuterne kiseline, 3-fluoro-izoleucina, 4-fluoroizoleucina, 5-fluoroizoleucina, 4-metil-fenilglicina, 4-etil-fenilglicina, 4-izopropil-fenilglicina, (S)-2-amino-5-(3-metilgvanidino) pentanske kiseline, (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propionske kiseline, (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oksazol-5-il)buterne kiseline, (S)-leucinola, (S)-valinola, (S)-terc-leucinola, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina, i (S)-N,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amina, (S)-2-amino-3-(oksazol-2-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(oksazol-5-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(1,3,4-oksadiazol-2-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(1,2,4-oksadiazol-3-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propionske kiseline, i (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propionske kiseline.

[0112] Dodatne neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na fluorisane aminokiseline, pri čemu je jedan ili više atoma ugljenika vezanih za atome vodonika zamenjeno fluorom. Broj uključenih atoma fluora može da bude u opsegu od 1 do i uključujući sve atome vodonika. Primeri takvih aminokiselina uključuju, ali nisu ograničene na 3-fluoroprolin, 3,3-difluoroprolin, 4-fluoroprolin, 4,4-difluoroprolin, 3,4-difluroprolin, 3,3,4,4-tetrafluoroprolin, 4-fluorotriptofan, 6-fluorotriptofan, 7-fluorotriptofan i njihove stereoizomere.

2

[0113] Dalje neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida uključuju, ali nisu ograničene na one koje su disupstituisane na α-ugljeniku. One uključuju aminokiseline u kojima su dva supstituenta na α-ugljeniku ista, na primer α-amino izobutirna kiselina i 2-amino-2-etil buterna kiselina, kao i one gde su supstituenti različiti, na primer α-metilfenilglicin i α-metilprolin. Dalji supstituenti na αugljeniku mogu zajedno da obrazuju prsten, na primer 1-aminociklopentankarboksilna kiselina, 1-aminociklobutankarboksilna kiselina, 1-aminocikloheksankarboksilna kiselina, 3-aminotetrahidrofuran-3-karboksilna kiselina, 3-aminotetrahidropiran-3-karboksilna kiselina, 4-aminotetrahidropiran-4-karboksilna kiselina, 3-aminopirolidin-3-karboksilna kiselina, 3-aminopiperidin-3-karboksilna kiselina, 4-aminopiperidinnne-4-karboksilix kiselina, i njihove stereoizomere.

[0114] Dodatne neprirodne aminokiseline koje su korisne u optimizaciji polipeptida uključuju, ali nisu ograničene na analoge triptofana u kojima je sistem indolnog prstena zamenjen drugim 9- ili 10-članim bicikličnim sistemom prstena koji obuhvata 0,1,2,3 ili 4 heteroatoma nezavisno odabrana od N,O ili S. Svaki sistem prstena može biti zasićen, delimično nezasićen ili potpuno nezasićen. Sistem prstena može biti supstituisan sa 0,1,2,3 ili 4 supstituenta na bilo kom zamenljivom atomu. Svaki supstituent je nezavisno odabran od H, F, Cl, Br, CN, okso, COOR, CONRR', OR, NRR'. Svako R i R' je nezavisno odabrano od H, C1-C20 alkila, C1-C20 alkil-O-C1-20 alkila.

[0115] Analozi triptofana (ovde se takođe nazivaju "triptofanski analozi") koji su korisni u optimizaciji polipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, 5-fluorotriptofan [(5-F)W], 5-metil-O-triptofan [(5-MeO)W], 1-metiltriptofan [(1-Me-W) ili (1-Me)W], D-triptofan (D-Trp), 7-azatriptofan (uključujući, ali ne ograničavajući se na 4-azatriptofan, 7-azatriptofan i 5-azatriptofan,) 5-hlorotriptofan, 4-fluorotriptofan, 6-fluorotriptofan, 7-fluorotriptofan, i njihove stereoizomere. Osim tamo gde je naznačeno suprotno, pojam "azatriptofan" i njegova skraćenica, "azaTrp," kao što se ovde koristi, odnosi se na 7-azatriptofan.

[0116] Polipeptidi mogu da uključuju terminalnu modifikaciju na N- ili C-krajevima sa dodavanjem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ili više ostataka i/ili cisteina u terminalnom regionu. Dodati ostaci mogu biti odabrani od, ali neograničavajući se na, bilo koje prirodne ili neprirodne aminokiseline, N-metilovanog oblika bilo koje prirodne ili neprirodne aminokiseline, D-stereoizomera bilo koje aminokiseline, norvalina, terc-butilglicina, fenilglicina, azatriptofana, 7-azatriptofana, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, sarkozina, homocisteina, 1-aminociklopropankarboksilne kiseline, 1-aminociklobutankarboksilne kiseline, 1-aminociklopentankarboksilne kiseline, 1-aminocikloheksankarboksilne kiseline, 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-karboksilne kiseline, aminoizobuterne kiseline, (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propionske kiseline, ciklopentilglicina, cikloheksilglicina, ciklopropilglicina, η-ω-metil-arginina, 4-hlorofenilalanina, 3-hlorotirozina, 3-fluorotirozina, 5-fluorotriptofana, 5-hlorotriptofana, citrulina, 4-hloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4-aminometil-fenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, oktilglicina, norleucina, traneksamske kiseline, 2-amino pentanske kiseline, 2-amino heksanske kiseline, 2-amino heptanske kiseline, 2-amino oktanske kiseline, 2-amino nonanske kiseline, 2-amino dekanske kiseline, 2-amino undekanske kiseline, 2-amino dodekanske kiseline, aminovalerijanske kiseline, i 2-(2-aminoetoksi)sirćetne kiseline, pipekolne kiseline, 2-karboksi azetidina, heksafluoroleucina, 3-Fluorovalina, 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbuterne kiseline, 3-fluoro-izoleucina, 4-fluoroizoleucina, 5-fluoroizoleucina, 4-metil-fenilglicina, 4-etil-fenilglicina, 4-izopropil-fenilglicina, (S)-2-amino-5-(3-metilgvanidino) pentanske kiseline, (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propionske kiseline, (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oksazol-5-il)buterne kiseline, (S)-leucinola, (S)-valinola, (S)-terc-leucinola, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina, i (S)-N,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amina, (S)-2-amino-3-(oksazol-2-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(oksazol-5-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(1,3,4-oksadiazol-2-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(1,2,4-oksadiazol-3-il)propionske kiseline, (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propionske kiseline i (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propionske kiseline.

[0117] Polipeptidi mogu biti konjugovani sa polipeptidom koji povećava ili smanjuje vezivanje proteina u plazmi uključujući ali ne ograničavajući se na one opisane u Dennis, M.S. et al., Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. J Biol Chem.2002 Sep 20;

277(38):35035-43; Nguyen, A. et al., Farmakokinetike Fab koji vezuje albumin (AB Fab) mogu se izmeniti kao funkcija afiniteta za albumin. Protein Eng Des Sel.2006 Jul; 19(7):291-7 i Langerheim, J.F. et al., Poboljšanje farmakokinetika/farmakodinamike prolaktina, GH i njihovih antagonista spajanjem sa sintetičkim polipeptidom koji vezuje albumin. J Endocrinol.2009 Dec;203(3):375-87. U nekim slučajevima, takvi polipeptidi vezuju serum albumin (ovde se nazivaju "albumin-vezujući polipeptidi"). U nekim slučajevima, albumin-vezujući polipeptidi se ciklizuju obrazovanjem disulfidne veze između cisteinskih ostataka prisutnih u njihovim polipeptidnim sekvencama. U nekim slučajevima, albuminvezujući polipeptidi konjugovani su bilo kojim njegovim N ili C-terminalnim krajevima. U nekim slučajevima, konjugacija sa polipeptidom koji vezuje albumin podešava količinu vremena za koje polipeptid ostaje netaknut u subjektu. U nekim slučajevima, konjugacija sa polipeptidom koji vezuje albumin povećava količinu vremena za koje polipeptid ostaje u krvi subjekta. Polipeptidi mogu biti konjugovani sa polipeptidima koji imaju svojstva prodiranja u ćeliju (koji se nazivaju "polipeptidi koji prodiru u ćeliju") uključujući, ali bez ograničenja na one opisane u Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today.2012 Aug;17(15-16):850-60. Dodatni polipeptidi koji prodiru u ćeliju poznati su stručnjacima u tehnici. Polipeptidi mogu biti konjugovani sa bilo kojim polipeptidnim konjugatima navedenim, na primer, u US objavama patenata US20110172126 ili US20030040472. Polipeptidi mogu da se konjuguju sa lipofilnim molekulom koji povećava vezivanje proteina u plazmi kao što su lipofilni supstituenti navedeni, na primer, u US Patent br.6,268,343 ili US objavi br. US2013/0053311.

[0118] Kada se bilo koja od ovih karakteristika identifikuje ili definiše kao željena komponenta polipeptida, bilo koja od nekoliko manipulacija i/ili modifikacija ovih karakteristika može se izvesti

4

pomeranjem, zamenom, invertovanjem, brisanjem, randomizacijom ili dupliranjem. Osim toga, podrazumeva se da manipulacija karakteristika može da rezultuje istim ishodom kao modifikacija molekula ovog otkrivanja. Na primer, manipulacija koja uključuje brisanje domena dovešće do izmene dužine molekula baš kao bi modifikacija neke nukleinske kiseline za kodiranje manje od molekula cele dužine.

[0119] Modifikacije i manipulacije mogu se postići postupcima poznatim u tehnici kao što su, ali ne ograničavajući se na, na mesto usmerena mutageneza. Dobijeni modifikovani molekuli mogu se onda testirati za aktivnost pomoću in vitro ili in vivo testova kao što su oni ovde opisani ili bilo kojim drugim pogodnim skrining testom koji je poznat u tehnici.

[0120] Polipeptidi mogu da obuhvataju konsenzus sekvencu koja je otkrivena kroz cikluse eksperimentisanja. Kao što se ovde koristi "konsenzus" sekvenca je jedna sekvenca koja predstavlja kolektivnu populaciju sekvenci omogućavajući varijabilnost na jednom ili više mesta.

[0121] Pojam "identitet" kao što je poznat u tehnici, odnosi se na vezu između sekvenci dva ili više polipeptida, kao što je određeno poređenjem sekvenci. U tehnici, identitet takođe znači stepen srodnosti sekvenci između polipeptida, kao što je određeno brojem parova između nizova dva ili više aminokiselinska ostatka. Identitet meri procenat identičnih poklapanja između manje od dve ili više sekvenci sa poravnanjima praznina (ako ih ima) kojima se bavi određeni matematički model ili računarski program (tj., "algoritmi"). Identitet srodnih polipeptida mogu se jednostavno izračunati poznatim postupcima. Takvi postupci uključuju, ali nisu ograničeni na, one prethodno opisane od strane drugih (Lesk, A. M., ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, New York, 1988; Smith, D. W., ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, New York, 1993; Griffin, A. M. et al., ed., Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Humana Press, New Jersey, 1994; von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, 1987; Gribskov, M. et al., ed., Sequence Analysis Primer, M. Stockton Press, New York, 1991; i Carillo et al., Applied Math, SIAM J, 1988, 48, 1073).

[0122] U nekim slučajevima, polipeptidna varijanta može da ima istu ili sličnu aktivnost kao referentni polipeptid. Alternativno, varijanta može da ima izmenjenu aktivnost (npr., povećanu ili smanjenu) u odnosu na referentni polipeptid. Uopšteno, varijante određenog polipeptida imaće najmanje oko 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ali manje od 100% identiteta sekvenci sa onima određenog referentnog polipeptida kao što je određeno programima za poravnavanje sekvenci i parametrima ovde opisanim i poznatim stručnjacima u tehnici. Takvi alati za poravnanje uključuju one BLAST seta (Altschul, S.F. et al., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res.1997, 25:3389-3402) Ovde su opisani drugi alati, specifično u definiciji "identiteta."

[0123] Zadati parametri u BLAST algoritmu uključuju, na primer, očekivani prag od 10, veličina reči od 28, Rezultati podudaranja/nepodudaranja 1, -2, troškovi praznine linearni. Bilo koji filter može da bude primenjen kao i selekcija za specifična ponavljanja za vrste, npr., Homo sapiens.

Skraćenice korišćene u polipeptidima

[0124] Kao što se ovde koristi, skraćenice imaju sledeće značenje: "Ac" i "NH2" označavaju acetil i amidirane krajeve, tim redom; "Nvl" označava norvalin; "Phg" označava fenilglicin; "Tbg" označava tercbutilglicin; "Chg" označava cikloheksilglicin; "(N-Me)X" označava N-metilovan oblik aminokiseline označene slovom ili troslovnim kodom aminokiseline umesto promenljive "X" napisane kao N-metil-X [npr. (N-Me)A ili (N-Me)Ala označavaju N-metilovan oblik alanina ili N-metil-alanin]; "azaTrp" označava azatriptofan; "(4-F)Phe" označava 4-fluorofenilalanin; "Tyr(OMe)" označava O-metil tirozin, "Aib" označava amino izobutirnu kiselinu; "(homo)F" ili "(homo)Phe" označava homofenilalanin; "(2-OMe)Phg" odnosi se na 2-O-metilfenilglicin; "(5-F)W" odnosi se na 5-fluorotriptofan; "D-X" odnosi se na D-stereoizomer date aminokiseline "X" [npr. (D-Chg) označava D-cikloheksilglicin]; "(5-MeO)W" odnosi se na 5-metil-O-triptofan; "homoC" odnosi se na homocistein; "(1-Me-W)" ili "(1-Me)W" odnosi se na 1-metiltriptofan; "Nle" odnosi se na norleucin; "Tiq" odnosi se na a tetrahidroizokvinolinski ostatak;

"Asp(T)" odnosi se na (S)-2-amino-3-1H-tetrazol-5-il)propionsku kiselinu; "(3-Cl-Phe)" odnosi se na 3-hlorofenilalanin; "[(N-Me-4-F)Phe]" ili "(N-Me-4-F)Phe" odnosi se na N-metil-4-fluorofenilalanin; "(m-Clhomo)Phe" odnosi se na meta-hloro homofenilalanin; "(dez-amino)C" odnosi se na 3-tiopropansku kiselinu; "(alfa-metil)D" odnosi se na alfa-metil L-asparaginsku kiselinu; "2Nal" odnosi se na 2-naftilalanin; "(3-aminometil)Phe" odnosi se na 3-aminometil-L-fenialanin; "Cle" odnosi se na cikloleucin; "Ac-Piran" odnosi se na 4-amino-tetrahidro-piran-4-karboksilnu kiselinu; "(Lys-C16)" odnosi se na N-εpalmitoil lizin; "(Lys-C12)" odnosi se na N-ε-lauril lizin; "(Lys-C10)" odnosi se na N-ε-kapril lizin; "(Lys-C8)" odnosi se na N-ε-kaprilni lizin; "[xKsilil(y, z)]" odnosi se na ksilil premošćavajući ostatak između dva tiola koji sadrže aminokiseline gde x može viti m, p ili o za označavanje upotrebe meta-, para- ili ortodibromoksilena (tim redom) za stvaranje premošćavajućih ostataka, a numerički identifikatori, y i z, određuju aminokiselinski položaj unutar polipeptida aminokiselina koje učestvuju u ciklizaciji;

"[ciklo(y,z)]" odnosi se na obrazovanje veze između dva aminokiselinska ostatka gde numerički identifikatori, y i z, određuju položaj ostataka koji učestvuju u vezi; "[ciklo-olefinil(y,z)]" odnosi se na obrazovanje veze između dva aminokiselinska ostatka metatezom olefina gde numerički identifikatori, y i z, određuju položaj ostataka koji učestvuju u vezi; "[ciklo-tioalkil(y,z)]" odnosi se na obrazovanje tioetarske veze između dva aminokiselinska ostatka gde numerički identifikatori, y i z, određuju položaj ostataka koji učestvuju u vezi; "[ciklo-triazolil(y,z)]" odnosi se na obrazovanje triazolnog prstena između dva aminokiselinska ostatka gde numerički identifikatori, y i z, određuju položaj ostataka koji učestvuju u vezi. "B20" odnosi se na N-ε-(PEG2-γ-glutaminska kiselina-N-α- oktadekandionska kiselina) lizin [takođe poznat kao (1S,28S)-1-amino-7,16,25,30-tetraokso-9,12,18,21-tetraoksa-6,15,24,29-tetraazaheksatetrakontan-1,28,46-trikarboksilna kiselina.]

"B28" odnosi se na N-ε-(PEG24-γ-glutaminska kiselina-N-α-heksadekanoil)lizin.

"K14" odnosi se na N-ε-1-(4,4-dimetil-2,6-dioksocikloheks-1-iliden)-3-metilbutil-L-lizin. Svi drugi simboli odnose se na standardni aminokiselinski kod od jednog slova.

Antitela

[0125] Jedinjenja i/ili kompozicije mogu da obuhvataju antitela ili njihove fragmente. Kao što se ovde koristi, pojam "antitelo" odnosi se, u najširem smislu, na i specifično pokriva različite aspekte uključujući, ali ne ograničavajući se na monoklonalna antitela, poliklonalna antitela, multispecifična antitela (npr. bispecifična antitela obrazovana od najmanje dva netaknuta antitela), i fragmente antitela kao što su dijatela sve dok ona pokazuju željenu biološku aktivnost. Antitela mogu takođe da obuhvataju humana antitela ili humanizovana antitela. Antitela su prevashodno molekuli na bazi aminokiselina, ali mogu takođe da obuhvataju jednu ili više modifikacija (uključujući, ali ne ograničavajući se na, dodavanje ostataka šećera, fluorescentne ostatke, hemijske oznake, itd.)

[0126] Kao što se ovde koristi pojam, "fragment antitela" odnosi se na bilo koji deo netaknutog antitela. U nekim slučajevima, fragmenti antitela obuhvataju antigen-vezujuće regione iz netaknutih antitela. Primeri fragmenata antitela mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, Fab, Fab', F(ab')2, i Fv fragmente; dijatela; linearna antitela; jednolančane molekule antitela; i multispecifična antitela obrazovana od fragmenata antitela. Papainska digestija antitela proizvodi dva identična antigen-vezujuća fragmenta, nazivaju se "Fab" fragmenti, svaki sa jednim antigen-vezujućim mestom. Takođe proizveden je rezidualni "Fc" fragment, čije ime odražava njegovu sposobnost da se lako kristališe. Lečenje pepsinom daje F(ab')2fragment koji ima dva antigen-vezujuća mesta i dalje može da umrežava antigen. Jedinjenja i/ili kompozicije mogu da obuhvataju jedan ili više ovih fragmenata. Za svrhe ovde, "antitelo" može da obuhvata teški i laki varijabilni domen kao i Fc region.

[0127] Kao što se ovde koristi, pojam "urođeno antitelo" odnosi se na a obično heterotetramerni glikoprotein od oko 150000 daltona, koji se sastoji od dva identična laka (L) lanca i dva identična teška (H) lanca. Svaki laki lanac je povezan sa teškim lancem jednom kovalentnom disulfidnom vezom, dok broj disulfidnih veza varira među teškim lancima različitih izotipova imunoglobulina. Svaki teški i laki lanac takođe ima pravilno raspoređene disulfidne mostove unutar lanca. Svaki težak lanac ima na jednom kraju varijabilni domen (VH) praćen nekim brojem konstantnih domena. Svaki laki lanac ima varijabilni domen na jednom kraju (VL) i konstantni domen na svom drugom kraju; konstantni domen lakog lanca poravnat je sa prvim konstantnim domenom teškog lanca, a varijabilni domen lakog lanca poravnat je sa varijabilnim domenom teškog lanca.

[0128] Kao što se ovde koristi, pojam "varijabilni domen" odnosi se na specifični domeni antitela koji se razlikuju u velikoj meri po sekvenci među antitelima i koriste se u vezivanju i specifičnosti svakog određenog antitela za njegov određen antigen.

Kao što se ovde koristi, pojam "Fv" odnosi se na fragmente antitela koji obuhvataju cela mesta za prepoznavanje antigena i antigen-vezujuća mesta. Ovi regioni sastoje se od dimera jednog teškog lanca i jednog varijabilnog domena lakog lanca u tesnoj, nekovalentnoj vezi.

[0129] Kao što se ovde koristi, pojam "laki lanac" odnosi se na komponentu antitela iz bilo kojih vrsta kičmenjaka dodeljenu jednom od dva jasno različita tipa, nazvanu kapa i lambda na osnovu aminokiselinskih sekvenci konstantnih domena.

[0130] Zavisno od aminokiselinske sekvence konstantnog domena njihovih teških lanaca, antitela mogu da budu dodeljena različitim klasama. Postoji pet glavnih klasa netaknutih antitela: IgA, IgD, IgE, IgG i IgM, a neke od njih mogu dalje da se podele na podklase (izotipovi), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA i IgA2.

[0131] Kao što se ovde koristi, pojam "jednolančani Fv" ili "scFv" odnosi se na fuzioni protein VHi VLdomena antitela, pri čemu su ovi domeni zajedno vezani u jedan polipeptidni lanac. U nekim slučajevima, Fv polipeptidni linker omogućava da scFv obrazuje željenu strukturu za vezivanje antigena.

[0132] Kao što se ovde koristi, pojam "dijatelo" odnosi se na mali fragment antitela sa dva antigenvezujuća mesta. Dijatela obuhvataju varijabilni domen VHteškog lanca vezan za varijabilni domen VLlakog lanca u istom polipeptidnom lancu. Korišćenjem linkera koji je prekratak da omogući uparivanje između dva domena na istom lancu, domeni su primorani da se spare sa komplementarnim domenima drugog lanca i stvore dva antigen-vezujuća mesta. Dijatela su potpunije objašnjena u, na primer, EP 404,097; WO 93/11161; i Hollinger et al. (Hollinger, P. et al., "Diabodies":Small bivalent and bispecific antibody fragments. PNAS.1993.90:6444-8).

[0133] Kao što se ovde koristi, pojam "monoklonalno antitelo" odnosi se na antitelo dobijeno iz populacije suštinski homogenih ćelija (ili klonova), tj., pojedinačna antitela koja obuhvataju populaciju su identična i/ili vezuju isti epitop, osim za moguće varijante koje se mogu nastati tokom proizvode monoklonalnih antitela, pri čemu su takve varijante uopšteno prisutne u malim količinama. Za razliku od preparata poliklonalnih antitela koji obučno uključuju različita antitela usmerena protiv različitih determinanti (epitopi), svako monoklonalno antitelo usmereno je protiv jedne determinante na antigen.

[0134] Modifikator "monoklonalno" označava karakter antitela kakvo je dobijeno od suštinski homogene populacije antitela, i ne treba tumačiti kao da zahteva proizvodnju antitela bilo kojim određenim postupkom. Monoklonalna antitela ovde uključuju "himerna" antitela (imunoglobuline) u kojima je deo teškog i/ili lakog lanca identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim iz određenih vrsta ili koja pripadaju određenoj klasi ili podklasi antitela, dok je ostatak lanca(lanaca) identičan sa ili homologan odgovarajućim sekvencama u antitelima dobijenim iz drugih vrsta ili koji pripadaju drugim klasama ili podklasama antitela, kao i fragmenti takvih antitela.

[0135] Kao što se ovde koristi, pojam "humanizovano antitelo" odnosi se na himerno antitelo koje obuhvata minimalni deo od jednog ili više nehumanih (npr., mišjih) izvora antitela sa ostatkom dobijenim od jednog ili više humanih izvora imunoglobulina. Za najveći deo, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (antitelo primaoca) u kojima su ostaci od hipervarijabilnog regiona iz nekog antitela primaoca zamenjeni ostacima od hipervarijabilnog regiona iz antitela nehumanih vrsta (antitelo donora) kao što je miš, pacov, zec ili nehumani primat koji ima željenu specifičnost, afinitet i/ili kapacitet.

[0136] Kao što se ovde koristi, pojam "hipervarijabilni region" odnosi se na regione unutar antigenvezujućeg domena antitela koji obuhvata aminokiselinske ostatke odgovorne za vezivanje antigena. Aminokiseline prisutne unutar hipervarijabilnih regiona određuju strukturu regiona koji određuje komplementarnost (CDR). Kao što se ovde koristi, pojam "CDR" odnosi se na regione antitela koji obuhvataju strukturu koja je komplementarna njegovom ciljnom antigenu ili epitopu.

[0137] Jedinjenja i/ili kompozicije mogu biti ili mogu da obuhvataju mimetike antitela. Kao što se ovde koristi, pojam "mimetik antitela" odnosi se na bilo koji molekul koji imitira funkciju ili dejstvo antitela i koji se vezuje specifično i sa visokim afinitetom za njihove molekularne mete. U nekim slučajevima, mimetici antitela mogu biti monotela, konstruisana da inkorporiraju domen fibronektina tipa III (Fn3) kao proteinsku osnovu (US 6,673,901 i US 6,348,584). U nekim slučajevima, mimetici antitela mogu da uključuju one koji su poznati u tehnici uključujući, ali ne ograničavajući se na molekule afitela, afiline, afitine, antikaline, avimere, Centirine, DARPINS™, Finomere, Adnektine i peptide Kunitz-ovog domena. U drugim slučajevima, mimetici antitela mogu da uključuju jedan ili više nepeptidnih regiona.

[0138] Kao što se ovde koristi, pojam "varijanta antitela" odnosi se na biomolekul koji je sličan nekom antitelu po strukturi i/ili funkciji obuhvatajući neke razlike u njihovoj aminokiselinskoj sekvenci, kompoziciji ili strukturi u poređenju sa urođenim antitelom.

[0139] Priprema antitela, bilo monoklonalna ili poliklonalna, poznata je u tehnici. Tehnike za proizvodnju antitela dobro su poznate u tehnici i opisane, npr. u Harlow and Lane "Antibodies, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 i Harlow and Lane "Using Antibodies: A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.

[0140] U nekim slučajevima, polipeptidnne sekvence obezbeđene ovde mogu da se koriste u proizvodnji jednog ili više antitela. U nekim slučajevima, takve polipeptidnne sekvence mogu da se ugrade u varijabilne domene antitela. Takvi varijabilni domeni mogu da se ugrade u antitela, mimetike antitela ili varijante antitela.

Mali molekuli

[0141] Jedinjenja mogu biti mali molekuli. Takva jedinjenja mogu da obuhvataju veličinu od oko 100 do oko 2000 Daltona (npr. od oko 100 do oko 200, do oko 300, do oko 400, do oko 500, do oko 600, do oko 700, do oko 800, do oko 900, do oko 1000, do oko 1100, do oko 1200, do oko 1300, do oko 1400, do oko 1500, do oko 1600, do oko 1700, do oko 1800, do oko 1900 ili do oko 2000 Daltona.) Mali molekuli mogu biti nepeptidni ili da dele neke ili mnogo karakteristika polipeptida i cikličnih polipeptida, uključujući amidne veze, ciklične strukture i supstituente slične aminokiselinima.

Aptameri

[0142] Jedinjenja mogu da obuhvataju aptamere (Keefe, A.D., Pai, S. and Ellington, A. (2010). Nat. Rev. Drug Discovery 9:537-550). Kao što se ovde koristi, pojam "aptamer" odnosi se na oligonukleinske ili polipeptidne molekule koji mogu da vezuju specifične ciljne molekule. Neki aptameri mogu da usvoje trodimenzionalnu konformaciju koja može da vezuje takve ciljne molekule sa visokim afinitetom i specifičnošću.

Izotopske varijacije

[0143] Polipeptidi mogu da obuhvataju jedan ili više atoma koji su izotopi. Kao što se ovde koristi, pojam "izotop" odnosi se na hemijski element koji ima jedan ili više dodatnih neutrona. U jednom slučaju, polipeptidi mogu biti deuterisani. Kao što se ovde koristi, pojam "deuterisan" odnosi se na supstancu koja je imala jedan ili više atoma vodonika zamenjenih izotopima deuterijuma. Izotopi deuterijuma su izotopi vodonika. Jezgro vodonika sadrži jedan proton dok jezgra deuterijuma sadrže i proton i neutron. Jedinjenja i farmaceutske kompozicije mogu biti deuterisane da bi se promenilo neko fizičko svojstvo,

4

kao što je stabilnost, ili da bi se omogućila njihova upotreba u dijagnostičkim i eksperimentalnim primenama.

Formulacija i isporuka

[0144] Pojam "farmaceutska kompozicija" odnosi se na kompoziciju koja obuhvata najmanje jedan aktivni sastojak (npr., kao što je polipeptid) u obliku i količini koja omogućava da aktivni sastojak bude terapeutski efektivan.

[0145] Polipeptidne formulacije uključuju formulacije sa kontrolisanim duodenalnim oslobađanjem, formulacije za vremensko oslobađanje, sistemi isporuke sa osmotski kontrolisanim oslobađanjem, mikroemulzije, mikrosfere, lipozome, nanočestice, lekovite flastere, pumpe, depoe lekova, i slično. Specifično uključeni u ovom otkrivanju su čvrsti oralni dozni oblici, kao što su praškovi, meke kapsule, želatinske kapsule, kapsule, pilule i tablete.

[0146] Farmaceutske kompozicije ovog otkrivanja mogu da se daju bilo kojim putem koji dovodi do terapeutski efektivnog ishoda. One uključuju, ali nisu ograničeni na, enteralno, gastroenteralno, epiduralno, oralno, periduralno, intracerebralno (u veliki mozak), intratrahealno (u disajne puteve radi isporuke u pluća), intracerebroventrikularno (u moždane komore), epikutano (nanošenje na kožu), intradermalno, (u samu kožu), subkutano (potkožno), nazalno davanje (kroz nos), intravensku (u venu), intraarterijalnu (u arteriju), intramuskularnu (u mišić), intrakardijalnu (u srce), intraosealnu infuziju (u koštanu srž), intratekalnu (u kičmeni kanal), intraperitonealnu, (infuzija ili injekcija u peritoneum), intravezikalnu infuziju, intravitrealnu, (u zadnju komoru oka), intrakavernoznu injekciju, (u osnovu penisa), intravaginalno davanje, intrauterino, ekstra-amnionsko davanje, transdermalno (difuzija kroz netaknutu kožu za sistemsku distribuciju), transmukozno (difuzija kroz mukoznu membranu), insuflaciju (šmrkanje), bukalno, sublingvalno, sublabijalno, klistir, kapi za oči (na konjunktivu) ili kapi za uši.

[0147] U nekim slučajevima, polipeptidi ovog otkrivanja formulišu se u sterilnom vodenom rastvoru. U nekim slučajevima, polipeptidi ovog otkrivanja formulišu se u lipidnu ili nelipidnu formulaciju. U nekom drugom slučaju, polipeptidi ovog otkrivanja formulišu se u formulaciji katjonskog ili nekatjonskog lipida. U bilo kom slučaju, sterilni vodeni rastvor može da sadrži dodatne aktivne ili neaktivne komponente. Neaktivne komponente, ovde se takođe nazivaju "ekscipijensi," mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, fiziološki kompatabilne soli, šećere, sredstva za povećanje zapremine, surfaktante ili pufere.

[0148] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu da obuhvataju ili da se formulišu ili isporuče zajedno sa jednim ili više agenasa nosača. Kao što se ovde koristi, pojam "nosač" se odnosi na supstancu koja je dodata isporuci ili poboljšava efektivnost polipeptida i/ili polipeptidnih kompozicija. Agens nosača može da bude supstanca koja se javlja u prirodi, kao što je protein (npr., humani serum albumin (HSA), lipoprotein male gustine (LDL) ili globulin); ugljeni hidrat (npr., dekstran, pululan, hitin, hitozan, inulin, ciklodekstrin ili hijaluronska kiselina); ili lipid. Molekul nosača može takođe da bude rekombinantni ili sintetički molekul, kao što je sintetički polimer, npr., sintetička poliaminokiselina. Primeri poliaminokiselina uključuju poli-L-lizin (PLL), poli-L-asparaginsku kiselinu i poli-L-glutaminsku kiselinu, kao i polimeri koji obuhvataju D-stereoizomere ovih aminokiselina. Ostali nosači uključuju poli(L-laktid-ko-glikolid) kopolimer, polietilen glikol (PEG), polivinil alkohol (PVA), poli(2-etilakrilna kiselina) i N-izopropilakrilamidne polimere. Drugi korisni molekuli nosača mogu se identifikovati rutinskim postupcima.

[0149] Jedinjenja mogu da budu kombinovana sa jednim ili više farmaceutskih prihvatljivih ekscipijenasa radi obrazovanja farmaceutske kompozicije. Kao što se ovde koristi, pojam "farmaceutski prihvatljiv" odnosi se na ona jedinjenja, materijale, kompozicije i/ili dozne oblike koji su, unutar obima ispravne medicinske procene, pogodni za upotrebu u kontaktu sa tkivima ljudskih bića i životinja bez prekomerne toksičnosti, iritacije, alergijskog odgovora ili drugog problema ili komplikacije, srazmerno razumnom odnosu koristi i rizika. Izraz "farmaceutski prihvatljivi ekscipijens," kao što se ovde koristi, odnosi se na bilo koji sastojak koji su invetivna jedinjenja opisana ovde (na primer, nosač koji može da suspenduje ili rastvara aktivno jedinjenje) i koje ima svojstva da je suštinski netoksično i nezapaljensko za pacijenta. Ekscipijensi mogu da uključuju, na primer: antiadherente, antioksidanse, veziva, omotače, sredstva za kompresiju, dezintegrante, boje (sredstva za bojenje), emolijense, emulgatore, punioce (razblaživače), sredstva za obrazovanje filma ili premaze, arome, mirise, glidante (pojačivači protoka), lubrikante, konzervanse, štamparske boje, sorbente, agense za suspendovanje ili disperziju, zaslađivače i vodu za hidrataciju. Primeri ekscipijenasa uključuju, ali nisu ograničeni na: butilovan hidroksitoluen (BHT), kalcijumkarbonat, kalcijumfosfat (dvobazni), kalcijumstearat, kroskarmeloza, umreženi polivinil pirolidon, limunsku kiselinu, krospovidon, cistein, etilcelulozu, želatin, hidroksipropil celulozu, hidroksipropil metilcelulozu, laktozu, magnezijumstearat, maltitol, manitol, metionin, metilcelulozu, metil paraben, mikrokristalnu celulozu, polietilen glikol, polivinil pirolidon, povidon, preželatiniziran skrob, propil paraben, retinil palmitat, šelak, silicijumdioksid, natrijum karboksimetil celulozu, natrijumcitrat, natrijum skrob glikolat, sorbitol, skrob (kukuruzni), stearinsku kiselinu, saharozu, talk, titanijumdioksid, vitamin A, vitamin E, vitamin C ksilitol. U nekim slučajevima, farmaceutske kompozicije obuhvataju jedan ili više aktivnih polipeptidnih sastojaka zajedno sa etanolom, mono-di-trigliceridima iz ulja kukuruza, hidrogenizovanim ricinusovim uljem, DL-tokoferolom, propilen glikolom, želatinmo, glicerolom, sredstvima za bojenje, aromama i zaslađivačima.

[0150] U drugim slučajevima, farmaceutske kompozicije obuhvataju jedan ili više aktivnih polipeptidnih sastojaka zajedno sa agensom za isporuku kao što je 4-(2-hidroksi-4-metoksibenzamido)buterna kiselina (ili bilo koji od agenasa za isporuku opisanih u US patentu broj 7,744,910B2), farmaceutski prihvatljivi pufer, dezintegrant, deterdžent, hidroksipropilmetilceluloza, sredstva za bojenje, arome i zaslađivači.

[0151] U drugim slučajevima, farmaceutske kompozicije obuhvataju jedan ili više aktivnih polipeptidnih sastojaka zajedno sa etanolom, fosfatidil holin soje, glicerol diolat koji se ubrizgava u višku fiziološkog rastvora kao što je opisano u US prijavi patenta 2008/0146490A1.

[0152] Isporuka jednog ili više polipeptida subjektu kom je to potrebno može da se postigne na brojne različite načine. In vivo isporuka može da se izvede direktno davanjem kompozicije koja obuhvata jedan ili više polipeptida, subjektu. Alternativno, isporuka se može izvesti indirektno davanjem jednog ili više vektora koji kodiraju i usmeravaju ekspresiju polipeptida.

[0153] Lokalnom isporukom izbegava se crevna propustljivost i sistemsko izlaganje. Na primer, polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida kogu da se primene u oko kao kap ili u zadnji deo oka direktnom injekcijom. Mogu se primeniti u crevima za ciljanje enzima. Mogu da se koriste topikalno u dermatološkim primenama (npr., kreme, masti, transdermalni lekoviti flasteri).

[0154] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu da obuhvataju ili da se formulišu sa jednim ili više fuzogenih agenasa. Kao što se ovde koristi, pojam "fuzogeni agens" odnosi se na neki agens koji reaguje na promene, kao što su pH promene u sredini, na primer. Nakon susreta pH endozoma, fuzogeni agens može da izazove fizičku promenu, npr., promena osmotskih svojstava koja remete ili povećavaju propustljivost membrane endozoma. Poželjno, fuzogeni agens menja naelektrisanje, npr., postaje protonovan, pri pH manjem od fiziološkog opsega. Na primer, fuzogeni agens može da postane protonovan pri pH 4.5-6.5. Fuzogeni agens može da služi za oslobađanje polipeptida u citoplazmi ćelije nakon uzimanja kompozicije, npr., preko endocitoze, ćelijom, čime se povećava ćelijska koncentracija polipeptida u ćeliji.

[0155] U nekim slučajevima, fuzogeni agensi mogu da imaju ostatak, npr., amino grupu, koja će, kada je izložena određenom pH opsegu, pretrpeće promenu, npr., naelektrisanje, npr., protonacija. Promene naelektrisanja fuzogenih agenasa mogu da izazovu promene, npr., osmotske promene, u vezikulama, npr., endocitne vezikule, npr., endozome. Na primer, fuzogeni agens, nakon izlaganja pH sredini endozoma, izazvaće rastvorljivost ili osmotsku promenu dovoljno značajnu za povećanje poroznosti (poželjno, za pucanje) endozomalne membrane.

[0156] Fuzogeni agensi mogu biti polimeri, poželjno poliamino lanci, npr., polietilenimin (PEI). PEI može biti linearan, razgranat, sintetički ili prirodan. PEI može biti, npr., alkil supstituisan PEI ili lipidom supstituisan PEI.

[0157] U drugim slučajevima, fuzogeni agensi mogu biti polihistidin, poliimidazol, polipiridin, polipropilenimin, melitin ili poliacetalne supstance, npr., katjonski poliacetali. U nekim slučajevima, fuzogeni agensi mogu imati strukturu alfa heliksa. Fuzogeni agensi mogu biti agensi koji prekidaju membranu, npr., melitin. Drugi pogodni fuzogeni agensi mogu se ispitati i identifikovati od strane stručnjaka.

4

[0158] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu da obuhvataju ili da se formulišu sa jednim ili više agenasa za kondenzaciju. Agensi za kondenzaciju kompozicija ovde opisanih mogu uzajamno da deluju sa (npr., privlače, drže ili vežu za) polipeptidima i deluju da (a) kondenzuju, npr., smanje veličinu ili naelektrisanje polipeptida i/ili (b) zaštite polipeptide, npr., zaštite polipeptide od razgradnje. Agensi za kondenzaciju mogu da uključuju neki ostatak, npr., naelektrisani ostatak, koji može uzajamno da deluje sa polipeptidima jonskim interakcijama. Agensi za kondenzaciju trebalo bi poželjno da su naelektrisani polimeri, npr., polikatjonski lanci. Agensi za kondenzaciju mogu biti polilizin (PLL), spermin, spermidin, poliamin, pseudopeptid-poliamin, peptidomimetički poliamin, dendrimer poliamin, arginin, amidin, protamin, katjonski lipid, katjonski porfirin, kvaternarna so poliamina ili neki alfa-spiralni peptid.

[0159] Polipeptidi mogu biti biciklični polipeptidi. Kao što se ovde koristi, pojam "biciklični polipeptid" odnosi se na neki polipeptid sa dve petlje. Kao neograničavajući primer, biciklični polipeptidni inhibitori C5 mogu se proizvesti u kombinatornim bibliotekama. Biciklični polipeptidi mogu da imaju 2, 3, 4, 5, 6 ili više aminokiselina po petlji.

[0160] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu biti obezbeđene kao prolekovi. Kao što se ovde koristi, pojam "prolek" odnosi se na neki lek koji je obezbeđen u neaktivnom obliku, a koji postaje aktivan u nekom trenutku nakon davanja. U nekim slučajevima u kojima se polipeptidi daju u obliku proleka, aminokiseline kritične za inhibitornu aktivnost polipeptida nisu dostupne za interakciju sa metom zbog reverzibilne hemijske veze, npr., estarska veza. Nakon davanja, takvi prolekovi mogu da se podvrgnu cepanju reverzibilne hemijske veze, npr., enzimskom ili kiselom hidrolizom u želucu, krvi i/ili ćelijama datog ciljnog tkiva.

C5 inhibitori

[0161] Neki polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida inhibiraju aktivaciju komplementa na nivou komponente komplementa C5, ovde se nativaju "C5 inhibitori." Neki C5 inhibitori funkcionišu sprečavanjem cepanja C5 na proizvode cepanja C5a i C5b, takvi inhibitori ovde se nazivaju "inhibitori C5 cepanja." U slučajevima, postupci ovog otkrivanja mogu da obuhvataju inhibiciju C5 cepanja u sistemu. Kao što se ovde koristi, "sistem" se odnosi na grupu povezanih delova koji funkcionišu zajedno. Takvi sistemi uključuju one koji obuhvataju C5, ovde se nazivaju "C5 sistemi." C5 sistemi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na rastvore, matrice, ćelije, tkiva, organe i telesne tečnosti

[0162] (uključujući, ali ne ograničavajući se na krv.) U nekim slučajevima, C5 sistemi mogu biti ćelijski sistemi. Kao što se ovde koristi pojam "ćelijski sistem" odnosi se na sistem koji obuhvata jednu ili više ćelija ili jednu ili više komponenata ili proizvoda ćelije. U nekim slučajevima, C5 sistemi mogu da uključuju in vivo sisteme, in vitro sisteme i ex vivo sisteme. In vivo C5 sistemi mogu da obuhvataju ili mogu da budu obuhvaćeni u subjektu.

[0163] C5 inhibitori mogu da uključuju bilo koji od polipeptida navedenih u Tabeli 1.

Tabela 1. Jedinjenja

4

4

4

4

4

1

[0164] U C5 sistemima, C5 i ostale komponente sistem mogu biti u rastvoru ili mogu biti fiksirane, kao što je u bunarčiću za ispitivanje. C5 sistemi mogu dalje da obuhvataju druge komponente komplementa, u nekim slučajevima uključujući sve komponente potrebne za obrazovanje kompleksa koji napada membranu (MAC.) U nekim slučajevima, polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu da se koriste za

2

inhibiciju C5 cepanja kod humanog subjekta. Takvi polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu da se koriste u lečenju raznih poremećaja i/ili bolesti povezanih sa komplementom kao i pratećih zapaljenskih stanja. Određeni C5 inhibitori poznati su tehnici i opisani su u U.S. Pat br.7,348,401 i 6,355,245.

[0165] Cepanje C5 daje proteolitičke proizvode C5a i C5b. Mesto cepanja kod C5 koji se cepa da bi se dobili ovi proizvodi odnosi se ovde na C5a-C5b mesto cepanja. C5b doprinosi obrazovanju kompleksa koji napada membranu (MAC) dok C5a stimuliše imuni sistem i zapaljenski odgovor. U nekim slučajevima, polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida sprečavaju cepanje C5 i, prema tome, mogu biti korisni u lečenju zapaljenja inhibicijom zapaljenskih događaja uključujući, ali ne ograničavajući se na hemotaksis i aktivaciju zapaljenskih ćelija (npr. makrofage, mastociti, neutrofili i trombociti), proliferaciju endotelijalnih ćelija i edem.

[0166] Mnoge komponente sistema komplemenata, uključujući ali ne ograničavajući se na C3, C4 i C5, su funkcionalno inertni u njihovom urođenom stanju dok ne budu ciljane za cepanje na više aktivnih komponenti. Cepanje C3 ili C4 izaziva konformacionu promenu koji razotkriva unutrašnji tioestarski domen. Unutar domena, unutrašnja tioestarska veza između bočnih lanaca cisteinskog i glutaminskog ostatka je hemijski labilna veza koja daje sposobnost C3 i C4 za vezivanje za površinu ćelije i/ili biološke molekule. Cepanje C3 i C4 takođe obezbeđuje komponente C5 konvertaze, ili C3bC4bC2a ili (C3b)2Bb. (Law, S.K., et al. (1997). Protein Science.6:263-274; van den Elsen, J.M.H., (2002). J. Mol. Biol.322:1103-1115.)

[0167] Višestruka struktura domena C5 slična je C3 i C4. C5 konvertaza cepa C5 na komponente C5a i C5b. Cepanje C5 izaziva konformacionu promenu koja izlaže C5b domen sličan tioestru, koji ima ulogu u C5 vezivanju C6, praćeno interakcijom sa C7 i C8 radi obrazovanja citolitičkog MAC. Strukture domena C5 obuhvataju regulatorne karakteristike koje su ključne za obradu i nishodnu aktivnost komplementa. (Fredslund, F. et al. (2008). Nature.9:753-760; Hadders, M.A. et al. (2012). Cell Reports.1:200-207.)

[0168] Jedinjenja mogu da vezuju C5 i sprečavaju cepanje C5 na C5a i C5b proizvode cepanja.

[0169] Nedavno, nova paradigma za aktivaciju komplementa je predložena, na osnovu otkrića da trombin stvara prethodno neidentifikovane C5 proizvode koji podržavaju put aktivacije terminalnih komplemenata (Krisinger, et al., (2014). Blood.120(8):1717-1725).

[0170] Trombin deluje u kaskadi koagulacije, drugi proces na bazi cirkulacije kojim organizmi, kao odgovor na povredu, mogu da ograniče krvarenje, vrate vaskularni integritet i ubrzaju izlečenje. Nakon oštećenja krvnog suda, faktor tkiva je izložen cirkulaciji, aktivirajući kaskadu proteolitičkih reakcija koje dovode do stvaranja centralnog koagulacionog enzima trombina, koji pretvara fibrinogen u fibrinski ugrušak.

[0171] Istorijski, put aktivacije komplement posmatran je odvojeno od kaskade koagulacije; međutim, uzajamno dejstvo ova dva sistema dostojna je ponovnog razmatranja. Koagulacija i komplement su koordinativno aktivirani na preklapajući prostorno-vremenski način kao odgovor na uobičajene patofiziološke stimulanse za održavanje homeostaze, i bolest koja nastaje kada postoji nekontrolisana aktivacija urođenih imunih odgovora i odgovora koagulacijom, o čemu svedoči, na primer, ateroskleroza, moždani udar, koronarna bolest srca, dijabetes, ishemijsko-reperfuziona povreda, trauma, paroksizmalna noćna hemoglobinurija, starosna makularna degeneracija i atipični hemolitičko-uremijski sindrom. Ustvari, otkriveno je da uvođenje inhibitora komplementa istovremeno leči zapaljenje i trombotičke poremećaje povezane sa nekim od ovih poremećaja.

[0172] Kao što je prethodno naznačeno, sistem komplemenata se aktivira preko tri glavna puta, pri čemu svi konvergiraju proteolitičkoj aktivaciji centralne komponente komplementa C3. Naknadno, obrazovanje C5 konvertaza dovodi do cepanja C5 na argininu 751 (R751) da bi se oslobodio hemotaktički i anafilatoksični C5a fragment i stvorio C5b. C5b je faktor inicijacije sklapanja C5b zavisnog litičkog kompleksa koji napada membranu (MAC; takođe poznat kao C5b-9), odgovornog za uništavanje oštećenih ćelija i patogena.

[0173] Nekoliko molekulskih veza između komplementa i koagulacije je identifikovano. Najvažnije u onome što je opisano kao novi put aktivacije komplementa je da je otkriveno da trombin može da direktno promoviše aktivaciju komplementa cepanjem C5, verovatno na R751, čime se oslobađa C5a u odsustvu C3 (Huber-Lang, et al., 2006. Nature Med.12(6):682-687). Međutim, ova ispitivanja nisu uporedila trombin sa bona fide C5 konvertazom, i izvedene su samo ograničene biohemijske analize; prema tome, fiziološka relevantnost puta nije procenjena.

[0174] Korišćenjem prečišćenih sistemi na bazi plazme, delovanja trombina i C5 konvertaze na C5 ocenjena su merenjem oslobađanja anafilatoksina C5a i stvaranja C5b, komponenta MAC. Otkriveno je da, dok je trombin cepao C5 slabo na R751, dajući minimalno C5a i C5b, efikasno cepa C5 na novo identifikovanom, visoko očuvanom R947 mestu, stvarajući ranije neopisane intermedijare C5Ti C5bT. Faktorom tkiva indukovano zgrušavanje plazme dovelo je do proteolize C5 na mestu osetljivom za trombin koje odgovara ovom novom R947 mestu, a ne R751. Kombinovano tretiranje C5 trombinom i C5 konvertazom dalo je C5a i C5bT, pri čemu potonji obrazuje C5bT-9 kompleks koji napada membranu sa značajno većom litičkom aktivnošću nego sa C5b-9. Tako, nova paradigma predložena je za aktivaciju komplementa, gde je trombin invarijanta i kritički partner sa C5 konvertazom u pokretanju obrazovanja aktivnijeg MAC obrazovanjem prethodno neidentifikovanih C5 proizvoda koji su generisani kooperativnom proteolizom preko dva enzima. Ova otkrića obezbeđuju nova saznanja u regulaciji urođenog imuniteta u konetkstu aktivacije koagulacije koja se javlja kod mnogih bolesti. (Krisinger, et al., (2014). Blood.120(8):1717-1725).

[0175] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu da inhibiraju trombinom indukovanu aktivaciju komplementa. Takvi polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu, prema tome, da se koriste za lečenje hemolize koja rezultuje od trombinom indukovane aktivacije komplementa.

4

[0176] S obzirom na otkrića molekularnih veza između komplementa i puteva koagulacije, veruje se da komplement može da se aktivira dodatnim komponentama koagulacije i/ili kaskada zapaljenja. Na primer, druge serinske proteaze sa blago drugačijom specifičnošću za supstrat mogu da deluju na sličan način. Huber-Lang et al. (2006) pokazali su da trombin ne samo da cepa C5 već i in vitro-generisani C3a kada se inkubira sa urođenim C3 (Huber-Lang, et al., 2006. Nature Med.12(6):682-687). Slično tome, otkriveno je da druge komponente puta koagulacije, kao što je FXa, FXIa i plazmin, cepaju C5 i C3.

[0177] Specifično, u mehanizmu sličnom onom primećenom putem aktivacije trombina, primećeno je da plazmin, FXa, FIXa i FXIa mogu da cepaju C5 da bi se generisali C5a i C5b (Amara, et al., (2010). J.

Immunol.185:5628-5636; Amara, et al., (2008) "Interaction Between the Coagulation and Complement System" in Current Topics in Complement II, J.D. Lambris (ed.), pp.71-79). Otkriveno je da su proizvedeni anafilatoksini biološki aktivni kao što je pokazano dozno zavisnim hemotaktičkim odgovorom neutrofila i HMC-1 ćelija, tim redom. Aktivnost cepanja indukovana plazmina mogla bi da se blokira na dozno zavistan način inhibitorom serinske proteaze aprotininom i leupeptinom. Ova otkrića ukazuju na to da različite serinske proteaze koje pripadaju sistemu koagulacije mogu da aktiviraju kaskadu komplementa nezavisno od ustanovljenih puteva. Štaviše, generišu se funkcionalni C5a i C3a (kao što je detektovano imunoblotingom i ELISA), pri čemu je za oba poznato da su ključno uključeni u inflamatorni odgovor.

[0178] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu da inhibiraju aktivaciju C5 plazminom, FXa, FIXa, FXIa i drugim proteazama puta koagulacije.

[0179] Dugo je poznato da se humana leukocitna elastaza (HLE), enzim kojeg izlučuju neutrofili i makrofage tokom zapaljenskih procesa, takođe oslobađa iz C5 hemotaktičkog, C5a-sličnog fragmenta. Međutim, ovaj C5a-sličan fragment, nije identičan sa C5a, jer HLE ne cepa peptidne veze na mestu cepanja gde obično cepa C5 na C5a i C5b nakon izlaganja konvertazama komplementa. Otkirveno je takođe da cepanje komplementa C5 od strane HLE generiše funkcionalno aktivan C5b-sličan molekul koji može da učestvuje u obrazovanju MAC (Vogt, (1999). Immunobiology.201:470-477).

[0180] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptide mogu da inhibiraju aktivaciju C5 od strane HLE i drugih proteaza kaskade zapaljenja.

[0181] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu biti korisne u lečenju bolesti, poremećaja i/ili stanja gde C5 cepanje dovodi do napredovanja bolesti, poremećaja i/ili stanja. Takve bolesti, poremećaji i/ili stanja mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, imune i autoimune, neurološke, kardivaskularne, plućne i očne bolesti, poremećaje i/ili stanja. Imune i autoimune bolesti i/ili poremećaji mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, akutni diseminovani encefalomijelitis (ADEM), akutni nekrotizirajući hemoragijski leukoencefalitis, Adisonovu bolest, agamaglobulinemiju, alopeciju areata, amiloidozu, ankilozni spondilitis, akutno antitelo-posredovano odbacivanje nakon transplantacije organa, anti-GBM/anti-TBM nefritis, antifosfolipidni sindrom (APS), autoimuni angioedem, autoimunu aplastičnu anemiju, autoimunu disautonomiju, autoimuni hepatitis, autoimunu hiperlipidemiju, autoimunu imunodeficijenciju, autoimunu bolest unutrašnjeg uha (AIED), autoimuni miokarditis, autoimuni pankreatitis, autoimunu retinopatiju, autoimunu trombocitopeničnu purpuru (ATP), autoimunu bolest štitne žlezde, autoimunu urtikariju, aksonalne i neuronske neuropatije, bakterijsku sepsu i septički šok, balo bolest, Bečetovu bolest, bulozni pemfigoid, kardiomiopatiju, Kastlemanovu bolest, Celijakija bolest, Šagasovu bolest, hronični sindrom zamora, hroničnu inflamatornu demijelinizirajuću polineuropatiju (CIDP), hronični rekurentni multifokalni osteomijelitis (CRMO), Čarg-Štrausov sindrom, ožiljkasti pemfigoid/benigni mukozni pemfigoid, Kronova bolest, Koganov sindrom, bolest hladnih aglutinina, kongenitalna blokada srca, koksaki miokarditis, CREST bolest, suštinska mešana krioglobulinemija, demijelinirajuće neuropatije, dermatitis herpetiformis, dermatomiozitis, Devic-ova bolest (neuromijelitis optika), dijabetes tipa I, diskoidni lupus, Dreslerov sindrom, endometrioza, eozinofilni ezofagitis, eozinofilni fasciitis, nodozni eritem, eksperimentalni alergijski encefalomijelitis, Evansov sindrom, fibromijalgija, fubrozni alveolitis, arteritis džinovskih ćelija (temporalni arteritis), glomerulonefritis, Goodpasture-ov sindrom, granulomatoza sa poliangiitisom (GPA) vidi Vegenerovu, Grejvsovu bolest, Guillain-Barre-ov sindrom, Hašimotov encefalitis, Hašimotov tiroiditis, Hemolitičku anemiju (uključujući atipični hemolitički uremijski sindrom i atipični hemolitičko-uremijski sindrom rezistentan na terapiju plazmom), Henoch-Schonleinovu purpuru, herpes gestationis, hipogamaglobulinemiju, idiopatsku trombocitopenijsku purpuru (ITP), IgA nefropatiju, IgG4-povezanu sklerozirajuću bolest, imunoregulatorne lipoproteine, miozitis sa inkluzionim telima, insulin-zavisni dijabetes (tip 1), intersticijalni cistitis, juvenilni artritis, juvenilni dijabetes, Kavasaki sindrom, Lambert-Itonov sindrom, vaskulopatiju velikih krvnih sudova, leukocitoklastični vaskulitis, Lihen planus, Lihen skleroza, lignozni konjunktivitis, linearnu IgA bolest (LAD), lupus (SLE), Lajmovu bolest, Meniereovu bolest, mikroskopski poliangiitis, mešovitu bolest vezivnog tkiva (MCTD), Moorenov čir, Mucha-Habermannovu bolest, sindrome višestrukih endokrinih neoplazija, multipla sklerozu, multifokalnu motornu neuropatiju, miozitis, mijastenija gravis, narkolepsiju, neuromijelitis optika (Devicov), neutropeniju, očni ožiljkasti pemfigoid, očni neuritis, osteoartritis, palindromski reumatizam, PANDAS (pedijatrijski autoimuni neuropsihijatrijski poremećaji povezani sa streptokokama), paraneoplastičnu cerebelarnu degeneraciju, paroksizmalnu noćnu hemoglobinuriju (PNH), Parry Rombergov sindrom, Parsonnage-Turnerov sindrom, Pars planitis (periferalni uveitis), pemfigus, periferalnu neuropatiju, perivenozni encefalomijelitis, pernicioznu anemiju, POEMS sindrom, Poliarteritis nodozu, autoimune poliglandularne sindrome tipa I, II i III, poliendokrinopatije, polimijalgiju reumatiku, polimiozitis, postmijokardijalni sindrom infarkta, sindrom postperikardiotomije, progesteronski dermatitis, primarnu bilijarnu cirozu, primarni sklerozirajući holangitis, psorijazu, psorijazni artritis, idiopatsku plućnu fibrozu, pioderma gangrenozum, čistu aplaziju crvenih krvnih zrnaca, Rejnoov fenomen, reaktivni artritis, refleksnu simpatičku distrofiju, Reiterov sindrom, Relapsirajući polihondritis, sindrom nemirnih nogu, retroperitonealnu fibrozu, reumatsku groznicu, reumatoidni artritis, sarkoidozu, Šmitov sindrom, skleritis, sklerodermu, hemolitičko-uremijski sindrom usled infekcije šiga-toksinom kojeg proizvodi Escherichia Coli (STEC-HUS), Sjogrenov sindrom, vaskulopatiju malih krvnih sudova, autoimunost sperme i testisa, sindrom ukočene osobe, subakutni bakterijski endokarditis (SBE), Susakov sindrom, simpatičnu oftalmiju, Takayasuov arteritis, temporalni arteritis/arteritis džinovskih ćelija, trombocitopenijsku purpuru (TTP), Tolosa-Huntov sindrom, transverzalni mijelitis, tubularni autoimunt poremećaj, ulcerativni kolitis, bolest nediferenciranog vezivnog tkiva (UCTD), uveitis, vezikulobuloznu dermatozu, vaskulitis, vitiligo i Wegenerovu granulomatozu (takođe poznata kao granulomatoza sa poliangiitisom (GPA)). Neurološke bolesti, poremećaji i/ili stanja mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, Alchajmeru bolest, Parkinsonovu bolest, demenciju Levijevih tela i multipla sklerozu. Kardivaskularne bolesti, poremećaji i/ili stanja mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, aterosklerozu, miokardijalni infarkt, moždani udar, vaskulitis, traumu i stanja koja nastaju usled kardivaskularne intervencije (uključujući, ali ne ograničavajući se na, srčanu bajpas operaciju, kalemljenje arterija i angioplastiju). Plućne bolesti, poremećaji i/ili stanja mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na, astmu, plućnu fibrozu, hroničnu opstruktivnu plućnu bolest (COPD) i respiratorni distresni sindrom kod odraslih. Očne aplikacije uključuju, ali nisu ograničene na: starosnu makularnu degeneraciju, alergijski i džinovski papilarni konjunktivitis, Bečetovu bolest, horoidalno zapaljenje, komplikacije povezane sa intraokularnom operacijom, odbacivanje transplantata rožnjače, čireve na rožnjači, citomegalovirusni retinitis, sindrom suvog oka, endoftalmitis, Fuchovu bolest, glaukom, vaskulitis stvoren imunim kompleksima, zapaljenski konjuktavistis, ishemijsku bolest mrežnjače, keratitis, makularni edem, očnu parazitnu infestaciju/migraciju, retinitis pigmentozu, skleritis, Stargardtovu bolest, subretinalnu fibrozu, uveitis, vitreo-retinalno zapaljenje i Vogt-Koyanagi-Haradaovu bolest.

[0182] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu biti naročito korisne u lečenju pacijenata sa PNH koji pokazuju slab odgovor na terapije monoklonalnim antitelima, kao što je EKULIZUMAB® terapija, zbog mutacija u C5 genu koje sprečavaju vezivanje antitela za C5 (Nishimura, J-I. (2012).54th ASH Annual Meeting, Abstract 3197).

[0183] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu biti korisne u lečenju infektivnih bolesti, poremećaja i/ili stanja, na primer, kod subjekta koji ima infekciju. U nekim slučajevima subjekat ima infekciju i je u riziku od razvoja sepse ili septičnog sindroma. Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida ovog otkrivanja su posebno korisne u lečenju sepse.

[0184] Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida mogu takođe da se daju za poboljšanje ishoda kliničkih procedura, gde je poželjna inhibicija komplementa. Takve procedure mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na kalemljenje, transplantaciju, implantaciju, kateterizaciju, intubaciju i slično. Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida koriste se za oblaganje sredstava, materijala i/ili biomaterijala korišćenih u tim procedurama. U nekim slučajevima, unutrašnja površina cevi može da bude obložena polipeptidima i/ili kompozicijama polipeptida da bi se sprečila aktivacija komplementa u telesnoj tečnosti koja prolazi kroz cev, ili in vivo ili ex vivo, npr., ekstrakorporalno ranžiranje, npr., dijaliza i srčani bajpas.

[0185] U nekim slučajevima, polipeptidi ovog otkrivanja vezuju se za C5 sa stehiometrijom 1:1. U nekim slučajevima, polipeptidi ovog otkrivanja inhibiraju preko alosternog mehanizma ili blokiranjem vezivanja konvertaze.

[0186] U nekim slučajevima, polipeptidi ovog otkrivanja inhibiraju C5 cepanje kod PNH pacijenata sa EKULIZUMAB®-rezistentnim C5 polimorfizmom.

II. Postupci upotrebe

[0187] Ovde su opisani postupci upotrebe jedinjenja (npr., bilo kog od jedinjenja navedenih u Tabeli 1) ili kompozicija za smanjenje C5 cepanja i nishodne posledice uključujući, ali ne ograničavajući se na, aktivaciju komplementa, ćelijsku lizu, lizu crvenih krvnih zrnaca (ovde se takođe naziva "hemoliza"). U nekim slučajevima, takvi postupci mogu da uključuju smanjenje cepanja C5 in vitro ili in vivo. U nekim slučajevima, takvi postupci mogu se izvoditi u biološkom sistemu, u nekom ispitivanju ili na subjektu.

[0188] C5 cepanje, aktivacija komplementa ili hemoliza, prema tome mogu se smanjiti od oko 1% do oko 5%, od oko 2% do oko 10%, od oko 5% do oko 20%, od oko 10% do oko 30%, od oko 20% do oko 50%, od oko 25% do oko 75%, od oko 30% do oko 60%, od oko 50% do oko 75%, od oko 50% do oko 90%, od oko 50% do oko 95%, od oko 75% do oko 100%, od oko 80% do oko 100%, od oko 85% do oko 95%, ili od oko 90% do oko 100%. Takva smanjenja mogu se oceniti istraživanjem nivoa jednog ili više C5 proizvoda cepanja (npr., C5a ili C5b proteini). U takvim slučajevima, nivoi proizvoda cepanja mogu se uporediti sa nivoima u netretiranom kontrolnom uzorku, subjektu ili sistemu ili pozadinskom merenju i može se odrediti procentna razlika. Takvi proizvodi cepanja mogu se izmeriti, u nekim slučajevima, imunotestom (npr., EIA ili ELISA). Slično tome, događaji nishodno od C5 cepanja mogu se izmeriti i uporediti sa netretiran kontrolnim uzorkom, subjektom ili sistemom ili pozadinskim merenjem. U nekim slučajevima, takvi događaji mogu da uključuju obrazovanje kompleksa koji napada membranu (MAC). MAC obrazovanje može se izmeriti pomoću ELISA (npr., WIESLAB® ELISA, Euro Diagnostica, Malmo, Švedska). U nekim slučajevima, hemoliza se može izmeriti spektrofotohemijski (npr., posmatranje optičke gustine na oko 412 nm talasne dužine) da bi se detektovalo oslobađanje hemoglobina iz ruptuiranih krvnih ćelija.

[0189] Postupci ovog otkrivanja uključuju postupke smanjenja C5 cepanja u biološkom sistemu koji obuhvataju obezbeđivanje polipeptid ovog otkrivanja. U nekim slučajevima, takvo smanjenje se ocenjuje poređenjem sa netretiranim kontrolnim sistemom. Smanjenje C5 cepanja može da uključuje smanjenje od najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100%. Prema takvim postupcima, polipeptidi mogu da budu obezbeđeni u koncentracijama od oko 0.001 nM do oko 5 nM, od oko 0.01 nM do oko 10 nM, od oko 0.1 nM do oko 50 nM, od oko 1 nM do oko 100 nM, od oko 20 nM do oko 200 nM ili od oko 100 nM do oko 10000 nM.

[0190] Postupci ovog otkrivanja uključuju postupke smanjenja hemolize u biološkom sistemu koja obuhvata obezbeđivanje polipeptida ovog otkrivanja. U nekim slučajevima, takvo smanjenje je ocenjeno poređenjem sa netretiranim kontrolnim sistemom. Smanjenje hemolize može da uključuje smanjenje najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99% ili 100%. Prema takvim postupcima, polipeptidi mogu biti obezbeđeni u koncentracijama od oko 0.001 nM do oko 5 nM, od oko 0.01 nM do oko 10 nM, od oko 0.1 nM do oko 50 nM, od oko 1 nM do oko 100 nM, od oko 20 nM do oko 200 nM ili od oko 100 nM do oko 10000 nM.

[0191] Postupci ovog otkrivanja uključuju postupke smanjenja hemolize u subjektu u odnosu na prethodno primećene nivoe hemolize kod subjekta. Smanjenje hemolize može da uključuje smanjenje najmanje 1%, najmanje 5%, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 50%, najmanje 75%, najmanje 80%, najmanje 85%, najmanje 90%, najmanje 95%, najmanje 98%, najmanje 99%, ili 100%. U nekim slučajevima, smanjenje hemolize može da uključuje smanjenje od oko 1% do oko 10%, od oko 5% do oko 25%, od oko 20% do oko 60%, od oko 40% do oko 80%, od oko 50% do oko 95% ili od oko 60% do 100%. Prema takvim postupcima, polipeptidi se mogu obezbediti u koncentracijama koje uključuju, ali nisu ograničene na od oko 0.001 nM do oko 5 nM, od oko 0.01 nM do oko 10 nM, od oko 0.1 nM do oko 50 nM, od oko 1 nM do oko 100 nM, od oko 20 nM do oko 200 nM ili od oko 100 nM do oko 10000 nM. U nekim slučajevima, polipeptidi mogu da se daju humanim subjektima korišćenjem doza koje uključuju, ali nisu ograničene na od oko 0.001 mg/kg do oko 1 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 2 mg/kg, od oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 20 mg/kg, ili od oko 5 mg/kg do oko 50 mg/kg. U nekim slučajevima, koncentracija polipeptida korišćena za davanje može da se menja da bi se postigao željeni nivo polipeptida u plazmi subjekta koji je primio polipeptid. U nekim slučajevima, željeni nivoi polipeptida u plazmi mogu da uključuju, ali nisu ograničeni na od oko 0.001 µM do oko 2 µM, od oko 0.01 µM do oko 3 µM, od oko 0.1 µM do oko 20 µM ili od oko 1 µM do oko 50 µM.

Terapeutske indikacije

[0192] Ovo otkrivanje posebno se odnosi na polipeptid (npr. peptidomimetike i ciklične polipeptide) i kompozicije koje sadrže najmanje jedan polipeptid, za lečenje poremećaja, stanja ili bolesti. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje subjekata koji boluju od paroksizmalne noćne hemoglobinurije (PNH). Subjekti sa PNH ne mogu da sintetizuju funkcionalne verzije regulatornih proteina komplemenata CD55 i CD59 na hematopoetskim matičnim ćelijama. Ovo rezultuje hemoliza posredovanim komplementom i raznim nishodnim komplikacijama. Drugi poremećaji i bolesti povezane sa komplementom uključuju, ali nisu ograničene na autoimune bolesti i poremećaje, neurološke bolesti i poremećaje, bolesti krvi i poremećaje i infektivne bolesti i poremećaje.

Eksperimentalni dokaz ukazuje na to da su mnogi poremećaji povezani sa komplementom povišeni inhibicijom aktivnosti komplementa.

[0193] Trenutna lečenja za PNH uključuju upotrebu EKULIZUMAB® (Alexion Pharmaceuticals, Cheshire, CT). U nekim slučajevima, EKULIZUMAB® može biti neefikasan zbog mutacije C5, kratkog poluživota, imune reakcije ili drugog razloga. Postupci ovog otkrivanja uključuju postupke lečenja subjekata sa PNH, pri čemu su takvi subjekti prethodno lečeni EKULIZUMABOM®. U nekim slučajevima, EKULIZUMAB® je neefikasan kod takvih pacijenata, čineći lečenje polipeptidima značajnim za terapeutsko olakšanje. U nekim slučajevima, polipeptidi se daju istovremeno ili zajedno sa EKULIZUMAB® terapijom. U takvim slučajevima, takvi subjekti mogu da dožive jedan ili više korisnih efekata takvog kombinovanog lečenja, uključujući, ali ne ograničavajući se na, efikasnije olakšanje, brže olakšanje ili manje neželjenih dejstava.

[0194] Stečena mutacija u biosintezi sidra fosfatidilinozitol glikana, gen klase A (PIG-A) koji potiče od multipotentne hematopoetske matične ćelije rezultuje retkom bolešću koja je poznata kao paroksizmalna noćna hemoglobinurija (PNH) (Pu, J.J. et al., Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria from bench to bedside. Clin Transl Sci.2011 Jun;4(3):219-24). PNH se karakteriše poremećajem koštane srži, hemolitičkom anemijom i trombozom. PIG-A genski proizvod je potreban za proizvodnju sidra glikolipida, glikozilfosfatidilinozitola (GPI), korišćen za vezivanje proteina za plazmatičnu membranu. Dva regulatorna proteina komplemenata, CD55 i CD59, postaju nefunkcionalni u odsustvu GPI. Ovo dovodi do uništavanja ovih ćelija posredovanog komplementom. Polipeptidi i/ili kompozicije polipeptida ovog otkrivanja su posebno korisne u lečenju PNH.

[0195] Postupci ovog otkrivanja uključuju postupke smanjenja hemolize kod subjekata sa PNH. Takvi postupci mogu da uključuju davanje polipeptida tim subjektima. Prema takvim postupcima, polipeptidi mogu da se daju u dozama koje uključuju, ali nisu ograničene na od oko 0.001 mg/kg do oko 1 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 2 mg/kg, od oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 1 mg/kg do oko 20 mg/kg, ili od oko 5 mg/kg do oko 50 mg/kg. Dodatni postupci mogu da uključuju jednu ili više doza. U slučajevima gde se daju višestruke doze, davanje može da uključuje, ali bez ograničenja na, svakodnevno davanje, jednom nedeljno, jednom mesečno ili jednom godišnje.

[0196] Kao što se ovde koristi pojmovi "lečiti," "lečenje," i slično, odnose se na olakšanje od ili ublažavanje patoloških procesa. U kontekstu ovog pronalaska u onoj meri u kojoj se to odnosi na bilo koji od drugih uslova navedenih u nastavku, pojmovi "lečiti," "lečenje," i slično znače olakšanje ili ublažavanje najmanje jednog simptoma povezanog sa takvim stanjem, ili usporavanje ili preokretanje napredovanja ili očekivanog napredovanja takvog stanja, kao što je usporavanje napredovanja maligniteta ili kancera, ili povećanje klirensa infektivnog organizma za ublažavanje/smanjenje simptoma izazvanih infekcijom, npr., hepatitis izazvan infekcijom virusom hepatitisa ili smanjenje uništavanja crvenih krvnih zrnaca (kao što je izmereno smanjenjem zahteva za transfuzijom ili povišenim nivoima hematokrita ili hemoglobina) koje nastaje od paroksizmalne noćne hemoglobinurije.

[0197] "Niži" ili "smanjeni" u kontekstu markera bolesti ili simptoma znači statistički značajno smanjenje u takvom nivou. Smanjenje može da bude, na primer, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40% ili veće, i poželjno je do nivoa prihvaćenog kao u okviru opsega normalnog za pojedinca bez takvog poremećaja.

[0198] "Povećan" ili "povišen" u kontekstu markera bolesti ili simptoma znači statistički značajno povećanje tog nivoa. Povećanje može da bude, na primer, najmanje 10%, najmanje 20%, najmanje 30%, najmanje 40% ili veće, i poželjno je do nivoa prihvaćenog kao u okviru opsega normalnog za pojedinca bez takvog poremećaja.

[0199] Kao što se ovde koristi, izrazi "terapeutski efektivna količina" i "profilaktički efektivna količina" odnosi se na količinu koja obezbeđuje terapijsku korist u lečenju, prevenciji ili upravljanju patološkim procesima ili kod očiglednog simptoma jednog ili više patoloških procesa. Specifična količina koja je terapeutski efektivna može se jednostavno odrediti od strane ordinirajućeg lekara, i može da varira zavisno od faktora poznatih u tehnici, kao što je, na primer, vrsta patoloških procesa, istorija i starost pacijenta, stadijum patoloških procesa i davanje drugih sredstava koji inhibiraju patološke procese.

[0200] Kao što se ovde koristi, "farmaceutska kompozicija" obuhvata farmakološki efektivnu količinu polipeptida i farmaceutski prihvatljivi nosač. Kao što se ovde koristi, "farmakološka efektivna količina," "terapeutski efektivna količina" ili jednostavno "efektivna količina" odnosi se na onu količinu polipeptida efektivnu za proizvodnju željenog farmakološkog, terapijskog ili preventivnog rezultata. Na primer, ako se dato kliničko lečenje smatra efektivnim kada postoji najmanje 10% izmene (povećanje ili smanjenje) parametra koji može da se meri povezanog sa bolešću ili poremećajem, terapeutski efektivna količina leka za lečenje te bolesti ili poremećaja je količina potrebna da izazove najmanje 10% izmene tog parametra. Na primer, terapeutski efektivna količina polipeptida može da bude ona koja menja vezivanje mete za njenog prirodnog partnera u vezivanju za najmanje 10%.

[0201] Pojam "farmaceutski prihvatljivi nosač" odnosi se na neki nosač za davanje terapijskog agensa. Takvi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, fiziološki rastvor, puferovan fiziološki rastvor, dekstrozu, vodu, glicerol, etanol i njihove kombinacije. Pojam specifično isključuje podlogu za ćelijsku kulturu. Za lekove date oralno, farmaceutski prihvatljivi nosači uključuju, ali nisu ograničeni na, farmaceutski prihvatljive ekscipijense kao što su inertni razblaživači, sredstva za dezintegrisanje, vezujuće agense, lubrikante, zaslađivače, arome, sredstva za obojenje i konzervanse. Pogodni inertni razblaživači uključuju natrijumkarbonat i kalcijumkarbonat, natrijumfosfat i kalcijumfosfat i laktozu, dok su kukuruzni skrob i alginska kiselina pogodni kao sredstva za dezintegrisanje. Vezujući agensi mogu da uključuju skrob i želatin, dok će lubrikant, ako je prisutan, uopšteno biti magnezijumstearat, stearinska kiselina ili talk. Po

1

želji, tablete mogu da budu obložene materijalom kao što je gliceril monostearat ili gliceril distearat, radi odlaganja apsorpcije u gastrointestinalnom traktu. Agensi uključeni u formulacije leka opisani su ovde u nastavku.

[0202] Efikasnost lečenja ili ublažavanje bolesti može da se oceni, na primer merenjem napredovanja bolesti, remisije bolesti, ozbiljnosti simptoma, smanjenja bola, kvaliteta života, doze leka potrebne za održavanje efekta lečenja, nivoa markera bolesti ili bilo kojeg drugog merljivog parametra odgovarajućeg za datu bolest koja se leči ili cilja radi prevencije. To je dobro unutar sposobnosti stručnjaka u tehnici da prate efikasnost lečenja ili prevencije merenjem bilo kog od tih parametara, ili bilo koje kombinacije parametara. U vezi sa davanjem polipeptida ili njegove farmaceutske kompozicije, "efektivno protiv" bolesti ili poremećaja označava da davanje na klinički odgovarajući način dovodi do blagotvornog dejstva za najmanje deo pacijenata, kao što je poboljšanje simptoma, izlečenje, smanjenje opterećenja bolešću, smanjenja mase ili broja ćelija tumora, produženja života, poboljšanja kvaliteta života, smanjenja potrebe za transfuzijama krvi ili drugog dejstva koje je opšte prepoznato kao pozitivno od strane doktora medicine slično lečenju određene vrste bolesti ili poremećaja.

[0203] Lečenje ili preventivni efekat je očigledan kada postoji statistički značajno poboljšanje jednog ili više parametara statusa bolesti, ili usled neuspeha da se pogoršaju ili razviju simptomi gde bi se inače očekivali. Kao primer, povoljna promena od najmanje 10% merljivog parametra bolesti, a poželjno najmanje 20%, 30%, 40%, 50% ili više, može ukazivati na efektivno lečenje. O efikasnost za dati polipeptidni lek ili formulaciju tog leka takođe se može suditi na osnovu eksperimentalnog životinjskog modela za datu bolest kao što je poznato u tehnici. Kada se koristi eksperimentalni životinjski model, efikasnost lečenja je dokazana kada se primeti statistički značajna modulacija markera ili simptoma.

[0204] Polipeptid i dodatni terapijski agens može se dati u kombinaciji u istoj kompoziciji, npr., parenteralno, ili se dodatni terapijski agens može dati kao deo odvojene kompozicije ili drugim ovde opisanim postupkom.

Indikacije zapaljenja

[0205] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje subjekata sa bolestima, poremećajima i/ili stanjima povezanim sa zapaljenjem. Zapaljenje može da bude regulisano tokom proteolitičke kaskade sistema komplemenata. Iako zapaljenje može imati blagotvorna dejstva, veće zapaljenje može dovesti do raznih patologija (Markiewski et al.2007. Am J Pathol.17: 715-27). Prema tome, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za smanjenje ili eliminisanje zapaljenja povezanog da aktivacijom komplementa.

2

Sterilno zapaljenje

[0206] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje, prevenciju ili odlaganje razvoja sterilnog zapaljenja. Sterilno zapaljenje je zapaljenje koje se javlja kao odgovor na stimulanse koji nisu infekcija. Sterilno zapaljenje može da bude uobičajeni odgovor na stres kao što je genomski stres, hipoksični stres, stres nutrijenata ili stres endoplazmatskog retikuluma uzrokovan fizičkim, hemijskim ili metaboličkim štetnim stimulansima. Sterilno zapaljenje može doprineti patogenezi mnogih bolesti kao što su, ali ne ograničavajući se na, ishemijom izazvane povrede, reumatoidni artritis, akutne povrede pluća, povrede jetre izazvane lekovima, zapaljenske bolesti creva i/ili druge bolesti, poremećaji ili stanja. Mehanizam sterilnog zapaljenja i postupci i kompozicije za lečenje, prevenciju i/ili odlaganje simptoma sterilnog zapaljenja mogu da uključuju bilo koji od onih koje navode Rubartelli et al. u Frontiers in Immunology, 2013, 4:398-99, Rock et al. u Annu Rev Immunol.2010, 28:321-342 ili u američkom patentu br.8,101,586.

Sistemski zapaljenski odgovor (SIRS) i sepsa

[0207] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje i/ili prevenciju sindroma sistemskog zapaljenskog odgovora (SIRS). SIRS je zapaljenje koje zahvata celo telo. Kada je SIRS izazvan infekcijom, naziva se sepsa. SIRS može takođe da bude izazvan ne-infektivnim događajima kao što su trauma, povreda, opekotine, ishemija, hemoragija i/ili ostala stanja. Tokom sepse i SIRS, aktivacija komplementa dovodi do prekomernog stvaranja proizvoda aktivacije komplementa što može izazvati zatajenje više organa (MOF) kod subjekata. Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za kontrolu i/ili balans aktivacije komplementa radi prevencije i lečenja SIRS, sepse i/ili MOF. Postupci primene inhibitora komplemenata za lečenje SIRS i sepse mogu da uključuju one opisane od

strane Rittirsch et al. u Clin Dev Immunol, 2012, 962927, u U.S. objavi br. US2013/0053302 ili u patentu Sjedinjenih Američkih Država br.8,329,169.

Akutni respiratorni distres sindrom (ARDS)

[0208] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje i/ili prevenciju razvoja akutnog respiratornog distres sindroma (ARDS). ARDS je rasprostranjeno zapaljenje pluća i može biti izazvano traumom, infekcijom (npr., sepsa), ozbiljnom pneumonijom i/ili inhalacijom štetnih supstanci. ARDS je obično ozbiljna komplikacija koja ugrožava život. Ispitivanja ukazuju da neutrofili mogu da doprinesu razvoju ARDS tako što utiču na akumulaciju polimorfonuklearnih ćelija u povređenim plućnim alveolama i intersticijalnom tkivu pluća. Prema tome, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se daju za smanjenje i/ili sprečavanje proizvodnje faktora tkiva u alveolarnim neutrofilima. Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu dalje da se koriste za lečenje, prevenciju i/ili odlaganje ARDS, u nekim slučajevima prema bilo kom od postupaka navedenih u Međunarodnoj objavi br. WO2009/014633.

Periodontitis

[0209] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje ili prevenciju razvoja periodontitisa i/ili povezanih stanja. Periodontitis je rasprostranjeno, hronično zapaljenje koje dovodi do uništavanja periodontalnog tkiva koje je tkivo koje drži i okružuje zube. Stanje takođe uključuje gubitak alveolarne kosti (kost koja drži zube). Periodontitis može biti izazvan nedostatkom oralne higijeni što dovodi do akumulacije bakterija na liniji desni, takođe poznato kao dentalni plak. Određena zdravstvena stanja kao što je dijabetes ili neuhranjenost i/ili navike kao što su pušenje mogu povećati rizik od periodontitisa. Periodontitis može da poveća rizik od moždanog udara, miokardijalnog infarkta, ateroskleroze, dijabetesa, osteoporoze, prevremenog porođaja, kao i drugih zdravstvenih tegoba. Ispitivanja pokazuju vezu između periodontitisa i lokalne aktivnosti komplementa. Periodontalne bakterije mogu da inhibiraju ili aktiviraju određene komponente kaskade komplementa. Prema tome, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za sprečavanje i/ili lečenje periodontitisa i povezanih bolesti i stanja. Inhibitori aktivacije komplemenata i postupci lečenja mogu da uključuju bilo koji od onih navedenih od strane Hajishengallis u Biochem Pharmacol.2010, 15; 80(12): 1 i Lambris ili u US objavi br. US2013/0344082.

Rane i povrede

[0210] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje i/ili ubrzavanje zarastanja različitih vrsta rana i/ili povreda. Kao što se ovde koristi, pojam "povreda" obično se odnosi na fizičku traumu, ali mogu da uključuju lokalizovane procese infekcije ili bolesti. Povrede mogu da se karakterišu oštećenjem, ozledom ili uništavanjem izazvanim spoljašnjim događajima koji deluju na delove tela i/ili organe. Rane su povezane sa posekotinama, udarcima, opekotinama i/ili drugim uticajima na kožu, koji ostavljaju kožu oštećenom ili narušenom. Rane i povrede su često akutne, ali ako se ne leče kako treba mogu dovesti do hroničnih komplikacija i/ili zapaljenja.

Rane i opekotine

[0211] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje i/ili za ubrzavanje zarastanja rana. Zdrava koža obezbeđuje vodootpornu, zaštitnu barijeru protiv patogena i drugih efektora životne sredine. Koža takođe kontroliše telesnu temperaturu i isparavanje tečnosti. Kada je koža ranjena, ove funkcije su poremećene čineći lečenje kože izazovom. Ranjavanje pokreće skup fizioloških procesa vezanih za imuni sistem koji obnavljaju i regenerišu tkivo. Aktivacija komplementa je jedan od ovih procesa. Ispitivanja aktivacije komplementa identifikovale su nekoliko komponenata komplemenata uključene zarastanje rana kao što je razmatrano od strane van de Goot et al. u J Burn

4

Care Res 2009, 30:274-280 i Cazander et al. Clin Dev Immunol, 2012, 2012:534291. U nekim slučajevima, aktivacija komplementa može biti preterana, pri čemu se izaziva smrt ćelija i pojačano zapaljenje (što dovodi do poremećenog zarastanja rana i hroničnih rana). U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za smanjenje ili eliminisanje takve aktivacije komplementa radi ubrzavanja zarastanja rana. Lečenje jedinjenjima i kompozicijama ovog otkrivanja može se izvesti prema bilo kom od postupaka za lečenje rana opisanim u Međunarodnoj objavi broj WO2012/174055.

Trauma glave

[0212] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje i/ili ubrzavanje zarastanja traume glave. Traume glave uključuju povrede skalpa, lobanje ili mozga. Primeri traume glave uključuju, ali nisu ograničeni na, potrese mozga, kontuzije, prelom lobanje, traumatske povrede mozga i/ili druge povrede. Traume glave mogu biti manje ili ozbiljne. U nekim slučajevima, trauma glave može da dovede do dugotrajnih fizičkih i/ili mentalnih komplikacija ili smrti. Ispitivanja označavaju da traume glave mogu da izazovu nepravilnu intrakranijalnu aktivaciju kaskade komplementa, što može dovesti do lokalnih zapaljenskih odgovora koji doprinose sekundarnom oštećenju mozga razvojem edema mozga i/ili neuronske smrti (Stahel et al. u Brain Research Reviews, 1998, 27: 243-56). Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje trauma glave i/ili za smanjenje ili prevenciju povezanih sekundarnih komplikacija. Postupci u kojima se koriste jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja za kontrolu aktivacije kaskade komplementa u traumi glave mogu da uključuju bilo koje od onih opisanih od strane Holers et al. u patentu Sjedinjenih Američkih Država br.8,911,733.

Povreda od prignječenja

[0213] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje i/ili ubrzavanje zarastanja povreda od prignječenja. Povrede od prignječenja su povrede izazvane silom ili pritiskom koji je primenjen na telo izazivajući krvarenje, modrice, prelome, povrede nerava, rane i/ili druga oštećenja tela. Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za smanjenje aktivacije komplementa nakon povreda od prignječenja, čime se ubrzava zarastanje nakon povreda od prignječenja (npr. ubrzavanjem regeneracije nerava, ubrzavanjem lečenja preloma, prevencijom ili lečenjem zapaljenja, i/ili drugih povezanih komplikacija). Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za ubrzavanje zarastanja prema bilo kom od postupaka navedenih u patentu Sjedinjenih Američkih Država br. 8,703,136; Međunarodnim objavama br. WO2012/162215; WO2012/174055; ili US objavi br. US2006/0270590.

Autoimuna bolest

[0214] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje subjekata sa autoimunim bolestima i/ili poremećajima. Imuni sistem može da se podeli na urođeni i adaptivni sistem, pri čemu se odnosi na nespecifične neposredne odbrambene mehanizme i složenije antigen-specifične sisteme, tim redom. Sistem komplemenata je deo urođenog imunog sistema, koji prepoznaje i eliminiše patogene. Pored toga, proteini komplemenata mogu da moduliraju adaptivni imunitet, povezuju urođene i adaptivne odgovore. Autoimune bolesti i poremećaji su imunološke abnormalnosti koje izazivaju da sistem cilja sopstvena tkiva i supstance. Autoimuna bolest može da uključuje određena tkiva ili organe tela. Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste da moduliraju komplement u lečenju i/ili prevenciji autoimunih bolesti. U nekim slučajevima, takva jedinjenja i kompozicije mogu da se koriste prema postupcima datim u Ballanti et al. Immunol Res (2013) 56:477-491.

Anti-fosfolipidni sindrom (APS) i katastrofični anti-fosfolipidni sindrom (CAPS)

[0215] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje antifosfolipidnog sindroma (APS) kontrolom aktivacije komplementa. APS je autoimuno stanje izazvano antifosfolipidnim antitelima koja izazivaju zgrušavanje krvi. APS može dovesti do rekurentne venske ili arterijske tromboze u organima, i komplikacija u placentalnim cirkulacijama koje izazivaju komplikacije povezane sa trudnoćom kao što su pobačaj, mrtvorođeno, preeklampsija, prevremeni porođaj i/ili druge komplikacije. Katastrofični anti-fosfolipidni sindrom (CAPS) je ekstremna i akutna verzija sličnog stanja koje dovodi do okluzije vena kod nekoliko organa istovremeno. Ispitivanja ukazuju da aktivacija komplementa može doprineti APS-povezanim komplikacijama uključujući komplikacije povezane sa trudnoćom, trombotične (zgrušavanje) komplikacije i vaskularne komplikacije. Jedinjenje i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje APS-povezanih stanja smanjenjem ili eliminisanjem aktivacije komplementa. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje APS i/ili APS-povezanih komplikacija prema postupcima opisanim od strane Salmon et al. Ann Rheum Dis 2002;61(Suppl II):ii46-ii50 i Mackworth-Young u Clin Exp Immunol 2004, 136:393-401.

Bolest hladnih aglutinina

[0216] U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje bolesti hladnih aglutinina (CAD), koja se takođe naziva hemoliza posredovana hladnim aglutininima. CAD je autoimuna bolest koja nastaje zbog visoke koncentracije IgM antitela koja uzajamno deluju sa crvenim krvnim zrncima na niskim telesnim temperaturama [Engelhardt et al. Blood, 2002, 100(5):1922-23]. CAD može dovesti do stanja kao što su anemija, zamor, dispneja, hemoglobinurija i/ili akrocianoza. CAD je povezana sa robusnom aktivacijom komplementa, a ispitivanja su pokazala da CAD može da se leči terapijama sa inhibitorom komplementa. Prema tome, ovo otkrivanje obezbeđuje postupke lečenja CAD pomoću jedinjenja i kompozicija ovog otkrivanja. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje CAD prema postupcima opisanim od strane Roth et al u Blood, 2009, 113:3885-86 ili u Međunarodnoj objavi br. WO2012/139081.

Vaskularne indikacije

[0217] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje vaskularnih indikacija koje pogađaju krvne sudove (npr., arterije, vene i kapilare). Takve indikacije mogu da pogađaju cirkulaciju krvi, krvni pritisak, protok krvi, funkciju organa i/ili druge telesne funkcje.

Trombotična mikroangiopatija (TMA)

[0218] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje i/ili prevenciju trombotične mikroangiopatije (TMA) i povezanih bolesti. Mikroangiopatije pogađaju male krvne sudove (kapilare) tela izazivajući da zidovi kapilara postanu debeli, slabi i skloni krvarenju i sporoj cirkulaciji krvi. TMA mogu dovesti do razvoja vaskularnih trombova, oštećenja endotelijalnih ćelija, trombocitopenije i hemolize. Organi kao što su mozak, bubreg, mišići, gastrointestinalni sistem, koža i pluća mogu biti pogođeni. TMA mogu nastati zbog medicinskih operacija i/ili stanja koja uključuju, ali nisu ograničeni na, transplantaciju hematopoetskih matičnih ćelija (HSCT), renalne poremećaje, dijabetes i/ili druga stanja. TMA mogu biti izazvane osnovnom disfunkcijom sistema komplemenata, kao što je opisano od strane Meri et al. u European Journal of Internal Medicine, 2013, 24: 496-502. Uopšteno, TMA mogu nastati zbog povišenih nivoa određenih komponenata komplemenata dovodeći do tromboze. U nekim slučajevima, ovo može biti izazvano mutacijama u proteinima komplemenata ili povezanim enzimima. Nastala disfunkcija komplementa može dovesti do ciljanja endotelijalnih ćelija i trombocita od strane komplement, što dovodi do povećane tromboze. TMA se mogu sprečiti i/ili lečiti jedinjenjima i kompozicijama ovog otkrivanja. U nekim slučajevima, postupci lečenja TMA jedinjenjima i kompozicijama ovog otkrivanja mogu se izvesti prema onima opisanim u US objavama

br. US2012/0225056 ili US2013/0246083.

Diseminovana intravaskularna koagulacija (DIC)

[0219] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje diseminovane intravaskularne koagulacije (DIC) kontrolisanjem aktivacije komplementa. DIC je patološko stanje u kom kaskada zgrušavanja krvi je veoma aktivirana i dovodi do obrazovanja krvnih ugrušaka naročito u kapilarima. DIC može dovesti do opstruiranog protoka krvi tkiva i eventualno može da ošteti organe. Pored toga, DIC pogađa normalni proces zgrušavanja krvi koji može dovesti do ozbiljnog krvarenja. Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje, prevenciju ili smanjenje ozbiljnosti DIC modulacijom aktivnosti komplementa. U nekim slučajevima jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste prema bilo kom od postupaka za DIC lečenje navedenim u US Patentu br.8,652,477.

Vaskulitis

[0220] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje vaskulitisa. Uopšteno, vaskulitis je poremećaj povezan sa zapaljenjem krvnih sudova, uključujući vene i arterije, koji se karakteriše time da bela krvna zrnca napadaju tkiva i izazivaju oticanje krvnih sudova. Vaskulitis može da bude povezan sa infekcijom, kao što je pegava groznica Stenovitih planina ili autoimunitetom. Primer vaskulitisa povezanog sa autoimunitetom je vaskulitis povezan sa antineutrofilnim citoplazmatskim autoantitelima (ANCA). ANCA vaskulitis je izazvan tako što abnormalna antitela napadaju sopstvene ćelije i tkiva tela. ANCA napadaju citoplazmu određenih belih krvnih zrnaca i neutrofila, navodeći ih da napadaju zidove krvnih sudova kod određenih organa i tkiva u telu. ANCA vaskulitis može da pogodi kožu, pluća, oči i/ili bubreg. Ispitivanja ukazuju da ANCA bolest aktivira alternativni put komplemenata i stvara određene komponente komplemenata koje stvaraju petlju za pojačavanje zapaljenja što dovodi do vaskularne povrede (Jennette et al.2013, Semin Nephrol.33(6): 557-64). U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje ANCA vaskulitisa inhibiranjem aktivacije komplementa.

Neurološke indikacije

[0221] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju, lečenje i/ili ublažavanje simptoma neuroloških indikacija, uključujući, ali ne ograničavajući se na, neurodegenerativne bolesti i povezane poremećaje. Neurodegeneracija uopšteno se odnosi na gubitak strukture ili funkcije neurona, uključujući odumiranje neurona. Ovi poremećaji mogu da se leče inhibicijom dejstva komplementa na neuronske ćelije pomoću jedinjenja i kompozicija ovog otkrivanja. Neurodegenerativno povezani poremećaji uključuju, ali nisu ograničeni na, amiotrofičnu lateralnu sklerozu (ALS), multipla sklerozu (MS), Parkinsonovu bolest i Alchajmerovu bolest.

Amiotrofična lateralna skleroza (ALS)

[0222] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju, lečenje i/ili ublažavanje simptoma ALS. ALS je fatalna bolest motornih neurona koja se karakteriše degeneracijom neurona kičmene moždine, moždanog stabla i motornog korteksa. ALS izaziva gubitak čvrstoće mišića dovodeći eventualno do respiratorne insuficijencije. Disfunkcija komplementa može doprineti ALS, i prema tome ALS može se sprečiti, lečiti i/ili se simptomi mogu ublažiti terapijom jedinjenjima i kompozicijama ovog otkrivanja koje ciljaju aktivnost komplementa. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za ubrzavanje regeneracije nerava. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste kao inhibitori komplemenata prema bilo kom od postupaka navedenih u US objavi br. US2014/0234275 ili US2010/0143344.

Alchajmerova bolest

[0223] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje Alchajmerove bolesti kontrolisanjem aktivnosti komplementa. Alchajmera bolest je hronična neurodegenerativna bolest sa simptomima koji mogu da uključuju dezorijentaciju, gubitak pamćenja, promene raspoloženja, probleme u ponašanju i eventualno gubitak telesnih funkcija. Smatra se da je Alchajmerova bolest uzrokovana ekstracelularnim naslagama amiloida u mozgu koje su povezane sa proteinima povezanim sa zapaljenjem kao što su proteini komplemenata (Sjoberg et al.2009. Trends in Immunology.30(2): 83-90). U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste kao inhibitori komplemenata prema bilo kom od postupaka lečenja Alchajmerove bolesti navedenim u US objavi br. US2014/0234275.

Indikacije vezane za bubrege

[0224] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje određenih bolesti, poremećaja i/ili stanja povezanih sa bubrezima, u nekim slučajevima inhibiranjem aktivnosti komplementa. Bubrezi su organi odgovorni za uklanjanje metaboličkih otpadnih proizvoda iz krvnog toka. Bubrezi regulišu krvni pritisak, urinarni sistem i homeostatske funkcije i, prema tome, su od suštinskog značaja za razne telesne funkcije. Bubrezi mogu biti ozbiljnije pogođeni zapaljenjem (u odnosu na druge organe) zbog jedinstvenih strukturnih karakteristika i izloženosti krvi. Bubrezi takođe proizvode svoje proteine komplemenata koji mogu da se aktiviraju nakon infekcije, bolesti bubrega i transplantacija bubrega. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste kao inhibitori komplemenata u lečenju određenih bolesti, stanja i/ili poremećaja bubrega prema postupcima opisanim od strane Quigg, J Immunol 2003; 171:3319-24.

Lupus Nefritis

[0225] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje lupus nefritisa inhibiranjem aktivnosti komplementa. Lupus nefritis je zapaljenje bubrega izazvano autoimunom bolešću koja se naziva sistemski eritemski lupus (SLE). Simptomi lupus nefritisa uključuju visok krvni pritisak; penušavi urin; oticanje nogu, stopala, ruku ili lica; bol u zglobovima; bol u mišićima; groznicu; i osip. Lupus nefritis može da se leči inhibitorima koji kontrolišu aktivnost komplementa, uključujući jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja. Postupci i kompozicije za prevenciju i/ili lečenje lupus nefritisa inhibicijom komplementa mogu da uključuju bilo koje od onih navedenih u US objavi br. US2013/0345257 ili Patentu Sjedinjenih Američkih Država br.8,377,437.

Membranski glomerulonefritis (MGN)

[0226] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje poremećaja membranskog glomerulonefritisa (MGN) inhibiranjem aktivacije određenih komponenata komplemenata. MGN je poremećaj bubrega koji može dovesti do zapaljenja i strukturnih promena. MGN izazivaju antitela koja se vezuju za rastvorljiv antigen u kapilarima bubrega (glomerulus). MGN može napasti funkcije bubrega, kao što je filtriranje fluida i može dovesti do otkazivanja bubrega.

Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste prema postupcima za sprečavanje i/ili lečenje MGN inhibicijom komplementa navedenim u U.S. objavi br. US2010/0015139 ili u Međunarodnoj objavi br. WO2000/021559.

Komplikacije hemodijalize

[0227] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje komplikacija povezanih sa hemodijalizom inhibiranjem aktivacije komplementa. Hemodijaliza je medicinska procedura koja se koristi za održavanje funkcije bubrega kod subjekata sa otkazivanjem bubrega. Kod hemodijalize, uklanjanje otpadnih proizvoda kao što su kreatinin, urea i slobodna voda u krvi izvodi se spolja. Česta komplikacija lečenja hemodijalizom je hronično zapaljenje izazvano kontaktom između krvi i membrane za dijalizu. Druga česta komplikacija je tromboza koja se odnosi na obrazovanje ugrušaka krvi koji ometaju cirkulaciju krvi. Ispitivanja su ukazala da su ove komplikacije povezane sa aktivacijom komplementa. Hemodijaliza može da se kombinuje sa terapijom inhibitorima komplemenata da bi se obezbedilo sredstvo za kontrolu zapaljenskih odgovora i patologija i/ili prevenciju ili lečenje tromboze kod subjekata koji se podvrgavaju hemodijalizi zbog otkazivanja bubrega. Postupci korišćenja jedinjenja i kompozicija ovog otkrivanja za lečenje komplikacija hemodijalize mogu se izvesti prema bilo kom od postupaka opisanih od strane DeAngelis et al u Immunobiology, 2012, 217(11): 1097-1105 ili od strane Kourtzelis et al. Blood, 2010, 116(4):631-639.

Očne bolesti

[0228] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje određenih bolesti, poremećaja i/ili stanja vezanih za oči. Kod zdravog oka sistem komplemenata je aktivan na niskom nivou i kontinuirano regulisan rastvorljivim intraokularnim proteinima vezanim za membranu koji štite od patogena. Prema tome, aktivacija komplementa ima važnu ulogu u nekoliko komplikacija vezanih za oko i kontrola aktivacije komplementa može da se koristi za lečenje tih bolesti. Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste kao inhibitori komplemenata u lečenju očne bolesti prema bilo kom od postupaka opisanim od strane Jha et al. u Mol Immunol.2007; 44(16): 3901-3908 ili u US Patentu br.8,753,625.

Starosna makularna degeneracija (AMD)

[0229] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje starosne makularne degeneracije (AMD) inhibiranjem aktivacije okularnog komplementa. AMD je hronična očna bolest koja izaziva zamagljen centralni vid, slepe tačke u centralnom vidu i/ili eventualni gubitak centralnog vida. Centralni vid utiče na sposobnost čitanja, vožnje automobila i/ili prepoznavanje lica. AMD je uopšteno podeljena na dva tipa, neeksudativni (suva) i eksudativni (vlažna). Suva AMD odnosi se na propadanje makule koje je tkivo u centru mrežnjače. Vlažna AMD odnosi se na otkazivanje krvnih sudova ispod mrežnjače što dovodi do curenja krvi i fluida. Nekoliko ispitivanja na ljudima i životinjama je identifikovalo proteine komplemenata koji su povezani sa AMD i nove terapijske strategije koje uključuju kontrolu puteva aktivacije komplemenata, kao što je opisano od strane Jha et al. u Mol Immunol.2007; 44(16): 3901-8. Postupci ovog otkrivanja koji uključuju upotrebu jedinjenja i kompozicija ovog otkrivanja za prevenciju i/ili lečenje AMD mogu da uključuju bilo koje od onih opisanih u US objavama br. US2011/0269807 ili US2008/0269318.

Bolest rožnjače

[0230] U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje bolesti rožnjače inhibiranjem aktivacije očnih komplemenata. Sistem komplemenata ima značajnu ulogu u zaštiti rožnjače od patogenih čestica i/ili zapaljenskih antigena. Rožnjača je krajnji prednji deo oka koji prekriva i štiti iris, zenicu i prednju komoru i, prema tome, je izložena spoljnim faktorima. Bolesti rožnjače uključuju, ali nisu ograničeni na, keratokonus, keratitis, očni herpes i/ili druge bolesti. Komplikacije na rožnjači mogu da izazovu bol, zamagljen vid, suzenje, crvenilo, osetljivost na svetlost i/ili ožiljke na rožnjači. Sistem komplemenata je ključan za zaštitu rožnjače, ali aktivacija komplementa može izazvati oštećenje tkiva rožnjače nakon što se infekcija očisti jer su određena jedinjenja komplementa jako izražena. Postupci ovog otkrivanja za modulaciju aktivnosti komplementa u lečenju bolesti rožnjače mogu da uključuju bilo koje od onih opisanih od strane Jha et al. u Mol Immunol.

2007; 44(16): 3901-8.

1

Autoimuni uveitis

[0231] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje uveitisa, koje je zapaljenje uvealnog sloja oka. Uvea je pigmentirano područje oka koje obuhvata žilnice, iris i cilijarno telo oka. Uveitis izaziva crvenilo, zamućen vid, bol, sinehiju i eventualno može dovesti do slepila. Ispitivanja pokazuju da su proizvodi aktivacije komplementa prisutni u očima pacijenata sa autoimunim uveitisom i komplement ima značajnu ulogu u razvoju bolesti. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za lečenje i/ili prevenciju uveitisa prema bilo kom od postupaka identifikovanih u Jha et al. u Mol Immunol.2007.44(16): 3901-8.

Dijabetesna retinopatija

[0232] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje dijabetesne retinopatije koja je bolest izazvana promenama u krvnim sudovima mrežnjače kod pacijenata sa dijabetesom. Retinopatija može da izazove oticanje krvnih sudova i curenje fluida i/ili razvoj abnormalnih krvnih sudova. Dijabetesna retinopatija utiče na vid i eventualno može da izazove gubitak vida. Ispitivanja su ukazala da aktivacija komplementa ima značajnu ulogu u razvoju dijabetesne retinopatije. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste prema postupcima za lečenje dijabetesne retinopatije opisanim u Jha et al. Mol Immunol.2007; 44(16): 3901-8.

Preeklampsija i HELLP- sindrom

[0233] Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste za prevenciju i/ili lečenje preeklampsije i/ili HELLP (skraćenica za karakteristike sindroma 1) hemolize, 2) povišenih enzima jetre i 3) malog broja trombocita) sindroma terapijom sa inhibitorom komplementa. Preeklampsija je poremećaj trudnoće sa simptomima koji uključuju povišeni krvni pritisak, oticanje, kratak dah, disfunkciju bubrega, pogoršanu funkciju jetre i/ili mali broj trombocita u krvi. Preeklampsija se obično dijagnostikuje visokim nivoom proteina u mokraći i visokim krvnim pritiskom. HELLP sindrom je kombinacija hemolize, povišenih enzima jetre i stanja niskih trombocita. Hemoliza je bolest koja uključuje rupturu crvenih krvnih zrnaca dovodeći do oslobađanja hemoglobina iz crvenih krvnih zrnaca. Povišeni enzimi jetre mogu da označavaju stanje jetre izazvano trudnoćom. Niski nivoi trombocita dovode do smanjene sposobnosti zgrušavanja, izazivajući opasnost od prekomernog krvarenja. HELLP je povezan sa preeklampsijom i poremećajem jetre. HELLP sindrom se obično javlja tokom kasnijih faza trudnoće ili nakon porođaja. Obično se dijagnostikuje testovima krvi koji ukazuju na prisustvo tri stanja koje uključuje. HELLP se obično leči izazivanjem isporuke.

[0234] Ispitivanja ukazuju da se aktivacija komplementa javlja tokom HELLP sindroma i preeklampsije i da su određene komponente komplemenata prisutne u povišenim nivoima tokom HELLP i preeklampsije. Inhibitori komplemenata mogu da se koriste kao terapijski agensi za sprečavanje i/ili

2

lečenje ovih stanja. Jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja mogu da se koriste prema postupcima za prevenciju i/ili lečenje HELLP i preeklampsije opisanih od strane Heager et al. u Obstetrics & Gynecology, 1992, 79(1): 19-26 ili u Međunarodnoj objavi br. WO201/078622.

Doziranje i davanje

[0235] Za upotrebu u lečenju humanih subjekata, polipeptidi mogu da se formulišu kao farmaceutske kompozicije. Zavisno od subjekta koji treba da se leči, režima davanja i željenog tipa lečenja (npr., prevencija, profilaksa ili terapija) polipeptidi se formulišu na načine koji su u skladu sa ovim parametrima. Suština tih tehnika otkrivena je u Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (2005); i Enciklopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick i J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Njujork.

[0236] Kompozicije se poželjno obezbeđuju u terapeutski efektivnoj količini, koja može biti, na primer, dnevna količina od oko 0.1 mg do oko 100 mg, od oko 0.5 mg do oko 200 mg, od oko 1 mg do oko 300 mg, od oko 5 mg do oko 500 mg, od oko 10 mg do oko 750 mg, od oko 50 mg do oko 1000 mg ili najmanje 1000 mg. U jednom slučaju, farmaceutska kompozicija obuhvata kapsulu, na primer u jediničnom doznom obliku.

[0237] Prema nekim postupcima, jedinjenja i kompozicije ovog otkrivanja obezbeđeni su u koncentracijama potrebnim za postizanje željenog dejstva. U nekim slučajevima, jedinjenja i kompozicije obezbeđene su u količini neophodnoj da se date reakcije ili proces smanje za polovinu. Koncentracija koja je potrebna da se postigne takvo smanjenje ovde se naziva polovina maksimalne inhibitorne koncentracije, ili "IC50." Alternativno, jedinjenja i kompozicije mogu da se obezbede u količini neophodnoj da se data reakcija, aktivnost ili proces poveća za polovinu. Koncentracija potrebna za takvo povećanje ovde se naziva polovina maksimalne efektivne koncentracije "EC50."

Jedinični dozni oblici

[0238] Polipeptidi mogu biti prisutni u ukupnim količinama 0.1-95 mas.% od ukupne mase kompozicije. Kompozicija može da bude obezbeđena u doznom obliku koji je pogodan za oralno davanje. Tako, farmaceutska kompozicija može da bude u obliku, npr., tvrdih kapsula (npr., tvrde želatinske kapsule ili tvrde kapsule hidroksipropil metilceluloze), mekih želatinskih kapsula, tableta, kapleta, tableta sa enteričkom oblogom, tableta za žvajanje, tvrdih želatinskih kapsula sa enteričkom oblogom, mekih želatinskih kapsula enteričkom oblogom, minikapsula, lozengi, filmova, traka, gelkapsula, dražeja, rastvora, emulzija, suspenzija, situpa ili sprejeva.

[0239] Terapijska količina polipeptida, uključujući, ali ne ograničavajući se na doze od 0.01 mg/kg, 1.0 mg/kg, ili 15 mg/kg može se dati subjektima. U nekim slučajevima, polipeptidi se daju sa od oko 0.001 mg/kg do oko 1.0 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 2.0 mg/kg, od oko 0.05 mg/kg do oko 5.0 mg/kg, od oko 0.03 mg/kg do oko 3.0 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 1.0 mg/kg do oko 5.0 mg/kg, od oko 2.0 mg/kg do oko 4.0 mg/kg, od oko 1.5 mg/kg do oko 7.5 mg/kg, od oko 5.0 mg/kg do oko 15 mg/kg, od oko 7.5 mg/kg do oko 12.5 mg/kg, ili od oko 10 mg/kg do oko 20 mg/kg. Takvi opsezi uključuju opsege pogodne za davanje humanim subjektima. U nekim slučajevima, humanim subjektima može da se daje od oko 0.01 mg/kg do oko 10 mg/kg, od oko 0.01 mg/kg do oko 15 mg/kg, ili od oko 3 mg/kg do oko 5 mg/kg. Nivoi doze mogu veoma da zavise od prirode stanja; efikasnosti leka; stanja pacijenta; mišljenja lekara; i učestalosti i režima davanja.

[0240] U nekim slučajevima, polipeptidi su obezbeđeni u koncentracijama podešenim za postizanje željenog nivoa tih polipeptida u uzorku, biološkom sistemu ili subjektu (npr., plazmatični nivo kod subjekta). U nekim slučajevima, željene koncentracije polipeptida u uzorku, biološkom sistemu ili subjektu mogu da uključuju koncentracije od oko 0.001 nM do oko 0.01 nM, od oko 0.005 nM do oko 0.05 nM, od oko 0.02 nM do oko 0.2 nM, od oko 0.03 nM do oko 0.3 nM, od oko 0.05 nM do oko 0.5 nM, od oko 0.01 nM do oko 2.0 nM, od oko 0.1 nM do oko 50 nM, od oko 0.1 nM do oko 10 nM, od oko 0.1 nM do oko 5 nM, ili od oko 0.2 nM do oko 20 nM. U nekim slučajevima, željene koncentracije polipeptida u plazmi subjekta mogu da budu od oko 0.01 mg/L do oko 2 mg/L, od oko 0.02 mg/L do oko 4 mg/L, od oko 0.05 mg/L do oko 5 mg/L, od oko 0.1 mg/L do oko 1.0 mg/L, od oko 0.2 mg/L do oko 2.0 mg/L, od oko 0.5 mg/L do oko 5 mg/L, od oko 1 mg/L do oko 5 mg/L, od oko 2 mg/L do oko 10 mg/L, od oko 3 mg/L do oko 9 mg/L, ili od oko 5 mg/L do oko 20 mg/L.

[0241] U drugim slučajevima, polipeptidi se daju sa učestalošću npr., svaka 4 h, svakih 6 h, svakih 12 h, svakih 18 h, svaka 24 h, svakih 36 h, svaka 72 h, svaka 84 h, svakih 96 h, svakih 5 dana, svakih 7 dana, svakih 10 dana, svakih 14 dana, svake 3 nedelje, ili više. Kompozicije mogu da se daju jednom dnevno ili se polipeptid može dati kao dve, tri ili više subdoza u odgovarajućim intervalima tokom dana ili da se isporuči kao formulacija sa kontrolisanim oslobađanjem. U tom slučaju, polipeptid sadržan u svakoj subdozi mora biti shodno tome manji da bi se postigla ukupna dnevna doza. Dozna jedinica takođe se može sastaviti za isporuku tokom nekoliko dana, npr., korišćenje konvencionalne formulacije sa produženim oslobađanjem, koje obezbeđuje produženo oslobađanje polipeptida tokom perioda od nekoliko dana.

[0242] Formulacije sa produženim oslobađanjem dobro su poznate u tehnici i posebno korisne za isporuku agenasa na određeno mesto, kao što može da se koristi sa kompozicijama polipeptida ovog otkrivanja. Dejstvo jedne doze može biti dugotrajno, tako da se sledeće doze daju u intervalima od najviše 3, 4 ili 5 dana, ili u intervalima od najviše 1 , 2, 3 ili 4 nedelje.

[0243] Polipeptid može da se daje intravenskom infuzijom tokom vremenskog perioda, kao što je tokom perioda od 5 minuta, 10 minuta, 15 minuta, 20 minuta ili 25 minuta. Davanje može redovno da se ponavlja, na primer, kao što je dvonedeljno (tj., svake dve nedelje) tokom jednog meseca, dva meseca,

4

tri meseca, četiri meseca ili duže. Nakon inicijalnog režima lečenja, lečenja mogu da se ređe primenjuju. Na primer, nakon dvonedeljnog davanja tokom tri meseca, davanje se može ponoviti jednom mesečno, tokom šest meseci ili jednom godišnje ili duže. Davanje polipeptida ili kompozicije može da smanji, snizi, poveća ili izmeni vezivanje ili bilo koji fiziološki štetni proces, npr., u ćeliji, tkivu, krvi, mokraći ili drugom delu pacijenta za najmanje 10%, najmanje 15%, najmanje 20%, najmanje 25%, najmanje 30%, najmanje 40%, najmanje 50%, najmanje 60%, najmanje 70%, najmanje 80 % ili najmanje 90% ili više.

[0244] Pre davanja cele doze polipeptida i/ili kompozicije polipeptida, pacijentima se može dati manja doza, kao što je 5% cele doze, i da se prate neželjena dejstva, kao što je alergijska reakcija ili reakcija infuzije, ili povišeni nivoi lipida ili krvni pritisak. U drugom primeru, pacijent može da se prati za neželjena imunostimulatorna dejstva, kao što su povišeni nivoi citokina (npr., TNF-alfa, Il-1, Il-6 ili Il-10).

[0245] Genetska predispozicija ima ulogu u razvoju nekih bolesti ili poremećaja. Prema tome, pacijent kojem treba polipeptid i/ili kompozicija polipeptida može da se identifikuje uzimanjem porodične anemneze, ili, na primer, skriningom za jedan ili više genetskih markera ili varijanti. Pružalac zdravstvenih usluga, kao što je doktor, medicinska sestra ili član porodice, može uzeti porodičnu anamnezu pre propisivanja ili davanja terapijske kompozicije ovog otkrivanja.

III. Kompleti

[0246] Bilo koja od ovde opisanih kompozicija može biti obuhvaćena u kompletu. U neograničavajućem primeru, polipeptidi mogu biti uključeni u kompletu za lečenje bolesti. Komplet može da uključuje fiolicu sterilnog, suvog praha polipeptida, sterilni rastvor za rastvaranje suvog praha i špric za infuziju podešen za davanje polipeptida.

[0247] Kada su polipeptidi obezbeđeni kao suvi prah smatra se da je u kompletima obezbeđeno između 10 mikrograma i 1000 miligrama polipeptida, ili najmanje ili najviše te količine.

[0248] Sredstva u kontejneru uopšteno će da uključuju najmanje jednu fiolicu, testnu epruvetu, balon, bocu, špric i/ili druga sredstva kontejnera, u koja se stavljaju formulacije polipeptida, poželjno, prikladno raspoređeni. Kompleti mogu takođe da obuhvataju drugo sredstvo kontejnera za držanje sterilnog, farmaceutski prihvatljivog pufera i/ili drugog razblaživača.

[0249] Komplet može da uključuje instrukcije za korišćenje komponenti kompleta kao i upotrebu bilo kog drugog reagensa koji nije uključen u komplet. Instrukcije mogu da uključuju varijacije koje mogu da se primene.

[0250] U patentnim zahtevima, članovi kao što su "neki," "neka," i "taj" mogu da predstavljaju jedan ili više od jedan osim ako nije naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta. Patentni zahtevi ili opisi koji uključuju "ili" između jednog ili više članova grupe smatraju se ispunjenim ako je jedan, više od jednog ili svi članovi grupe prisutno u, korišćeno u, ili na drugi način relevantno za dati proizvod ili postupak osim ako nije naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta. Ovaj pronalazak uključuje načine ostvarivanja u kojima je tačno jedan član grupe prisutan u, korišćen u, ili na drugi način relevantan za dati proizvod ili postupak. Ovaj pronalazak uključuje načine ostvarivanja u kojima je više od jednog, ili svi članovi grupe prisutno u, korišćeno u, ili na drugi način relevantno za dati proizvod ili postupak.

[0251] Takođe se napominje da je pojam "koji obuhvata" otvoren i dozvoljava ali ne zahteva uključivanje dodatnih elemenata ili faza. Kada se ovde koristi pojam "koji obuhvata", pojmovi "koji se sastoji od" i "ili koji uključuje" su, prema tome, takođe obuhvaćeni i opisani.

[0252] Kada su dati opsezi, uključene su krajnje tačke. Osim toga, podrazumeva se da, osim ako nije naznačeno suprotno ili na drugi način očigledno iz konteksta i razumevanja prosečnog stručnjaka u tehnici, vrednosti koji su izraženi kao opsezi mogu da imaju bilo koju specifičnu vrednost ili podopseg unutar naznačenog opsega u različitim načinima ostvarivanja ovog pronalaska, do desetine jedinice donje granice opsega, osim ako kontekst jasno ne diktira drugačije. U slučaju suprotstavljenih izjava citiranog izvora i ove prijave, prednost ima izjava u ovoj prijavi.

PRIMERI

Primer 1. Priprema biotinilovanog C5

[0253] Efektivni krajnji molarni odnos 1:4 C5 prema biotinu korišćen je za biotinilaciju velikih razmera.

10 mM rastvor EZ-Link Sulfo-NHS-LC Biotina (Thermo Scientific, Billerica, MA) je pripremljen prema instrukcijama proizvođača. U 1 mg 1 mg/ml C5 (Complement Tech, Tyler TX), 2.1 µl 10mM rastvora biotina je dodato i inkubirano na ledu tokom 2 sata. Reakcija je ugašena za 30 minuta na 4°C nakon dodavanja 100 µl 1 M Tris HCl pH 7.5. Reakcija je dijalizovan preko noći protiv hladnog PBST (fiziološki rastvor puferovan fosfatom (PBS) 0.1% Tween 80). Biotinilovan-C5 je podeljen na alikvote i čuvan na -80°C. Biotinilovan C5 je okarakterisan pomoću SDS-PAGE pod redukujučim i ne-redukujućim uslovima i okarakterisan za aktivnost ispitivanjem hemolize crvenih krvnih zrnaca. Biotinilovan C5 takođe je proveren za izdvajanje na perlama streptavidina (Invitrogen, Grand Island, NY). Hvatanje je izvedeno u uslovima preporučenim od strane proizvođača. Za hvatanje 4 µg biotinilovanog C5 iz 100 nM rastvora, korišćeno je 40 µl kaše perli i inkubirano na 4°C tokom 1 sata. Koncentracija uhvaćenih biotinilovanih C5 izračunata je propuštanjem poznate količine C5 na NuPage 4-12% Bis-Tris gelu (Invitrogen, Grand Island, NY).

Primer 2. Humano ispitivanje hemolize za QC biotinilovanog C5

[0254] Ispitivanje hemolize izvedeno je sa C5-osiromašenim serumima i biotinilovanim C5 i nebiotinilovanim C5 da bi se uporedile aktivnosti lize C5 pre i nakon biotinilacije. Ovčiji eritrociti osetljivi na antitela (Complement Technology, Tyler TX) u rastvoru sa 5 x 10<8>ćelija/ml centrifugirani su sa 2090 x gravitacija za 3 minuta i resuspendovani u GVB++ puferu (Complement Technology, Tyler TX). C5-osiromašeni humani serumi (Complement Technology, Tyler TX) brzo su odmrznuti na 37°C i stavljeni na led dok se nisu razblažili u GVB++. Ne-biotinilovani C5 protein (Complement Technology, Tyler TX) i biotinilovani C5 protein (unutrašnja biotinilacija) brzo su odmrznuti na 37°C i stavljeni na vlažnu ledenu kašu dok se nisu razblažili u GVB++.100 µl ćelija (pri krajnjoj koncentraciji od 2.5 x 10<7>ćelija/ml) kombinovano je sa C5-osiromašenim humanim serumima i 50 µl biotinilovanog C5 ili ne-biotinilovanog C5 (sa krajnjim koncentracijama ili 10 µg/ml, 3 µg/ml ili 1 µg/ml) u prozirnoj mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića tretiranoj kulturom tkiva (USA Scientific, Ocala, FL). Ploča je inkubirana tokom 1 sata na 37°C. Nakon inkubacije, ploče su zatim centrifugirane sa 2090 x gravitacija tokom 2 minuta pre prenošenja 100 µl supernatanta u novu mikrotitarsku ploču. Apsorbanca je očitana na 412 nm i procentna aktivnost lize ne-biotinilovanog C5 i biotinilovanog C5 je upoređena.

Primer 3. Selekcija polipeptida koji vezuju C5

[0255] C5 inhibitori identifikovani su u nekoliko rundi mRNK prikaza i selekcije. mRNK prikaz izveden je uopšteno kao što je opisano (Roberts, R.W., i Szostak, J.W. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302; WO2009067191) sa modifikacijama kao što je ovde opisano. RNK pulovi generisani su in vitro transkripcijom od DNK sintetizovanom sa fiksnim N-terminalnim kodonima metionina i cisteina, praćeno sa tri položaja mešavine šesnaest kodona fosforamidita, praćeno sa osam položaja mešavine drugog kodona takođe koja sadrži kodon cisteina. Dobijena biblioteka mRNK ima fiksni početni metionin praćen cisteinskim ostatkom, praćen sa tri položaja bez cisteina, praćeno sa osam položaja u kojima se javlja cistein sa učestalošću od 12.5%. Da bi se izvela selekcija, prva runda obogaćivanja obuhvatala je prvu fazu u kojoj RNK pulovi koji sadrže 3' terminalni UV umreženi oligonukleotid koji sadrži puromicin prevedeni su in vitro sa prečišćenim komponentama translacije navedenim u Tabeli 2. Translacija je izvedena pod dva dvojena uslova da bi se generisale dve jedinstvene biblioteke na bazi varijacije aminokiselina. Prvi uslov koristio je samo 20 prirodnih aminokiselina, dok je drugi uslov koristio prirodne aminokiseline (0.1 mM histidin, treonin, prolin, lizin, asparagin, tirozin, glutaminska kiselina i cistein), neprirodne aminokiseline (2 mM tertbutil-glicin (Tbg), 0.8 mM 7-azatriptofan (skraćeno "azaTrp" u ovom primeru) i 1 mM norvalin (Nvl), azaleucin i fenil-glicin (Phg)) i N-metil aminokiseline (450 µM mešavina N-metilovanog serina [(N-Me)S], alanina [(N-Me)A], glicina [(N-Me)G] i 4-fluoro-N-metilfenilalanina [(N-Me-4-F)Phe]).<35>S-obeleženi cisteinski ostaci uključeni su u oba uslova da bi se omogućilo praćenje obogaćivanje polipeptida po rundi.

Tabela 2. Komponente in vitro translacije

[0256] tRNK su enzimski naelektrisane njihovim odgovarajućim aminokiselinama pomoću tRNK sintetaza. Četiri N-metil tRNK su prethodno naelektrisane, dok su sve ostale tRNK enzimski naelektrisane tokom in vitro reakcije translacije. tRNK sintetaze dodate su na zapreminskoj osnovi bez obzira na njihove koncentracije.0.1 µl svake tRNK sintetaze (osim za metionin tRNK sintetazu, koja je dodata sa 0.4 µl po 25 µl reakcije translacije) dodato je za in-situ naelektrisanje tokom translacije za 25 µl reakcije translacije. Umrežena mRNK je dodata u krajnjoj koncentraciji 0.75 µM. Reakcija translacije održavana je na 37°C tokom 1 sata. Nakon translacije, fuzija prenetih polipeptida na njihove odgovarajuće mRNK izvedena je dodavanjem visoke soli u mešavinu translacije i inkubiranjem na 37°C tokom 1.5 sata.

Biblioteka za selekciju prirodnih polipeptida je pripremljena od osam pojedinačnih biblioteka sa fiksnim kodonom cisteina u položajima 5-11. Nasumični položaji u ovim bibliotekama, sa svih mogućih 20 aminokiselina, izvedeni su kombinatorno sa ponavljajućim kodonskim jedinicama NNS (N je A,G,C, ili T; S je G ili C) (Devlin, J.J., et. al., (1990). Science 249, 404-406.) Translacija ovih biblioteka u prirodnim polipeptidima je izvedena pomoću zečijih retikulocita kompleta za in vitro translaciju pre nego gore opisani rekonstituisanog sistema.

[0257] Izdvajanje mRNK-prikazanih polipeptida izvedeno je pomoću i Oligo dT i Ni-NTA afiniteta, da bi se izolovali fuzioni molekuli koji sadrže i poliA mRNK i His označeni polipeptidi. Oligo dT perla-vezani polipeptidi su zatim ciklizovani sa dibromoksilenom kao što je opisano od strane drugih (J. Am. Chem. Soc.127:11727 (2005)).

[0258] Direktna selekcija polipeptida po ciljnom afinitetu je zatim izvedena. Omogućeno je da se mRNK-prikazani polipeptidi vežu tokom 1 sata na 4°C za biotinilovani C5 u 100 nM rastvora biotinilovanog C5 u PBST. RNK koja odgovara polipeptidima odabranim prema afinitetu je reverzno transkribovana i PCR amplifikovana da bi se stvorio pul dvolančane DNK. DNK pul je in vitro transkribovan za generisanje mRNK, i proizvedena mRNK je umrežena kao pre na njenom 3' kraju sa oligonukleotidom koji sadrži puromicin. Fuzije mRNK-puromicina podvrgnute su in vitro translaciji da bi se generisala druga runda biblioteke, koja je sad obogaćena polipeptidima koji vezuju komponentu komplementa C5. Ciklus selekcije je ponovljen u šest rundi. Nakon šeste runde, DNK pul koji predstavlja odabrane polipeptide kloniran je i sekvenciran, a aminokiselinske sekvence inhibitora kandidata C5 određene su na osnovu DNK sekvenci. Identifikovane polipeptidne sekvence su navedene u Tabeli 3.

[0259] Kao što se koriste u svim narednim tabelama kao u listi sekvenci, skraćenice imaju sledeća značenja: "Ac" i "NH2" označavaju acetil i amidirane krajeve, tim redom; "Nvl" označava norvalin; "Phg" označava fenilglicin; "Sar" označava sarkozin; "Tbg" označava terc-butilglicin; "Trt" označava tritil ili trifenilmetil; "Chg" označava cikloheksilglicin; "(N-Me)X" označava N-metilovan oblik aminokiseline označene jednoslovnom ili troslovnom skraćenicom za tu aminokiselinu umesto varijable "X" napisano kao N-metil-X [npr. (N-Me)A i (N-Me)Ala označavaju N-metilovan oblik alanina ili N-metil-alanina]; 7-azatriptofan je ugrađen gde je "azaTrp" označeno; "(4-F)Phe" označava 4-fluorofenilalanin; "Tyr(OMe)" označava O-metil tirozin, "Aib" označava amino izobutirnu kiselinu; "(homo)F" ili "(homo)Phe" označava homofenilalanin; "(2-OMe)Phg" odnosi se na 2-O-metilfenilglicin; "PropargilGly" odnosi se na Propargilglicin; "(5-F)W" ili "(5-F)Trp" odnosi se na 5-fluorotriptofan; "D-X" odnosi se na D-stereoizomer date aminokiseline "X" gde aminokiselina može biti skraćena pomoću jednoslovnog ili troslovnog koda [npr. (D-Chg) označava D-cikloheksilglicin i (D-W) označava D-triptofan]; "(5-MeO)W" ili "(5-MeO)Trp" odnosi se na 5-metil-O-triptofan; "homoC" odnosi se na homocistein; "(1-Me-W)" ili "(1-Me)W" ili "(1-Me-Trp)" ili "(1-Me)Trp" odnosi se na 1-metiltriptofan; "Nle" odnosi se na norleucin; 1,2,3,4-tetrahidroizokvinolin-1-karboksilna kiselina je ugrađena gde je "Tiq" označeno; "Asp(T)" odnosi se na (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propionsku kiselinu; "(3-Cl-Phe)" odnosi se na 3-hlorofenilalanin; "[(N-Me-4-F)Phe]" ili "(N-Me-4-F)Phe" odnosi se na N-metil-4-fluorofenilalanin; "Boc" je terc-butiloksikarbonilna zaštitna grupa; "[xKsilil(y, z)]" odnosi se na ksilil premošćavajući ostatak između dva cisteina gde x može da bude m, p ili o da bi se označila upotreba meta-, para- ili orto-dibromoksilena (tim redom) za generisanje premošćavajućih ostataka, a numerički identifikatori, y i z, određuju položaj aminokiselina unutar polipeptida cisteina koji učestvuju u ciklizaciji; "[ciklo(y,z)]" odnosi se na obrazovanje veze između dva ostatka gde numerički identifikatori, y i z, određuju položaj ostataka koji učestvuju u vezi; "[mKsililbiciklo]" označava da polipeptid obuhvata dve ciklične petlje i da je premošćavajući ostatak generisan reakcijom sa meta-dibromoksilenom. Svi drugi simboli odnose se na standardni aminokiselinski kod od jednog slova. Pored toga, polipeptidi koji obuhvataju PEG2000 ili BODIPY-TMR-X oznake sekvenci su označeni.

Tabela 3. Polipeptidne sekvence

Primer 4. Sinteza polipeptida

[0260] Polipeptidi su sintetizovani pomoću standardnih Fmoc/tBu postupaka na čvrstoj fazi. Sinteza se obično izvodi na Liberty automatizovanom mikrotalasnom peptidnom sintesajzeru (CEM, Matthews NC) korišćenjem standardnih protokola sa Rink amidnom smolom, iako mogu da se koriste drugi automatski sintesajzeri bez mogućnosti stvaranja mikrotalasa. Sve aminokiseline dobijene su iz komercijalnih izvora osim ako nije drugačije naznačeno. Korišćeni reagens za kuplovanje je 2-(6-hloro-1-H-benzotriazol-lil)-1,1,3,3,-tetrametilaminijum heksafluorofosfat (HCTU), a baza je diizopropiletilamin (DIEA). Polipeptidi su otcepljeni od smole sa 95% TFA, 2.5% TIS i 2.5% vode za 3 sata i izolovani taloženjem etrom. Sirovi polipeptidi prečišćeni su na preparativnoj HPLC reverzne faze korišćenjem C18 kolone, sa acetonitril/voda 0.1% TFA gradijentom od 20%-50% tokom 30 min. Frakcije koje sadrže čist polipeptid su prikupljene i liofilizovane i svi polipeptidi analiziranu su pomoću LC-MS.

Primer 5. Obrazovanje disulfidnih ciklizovanih polipeptida

[0261] Da bi se proizveli disulfidni ciklizovani polipeptidi, linearni polipeptid je rastvoren u mešavini vode i DMSO, a dobijeni rastvor je snažno mešan pod atmosferom vazduha za 12 h.

Primer 6. Ciklizacija dibromoksilen polipeptida

[0262] Balon od 100 mL napunjen je acetonitrilom (12 mL) i vodom (24 mL) i degaziran argonom za oko 5 min. Linearni polipeptid (0.01 mmol) i 200 mM amonijum bikarbonat (6mL) dodati su praćeno sa 0.012 mmol ili 1,3-bis(bromometil) benzena, 1,2-bis(bromometil)benzena, 1,4-bis(bromometil)benzena, 2,6-bis(bromometil)piridina ili (E)-1,4-dibromobut-2-ena. Reakciona mešavina mešana je pod argonom na sobnoj temperaturi za približno 2 sata i praćena pomoću LC-MS. Nakon što se reakcija završila, reakcioni rastvor je zamrznut i liofilizovan. HPLC prečišćavanje sirovog liofilizovanog proizvoda praćeno liofilizacijom frakcija koje sadrže čist polipeptid dalo je krajnji ciklizovani proizvod kao beli prah.

Primer 7. Laktamom ciklizacija polipeptida

[0263] Ciklizacija polipeptida korišćenjem laktamske grupe je izvedena na čvrstoj fazi. Polipeptid je prvo sintetizovan na Wang smoli čvrstog nosača standardnom Fmoc hemijom. Fmoc-ASP(alil)-OH i Fmoc-LYS(alok)-OH ugrađeni su u polipeptid na označenim položajima kao dva monomera prekursora za obrazovanje laktamskog mosta. Nakon pune elongacije, smola je isprana suvim dihlorometanom (3x) i pročišćena suvim gasom azota za 10 min. Da bi se uklonile alil i alok zaštitne grupe, smola je tretirana 5-strukim molarnim viškom fenilsilana i pročišćena azotom za 10 min. Katalitička količina tetrakis Pd(0) rastvorena je u suvom dihlorometanu i dodata suspenziji smole. Nakon jednog sata, smola je isprana

1

uzastopno dihlorometanom (3x), dimetilformamidom (3x), natrijum dietilditiokarbamat trihidratom (3x), dimetilformamidom (3x) i dihlorometanom (3x). Ciklizacija laktama postignuta je u dimetilformamidu (DMF) tretiranjem deprotektovanog polipeptida koji sadrži smolu sa PyAOP ((3-Hidroksi-3H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinato-O)tri-1-pirolidinil- fosfor heksafluorofosfat) i diizopropiletilaminom i ostavljanjem da reaguju preko noći. Smola je isprana sa DMF i tretirana svežim PyAOP i diizopropiletilaminom tokom dodatnih 60 minuta na 45 °C. Smola je isprana i oprana dimetilformamidom pet puta. Polipeptid je bio pocepan i prečišćen kao što je opisano u primeru 4.

Primer 8. Triazolom ciklizacija polipeptida

[0264] Ciklizacija polipeptidi koji sadrži azid i alkin ostatk izvedena je na čvrstoj fazi. Polipeptid koji sadrži smolu (0.05 mmol) tretiran je dihlorometanom i ostavljen da nabubri za 10 min. Rastvarač je zatim zamenjen sa DMF (3-5 mL) i nakon 10 min, rastvor Cu-TBTA liganda je dodat (125 µL 20 mM rastvora). Suspenzija je prečišćena gasom argona i zatim je dodata askorbinska kiselina (5 µmol). Rastvor je mućkan tokom 2h i reagensi u višku su uklonjeni, smola je isprana rastvorom EDTA u DMF da bi se uklonio višak bakra. Polipeptid je pocepan i prečišćen kao što je opisano u primeru 4.

Primer 9. Polipeptidi

[0265] Polipeptidi su sintetizovani. Oni uključuju jedinjenja navedena u Tabeli 4.

Tabela 4. Jedinjenja

2

4

[0266] Polipeptidi R3183 (SEQ ID NO: 184) i R3193 (SEQ ID NO: 194) su sintetizovani prema aminokiselinskim sekvencama R3176 (SEQ ID NO: 177) sa izuzetkom zamene Nvl-NH2sa Lys. Amin grupa bočnog lanca Lys ostatka je modifikovana različitim lipofilnim ostacima dajući lipidovane polipeptide.

Primer 10. Optimizacija i ispitivanje C5 inhibitora

[0267] Polipeptidi odabrani prema Primeru 3 i navedeni u Tabeli 3 testirani su za njihovu sposobnost da inhibiraju komplementom posredovanu ćelijsku lizu. Pored toga, različiti optimizovani polipeptidi su sintetizovani prema postupcima iz Primera 4-8 i testirani isto tako (vidi Tabelu 4). Optimizovane polipeptidne sekvence uključuju one dobijene izvođenjem raznih skraćivanja, delecija, adicija i/ili supstitucija na jedinjenju R3002 (SEQ ID NO: 3), R3008 (SEQ ID NO: 9) i R3021 (SEQ ID NO: 11) ili obrazovanjem hibridnih polipeptida koji obuhvataju kombinacije regiona odabranih iz bilo koja od ova tri.

Humano ispitivanje hemolize (test RBC lize pomoću kompletnih humanih seruma)

[0268] Polipeptidi navedeni u Tabeli 3, kao i njihovi optimizovani derivati (vidi Tabelu 4) testirani su za inhibitornu aktivnost ispitivanjem hemolize crvenih krvnih zrnaca. Ovčiji eritrociti osetljivi na antitela (Complement Technology, Tyler, TX) zasejani su sa 2.5 x 10<7>ćelija/bunarčić sa kompletnim humanim serumima (Complement Technology, Tyler TX) i polipeptidima da bi se odredilo inhibitorno dejstvo polipeptida na lizu crvenih krvnih zrnaca. Ćelije su centrifugirani za 3 minuta sa 2090 x gravitacija i resuspendovane u svežem GVB++ puferu (Complement Technology, Tyler TX). Humani serumi brzo su odmrznuti na 37°C i zatim čuvani na ledu do razblaživanja u GVB++. Deset 6-strukih serijskih razblaženja polipeptida (10mM zaliha, DMSO) izvedeno je u DMSO i zatim dodato puferu.50 µl svakog razblaženja polipeptida kombinovano je sa serumima i 100 µl ćelija u pojedinačnim bunarčićima prozirne mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića tretirane kulturom tkiva (USA Scientific, Ocala, FL) i resuspendovano pipetiranjem. Uzorci su inkubirani na 37°C tokom jednog sata. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane sa 2090 x gravitacija tokom 2 minuta.100 µl supernatanta preneto je na novu ploču i apsorbanca je očitana na 412 nm. Podaci su usklađeni sa log-logit formulom koja daje krivu doza-odgovor i IC50. Kao što se ovde koristi, pojam "IC50" odnosi se na polovinu maksimalne inhibitorne koncentracije, vrednost korišćena da označi količinu inhibitora potrebnog da se data reakcija ili proces smanje za polovinu. Testirana jedinjenja navedena su u Tabeli 5.

Tabela 5. Analizirana jedinjenja

1

2

4

Primer 11. Alternativno humano ispitivanje hemolize korišćenjem C5 osiromašenih seruma

[0269] Polipeptidi navedeni u Tabeli 6 testirani su za funkcionalnu aktivnost u ispitivanju hemolize crvenih krvnih zrnaca korišćenjem humanih C5 osiromašenih seruma i prečišćenog humanog C5 pre nego kompletnih humanih seruma. Da bi se ocenila aktivnost, ovčiji eritrociti osetljivi na antitela (Complement Technology, Tyler, TX) zasejani su sa 2.5 x 10<7>ćelija/bunarčić sa 1.5% humanim C5 osiromašenim serumima (Complement Technology, Tyler, TX) i 0.5nM prečišćenim humanim C5 (Complement Technology, Tyler, TX). Ovčiji eritrociti osetljivi na antitela su centrifugirani sa 2090 x gravitacija tokom 3 minuta i zatim resuspendovani u svežem GVB + (Complement Technology, Tyler, TX). Humani C5 osiromašeni serumi i prečišćeni humani C5 brzo su odmrznuti na 37°C i zatim čuvani na ledu ili vlažnom ledu, tim redom. Zaliha polipeptida (10mM, DMSO) je serijski razblažena u DMSO da bi se dobilo 106-strukih razblaženja i zatim im je GVB++ dodat.50 µl svakog razblaženja polipeptida je kombinovano sa 25 µl C5 osiromašenih seruma, 25 µl prečišćenog humanog C5 i 100 µl ćelija u pojedinačnim bunarčićima prozirne mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića tretirane kulturom tkiva (USA Scientific, Ocala, FL) i resuspendovano pipetiranjem. Uzorci su inkubirani na 37°C tokom jednog sata. Po završetku inkubacije, ploče su centrifugirane sa 2090x gravitacija tokom 2 minuta.100 µl supernatanta preneto je na novu ploču i apsorbanca je očitana na 412 nm. Podaci su usklađeni sa log-logit formulom koja daje krivu doza-odgovor i IC50.

Tabela 6. Analizirana jedinjenja

Primer 12. Enzimski imunotest za ocenu C5 inhibicije

[0270] C5 inhibitorna aktivnost ocenjena je enzimskim imunotestom (EIA). Inhibicija proizvodnje C5a i kompleks koji napada membranu (MAC) izmereni su pomoću MicroVue EIA kompleta (Quidel Corporation, San Diego, CA).

C5a EIA

[0271] Supernatant iz humanog RBC ispitivanja hemolize R3002 (SEQ ID NO: 3) i R3008 (SEQ ID NO: 9) je razblažen 1:50 i ispitan pomoću C5a EIA (Fig.1). Oba polipeptida inhibirala su obrazovanje C5a. R3002 (SEQ ID NO: 3) je imao IC50od 5.4 nM, dok je R3008 (SEQ ID NO: 9) imao IC50od 54.5 nM.

Kompleks koji napada membranu (MAC) EIA

[0272] MAC EIA je izveden na razblaženom supernatantu (1:5) R3008 (SEQ ID NO: 9) iz humanog RBC ispitivanja hemolize (Fig.2). Pokazalo se da je ovaj polipeptid inhibirao obrazovanje MAC sa IC50od 33 nM.

Primer 13. Karakterizacija vezivanja peptidomimetika pomoću fluorescentne polarizacije

[0273] Fluorescentna polarizacija (FP) omogućava događaje vezivanja koji se mere u homogenom rastvoru (Banks, P. et al., Impact of a red-shifted dye label for high throughput fluorescence polarization assays of G protein-coupled receptors. J Biomol Screen.2000 Oct;5(5):329-34 i Parker, G.J. et al., Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptorligand-binding and kinase/phosphatase assays. J Biomol Screen.2000 Apr;5(2):77-88). Ključni koncept FP je da je stepen u kom fluorofor polarizuje svetlost u obrnutoj vezi sa njegovom molekularnom rotacijom (Lea, W.A. et al., Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert Opin Drug Discov.

2011 Jan;6(1):17-32), i fluorofor vezan za mnogo veći ciljni protein rotira sporije nego nevezani fluorofor, što dovodi do povećanja polarizacije koja može da se kvantifikuje. FP se koristi sve više u kampanjama visoke propusnosti kao postupak za merenje vezivanja liganda-mete (Parker, G.J. et al., Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assays. J Biomol Screen.2000 Apr;5(2):77-88), za određivanje ravnotežne konstante disocijacije (KD) (Prystay, L. et al., Determination of equilibrium dissociation constants in fluorescence polarization. J Biomol Screen.2001 Jun;6(3):141-50), i vodeći otkriće kroz testove kompetitivnog vezivanja (Tian, W. et al., Development of novel fluorescence polarization-based assay for studying the β-catenin/Tcf4 interaction. J Biomol Screen.2012 Apr;17(4):530-4).

Materijali i postupci

[0274] FP je korišćen za skrining kompetitivnih inhibitora polipeptida C5 proteina. Proba R3076 (SEQ ID NO: 40) je generisana inkubiranjem matičnog polipeptida, R3072 (SEQ ID NO: 20) sa BODIPY-TMR-X, SE (Life Technologies, Grand Island, NY) u DMF (Sigma, Saint Louis, MO) tokom 4 sata. BODIPY-TMR boja vezana za C-terminalni lizin proteina i naknadna obeležena proba je prečišćena pomoću HPLC.

[0275] Ravnotežna konstanta disocijacije (KD) za vezivanje R3076 (SEQ ID NO: 40) za humani C5 protein (Complement Technology, Tyler, TX) određena je inkubiranjem rastvora 25 nM R3076 (SEQ ID NO: 40) sa povećanjem koncentracija C5 protein. Polarizacija je merena tokom vremena, dok nije postignuta ravnoteža vezivanja. KDje određena pomoću Graphpad Prism (korišćenjem "Zasićene krive vezivanja, jedna lokacija - specifično vezivanje sa nagibom brda" kao krive podešene za određivanje KD). Ravnoteža je dostignuta nakon 10 minuta, pri čemu su vrednosti za KD, nagib brda i maksimalno vezivanje ostale stabilne tokom 60 minuta. Krajnja KDvrednost od 8.07 nM (0.53 standardna devijacija) određena je izračunavanjem prosečne vrednosti za KDod 10 do 60 minuta. Na osnovu ovih informacija, 25 nM i 50 nM koncentracije za R3076 (SEQ ID NO: 40) i C5 protein, tim redom, odabrane su za upotrebu u kompetitivnom testu. Ove koncentracije predstavljale su približni nivo proteina potrebnog za 95% probe koja se vezuje za C5 protein. R3023 (SEQ ID NO: 104) je kodirana polipeptidna varijanta R3002 (SEQ ID NO: 3) i uključena je u sve testove kao negativna kontrola.

[0276] Humani C5 protein je razblažen do 200 nM u testnom puferu, koji se sastojao od TBS (EMD Millipore, Billerica, MA) 0.005% Triton-X (Sigma, Saint Louis, MO).10 µl testnog pufera dodato je u sve bunarčiće crne, nevezujuće ploče sa 384 bunarčića za analizu (Greiner, Monroe, NC) i 10 µl razblaženog C5 proteina zalihe dodato je u eksperimentalne i naznačene kontrolne bunarčiće.

[0277] Proba R3076 (SEQ ID NO: 40) je razblažena 1 prema 10 u DMSO (Life Technologies, Grand Island, NY) i 30 µl te zalihe je razblaženo u 3 ml testnog pufera da bi se dobilo 100 nM zalihe.10 µl ove radne

1

zalihe je zatim dodato u svaki bunarčić u ploču za analizu. Ploča za analizu inkubirana je na sobnoj temperaturi, zaštićena od svetlosti, tokom 20 minuta da se omogući vezivanje za dostizanje ravnoteže.

[0278] Predmeti ispitivanja navedeni u Tabeli 7 su naknadno razblaženi u DMSO, zatim u testnom puferu, koji obuhvata 102-struka razblaženja i zatim su dodati u ploču za analizu u triplikatu, brzo. Ploča za analizu je zatim inkubirana u Paradigm (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) čitaču ploča za 60 minuta na 25°C.

[0279] Nakon inkubacije tokom 60 minuta, ploča je očitana korišćenjem Paradigm FP protokola (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) i sirove vrednosti polarizacije učitane su u Graphpad Prism. K¡(koji koristi model podešavanja One Site KiCurve, koncentracija probe = 25 nM, KD= 8.07 nM, sa osnovnom linijom ograničenom na prosek kontrole vezivanja od 0%) i IC50(log inhibitor vs odgovor, podešavanje krive sa 4 parametra) određeni su u Graphpad.

Rezultati

[0280] Svi predmeti ispitivanja mogli su da se takmiče sa obeleženom probom za vezivanje za humani C5 protein (Fig.3, Tabela 7). R3003 (SEQ ID NO: 4) bio je najpotentniji testirani polipeptid, sa Kivrednošću od 9.54 nM. R3023 (SEQ ID NO: 104) vezivanje nije detektovano na najvišoj ispitivanoj koncentraciji.

Tabela 7. Podaci kompetitivne fluorescentne polarizacije

[0281] Podaci prikazani u Tabeli 7 dobijeni su iz analize podešavanja krive Graphpad Prism softverom kao što je prethodno opisano. Za vrednosti triplikata izračunate su prosečne vrednosti da bi se dobile tačke podataka predstavljene u svakom eksperimentu. Od testiranih polipeptida, R3003 (SEQ ID NO: 4) je identifikovan prvobitno selekcijom mRNK prikaza. Afinitet R3003 (SEQ ID NO: 4) za C5 verifikovan je pomoću rezultata FP analize koja prikazuje malu Kikao i IC50vrednosti. Inhibitori R3011 (SEQ ID NO: 31) i R3050 (SEQ ID NO: 23) takođe su pokazali relativno snažan afinitet prema C5. Kontrolni polipeptid,

1 1

R3023 (SEQ ID NO: 104), nije pokazao afinitet prema C5, dok su inhibitori R3014 (SEQ ID NO: 55) i R3043 (SEQ ID NO: 50) pokazali slab afinitet.

Primer 14. Analiza stabilnosti jedinjenja u plazmi

[0282] Jedinjenja su ispitana za stabilnost u humanoj plazmi pod sledećim uslovima. Humana plazma je dobijena od Bioreclamation (Westbury, NY) i sakupljena u natrijum heparinu. Plazma je podešena na pH 7.4. DMSO zalihe sa 10 mM koncentracijom pripremljene su za testirana jedinjenja. Alikvoti DMSO rastvora dozirani su u 1 mL plazme, koja je prethodno zagrejana do 37°C, sa krajnjom koncentracijom testnog jedinjenja od 10 µM. Fiolice su čuvane na stolnoj ploči THERMOMIXER® (Eppendorf, Hauppauge, NY) tokom trajanja eksperimenta. Alikvoti (100 µL) su uzimani u svakoj vremenskoj tački i dodati u ploču sa 96 bunarčića koja je prethodno napunjena sa 300 µL rastvora acetonitrila koji sadrži mešavinu internih standarda (metoprolol, propranolol i varfarin svaki sa 500 ng/mL). Uzorci su čuvani na 4°C do kraja eksperimenta. Nakon uzimanja uzorka u krajnjoj vremenskoj tački, ploča je mešana i zatim centrifugirana sa 3000 o/min tokom 10 minuta. Alikvoti supernatanta su uklonjeni i analizirani pomoću LC-HRAMS. Postavke tečne hromatografije navedena su u Tabeli 8, a postavke masene spektrometrije navedene su u Tabeli 9.

Tabela 8. Postavke tečne hromatografije

1 2

Tabela 9. Postavke masene spektrometrije

[0283] Koncentracija testiranog jedinjenja R3050 (SEQ ID NO: 23) određena je poređenjem sa prethodno određenom kalibracionom krivom (Tabela 10).

Tabela 10. Profil stabilnosti

[0284] Pod ovim uslovima, R3050 (SEQ ID NO: 23) je pokazao da je visoko stabilan.

Primer 15. Polipeptidne varijante koje obuhvataju triptofanske analoge

[0285] U nekim slučajevima, polipeptidi ovog otkrivanja obuhvataju 7-azatriptofan. Da bi se odredio značaj ovog ostatka u C5 inhibiciji, analiza aminokiselinske supstitucije izvedena je gde je 7-azatriptofan zamenjen prirodnim triptofanom kao i razni drugi triptofanski analozi uključujući 5-fluorotriptofan [(5-

1

F)W], 1-metil-triptofan [(1-Me)W], D-triptofan i 5-metil-O-triptofan [(5-MeO)W]. Slični polipeptidi sa netriptofanskim supstitucijama analizirani su isto tako.

[0286] Polipeptidne varijante R3002 (SEQ ID NO: 3) i R3008 (SEQ ID NO: 9) su sintetizovane i testirane za njihovu sposobnost da inhibiraju lizu crvenih krvnih zrnaca kao što je opisano u primeru 10 (vidi Tabele 11 i 12). Od ispitanih varijanti, sve sa supstitucijom 7-azatriptofanskog ostatka pokazale su smanjenu sposobnost da inhibiraju lizu crvenih krvnih zrnaca kao što je naznačeno povećanjem prosečnih IC50vrednosti (mera polovine maksimalne inhibitorne koncentracije, vrednost korišćena da se označi količina inhibitora potrebna da se data reakcija ili proces smanji za pola).

Tabela 11.7-azatriptofanski varijantni polipeptidi R3002 (SEQ ID NO: 3) analizirani humanim ispitivanjem hemolize

Tabela 12.7-azatriptofanski varijantni polipeptidi R3008 (SEQ ID NO: 9) analizirani humanim ispitivanjem hemolize

1 4

Primer 16. Dejstvo skraćivanja polipeptida i delecije aminokiselina analizirano humanim ispitivanjem hemolize

[0287] C-terminalno skraćene polipeptidne varijante R3021 (SEQ ID NO: 11) su sintetizovane i ispitane humanim ispitivanjem hemolize opisanim u Primeru 10 za njihovu sposobnost da inhbiraju C5-zavisnu lizu crvenih krvnih zrnaca. Prosečne IC50vrednosti (mera polovine maksimalne inhibitorne koncentracije, vrednost korišćena da se naznače količine inhibitora potrebne da se data reakcija ili proces smanji za polovinu) za svaki testirani polipeptid su navedene u Tabeli 13. Skraćeni polipeptidi pokazali su smanjenu sposobnost (kao što je naznačeno povećanjem IC50vrednosti) da inhibiraju lizu crvenih krvnih zrnaca sa onim varijantama bez triptofana koje imaju najveće IC50vrednosti.

[0288] Pored toga, polipeptidne varijante R3021 (SEQ ID NO: 11) sa internim aminokiselinskim delecijama su sintetizovane i ispitane (vidi Tabelu 14) za njihovu sposobnost da inhibiraju C5-zavisnu lizu crvenih krvnih zrnaca prema postupku opisanom u Primeru 10. Pored toga, N-terminalni metionin u ovim varijantama zamenjen je acetil grupom. Prosečne IC50vrednost iza svaki testirani polipeptid navedeni su u Tabeli 14. Interesantno, zamena acetil grupe N-terminalnim metioninom samo [R3048 (SEQ ID NO: 19)] povećaja je sposobnost polipeptida da inhibira lizu crvenih krvnih zrnaca. Uklanjanje internog ostatka D [R3124 (SEQ ID NO: 130)] ili internih ostataka DVY [R3125 (SEQ ID NO: 131), koji odgovaraju ostacima 8, 9 i 10 iz R3021 (SEQ ID NO: 11)] dovela je do smanjenja sposobnosti polipeptida da inhibiraju lizu crvenih krvnih zrnaca.

1

Tabela 13. C-terminalno skraćene polipeptidne varijante R3021 (SEQ ID NO: 11) analizirane humanim ispitivanjem hemolize

Tabela 14. Polipeptidne varijante R3021 (SEQ ID NO: 11) sa internim aminokiselinskim delecijama analizirane humanim ispitivanjem hemolize

Primer 17. Inkorporacija albumin-vezujućih polipeptida

[0289] Polipeptidi su konjugovani sa jednim ili više polipeptida koji moduliraju vezivanje proteina u plazmi. Ovi polipeptidi, koji se ovde nazivaju "albumin-vezujući polipeptidi" navedeni su u Tabeli 15.

Tabela 15. Albumin-vezujući polipeptidi

1

[0290] Albumin-vezujući polipeptidi su ciklizovani obrazovanjem disulfidnih veza na cisteinskim ostacima. U nekim slučajevima, albumin-vezujući polipeptidi su konjugovani ili njihovim N ili C-terminalnim krajevima, pri čemu imaju malo drugačije strukture (npr. nema acetil grupe).

Primer 18. Inkorporacija polipeptida koji prodiru u ćeliju

[0291] Polipeptidi su konjugovani sa polipeptidom koji ima svojstva prodiranja u ćeliju. Ovi polipeptidi navedeni su u Tabeli 16 i opisani u Milletti, F., Cell-penetrating polypeptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today.2012 Aug;17(15-16):850-60.

Tabela 16. Polipeptidi koji prodiru u ćeliju

Primer 19. Analiza polipeptidnih mešavina koje obuhvataju stereoizomere aminokiselina

[0292] Polipeptidi R3136 (SEQ ID NO: 137) i R3137 (SEQ ID NO: 138) su sintetizovani prema aminokiselinskim sekvencama R3085 (SEQ ID NO: 90) i R3082 (SEQ ID NO: 116), tim redom sa izuzetkom zamene Phg u svakom sa D-Phg (vidi Tabelu 17). Kompozicija koja obuhvata ili R3136 (SEQ ID NO: 137) i R3085 (SEQ ID NO: 90) ili R3137 (SEQ ID NO: 138) i R3082 (SEQ ID NO: 116) su analizirani za njihovu sposobnost da inhibiraju lizu crvenih krvnih zrnaca prema humanom ispitivanju hemolize opisanom u Primeru 10. Kompozicija koja obuhvata R3136 (SEQ ID NO: 137) i R3085 (SEQ ID NO: 90) daje prosečnu IC50(nM) od >50000, dok kompozicija koja obuhvata R3137 (SEQ ID NO: 138) i R3082 (SEQ ID NO: 116) daje prosečnu IC50(nM) od >100000.

Tabela 17. Jedinjenja korišćena u mešavinama polipeptida stereoizomera aminokiselina

1

Primer 20. Farmakokinetička ispitivanja kod nehumanih primata

[0293] Farmakokinetička ispitivanja izvedena su kod nehumanih primata korišćenjem jedinjenja navedenih u Tabeli 18. U tabeli, "Cmpd" se odnosi na jedinjenje a "Avg" se odnosi na prosek.

Tabela 18. Jedinjenja testirano u in vivo ispitivanjima

[0294] Koncentracija polipeptida R3152 (SEQ ID NO: 153) u plazmi određena je kod cinomolgus majmuna nakon intravenske (IV) doze. Tri mužjaka životinja primila su 3 mg/kg polipeptida, a koncentracije polipeptida u plazmi određene su pomoću LC/MS-MS nakon taloženja acetonitrila i ekstrakcije na Sirocco ploči za taloženje proteina (Waters Corporation, Milford, MA.) Farmakokinetički (PK) parametri izračunati su od vremenskog toka (vidi Fig.4) kombinovanih koncentracija R3152 (SEQ ID NO: 153,) u plazmi određeni neposredno nakon doze do 48 h nakon doze. Nivoi leka u plazmi brzo su padali tokom inicijalne faze distribucije (<1 sat), a zatim su se blago smanjivali i bili su detektabilni do 48 sati. R3152 (SEQ ID NO: 153) imao je srednji terminalni poluživot od 10.9 ± 0.8 sati. Srednja brzina klirensa bila je 0.129 ± 0.0122 L/h/kg koja je približno 5% protoka krvi jetre tipičnog majmuna (2.6 L/h/kg). Srednja vrednost zapremine distribucije bila je 1.49 ± 0.152 L/kg što je približno dvostruko ukupne vode u telu za tipičnog majmuna (0.7 L/kg). Prosečna AUC∞ bila je 23319 ± 2120 h*ng/mL.

[0295] R3152 (SEQ ID NO: 153) vezuje se visokim afinitetom za C5 protein primata i blokira put komplementa sprečavanjem stvaranja C5a i C5b proizvoda i proizvodnje multimernog kompleksa koji napada membranu (MAC). Inhibicija komplement-posredovanog MAC obrazovanja u uzorcima plazme iz gornjeg PK ispitivanja ispitana je pomoću ustanovljenog ex vivo testa (vidi humano ispitivanje hemolize

1

opisano u Primeru 10), gde je plazma razblažena 1:100 i inkubirana sa aktiviranim ovčijim crvenim krvnim zrncima (Complement Technology, Tyler, TX). U svakoj vremenskoj tački, hemolitička aktivnost određena je kao indikator aktivnog serumskog komplementa (vidi Fig.4). U plazmi koja sadrži >200 ng/mL R3152 (SEQ ID NO: 153) postojala je jasna inhibicija hemolize posredovane komplementom, što ukazuje na blokadu MAC obrazovanja. Egzogeni R3152 (SEQ ID NO: 153) dodat u normalnu cinomolgus plazmu ima IC50= 2-20 ng/mL. Hemolitička aktivnost vraćena je na normalne nivoe 48 sati nakon doziranja jer su nivoi R3152 (SEQ ID NO: 153) u plazmi pali ispod 100 ng/ml.

Primer 21. Farmakokinetička ispitivanja kod pacova

[0296] R3152 (SEQ ID NO: 153) dostavljena je kao intravenska (IV) ili subkutana (SC) doza mužjacima pacova sa 2 i 30 mg/kg, tim redom. Nakon IV doziranja, R3152 (SEQ ID NO: 153) je praćen pomoću LC/MS-MS nakon taloženja acetonitrila i ekstrakcije na Sirocco ploči za taloženje proteina (Waters Corporation, Milford, MA) kao što je prethodno opisano. Farmakokinetički (PK) parametri su izračunati od vremenskog toka kombinovanih koncentracija R3152 (SEQ ID NO: 153) u plazmi i njegovog ekvipotentnog C-terminalno deamidiranog metabolita, R3201 (SEQ ID NO: 211). Rezultati prikazani su na Fig.5. Na slici, kružići predstavljaju koncentracije dobijene nakon SC doze, a kvadratići predstavljaju koncentracije dobijene nakon IV doze.

[0297] R3152 (SEQ ID NO: 153)/ R3201 (SEQ ID NO: 211) ispoljili su fazu brze distribucije, praćeno sporim uklanjanjem sa t1⁄2= 5.3 h. Slična brzina uklanjanja primećena je nakon SC doziranja od 30 mg/kg, sa približno 65% biodostupnosti doze, na osnovu AUC. Tmaxod 4 h i produženo izlaganje leku koje se vidi u SC dozi omogućila je proširenu pokrivenost terapijske koncentracije u plazmi. Kao R3152 (SEQ ID NO: 153) i R3201 (SEQ ID NO: 211) se ne vezuje za C5 pacova, veoma mala inhibitorna aktivnost primećena je u ex vivo ispitivanjima hemolize.

[0298] Lipidovana i nelipidovana jedinjenja R3183 (SEQ ID NO: 184) i R3176 (SEQ ID NO: 177), tim redom, ocenjena su za farmakokinetička svojstva kod mužjaka Sprague-Dawley pacova nakon intravenskog ili subkutanog davanja. Fig.6A i 6B prikazuju rezultate. Fig.6A prikazuje mužjake Sprague-Dawley pacova (n=3) koji su intravenski primili injekciju jedne doze od 2 mg/kg. Uzorci krvi su uzeti u naznačenim vremenskim tačkama, prerađeni u plazmu i analizirani za naznačeno jedinjenje pomoću LC-MS. Crni kružići: R3176 (SEQ ID NO: 177) (nelipidovano jedinjenje); Prazni kružići: R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 lipidovano jedinjenje). Fig.6B prikazuje mužjake Sprague-Dawley pacova (n=3) koji su subkutano primili injekciju jedne doze od 15 mg/kg. Uzorci krvi su uzeti u naznačenim vremenskim tačkama, prerađeni u plazmu i analizirani za naznačeno jedinjenje pomoću LC-MS. Crni kružići: R3176 (SEQ ID NO: 177) (nelipidovano jedinjenje); Prazni kružići: R3183 (SEQ ID NO: 184) (C16 lipidovano

1

jedinjenje). Lipidacija je dovela do povećanja izlaganja kao što je ocenjeno određivanjem površine ispod krive (AUC) sa 2.1 puta intravenskim putem i 2.7 puta subkutanim putem.

Primer 22. Inhibicija hemolize u trombinom indukovanom putu komplementa

[0299] Trombin može da indukuje aktivnost komplementa cepanjem C5 na C5Tkoji će potom biti pocepan na C5a i C5bT. C5bT, kao C5b, vezaće se za C6, a preostale terminalne komponente puta komplementa, C7, C8 i C9, dovešće do obrazovanja kompleksa koji napada membranu (MAC) izazivajući lizu crvenih krvnih zrnaca (Krisinger, et al., (2014). Blood.120(8):1717-1725). Tako, R3183 i anti-C5 monoklonalno antitelo slično EKULIZUMABU® bila su testirana za njihovu sposobnost da inhibiraju hemolizu preko trombinom indukovanog puta komplementa.

[0300] Da bi se ocenila aktivnost inhibitora, C5 (Complement Technology, Tyler, TX) dodat je da bi se postigla koncentracija od 400 nM, a uzorak je inkubiran sa C6 u krajnjoj koncentraciji od 600 nM (Complement Technology, Tyler, TX) i trombinom u koncentraciji od 50 nM (Enzyme Research Laborites, South Bend, IN) na 37°C tokom 30 minuta, u prisustvu ili R3183 ili anti-C5 monoklonalnog antitela sličnog EKULIZUMABU®, ili bez inhibitora. Reakcija je zaustavljena dodavanjem hirudina u 150 nM (Cell Sciences, Canton, MA) u puferu GVB+EDTA (Complement Technology, Tyler, TX) i inkubirana 5 minuta na sobnoj temperaturi. Ovi razblaženi uzorci umešani su sa ovčijim eritrocitima osetljivim na antitela (Complement Technology, Tyler, TX) u mikrotitarskoj ploči sa 96 bunarčića (USA Scientific, Ocala, FL) i inkubirani na 37°C tokom 5 minuta. C7 (Complement Technology, Tyler, TX) je potom dodat u bunarčiće da bi se postigla koncentracija od 15 nM, a ploča je vraćena na 37°C tokom 15 minuta. Kompleks C8 (10 nM; Complement Technology, Tyler, TX) i C9 (25 nM; Complement Technology, Tyler, TX) zatim je dodat testnu mešavinu i uzorci su inkubirani tokom 30 minuta na 37°C. Nakon inkubacije, ploča je centrifugirana pri 1000 x g i 100 µL supernatanta je preneto na novu mikrotitarsku ploču i očitana je apsorbanca na 412 nm. Dobijeni podaci prikazani su na Fig.7. Otkriveno je da R3183 inhibira hemolizu trombinom indukovanim putem komplementa u koncentracijama većim od 6 ng/mL, dok anti-C5 monoklonalno antitelo ne inhibira.

Primer 23. Analiza rezonancije površinskih plazmona R3183 vezivanja

[0301] Eksperimenti rezonancije površinskih plazmona (SPR) izvedeni su na 25°C pomoću ProteOn XPR36 sistema od BioRad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). C5 protein [ili kontrola humanim serumom albuminom (HSA)] imobilisan je direktnim kuplovanjem amina na ProteOn GLH senzorni čip kreiran za maksimalni kapacitet vezivanja korišćenjem acetatnog pufera sa pH 5. Kinetička karakterizacija R3183 vezivanja izvedena je u puferu za vezivanje koji sadrži 10 mM HEPES, pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.5 mM MgCl2, 0.15 mM CaCl2, 0.005% Tween-20 i 1% DMSO da bi se odredile kon, koffi KD. Analiza podataka

11

izvedena je pomoću BioRad ProteOn Manager softvera. Senzogrami su podešeni za model heterogenog liganda (vidi Fig.8). Koncentracije R3183 ocenjene u ovom eksperimentu bile su 3.3, 1.1, 0.37 i 0.12 µM kao što je označeno na slici.

[0302] Otkriveno je da R3183 ima ka(1/Ms) od 1.18 x 10<5>za C5, kao i kd (1/s) od 3.04 x 10<-4>i KD(M) od 2.58 x 10<-9>. Vrednosti za HSA vezivanje bile su: ka (1/Ms) od 3.01 x 10<4>, kd (1/s) od 1.76 x 10<-1>i KD(M) od 5.86 x 10<-6>.

Primer 24. Strukturna ispitivanja

[0303] Kristalografska ispitivanja izvedena su radi poređenja mesta C5 vezivanja između bliskog hemijskog analoga R3183 i EKULIZUMABA® (Alexion Pharmaceuticals, Cheshire, CT). Indukovani podešeni model otkrio je da se analog vezuje za mesto udaljeno od onog prijavljenog za EKULIZUMAB®.

Primer 25. Analiza inhibitorne aktivnosti R3183 imunotestom

[0304] C5 inhibitorna aktivnost za R3183 ocenjena je enzimskim imunotestom (EIA). Inhibicija proizvodnje C5a i kompleksa koji napada membranu (MAC) izmereni su pomoću MicroVue EIA kompleta (Quidel Corporation, San Diego, CA).

[0305] Supernatant iz ispitivanja hemolize humanih crvenih krvnih zrnaca (RBC) R3183 je razblažen 1:50 i ispitan pomoću C5a EIA (Fig.9). R3183 inhibirao je obrazovanje C5a sa IC50od 11 nM.

[0306] MAC EIA je izvedena sa R3183 na istom supernatantu, razblaženom 1:5 (vidi Fig.10). Pokazalo se da ovo jedinjenje inhibira obrazovanje MAC sa IC50od 6.9 nM. Uzorci seruma koji sadrže različite koncentracije R3183 takođe su analizirani za inhibiciju alternativnog puta aktivacije komplementa pomoću WIESLAB® kompleta za skrining sistema komplemenata (Euro Diagnostica, Malmo, Švedska). Rezultati označavaju IC50od 12.5 nM za R3183.

Primer 26. Humano ispitivanje hemolize

[0307] R3183 inhibitorna aktivnost upoređena je sa antitelom sličnom EKULIZUMABU® (mAb-C5) pomoću ispitivanja hemolize crvenih krvnih zrnaca. DNK ekspresioni faktor za inhibitor IgG monoklonalnog antitela od C5 (mAb-C5) konstruisan je od objavljene sekvence za sekvence varijabilnog teškog i lakog lanca h5G1.1, h5G1.1VHC+F i h5G1.1VLC+F, tim redom (Thomas et al.1996. Molecular Immunology.33(17-18):1389-401). Humane sekvence konstantnog lakog lanca kapa i IgG2 konstantnog teškog lanca korišćene su za konstantne regione antitela. Ovo antitelo eksprimirano je iz humanih embrionskih ćelija bubrega (HEK293) i prečišćeno afinitetnom hromatografijom proteina A. Ovčiji eritrociti osetljivi na antitela (Complement Technology, Tyler, TX) zasejani su sa 2.5 x 10<7>ćelija/bunarčić sa kompletnim humanim serumima (Complement Technology, Tyler TX) sa ili bez inhibitora da bi se odredilo inhibitorno dejstvo jedinjenja na lizu crvenih krvnih zrnaca. Ćelije su centrifugirane su tokom 3 minuta pri 2090 x gravitacija i resuspendovane u svežem GVB++ puferu (Complement Technology, Tyler TX). Humani serumi brzo su odmrznuti na 37°C i zatim čuvani na ledu do razblaženja u GVB++. Deset 6-strukih serijskih razblaženja svakog jedinjenja (10mM zaliha, DMSO) izvedeno je u DMSO i zatim dodato u puferu.50 µl svakog razblaženja jedinjenja je kombinovano sa serumima i 100 µl ćelija u pojedinačnim bunarčićima prozirne mikrotitarske ploče sa 96 bunarčića tretirane kulturom tkiva (USA Scientific, Ocala, FL) i resuspendovano pipetiranjem. Uzorci su inkubirani na 37°C tokom jednog sata. Nakon inkubacije, ploče su centrifugirane sa 2090 x gravitacija tokom 2 minuta.100 µl supernatanta preneto je na novu ploču i apsorbanca je očitana na 412 nm. Podaci su usklađeni sa log-logit formulom koja daje krivu dozaodgovor i IC50(vidi Fig.11A). IC50za R3183 je bila 8.1 nM u poređenju sa 0.2 nM za mAb-C5.

Interesantno, molekulska masa za R3183 je 2 kDa, dok molekulska masa za mAb-C5 iznosi 140 kDa, što ukazuje da je mnogo manja ukupna količina potrebna za terapeutske primene.

[0308] Slična ispitivanja pokazala su da je R3183 takođe aktivan u serumu iz cinomolgus majmuna i svinja, ali je mnogo manje aktivan u serumu glodara i pasa. Kada je 1% humani serum upoređen sa 1% serumom cinomolgus majmuna u testu, R3183 je imao IC50od 1.9 nM i IC90od 5.2 nM sa humanim serumom u odnosu na IC50od 4.2 nM i IC90od 13.2 nM sa serumom cinomolgus majmuna (vidi Fig.11B).

Primer 27. Farmakodinamička i farmakokinetička ispitivanja

[0309] Ispitivanja su izvedena kod nehumanih primata da bi se odredila doza i režim R3183 potreban da se postigne neprekidna inhibicija komplementa, kao i da bi se odredio farmakokinetički profil R3183 tokom perioda davanja i tokom vremena nakon davanja krajnje doze. Grupa sa malom dozom (doza A) koju su činila tri mužjaka primila je 0.3 mg/kg R3183 svakodnevno tokom sedam dana i praćeni su 10 dana nakon toga. Druga, grupa sa visokom dozom koju su činila tri mužjaka primila je jednu malu dozu (doza A; 0.3 mg/kg) R3183 na dan 1 i primala je veće dnevne doze (doza B; 3.0 mg/kg) R3183 tokom 6 dana nakon toga. Ova grupa je takođe praćena tokom 10 dana nakon primanja poslednje doze. Uzorci plazme dobijeni su pre svake doze, neposredno nakon doze i dvaput nakon toga svakog dana do završetka svakodnevnog doziranja. Uzorci su uzimani periodično nakon toga tokom 10 dana.

Koncentracije R3183 su određene u svakom uzorku plazme pomoću LC/MS-MS nakon taloženja acetonitrila i ekstrakcije na Sirocco pločama za taloženje proteina (Waters Corporation, Milford, MA).

[0310] R3183 vezuje se sa visokim afinitetom za C5 protein primata i blokira put komplementa sprečavanjem stvaranja C5a i C5b proizvoda i proizvodnje multimernog kompleksa koji napada membranu (MAC). Inhibicija komplement-posredovanog MAC obrazovanja u istim uzorcima plazme ispitana je pomoću ustanovljenog ex vivo testa u kom je plazma razblažen 1:100 i inkubirana sa aktiviranim ovčijim crvenim krvnim zrncima (Complement Technology, Tyler, TX). U svakoj vremenskoj tački, hemolitička aktivnost određena je kao indikator aktivnog serumskog komplementa (vidi Fig.12A i 12B). U grupi sa malom dozom, 90% inhibicija je primećena sa nekim R3183 koncentracijama u plazmi između 2000 i 4000 ng/ml, sa više od 90% inhibicije sa najvećim koncentracijama iznad 4000 ng/ml (Fig. 12A). R3183 inhibicija hemolitičke aktivnosti detektovana je do 10 dana nakon poslednjih tretiranja. Kombinovani grafički prikaz podataka grupa sa malom i velikom dozom prikazan je na Fig.13.

Primer 28. Inhibicija lize dodavanjem terminalnih komponenti

[0311] C5 je inkubiran sa C6 i trombinom na 37°C tokom 30 minuta sa i bez R3183. Reakcija je zaustavljena dodavanjem hirudina. Razblaženi uzorci su umešani sa ovčijim eritrocitima osetljivim na antitela i zatim inkubirani tokom 5 minuta na 37°C. Prečišćen C7 je dodat i inkubiran tokom 15 minuta na 37°C. Kompleks prečišćenih C8 i C9 je zatim dodat i mešavina je inkubirana tokom 30 minuta na 37°C. Ploča je centrifugirana i supernatant prenet i očitana na 412 nm. Rezultati pokazuju snažnu inhibiciju u prisustvu R3183 (vidi Fig.14).

Primer 29. Analiza hemolize u uzorcima PNH pacijenta

[0312] Aktivacija i inhibicija alternativnog puta komplementa u ćelijama krvi dobijenim od pacijenata sa paroksizmalnom noćnom hemoglobinurijom (PNH) praćena je u prisustvu ili odsustvu inhibitora komplementa protočnom citometrijom kao što je opisano u Risitano et al., 2012. Blood.119(6): 6307-16. Aktivacija komplementa može da se poveća kada je serum zakiseljen. Ovde su crvena krvna zrnca od pacijenata sa PNH inkubirana u serumu u prisustvu ili odsustvu R3144 (SEQ ID NO: 145) ili EKULIZUMABA®. Toplotom inaktiviran serum korišćen je kao negativna kontrola (tj., nije došlo do lize crvenih krvnih zrnaca). pH u uzorcima je spušten dodavanjem hlorovodonične kiseline (1:20 razblaženje 0.1 N HCl) da bi se inicirala aktivacija komplementa. Uzorci su inkubirani tokom 24 sata na 37°C pre analize. Crvena krvna zrnca su peletirana, i 1 µl je resuspendovano u 1 ml fiziološkog rastvora. Uzorci su zatim inkubirani sa anti-CD59 antitelima sa fikoeritrinskim oznakama kao i anti-C3 antitela obeležena fluorescein izotiocijanatom (FITC) tokom 1 sata pre analize sortiranja ćelija povezanog sa fluorescencijom (FACS). Rezultati su ukazivali na slične nivoe inhibicije iznad nivoa osnovne linije i za R3144 i za EKULIZUMAB®.

11

11

11

11

11

11

12

12

12

12

12

12

12

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

14

14

14

14

14

14

14

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

1

11

12

1

14

1

1

1

1

1

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

21

21

21

21

21

21

21

22

22

22

22

22

22

22

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

24

24

24

24

24

24

24

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

2

21

22

2

24

2

2

2

2

2

1

2

4

Claims (10)

1. Patentni zahtevi 1. Polipeptid koji se sastoji od SEQ ID NO: 194 ili SEQ ID NO: 184 za upotrebu u postupku lečenja poremećaja povezanog sa C5-komplementom, pri čemu postupak obuhvata davanje polipeptida u dozi od oko 0.1 mg/kg do oko 10 mg/kg, pri čemu je hemoliza kod subjekta smanjena za najmanje 50% u odnosu na prethodno primećene nivoe hemolize kod pomenutog subjekta.
2. 2. Polipeptid za upotrebu prema zahtevu 1, pri čemu se pomenuti polipeptid daje pomenutom subjektu u dozi od oko 0.3 mg/kg do oko 3 mg/kg.
3. 3. Polipeptid za upotrebu prema zahtevu 2, pri čemu se pomenuti polipeptid daje pomenutom subjektu u dozi od oko 0.3 mg/kg.
4. 4. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-3, pri čemu se pomenuto davanje izvodi svakodnevno.
5. 5. Polipeptid za upotrebu prema zahtevu 4, pri čemu se pomenuto davanje izvodi tokom sedam dana.
6. 6. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-5, pri čemu poremećaj povezan sa C5-komplementom predstavlja paroksizmalnu noćnu hemoglobinuriju.
7. 7. Polipeptid za upotrebu prema zahtevu 6, pri čemu je pomenuti subjekat prethodno lečen EKULIZUMABOM.
8. 8. Polipeptid za upotrebu prema zahtevu 6, pri čemu se pomenuti subjekat takođe leči EKULIZUMABOM.
9. 9. Polipeptid za upotrebu prema zahtevu 7 ili 8, pri čemu je lečenje EKULIZUMABOM neefikasno.
10. 10. Polipeptid za upotrebu prema bilo kom od zahteva 1-9, pri čemu je hemoliza kod subjekta smanjena za najmanje 90% u odnosu na prethodno primećene nivoe hemolize kod pomenutog subjekta.