ES2900998T3 - Moduladores de la actividad del complemento - Google Patents

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ES2900998T3 ES16744125T ES16744125T ES2900998T3 ES 2900998 T3 ES2900998 T3 ES 2900998T3 ES 16744125 T ES16744125 T ES 16744125T ES 16744125 T ES16744125 T ES 16744125T ES 2900998 T3 ES2900998 T3 ES 2900998T3
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Ketki Dhamnaskar
Daniel Elbaum
Kristopher Josephson
Kelley Larson
Zhong Ma
Nathan Nims
Alonso Ricardo
Kathleen Seyb
Guo-Qing Tang
Douglas Treco
Zhaolin Wang
Ping Ye
Hong Zheng
Sarah Perlmutter
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Abstract

Polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 194 o SEQ ID NO: 184 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno relacionado con el complemento C5, comprendiendo el método administrar el polipéptido a una dosis de desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, en el que la hemólisis en el sujeto se reduce en al menos el 50% en relación con los niveles de hemólisis previamente observados en dicho sujeto.

Description

DESCRIPCIÓN
Moduladores de la actividad del complemento
Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
Esta solicitud reivindica prioridad a la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/108.772 presentada el 28 de enero de 2015, titulada Modulación de la actividad del complemento, la publicación internacional n.° PCT/US2015/035473 presentada el 12 de junio de 2015, titulada Modulación de la actividad del complemento, y la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/185.298 presentada el 26 de junio de 2015, titulada Modulación de la actividad del complemento.
Lista de secuencias
La presente solicitud contiene una lista de secuencias que se ha presentado electrónicamente en formato ASCII. Dicha copia ASCII, creada el 28 de enero de 2016, se llama 2011-1007PCT SL.txt y pesa 125.781 bytes.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a compuestos, incluyendo polipéptidos, que son útiles como moduladores de la actividad del complemento y a su uso como productos terapéuticos.
Antecedentes de la invención
La respuesta inmunitaria de vertebrados está compuesta por componentes inmunitarios adaptativo e innato. Mientras que la respuesta inmunitaria adaptativa es selectiva para patógenos particulares y es de respuesta lenta, los componentes de la respuesta inmunitaria innata reconocen una amplia gama de patógenos y responden rápidamente tras la infección. Un componente de este tipo de la respuesta inmunitaria innata es el sistema del complemento.
El sistema del complemento incluye aproximadamente 20 proteínas circulantes, sintetizadas principalmente por el hígado. Los componentes de esta respuesta inmunitaria particular se denominaron en primer lugar “complemento” debido a la observación de que complementaban a la respuesta de anticuerpos en la destrucción de bacterias. Estas proteínas permanecen en forma inactiva antes de la activación en respuesta a infección. La activación se produce mediante una ruta de escisión proteolítica iniciada mediante reconocimiento de patógenos y que conduce a la destrucción de patógenos. Se conocen tres de tales rutas en el sistema del complemento y se denominan ruta clásica, ruta de lectina y ruta alternativa. La ruta clásica se activa cuando se une una molécula de IgG o IgM a la superficie de un patógeno. La ruta de lectina se inicia mediante la proteína lectina de unión a manano que reconoce los residuos de azúcar de una pared de célula bacteriana. La ruta alternativa permanece activa a niveles bajos en ausencia de cualquier estímulo específico. Aunque las tres rutas difieren con respecto a los acontecimientos de inicio, las tres rutas convergen con la escisión de componente C3 del complemento. C3 se escinde para dar dos productos denominados C3a y C3b. De estos, C3b se une de manera covalente a la superficie de patógeno mientras que C3a actúa como señal difusible para fomentar la inflamación y reclutar células inmunitarias circulantes. C3b asociado a la superficie forma un complejo con otros componentes para iniciar una cascada de reacciones entre los componentes posteriores del sistema del complemento. Debido al requisito de la unión a superficie, la actividad del complemento permanece localizada y minimiza la destrucción de células no diana.
C3b asociado a patógeno facilita la destrucción de patógeno de dos maneras. En una ruta, C3b se reconoce directamente por células fagocíticas y conduce al atrapamiento del patógeno. En la segunda ruta, C3b asociado a patógeno inicia la formación del complejo de ataque a membrana (MAC). En la primera etapa, C3b se compleja con otros componentes del complemento para formar el complejo C5-convertasa. Dependiendo de la ruta de activación del complemento inicial, los componentes de este complejo pueden diferir. C5-convertasa formada como resultado de la ruta del complemento clásica comprende C4b y C2a además de C3b. Cuando se forma mediante la ruta alternativa, C5-convertasa comprende dos subunidades de C3b así como un componente de Bb.
El componente C5 del complemento se escinde mediante cualquier complejo C5-convertasa para dar C5a y C5b. C5a, al igual que C3a, difunde a la circulación y fomenta la inflamación, actuando como agente quimiotáctico para células inflamatorias. C5b permanece unido a la superficie celular en la que desencadena la formación del MAC mediante interacciones con C6, C7, C8 y C9. El MAC es un poro hidrófilo que abarca la membrana y fomenta el flujo libre de fluido al interior y al exterior de la célula, destruyéndola de ese modo.
Un componente importante de toda la actividad inmunitaria es la capacidad del sistema inmunitario para distinguir entre células propias y no propias. La patología surge cuando el sistema inmunitario es incapaz de realizar esta distinción. En el caso del sistema del complemento, las células de vertebrados expresan proteínas que las protegen frente a los efectos de la cascada del complemento. Esto garantiza que dianas del sistema del complemento se limitan a células patógenas. Muchos trastornos y enfermedades relacionados con el complemento están asociados con la destrucción anómala de células propias por la cascada del complemento. En un ejemplo, sujetos que padecen hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) son incapaces de sintetizar versiones funcionales de las proteínas reguladoras del complemento CD55 y CD59 en células madre hematopoyéticas. Esto da como resultado hemólisis mediada por el complemento y una variedad de complicaciones posteriores. Otros trastornos y enfermedades relacionados con el complemento incluyen, pero no se limitan a, enfermedades y trastornos autoinmunitarios, enfermedades y trastornos neurológicos, enfermedades y trastornos de la sangre y enfermedades y trastornos infecciosos. Evidencias experimentales sugieren que muchos trastornos relacionados con el complemento se alivian mediante inhibición de la actividad del complemento. Por tanto, existe una necesidad del desarrollo de compuestos y métodos para bloquear de manera selectiva la destrucción celular mediada por el complemento y para tratar indicaciones relacionadas. La presente invención satisface esta necesidad al proporcionar los polipéptidos descritos en el presente documento y métodos relacionados para su uso.
El documento WO 2013/126006 A1 se refiere a polipéptidos que se unen a C5 humano y al uso de tales polipéptidos en terapia.
Hillmen (2006); NEJM 355(12):1233-1243 y Legendre (2013); NEJM 368(23):2169-2181 comentan el uso de Eculizumab para tratar PNH y HUS.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 194 o SEQ ID NO: 184 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno relacionado con el complemento C5, comprendiendo el método administrar el polipéptido a una dosis de desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, en el que la hemólisis en el sujeto se reduce en al menos el 50% en relación con los niveles de hemólisis previamente observados en dicho sujeto.
En las reivindicaciones se proporcionan otros aspectos de la invención.
Descripción de las figuras
La figura 1 es un gráfico de líneas que presenta los resultados de un inmunoensayo enzimático (EIA) para la detección de C5a en sobrenadante a partir de un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos (RBC) humanos con concentraciones crecientes de inhibidores r 3002 (SEQ ID NO: 3) y R3008 (SEQ ID NO: 9). Los niveles de C5a se correlacionan con la actividad del complemento y por tanto son un indicador de la capacidad de los compuestos sometidos a prueba para inhibir la actividad del complemento. Se diluyó 1:50 sobrenadante a partir del ensayo de hemólisis y se sometió a ensayo para determinar los niveles de C5a. Los niveles de C5a disminuyeron en muestras de sobrenadante de ensayo de hemólisis en humanos con niveles crecientes de cualquier inhibidor sometido a ensayo. R3002 (SEQ ID NO: 3) tenía una CI50 de 5,4 nM mientras que R3008 (SEQ ID NO: 9) tenía una CI50 de 54,5 nM. Tal como se usa en el presente documento, el término “CI50” se refiere a la concentración inhibidora semimáxima, un valor usado para indicar la cantidad del inhibidor necesaria para reducir una reacción o proceso dado en la mitad.
La figura 2 es un gráfico de líneas que presenta los resultados de un EIA para la detección del complejo de ataque a membrana (MAC) en sobrenadante a partir de un ensayo de hemólisis de RBC humanos con concentraciones crecientes de R3008 (SEQ ID NO: 9). Los niveles del MAC se correlacionan con la actividad del complemento y por tanto son un indicador de la capacidad de R3008 (SEQ ID NO: 9) para inhibir la actividad del complemento. Se diluyó 1:5 sobrenadante a partir del ensayo de hemólisis y se sometió a ensayo para determinar los niveles de MAC. Los niveles de MAC disminuyeron en muestras de sobrenadante de ensayo de hemólisis con niveles crecientes del inhibidor sometido a ensayo con una CI50 de 33 nM.
La figura 3 es un gráfico de líneas que presenta datos de polarización de fluorescencia (FP) de competencia para artículos de prueba R3003 (SEQ ID NO: 4), R3011 (SEQ ID NO: 31), R3014 (SEQ ID NO: 55), R3023 (SEQ ID NO: 104), R3043 (SEQ ID NO: 50) y R3050 (SEQ ID NO: 23). FP permite medir acontecimientos de unión en una disolución homogénea. Se llevó a cabo un ensayo de unión de competencia en el que se combinó una disolución 25 nM de compuesto R3076 (SEQ ID NO: 40), que tiene una etiqueta fluorescente, con cantidades crecientes de los artículos de prueba y se midió para detectar cambios en la FP (en unidades de mili-polarización; mP). Los niveles de mP decrecientes se correlacionan con competición satisfactoria para C5 por los artículos de prueba. Se muestran los promedios de dos experimentos independientes realizados por triplicado (+/- desviación estándar). De los artículos sometidos a prueba, R3003 (SEQ ID No : 4) fue el más potente mientras que R3023 (SEQ ID NO: 104), un polipéptido de control, no mostró ninguna actividad a la concentración más alta sometida a prueba.
La figura 4 es un gráfico de líneas que muestra resultados de un estudio en macaco cangrejero. Se muestran cambios en la concentración en plasma de R3152 (SEQ ID NO: 153) (círculos) tras una única dosis i.v. de 3 mg/kg en macaco cangrejero. También se muestran cambios en la actividad hemolítica (cuadrados) en los mismos puntos de tiempo.
La figura 5 es un gráfico de líneas que muestra resultados de la monitorización de compuestos en plasma tras la administración intravenosa (i.v.; cuadrados) o subcutánea (s.c.; círculos) de 2 mg/kg de R3152 (SEQ ID NO: 153) en ratas Sprague-Dawley macho. La monitorización comprendía la determinación de concentraciones en plasma combinadas de R3152 (SEQ ID NO: 153) así como su metabolito desaminado en el extremo C-terminal equipotente, R3201 (SEQ ID NO: 211).
Las figuras 6A y 6B son gráficos de líneas que representan la farmacocinética de compuestos de la presente divulgación en ratas. A ratas Sprague-Dawley macho (n=3) se les inyectó por vía intravenosa una única dosis de 2 mg/kg. Se extrajeron muestras de sangre en puntos de tiempo indicados, se procesaron para dar plasma y se analizaron para detectar el compuesto indicado mediante CL-EM (figura 6A). Los círculos negros indican resultados
con R3176 (SEQ ID NO: 177) (compuesto no lipidado) y los círculos blancos indican resultados con R3183 (SEQ ID
NO: 184) (compuesto lipidado en C16). A ratas Sprague-Dawley macho (n=3) también se les inyectó por vía subcutánea una única dosis de 15 mg/kg. Se extrajeron muestras de sangre en puntos de tiempo indicados, se procesaron para dar plasma y se analizaron para detectar el compuesto indicado mediante CL-EM (figura 6B). Los círculos negros indican resultados con R3176 (SEQ ID NO: 177) (compuesto no lipidado) y los círculos blancos indican resultados con R3183 (SEQ ID NO: 184) (compuesto lipidado en C16).
La figura 7 es un diagrama de dispersión que presenta los efectos de R3183 (SEQ ID NO: 184) (compuesto lipidado
en C16) o un anticuerpo monoclonal anti-C5 similar a ECULIZUMAB® sobre la inhibición de hemólisis mediante la ruta
del complemento inducida por trombina.
La figura 8 es un gráfico de líneas que muestra resultados del análisis por resonancia de plasmón superficial de la
unión de C5 por R3183 (SEQ ID NO: 184).
La figura 9 es un gráfico de líneas que muestra resultados de un inmunoensayo de C5a con sobrenadante de ensayo
de hemólisis de glóbulos rojos humanos.
La figura 10 es un gráfico de líneas que muestra resultados de un inmunoensayo de formación de complejo de ataque
a membrana (MAC) en sobrenadante a partir de un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos humanos.
Las figuras 11A y 11B son gráficos de líneas que muestran resultados de ensayos de hemólisis en seres humanos.
La figura 11A es un gráfico de líneas que compara la inhibición entre ECULIZUMAB® y R3183 (SEQ ID NO: 184). La
figura 11B es un gráfico de líneas que presenta resultados de un ensayo de hemólisis con R3183 (SEQ ID NO: 184) en presencia de suero humano o de primate no humano.
Las figuras 12A y B son gráficos de líneas que muestran resultados de la administración de compuesto en modelos animales. La figura 12A es un gráfico de líneas que muestra resultados de la administración de R3183 en un modelo animal. La figura 12B es un gráfico de líneas que muestra resultados de la administración de R3183 en un modelo animal.
La figura 13 es un diagrama de dispersión que muestra datos combinados de estudios farmacocinéticos y farmacodinámicos.
La figura 14 es un gráfico de barras que muestra resultados de un ensayo de hemólisis.
Descripción detallada
La información técnica expuesta a continuación, en algunos aspectos, puede ir más allá del alcance de la invención, que se define exclusivamente por las reivindicaciones adjuntas. La información técnica adicional se proporciona para
situar la presente invención en un contexto técnico más amplio y para ilustrar posibles desarrollos técnicos relacionados. Tal información técnica adicional, que no se encuentra dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas, no forma parte de la invención.
La presente divulgación se refiere al descubrimiento de compuestos moduladores de C5 novedosos y a métodos para
su uso. Tales compuestos pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos (por ejemplo polipéptidos cíclicos, compuestos peptidomiméticos y compuestos peptidomiméticos cíclicos), moléculas pequeñas, anticuerpos, fragmentos de anticuerpo y aptámeros. En algunos casos, los compuestos moduladores de C5 son polipéptidos útiles
en el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades en las que es deseable la inhibición de activación del complemento.
En algunos casos, los polipéptidos de la divulgación se unen específicamente al componente C5 del complemento.
En casos adicionales, los polipéptidos de la divulgación reducen la lisis celular mediada por el complemento (por ejemplo, hemólisis de glóbulos rojos) previniendo la escisión de C5 para dar fragmentos C5a y C5b.
Definiciones
Sistema biológico: tal como se usa en el presente documento, el término “sistema biológico” se refiere a una célula, a
un grupo de células, a un tejido, a un órgano, a un grupo de órganos, a un orgánulo, a una ruta de señalización biológica (por ejemplo, una ruta de señalización activada por receptor, una ruta de señalización activada por carga, una ruta metabólica, una ruta de señalización celular, etc.), a un grupo de proteínas, a un grupo de ácidos nucleicos
o a un grupo de moléculas (incluyendo, pero sin limitarse a, biomoléculas) que llevan a cabo al menos una función biológica o tarea biológica dentro de membranas celulares, compartimentos celulares, células, cultivos celulares, tejidos, órganos, sistemas orgánicos, organismos, organismos multicelulares o cualquier entidad biológica. En algunos casos, los sistemas biológicos son rutas de señalización celular que comprenden biomoléculas de señalización intracelular y/o extracelular. En algunos casos, los sistemas biológicos comprenden cascadas proteolíticas (por ejemplo, la cascada del complemento).
Sistema de control: tal como se usa en el presente documento, el término “sistema de control” se refiere a un sistema biológico que está sin tratar y se usa para comparación con un sistema biológico que se trata o se ha tratado o manipulado de otro modo.
Acontecimiento posterior: tal como se usa en el presente documento, el término “posterior” o “acontecimiento posterior” se refiere a cualquier acontecimiento que se produce después y como resultado de otro acontecimiento. En algunos casos, los acontecimientos posteriores son acontecimientos que se producen después y como resultado de la escisión de C5 y/o la activación del complemento. Tales acontecimientos pueden incluir, pero no se limitan a, generación de productos de escisión de C5, activación de MAC, hemólisis y enfermedad relacionada con hemólisis (por ejemplo, PNH).
Muestra: tal como se usa en el presente documento, el término “muestra” se refiere a una alícuota o porción tomada a partir de una fuente y/o proporcionada para su análisis o procesamiento. En algunos casos, una muestra es a partir de una fuente biológica tal como un tejido, una célula o una parte de componente (por ejemplo, un líquido corporal, incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, moco, líquido linfático, líquido sinovial, líquido cefalorraquídeo, saliva, líquido amniótico, sangre de cordón amniótico, orina, líquido vaginal y semen). En algunos casos, una muestra puede ser o comprender un homogeneizado, lisado o extracto preparado a partir de un organismo completo o de un subconjunto de sus tejidos, células o partes de componente, o una fracción o porción de los mismos, incluyendo, pero sin limitarse a, por ejemplo, plasma, suero, líquido cefalorraquídeo, líquido linfático, las secciones externas de la piel, los aparatos respiratorio, intestinal y genitourinario, lágrimas, saliva, leche, células sanguíneas, tumores, órganos. En algunos casos, una muestra es o comprende un medio, tal como un gel o caldo de nutrientes, que puede contener componentes celulares, tales como proteínas o moléculas de ácido nucleico. En algunos casos, una muestra “primaria” es una alícuota de la fuente. En algunos casos, una muestra primaria se somete a una o más etapas de procesamiento (por ejemplo, separación, purificación, etc.) para preparar una muestra para su análisis u otro uso.
Sujeto: tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” se refiere a cualquier organismo al que puede administrarse un compuesto según la divulgación, por ejemplo, para propósitos de experimentación, diagnóstico, profilácticos y/o terapéuticos. Los sujetos típicos incluyen animales (por ejemplo, mamíferos tales como ratones, ratas, conejos, sujetos porcinos, primates no humanos y humanos).
I. Compuestos y composiciones
En algunos casos, la presente divulgación proporciona compuestos y composiciones para la modulación de la actividad del complemento. En algunos casos, los compuestos incluyen compuestos moduladores de C5. Tales compuestos pueden incluir, pero no se limitan a, polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos cíclicos, compuestos peptidomiméticos y compuestos peptidomiméticos cíclicos). Tal como se usa en el presente documento, un “compuesto mimético” se refiere a una molécula que muestra algunas de las propiedades o características de otra molécula. Un “compuesto peptidomimético” o “compuesto mimético de polipéptido” es un compuesto mimético en el que la molécula contiene elementos estructurales que no se encuentran en polipéptidos naturales (es decir, polipéptidos compuestos únicamente por los 20 aminoácidos proteinogénicos). En algunos casos, los compuestos peptidomiméticos son capaces de resumir o imitar la(s) acción/acciones biológica(s) de un péptido natural. Un compuesto peptidomimético puede diferir de muchas maneras con respecto a polipéptidos naturales, incluyendo, pero sin limitarse a, cambios en la estructura principal y la presencia de aminoácidos que no se producen en la naturaleza. En algunos casos, los compuestos peptidomiméticos pueden incluir aminoácidos con cadenas laterales que no se encuentran entre los 20 aminoácidos proteinogénicos conocidos, restos de puente no basados en polipéptido usados para realizar la ciclación entre los extremos o porciones internas de la molécula, sustituciones del resto de hidrógeno de enlace amida por grupos metilo (N-metilación) u otros grupos alquilo, sustitución de un enlace peptídico por un grupo o enlace químico que es resistente a tratamientos químicos o enzimáticos, modificaciones en los extremos N y C-terminales, y conjugación con una extensión no peptídica (tal como polietilenglicol, lípidos, hidratos de carbono, nucleósidos, nucleótidos, bases de nucleósidos, diversas moléculas pequeñas, o grupos fosfato o sulfato).
Algunos polipéptidos de la invención pueden ser cíclicos. Los polipéptidos cíclicos incluyen cualquier polipéptido que tiene como parte de su estructura una o más características cíclicas tales como un bucle, resto de puente y/o una unión interna. Tal como se usa en el presente documento, el término “resto de puente” se refiere a uno o más componentes de un puente formado entre dos aminoácidos adyacentes o no adyacentes, aminoácidos no naturales o compuestos distintos de aminoácidos en un polipéptido. Los restos de puente pueden ser de cualquier tamaño o composición. En algunas realizaciones, los restos de puente pueden comprender uno o más enlaces químicos entre dos aminoácidos adyacentes o no adyacentes, aminoácidos no naturales, residuos distintos de aminoácido o combinaciones de los mismos. En algunas realizaciones, tales enlaces químicos pueden ser entre uno o más grupos funcionales en aminoácidos adyacentes o no adyacentes, aminoácidos no naturales, residuos distintos de aminoácido o combinaciones de los mismos. Los restos de puente pueden comprender una o más características incluyendo, pero sin limitarse a, un enlace amida (lactama), enlace disulfuro, enlace tioéter, anillo aromático, anillo de triazol y cadena de hidrocarburo. En algunas realizaciones, los restos de puente comprenden un enlace amida entre una funcionalidad amina y una funcionalidad carboxilato, cada una presente en una cadena lateral de aminoácido, aminoácido no natural o residuo distinto de aminoácido. En algunas realizaciones, las funcionalidades amina o carboxilato forman parte de un residuo distinto de aminoácido o residuo de aminoácido no natural. En algunos casos, los restos de puente pueden comprender enlaces formados entre residuos que pueden incluir, pero no se limitan a, ácido (S)-2-amino-5-azidopentanoico (también denominado en el presente documento “X02”), ácido (S)-2-aminohept-6-enoico (también denominado en el presente documento “X30”), ácido (S)-2-aminopent-4-inoico (también denominado en el presente documento “X31”) y ácido (S)-2-aminopent-4-enoico (también denominado en el presente documento “X12”). Los restos de puente pueden formarse mediante reacciones de ciclación usando metatésis de olefinas. En algunos casos, tales restos de puente pueden formarse entre residuos de X12 y X30. En algunas realizaciones, el resto de puente comprende un enlace disulfuro formado entre dos residuos que contienen tiol. En algunas realizaciones, el resto de puente comprende uno o más enlaces tioéter. Tales enlaces tioéter pueden incluir los encontrados en compuestos de ciclo-tioalquilo. Estos enlaces se forman durante una reacción de ciclación química entre grupos modificados en el extremo N-terminal con ácido cloroacético (también denominado en el presente documento “X35”) y residuos de cisteína. En algunos casos, los restos de puente comprenden uno o más anillos de triazol. Tales anillos de triazol pueden incluir, pero no se limitan a, los formados mediante reacción de ciclación entre X02 y X31. En algunos casos, los restos de puente comprenden restos no basados en proteína o no basados en polipéptido, incluyendo, pero sin limitarse a, anillos cíclicos (incluyendo, pero sin limitarse a, estructuras de anillo aromático (por ejemplo xililos)). Tales restos de puente pueden introducirse mediante reacción con reactivos que contienen múltiples haluros reactivos, incluyendo, pero sin limitarse a, poli(bromometil)bencenos, poli(bromometil)piridinas, poli(bromometil)alquilbencenos y/o (E)-1,4-dibromobut-2-eno. En algunos casos, los restos de puente incluyen, pero no se limitan a, las siguientes estructuras:
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en las que cada X es independientemente N o CH, de tal manera que ningún anillo contiene más de 2 N; cada Z está independientemente ausente o se selecciona de un enlace, NR, O, S, CH2, C(O)NR, NRC(O), S(O)vNR y NRS(O)v; cada m se selecciona independientemente de 0, 1,2 y 3; cada v se selecciona independientemente de 1 y 2; cada R se selecciona independientemente de H y C1-C6 ; y cada resto de puente está conectado al polipéptido mediante un enlace o espaciador C1-C6 independientemente seleccionado.
En determinados casos, los polipéptidos se vuelven macrocíclicos mediante formación de enlaces covalentes entre átomos presentes dentro del polipéptido lineal y átomos de un resto de puente. Este resto de puente sirve para el propósito de anclar químicamente dos sitios reactivos en el polipéptido lineal para proporcionar un producto de polipéptido cíclico. La presente divulgación incluye polipéptidos ciclados de la manera anteriormente mencionada y que comprenden un resto de puente que contiene un anillo aromático de 6 miembros. En estos casos, los átomos del polipéptido lineal que forman enlaces químicos explícitos con el resto de puente pueden ser heteroátomos (incluyendo, pero sin limitarse a, nitrógeno, oxígeno y azufre), o átomos de carbono saturados o insaturados. En cada caso, los átomos de la cadena lateral del polipéptido pueden unirse directamente a un átomo de carbono dentro del anillo aromático del resto de puente. En formas alternativas, los átomos de la cadena lateral del polipéptido pueden unirse a un grupo -CH2- saturado que a su vez se une directamente a un átomo de carbono dentro del anillo aromático del resto de puente. En determinados casos, el anillo aromático de 6 miembros dentro del resto de puente es benceno, tal como en las siguientes estructuras en las que Z puede seleccionarse de NH, S, O y (CH)2 :
Figure imgf000007_0001
En formas alternativas del anillo aromático de 6 miembros que comprende el resto de puente es heterocíclico y contiene uno o más átomos de nitrógeno. En estos casos, el heterociclo aromático puede ser piridina, que contiene un único átomo de nitrógeno en el anillo aromático [por ejemplo cualquiera de las siguientes estructuras en las que Z puede seleccionarse de NH, S, O y (CH)2]:
Figure imgf000007_0002
Figure imgf000008_0001
Heterociclos aromáticos pueden ser alternativamente piridazina, que contiene dos átomos de nitrógeno adyacentes en una orientación 1,2 dentro del anillo aromático [por ejemplo cualquiera de las siguientes estructuras en las que Z puede seleccionarse de NH, S, O y (CH)2]:
Figure imgf000008_0002
En otros casos, el heterociclo aromático puede ser pirimidina, que contiene dos átomos de nitrógeno en una orientación 1,3 dentro del anillo aromático [por ejemplo cualquiera de las siguientes estructuras en las que Z puede seleccionarse de NH, S, O y (CH)J:
Figure imgf000008_0003
Z == NH, $, O, CH,
Alternativamente, el heterociclo aromático puede ser pirazina, que contiene dos átomos de nitrógeno en una orientación 1,4 dentro del anillo aromático [por ejemplo cualquiera de las siguientes estructuras en las que Z puede seleccionarse de NH, S, O y (CH)2]:
Figure imgf000009_0001
Z * MH. Sf O, CH...
En formas alternativas, los polipéptidos se vuelven macrocíclicos como resultado de la formación de enlaces covalentes entre átomos del polipéptido lineal y átomos de un resto de puente que consiste en un anillo heterocíclico, aromático, de 5 miembros. En estos casos, los átomos del polipéptido lineal que forman enlaces químicos explícitos con el resto de puente pueden ser heteroátomos (incluyendo, pero sin limitarse a, nitrógeno, oxígeno y azufre), o átomos de carbono saturados o insaturados. En cada caso, los átomos de la cadena lateral del polipéptido pueden unirse directamente a un átomo de carbono o átomo de nitrógeno dentro del anillo aromático del resto de puente. En formas alternativas, los átomos de la cadena lateral del polipéptido pueden unirse a un grupo -CH2- saturado que a su vez se une directamente a un átomo de carbono o átomo de nitrógeno dentro del anillo aromático del resto de puente. En determinados casos, el anillo heterocíclico, aromático, de 5 miembros dentro del resto de puente es 1,2,3-triazol. En estos casos, el anillo aromático puede estar sustituido en las posiciones 1 y 4 con funcionalidad química del polipéptido lineal que está anclándose. Alternativamente, el armazón de 1,2,3-triazol puede estar sustituido en las posiciones 1 y 4 con grupos -CH2- que están unidos directamente a los átomos del polipéptido lineal que está anclándose [por ejemplo cualquiera de las siguientes estructuras en las que Z puede seleccionarse de NH, S, O y (CH)2]:
Figure imgf000009_0002
En otros casos, el anillo heterocíclico, aromático, de 5 miembros que comprende el resto de puente es pirazol. En estos casos, el anillo aromático puede estar sustituido o bien en las posiciones 1 y 3 o bien en las posiciones 1 y 4 con funcionalidad química del polipéptido lineal que está anclándose. Alternativamente, el armazón de pirazol puede estar sustituido o bien en las posiciones 1 y 3 o bien en las posiciones 1 y 4 con grupos -CH2- que están unidos directamente a los átomos del polipéptido lineal que está anclándose [por ejemplo cualquiera de las siguientes estructuras en las que Z puede seleccionarse de NH, S, O y (CH)2]:
Figure imgf000010_0001
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto habitual en la técnica a la que pertenece esta invención.
Polipéptidos como fármacos
Gracias a su tamaño y complejidad, los polipéptidos son capaces de formar numerosos contactos altamente específicos con sus dianas biológicas y pueden mostrar un alto nivel de selectividad por la diana correcta o deseada en comparación con una diana estrechamente relacionada dentro de la misma familia. Los efectos colaterales (también conocidos como efectos secundarios) con frecuencia provocan que fármacos altamente eficaces no logren la aprobación normativa debido a preocupaciones de seguridad.
Numerosos polipéptidos (incluyendo, pero sin limitarse a, compuestos peptidomiméticos), se han desarrollado para dar fármacos eficaces. Estos incluyen, pero no se limitan a, insulina, péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), somatostatina, vasopresina, ciclosporina A y similares. El polipéptido terapéutico puede ser idéntico a la molécula que se produce de manera natural (es decir, la que circula en humanos y se considera “de tipo natural” en la población humana). En muchos otros casos, el polipéptido no es adecuado o es inferior a lo óptimo para su uso terapéutico debido a una semivida en circulación corta que con frecuencia se debe a inestabilidad metabólica en el organismo. En estos casos se usa una forma modificada o variante del polipéptido (compuesto peptidomimético) que da como resultado un comportamiento farmacocinético y farmacodinámico mejorado. En otros casos un polipéptido derivado de una fuente natural tiene un mecanismo de acción equivalente y un perfil farmacéutico preferido y puede usarse como terapia. Por ejemplo, exenatida, una versión sintética de exedina 4, tiene propiedades biológicas similares al péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) humano pero una farmacocinética mejorada, y se ha aprobado por la FDA para el tratamiento de diabetes mellitus tipo 2. Como otro ejemplo, la calcitonina de salmón, calcitonina extraída a partir de las glándulas ultimobranquiales del salmón, se parece a la calcitonina humana pero es más activa que la calcitonina humana y puede usarse para tratar osteoporosis posmenopáusica, hipercalcemia, enfermedad de Paget, metástasis óseas y dolor del miembro fantasma.
Los polipéptidos están normalmente limitados a vías de administración no orales. En casi todos los casos, los polipéptidos deben administrarse mediante inyección, dado que incluso los polipéptidos muy cortos (por ejemplo, polipéptidos con 4-10 residuos de aminoácido) son incapaces o escasamente capaces de pasar a través de las membranas celulares que revisten el tracto intestinal. Para una disponibilidad oral eficiente, normalmente los fármacos necesitan pasar a través de las membranas tanto luminal como basolateral de células epiteliales del intestino con el fin de entrar en la circulación sistémica. La escasa capacidad de penetración en membrana y falta de biodisponibilidad oral de los polipéptidos limitan significativamente su uso terapéutico.
La eficacia de un polipéptido como fármaco puede verse influida por su estabilidad proteolítica. Dentro del organismo, los polipéptidos pueden modificarse o degradarse por enzimas, lo cual puede limitar su eficacia para interaccionar con una diana prevista.
La estabilidad metabólica de los polipéptidos es importante ya que está relacionada con su flexibilidad global, fluctuaciones intramoleculares, diversos procesos dinámicos internos así como muchas funciones biológicas. La estabilidad metabólica de los polipéptidos puede ser crítica en el desarrollo de productos farmacéuticos, afectando a parámetros tales como, pero sin limitarse a, aclaramiento, semivida y biodisponibilidad de los fármacos.
Mantener un nivel dado de un polipéptido terapéutico dentro del organismo o del torrente sanguíneo puede ser difícil debido al eflujo. La tasa de eflujo de un polipéptido a partir del organismo puede variar y debe monitorizarse cuando se considera la administración de polipéptidos terapéuticos.
Sigue existiendo una necesidad médica significativa de inhibidores de activación del complemento o inhibidores de actividad del complemento y formulaciones de inhibidores que sean altamente potentes y altamente específicos.
Descubrimiento de compuestos peptidomiméticos
Pueden identificarse compuestos peptidomiméticos mediante una variedad de medios. En algunos casos se usa como punto de partida un péptido que se produce de manera natural o una secuencia encontrada en una proteína natural. En estos casos, la secuencia peptídica de partida se ha elegido porque se sabe que interacciona físicamente con una molécula diana deseada. Un péptido natural puede elegirse porque es un agonista o antagonista para un receptor, inhibe una enzima o modula un canal. Puede elegirse una secuencia encontrada en una proteína natural porque comprende un dominio que participa en una interacción con otra proteína o alguna otra molécula en un humano o animal. En muchos casos, pueden obtenerse datos estructurales sobre proteínas que interaccionan a partir de bases de datos públicas (por ejemplo, el RCSB Protein Data Bank; H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000) The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242) y la región específica de una proteína que interacciona con la diana deseada puede identificarse a partir de datos cristalográficos sobre el complejo de proteína. En otros casos, pueden prepararse polipéptidos correspondientes a diversas porciones de una proteína y someterse a prueba para determinar la unión a una diana de interés. Una vez identificados, se introducen modificaciones químicas para mejorar su estabilidad y potencia, teniendo el compuesto peptidomimético resultante parámetros farmacocinéticos o farmacodinámicos mejorados.
En otros casos, se aísla un polipéptido mediante uno de varios métodos para aislar secuencias de polipéptido a partir de bibliotecas de polipéptidos basándose en sus afinidades frente a proteínas, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos o células completas diana específicos. Tales métodos incluyen presentación en fagos, presentación en ARNm, presentación en ribosoma, presentación en ADN, conjunto codificado por ADN, y examen de dos híbridos, así como sus modificaciones (véase, por ejemplo, Takashashi, T.T et al. (2003). Trends in Biochem. Sci. 28(3): 159-165; Kay, B.K. et al. (2001). Methods. 24:240-246; He, M y Taussig, M (2002). Briefs in Functional Genomics and Proteomics.
1(2): 204-212; Rothe, A. et al. (2006). The Fa Se B Journal. 20(10):1599-1610; todos los cuales se incluyen en el presente documento por referencia en sus totalidades).
Los polipéptidos pueden adoptar estructuras tridimensionales que son capaces de unirse a otras moléculas biológicas con ciertos grados de afinidad y especificidad. Algunos se unirán con una afinidad y especificidad muy altas. Se rellenará una biblioteca de secuencias de polipéptido al azar con moléculas con una amplia variedad de estructuras tridimensionales. Con el fin de aislar un polipéptido con una conformación que interacciona con una proteína diana específica, pueden prepararse secuencias individuales a partir de la biblioteca y someterse a prueba o examinarse para determinar su afinidad frente a la diana. Sin embargo, para bibliotecas muy grandes (>106 miembros), el examen de secuencias individuales para determinar la afinidad de unión no es viable. Para superar esta limitación, se han desarrollado varias técnicas para seleccionar polipéptidos novedosos a partir de mezclas extremadamente grandes y complejas gracias a su afinidad de unión frente a una diana. Dado que se predice que los polipéptidos de unión con alta afinidad están presentes a una frecuencia muy baja dentro de la población, estos métodos de selección se basan en mantener una unión física entre el polipéptido y el material genético (generalmente un ácido nucleico tal como ADN o ARN) que codifica para el polipéptido de modo que la selección del polipéptido incluye automáticamente la selección de un ácido nucleico que codifica para el mismo. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido seleccionado puede amplificarse y secuenciarse para revelar la secuencia tanto del ácido nucleico como del polipéptido. En un enfoque, presentación en fago (véase Cwirla, S.E. et al. (1990). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87:6378-6382; Dower, W.J. y Cwirla, S.E. patentes estadounidenses n.os 5.427.908 y 5.580.717), cada miembro polipeptídico aleatorio de la biblioteca se presenta sobre la superficie de una partícula de bacteriófago como parte de una proteína de fusión entre el polipéptido y una de las proteínas de recubrimiento de fago. La partícula de fago proporciona la unión entre el polipéptido y el ADN codificante ubicándolos conjuntamente dentro de la misma entidad física, y posteriormente puede amplificarse el ADN codificante infectando bacterias con el fago seleccionado. En otro enfoque, presentación en ribosoma (véase Kawasaki, G.H. patentes estadounidenses n.os 5.658.754 y 5.643.768), se traduce in vitro una mezcla de moléculas de ARN mensajero (ARNm) de una manera que produce, para cada ARNm en la mezcla, un complejo estabilizado de ribosoma, ARNm y polipéptido recién sintetizado que sobresale a partir de ribosoma. Estabilizar el complejo permite mantenerlo junto mientras se examinan los polipéptidos para determinar la unión a una diana de interés. Los ARNm que codifican para los polipéptidos seleccionados pueden amplificarse usando reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y después caracterizarse, por ejemplo, mediante secuenciación.
En aún otro enfoque, presentación en ARNm (véase Szostak, J.W. y Roberts, R.W., patente estadounidense n.° 6.258.558), cada molécula de ARNm en la biblioteca se modifica mediante la adición covalente de un resto de tipo puromicina en su extremo 3'-terminal. El resto de tipo puromicina es un análogo de tallo aceptor de aminoacil-ARNt que funciona como aceptor de peptidilo, y puede añadirse a una cadena de polipéptido en crecimiento mediante la actividad peptidil transferasa de un ribosoma que traduce el ARNm. Durante la traducción in vitro, el ARNm y el polipéptido codificado se unen de manera covalente a través del resto de tipo puromicina, creando una fusión de ARN-péptido. Tras seleccionar una molécula de fusión mediante unión de su componente de polipéptido a una diana, el componente de ARN de la molécula de fusión seleccionada puede amplificarse usando PCR, y después caracterizarse. Se han desarrollado varios otros métodos para producir una unión física entre un polipéptido y su ácido nucleico codificante para facilitar la selección y amplificación (véase Yanagawa, H., Nemoto, N., Miyamoto, E., y Husimi, Y., patente estadounidense n.° 6.361.943; Nemoto, H., Miyamoto-Sato, E., Husimi, H., y Yanagawa, H. (1997). FEBS Lett. 414:405-408; Gold, L., Tuerk, C., Pribnow, D., y Smith, J.D., patentes estadounidenses n.os 5.843.701 y 6.194.550; Williams, R.B., patente estadounidense n.° 6.962.781; Baskerville, S. y Bartel, D.P. (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9154-9159; Baskerville, D.S. y Bartel, D.P., patente estadounidense n.° 6.716.973; Sergeeva, A. et al.
(2006). Adv. Drug Deliv. Rev. 58:1622-1654).
La presentación en ARNm es un método particularmente útil para crear grandes bibliotecas de polipéptidos. Por consiguiente, en el presente documento se divulgan métodos de selección de un polipéptido (o un ARNm que codifica para un polipéptido) que interacciona con proteína C5 del complemento. Una biblioteca contendrá generalmente al menos 102 miembros, más preferiblemente al menos 106 miembros, y más preferiblemente al menos 109 miembros (por ejemplo, cualquiera de los complejos de ARNm-polipéptido). En algunos casos, la biblioteca incluirá al menos 1012 miembros o al menos 1014 miembros. En general, los miembros diferirán unos de otros; sin embargo, se espera que haya algún grado de redundancia en cualquier biblioteca. La biblioteca puede existir como una única mezcla de todos los miembros, o puede dividirse en varias combinaciones contenidas en recipientes o pocillos independientes, que contienen cada uno un subconjunto de la biblioteca, o la biblioteca puede ser una colección de recipientes o pocillos en una placa, conteniendo cada recipiente o pocillo tan sólo uno o unos pocos miembros de la biblioteca.
Cada ARNm en la biblioteca comprende preferiblemente una secuencia de inicio de la traducción, un codón de iniciación y una región que codifica para polipéptido variable (por ejemplo, proteína o péptido corto) que se genera, por ejemplo, mediante ensamblaje aleatorio o semialeatorio de nucleótidos, y varía de un ARNm a otro ARNm en la biblioteca (aunque probablemente habrá algún grado de redundancia dentro de la biblioteca). La secuencia de inicio de la traducción, codón de iniciación y región que codifica para polipéptido variable pueden estar flanqueados por secuencias fijas conocidas que pueden usarse para la amplificación mediante PCR del ARNm, por ejemplo, tras la selección. Otras secuencias fijas que pueden estar presentes incluyen las correspondientes a secuencias que codifican para aminoácidos que pueden participar en reacciones de reticulación química o enzimática, de tal manera que el polipéptido producido puede modificarse o derivatizarse tras la traducción, o que codifican para una extensión C-terminal fijada tal como una etiqueta de polipéptido que puede facilitar la purificación de las fusiones de péptido-ARNm.
Una vez generada una biblioteca de ARNm derivatizada con puromicina, puede traducirse la biblioteca. Los polipéptidos resultantes (por ejemplo, polipéptidos presentados) estarán unidos a sus ARNm correspondientes tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, como complejo de ARNm-polipéptido).
En la bibliografía se han descrito numerosos sistemas de traducción in vitro. Los sistemas más habituales usan lisados de reticulocitos de conejo, extractos de germen de trigo, o extractos de E. coli, que están disponibles a partir de varias fuentes comerciales en forma de kit (por ejemplo, Ambion, Austin, TX; Promega, Madison, WI; Novagen/EMD Chemicals, Gibbstown, NJ; Qiagen, Valencia, CA).
A diferencia de la presentación en fagos u otros sistemas que se basan en la traducción dentro de células, la presentación en ARNm puede adaptarse para producir directamente bibliotecas de compuestos peptidomiméticos realizando traducción in vitro con aminoácidos no naturales o no convencionales. Los 20 aminoácidos proteinogénicos naturales se identifican y se hace referencia a los mismos en el presente documento mediante sus designaciones o bien de una letra o bien de tres letras de la siguiente manera: ácido aspártico (Asp:D), isoleucina (Ile:I), treonina (Thr:T), leucina (Leu:L), serina (Ser:S), tirosina (Tyr:Y), ácido glutámico (Glu:E), fenilalanina (Phe:F), prolina (Pro:P), histidina (His:H), glicina (Gly:G), lisina (Lys:K), alanina (Ala:A), arginina (Arg:R), cisteína (Cys:C), triptófano (Trp:W), valina (Val:V), glutamina (Gln:Q) metionina (Met:M), asparagina (Asn:N). Los aminoácidos que se producen de manera natural existen en sus formas estereoisoméricas levógiras (L). Los aminoácidos a los que se hace referencia en el presente documento son los estereoisómeros L excepto cuando se indique lo contrario.
Los aminoácidos no naturales tienen cadenas laterales u otras características no presentes en los 20 aminoácidos que se producen de manera natural indicados anteriormente e incluyen, pero no se limitan a: N-metil-aminoácidos, N-alquil-aminoácidos, aminoácidos sustituidos en alfa,alfa, beta-aminoácidos, alfa-hidroxi-aminoácidos, D-aminoácidos, y otros aminoácidos no naturales conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Josephson et al., (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6353-6357; Subtelny et al., (2008) J. Am. Chem. Soc. 130: 6131-6136; Hartman, M.C.T. et al. (2007) PLoS ONE 2:e972; y Hartman et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:4356-4361).
Puede usarse esencialmente cualquier aminoácido que, cuando se une a un ARNt apropiado, pueda ensamblarse para dar un polímero mediante ribosomas natural o mutantes (véase Sando, S. et al., (2007) J. Am. Chem. Soc.
129:6180-6186; Dedkova, L. et al. (2003) J. Am. Chem. Soc. 125: 6616-6617; Josephson, K., Hartman, M.C.T., y Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127:11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:6353-6357; Subtelny, A.O., Hartman, M.C.T., y Szostak, J.W. (2008) J. Am. Chem. Soc. 130:6131-6136; y Hartman, M.C.T. et al. (2007) PLoS ONE 2:e972).
Cuando se desean aminoácidos no naturales, puede resultar ventajoso usar un sistema de traducción purificado que carece de ARNt aminoacilados endógenos (Shimizu, Y. et al. (2001) Nat. Biotech. 19:751-755; Josephson, K., Hartman, M.C.T., y Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 6353-6357). Si se usan aminoácidos no naturales con un sistema de traducción in vitro basado en un lisado o extracto, puede ser deseable agotar los ARNt endógenos del extracto, tal como se describió anteriormente (véase Jackson, R.J., Napthine, S., y Brierley, I. (2001) RNA 7:765-773). Está comercialmente disponible un sistema basado en factores de traducción de E. coli purificados (PUREXPRESS™; New England Biolabs, Ipswich, MA). Estos sistemas son particularmente útiles para la traducción con aminoácidos no naturales para producir compuestos peptidomiméticos.
Cuando se usan aminoácidos naturales con un sistema de traducción in vitro basado en un lisado o extracto, la traducción depende de la carga enzimática de aminoácidos sobre ARNt mediante ARNt sintetasas, todos los cuales son componentes de los extractos. Alternativamente, los sistemas de traducción in vitro que usan ribosomas y factores de traducción purificados, o extractos agotados en cuanto a ARNt, requieren que se proporcionen ARNt aminoacilados. En estos casos, pueden cargarse ARNt sintetizados in vitro o purificados con aminoácidos que usan procedimientos químicos (véase Frankel, A., Millward, S.W., y Roberts, R.W. (2003) Chem. Biol. 10:1043-1050) o enzimáticos (Josephson, K., Hartman, M.C.T., y Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 11727-11735; Murakami, H. et al. (2006) Nat. Methods 3:357-359).
Numerosas publicaciones describen la recuperación de polipéptidos presentados en ARNm a partir de complejos de traducción, y son adecuados para su uso con los métodos descritos en el presente documento (Liu, R. et al. (2000). Methods Enzymol. 318:268-293; Baggio, R. et al. (2002). J. Mol. Recognit. 15:126-134; patente estadounidense n.° 6.261.804). La recuperación de polipéptidos presentados en ARNm puede facilitarse mediante el uso de diversas “etiquetas” que se incluyen en el polipéptido mediante traducción de secuencias fijadas de la secuencia que codifica para polipéptido y que se unen a sustratos o moléculas específicos. Están comercialmente disponibles numerosos reactivos para capturar tales etiquetas, incluyendo reactivos para capturar la etiqueta de His, etiqueta de FLAG, etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta de estrep., etiqueta de VHS, etiqueta de T7, etiqueta de S, etiqueta de DsbA, etiqueta de DsbC, etiqueta de Nus, etiqueta de myc, etiqueta de hemaglutinina (HA), o etiqueta de Trx (Novagen, Gibbstown, NJ; Pierce, Rockford, IL). También pueden aislarse polipéptidos presentados en ARNm mediante unión de una cola de poliA en el ARNm a resina de polidT, o una combinación de una cola de poliA y una etiqueta de His.
Tras haberse realizado la reacción de traducción in vitro, y antes de la etapa de selección, normalmente se somete la porción de ARNm del ARN funcionalizado a transcripción inversa para producir una molécula híbrida de ARN-ADN. Esto sirve para proteger el ARN frente a degradación, y también evita que el ARN se pliegue para dar una estructura secundaria que puede unirse a la diana de selección, lo cual conduciría a la selección de productos inapropiados (por ejemplo, la selección de aptámeros de ARN en vez de aptámeros de polipéptido).
Tras la traducción in vitro y el aislamiento de fusiones de polipéptido-ARNm, puede modificarse el resto de polipéptido mediante reticulación intramolecular o intermolecular, conjugación química, escisión enzimática, truncamiento o extensión con monómeros de aminoácido adicionales. Una manera de lograr esto es incorporando aminoácidos no naturales con cadenas laterales reactivas en los polipéptidos que constituyen la biblioteca. Tras la traducción, pueden hacerse reaccionar los polipéptidos recién formados con moléculas que reaccionan específicamente con la cadena lateral reactiva del aminoácido incorporado. Por ejemplo, puede incorporarse un aminoácido con una cadena lateral de alquino terminal en la biblioteca de polipéptidos y posteriormente hacerse reaccionar un azúcar de azido, creando una biblioteca de polipéptidos presentados con azúcares unidos en las posiciones de las cadenas laterales de alquinilo (Josephson, K., Hartman, M.C.T., y Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem. Soc. 127: 11727-11735). Puede usarse una variedad de cadenas laterales reactivas para tal conjugación postraduccional, incluyendo aminas, grupos carboxilo, azidas, alquinos terminales, alquenos y tioles.
Una modificación particularmente útil se basa en la reticulación de aminoácidos para producir estructuras cíclicas. Las regiones cíclicas en un polipéptido contienen un dominio rígido, que reduce la flexibilidad conformacional y los grados de libertad de rotación, conduciendo a una unión con afinidad muy alta a proteínas diana. Hay varios métodos para ciclar un polipéptido disponibles para los expertos en la técnica. Normalmente, se aprovecha la reactividad química de cadenas laterales de aminoácidos específicas y/o los extremos carboxilo o amino-terminales del polipéptido para reticular dos sitios del polipéptido para producir una molécula cíclica. En un método, el grupo tiol de un residuo de cisteína se reticula con otro residuo de cisteína para formar un enlace disulfuro. En algunos casos, los grupos tiol de residuos de cisteína reaccionan con grupos bromometilo de moléculas de poli(bromometil)benceno para formar uniones estables (véase Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem 6:821-824). Las moléculas de poli(bromometil)benceno pueden incluir, pero no se limitan a, 1,2-bis(bromometil)benceno, 1,3-bis(bromometil)benceno y 1,4-bis(bromometil)benceno. Pueden usarse moléculas de bis, tris y tetrakis(bromometil)benceno, por ejemplo, para generar restos de puente para producir polipéptidos con uno, dos o tres bucles, respectivamente. Los grupos bromometilo de una molécula de poli(bromometil)benceno pueden estar dispuestos en el anillo de benceno en carbonos de anillo adyacentes (orto- u o-), con un carbono de anillo separando los dos grupos (meta- o m-) o en carbonos de anillo opuestos (para- o p-). En algunos casos, se usa mbis(bromometil)benceno (también denominado en el presente documento m-dibromoxileno) en la formación de polipéptidos cíclicos. En algunos casos, se usan o-bis(bromometil)benceno (también denominado en el presente documento o-dibromoxileno) o p-bis(bromometil)benceno (también denominado en el presente documento pdibromoxileno) en la formación de polipéptidos cíclicos. En algunos casos, grupos tiol de residuos de cisteína reaccionan con otros reactivos que comprenden uno o más grupos funcionales de bromo para formar uniones estables. Tales reactivos pueden incluir, pero no se limitan a, poli(bromometil)piridinas (incluyendo, pero sin limitarse a, 2,6-bis(bromometil)piridina), poli(bromometil)alquilbencenos (incluyendo, pero sin limitarse a, 1,2-bis(bromometil)-4alquilbenceno) y/o (E)-1,4-dibromobut-2-eno.
En otro método a modo de ejemplo, se reticulan un grupo amino de cadena lateral y un grupo amino terminal con glutarato de disuccinimidilo (véase Millward, S.W. et al., J. Am. Chem. Soc. 127:14142-14143, 2005). En otros enfoques, se logra la ciclación formando un enlace tioéter entre dos sitios en el polipéptido (véase Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem 6:821-824). Un método enzimático se basa en la reacción entre (1) una cisteína y (2) un grupo deshidroalanina o deshidrobutirina, catalizada por una sintetasa lantibiótica, para crear el enlace tioéter (véase Levengood, M.R. y Van der Donk, W.A., Bioorg. y Med. Chem. Lett. 18:3025-3028, 2008). El grupo funcional deshidro también puede generarse químicamente mediante la oxidación de cadenas laterales de aminoácidos que contienen selenio incorporadas durante la traducción (véase Seebeck, F.P. y Szostak, J.W. J. Am. Chem. Soc. 2006).
Una biblioteca de fusiones de ARNm-polipéptido (también denominada en el presente documento biblioteca de presentación en ARNm) generada usando los métodos descritos anteriormente, y que puede haberse sometido o no a una modificación postraduccional (tal como ciclación del polipéptido, tal como se describió anteriormente), puede someterse a una etapa de selección discontinua para aislar los complejos que presentan polipéptidos deseables.
Normalmente, se conjuga C5 con un sustrato sólido, tal como una perla de polímero sintético o de agarosa. Hay numerosos métodos disponibles para inmovilizar C5 en un soporte sólido. En un método particularmente útil, se conjuga C5 a biotina y se usan perlas de estreptavidina para inmovilizar la proteína. Se mezclan las perlas que comprenden el C5 inmovilizado con la biblioteca de presentación en ARNm y se incuban en condiciones (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica, cationes divalentes y moléculas de unión de competencia) que permiten que miembros específicos de la biblioteca se unan a la diana. Alternativamente, la enzima biotinilada puede estar libre en disolución y, tras unirse a un polipéptido apropiado, las fusiones de ARNm-polipéptido unidas a C5 se capturan mediante perlas modificadas de manera apropiada.
Las condiciones de unión pueden variarse con el fin de cambiar la rigurosidad de la selección. Por ejemplo, pueden añadirse bajas concentraciones de un agente de unión de competencia para garantizar que los polipéptidos seleccionados tienen una afinidad relativamente superior. Alternativamente, puede elegirse el periodo de incubación para que sea muy breve, de tal manera que sólo se aislarán los polipéptidos con altas velocidades kon (velocidad de asociación). De esta manera, las condiciones de incubación desempeñan un papel importante en la determinación de las propiedades de los polipéptidos seleccionados. También pueden emplearse selecciones negativas. En este caso, se lleva a cabo una selección para eliminar polipéptidos con afinidad por el sustrato al que se une la diana (por ejemplo, Sepharose) aplicando la biblioteca presentada a perlas de sustrato que carecen de la proteína diana. Esta etapa puede eliminar los ARNm y sus polipéptidos codificados que no son específicos para la proteína diana. Están disponibles numerosas referencias que describen cómo realizar experimentos de selección (véase, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.258.558, Smith, G.P. y Petrenko, V.A., (1997) Chem. Rev. 97:391-410; Keefe, A.D. y Szostak, J.W. (2001) Nature 15:715-718; Baggio, R. et al. (2002) J. Mol. Recog. 15:126-134 y Sergeeva, A. et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58:1622-1654).
Se espera que la frecuencia a la que están presentes moléculas de unión en una biblioteca de secuencias aleatorias sea muy baja. Por tanto, en la etapa de selección inicial, deben recuperarse muy pocos polipéptidos que cumplan los criterios de selección (y sus ARNm asociados). Normalmente, se repite la selección con ARNm seleccionados de la primera ronda de selección. Esto se logra usando PCR para amplificar los ARNm o los ADNc correspondientes seleccionados en la primera ronda, seguido por transcripción in vitro para producir una nueva biblioteca de ARNm. Se usan cebadores de PCR correspondientes a los extremos 5' y 3' de los ARNm en la biblioteca. Normalmente, el cebador en 5' se extenderá en el sentido de 5' más allá del extremo del ARNm de modo que se añade un promotor bacteriano, tal como un promotor de T7, al extremo 5' de cada molécula amplificada. Una vez amplificado, puede usarse el ADN bicatenario en una reacción de transcripción in vitro para generar el ARNm para una ronda de selección posterior.
El procedimiento de selección normalmente implica varias rondas o ciclos, en los que la combinación de moléculas seleccionadas se enriquece cada vez más en un conjunto específico de secuencias al final de cada ronda. Las condiciones de selección pueden ser las mismas para cada ronda, o las condiciones pueden cambiar, por ejemplo, con el fin de aumentar la rigurosidad de selección en rondas posteriores. El avance de la selección puede monitorizarse mediante el uso de aminoácidos marcados de manera isotópica, tales como 35S-metionina. Se mide la cantidad de polipéptido radiomarcado unido a la diana en cada ronda, y un aumento progresivo de radioetiqueta recuperada es indicativo de un aumento progresivo de moléculas de ARN que codifican para polipéptidos con afinidad de unión para la diana. Tras cualquier ronda, los productos de PCR pueden clonarse y secuenciarse. Generalmente, se realizan clonación y secuenciación tras una ronda en la que se recuperan cantidades apreciables (por ejemplo >2% sobre el fondo con respecto a perlas que carecen de C5 inmovilizado) de polipéptido radiomarcado en la combinación unida a diana. Las secuencias que se encuentran en múltiples aislados son candidatas para codificar para polipéptidos que se unen específicamente a la diana. Alternativamente, puede realizarse secuenciación de alto rendimiento de miles de clones tras la primera ronda o rondas posteriores. Las secuencias que aumentan de frecuencia entre, por ejemplo, la tercera y la cuarta ronda son candidatas para codificar para polipéptidos que se unen específicamente a la diana. El polipéptido codificado por cualquier secuencia puede traducirse o sintetizarse y someterse a prueba para determinar la afinidad de unión a la proteína diana original usada en la selección.
Las bibliotecas y los métodos pueden usarse para optimizar la función o las propiedades de un polipéptido. En un enfoque, se usa PCR mutagénica (Keefe, A.D. y Szostak, J.W. (2001). Nature 15:715-718) para introducir variación de secuencia en la biblioteca una vez enriquecida la población en polipéptidos con un determinado nivel de afinidad de unión. Alternativamente, una única secuencia de ARN que codifica para un polipéptido con propiedades de unión definidas puede repetirse pero con un nivel definido de mutaciones, o puede realizarse PCR mutagénica para producir una combinación de moléculas mutantes. Tras la traducción in vitro se espera que la mezcla resultante de moléculas de ARNm producidas a partir de una combinación de este tipo codifiquen para polipéptidos con una gama de afinidades mejoradas, similares o reducidas en comparación con la secuencia de partida, y puede esperarse que una selección realizada con ARNm a partir de una combinación de este tipo identifique polipéptidos con afinidad mejorada si se usa un régimen de rigurosidad apropiado durante la selección.
En un segundo enfoque, se realiza optimización de una manera dirigida. Se somete una secuencia que codifica para un polipéptido con propiedades de unión o funcionales establecidas a mutagénesis dirigida al sitio, mediante lo cual se produce una serie de secuencias, teniendo cada secuencia un codón sustituido, por ejemplo, por un codón de alanina. El número de secuencias en el conjunto es igual al número de residuos de aminoácido que van a mutarse. Tras la traducción in vitro, se somete a prueba el producto de polipéptido de cada mutante de “exploración con alanina” para determinar propiedades de unión o funcionales. Se considera que los sitios en los que una sustitución por alanina afecta a la unión o función del polipéptido son residuos críticos. De manera similar, puede realizarse una exploración con N-metilo, de tal manera que cada residuo se sustituye por el derivado de N-metilo, y pueden identificarse posiciones en la estructura principal de polipéptido que pueden tolerar sustituciones con N-metilo.
Alternativamente, las secuencias pueden combinarse, someterse a una o más rondas de una selección de alta rigurosidad, y se aísla una combinación de secuencias que representan polipéptidos de unión con alta afinidad. Se identifican residuos críticos tras la secuenciación de ADN del ADN recuperado como aquellos que no pueden sustituirse por un residuo de alanina sin pérdida de actividad. Una vez identificados los residuos críticos, se produce una combinación de moléculas de ARNm que codifican para una amplia variedad de aminoácidos naturales (o no naturales) en cada posición crítica. La combinación resultante se somete a una o más rondas de una selección de alta rigurosidad (con la mezcla apropiada de ARNt cargados con aminoácidos naturales o no naturales), y se aíslan secuencias que representan polipéptidos de unión con alta afinidad tras la traducción in vitro. De esta manera, puede identificarse un polipéptido óptimo. Dado que la secuencia óptima puede no identificarse necesariamente combinando residuos óptimos en sitios individuales, resulta útil someter a prueba mutaciones en múltiples sitios en combinación.
Tanto la exploración con alanina como con N-metilo también pueden realizarse usando enfoques de síntesis química, tales como síntesis de polipéptidos en fase sólida (véase por ejemplo, Coin, I et al. (2007); Nature Protocols 2 (12):3247-56).
Una vez identificada una combinación, población o subconjunto de polipéptidos, pueden evaluarse para determinar aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico, incluyendo propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas mejoradas.
En un caso, se evalúan polipéptidos para determinar una o más de afinidad de unión a diana, actividad en ensayos bioquímicos o basados en células, resistencia a proteasa, capacidad de penetración in vitro o in vivo, propiedades relacionadas con la idoneidad para su uso como agente farmacéutico tales como unión a proteínas en plasma, metabolismo (en microsomas, hepatocitos o plasma), inhibición de P-glicoproteína (Pgp) e inhibición de citocromo P450. Los polipéptidos también pueden someterse a pruebas para determinar la biodisponibilidad oral, toxicidad, inhibición de producto génico relacionado con éter a go-go humano (hERG), semivida en circulación, otros parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos, y eficacia en modelos de enfermedad en animales.
Polipéptidos
Según la presente divulgación, una vez identificado un único polipéptido o una combinación de moléculas de polipéptido candidatas, pueden someterse a una o más rondas de optimización de la relación estructura-actividad (SAR) usando técnicas de síntesis química y de polipéptidos convencionales. Tal optimización puede incluir consideraciones tales como evitar cadenas laterales con carga polar (Asp, Glu, Arg, Lys) que pueden inhibir la penetración celular, evitación de cadenas laterales que suponen impedimentos metabólicos (Tyr, Met, Trp, Cys), mejorar la solubilidad, evitación de peso molecular innecesario, evitación de enlaces rotatorios y alterar la lipofilia.
Los polipéptidos pueden comprender desde aproximadamente 10 hasta aproximadamente 18 aminoácidos o variantes de aminoácidos. En algunos casos, tales polipéptidos comprenden un bucle cíclico.
Variantes de aminoácidos
Tal como se usa en el presente documento, el término “aminoácido” incluye los residuos de los aminoácidos naturales así como aminoácidos no naturales. El término también incluye aminoácidos que portan un grupo protector de amino convencional (por ejemplo acetilo o benciloxicarbonilo), así como aminoácidos naturales y no naturales protegidos en el extremo carboxilo-terminal (por ejemplo, como amida o éster alquílico (C-i-Ca), fenílico o bencílico; o como alfametilbencil-amida). Los expertos en la técnica conocen otros grupos protectores de amino y carboxilo adecuados (véase por ejemplo, Greene, T. W.; Wutz, P. G. M., Protecting Groups In Organic Synthesis; segunda edición, 1991, Nueva York, John Wiley & sons, Inc., y documentos citados en el mismo). Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos también pueden incluir aminoácidos modificados.
Los aminoácidos no naturales útiles para la optimización de polipéptidos y/o composiciones de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-1-carboxílico, ácido 1-amino-2,3-hidro-1H-indeno-1-carboxílico, homolisina, homoarginina, homoserina, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, ácido 4-aminobutírico, ácido 5-aminopentanoico, ácido 5-aminohexanoico, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisobutírico, ácido 2-aminopimélico, desmosina, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilpentilglicina, naftilalanina, ornitina, pentilglicina, tioprolina, norvalina, terc-butil-glicina, fenilglicina, azatriptófano, 5-azatriptófano, 7-azatriptófano, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, sarcosina, homocisteína, ácido 1-aminociclopropanocarboxílico, ácido 1-aminociclobutanocarboxílico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclohexanocarboxílico, ácido 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-carboxílico, ácido (S)-2-amino-3-(1 H-tetrazol-5-il)propanoico, ciclopentilglicina, ciclohexilglicina, ciclopropilglicina, ^-ro-metilarginina, 4-clorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, 5-fluorotriptófano, 5-clorotriptófano, citrulina, 4-cloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4-aminometil-fenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, octilglicina, norleucina, ácido tranexámico, ácido 2-aminopentanoico, ácido 2-aminohexanoico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminooctanoico, ácido 2-aminononanoico, ácido 2-aminodecanoico, ácido 2-aminoundecanoico, ácido 2-aminododecanoico, ácido aminovalérico, y ácido 2-(2-aminoetoxi)acético, ácido pipecólico, 2-carboxi-azetidina, hexafluoroleucina, 3-fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3-fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metil-fenilglicina, 4-etilfenilglicina, 4-isopropil-fenilglicina, ácido (S)-2-amino-5-azidopentanoico (también denominado en el presente documento “X02”), ácido (S)-2-aminohept-6-enoico (también denominado en el presente documento “X30”), ácido (S)-2-aminopent-4-inoico (también denominado en el presente documento “X31”), ácido (S)-2-aminopent-4-enoico (también denominado en el presente documento “X12”), ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-terc-leucinol, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina, y (S)-W,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amina, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico, y ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il)butanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)butanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)butanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)butanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)butanoico, y ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)butanoico, ácido 2-(2'-MeO-fenil)-2-aminoacético, ácido tetrahidro-3-isoquinolincarboxílico y estereoisómeros de los mismos (incluyendo, pero sin limitarse a, isómeros D y L).
Los aminoácidos no naturales adicionales que son útiles en la optimización de polipéptidos o composiciones de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos fluorados en los que uno o más átomos de hidrógeno unidos a carbono se sustituyen por flúor. El número de átomos de flúor incluidos puede oscilar desde 1 hasta, e incluyendo, todos los átomos de hidrógeno. Los ejemplos de tales aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, 3-fluoroprolina, 3,3-difluoroprolina, 4-fluoroprolina, 4,4-difluoroprolina, 3,4-difluroprolina, 3,3,4,4-tetrafluoroprolina, 4-fluorotriptófano, 5-flurotriptófano, 6-fluorotriptófano, 7-fluorotriptófano, y estereoisómeros de los mismos.
Los aminoácidos no naturales adicionales que son útiles en la optimización de polipéptidos o composiciones de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los que están disustituidos en el carbono a . Estos incluyen aminoácidos en los que los dos sustituyentes en el carbono a son iguales, por ejemplo ácido a -amino-isobutírico, y ácido 2-amino-2-etil-butanoico, así como aquellos en los que los sustituyentes son diferentes, por ejemplo a -metilfenilglicina y a-metilprolina. Además, los sustituyentes en el carbono a pueden tomarse juntos para formar un anillo, por ejemplo ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclobutanocarboxílico, ácido 1-aminociclohexanocarboxílico, ácido 3-aminotetrahidrofuran-3-carboxílico, ácido 3-aminotetrahidropiran-3-carboxílico, ácido 4-aminotetrahidropiran-4-carboxílico, ácido 3-aminopirrolidin-3-carboxílico, ácido 3-aminopiperidin-3-carboxílico, ácido 4-aminopiperidin-4-carboxílico, y estereoisómeros de los mismos.
Los aminoácidos no naturales adicionales que son útiles en la optimización de polipéptidos o composiciones de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, análogos de triptófano en los que el sistema de anillo de indol se sustituye por otro sistema de anillo bicíclico de 9 ó 10 miembros que comprende 0, 1, 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O o S. Cada sistema de anillo puede estar saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado. El sistema de anillo puede estar sustituido con 0, 1, 2, 3 ó 4 sustituyentes en cualquier átomo que puede sustituirse. Cada sustituyente se selecciona independientemente de H, F, Cl, Br, CN, COOR, CONRR', oxo, Or , NRR'. Cada R y R' se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C20, (alquil C-i-C2o)-O-alquilo C1-20.
En algunos casos, los análogos de triptófano (también denominados en el presente documento “análogos de triptófano”) que son útiles en la optimización de polipéptidos o composiciones de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorotriptófano [(5-F)W], 5-metil-O-triptófano [(5-MeO)W], 1-metiltriptófano [(1-Me-W) o (1-Me)W], D-triptófano (D-Trp), azatriptófano (incluyendo, pero sin limitarse a, 4-azatriptófano, 7-azatriptófano y 5-azatriptófano), 5-clorotriptófano, 4-fluorotriptófano, 6-fluorotriptófano, 7-fluorotriptófano, y estereoisómeros de los mismos. Excepto cuando se indique lo contrario, el término “azatriptófano” y su abreviatura, “azaTrp”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a 7-azatriptófano.
Los residuos de aminoácido modificados útiles para la optimización de polipéptidos y/o composiciones de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, aquellos que están químicamente bloqueados, de manera reversible o irreversible, o químicamente modificados en su grupo amino N-terminal o sus grupos de cadena lateral, o químicamente modificados en la estructura principal de amida, tales como, por ejemplo, N-metilados, estereoisómeros D (aminoácidos no naturales) y L (aminoácidos naturales) o residuos en los que los grupos funcionales de cadena lateral están químicamente modificados para dar otro grupo funcional. Por ejemplo, los aminoácidos modificados incluyen, sin limitación, sulfóxido de metionina; metionina-sulfona; éster beta-metílico de ácido aspártico, un aminoácido de ácido aspártico modificado; N-etilglicina, un aminoácido de glicina modificado; o alanina-carboxamida, y un aminoácido de alanina modificado. Pueden adquirirse aminoácidos no naturales de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO), Bachem (Torrance, CA) u otros proveedores. Los aminoácidos no naturales pueden incluir además cualquiera de los indicados en la tabla 2 de la publicación de patente estadounidense US 2011/0172126.
En algunos casos, las secuencias de aminoácidos de polipéptidos y/o composiciones de polipéptidos pueden comprender únicamente aminoácidos que se producen de manera natural.
Los polipéptidos pueden comprender aminoácidos tanto que se producen de manera natural como que no se producen de manera natural y/o modificados o estar compuestos exclusivamente por aminoácidos que no se producen de manera natural.
Variantes de polipéptidos
Cualquier molécula basada en aminoácidos (naturales o no naturales) puede denominarse “polipéptido” y este término abarca “péptidos”, “compuestos peptidomiméticos” y “proteínas”. Los polipéptidos también son una categoría de proteína y tradicionalmente se considera que su tamaño oscila desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 50 aminoácidos. Los dipéptidos, aquellos que tienen dos residuos de aminoácido, son una categoría de polipéptido al igual que los tripéptidos (polipéptidos que comprenden tres aminoácidos). Los polipéptidos de más de aproximadamente 50 aminoácidos se denominan generalmente “proteínas”. Las secuencias de polipéptido pueden ser lineales o cíclicas. Por ejemplo, un polipéptido cíclico puede prepararse o puede resultar de la formación de enlaces disulfuro entre dos residuos de cisteína en una secuencia. Un polipéptido puede ciclarse a través del extremo carboxiloterminal, el extremo amino-terminal o a través de cualquier otro punto de unión conveniente, tal como, por ejemplo, a través del azufre de una cisteína o cualquier cadena lateral de un residuo de aminoácido u otra unión incluyendo, pero sin limitarse a, una unión de maleimida, una unión de amida, una unión de éster, una unión de éter, una unión de tioléter, una unión de hidrazona, o una unión de acetamida. En algunos casos, se forman polipéptidos cíclicos cuando una molécula actúa como resto de puente para unir dos o más regiones del polipéptido.
El término “variante de secuencia de aminoácidos” se refiere a polipéptidos con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con una secuencia de partida, de referencia o nativa. Las variantes de secuencia de aminoácidos pueden presentar sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos. De manera habitual, las variantes presentarán al menos aproximadamente el 70% de homología con respecto a una secuencia nativa o de partida, y preferiblemente, serán homólogas al menos aproximadamente al 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente al 90% con respecto a una secuencia nativa o de partida.
“Homología” tal como se aplica a secuencias de aminoácidos se define como el porcentaje de residuos en la secuencia de aminoácidos candidata que son idénticos a los residuos en la secuencia de aminoácidos de una segunda secuencia tras alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr la máxima homología en porcentaje. En la técnica se conocen bien métodos y programas informáticos para la alineación. Se entiende que la homología depende de un cálculo de identidad en porcentaje pero el valor puede diferir debido a huecos y penalizaciones introducidos en el cálculo.
Por “homólogos” tal como se aplica a secuencias de aminoácidos quiere decirse la secuencia correspondiente de otra especie que tiene identidad sustancial con respecto a una segunda secuencia de una segunda especie.
Se pretende que “análogos” incluya variantes de secuencia de aminoácidos que difieren en una o más alteraciones de aminoácido, por ejemplo, sustituciones, adiciones o deleciones de residuos de aminoácido que todavía conservan una o más de las propiedades del polipéptido original o de partida.
La presente divulgación contempla varios tipos de composiciones que incluyen polipéptidos que incluyen variantes y derivados. Estos incluyen derivados y variantes de sustitución, inserción, deleción y covalentes. El término “derivado” se usa como sinónimo del término “variante” y se refiere a una molécula que se ha modificado o cambiado de cualquier manera con respecto a una molécula de referencia o molécula de partida.
Como tales, en el presente documento se divulgan polipéptidos que contienen sustituciones, inserciones y/o adiciones, deleciones y modificaciones covalentes. Por ejemplo, pueden añadirse etiquetas de secuencia o aminoácidos, tales como una o más lisinas, a las secuencias de polipéptido (por ejemplo, en los extremos N-terminal o C-terminal). Pueden usarse etiquetas de secuencia para la purificación o localización de polipéptidos. Pueden usarse lisinas para aumentar la solubilidad de polipéptidos o para permitir modificaciones específicas del sitio, tales como, pero sin limitarse a, biotinilación o pegilación. En algunos casos, pueden destiobiotinilarse los polipéptidos. Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido que está destiobiotinilado puede comprender un resto destiobiotina (Dtb) conjugado al grupo épsilon-amino de un residuo de lisina. Tales residuos de lisina pueden ser residuos C-terminales en algunos casos. Alternativamente, de manera opcional pueden delecionarse residuos de aminoácido ubicados en las regiones carboxilo y amino-terminales de la secuencia de aminoácidos de un polipéptido, proporcionando secuencias truncadas. Alternativamente pueden delecionarse determinados aminoácidos (por ejemplo, residuos C-terminales o N-terminales) dependiendo del uso de la secuencia, tal como, por ejemplo, expresión de la secuencia como parte de una secuencia más grande, que es soluble, o unida a un soporte sólido.
“Variantes de sustitución”, cuando se hace referencia a polipéptidos, son aquellos que tienen al menos un residuo de aminoácido en una secuencia nativa o de partida eliminado y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser individuales, en las que sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en las que se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula.
Tal como se usa en el presente documento el término “sustitución de aminoácido conservativa” se refiere a la sustitución de un aminoácido que está normalmente presente en la secuencia por un aminoácido diferente de tamaño, carga o polaridad similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina y leucina por otro residuo no polar. Asimismo, los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, y entre glicina y serina. Adicionalmente, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro residuo ácido, son ejemplos adicionales de sustituciones conservativas. Los ejemplos de sustituciones no conservativas incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido no polar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina por un residuo polar (hidrófilo) tal como cisteína, glutamina, ácido glutámico o lisina y/o un residuo polar por un residuo no polar.
Los “ isósteros” son una de dos o más moléculas que muestran algo de similitud de propiedades biológicas como resultado de tener el mismo número de electrones totales o de valencia en la misma disposición y que consisten en diferentes átomos, no necesariamente el mismo número de átomos. Hay dos clases de isósteros, clásicos y no clásicos. Los isósteros clásicos tienen el mismo número de átomos y/o el mismo número de electrones de valencia mientras que los isósteros no clásicos son moléculas que producen un efecto biológico similar in vivo pero no tienen el mismo número de átomos y/o electrones de valencia.
Según la presente divulgación, los “ isósteros de enlace peptídico” se definen como isósteros que tienen propiedades que se asemejan a enlaces peptídicos. Los isósteros de enlace peptídico pueden ser de tipo lineal que comprende al menos una sustitución de enlace peptídico o pueden ser cíclicos y comprender una función amina y ácido carboxílico. Tal sustitución puede ser con cualquier resto que mejora las propiedades fisicoquímicas, estructurales o funcionales de la molécula. La sustitución del enlace peptídico puede aumentar la estabilidad metabólica de los polipéptidos y reducir o aumentar la flexibilidad. Los isósteros de enlace peptídico descritos en el presente documento pueden ser isósteros de mono, di, tri, tetra, penta, hexa, septa, octa, nona, o deca-enlaces peptídicos, lo que significa que pueden sustituirse al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 enlaces peptídicos. Los ejemplos no limitativos de isósteros de di­ enlaces peptídicos lineales para enlaces (peptídicos) de amida incluyen tioamida, sulfonamida, sulfonato, fosfonamida, fosfonato, fosfotioato, fosfinato, alcano, 1 ó 2-hidroxietileno, dihidroxiletileno, enlace sencillo C-C (alcano), doble enlace C-C (alqueno), enlace triple C-C (alquino), enlace C-O (metilenoxi), enlace O-N o N-O (metilenimino), triazol, hidrazida, urea, cetona, enlace uretano, (di)haloalqueno, mercaptometileno, metilenamino, trifluoroetilamino, hidrazida, amidesoxi y otros conocidos por los expertos en la técnica.
Los isósteros de enlace peptídico también pueden ser moléculas cíclicas que están decoradas con una función amina y una función de ácido carboxílico. Los ejemplos no limitativos de isósteros de enlace peptídico cíclicos con tamaños de anillo variables incluyen carbaciclos, azaciclos y oxaciclos. Los azaciclos pueden basarse en un núcleo de alcaloide que forma un isóstero de estructura bicíclica. Un ejemplo de un isóstero azacíclico incluye un isóstero basado en un anillo de triazol formado mediante una cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre. Los isósteros de enlace peptídico cíclicos descritos en el presente documento pueden ser isósteros cíclicos bi, tri, tetra, penta, hexa, septa, octa, nona, deca-peptídicos.
Las “variantes de inserción”, cuando se hace referencia a polipéptidos, son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa o de partida. “Inmediatamente adyacente” a un aminoácido significa conectado al grupo funcional o bien alfa-carboxilo o bien alfa-amino del aminoácido.
Las “variantes de deleción”, cuando se hace referencia a polipéptidos, son aquellas con uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos nativa o de partida eliminados. De manera habitual, las variantes de deleción tendrán uno o más aminoácidos eliminados en una región particular de la molécula.
Las “variantes truncadas”, cuando se hace referencia a polipéptidos, son aquellas con uno o más aminoácidos en la secuencia de aminoácidos nativa o de partida eliminados de cualquier extremo terminal del polipéptido.
Los polipéptidos pueden modificarse mediante la adición de uno o más grupos conjugados. En algunos casos, los polipéptidos pueden administrarse en combinación con una o más moléculas adicionales.
Tal como se usa en el presente documento, un “conjugado” se refiere a cualquier molécula o resto añadido a otra molécula. Los conjugados pueden estar basados en polipéptidos (aminoácidos) o no. Los conjugados pueden comprender lípidos, moléculas pequeñas, ARN, ADN, polipéptidos, polímeros, o combinaciones de los mismos. Funcionalmente, los conjugados pueden servir como moléculas de direccionamiento o pueden servir como carga útil que va a suministrarse a una célula, órgano o tejido. Los conjugados son normalmente modificaciones covalentes introducidas haciendo reaccionar residuos de aminoácido seleccionados como diana o los extremos terminales del polipéptido con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con residuos terminales o cadenas laterales seleccionados. Tales modificaciones están dentro de las habilidades habituales en la técnica y se realizan sin experimentación excesiva.
El procedimiento de conjugación puede implicar pegilación, lipidación, albuminación, biotinilación, destiobiotinilación, la adición de otras colas de polipéptido, o el injerto en dominios Fc de anticuerpo, regiones CDR de anticuerpos intactos, o dominios de anticuerpo producidos mediante varios medios. El conjugado puede incluir anclajes incluyendo resto oleato de colesterol, resto laurato de colesterilo, un resto a -tocoferol, un resto fitol, un resto oleato, o un resto éster de colesterol insaturado o un compuesto lipófilo seleccionado de acetanilidas, anilidas, aminoquinolinas, compuestos de benzhidrilo, benzodiazepinas, benzofuranos, canabinoides, polipéptidos cíclicos, dibenzoazepinas, glicósidos digitálicos, alcaloides de cornezuelo, flavonoides, imidazoles, quinolinas, macrólidos, naftalenos, opiáceos (tales como, pero sin limitarse a, morfinanos u otros fármacos psicoactivos), oxazinas, oxazoles, fenilalquilaminas, piperidinas, hidrocarburos aromáticos policíclicos, pirrolidinas, pirrolidinonas, estilbenos, sulfonilureas, sulfonas, triazoles, tropanos y alcaloides de la vinca. Los polipéptidos lipidados pueden incluir polipéptidos lipidados en el extremo C-terminal. En algunos casos, los polipéptidos están lipidados con C12, C14, C16, C18 o C20 saturado o insaturado.
Tal como se usa en el presente documento, el término “derivado covalente”, cuando se hace referencia a un polipéptido, incluye modificación de un polipéptido nativo o de partida con un agente de derivatización orgánico proteico o no proteico, y/o modificación postraduccional. Las modificaciones covalentes se introducen tradicionalmente haciendo reaccionar residuos de aminoácido seleccionados como diana del polipéptido con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con residuos terminales o cadenas laterales seleccionados, o aprovechando mecanismos de modificaciones postraduccionales que funcionan en células huésped recombinantes seleccionadas. Los derivados covalentes resultantes son útiles en programas dirigidos a identificar residuos importantes para la actividad biológica, para inmunoensayos o para la preparación de anticuerpos anti-proteína para purificación por inmunoafinidad de la proteína recombinante. Tales modificaciones están dentro de las habilidades habituales en la técnica y se realizan sin experimentación excesiva.
Determinadas modificaciones postraduccionales son el resultado de la acción de células huésped recombinantes sobre un polipéptido expresado. Con frecuencia se desamidan tras la traducción los residuos de glutaminilo y asparaginilo para dar los residuos de glutamilo y aspartilo correspondientes. Alternativamente, estos residuos se desamidan en condiciones levemente ácidas. Cualquier forma de estos residuos puede estar presente en los polipéptidos producidos según la presente divulgación.
Otras modificaciones postraduccionales incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilo de residuos de tirosinilo, serilo o treonilo, metilación de los grupos alfa-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (Creighton, T. E., Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 1983, págs. 79-86).
Las modificaciones covalentes incluyen específicamente la unión de polímeros no proteicos a polipéptidos. Los polímeros no proteicos pueden incluir un polímero sintético hidrófilo, es decir, un polímero no encontrado de otro modo en la naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la naturaleza y se producen mediante métodos recombinantes o in vitro son útiles, al igual que los polímeros que se aíslan de la naturaleza. Se divulgan polímeros de polivinilo hidrófilos, por ejemplo poli(alcohol vinílico) y polivinilpirrolidona. Los polipéptidos pueden unirse a diversos polímeros no proteicos, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes estadounidenses n.os 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
Las “características”, cuando se hace referencia a polipéptidos, se definen como componentes basados en secuencia de aminoácidos diferenciados de una molécula. Las características del polipéptido de la presente divulgación incluyen manifestaciones en superficie, forma conformacional local, pliegues, bucles, semibucles, dominios, semidominios, sitios, extremos terminales o cualquier combinación de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento, cuando se hace referencia a polipéptidos el término “pliegue” se refiere a la conformación resultante de una secuencia de aminoácidos tras minimización de energía. Un pliegue puede producirse a nivel secundario o terciario del proceso de plegamiento. Los ejemplos de pliegues de nivel secundario incluyen láminas beta y hélices alfa. Los ejemplos de pliegues terciarios incluyen dominios y regiones formados debido a agregación o separación de regiones fisicoquímicamente diferenciadas. Las regiones formadas de esta manera incluyen cavidades hidrófobas e hidrófilas, y similares.
Tal como se usa en el presente documento el término “giro”, tal como se refiere a conformación de proteína, significa una curva que altera la dirección de la estructura principal de un polipéptido y puede implicar uno, dos, tres o más residuos de aminoácido.
Tal como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a polipéptidos el término “bucle” se refiere a una característica estructural de un polipéptido que puede servir para invertir la dirección de la estructura principal de un polipéptido. Cuando el bucle se encuentra en un polipéptido y sólo altera la dirección de la estructura principal, puede comprender cuatro o más residuos de aminoácido. Oliva et al. han identificado al menos 5 clases de bucles de proteína (Oliva, B. et al., J Mol Biol. 7 de marzo de 1997; 266 (4): 814-30).
Los bucles pueden estar abiertos o cerrados. Pueden formarse bucles cerrados o bucles “cíclicos” cuando dos aminoácidos se conectan mediante un resto de puente. El bucle cíclico comprende los aminoácidos a lo largo del polipéptido presentes entre los aminoácidos conectados en puente. Los bucles cíclicos pueden comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más aminoácidos.
Tal como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a polipéptidos el término “semibucle” se refiere a una porción de un bucle identificado que tiene al menos la mitad del número de residuos de aminoácido que el bucle a partir del cual se deriva. Se entiende que los bucles pueden no siempre contener un número par de residuos de aminoácido. Por tanto, en los casos en los que un bucle contiene o se identifica que comprende un número impar de aminoácidos, un semibucle del bucle de número impar comprenderá la porción de número entero o la siguiente porción de número entero del bucle (número de aminoácidos del bucle/2+/-0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un bucle que se identifica como un bucle de 7 aminoácidos puede producir semibucles de 3 aminoácidos o de 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 que es 3 ó 4).
Tal como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a proteínas, el término “región” se refiere a una zona o área general. En algunos casos, cuando se hace referencia a una proteína, una región puede comprender una secuencia de aminoácidos lineal a lo largo de la proteína o puede comprender una estructura secundaria o terciaria específica y/o una o más características o dominios de proteína.
Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio”, cuando se hace referencia a proteínas, se refiere a un motivo de un polipéptido que tiene una o más características o propiedades estructurales (tales como estructuras secundarias o terciarias) o funcionales identificables (por ejemplo, capacidad de unión, servir como sitio para interacciones proteína-proteína).
Tal como se usa en el presente documento, el término “semidominio”, cuando se hace referencia a proteínas, se refiere a una porción de un dominio identificado que tiene al menos la mitad del número de residuos de aminoácido que el dominio a partir del cual se deriva. Se entiende que los dominios pueden no siempre contener un número par de residuos de aminoácido. Por tanto, en los casos en los que un dominio contiene o se identifica que comprende un número impar de aminoácidos, un semidominio del dominio de número impar comprenderá la porción de número entero o la siguiente porción de número entero del dominio (número de aminoácidos del dominio/2+/-0,5 aminoácidos). Por ejemplo, un dominio que se identifica como un dominio de 7 aminoácidos puede producir semidominios de 3 aminoácidos o de 4 aminoácidos (7/2=3,5+/-0,5 que es 3 ó 4). También se entiende que pueden identificarse subdominios dentro de dominios o semidominios, presentando estos subdominios menos que la totalidad de las propiedades estructurales o funcionales identificadas en los dominios o semidominios a partir de los cuales se derivan. También se entiende que no se necesita que los aminoácidos que comprenden cualquiera de los tipos de dominio en el presente documento sean contiguos a lo largo de la estructura principal del polipéptido (es decir, aminoácidos no adyacentes pueden plegarse estructuralmente para producir un dominio, semidominio o subdominio).
Tal como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a polipéptidos el término “sitio” según se refiere a aspectos basados en aminoácidos se usa como sinónimo de “residuo de aminoácido” y “cadena lateral de aminoácido”. Un sitio representa una posición dentro de un polipéptido que puede modificarse, manipularse, alterarse, derivatizarse o variarse dentro de las moléculas basadas en polipéptido.
Tal como se usa en el presente documento los términos “extremos terminales” o “extremo terminal” cuando se hace referencia a polipéptidos se refieren a un extremo de un polipéptido. Tal extremo no se limita únicamente al primer o último sitio del polipéptido sino que puede incluir aminoácidos adicionales en las regiones terminales. Las moléculas basadas en polipéptido pueden caracterizarse por tener tanto un extremo N-terminal como un extremo C-terminal. Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos están compuestos en algunos casos por múltiples cadenas de polipéptido unidas mediante enlaces disulfuro o mediante fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estas clases de proteínas tendrán múltiples extremos N y C-terminales. Alternativamente, los extremos terminales de los polipéptidos pueden modificarse de tal manera que comienzan o terminan, según el caso, con un resto no basado en polipéptido tal como un conjugado orgánico.
Los polipéptidos pueden incluir una región terminal. Tal como se usa en el presente documento, “región terminal” es una región terminal de aminoácidos que puede incluir una cisteína. La región terminal puede ser una región N y/o C-terminal. En algunos casos, las regiones terminales pueden conectarse a los polipéptidos originales usando un resto de puente. Tal como se usa en el presente documento, “polipéptido original” se refiere a la parte del polipéptido que no incluye la región terminal. La región terminal puede estar separada del polipéptido original por 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos. Los residuos añadidos pueden seleccionarse de, pero no se limitan a, cualquier aminoácido natural o no natural, la forma N-metilada de cualquier aminoácido natural o no natural, el estereoisómero D de cualquier aminoácido natural o no natural, norvalina, terc-butil-glicina, fenilglicina, azatriptófano, 7-azatriptófano, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, sarcosina, homocisteína, ácido 1-aminociclopropanocarboxílico, ácido 1-aminociclobutanocarboxílico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclohexanocarboxílico, ácido 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-carboxílico, ácido aminoisobutírico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazo)-5-il)propanoico, ciclopentilglicina, ciclohexilglicina, ciclopropilglicina, ^-ro-metil-arginina, 4-clorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, 5-fluorotriptófano, 5-clorotriptófano, citrulina, 4-cloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4-aminometilfenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, octilglicina, norleucina, ácido tranexámico, ácido 2-aminopentanoico, ácido 2-aminohexanoico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminooctanoico, ácido 2-aminononanoico, ácido 2-aminodecanoico, ácido 2-aminoundecanoico, ácido 2-aminododecanoico, ácido aminovalérico, y ácido 2-(2-aminoetoxi)acético, ácido pipecólico, 2-carboxi-azetidina, hexafluoroleucina, 3-fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3-fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metil-fenilglicina, 4-etilfenilglicina, 4-isopropilfenilglicina, ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-terc-leucinol, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina, y (S)-W,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amina, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico, y ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propanoico.
Los aminoácidos no naturales adicionales que son útiles en la optimización de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, aminoácidos fluorados en los que uno o más átomos de hidrógeno unidos a carbono se sustituyen por flúor. El número de átomos de flúor incluidos puede oscilar desde 1 hasta, e incluyendo, todos los átomos de hidrógeno. Los ejemplos de tales aminoácidos incluyen, pero no se limitan a, 3-fluoroprolina, 3,3-difluoroprolina, 4-fluoroprolina, 4,4-difluoroprolina, 3,4-difluroprolina, 3,3,4,4-tetrafluoroprolina, 4-fluorotriptófano, 6-fluorotriptófano, 7-fluorotriptófano, y estereoisómeros de los mismos.
Los aminoácidos no naturales adicionales que son útiles en la optimización de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los que están disustituidos en el carbono a . Estos incluyen aminoácidos en los que los dos sustituyentes en el carbono a son iguales, por ejemplo ácido a-amino-isobutírico, y ácido 2-amino-2-etil-butanoico, así como aquellos en los que los sustituyentes son diferentes, por ejemplo a-metilfenilglicina y a-metilprolina. Además, los sustituyentes en el carbono a pueden tomarse juntos para formar un anillo, por ejemplo ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclobutanocarboxílico, ácido 1-aminociclohexanocarboxílico, ácido 3-aminotetrahidrofuran-3-carboxílico, ácido 3-aminotetrahidropiran-3-carboxílico, ácido 4-aminotetrahidropiran-4-carboxílico, ácido 3-aminopirrolidin-3-carboxílico, ácido 3-aminopiperidin-3-carboxílico, ácido 4-aminopiperidin-4-carboxílico, y estereoisómeros de los mismos.
Los aminoácidos no naturales adicionales que son útiles en la optimización de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, análogos de triptófano en los que el sistema de anillo de indol se sustituye por otro sistema de anillo bicíclico de 9 ó 10 miembros que comprende 0, 1, 2, 3 ó 4 heteroátomos seleccionados independientemente de N, O S. Cada sistema de anillo puede estar saturado, parcialmente insaturado o totalmente insaturado. El sistema de anillo puede estar sustituido con 0, 1, 2, 3 ó 4 sustituyentes en cualquier átomo que puede sustituirse. Cada sustituyente se selecciona independientemente de H, F, Cl, Br, CN, oxo, COOR, CONRR', OR, NRR'. Cada R y R' se selecciona independientemente de H, alquilo C1-C20, (alquil C-i-C20)-O-alquilo C1-20.
Los análogos de triptófano (también denominado en el presente documento “análogos de triptófano”) que son útiles en la optimización de polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorotriptófano [(5-F)W], 5-metil-O-triptófano [(5-MeO)W], 1-metiltriptófano [(1-Me-W) o (1-Me)W], D-triptófano (D-Trp), 7-azatriptófano (incluyendo, pero sin limitarse a, 4-azatriptófano, 7-azatriptófano y 5-azatriptófano), 5-clorotriptófano, 4-fluorotriptófano, 6-fluorotriptófano, 7-fluorotriptófano, y estereoisómeros de los mismos. Excepto cuando se indique lo contrario, el término “azatriptófano” y su abreviatura, “azaTrp”, tal como se usan en el presente documento, se refieren a 7-azatriptófano.
Los polipéptidos pueden incluir una modificación terminal en los extremos N o C-terminales con la adición de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más residuos y/o una cisteína en la región terminal. Los residuos añadidos pueden seleccionarse de, pero no se limitan a, cualquier aminoácido natural o no natural, la forma N-metilada de cualquier aminoácido natural o no natural, el estereoisómero D de cualquier aminoácido, norvalina, terc-butil-glicina, fenilglicina, azatriptófano, 7-azatriptófano, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, sarcosina, homocisteína, ácido 1-aminociclopropanocarboxílico, ácido 1-aminociclobutanocarboxílico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclohexanocarboxílico, ácido 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-carboxílico, ácido aminoisobutérico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico, ciclopentilglicina, ciclohexilglicina, ciclopropilglicina, ^-ro-metil-arginina, 4-clorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, 5-fluorotriptófano, 5-clorotriptófano, citrulina, 4-cloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4-aminometil-fenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, octilglicina, norleucina, ácido tranexámico, ácido 2-aminopentanoico, ácido 2-aminohexanoico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminooctanoico, ácido 2-aminononanoico, ácido 2-aminodecanoico, ácido 2-aminoundecanoico, ácido 2-aminododecanoico, ácido aminovalérico, y ácido 2-(2-aminoetoxi)acético, ácido pipecólico, 2-carboxi-azetidina, hexafluoroleucina, 3-fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3-fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metil-fenilglicina, 4-etil-fenilglicina, 4-isopropil-fenilglicina, ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-terc-leucinol, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina, y (S)-W,2-dimetiM-(piridin-2-il)propan-1-amina, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico, y ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propanoico.
Los polipéptidos pueden conjugarse a un polipéptido que aumenta o disminuye la unión a proteínas en plasma incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en Dennis, M.S. et al., Albumin binding as a general strategy for improving the pharmacokinetics of proteins. J Biol Chem. 20 de septiembre de 2002; 277(38):35035-43; Nguyen, A. et al., The pharmacokinetics of an albumin-binding Fab (AB Fab) can be modulated as a function of affinity for albumin. Protein Eng Des Sel. julio de 2006; 19(7):291-7 y Langerheim, J.F. et al., Improving the pharmacokinetics/pharmacodynamics of prolactin, GH, and their antagonists by fusion to a synthetic albumin-binding polypeptide. J Endocrinol. diciembre de 2009; 203(3):375-87. En algunos casos, tales polipéptidos se unen a albúmina sérica (denominados en el presente documento “polipéptidos de unión a albúmina”). En algunos casos, los polipéptidos de unión a albúmina se ciclan mediante formación de enlace disulfuro entre residuos de cisteína presentes en sus secuencias de polipéptido. En algunos casos, los polipéptidos de unión a albúmina se conjugan mediante sus extremos o bien N o bien C-terminales. En algunos casos, la conjugación a un polipéptido de unión a albúmina modula la cantidad de tiempo que permanece intacto un polipéptido en un sujeto. En algunos casos, la conjugación a un polipéptido de unión a albúmina aumenta la cantidad de tiempo que permanece un polipéptido en la sangre de un sujeto. Los polipéptidos pueden conjugarse a polipéptidos que tienen propiedades de penetración celular (denominados en el presente documento “polipéptidos de penetración celular”) incluyendo, pero sin limitarse a, los divulgados en Milletti, F., Cell-penetrating peptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today. agosto de 2012; 17(15-16):850-60. Los expertos en la técnica conocen polipéptidos de penetración celular adicionales. Los polipéptidos pueden conjugarse a cualquiera de los conjugados de polipéptido enseñados, por ejemplo, en las publicaciones de patente estadounidense US20110172126 o US20030040472. Los polipéptidos pueden conjugarse a una molécula lipófila que aumenta la unión a proteínas en plasma tal como los sustituyentes lipófilos enseñados, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 6.268.343 o la publicación estadounidense n.° US2013/0053311.
Una vez identificada o definida cualquiera de las características como componente deseado de un polipéptido, puede realizarse cualquiera de diversas manipulaciones y/o modificaciones de estas características mediante movimiento, intercambio, inversión, deleción, aleatorización o duplicación. Además, se entiende que la manipulación de características puede dar como resultado el mismo desenlace que una modificación de las moléculas de la divulgación. Por ejemplo, una manipulación que implica delecionar un dominio dará como resultado la alteración de la longitud de una molécula al igual que lo hará la modificación de un ácido nucleico para codificar para menos que una molécula de longitud completa.
Pueden lograrse modificaciones y manipulaciones mediante métodos conocidos en la técnica tales como, pero sin limitarse a, mutagénesis dirigida al sitio. Las moléculas modificadas resultantes pueden someterse entonces a prueba para determinar la actividad usando ensayos in vitro o in vivo tales como los descritos en el presente documento o cualquier otro ensayo de exploración adecuado conocido en la técnica.
Los polipéptidos pueden comprender una secuencia consenso que se descubre mediante rondas de experimentación. Tal como se usa en el presente documento, una secuencia “consenso” es una secuencia individual que representa una población colectiva de secuencias permitiendo variabilidad en uno o más sitios.
El término “ identidad” tal como se conoce en la técnica se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos, tal como se determina comparando las secuencias. En la técnica, identidad también significa el grado de relación de secuencia entre polipéptidos, tal como se determina mediante el número de coincidencias entre cadenas de dos o más residuos de aminoácido. La identidad mide el porcentaje de coincidencias idénticas entre la más pequeña de dos o más secuencias con alineaciones de huecos (si los hay) abordadas mediante un modelo matemático o programa informático particular (es decir, “algoritmos”). La identidad de polipéptidos relacionados puede calcularse fácilmente mediante métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, los descritos anteriormente por otros (Lesk, A. M., ed., Computational Molecular Biology, Oxford University Press, Nueva York, 1988; Smith, D. W., ed., Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Academic Press, Nueva York, 1993; Griffin, A. M. et al., ed., Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Humana Press, Nueva Jersey, 1994; von Heinje, G., Sequence Analysis in Molecular Biology, Academic Press, 1987; Gribskov, M. et al., ed., Sequence Analysis Primer, M. Stockton Press, Nueva York, 1991; y Carillo et al., Applied Math, SIAM J, 1988, 48, 1073).
En algunos casos, una variante de polipéptido puede tener la misma actividad o una actividad similar al polipéptido de referencia. Alternativamente, una variante puede tener una actividad alterada (por ejemplo, aumentada o reducida) con respecto a un polipéptido de referencia. Generalmente, las variantes de un polipéptido particular tendrán al menos aproximadamente el 40%, el 45%, el 50%, el 55%, el 60%, el 65%, el 70%, el 75%, el 80%, el 85%, el 90%, el 91%, el 92%, el 93%, el 94%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% pero menos del 100% de identidad de secuencia con respecto a la de un polipéptido de referencia particular tal como se determina mediante programas de alineación de secuencias y parámetros descritos en el presente documento y conocidos por los expertos en la técnica. Tales herramientas para alineación incluyen las de la serie BLAST (Altschul, S.F. et al., Gapped BLAST y PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucleic Acids Res. 1997, 25:3389-3402). En el presente documento se describen otras herramientas, específicamente en la definición de “ identidad”.
Los parámetros por defecto en el algoritmo de BLAST incluyen, por ejemplo, un umbral previsto de 10, tamaño de palabra de 28, puntuaciones de coincidencia/coincidencia errónea de 1, -2, costes de hueco lineales. Puede aplicarse cualquier filtro así como una selección para repeticiones específicas de especie, por ejemplo, Homo sapiens.
Abreviaturas usadas en polipéptidos
Tal como se usa en el presente documento, las abreviaturas tienen los siguientes significados: “Ac” y “NH2” indican acetilo y extremos terminales amidados, respectivamente; “Nvl” representa norvalina; “Phg” representa fenilglicina; “Tbg” representa terc-butil-glicina; “Chg” representa ciclohexilglicina; “(N-Me)X” representa la forma N-metilada del aminoácido indicado mediante código de aminoácido de una letra o de tres letras en lugar de la variable “X” escrito como N-metil-X [por ejemplo (N-Me)A o (N-Me)Ala representan la forma N-metilada de alanina o N-metil-alanina]; “azaTrp” representa azatriptófano; “(4-F)Phe” representa 4-fluorofenilalanina; “Tyr(OMe)” representa O-metil-tirosina, “Aib” representa ácido amino-isobutírico; “(homo)F” u “(homo)Phe” representa homofenilalanina; “(2-OMe)Phg” se refiere a 2-O-metilfenilglicina; “(5-F)W” se refiere a 5-fluorotriptófano; “D-X” se refiere al estereoisómero D del aminoácido dado “X” [por ejemplo (D-Chg) representa D-ciclohexilglicina]; “(5-MeO)W” se refiere a 5-metil-O-triptófano; “homoC” se refiere a homocisteína; “(1-Me-W)” o “(1-Me)W” se refiere a 1-metiltriptófano; “Nle” se refiere a norleucina; “Tiq” se refiere a un residuo de tetrahidroisoquinolina; “Asp(T)” se refiere a ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico; “(3-Cl-Phe)” se refiere a 3-clorofenilalanina; “[(N-Me-4-F)Phe]” o “(N-Me-4-F)Phe” se refiere a N-metil-4-fluorofenilalanina; “(m-Cl-homo)Phe” se refiere a meta-cloro-homofenilalanina; “(des-amino)C” se refiere a ácido 3-tiopropiónico; “(alfa-metil)D” se refiere a ácido alfa-metil-L-aspártico; “2Nal” se refiere a 2-naftilalanina; “(3-aminometil)Phe” se refiere a 3-aminometil-L-fenilalanina; “Cle” se refiere a cicloleucina; “Ac-Piran” se refiere a ácido 4-amino-tetrahidropiran-4-carboxílico; “(Lys-C16)” se refiere a N-s-palmitoil-lisina; “(Lys-C12)” se refiere a N-s-laurillisina; “(Lys-C10)” se refiere a N-s-capril-lisina; “(Lys-C8)” se refiere a lisina N-s-caprílica; “[xXilil(y,z)]” se refiere al resto de puente xililo entre dos aminoácidos que contienen tiol en el que x puede ser m, p u o para indicar el uso de meta, para u orto-dibromoxilenos (respectivamente) para generar restos de puente y los identificadores numéricos, y y z, sitúan la posición de aminoácido dentro del polipéptido de los aminoácidos que participan en la ciclación; “[ciclo(y,z)]” se refiere a la formación de un enlace entre dos residuos de aminoácido en el que los identificadores numéricos, y y z, sitúan la posición de los residuos que participan en el enlace; “[ciclo-olefinil(y,z)]” se refiere a la formación de un enlace entre dos residuos de aminoácido mediante metatésis de olefinas en el que los identificadores numéricos, y y z, sitúan la posición de los residuos que participan en el enlace; “[ciclo-tioalquil(y,z)]” se refiere a la formación de un enlace tioéter entre dos residuos de aminoácido en el que los identificadores numéricos, y y z, sitúan la posición de los residuos que participan en el enlace; “[ciclo-triazolil(y,z)]” se refiere a la formación de un anillo de triazol entre dos residuos de aminoácido en el que los identificadores numéricos, y y z, sitúan la posición de los residuos que participan en el enlace. “B20” se refiere a N-s-(PEG2-y-ácido glutámico-N-a-ácido octadecanodioico)lisina [también conocido como ácido (1S,28S)-1-amino-7,16,25,30-tetraoxo-9,12,18,21-tetraoxa-6,15,24,29-tetraazahexatetracontano-1,28,46-tricarboxílico].
B20
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B28
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“K14” se refiere a N-8-1-(4,4-dimetil-2,6-dioxocidohex-1-iliden)-3-metilbutil-L-lisina. Todos los demás símbolos se refieren al código de aminoácidos de una letra convencional.
Anticuerpos
Los compuestos y/o las composiciones pueden comprender anticuerpos o fragmentos de los mismos. Tal como se usa en el presente documento, se hace referencia al término “anticuerpo” en el sentido más amplio y cubre específicamente diversos aspectos incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos monoclonales, anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo anticuerpos biespecíficos formados a partir de al menos dos anticuerpos intactos), y fragmentos de anticuerpo tales como diacuerpos siempre que presenten una actividad biológica deseada. Los anticuerpos también pueden comprender anticuerpos humanos o anticuerpos humanizados. Los anticuerpos son principalmente moléculas basadas en aminoácidos, pero también pueden comprender una o más modificaciones (incluyendo, pero sin limitarse a, la adición de restos de azúcar, restos fluorescentes, etiquetas químicas, etc.).
Tal como se usa en el presente documento el término, “fragmento de anticuerpo” se refiere a cualquier porción de un anticuerpo intacto. En algunos casos, los fragmentos de anticuerpo comprenden regiones de unión a antígeno a partir de anticuerpos intactos. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpo pueden incluir, pero no se limitan a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 y Fv; diacuerpos; anticuerpos lineales; moléculas de anticuerpo de cadena sencilla; y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La digestión con papaína de anticuerpos produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos, denominados fragmentos “Fab”, cada uno con un único sitio de unión a antígeno. También se produce un fragmento “Fc” residual, cuyo nombre refleja su capacidad para cristalizarse fácilmente. El tratamiento con pepsina produce un fragmento F(ab')2 que tiene dos sitios de unión a antígeno y todavía es capaz de reticularse con antígeno. Los compuestos y/o las composiciones pueden comprender uno o más de estos fragmentos. Para los propósitos en el presente documento, un “anticuerpo” puede comprender un dominio variable pesado y ligero así como una región Fc.
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo nativo” se refiere a una glicoproteína habitualmente heterotetramérica de aproximadamente 150.000 Dalton, compuesta por dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada mediante un enlace disulfuro covalente, mientras que el número de enlaces disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulina. Cada cadena pesada y ligera también tiene puentes disulfuro entre cadenas separados regularmente. Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por varios dominios constantes. Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el dominio constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada, y el dominio variable de cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada.
Tal como se usa en el presente documento, el término “dominio variable” se refiere a dominios de anticuerpo específicos que difieren ampliamente en cuanto a la secuencia entre anticuerpos y se usan en la unión y especificidad de cada anticuerpo particular por su antígeno particular.
Tal como se usa en el presente documento, el término “Fv” se refiere a fragmentos de anticuerpo que comprenden sitios completos de reconocimiento de antígeno y unión a antígeno. Estas regiones consisten en un dímero de una cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera en asociación estrecha no covalente.
Tal como se usa en el presente documento, el término “cadena ligera” se refiere a un componente de un anticuerpo de cualquier especie de vertebrado asignado a uno de dos tipos claramente diferenciados, denominados kappa y lambda basándose en secuencias de aminoácidos de dominios constantes.
Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos pueden asignarse a diferentes clases. Hay cinco clases principales de anticuerpos intactos: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y varias de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgA2.
Tal como se usa en el presente documento, el término “Fv de cadena sencilla” o “scFv” se refiere a una proteína de fusión de dominios de anticuerpo de Vh y Vl, en la que estos dominios están unidos entre sí para dar una única cadena de polipéptido. En algunos casos, el grupo de unión de polipéptido de Fv permite que el scFv forme la estructura deseada para unión a antígeno.
Tal como se usa en el presente documento, el término “diacuerpo” se refiere a un fragmento de anticuerpo pequeño con dos sitios de unión a antígeno. Los diacuerpos comprenden un dominio variable de cadena pesada Vh conectado a un dominio variable de cadena ligera Vl en la misma cadena de polipéptido. Usando un grupo de unión que es demasiado corto como para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, se fuerza que los dominios se emparejen con los dominios complementarios de otra cadena y creen dos sitios de unión a antígeno. Se describen diacuerpos más completamente, por ejemplo, en los documentos EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al. (Hollinger, P. et al., “Diabodies”: Small bivalent and bispecific antibody fragments. PNAS. 1993. 90:6444-8).
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo monoclonal” se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población de células sustancialmente homogéneas (o clones), es decir, los anticuerpos individuales que comprende la población son idénticos y/o se unen al mismo epítopo, excepto por posibles variantes que pueden surgir durante la producción de los anticuerpos monoclonales, estando tales variantes generalmente presentes en cantidades minoritarias. A diferencia de preparaciones de anticuerpos policlonales que normalmente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un único determinante en el antígeno.
El modificador “monoclonal” indica el carácter del anticuerpo tal como se obtiene a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe interpretarse como que requiera la producción del anticuerpo mediante ningún método particular. Los anticuerpos monoclonales en el presente documento incluyen anticuerpos “quiméricos” (inmunoglobulinas) en los que una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados a partir de una especie particular o que pertenecen a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la(s) cadena(s) es idéntico u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados a partir de otra especie o que pertenecen a otra clase o subclase de anticuerpo, así como fragmentos de tales anticuerpos.
Tal como se usa en el presente documento, el término “anticuerpo humanizado” se refiere a un anticuerpo quimérico que comprende una porción mínima a partir de una o más fuentes de anticuerpo no humanas (por ejemplo, murina) derivándose el resto a partir de una o más fuentes de inmunoglobulina humanas. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que residuos de la región hipervariable de un anticuerpo del receptor se sustituyen por residuos de la región hipervariable de un anticuerpo de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tiene la especificidad, afinidad y/o capacidad deseadas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “región hipervariable” se refiere a regiones dentro del dominio de unión a antígeno de un anticuerpo que comprenden residuos de aminoácido responsables de la unión a antígeno. Los aminoácidos presentes dentro de las regiones hipervariables determinan la estructura de la región determinante de complementariedad (CDR). Tal como se usa en el presente documento, el término “CDR” se refiere a regiones de anticuerpos que comprenden una estructura que es complementaria a su antígeno o epítopo diana.
Los compuestos y/o las composiciones pueden ser o comprender compuestos miméticos de anticuerpos. Tal como se usa en el presente documento, el término “compuesto mimético de anticuerpo” se refiere a cualquier molécula que imita la función o el efecto de un anticuerpo y que se une específicamente y con alta afinidad a sus dianas moleculares. En algunos casos, los compuestos miméticos de anticuerpos pueden ser monocuerpos, diseñados para incorporar el dominio de fibronectina tipo III (Fn3) como armazón proteico (documentos US 6.673.901 y US 6.348.584). En algunos casos, los compuestos miméticos de anticuerpos pueden incluir los conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitarse a, moléculas de aficuerpos, afilinas, afitinas, anticalinas, avímeros, centirinas, DARPINS™, finómeros, adnectinas y péptidos de domino de Kunitz. En otros casos, los compuestos miméticos de anticuerpos pueden incluir una o más regiones no peptídicas.
Tal como se usa en el presente documento, el término “variante de anticuerpo” se refiere a una biomolécula que se asemeja a un anticuerpo en cuanto a la estructura y/o función que comprende algunas diferencias en su secuencia de aminoácidos, composición o estructura en comparación con un anticuerpo nativo.
En la técnica se conoce la preparación de anticuerpos, ya sean monoclonales o policlonales. En la técnica se conocen bien técnicas para la producción de anticuerpos y se describen, por ejemplo, en Harlow y Lane “Antibodies, A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988 y Harlow y Lane “Using Antibodies: A Laboratory Manual” Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999.
En algunos casos, las secuencias de polipéptido proporcionadas en el presente documento pueden usarse en la producción de uno o más anticuerpos. En algunos casos, tales secuencias de polipéptido pueden incorporarse en dominios variables de anticuerpo. Tales dominios variables pueden incorporarse en anticuerpos, compuestos miméticos de anticuerpos o variantes de anticuerpo.
Moléculas pequeñas
Los compuestos pueden ser moléculas pequeñas. Tales compuestos pueden comprender un tamaño de desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 2000 Dalton (por ejemplo desde aproximadamente 100 hasta aproximadamente 200, hasta aproximadamente 300, hasta aproximadamente 400, hasta aproximadamente 500, hasta aproximadamente 600, hasta aproximadamente 700, hasta aproximadamente 800, hasta aproximadamente 900, hasta aproximadamente 1000, hasta aproximadamente 1100, hasta aproximadamente 1200, hasta aproximadamente 1300, hasta aproximadamente 1400, hasta aproximadamente 1500, hasta aproximadamente 1600, hasta aproximadamente 1700, hasta aproximadamente 1800, hasta aproximadamente 1900 o hasta aproximadamente 2000 Dalton). Las moléculas pequeñas pueden no ser peptídicas o compartir algunas o muchas características de polipéptidos y polipéptidos cíclicos, incluyendo enlaces amida, estructuras cíclicas y sustituyentes de tipo aminoácido.
Aptámeros
Los compuestos pueden comprender aptámeros (Keefe, A.D., Pai, S. y Ellington, A. (2010). Nat. Rev. Drug Discovery 9:537-550). Tal como se usa en el presente documento, el término “aptámero” se refiere a moléculas oligonucleicas o de polipéptido que son capaces de unirse a moléculas diana específicas. Algunos aptámeros pueden adoptar una conformación tridimensional capaz de unirse a tales moléculas diana con alta afinidad y especificidad.
Variaciones isotópicas
Los polipéptidos pueden comprender uno o más átomos que son isótopos. Tal como se usa en el presente documento, el término “ isótopo” se refiere a un elemento químico que tiene uno o más neutrones adicionales. En un caso, los polipéptidos pueden estar deuterados. Tal como se usa en el presente documento, el término “deuterado” se refiere a una sustancia en la que uno o más átomos de hidrógeno se han sustituido por isótopos de deuterio. Los isótopos de deuterio son isótopos de hidrógeno. El núcleo de hidrógeno contiene un protón mientras que los núcleos de deuterio contienen tanto un protón como un neutrón. Los compuestos y las composiciones farmacéuticas pueden estar deuterados con el fin de cambiar una propiedad física, tal como estabilidad, o para permitir que se usen en aplicaciones de diagnóstico y experimentación.
Formulación y administración
El término “composición farmacéutica” se refiere a una composición que comprende al menos un principio activo (por ejemplo, tal como un polipéptido) en una forma y cantidad que permiten que el principio activo sea terapéuticamente eficaz.
Las formulaciones de polipéptido incluyen formulaciones de liberación duodenal controlada, formulaciones de liberación en el tiempo, sistemas de administración de liberación controlada por osmosis, microemulsiones, microesferas, liposomas, nanopartículas, parches, bombas, depósitos de fármaco y similares. Se incluyen específicamente en la presente divulgación formas de dosificación orales sólidas, tales como polvos, geles blandos, cápsulas de gelatina, cápsulas, pastillas y comprimidos.
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse mediante cualquier vía que de cómo resultado un desenlace terapéuticamente eficaz. Estas incluyen, pero no se limitan a, enteral, gastroenteral, epidural, oral, peridural, intracerebral (en el cerebro), intratraqueal (en las vías respiratorias para su administración al pulmón), intracerebroventricular (en los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación sobre la piel), intradérmica (en la propia piel), subcutánea (bajo la piel), administración nasal (a través de la nariz), intravenosa (en una vena), intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardiaca (en el corazón), infusión intraósea (en la médula ósea), intratecal (en el canal espinal), intraperitoneal, (infusión o inyección en el peritoneo), infusión intravesical, intravítrea (en la cámara posterior del ojo), inyección intracavernosa (en la base del pene), administración intravaginal, intrauterina, administración extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para su distribución sistémica), transmucosa (difusión a través de una membrana mucosa), insuflación (inhalación), bucal, sublingual, sublabial, enema, gotas para los ojos (sobre la conjuntiva) o en gotas para los oídos.
En algunos casos, los polipéptidos de la presente divulgación se formulan en una disolución acuosa estéril. En algunos casos, los polipéptidos de la presente divulgación se formulan en una formulación lipídica o no lipídica. En otro caso, los polipéptidos de la presente divulgación se formulan en una formulación lipídica catiónica o no catiónica. En cualquier caso, la disolución acuosa estéril puede contener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes inactivos, también denominados en el presente documento “excipientes”, pueden incluir, pero no se limitan a, sales fisiológicamente compatible, azúcares, agentes de carga, tensioactivos o tampones.
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden comprender o formularse o administrarse junto con uno o más agentes portadores. Tal como se usa en el presente documento, el término “portador” se refiere a una sustancia que ayuda en la administración o mejora la eficacia de los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos. El agente portador puede ser una sustancia que se produce de manera natural, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL), o globulina); hidrato de carbono (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina, o ácido hialurónico); o lípido. La molécula de portador también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen poli-L-lisina (PLL), poli-L-ácido aspártico y poli-L-ácido glutámico, así como polímeros que comprenden los estereoisómeros D de estos aminoácidos. Otros portadores incluyen copolímero de poli(L-lactida-co-glicolida), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(ácido 2-etilacrílico), y polímeros de N-isopropilacrilamida. Otras moléculas de portador útiles pueden identificarse mediante métodos de rutina.
Los compuestos pueden combinarse con uno o más excipientes farmacéuticamente aceptables para formar una composición farmacéutica. Tal como se usa en el presente documento, el término “farmacéuticamente aceptable” se refiere a los compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que, dentro del alcance del criterio médico razonable, son adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación excesiva, proporcional a una razón de riesgo/beneficio razonable. La frase “excipiente farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier componente distinto de los compuestos de la invención descritos en el presente documento (por ejemplo, un vehículo capaz de suspender o disolver el compuesto activo) y que tiene las propiedades de ser sustancialmente no tóxico y no inflamatorio en un paciente. Los excipientes pueden incluir, por ejemplo: antiadherentes, antioxidantes, aglutinantes, recubrimientos, adyuvantes de compresión, disgregantes, tintes (colores), emolientes, emulsionantes, cargas (diluyentes), formadores de película o recubrimientos, aromatizantes, fragancias, deslizantes (potenciadores del flujo), lubricantes, conservantes, tintas de impresión, sorbentes, agentes de suspensión o dispersión, edulcorantes y aguas de hidratación. Los excipientes a modo de ejemplo incluyen, pero no se limitan a: hidroxitolueno butilado (BHT), carbonato de calcio, fosfato de calcio (dibásico), estearato de calcio, croscarmelosa, polivinilpirrolidona reticulada, ácido cítrico, crospovidona, cisteína, etilcelulosa, gelatina, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, lactosa, estearato de magnesio, maltitol, manitol, metionina, metilcelulosa, metilparabeno, celulosa microcristalina, polietilenglicol, polivinilpirrolidona, povidona, almidón pregelatinizado, propilparabeno, palmitato de retinilo, goma laca, dióxido de silicio, carboximetilcelulosa de sodio, citrato de sodio, glicolato sódico de almidón, sorbitol, almidón (de maíz), ácido esteárico, sacarosa, talco, dióxido de titanio, vitamina A, vitamina E, vitamina C y xilitol. En algunos casos, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más principios activos de polipéptido junto con etanol, mono, di, triglicéridos de aceite de maíz, aceite de ricino hidrogenado, DL-tocoferol, propilenglicol, gelatina, glicerol, colorantes, aromatizantes y edulcorantes.
En otros casos, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más principios activos de polipéptido junto con un agente de administración tal como ácido 4-(2-hidroxi-4-metoxibenzamido)butanoico (o cualquiera de los agentes de administración descritos en la patente estadounidense número 7.744.910B2), un tampón farmacéuticamente aceptable, un disgregante, un detergente, hidroxipropilmetilcelulosa, colorantes, aromatizantes y edulcorantes.
En otros casos, las composiciones farmacéuticas comprenden uno o más principios activos de polipéptido junto con etanol, fosfatidilcolina de soja, diolato de glicerol que se inyecta en un exceso de solución salina tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense 2008/0146490A1.
La administración de uno o más polipéptidos a un sujeto que lo necesita puede lograrse de varias maneras diferentes. La administración in vivo puede realizarse directamente administrando una composición que comprende uno o más polipéptidos a un sujeto. Alternativamente, la administración puede realizarse indirectamente administrando uno o más vectores que codifican para, y dirigen la expresión de, los polipéptidos.
La administración local evita la permeabilidad en el intestino y la exposición sistémica. Por ejemplo, los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden usarse en el ojo como gota o en la sección posterior del ojo mediante inyección directa. Pueden aplicarse en el intestino para seleccionar enzimas como diana. Pueden usarse de manera tópica en aplicaciones dermatológicas (por ejemplo, cremas, pomadas, parches transdérmicos).
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden comprender o formularse con uno o más agentes fusogénicos. Tal como se usa en el presente documento, el término “agente fusogénico” se refiere a un agente que es sensible a cambios, tales como cambios de pH en el entorno, por ejemplo. Tras encontrarse con el pH de un endosoma, un agente fusogénico puede provocar un cambio físico, por ejemplo, un cambio en las propiedades osmóticas que altera o aumenta la permeabilidad de la membrana de endosoma. Preferiblemente, el agente fusogénico se carga, por ejemplo, se protona, a un pH inferior al intervalo fisiológico. Por ejemplo, el agente fusogénico puede protonarse a pH 4,5-6,5. Un agente fusogénico puede servir para liberar un polipéptido en el interior del citoplasma de una célula tras captarse una composición, por ejemplo, mediante endocitosis, por la célula, aumentando así la concentración celular del polipéptido en la célula.
En algunos casos, los agentes fusogénicos pueden tener un resto, por ejemplo, un grupo amino, que, cuando se expone a un intervalo de pH especificado, experimentará un cambio, por ejemplo, de carga, por ejemplo, protonación. Los cambios de carga de los agentes fusogénicos pueden desencadenar cambios, por ejemplo, cambios osmóticos, en vesículas, por ejemplo, vesículas endocíticas, por ejemplo, endosomas. Por ejemplo, el agente fusogénico, tras exponerse al entorno de pH de un endosoma, provocará un cambio de solubilidad u osmótico lo bastante sustancial como para aumentar la porosidad (preferiblemente, hasta la ruptura) de la membrana endosómica.
Los agentes fusogénicos pueden ser polímeros, preferiblemente cadenas de poliamino, por ejemplo, polietilenimina (PEI). La PEI puede ser lineal, ramificada, sintética o natural. La PEI puede ser, por ejemplo, PEI sustituida con alquilo, o PEI sustituida con lípido.
En otros casos, los agentes pueden ser polihistidina, poliimidazol, polipiridina, polipropilenimina, melitina, o sustancias de poliacetal, por ejemplo, poliacetales catiónicos. En algunos casos, los agentes fusogénicos pueden tener una estructura de hélice alfa. Los agentes fusogénicos pueden ser agentes que alteran la membrana, por ejemplo, melitina. Un experto en la técnica puede someter a prueba e identificar otros agentes fusogénicos adecuados.
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden comprender o formularse con uno o más agentes de condensación. Los agentes de condensación de composiciones descritas en el presente documento pueden interaccionar con (por ejemplo, atraer, retener o unirse a) polipéptidos y actuar para (a) condensar, por ejemplo, reducir el tamaño o la carga de polipéptidos y/o (b) proteger polipéptidos, por ejemplo, proteger polipéptidos frente a la degradación. Los agentes de condensación pueden incluir un resto, por ejemplo, un resto cargado, que puede interaccionar con polipéptidos mediante interacciones iónicas. Los agentes de condensación serán preferiblemente polímeros cargados, por ejemplo, cadenas policatiónicas. Los agentes de condensación pueden ser polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, compuesto peptidomimético-poliamina, dendrímeropoliamina, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliamina, o un péptido de hélice alfa.
Los polipéptidos pueden ser polipéptidos bicíclicos. Tal como se usa en el presente documento, el término “polipéptido bicíclico” se refiere a un polipéptido con dos bucles. Como ejemplo no limitativo, pueden producirse los inhibidores de C5 de polipéptido bicíclico en bibliotecas combinatorias. Los polipéptidos bicíclicos pueden tener 2, 3, 4, 5, 6 o más aminoácidos por bucle.
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden proporcionarse como profármacos. Tal como se usa en el presente documento, el término “profármaco” se refiere a un fármaco que se proporciona en una forma inactiva que se vuelve activa en algún punto tras la administración. En algunos casos en los que se administran polipéptidos en forma de un profármaco, los aminoácidos críticos para la actividad inhibidora de polipéptido no están disponibles para su interacción con la diana debido a un enlace químico reversible, por ejemplo, un enlace éster. Tras la administración, tales profármacos pueden someterse a escisión del enlace químico reversible, por ejemplo, mediante hidrólisis enzimática o ácida en el estómago, la sangre y/o células de un tejido diana dado.
Inhibidores de C5
Algunos polipéptidos y/o composiciones de polipéptidos inhiben la activación del complemento a nivel del componente C5 del complemento, denominados en el presente documento “ inhibidores de C5”. Algunos inhibidores de C5 funcionan evitando la escisión de C5 para dar los productos de escisión C5a y C5b, tales inhibidores se denominan en el presente documento “ inhibidores de la escisión de C5”. En casos, los métodos de la presente divulgación pueden comprender inhibir la escisión de C5 en un sistema. Tal como se usa en el presente documento, un “sistema” se refiere a un grupo de partes relacionadas que funcionan en conjunto. Tales sistemas incluyen los que comprenden C5, denominados en el presente documento “sistemas de C5”. Los sistemas de C5 pueden incluir, pero no se limitan a, disoluciones, matrices, células, tejidos, órganos y líquidos corporales (incluyendo, pero sin limitarse a, sangre). En algunos casos, los sistemas de C5 pueden ser sistemas celulares. Tal como se usa en el presente documento el término “sistema celular” se refiere a un sistema que comprende una o más células o uno o más componentes o productos de una célula. En algunos casos, los sistemas de C5 pueden incluir sistemas in vivo, sistemas in vitro y sistemas ex vivo. Los sistemas de C5 in vivo pueden comprender o estar comprendidos en un sujeto.
Los inhibidores de C5 pueden incluir cualquiera de los polipéptidos indicados en la tabla 1.
Tabla 1. Compuestos
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En sistemas de C5, C5 y otros componentes de sistema pueden estar en disolución o pueden estar fijados, tal como en un pocilio de ensayo. Los sistemas de C5 pueden comprender además otros componentes de complemento, incluyendo en algunos casos todos los componentes necesarios para formar el complejo de ataque a membrana (MAC). En algunos casos, los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden usarse para inhibir la escisión de C5 en un sujeto humano. Tales polipéptidos y/o composiciones de polipéptidos pueden encontrar utilidad en el tratamiento de diversos trastornos y/o enfermedades relacionados con el complemento así como estados inflamatorios acompañantes. En la técnica se conocen determinados inhibidores de C5 y se enseñan en las patentes estadounidenses n.os 7.348.401 y 6.355.245.
La escisión de C5 proporciona los productos proteolíticos C5a y C5b. El sitio de escisión de C5 que se escinde para proporcionar estos productos se denomina en el presente documento sitio de escisión de C5a-C5b. C5b contribuye a la formación del complejo de ataque a membrana (MAC) mientras que C5a estimula el sistema inmunitario y la respuesta inflamatoria. En algunos casos, los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos evitan la escisión de C5 y por tanto pueden ser útiles en el tratamiento de inflamación mediante la inhibición de acontecimientos inflamatorios incluyendo, pero sin limitarse a, quimiotaxia y activación de células inflamatorias (por ejemplo macrófagos, mastocitos, neutrófilos y plaquetas), proliferación de células endoteliales y edema.
Muchos de los componentes del sistema del complemento, incluyendo, pero sin limitarse a, C3, C4 y C5, son funcionalmente inertes en su estado nativo hasta que se seleccionan como diana para su escisión para dar múltiples componentes activos. La escisión de C3 o C4 provoca un cambio conformacional que expone un dominio de tioéster interno. Dentro del dominio, un enlace tioéster interno entre cadenas laterales de residuos de cisteína y glutamina es un enlace químicamente lábil que confiere la capacidad a C3 y C4 de unirse a la superficie celular y/o moléculas biológicas. La escisión de C3 y C4 también proporciona los componentes de la C5 convertasa, o bien C3bC4bC2a o bien (C3b)2Bb. (Law, S.K., et al. (1997). Protein Science. 6:263-274; van den Elsen, J.M.H., (2002). J. Mol. Biol.
322:1103-1115).
La estructura de múltiples dominios de C5 es similar a C3 y C4. La C5 convertasa escinde C5 para dar los componentes C5a y C5b. La escisión de C5 provoca un cambio conformacional que expone el dominio de tipo tioéster de C5b, que desempeña un papel en la unión de C5 a C6, seguido por interacciones con C7 y C8 para formar el MAC citolítico. Las estructuras de dominio de C5 comprenden características reguladoras que son críticas para el procesamiento y la actividad posterior del complemento. (Fredslund, F. et al. (2008). Nature. 9:753-760; Hadders, M.A. et al. (2012). Cell Reports. 1:200-207).
Los compuestos pueden unirse a C5 y evitar la escisión de C5 para dar los productos de escisión C5a y C5b.
Recientemente, se propuso un nuevo paradigma para la activación del complemento, basado en el descubrimiento de que la trombina genera productos de C5 no identificados anteriormente que soportan la ruta de activación del complemento terminal (Krisinger, et al., (2014). Blood. 120(8): 1717-1725).
La trombina actúa en la cascada de coagulación, un proceso basado en segunda circulación mediante el cual los organismos, en respuesta a una lesión, son capaces de limitar la hemorragia, restaurar la integridad vascular, y fomentar la curación. Tras un daño a un vaso, se expone factor tisular a la circulación, desencadenando una cascada de reacciones proteolíticas que conduce a la generación de la enzima de coagulación central, trombina, que convierte fibrinógeno en un coágulo de fibrina.
Históricamente, la ruta de activación del complemento se ha considerado de manera independiente de la cascada de coagulación; sin embargo, la interacción de estos dos sistemas merece una consideración renovada. La coagulación y el complemento se activan de manera coordinada de una manera espaciotemporal solapada en respuesta a estímulos fisiopatológicos comunes para mantener la homeostasis, y surge la enfermedad cuando hay una activación descontrolada de las respuestas inmunitaria y de coagulación innatas, tal como se demuestra, por ejemplo, por la aterosclerosis, accidente cerebrovascular, cardiopatía coronaria, diabetes, lesión por isquemia-reperfusión, traumatismo, hemoglobinuria paroxística nocturna, degeneración macular relacionada con la edad, y síndrome urémico hemolítico atípico. De hecho, se ha encontrado que la introducción de inhibidores del complemento trata simultáneamente las alteraciones inflamatorias y trombóticas asociadas con algunos de estos trastornos.
Tal como se indicó anteriormente, el sistema del complemento se activa mediante tres rutas principales, convergiendo todas ellas con la activación proteolítica del componente C3 del complemento central. Posteriormente, la formación de C5 convertasas da como resultado la escisión de C5 en la arginina 751 (R751) para liberar un fragmento C5a quimiotáctico y anafilatóxico y generar C5b. C5b es el factor de iniciación para el ensamblaje del complejo de ataque a membrana (MAC; también conocido como C5b-9) lítico dependiente de C5b, responsable de destruir células dañadas y patógenos.
Se han identificado varias conexiones moleculares entre el complemento y la coagulación. De la manera más notable, en lo que se describió como una nueva ruta de activación del complemento, se encontró que la trombina era capaz de fomentar directamente la activación de complemento escindiendo C5, supuestamente en R751, liberando así C5a en ausencia de C3 (Huber-Lang, et al., 2006. Nature Med. 12(6):682-687). Sin embargo, estos estudios no compararon la trombina con la C5 convertasa auténtica, y sólo se realizaron análisis bioquímicos limitados; por tanto, no pudo evaluarse la relevancia fisiológica de la ruta.
Usando sistemas purificados y basados en plasma, se evaluaron los efectos de trombina y C5 convertasa sobre C5 midiendo la liberación de la anafilatoxina C5a y la generación de C5b, componente de MAC. Se descubrió que, aunque la trombina escindía C5 escasamente en R751, produciendo una cantidad mínima de C5a y C5b, escindía C5 eficazmente en un sitio R947 recién identificado y altamente conservado, generando productos intermedios no descritos anteriormente C5t y C5bj. La coagulación de plasma inducida por factor tisular condujo a la proteolisis de C5 en un sitio sensible a trombina correspondiente a este nuevo sitio R947 y no R751. El tratamiento combinado de C5 con trombina y C5 convertasa produjo C5a y C5bT, formando este último un complejo de ataque a membrana C5bT-9 con significativamente más actividad lítica que con C5b-9. Por tanto, se ha propuesto un nuevo paradigma para la activación del complemento, en el que la trombina es una pareja invariable y crítica con C5 convertasa en el inicio de la formación de un MAC más activo mediante la formación de productos de C5 no identificados anteriormente que se generan mediante proteolisis colaborativa mediante las dos enzimas. Estos descubrimientos proporcionan nuevos conocimientos sobre la regulación de inmunidad innata en el contexto de activación de la coagulación que se produce en muchas enfermedades (Krisinger, et al., (2014). Blood. 120(8): 1717-1725).
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden inhibir la activación del complemento inducida por trombina. Tales polipéptidos y/o composiciones de polipéptidos pueden usarse por tanto para tratar la hemólisis resultante de la activación del complemento inducida por trombina.
Dados los hallazgos de conexiones moleculares entre las rutas del complemento y de coagulación, se cree que el complemento puede activarse mediante componentes adicionales de las cascadas de coagulación y/o inflamación. Por ejemplo, otras serina proteasas con especificidad de sustrato ligeramente diferente pueden actuar de una manera similar. Huber-Lang et al. (2006) mostraron que la trombina no sólo escindía C5 sino también C3a generado in vitro cuando se incuba con C3 nativo (Huber-Lang, et al., 2006. Nature Med. 12(6):682-687). De manera similar, se ha encontrado que otros componentes de la ruta de coagulación, tales como FXa, FXIa y plasmina, escinden tanto C5 como C3.
Específicamente, en un mecanismo similar al observado mediante activación de trombina, se ha observado que la plasmina, FXa, FIXa y FXIa son capaces de escindir C5 para generar C5a y C5b (Amara, et al., (2010). J. Immunol.
185: 5628-5636; Amara, et al., (2008) “Interaction Between the Coagulation and Complement System” en Current Topics in Complement II, J.D. Lambris (ed.), págs. 71-79). Se encontró que las anafilatoxinas producidas eran biológicamente activas tal como se muestra mediante una respuesta quimiotáctica dependiente de la dosis de neutrófilos y células HMC-1, respectivamente. La actividad de escisión inducida por plasmina pudo bloquearse de una manera dependiente de la dosis mediante el inhibidor de serina proteasa, aprotinina y leupeptina. Estos hallazgos sugieren que diversas serina proteasas pertenecientes al sistema de coagulación son capaces de activar la cascada del complemento de manera independiente de las rutas establecidas. Además, se generan C5a y C3a funcionales (tal como se detecta mediante inmunotinción y ELISA), ambos de los cuales se sabe que están implicados de manera crucial en la respuesta inflamatoria.
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden inhibir la activación de C5 mediante plasmina, FXa, FIXa, FXIa y otras proteasas de la ruta de coagulación.
Desde hace mucho tiempo se ha sabido que la elastasa leucocitaria humana (HLE), una enzima secretada por neutrófilos y macrófagos durante procesos inflamatorios, también libera a partir de C5 un fragmento quimiotáctico similar a C5a. Sin embargo, este fragmento similar a C5a no es idéntico a C5a, dado que HLE no escinde enlaces peptídicos en el sitio de escisión que escinde habitualmente C5 para dar C5a y C5b tras la exposición a las convertasas del complemento. En vez de eso, se ha encontrado que la escisión de complemento C5 mediante HLE también genera una molécula similar a C5b funcionalmente activa que es capaz de participar en la formación de MAC (Vogt, (1999). Immunobiology. 201:470-477).
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden inhibir la activación de C5 mediante HLE y otras proteasas de la cascada de inflamación.
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, trastornos y/o estados en los que la escisión de c 5 conduce a la progresión de la enfermedad, trastorno y/o estado. Tales enfermedades, trastornos y/o estados pueden incluir, pero no se limitan a, enfermedades, trastornos y/o estados inmunitarios y autoinmunitarios, neurológicos, cardiovasculares, pulmonares y oculares. Las enfermedades y/o los trastornos inmunitarios y autoinmunitarios pueden incluir, pero no se limitan a, encefalomielitis diseminada aguda (ADEM), leucoencefalitis hemorrágica necrotizante aguda, enfermedad de Addison, agammaglobulinemia, alopecia areata, amiloidosis, espondilitis anquilosante, rechazo agudo mediado por anticuerpos tras trasplante de órgano, nefritis anti-GBM/anti-TBM, síndrome antifosfolípidos (APS), angioedema autoinmunitario, anemia aplásica autoinmunitaria, disautonomía autoinmunitaria, hepatitis autoinmunitaria, hiperlipidemia autoinmunitaria, inmunodeficiencia autoinmunitaria, enfermedad del oído interno autoinmunitaria (AIED), miocarditis autoinmunitaria, pancreatitis autoinmunitaria, retinopatía autoinmunitaria, púrpura trombocitopénica autoinmunitaria (ATP), enfermedad tiroidea autoinmunitaria, urticaria autoinmunitaria, neuropatías axonal y neuronal, septicemia bacteriana y choque séptico, enfermedad de Balo, enfermedad de Behcet, penfigoide ampolloso, cardiomiopatía, enfermedad de Castleman, enfermedad celiaca, enfermedad de Chagas, síndrome de fatiga crónica, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica (CIDP), osteomielitis multifocal recurrente crónica (CRMO), síndrome de Churg-Strauss, penfigoide cicatricial/penfigoide mucoso benigno, enfermedad de Crohn, síndrome de Cogans, enfermedad de aglutininas frías, bloqueo cardiaco congénito, miocarditis de Coxsackie, enfermedad de CREST, crioglobulinemia mixta esencial, neuropatías desmielinizantes, dermatitis herpetiforme, dermatomiositis, enfermedad de Devic (neuromielitis óptica), diabetes tipo I, lupus discoide, síndrome de Dressler, endometriosis, esofagitis eosinófila, fascitis eosinófila, eritema nodoso, encefalomielitis alérgica experimental, síndrome de Evans, fibromialgia, alveolitis fibrosante, arteritis de células gigantes (arteritis temporal), glomerulonefritis, síndrome de Goodpasture, granulomatosis con poliangitis (GPA) véase enfermedad de Wegener, de Graves, síndrome de Guillain-Barre, encefalitis de Hashimoto, tiroiditis de Hashimoto, anemia hemolítica (incluyendo síndrome urémico hemolítico atípico y síndrome urémico hemolítico atípico resistente a terapia con plasma), púrpura de Henoch-Schonlein, herpes gestacional, hipogammaglobulinemia, púrpura trombocitopénica idiopática (ITP), nefropatía de IgA, enfermedad esclerosante relacionada con IgG4, lipoproteínas inmunorreguladoras, miositis por cuerpos de inclusión, diabetes dependiente de insulina (tipo 1), cistitis intersticial, artritis juvenil, diabetes juvenil, síndrome de Kawasaki, síndrome de Lambert-Eaton, vasculopatía de vasos grandes, vasculitis leucocitoclástica, liquen plano, liquen escleroso, conjuntivitis lignea, enfermedad de IgA lineal (LAD), lupus (SLE), enfermedad de Lyme, enfermedad de Meniere, poliangitis microscópica, enfermedad de tejido conjuntivo mixta (MCTD), úlcera de Mooren, enfermedad de Mucha-Habermann, síndromes de neoplasia endocrina múltiple, esclerosis múltiple, neuropatía motora multifocal, miositis, miastenia grave, narcolepsia, neuromielitis óptica (de Devic), neutropenia, penfigoide cicatricial ocular, neuritis óptica, osteoartritis, reumatismo palindrómico, PANDAS (trastornos neuropsiquiátricos autoinmunitarios pediátricos asociados con estreptococos), degeneración cerebelar paraneoplásica, hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH), síndrome de Parry Romberg, síndrome de Parsonnage-Turner, pars plana (uveítis periférica), pénfigo, neuropatía periférica, encefalomielitis perivenosa, anemia perniciosa, síndrome de POEMS, poliarteritis nodosa, síndromes poliglandulares autoinmunitarios tipo I, II y III, poliendocrinopatías, polimialgia reumática, polimiositis, síndrome tras infarto de miocardio, síndrome pospericardiotomía, dermatitis por progesterona, cirrosis biliar primaria, colangitis esclerosante primaria, psoriasis, artritis psoriásica, fibrosis pulmonar idiopática, pioderma gangrenoso, aplasia pura de glóbulos rojos, fenómeno de Raynauds, artritis reactiva, distrofia simpática refleja, síndrome de Reiter, policondritis recidivante, síndrome de piernas inquietas, fibrosis retroperitoneal, fiebre reumática, artritis reumatoide, sarcoidosis, síndrome de Schmidt, escleritis, escleroderma, síndrome urémico hemolítico por Escherichia Coli productora de toxina Shiga (STEC-HUS), síndrome de Sjogren, vasculopatía de vasos pequeños, autoinmunidad de espermatozoides y testicular, síndrome de la persona rígida, endocarditis bacteriana subaguda (SBE), síndrome de Susac, oftalmia simpática, arteritis de Takayasu, arteritis temporal/arteritis de células gigantes, púrpura trombocitopénica (TTP), síndrome de Tolosa-Hunt, mielitis transversal, trastorno autoinmunitario tubular, colitis ulcerosa, enfermedad de tejido conjuntivo indiferenciado (UCTD), uveítis, dermatosis vesiculoampollosa, vasculitis, vitíligo y granulomatosis de Wegener (también conocida como granulomatosis con poliangitis (GPA)). Las enfermedades, los trastornos y/o estados neurológicos pueden incluir, pero no se limitan a, enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, demencia de cuerpos de Lewy y esclerosis múltiple. Las enfermedades, los trastornos y/o estados cardiovasculares pueden incluir, pero no se limitan a, aterosclerosis, infarto de miocardio, accidente cerebrovascular, vasculitis, traumatismo y estados que surgen de intervención cardiovascular (incluyendo, pero sin limitarse a, cirugía de derivación cardiaca, injerto arterial y angioplastia). Las enfermedades, los trastornos y/o estados pulmonares pueden incluir, pero no se limitan a, asma, fibrosis pulmonar, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y síndrome de dificultad respiratoria del adulto. Las aplicaciones relacionadas con los ojos incluyen, pero no se limitan a: degeneración macular relacionada con la edad, conjuntivitis papilar gigante y alérgica, enfermedad de Behcet, inflamación coroidea, complicaciones relacionadas con cirugía intraocular, rechazo de trasplante de córnea, úlceras en la córnea, retinitis por citomegalovirus, síndrome de ojo seco, endoftalmitis, enfermedad de Fuch, glaucoma, vasculitis de complejo inmunitario, conjuntivitis inflamatoria, enfermedad isquémica de la retina, queratitis, edema macular, infestación/migración parasitaria ocular, retinitis pigmentosa, escleritis, enfermedad de Stargardt, fibrosis subretiniana, uveítis, inflamación retiniana del cristalino y enfermedad de Vogt-Koyanagi-Harada.
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden ser particularmente útiles en el tratamiento de pacientes con PNH que muestran una escasa respuesta frente a terapias con anticuerpos monoclonales, tales como terapia con ECULIZUMAB®, debido a mutaciones en el gen de C5 que evitan la unión del anticuerpo a C5 (Nishimura, J-I. (2012). 54th ASH Annual Meeting, Abstract 3197).
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos pueden ser útiles en el tratamiento de enfermedades, trastornos y/o estados infecciosos, por ejemplo, en un sujeto que tiene una infección. En algunos casos, el sujeto tiene una infección y corre el riesgo de desarrollar septicemia o un síndrome séptico. Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos de la presente divulgación son particularmente útiles en el tratamiento de septicemia.
Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos también pueden administrarse para mejorar el desenlace de intervenciones clínicas en los que se desea la inhibición del complemento. Tales intervenciones pueden incluir, pero no se limitan a, injerto, trasplante, implantación, cateterización, intubación y similares. Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos se usan para recubrir dispositivos, materiales y/o biomateriales usados en tales intervenciones. En algunos casos, la superficie interna de un tubo puede recubrirse con polipéptidos y/o composiciones de polipéptidos para evitar la activación del complemento dentro de un líquido corporal que pasa a través del tubo, o bien in vivo o bien ex vivo, por ejemplo, derivación extracorpórea, por ejemplo, diálisis y derivación cardiaca.
En algunos casos, los polipéptidos de la divulgación se unen a C5 con una estequiometría 1:1. En algunos casos, los polipéptidos de la divulgación inhiben a través de un mecanismo alostérico o bloqueando la unión de convertasa.
En algunos casos, los polipéptidos de la divulgación inhiben la escisión de C5 en pacientes con PNH con polimorfismos de C5 resistentes a e Cu LIZUMAB®.
II. Métodos de uso
En el presente documento se divulgan métodos de uso de los compuestos (por ejemplo, cualquiera de los compuestos enumerados en la tabla 1) o las composiciones para reducir la escisión de C5 y las consecuencias posteriores incluyendo, pero sin limitarse a, activación del complemento, lisis celular, lisis de glóbulos rojos (también denominada en el presente documento “hemólisis”). En algunos casos, tales métodos pueden incluir la reducción de la escisión de C5 in vitro o in vivo. En algunos casos, tales métodos pueden llevarse a cabo en un sistema biológico, en un ensayo o en un sujeto.
La escisión de C5, la activación del complemento o la hemólisis puede reducirse por consiguiente desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 5%, desde aproximadamente el 2% hasta aproximadamente el 10%, desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 20%, desde aproximadamente el 10% hasta aproximadamente el 30%, desde aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 50%, desde aproximadamente el 25% hasta aproximadamente el 75%, desde aproximadamente el 30% hasta aproximadamente el 60%, desde aproximadamente el 50% hasta aproximadamente el 75%, desde aproximadamente el 50% hasta aproximadamente el 90%, desde aproximadamente el 50% hasta aproximadamente el 95%, desde aproximadamente el 75% hasta aproximadamente el 100%, desde aproximadamente el 80% hasta aproximadamente el 100%, desde aproximadamente el 85% hasta aproximadamente el 95% o desde aproximadamente el 90% hasta aproximadamente el 100%. Tales reducciones pueden evaluarse examinando los niveles de uno o más productos de escisión de C5 (por ejemplo, proteínas C5a o C5b). En tales casos, los niveles de productos de escisión pueden compararse con los niveles en una muestra, un sujeto o un sistema de control no tratado o una medición inicial, y puede determinarse la diferencia en porcentaje. Tales productos de escisión pueden medirse, en algunos casos, mediante inmunoensayo (por ejemplo, EIA o ELISA). De manera similar, pueden medirse los acontecimientos posteriores de la escisión de C5 y compararse con una muestra, un sujeto o un sistema de control no tratado o una medición inicial. En algunos casos, tales acontecimientos pueden incluir la formación del complejo de ataque a membrana (MAC). La formación de MAC puede medirse mediante ELISA (por ejemplo, WIESLAB® ELISA, Euro Diagnostica, Malmo, Suecia). En algunos casos, la hemólisis puede medirse de manera espectrofotométrica (por ejemplo, observando la densidad óptica a una longitud de onda de aproximadamente 412 nm) para detectar la liberación de hemoglobina a partir de células sanguíneas rotas.
Los métodos de la divulgación incluyen métodos de reducción de la escisión de C5 en un sistema biológico que comprenden proporcionar un polipéptido de la divulgación. En algunos casos, tal reducción se evalúa mediante comparación con un sistema de control no tratado. La reducción en la escisión de C5 puede incluir reducciones de al menos el 1%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 50%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100%. Según tales métodos, los polipéptidos pueden proporcionarse a concentraciones de desde aproximadamente 0,001 nM hasta aproximadamente 5 nM, desde aproximadamente 0,01 nM hasta aproximadamente 10 nM, desde aproximadamente 0,1 nM hasta aproximadamente 50 nM, desde aproximadamente 1 nM hasta aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 20 nM hasta aproximadamente 200 nM o desde aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 10.000 nM.
Los métodos de la divulgación incluyen métodos de reducción de la hemólisis en un sistema biológico que comprenden proporcionar un polipéptido de la divulgación. En algunos casos, tal reducción se evalúa mediante comparación con un sistema de control no tratado. La reducción en la hemólisis puede incluir reducciones de al menos el 1%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 50%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100%. Según tales métodos, los polipéptidos pueden proporcionarse a concentraciones de desde aproximadamente 0,001 nM hasta aproximadamente 5 nM, desde aproximadamente 0,01 nM hasta aproximadamente 10 nM, desde aproximadamente 0,1 nM hasta aproximadamente 50 nM, desde aproximadamente 1 nM hasta aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 20 nM hasta aproximadamente 200 nM o desde aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 10.000 nM.
Los métodos de la divulgación incluyen métodos de reducción de la hemólisis en un sujeto en relación con los niveles de hemólisis previamente observados en el sujeto. La reducción en la hemólisis puede incluir reducciones de al menos el 1%, al menos el 5%, al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 50%, al menos el 75%, al menos el 80%, al menos el 85%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98%, al menos el 99% o el 100%. En algunos casos, las reducciones en la hemólisis pueden incluir reducciones de desde aproximadamente el 1% hasta aproximadamente el 10%, desde aproximadamente el 5% hasta aproximadamente el 25%, desde aproximadamente el 20% hasta aproximadamente el 60%, desde aproximadamente el 40% hasta aproximadamente el 80%, desde aproximadamente el 50% hasta aproximadamente el 95% o desde aproximadamente el 60% hasta el 100%. Según tales métodos, los polipéptidos pueden proporcionarse a concentraciones que incluyen, pero no se limitan a, desde aproximadamente 0,001 nM hasta aproximadamente 5 nM, desde aproximadamente 0,01 nM hasta aproximadamente 10 nM, desde aproximadamente 0,1 nM hasta aproximadamente 50 nM, desde aproximadamente 1 nM hasta aproximadamente 100 nM, desde aproximadamente 20 nM hasta aproximadamente 200 nM o desde aproximadamente 100 nM hasta aproximadamente 10.000 nM. En algunos casos, los polipéptidos pueden administrarse a sujetos humanos usando dosis que incluyen, pero no se limitan a, desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 2 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg o desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg. En algunos casos, las concentraciones de polipéptido usadas para la administración pueden variarse para lograr un nivel deseado del polipéptido en el plasma del sujeto que recibe el polipéptido. En algunos casos, los niveles en plasma deseados de polipéptidos pueden incluir, pero no se limitan a, desde aproximadamente 0,001 |iM hasta aproximadamente 2 |iM, desde aproximadamente 0,01 |iM hasta aproximadamente 3 |iM, desde aproximadamente 0,1 |iM hasta aproximadamente 20 |iM o desde aproximadamente 1 |iM hasta aproximadamente 50 |iM.
Indicaciones terapéuticas
La divulgación se refiere en particular al uso de polipéptido (por ejemplo, compuestos peptidomiméticos y polipéptidos cíclicos) y composiciones que contienen al menos un polipéptido, para el tratamiento de un trastorno, un estado o una enfermedad. En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar a sujetos que padecen hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH). Los sujetos con PNH son incapaces de sintetizar versiones funcionales de las proteínas reguladoras del complemento CD55 y CD59 en células madre hematopoyéticas. Esto da como resultado la hemólisis mediada por el complemento y una variedad de complicaciones posteriores. Otros trastornos y enfermedades relacionados con el complemento incluyen, pero no se limitan a, enfermedades y trastornos autoinmunitarios, enfermedades y trastornos neurológicos, enfermedades y trastornos de la sangre y enfermedades y trastornos infecciosos. Evidencias experimentales sugieren que muchos trastornos relacionados con el complemento se alivian mediante la inhibición de la actividad del complemento.
Los tratamientos actuales para PNH incluyen el uso de ECULIZUMAB® (Alexion Pharmaceuticals, Cheshire, CT). En algunos casos, ECULIZUMAB® puede ser ineficaz debido a la mutación en C5, semivida corta, reacción inmunitaria u otro motivo. Los métodos de la divulgación incluyen métodos de tratamiento de sujetos con PNH, en los que tales sujetos se han tratado previamente con ECULIZUMAB®. En algunos casos, ECULIZUMAB® es ineficaz en tales pacientes, haciendo que el tratamiento con polipéptidos sea importante para el remedio terapéutico. En algunos casos, los polipéptidos se administran simultáneamente o junto con terapia con ECULIZUMAB®. En tales casos, tales sujetos pueden experimentar uno o más efectos beneficiosos de tal tratamiento combinado, incluyendo, pero sin limitarse a, remedio más eficaz, remedio más rápido o menos efectos secundarios.
Una mutación adquirida en el gen de biosíntesis de anclaje de glicano de fosfatidilinositol, clase A (PIG-A), que se origina a partir de una célula madre hematopoyética multipotente, da como resultado una enfermedad poco frecuente conocida como hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) (Pu, J.J. et al., Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria from bench to bedside. Clin Transl Sci. junio de 2011; 4 (3): 219-24). La PNH se caracteriza por trastorno de médula ósea, anemia hemolítica y trombosis. El producto génico de PIG-A es necesario para la producción de un anclaje de glicolípidos, glicosilfosfatidilinositol (GPI), usado para anclar proteínas a la membrana plasmática. Dos proteínas reguladoras del complemento, CD55 y CD59, se vuelven no funcionales en ausencia de GPI. Esto conduce a la destrucción mediada por el complemento de estas células. Los polipéptidos y/o las composiciones de polipéptidos de la presente divulgación son particularmente útiles en el tratamiento de PNH.
Los métodos de la divulgación incluyen métodos de reducción de la hemólisis en sujetos con PNH. Tales métodos pueden incluir administrar los polipéptidos a tales sujetos. Según tales métodos, los polipéptidos pueden administrarse a dosis que incluyen, pero no se limitan a, desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta aproximadamente 1 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 2 mg/kg, desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 1 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg o desde aproximadamente 5 mg/kg hasta aproximadamente 50 mg/kg. Los métodos adicionales pueden incluir dosis individuales o múltiples dosis. En casos en los que se administran múltiples dosis, la administración puede incluir, pero no se limita a, administración diaria, semanal, mensual o anual.
Tal como se usan en el presente documento, los términos “tratar”, “tratamiento” y similares se refieren al remedio o alivio de procesos patológicos. En el contexto de la presente invención, en la medida en que se refieren a cualquiera de los demás estados mencionados a continuación en el presente documento, los términos “tratar”, “tratamiento” y similares significan remediar o aliviar al menos un síntoma asociado con tal estado, o ralentizar o revertir la progresión o progresión prevista de tal estado, tal como ralentizar la progresión de un tumor maligno o cáncer, o aumentar el aclaramiento de un organismo infeccioso para aliviar/reducir los síntomas provocados por la infección, por ejemplo, hepatitis provocada por infección por un virus de hepatitis o reducir la destrucción de glóbulos rojos (tal como se mide mediante los requisitos de transfusión reducidos o los niveles de hematocrito o hemoglobina aumentados) resultante de hemoglobinuria paroxística nocturna.
Por “disminuir” o “reducir” en el contexto de un marcador de enfermedad o síntoma quiere decirse una disminución estadísticamente significativa de tal nivel. La disminución puede ser, por ejemplo, de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40% o más, y es preferiblemente hasta un nivel aceptado como dentro del intervalo de lo normal para un individuo sin tal trastorno.
Por “aumentar” o “elevar” en el contexto de un marcador de enfermedad o síntoma quiere decirse un aumento estadísticamente significativo de tal nivel. El aumento puede ser, por ejemplo, de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40% o más, y es preferiblemente hasta un nivel aceptado como dentro del intervalo de lo normal para un individuo sin tal trastorno.
Tal como se usan en el presente documento, las frases “cantidad terapéuticamente eficaz” y “cantidad profilácticamente eficaz” se refieren a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento, la prevención o gestión de procesos patológicos o un síntoma evidente de uno o más procesos patológicos. La cantidad específica que es terapéuticamente eficaz puede determinarse fácilmente por un médico habitual, y puede variar dependiendo de factores conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, el tipo de proceso patológico, la historia del paciente y edad, el estadio del proceso patológico y la administración de otros agentes que inhiben procesos patológicos.
Tal como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un polipéptido y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, “cantidad farmacológicamente eficaz”, “cantidad terapéuticamente eficaz” o simplemente “cantidad eficaz” se refiere a la cantidad de un polipéptido eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo previsto. Por ejemplo, si se considera que un tratamiento clínico dado es eficaz cuando hay una alteración (aumento o disminución) de al menos el 10% en un parámetro medible asociado con una enfermedad o un trastorno, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco para el tratamiento de esa enfermedad o trastorno es la cantidad necesaria para realizar una alteración de al menos el 10% en ese parámetro. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un polipéptido puede ser una que altera la unión de una diana a su pareja de unión natural en al menos el 10%.
El término “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un portador para la administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol y combinaciones de los mismos. El término excluye específicamente medio de cultivo celular. Para fármacos administrados por vía oral, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfato de sodio y calcio, y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido algínico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidón y gelatina, mientras que el agente lubricante, si está presente, será generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal. A continuación en el presente documento, se describen adicionalmente agentes incluidos en formulaciones de fármaco.
La eficacia del tratamiento o mejora de la enfermedad pueden evaluarse, por ejemplo, midiendo la progresión de la enfermedad, remisión de la enfermedad, gravedad de síntomas, reducción de dolor, calidad de vida, dosis de un medicamento requerida para sostener un efecto de tratamiento, el nivel de un marcador de enfermedad o cualquier otro parámetro medible apropiado para una enfermedad dada que está tratándose o seleccionándose como diana para la prevención. Monitorizar la prevención o eficacia del tratamiento midiendo uno cualquiera de tales parámetros, o cualquier combinación de parámetros, se encuentra fácilmente dentro de la capacidad de un experto en la técnica. En relación con la administración de un polipéptido o una composición farmacéutica del mismo, “eficaz contra” una enfermedad o un trastorno indica que la administración de una manera clínicamente apropiada da como resultado un efecto beneficioso para al menos una fracción de pacientes, tal como una mejora de síntomas, una cura, una reducción de la carga de enfermedad, reducción de la masa tumoral o números de célula, prolongación de la vida, mejora de la calidad de vida, una reducción de la necesidad de transfusiones de sangre u otro efecto generalmente reconocido como positivo por médicos familiarizados con el tratamiento del tipo particular de enfermedad o trastorno.
Un efecto de tratamiento o preventivo resulta evidente cuando hay una mejora estadísticamente significativa en uno o más parámetros de estado patológico, o por no empeorar o desarrollar síntomas cuando éstos se preverían de otro modo. Como ejemplo, un cambio favorable de al menos el 10% en un parámetro medible de enfermedad, y preferiblemente al menos el 20%, el 30%, el 40%, el 50% o más, puede ser indicativo de tratamiento eficaz. La eficacia para un fármaco de polipéptido dado o una formulación de ese fármaco también puede evaluarse usando un modelo en animal de experimentación para la enfermedad dada tal como se conoce en la técnica. Cuando se usa un modelo en animal de experimentación, la eficacia de tratamiento se demuestra cuando se observa una modulación estadísticamente significativa en un marcador o síntoma.
El polipéptido y un agente terapéutico adicional pueden administrarse en combinación en la misma composición, por ejemplo, por vía parenteral, o el agente terapéutico adicional puede administrarse como parte de una composición independiente o mediante otro método descrito en el presente documento.
Indicaciones inflamatorias
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar a sujetos con enfermedades, trastornos y/o estados relacionados con inflamación. La inflamación puede regularse por incremento durante la cascada proteolítica del sistema del complemento. Aunque la inflamación puede tener efectos beneficiosos, el exceso de inflamación puede conducir a una variedad de patologías (Markiewski et al. 2007. Am J Pathol. 17:715-27). Por consiguiente, los compuestos y las composiciones de la presente divulgación pueden usarse para reducir o eliminar la inflamación asociada con la activación del complemento.
Inflamación estéril
Los compuestos y las composiciones de la presente divulgación pueden usarse para tratar, prevenir o retrasar el desarrollo de inflamación estéril. La inflamación estéril es la inflamación que se produce en respuesta a estímulos distintos de infección. La inflamación estéril puede ser una respuesta habitual a estrés tal como estrés genómico, estrés hipóxico, estrés nutricional o estrés de retículo endoplasmático provocados por unos estímulos nocivos físicos, químicos o metabólicos. La inflamación estéril puede contribuir a la patogénesis de muchas enfermedades tales como, pero sin limitarse a, lesiones inducidas por isquemia, artritis reumatoide, lesiones pulmonares agudas, lesiones hepáticas inducidas por fármacos, enfermedades inflamatorias del intestino y/u otras enfermedades, trastornos o estados. El mecanismo de la inflamación estéril y los métodos y las composiciones para el tratamiento, la prevención y/o el retraso de los síntomas de inflamación estéril pueden incluir cualquiera de los enseñados por Rubartelli et al. en Frontiers in Immunology, 2013, 4:398-99, Rock et al. en Annu Rev Immunol. 2010, 28:321-342 o en la patente estadounidense n.° 8.101.586.
Respuesta inflamatoria sistémica (SIRS) y septicemia
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar y/o prevenir el síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SlRs). El SIRS es una inflamación que afecta a todo el organismo. Cuando el SIRS está provocado por una infección, se denomina septicemia. El SIRS puede estar provocado por acontecimientos no infecciosos tales como traumatismo, lesión, quemaduras, isquemia, hemorragia y/u otros estados. Durante la septicemia y el SIRS, la activación del complemento conduce a una generación excesiva de productos de activación del complemento, lo que puede provocar fallo multiorgánico (MOF) en sujetos. Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para controlar y/o equilibrar la activación del complemento para la prevención y el tratamiento de SIRS, septicemia y/o MOF. Los métodos de aplicación de inhibidores del complemento para tratar SIRS y septicemia pueden incluir los enseñados por Rittirsch et al. en Clin Dev Immunol, 2012, 962927, en la publicación estadounidense n.° US2013/0053302 o en la patente estadounidense n.° 8.329.169.
Síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS)
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar y/o prevenir el desarrollo de síndrome de dificultad respiratoria aguda (ARDS). El ARDS es una inflamación extendida de los pulmones y puede provocarse por traumatismo, infección (por ejemplo, septicemia), neumonía grave y/o inhalación de sustancias dañinas. El ARDS es normalmente una complicación grave potencialmente mortal. Los estudios sugieren que los neutrófilos pueden contribuir al desarrollo de ARDS afectando a la acumulación de células polimorfonucleares en los alveolos pulmonares lesionados y el tejido intersticial de los pulmones. Por consiguiente, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden administrarse para reducir y/o prevenir la producción de factor tisular en neutrófilos alveolares. Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse además para el tratamiento, la prevención y/o el retraso de ARDS, en algunos casos según cualquiera de los métodos enseñados en la publicación internacional n.° WO2009/014633.
Periodontitis
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar o prevenir el desarrollo de periodontitis y/o estados asociados. La periodontitis es una inflamación crónica extendida que conduce a la destrucción de tejido periodontal que es el tejido que soporta y rodea los dientes. El estado también implica la pérdida de hueso alveolar (hueso que sujeta los dientes). La periodontitis puede estar provocada por una falta de higiene bucal que conduce a la acumulación de bacterias en la línea gingival, también conocida como placa dental. Determinados estados de salud tales como diabetes o malnutrición y/o hábitos tales como tabaquismo pueden aumentar el riesgo de periodontitis. La periodontitis puede aumentar el riesgo de accidente cerebrovascular, infarto de miocardio, aterosclerosis, diabetes, osteoporosis, parto prematuro, así como otros problemas de salud. Los estudios demuestran una correlación entre la periodontitis y la actividad local del complemento. Las bacterias periodontales pueden o bien inhibir o bien activar determinados componentes de la cascada del complemento. Por consiguiente, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar la periodontitis y enfermedades y estados asociados. Los inhibidores de activación del complemento y los métodos de tratamiento pueden incluir cualquiera de los enseñados por Hajishengallis en Biochem Pharmacol. 2010, 15; 80(12):1 y Lambris o en la publicación estadounidense n.° US2013/0344082.
Heridas y lesiones
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar y/o fomentar la curación de diferentes tipos de heridas y/o lesiones. Tal como se usa en el presente documento, el término “ lesión” se refiere normalmente a un traumatismo físico, pero puede incluir procesos patológicos o infecciosos localizados. Las lesiones pueden caracterizarse por afectación, daño o destrucción provocados por acontecimientos externos que afectan a partes del organismo y/u órganos. Las heridas están asociadas con cortes, golpes, quemaduras y/u otros impactos en la piel, dejando la piel rota o dañada. Las heridas y lesiones son con frecuencia agudas, pero si no se curan apropiadamente pueden conducir a complicaciones y/o inflamación crónicas.
Heridas y heridas por quemadura
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar y/o fomentar la curación de heridas. La piel sana proporciona una barrera protectora impermeable frente a patógenos y otros agentes afectantes del entorno. La piel también controla la temperatura corporal y la evaporación de líquidos. Cuando la piel está herida, estas funciones se ven alteradas haciendo que la curación de la piel resulte un desafío. La formación de heridas inicia un conjunto de procesos fisiológicos relacionados con el sistema inmunitario que reparan y regeneran el tejido. La activación del complemento es uno de estos procesos. Los estudios sobre la activación del complemento han identificado varios componentes del complemento implicados en la curación de heridas tal como se enseña por van de Goot et al. en J Burn Care Res 2009, 30:274-280 y Cazander et al. Clin Dev Immunol, 2012, 2012:534291. En algunos casos, la activación del complemento puede ser excesiva, provocando muerte celular e inflamación potenciada (conduciendo a una curación de heridas alterada y a heridas crónicas). En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la presente divulgación pueden usarse para reducir o eliminar tal activación del complemento para fomentar la curación de heridas. El tratamiento con compuestos y composiciones de la divulgación puede llevarse a cabo según cualquiera de los métodos para tratar heridas divulgados en la publicación internacional n.° WO2012/174055.
Traumatismo craneal
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar y/o fomentar la curación de traumatismo craneal. Los traumatismos craneales incluyen lesiones en el cuero cabelludo, el cráneo o el cerebro. Los ejemplos de traumatismo craneal incluyen, pero no se limitan a, concusiones, contusiones, fractura craneal, lesiones cerebrales por traumatismo y/u otras lesiones. Los traumatismos craneales pueden ser menores o graves. En algunos casos, el traumatismo craneal puede conducir a complicaciones físicas y/o mentales a largo plazo o a la muerte. Los estudios indican que los traumatismos craneales pueden inducir la activación de la cascada del complemento intracraneal inapropiada, lo que puede conducir a respuestas inflamatorias locales que contribuyen a daño cerebral secundario mediante desarrollo de edema cerebral y/o muerte neuronal (Stahel et al. en Brain Research Reviews, 1998, 27: 243-56). Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar traumatismo craneal y/o para reducir o prevenir complicaciones secundarias relacionadas. Los métodos de uso de los compuestos y las composiciones de la divulgación para controlar la activación de la cascada del complemento en traumatismo craneal pueden incluir cualquiera de los enseñados por Holers et al. en la patente estadounidense n.° 8.911.733.
Lesión por aplastamiento
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar y/o fomentar la curación de lesiones por aplastamiento. Las lesiones por aplastamiento son lesiones provocadas por una fuerza o una presión impuesta sobre el organismo provocando hemorragia, moretones, fracturas, lesiones nerviosas, heridas y/u otros daños en el organismo. Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para reducir la activación del complemento tras lesiones por aplastamiento, fomentando así la curación tras lesiones por aplastamiento (por ejemplo, fomentando la regeneración nerviosa, fomentando la curación de fracturas, impidiendo o tratando la inflamación y/u otras complicaciones relacionadas). Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para fomentar la curación según cualquiera de los métodos enseñados en la patente estadounidense n.° 8.703.136; publicaciones internacionales n.os WO2012/162215; WO2012/174055; o publicación estadounidense n.° US2006/0270590.
Enfermedad autoinmunitaria
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar a sujetos con enfermedades y/o trastornos autoinmunitarios. El sistema inmunitario puede dividirse en sistemas innato y adaptativo, refiriéndose a mecanismos de defensa inmediata no específicos y a sistemas específicos de antígeno más complejos, respectivamente. El sistema del complemento forma parte del sistema inmunitario innato, que reconoce y elimina patógenos. Adicionalmente, las proteínas del complemento pueden modular la inmunidad adaptativa, conectando las respuestas innata y adaptativa. Las enfermedades y los trastornos autoinmunitarios son anomalías inmunitarias que provocan que el sistema seleccione como diana sustancias y tejidos propios. La enfermedad autoinmunitaria puede afectar a determinados tejidos u órganos del organismo. Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para modular el complemento en el tratamiento y/o la prevención de enfermedades autoinmunitarias. En algunos casos, tales compuestos y composiciones pueden usarse según los métodos presentados en Ballanti et al. Immunol Res (2013) 56:477-491.
Síndrome antifosfolípidos (APS) y síndrome antifosfolípidos catastrófico (CAPS)
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar síndrome antifosfolípidos (APS) mediante el control de la activación del complemento. El APS es un estado autoinmunitario provocado por anticuerpos antifosfolípidos que provocan que la sangre se coagule. El APS puede conducir a trombosis venosa o arterial recurrente en órganos, y complicaciones en circulaciones de la placenta provocando complicaciones relacionadas con el embarazo tales como aborto espontáneo, mortinatalidad, preeclampsia, nacimiento prematuro y/u otras complicaciones. El síndrome antifosfolípidos catastrófico (CAPS) es una versión extrema y aguda de un estado similar que conduce a la oclusión de las venas en varios órganos simultáneamente. Los estudios sugieren que la activación del complemento puede contribuir a complicaciones relacionadas con APS incluyendo complicaciones relacionadas con el embarazo, complicaciones trombóticas (de coagulación) y complicaciones vasculares. El compuesto y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar estados relacionados con APS reduciendo o eliminando la activación del complemento. En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar APS y/o complicaciones relacionadas con APS según los métodos enseñados por Salmon et al. Ann Rheum Dis 2002; 61 (sup. N):ii46-ii50 y Mackworth-Young en Clin Exp Immunol 2004, 136:393-401.
Enfermedad de aglutininas frías
En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar enfermedad de aglutininas frías (CAD), también denominada hemólisis mediada por aglutininas frías. La CAD es una enfermedad autoinmunitaria resultante de una alta concentración de anticuerpos de IgM que interaccionan con glóbulos rojos a temperaturas corporales en un intervalo bajo [Engelhardt et al. Blood, 2002, 100(5): 1922-23]. La CAD puede conducir a estados tales como anemia, fatiga, disnea, hemoglobinuria y/o acrocianosis. La CAD está relacionada con la activación robusta del complemento, y los estudios han mostrado que la CAD puede tratarse con terapias con inhibidores del complemento. Por consiguiente, la presente divulgación proporciona métodos de tratamiento de CAD usando compuestos y composiciones de la divulgación. En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar CAD según los métodos enseñados por Roth et al en Blood, 2009, 113:3885-86 o en la publicación internacional n.° WO2012/139081.
Indicaciones vasculares
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar indicaciones vasculares que afectan a vasos sanguíneos (por ejemplo, arterias, venas y capilares). Tales indicaciones pueden afectar a la circulación sanguínea, la tensión arterial, el flujo de sangre, la función de órganos y/u otras funciones corporales.
Microangiopatía trombótica (TMA)
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar y/o prevenir la microangiopatía trombótica (TMA) y enfermedades asociadas. Las microangiopatías afectan a vasos sanguíneos pequeños (capilares) del organismo provocando que las paredes capilares se vuelvan espesas, débiles y propensas a hemorragias y circulación sanguínea lenta. Las t Ma tienden a conducir al desarrollo de trombos vasculares, daño de células endoteliales, trombocitopenia y hemólisis. Los órganos tales como el cerebro, el riñón, los músculos, el sistema gastrointestinal, la piel y los pulmones pueden verse afectados. Las TMA pueden surgir a partir de operaciones médicas y/o estados que incluyen, pero no se limitan a, trasplante de células madre hematopoyéticas (HSCT), trastornos renales, diabetes y/u otros estados. Las TMA pueden estar provocadas por disfunción subyacente del sistema del complemento, tal como se describe por Meri et al. en European Journal of Internal Medicine, 2013, 24: 496-502. Generalmente, las TMA pueden dar como resultado niveles aumentados de determinados componentes del complemento conduciendo a trombosis. En algunos casos, esto puede estar provocado por mutaciones en proteínas del complemento o enzimas relacionadas. La disfunción del complemento resultante puede conducir a que el complemento seleccione como diana células endoteliales y plaquetas conduciendo a trombosis aumentada. Las TMA pueden prevenirse y/o tratarse con compuestos y composiciones de la divulgación. En algunos casos, los métodos de tratamiento de TMA con compuestos y composiciones de la divulgación pueden llevarse a cabo según los descritos en las publicaciones estadounidenses n.os US2012/0225056 o US2013/0246083.
Coagulación intravascular diseminada (DIC)
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar la coagulación intravascular diseminada (DIC) controlando la activación del complemento. La DIC es un estado patológico en el que se activa de manera amplia la cascada de coagulación en la sangre y da como resultado la formación de coágulos de sangre especialmente en los capilares. La DIC puede conducir a un flujo de sangre obstruido de tejidos y finalmente puede dañar órganos. Adicionalmente, la DIC afecta al proceso normal de coagulación de la sangre, lo que puede conducir a hemorragia grave. Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar, prevenir o reducir la gravedad de DIC modulando la actividad del complemento. En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse según cualquiera de los métodos de tratamiento de DIC enseñados en la patente estadounidense n.° 8.652.477.
Vasculitis
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar la vasculitis. Generalmente, la vasculitis es un trastorno relacionado con la inflamación de vasos sanguíneos, incluyendo venas y arterias, caracterizado por glóbulos blancos que atacan a tejidos y que provocan el hinchamiento de los vasos sanguíneos. La vasculitis puede estar asociada con una infección, tal como en la fiebre manchada de las Montañas Rocosas, o autoinmunidad. Un ejemplo de vasculitis asociada con autoinmunidad es la vasculitis por anticuerpos citoplasmáticos anti-neutrófilos (ANCA). La vasculitis por ANCA está provocada por anticuerpos anómalos que atacan a las células y los tejidos del propio organismo. Los ANCA atacan al citoplasma de determinados glóbulos blancos y neutrófilos, haciendo que ataquen a las paredes de los vasos en determinados órganos y tejidos del organismo. La vasculitis por ANCA puede afectar a la piel, los pulmones, los ojos y/o el riñón. Los estudios sugieren que la enfermedad por ANCA activa una ruta del complemento alternativa y genera determinados componentes del complemento que crean un bucle de amplificación de la inflamación dando como resultado una lesión vascular (Jennette et al. 2013, Semin Nephrol. 33(6): 557-64). En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar la vasculitis por ANCA inhibiendo la activación del complemento.
Indicaciones neurológicas
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir, tratar y/o aliviar los síntomas de indicaciones neurológicas, incluyendo, pero sin limitarse a, enfermedades neurodegenerativas y trastornos relacionados. La neurodegeneración se refiere generalmente a una pérdida de la estructura o función de neuronas, indicando muerte de neuronas. Estos trastornos pueden tratarse inhibiendo el efecto del complemento sobre células neuronales usando compuestos y composiciones de la divulgación. Los trastornos relacionados con la neurodegeneración incluyen, pero no se limitan a, esclerosis lateral amiotrófica (ALS), esclerosis múltiple (MS), enfermedad de Parkinson y enfermedad de Alzheimer.
Esclerosis lateral amiotrófica (ALS)
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir, tratar y/o aliviar los síntomas de ALS. La ALS es una enfermedad de neuronas motoras mortal caracterizada por la degeneración de neuronas de la médula espinal, el tronco encefálico y la corteza motora. La ALS provoca la pérdida de fuerza muscular que finalmente conduce a una insuficiencia respiratoria. La disfunción del complemento puede contribuir a ALS, y por tanto la ALS puede prevenirse, tratarse y/o reducirse sus síntomas mediante terapia con compuestos y composiciones de la divulgación que seleccionan como diana la actividad del complemento. En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para fomentar la regeneración nerviosa. En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse como inhibidores del complemento según cualquiera de los métodos enseñados en las publicaciones estadounidenses n.os US2014/0234275 o US2010/0143344.
Enfermedad de Alzheimer
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar la enfermedad de Alzheimer controlando la actividad del complemento. La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad neurodegenerativa crónica con síntomas que pueden incluir desorientación, pérdida de memoria, cambios de humor, problemas de comportamiento y finalmente pérdida de funciones corporales. Se piensa que la enfermedad de Alzheimer está provocada por depósitos cerebrales extracelulares de amiloide que están asociados con proteínas relacionadas con la inflamación tales como proteínas del complemento (Sjoberg et al. 2009. Trends in Immunology.
30(2): 83-90). En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse como inhibidores del complemento según cualquiera de los métodos de tratamiento de la enfermedad de Alzheimer enseñados en la publicación estadounidense n.° US2014/0234275.
Indicaciones relacionadas con el riñón
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar determinadas enfermedades, trastornos y/o estados relacionados con los riñones, en algunos casos inhibiendo la actividad del complemento. Los riñones son órganos responsables de eliminar productos residuales metabólicos del torrente sanguíneo. Los riñones regulan la tensión arterial, el aparato urinario y las funciones homeostáticas, y por tanto son esenciales para una variedad de funciones corporales. Los riñones pueden verse afectados más gravemente por la inflamación (en comparación con otros órganos) debido a características estructurales únicas y exposición a la sangre. Los riñones también producen sus propias proteínas del complemento que pueden activarse tras la infección, enfermedad renal y trasplantes de riñón. En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse como inhibidores del complemento en el tratamiento de determinadas enfermedades, estados y/o trastornos del riñón según los métodos enseñados por Quigg, J Immunol 2003; 171:3319-24.
Nefritis lúpica
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar nefritis lúpica inhibiendo la actividad del complemento. La nefritis lúpica es una inflamación renal provocada por una enfermedad autoinmunitaria denominada lupus eritematoso sistémico (SLE). Los síntomas de la nefritis lúpica incluyen tensión arterial alta; orina espumosa; hinchamiento de las piernas, los pies, las manos o la cara; dolor articular; dolor muscular; fiebre; y exantema. La nefritis lúpica puede tratarse mediante inhibidores que controlan la actividad del complemento, incluyendo compuestos y composiciones de la presente divulgación. Los métodos y las composiciones para prevenir y/o tratar la nefritis lúpica mediante la inhibición del complemento pueden incluir cualquiera de los enseñados en la publicación estadounidense n.° US2013/0345257 o la patente estadounidense n.° 8.377.437.
Glomerulonefritis membranosa (MGN)
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar el trastorno de glomerulonefritis membranosa (MGN) inhibiendo la activación de determinados componentes del complemento. La MGN es un trastorno del riñón que puede conducir a inflamación y cambios estructurales. La MGN está provocada por anticuerpos que se unen a un antígeno soluble en capilares del riñón (glomérulo). La MGN puede afectar a las funciones renales, tales como filtrado de líquidos, y puede conducir a insuficiencia renal. Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse según métodos de prevención y/o tratamiento de MGN mediante la inhibición del complemento enseñados en la publicación estadounidense n.° US2010/0015139 o en la publicación internacional n.° WO2000/021559.
Complicaciones de hemodiálisis
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar complicaciones asociadas con hemodiálisis inhibiendo la activación del complemento. La hemodiálisis es una intervención médica usada para mantener la función renal en sujetos con insuficiencia renal. En la hemodiálisis, la retirada de productos residuales tales como creatinina, urea y agua libre a partir de sangre se realiza de manera externa. Una complicación habitual del tratamiento por hemodiálisis es la inflamación crónica provocada por el contacto entre la sangre y la membrana de diálisis. Otra complicación habitual es la trombosis referida a una formación de coágulos de sangre que obstruyen la circulación sanguínea. Los estudios han sugerido que estas complicaciones están relacionadas con la activación del complemento. La hemodiálisis puede combinarse con terapia con inhibidores del complemento para proporcionar medios para controlar respuestas y patologías inflamatorias y/o prevenir o tratar la trombosis en sujetos que se someten a hemodiálisis debido a insuficiencia renal. Los métodos de uso de compuestos y composiciones de la divulgación para el tratamiento de complicaciones de hemodiálisis pueden llevarse a cabo según cualquiera de los métodos enseñados por DeAngelis et al. en Immunobiology, 2012, 217(11): 1097-1105 o por Kourtzelis et al. Blood, 2010, 116(4):631-639.
Enfermedades oculares
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar determinadas enfermedades, trastornos y/o estados relacionados con los ojos. En un ojo sano, el sistema del complemento se activa a un nivel bajo y se regula continuamente mediante proteínas intraoculares solubles y unidas a la membrana que protegen frente a patógenos. Por tanto, la activación del complemento desempeña un papel importante en varias complicaciones relacionadas con el ojo y puede usarse el control de la activación del complemento para tratar tales enfermedades. Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse como inhibidores del complemento en el tratamiento de enfermedad ocular según cualquiera de los métodos enseñados por Jha et al. en Mol Immunol. 2007; 44(16): 3901-3908 o en la patente estadounidense n.° 8.753.625.
Degeneración macular relacionada con la edad (AMD)
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar la degeneración macular relacionada con la edad (AMD) inhibiendo la activación del complemento ocular. La AMD es una enfermedad ocular crónica que provoca visión central borrosa, puntos ciegos en la visión central y/o pérdida final de visión central. La visión central afecta a la capacidad para leer, conducir un vehículo y/o reconocer caras. La AMD se divide generalmente en dos tipos, no exudativa (seca) y exudativa (húmeda). La AMD seca se refiere al deterioro de la mácula que es el tejido en el centro de la retina. La AMD húmeda se refiere al fallo de los vasos sanguíneos bajo la retina conduciendo a la fuga de sangre y líquido. Varios estudios con humanos y animales han identificado proteínas del complemento que están relacionadas con la AMD y estrategias terapéuticas novedosas incluyeron controlar las rutas de activación del complemento, tal como se comenta por Jha et al. en Mol Immunol. 2007; 44(16): 3901-8. Los métodos de la divulgación que implican el uso de compuestos y composiciones de la divulgación para la prevención y/o el tratamiento de AMD pueden incluir cualquiera de los enseñados en las publicaciones estadounidenses n.os US2011/0269807 o US2008/0269318.
Enfermedad de la córnea
En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar enfermedades de la córnea inhibiendo la activación del complemento ocular. El sistema del complemento desempeña un papel importante en la protección de la córnea frente a partículas patógenas y/o antígenos inflamatorios. La córnea es la parte delantera más externa del ojo que cubre y protege el iris, la pupila y la cámara anterior, y por tanto está expuesta a factores externos. Las enfermedades de la córnea incluyen, pero no se limitan a, queratocono, queratitis, herpes ocular y/u otras enfermedades. Las complicaciones de la córnea pueden provocar dolor, visión borrosa, lagrimeo, enrojecimiento, sensibilidad a la luz y/o cicatrización de la córnea. El sistema del complemento es crítico para la protección de la córnea, pero la activación del complemento puede provocar daño al tejido de la córnea tras aclararse una infección ya que determinados compuestos del complemento se expresan en gran medida. Los métodos de la presente divulgación para modular la actividad del complemento en el tratamiento de enfermedad de la córnea pueden incluir cualquiera de los enseñados por Jha et al. en Mol Immunol. 2007; 44(16): 3901-8.
Uveítis autoinmunitaria
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar la uveítis, que es una inflamación de la capa uveal del ojo. La úvea es la zona pigmentada del ojo que comprende la coroides, el iris y el cuerpo ciliar del ojo. La uveítis provoca enrojecimiento, visión borrosa, dolor, sinequia y finalmente puede provocar ceguera. Los estudios han indicado que están presentes productos de activación del complemento en los ojos de pacientes con uveítis autoinmunitaria y el complemento desempeña un papel importante en el desarrollo de la enfermedad. En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para tratar y/o prevenir la uveítis según cualquiera de los métodos identificados en Jha et al. en Mol Immunol. 2007. 44(16): 3901-8.
Retinopatía diabética
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar la retinopatía diabética que es una enfermedad provocada por cambios en los vasos sanguíneos de la retina en pacientes diabéticos. La retinopatía puede provocar hinchamiento de vasos sanguíneos y fuga de líquidos y/o crecimiento de vasos sanguíneos anómalos. La retinopatía diabética afecta a la visión y finalmente puede conducir a ceguera. Los estudios han sugerido que la activación del complemento tiene un papel importante en el desarrollo de retinopatía diabética. En algunos casos, los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse según los métodos de tratamiento de retinopatía diabética descritos en Jha et al. Mol Immunol. 2007; 44(16): 3901-8.
Preeclampsia y síndrome de HELLP
Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse para prevenir y/o tratar la preeclampsia y/o el síndrome de HELLP (abreviatura que representa las características del síndrome de 1) hemólisis, 2) enzimas hepáticas elevadas y 3) bajo recuento de plaquetas) mediante terapia con inhibidores del complemento. La preeclampsia es un trastorno del embarazo con síntomas que incluyen tensión arterial elevada, hinchamiento, falta de aliento, disfunción renal, función hepática afectada y/o bajo recuento de plaquetas en sangre. La preeclampsia se diagnostica normalmente mediante un nivel de proteínas en orina alto y tensión arterial alta. El síndrome de HELLP es una combinación de hemólisis, enzimas hepáticas elevadas y estados de plaquetas bajas. La hemólisis es una enfermedad que implica la ruptura de glóbulos rojos conduciendo a la liberación de hemoglobina a partir de glóbulos rojos. Las enzimas hepáticas elevadas pueden indicar un estado hepático inducido por el embarazo. Los niveles de plaquetas bajos conducen a una reducción de la capacidad de coagulación, provocando riesgo de hemorragia excesiva. El HELLP está asociado con preeclampsia y trastorno hepático. El síndrome de HELLP se produce normalmente durante las últimas fases del embarazo o tras el parto. Normalmente se diagnostica mediante análisis de sangre que indican la presencia de los tres estados que implica. Normalmente, el HELLP se trata induciendo el parto.
Los estudios sugieren que se produce la activación del complemento durante el síndrome de HELLP y la preeclampsia y que determinados componentes del complemento están presentes a niveles aumentados durante HELLP y preeclampsia. Pueden usarse inhibidores del complemento como agentes terapéuticos para prevenir y/o tratar estos estados. Los compuestos y las composiciones de la divulgación pueden usarse según métodos de prevención y/o tratamiento de HELLP y preeclampsia enseñados por Heager et al. en Obstetrics & Gynecology, 1992, 79(1):19-26 o en la publicación internacional n.° WO201/078622.
Dosificación y administración
Para su uso como tratamiento de sujetos humanos, pueden formularse polipéptidos como composiciones farmacéuticas. Dependiendo del sujeto que va a tratarse, el modo de administración y el tipo de tratamiento deseado (por ejemplo, prevención, profilaxis o terapia), los polipéptidos se formulan de maneras compatibles con estos parámetros. Se encuentra un resumen de tales técnicas en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Lippincott Williams & Wilkins, (2005); y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y J. C. Boilan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York.
Las composiciones se proporcionan preferiblemente en una cantidad terapéuticamente eficaz, que puede ser, por ejemplo, una cantidad diaria de desde aproximadamente 0,1 mg hasta aproximadamente 100 mg, desde aproximadamente 0,5 mg hasta aproximadamente 200 mg, desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 300 mg, desde aproximadamente 5 mg hasta aproximadamente 500 mg, desde aproximadamente 10 mg hasta aproximadamente 750 mg, desde aproximadamente 50 mg hasta aproximadamente 1000 mg o al menos 1000 mg. En un caso, una composición farmacéutica comprende una cápsula, por ejemplo en forma de dosificación unitaria.
Según algunos métodos, los compuestos y las composiciones de la divulgación se proporcionan a concentraciones necesarias para lograr un efecto deseado. En algunos, los compuestos y las composiciones se proporcionan en una cantidad necesaria para reducir a la mitad una reacción o un proceso dado. La concentración necesaria para lograr una reducción de este tipo se denomina en el presente documento concentración inhibidora semimáxima o “CI50”. Alternativamente, los compuestos y las composiciones pueden proporcionarse en una cantidad necesaria para aumentar en la mitad una reacción, una actividad o un proceso dado. La concentración necesaria para lograr un aumento de este tipo se denomina en el presente documento concentración eficaz semimáxima o “CE50”.
Formas de dosificación unitarias
Los polipéptidos pueden estar presentes en cantidades que representan en total el 0,1-95% en peso del peso total de la composición. La composición puede proporcionarse en una forma de dosificación que es adecuada para administración oral. Por tanto, la composición farmacéutica puede estar en forma, por ejemplo, de cápsulas duras (por ejemplo, cápsulas de gelatina duras o cápsulas de hidroxipropilmetilcelulosa duras), cápsulas de gelatina blandas, comprimidos, comprimidos oblongos, comprimidos con recubrimiento entérico, comprimidos masticables, cápsulas de gelatina duras con recubrimiento entérico, cápsulas de gelatina blandas con recubrimiento entérico, minicápsulas, pastillas, películas, tiras, cápsulas de gelatina, grageas, disoluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes o pulverizaciones.
Puede administrarse a los sujetos una cantidad terapéutica de un polipéptido, incluyendo, pero sin limitarse a, dosis de 0,01 mg/kg, 1,0 mg/kg o 15 mg/kg. En algunos casos, los polipéptidos se administran a desde aproximadamente 0,001 mg/kg hasta aproximadamente 1,0 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 2,0 mg/kg, desde aproximadamente 0,05 mg/kg hasta aproximadamente 5,0 mg/kg, desde aproximadamente 0,03 mg/kg hasta aproximadamente 3,0 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 1,0 mg/kg hasta aproximadamente 5,0 mg/kg, desde aproximadamente 2,0 mg/kg hasta aproximadamente 4,0 mg/kg, desde aproximadamente 1,5 mg/kg hasta aproximadamente 7,5 mg/kg, desde aproximadamente 5,0 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg, desde aproximadamente 7,5 mg/kg hasta aproximadamente 12,5 mg/kg o desde aproximadamente 10 mg/kg hasta aproximadamente 20 mg/kg. Tales intervalos incluyen intervalos adecuados para la administración a sujetos humanos. En algunos casos, puede administrarse a los sujetos humano desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, desde aproximadamente 0,01 mg/kg hasta aproximadamente 15 mg/kg o desde aproximadamente 3 mg/kg hasta aproximadamente 5 mg/kg. Los niveles de dosificación pueden depender altamente de la naturaleza del estado; eficacia del fármaco; el estado del paciente; el criterio del médico; y la frecuencia y el modo de administración.
En algunos casos, los polipéptidos se proporcionan a concentraciones ajustadas para lograr un nivel deseado de tales polipéptidos en una muestra, un sistema biológico o un sujeto (por ejemplo, nivel en plasma en un sujeto). En algunos casos, las concentraciones deseadas de polipéptidos en una muestra, un sistema biológico o un sujeto puede incluir concentraciones de desde aproximadamente 0,001 nM hasta aproximadamente 0,01 nM, desde aproximadamente 0,005 nM hasta aproximadamente 0,05 nM, desde aproximadamente 0,02 nM hasta aproximadamente 0,2 nM, desde aproximadamente 0,03 nM hasta aproximadamente 0,3 nM, desde aproximadamente 0,05 nM hasta aproximadamente 0,5 nM, desde aproximadamente 0,01 nM hasta aproximadamente 2,0 nM, desde aproximadamente 0,1 nM hasta aproximadamente 50 nM, desde aproximadamente 0,1 nM hasta aproximadamente 10 nM, desde aproximadamente 0,1 nM hasta aproximadamente 5 nM o desde aproximadamente 0,2 nM hasta aproximadamente 20 nM. En algunos casos, las concentraciones deseadas de polipéptidos en el plasma del sujeto pueden ser desde aproximadamente 0,01 mg/l hasta aproximadamente 2 mg/l, desde aproximadamente 0,02 mg/l hasta aproximadamente 4 mg/l, desde aproximadamente 0,05 mg/l hasta aproximadamente 5 mg/l, desde aproximadamente 0,1 mg/l hasta aproximadamente 1,0 mg/l, desde aproximadamente 0,2 mg/l hasta aproximadamente 2,0 mg/l, desde aproximadamente 0,5 mg/l hasta aproximadamente 5 mg/l, desde aproximadamente 1 mg/l hasta aproximadamente 5 mg/l, desde aproximadamente 2 mg/l hasta aproximadamente 10 mg/l, desde aproximadamente 3 mg/l hasta aproximadamente 9 mg/l o desde aproximadamente 5 mg/l hasta aproximadamente 20 mg/l.
En otros casos, los polipéptidos se administran a una frecuencia de, por ejemplo, cada 4 h, cada 6 h, cada 12 h, cada 18 h, cada 24 h, cada 36 h, cada 72 h, cada 84 h, cada 96 h, cada 5 días, cada 7 días, cada 10 días, cada 14 días, cada 3 semanas o más. Las composiciones pueden administrarse una vez al día o el polipéptido puede administrarse como dos, tres o más subdosis a intervalos apropiados a lo largo de todo el día o administración mediante una fórmula de liberación controlada. En ese caso, el polipéptido contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente menor con el fin de lograr la dosificación diaria total. La unidad de dosificación también puede combinarse para su administración a lo largo de varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional, que proporciona la liberación sostenida del polipéptido a lo largo de un periodo de varios días.
Las formulaciones de liberación sostenida se conocen bien en la técnica y son particularmente útiles para la administración de agentes a un sitio particular, tal como puede usarse con las composiciones de polipéptidos de la presente divulgación. El efecto de una única dosis puede ser de larga duración, de tal manera que se administran dosis posteriores a intervalos de no más de 3, 4 ó 5 días, o a intervalos de no más de 1, 2, 3 ó 4 semanas.
El polipéptido puede administrase mediante infusión intravenosa a lo largo de un periodo de tiempo, tal como a lo largo de un periodo de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos o 25 minutos. La administración puede repetirse, por ejemplo, de manera regular, tal como de manera bisemanal (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más tiempo. Tras un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos pueden administrarse de manera menos frecuente. Por ejemplo, tras la administración bisemanal durante tres meses, puede repetirse la administración una vez al mes, durante seis meses o un año o más tiempo. La administración del polipéptido o la composición puede reducir, disminuir, aumentar o alterar la unión o cualquier proceso fisiológicamente perjudicial, por ejemplo, en una célula, un tejido, sangre, orina u otro compartimento de un paciente, en al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% o más.
Antes de la administración de una dosis completa del polipéptido y/o la composición de polipéptido, puede administrarse a los pacientes una dosis más pequeña, tal como el 5% de una dosis completa, y monitorizarse para detectar efectos adversos, tales como una reacción alérgica o reacción frente a la infusión, o para detectar elevación de niveles de lípidos o tensión arterial. En otro ejemplo, puede monitorizarse al paciente para detectar efectos inmunoestimulantes no deseados, tales como aumento de niveles de citocinas (por ejemplo, TNF-alfa, Il-1, Il-6 o Il-10).
La predisposición genética desempeña un papel en el desarrollo de algunas enfermedades o trastornos. Por tanto, puede identificarse a un paciente que necesita un polipéptido y/o composición de polipéptido tomando una historia familiar o, por ejemplo, examinando para detectar una o más variantes o marcadores genéticos. Un profesional sanitario, tal como un médico, enfermera o miembro de la familia, puede tomar una historia familiar antes de recetar o administrar una composición terapéutica de la presente divulgación.
III. Kits
Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede estar comprendida en un kit. En un ejemplo no limitativo, pueden incluirse polipéptidos en un kit para tratar una enfermedad. El kit puede incluir un vial de polvo de polipéptido seco y estéril, disolución estéril para disolver el polvo seco y una jeringa para equipo de infusión para administrar el polipéptido.
Cuando se proporcionan polipéptidos como polvo seco, se contempla que se proporcionen entre 10 microgramos y 1000 miligramos de polipéptido, o al menos o como máximo esas cantidades, en kits.
Los medios de recipiente incluirán generalmente al menos un vial, un tubo de ensayo, un frasco, una botella, una jeringa y/u otros medios de recipiente, en los que se colocan las formulaciones de polipéptido, preferiblemente, asignados de manera adecuada. Los kits también pueden comprender unos segundos medios de recipiente para contener un tampón farmacéuticamente aceptable estéril y/u otro diluyente.
Un kit puede incluir instrucciones para emplear los componentes del kit así como el uso de cualquier otro reactivo no incluido en el kit. Las instrucciones pueden incluir variaciones que pueden implementarse.
En las reivindicaciones, los artículos tales como “un”, “uno/a” y “el/la” pueden significar uno o más de uno a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto. Las reivindicaciones o descripciones que incluyen “o” entre uno o más miembros de un grupo se consideran satisfechos si uno, más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en o son de otro modo relevantes para un producto o proceso dado a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto. La invención incluye realizaciones en las que exactamente un miembro del grupo está presente en, se emplea en o es de otro modo relevante para un producto o proceso dado. La invención incluye realizaciones en las que más de uno o todos los miembros del grupo están presentes en, se emplean en o son de otro modo relevantes para un producto o proceso dado.
También debe señalarse que el término “que comprende” pretende ser abierto, y permite pero no requiere la inclusión de elementos o etapas adicionales. Por tanto, cuando se usa el término “que comprende” en el presente documento, también se engloban y divulgan los términos “que consiste en” y “o que incluye”.
Cuando se proporcionan intervalos, se incluyen los puntos de extremo. Además, debe entenderse que a menos que se indique lo contrario o resulte evidente de otro modo a partir del contexto y la comprensión de un experto habitual en la técnica, los valores que se expresan como intervalos pueden tomar cualquier valor o subintervalo específico dentro de los intervalos declarados en diferente realizaciones de la invención, hasta la décima de la unidad del límite inferior del intervalo, a menos que el contexto dicte claramente lo contrario.
En caso de declaraciones conflictivas de una fuente citada y la presente solicitud, prevalecerá la declaración en la presente solicitud.
Ejemplos
Ejemplo 1. Preparación de C5 biotinilado
Se usó una razón molar final eficaz de 1:4 de C5 con respecto a biotina para la biotinilación a gran escala. Se preparó una disolución 10 mM de EZLink Sulfo-NHS-LC biotina (Thermo Scientific, Billerica, MA) según las instrucciones del fabricante. A 1 mg de 1 mg/ml de C5 (Complement Tech, Tyler TX), se le añadieron 2,1 |il de la disolución de biotina 10 mM y se incubó en hielo durante 2 horas. Se extinguió la reacción durante 30 minutos a 4°C tras la adición de 100 |il de Tris HCl 1 M pH 7,5. Se sometió la reacción a diálisis durante la noche frente a PBST frío (solución salina tamponada con fosfato (PBS) Tween 80 al 0,1%). Se tomaron alícuotas del C5 biotinilado y se almacenaron a -80°C. Se caracterizó el C5 biotinilado mediante SDS-PAGE en condiciones reductoras y no reductoras y se caracterizó para determinar la actividad mediante un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos. También se comprobó el C5 biotinilado para determinar la recuperación sobre perlas de estreptavidina (Invitrogen, Grand Island, NY). Se realizó la captura usando condiciones recomendadas por el fabricante. Para capturar 4 |ig de C5 biotinilado a partir de una disolución 100 nM, se usaron 40 |il de suspensión de perlas y se incubaron a 4°C durante 1 hora. Se calculó la concentración de C5 biotinilado capturado haciendo pasar una cantidad conocida de C5 sobre un gel de NuPage con Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen, Grand Island, NY).
Ejemplo 2. Ensayo de hemólisis en humanos para QC de C5 biotinilado
Se realizó un ensayo de hemólisis con sueros agotados para C5, y C5 biotinilado y C5 no biotinilado para comparar las actividades de lisis de C5 antes y después de la biotinilación. Se centrifugaron eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos (Complement Technology, Tyler TX) en disolución a 5 x 108 células/ml a 2.090 x gravedad durante 3 minutos y se resuspendieron en tampón GVB++ (Complement Technology, Tyler TX). Se descongelaron rápidamente sueros humanos agotados para C5 (Complement Technology, Tyler TX) a 37°C y se colocaron en hielo hasta que se diluyeron en GVB++. Se descongelaron rápidamente proteína C5 no biotinilada (Complement Technology, Tyler TX) y proteína C5 biotinilada (biotinilación interna) a 37°C y se colocaron en una suspensión en hielo húmedo hasta que se diluyeron en GVB++. Se combinaron 100 |il de células (a una concentración final de 2,5 x 107 células/ml) con sueros humanos agotados para C5 y 50 |il de C5 biotinilado o C5 no biotinilado (con concentraciones finales cualquiera de 10 |ig/ml, 3 |ig/ml o 1 |ig/ml) en una placa de microtitulación de 96 pocillos transparente tratada con cultivo tisular (USA Scientific, Ocala, FL). Se incubó la placa durante 1 hora a 37°C. Tras la incubación, después se centrifugaron las placas a 2.090 x gravedad durante 2 minutos antes de transferir 100 |il de sobrenadante a una nueva placa de microtitulación. Se leyó la absorbancia a 412 nm y se comparó la actividad de lisis en porcentaje de C5 no biotinilado y C5 biotinilado.
Ejemplo 3. Selección de polipéptidos que se unen a C5
Se identificaron inhibidores de C5 a través de varias rondas de visualización y selección de ARNm. Se realizó la visualización de ARNm generalmente tal como se describe (Roberts, R.W. y Szostak, J.W. (1997). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302; documento WO2009067191) con modificaciones tal como se describe en el presente documento. Se generaron combinaciones de ARN mediante transcripción in vitro a partir de ADN sintetizado con codones de cisteína y metionina N-terminal fijos, seguido por tres posiciones de una mezcla de fosforamidita de dieciséis codones, seguido por ocho posiciones de una segunda mezcla de codones que también contenía el codón de cisteína. La biblioteca de ARNm resultante tiene una metionina de iniciación fija seguida por un residuo de cisteína, seguido por tres posiciones que carecen de cisteína, seguido por ocho posiciones en las que se produce cisteína con una frecuencia del 12,5%. Para llevar a cabo la selección, la primera ronda de enriquecimiento comprendía una primera etapa en la que combinaciones de ARN que contenían un oligonucleótido reticulado por UV 3'-terminal que contenía puromicina se tradujeron in vitro con los componentes de traducción purificados indicados en la tabla 2. Se llevó a cabo la traducción en dos condiciones independientes para generar dos bibliotecas únicas basándose en la variación de aminoácidos. La primera condición usó únicamente los 20 aminoácidos naturales mientras que la segunda condición usó aminoácidos naturales (0,1 mM de histidina, treonina, prolina, lisina, asparagina, tirosina, ácido glutámico y cisteína), aminoácidos no naturales (2 mM de terc-butil-glicina (Tbg), 0,8 mM de 7-azatriptófano (abreviado mediante “azaTrp” en este ejemplo) y 1 mM de norvalina (Nvl), azaleucina y fenilglicina (Phg)) y N-metil-aminoácidos (450 |iM de mezcla de serina [(N-Me)S], alanina [(N-Me)A], glicina [(N-Me)G] y 4-fluoro-N-metilfenilalanina [(N-Me-4-F)Phe] N-metiladas). Se incluyeron residuos de cisteína marcados con 35S en ambas condiciones para permitir la monitorización de enriquecimiento en polipéptido por ronda.
Tabla 2. Componentes de traducción in vitro
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Se cargaron enzimáticamente los ARNt con sus aminoácidos respectivos usando ARNt sintetasas. Los cuatro N-metil-ARNt se cargaron previamente, mientras que los demás ARNt se cargaron enzimáticamente durante la reacción de traducción in vitro. Las ARNt sintetasas se añadieron basándose en el volumen independientemente de sus concentraciones. Se añadieron 0,1 ul de cada ARNt sintetasa (excepto para metionina ARNt sintetasa, que se añadió a 0,4 |il por 25 ul de reacción de traducción) para la carga in situ durante la traducción para una reacción de traducción de 25 |il. Se añadió ARNm reticulado a una concentración final de 0,75 uM. Se mantuvo la reacción de traducción a 37°C durante 1 hora. Tras la traducción, se llevó a cabo la fusión de los polipéptidos traducidos a sus ARNm respectivos añadiendo una alta cantidad de sal a la mezcla de traducción e incubando a 37°C durante 1,5 horas. Se preparó una biblioteca para la selección de polipéptidos naturales a partir de ocho bibliotecas individuales con un codón de cisteína fijo en las posiciones 5-11. Las posiciones aleatorias en estas bibliotecas, con los 20 aminoácidos posibles, se realizaron de manera combinatoria con unidades de codones de repetición de NNS (N es A, G, C o T; S es G o C) (Devlin, J.J., et al., (1990). Science 249, 404-406). La traducción de estas bibliotecas para dar polipéptidos naturales se realizó usando un kit de traducción in vitro de reticulocitos de conejo en lugar del sistema reconstituido descrito anteriormente.
Se realizó la recuperación de los polipéptidos visualizados en ARNm usando afinidad tanto para oligo-dT como para Ni-NTA, para aislar moléculas de fusión que contenían tanto ARNm de poliA como polipéptidos marcados con His. Después se ciclaron polipéptidos unidos a perlas de oligo-dT con dibromoxileno tal como se describe por otros (J. Am. Chem. Soc. 127:1 1727 (2005)).
Después se realizó la selección directa de los polipéptidos mediante afinidad por diana. Se dejó que polipéptidos visualizados en ARNm se unieran durante 1 hora a 4°C a C5 biotinilado en una disolución 100 nM de C5 biotinilado en PBST. Se sometió el ARN correspondiente a los polipéptidos seleccionados por afinidad a transcripción inversa y se amplificó por PCR para crear una combinación de ADN de cadena doble. Se sometió la combinación de ADN a transcripción in vitro para generar ARNm, y se reticuló el ARNm producido como anteriormente en su extremo 3'-terminal con un oligonucleótido que contenía puromicina. Se sometieron las fusiones de ARNm-puromicina a traducción in vitro para generar la segunda ronda de la biblioteca, que ahora está enriquecida en polipéptidos que se unen al componente C5 del complemento. Se repitió el ciclo de selección para seis rondas. Tras la sexta ronda, se clonó la combinación de ADN que representaba los polipéptidos seleccionados y se secuenció, y se determinaron las secuencias de aminoácidos de inhibidores de C5 candidatos basándose en las secuencias de ADN. Las secuencias de polipéptidos identificadas se indican en la tabla 3.
Tal como se usa en la totalidad de las siguientes tablas así como en la lista de secuencias, las abreviaturas tienen los siguientes significados: “Ac” y “NH2” indican extremos terminales de acetilo y amidado, respectivamente; “Nvl” representa norvalina; “Phg” representa fenilglicina; “Sar” representa sarcosina; “Tbg” representa terc-butil-glicina; “Trt” representa tritilo o trifenilmetilo; “Chg” representa ciclohexilglicina; “(N-Me)X” representa la forma N-metilada del aminoácido indicado mediante la abreviatura de una letra o de tres letras para ese aminoácido en el lugar de la variable “X” escrito como N-metil-X [por ejemplo (N-Me)A y (N-Me)Ala representan ambos la forma N-metilada de alanina o N-metil-alanina]; se incorpora 7-azatriptófano cuando se indica “azaTrp”; “(4-F)Phe” representa 4-fluorofenilalanina; “Tyr(OMe)” representa O-metil-tirosina, “Aib” representa ácido amino-isobutírico; “(homo)F” u “(homo)Phe” representa homofenilalanina; “(2-OMe)Phg” se refiere a 2-O-metilfenilglicina; “propargilGly” se refiere a propargil-glicina; “(5-F)W o “(5-F)Trp” se refiere a 5-fluorotriptófano; “D-X” se refiere al estereoisómero D del aminoácido dado “X” en el que el aminoácido puede abreviarse usando el código de una sola o de tres letras [por ejemplo (DChg) representa D-ciclohexilglicina y (D-W) representa D-triptófano]; “(5-MeO)W” o “(5-MeO)Trp” se refiere a 5-metil-O-triptófano; “homoC” se refiere a homocisteína; “(1-Me-W)” o “(1-Me)W” o “(1-Me-Trp)” o “(1-Me)Trp” se refiere a 1-metiltriptófano; “Nle” se refiere a norleucina; se incorpora ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-1-carboxílico cuando se indica “Tiq”; “Asp(T)” se refiere a ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico; “(3-Cl-Phe)” se refiere a 3-clorofenilalanina; “[(N-Me-4-F)Phe]” o “(N-Me-4-F)Phe” se refiere a N-metil-4-fluorofenilalanina; “Boc” es un grupo protector tercbutiloxicarbonilo; “[xXilil(y,z)]” se refiere al resto de puente xililo entre dos cisteínas en el que x puede ser m, p u o para indicar el uso de meta, para u orto-dibromoxilenos (respectivamente) para generar restos de puente, y los identificadores numéricos, y y z, sitúan la posición del aminoácido dentro del polipéptido de las cisteínas que participan en la ciclación; “[ciclo(y,z)]” se refiere a la formación de un enlace entre dos residuos en el que los identificadores numéricos, y y z, sitúan la posición de los residuos que participan en el enlace; “[mXilil-biciclo]” indica que el polipéptido comprende dos bucles cíclicos y que el resto de puente se genera mediante reacción con un meta-dibromoxileno. Todos los demás símbolos se refieren al código de aminoácidos de una letra convencional. Adicionalmente, se indican polipéptidos que comprenden etiquetas de secuencia de PEG2000 o BODIPY-TMR-X.
Tabla 3. Secuencias de polipéptidos
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Ejemplo 4. Síntesis de polipéptidos
Se sintetizan polipéptidos usando métodos convencionales de Fmoc/tBu en fase sólida. La síntesis se realiza normalmente en un sintetizador de péptidos por microondas automatizado Liberty (CEM, Matthews NC) usando protocolos convencionales con resina de amida Rink, aunque también pueden usarse otros sintetizadores automatizados sin capacidades para microondas. Todos los aminoácidos se obtienen a partir de fuentes comerciales a menos que se indique lo contrario. El reactivo de acoplamiento usado es hexafluorofosfato de 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1il)-1,1,3,3,-tetrametilaminio (HCTU) y la base es diisopropiletilamina (DIEA). Se escinden polipéptidos a partir de la resina con el 95% de TFA, el 2,5% de TIS y el 2,5% de agua durante 3 horas y se aíslan mediante precipitación con éter. Los polipéptidos en bruto se purifican en una HPLC preparativa de fase inversa usando una columna C18, con un gradiente de TFA al 0,1% en acetonitrilo/agua de desde el 20%-50% a lo largo de 30 min. Se recogen fracciones que contienen el polipéptido puro y se liofilizan, y todos los polipéptidos se analizan mediante CL-EM.
Ejemplo 5. Formación de polipéptidos ciclados con disulfuro
Para producir polipéptidos ciclados con disulfuro, se disuelve el polipéptido lineal en una mezcla de agua y DMSO, y se agita vigorosamente la disolución resultante bajo una atmósfera de aire durante 12 h.
Ejemplo 6. Ciclación de polipéptido con dibromoxileno
Se carga un matraz de 100 ml con acetonitrilo (12 ml) y agua (24 ml), y se desgasifica con argón durante aproximadamente 5 min. Se añaden polipéptido lineal (0,01 mmol) y bicarbonato de amonio 200 mM (6 ml) seguido por 0,012 mmol o 1,3-bis(bromometil)benceno, 1,2-bis(bromometil)benceno, 1,4-bis(bromometil)benceno, 2,6-bis(bromometil)piridina o (E)-1,4-dibromobut-2-eno. Se agita la mezcla de reacción bajo argón a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas y se monitoriza mediante CL-EM. Tras completarse la reacción, se congela la disolución de reacción y se liofiliza. La purificación mediante HPLC del producto liofilizado en bruto seguida por liofilización de fracciones que contienen polipéptido puro produjo el producto ciclado final como un polvo blanco.
Ejemplo 7. Ciclación de polipéptidos con lactama
Se realizó la ciclación de polipéptidos usando un resto de lactama en fase sólida. En primer lugar se sintetizó un polipéptido sobre una resina de Wang de soporte sólido mediante química de Fmoc convencional. Se incorporaron Fmoc-ASP(alil)-OH y Fmoc-LYS(aloc)-OH en el polipéptido en las posiciones indicadas como los dos monómeros precursores para la formación del puente de lactama. Tras la elongación completa, se lavó la resina con diclorometano anhidro (3x) y se purgó con gas nitrógeno anhidro durante 10 min. Para eliminar los grupos protectores alilo y aloc, se trató la resina con un exceso molar de 5 veces de fenilsilano y se purgó con nitrógeno durante 10 min. Se disolvió una cantidad catalítica de tetrakis-Pd(0) en diclorometano anhidro y se añadió a la suspensión de resina. Tras una hora se lavó la resina secuencialmente con diclorometano (3x), dimetilformamida (3x), dietilditiocarbamato de sodio trihidratado (3x), dimetilformamida (3x) y diclorometano (3x). Se logró la ciclación con lactama en dimetilformamida (DMF) tratando la resina que contenía polipéptido desprotegido con PyAOP (hexafluorofosfato de (3-hidroxi-3H-1,2,3-triazolo[4,5-b]piridinato-O)tri-1 -pirrolidinil-fósforo) y diisopropiletilamina, y se dejó reaccionar durante la noche. Se aclaró la resina con DMF y se trató con PyAOP y diisopropiletilamina nuevas durante 60 minutos adicionales a 45°C. Se aclaró la resina y se lavó con dimetilformamida cinco veces. Se escindió el polipéptido y se purificó tal como se describió en el ejemplo 4.
Ejemplo 8. Ciclación de polipéptidos con triazol
Se realizó la ciclación de polipéptidos que contenían un resto azida y uno alquino en la fase sólida. Se trató la resina que contenía polipéptido (0,05 mmol) con diclorometano y se dejó hinchar durante 10 min. Después se sometió el disolvente a intercambio con DMF (3-5 ml), y tras 10 min se añadió una disolución de ligando Cu-TBTA (125 |il de una disolución 20 mM). Se purgó la suspensión con gas argón y después se añadió ácido ascórbico (5 |imol). Se agitó la disolución durante 2 h y se retiraron los reactivos en exceso, se lavó la resina con una disolución de EDTA en DMF para eliminar el cobre en exceso. Se escindió el polipéptido y se purificó tal como se describió en el ejemplo 4.
Ejemplo 9. Polipéptidos
Se sintetizaron polipéptidos. Éstos incluyen los compuestos indicados en la tabla 4.
Tabla 4. Compuestos
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| R3200________ | [ciclo(1,6)]Ac-K-V-E-R-F-D-(N-Me)D-Tbg-Y-azaTrp-E-Y-P-Aib-(Lys-C16) | 201_________|
Los polipéptidos R3183 (SEQ ID NO: 184) y R3193 (SEQ ID NO: 194) se sintetizaron según las secuencias de aminoácidos de R3176 (SEQ ID NO: 177) con la excepción de la sustitución de Nvl-NH2 por Lys. El grupo amina de cadena lateral del residuo de Lys se modificó con los diferentes restos lipófilos dando resultantes en polipéptidos lipidados.
Ejemplo 10. Optimización y pruebas de inhibidores de C5
Se sometieron a prueba polipéptidos seleccionados según el ejemplo 3 e indicados en la tabla 3 para determinar su capacidad para inhibir la lisis celular mediada por el complemento. Adicionalmente, se sintetizó una variedad de polipéptidos optimizados según los métodos de los ejemplos 4-8 y también se sometieron a prueba (véase la tabla 4). Las secuencias de polipéptido optimizadas incluyen las obtenidas realizando una variedad de truncamientos, deleciones, adiciones y/o sustituciones en los compuestos R3002 (SEQ ID NO: 3), R3008 (SEQ ID NO: 9) y R3021 (SEQ ID NO: 11) o mediante la formación de polipéptidos híbridos que comprendían combinaciones de regiones seleccionadas de cualquiera de los tres.
Ensayo de hemólisis en humanos (ensayos de lisis de RBC usando sueros humanos completos)
Se evaluaron los polipéptidos indicados en la tabla 3, así como sus derivados optimizados (véase la tabla 4), para determinar la actividad inhibidora usando un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos. Se sembraron en placa eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos (Complement Technology, Tyler, TX) a 2,5 x 107 células/pocillo con sueros humanos completos (Complement Technology, Tyler TX) y polipéptidos para determinar el efecto inhibidor de los polipéptidos sobre la lisis de glóbulos rojos. Se centrifugaron células durante 3 minutos a 2.090 x gravedad y se resuspendieron en tampón GVB++ nuevo (Complement Technology, Tyler TX). Se descongelaron rápidamente los sueros humanos a 37°C y después se almacenaron en hielo hasta que se diluyeron en GVB++. Se realizaron diez diluciones en serie en 6 veces de los polipéptidos (disolución madre 10 mM, DMSO) en DMSO y después se añadieron al tampón. Se combinaron 50 |il de cada dilución de polipéptido con sueros y 100 |il de células en pocillos individuales de una placa de microtitulación transparente tratada con cultivo tisular de 96 pocillos (USA Scientific, Ocala, FL) y se resuspendieron mediante pipeteado. Se incubaron las muestras a 37°C durante una hora. Tras la incubación, se centrifugaron las placas a 2.090 x gravedad durante 2 minutos. Se transfirieron 100 |il de sobrenadante a una nueva placa y se leyó la absorbancia a 412 nm. Se ajustaron los datos con una fórmula de log-logit produciendo una curva de dosis-respuesta y CI50. Tal como se usa en el presente documento, el término “CI50” se refiere a la concentración inhibidora semimáxima, un valor usado para indicar la cantidad de inhibidor necesaria para reducir una reacción o un proceso dado a la mitad. En la tabla 5 se indican los compuestos sometidos a prueba.
Tabla 5. Compuestos analizados
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Ejemplo 11. Ensayo de hemólisis en humanos alternativo usando sueros agotados en C5
Se sometieron a prueba los polipéptidos indicados en la tabla 6 para determinar la actividad funcional en un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos usando sueros agotados en C5 humanos y C5 humano purificado en lugar de sueros humanos completos. Para evaluar la actividad, se sembraron en placa eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos (Complement Technology, Tyler, TX) a 2,5 x 107 células/pocillo con sueros agotados en C5 humanos al 1,5% (Complement Technology, Tyler, TX) y C5 humano purificado 0,5 nM (Complement Technology, Tyler, TX). Se centrifugaron los eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos a 2.090 x gravedad durante 3 minutos y después se resuspendieron en GVB++ nuevo (Complement Technology, Tyler, TX). Se descongelaron rápidamente los sueros agotados en C5 humanos y C5 humano purificado a 37°C y después se almacenaron en hielo o hielo húmedo, respectivamente. Se diluyó en serie la disolución madre de polipéptido (10 mM, DMSO) en DMSO con el fin de obtener 10 diluciones de 6 veces y después se añadió GVB++ a las mismas. Se combinaron 50 |il de cada dilución de polipéptido con 25 |il de sueros agotados en C5, 25 |il de C5 humano purificado y 100 |il de células en pocillos individuales de una placa de microtitulación transparente tratada con cultivo tisular de 96 pocillos (USA Scientific, Ocala, FL) y se resuspendieron mediante pipeteado. Se incubaron las muestras a 37°C durante una hora. Al completarse la incubación, se centrifugaron las placas a 2.090 x gravedad durante 2 minutos. Se transfirieron 100 |il de sobrenadante a una nueva placa y se leyó la absorbancia a 412 nm. Se ajustaron los datos con una fórmula de log-logit produciendo una curva de dosis-respuesta y CI50.
Tabla 6. Compuestos analizados
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Ejemplo 12. Inmunoensayo enzimático para evaluar la inhibición de C5
Se evaluó la actividad inhibidora de C5 mediante inmunoensayo enzimático (EIA). Se midieron la inhibición de la producción de C5a y el complejo de ataque a membrana (MAC) mediante kits de EIA MicroVue (Quidel Corporation, San Diego, CA).
EIA de C5a
Se diluyó 1:50 el sobrenadante de un ensayo de hemólisis de RBC humanos de R3002 (SEQ ID NO: 3) y R3008 (SEQ ID NO: 9) y se sometió a ensayo mediante EIA de C5a (figura 1). Ambos polipéptidos inhibieron la formación de C5a. R3002 (SEQ ID NO: 3) tenía una CI50 de 5,4 nM, R3008 (SEQ ID NO: 9) tenía una CI50 de 54,5 nM.
EIA de complejo de ataque a membrana (MAC)
Se realizó el EIA de MAC con el sobrenadante diluido (1:5) de R3008 (SEQ ID NO: 9) de un ensayo de hemólisis de RBC humanos (figura 2). Se mostró que este polipéptido inhibía la formación del MAC con una CI50 de 33 nM.
Ejemplo 13. Caracterización de unión a compuesto peptidomimético mediante polarización de fluorescencia
La polarización de fluorescencia (FP) permite medir acontecimientos de unión en una disolución homogénea (Banks, P. et al., Impact of a red-shifted dye label for high throughput fluorescence polarization assays of G protein-coupled receptors. J Biomol Screen. octubre de 2000; 5(5):329-34 y Parker, G.J. et al., Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/fosfatase assays. J Biomol Screen. abril de 2000; 5(2):77-88). El concepto clave de FP es que el grado en el que un fluoróforo polariza la luz está inversamente relacionado con su rotación molecular (Lea, W.A. et al., Fluorescence polarization assays in small molecule screening. Expert Opin Drug Discov. enero de 2011; 6(1):17-32), y un fluoróforo unido a una proteína diana mucho mayor rota más lentamente que un fluoróforo no unido, dando como resultado un aumento de la polarización que puede cuantificarse. Se ha usado FP cada vez más en campañas de alto rendimiento como método para medir la unión ligando-diana (Parker, G.J. et al., Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/fosfatase assays. J Biomol Screen. abril de 2000; 5(2):77-88), para la determinación de la constante de disociación en equilibrio (Kd) (Prystay, L. et al., Determination of equilibrium dissociation constants in fluorescence polarization. J Biomol Screen. junio de 2001; 6(3):141-50), y el descubrimiento de moléculas de partida mediante ensayos de unión de competencia (Tian, W. et al., Development of novel fluorescence polarization-based assay for studying the p-catenin/Tcf4 interaction. J Biomol Screen. abril de 2012; 17(4):530-4).
Materiales y métodos
Se usó FP para examinar inhibidores de polipéptidos competitivos de la proteína C5. Se generó la sonda R3076 (SEQ ID NO: 40) incubando el polipéptido original, R3072 (SEQ ID NO: 20), con BODIPY-TMR-X, SE (Life Technologies, Grand Island, NY) en Dm F (Sigma, Saint Louis, MO) durante 4 horas. El colorante BODIPY-TMR se unió a la lisina C-terminal de la proteína y se purificó la sonda marcada consiguiente mediante HPLC.
La constante de disociación en equilibrio (Kd) para la unión de R3076 (SEQ ID NO: 40) a la proteína C5 humana (Complement Technology, Tyler, TX) se determinó incubando una disolución de R307625 nM (SEQ ID NO: 40) con concentraciones crecientes de proteína C5. Se midió la polarización a lo largo del tiempo, hasta que la unión alcanzó el equilibrio. Se determinó la Kd usando Graphpad Prism (usando “Saturating Binding Curves, One Site - Specific Binding With Hill Slope” como ajuste de curva para determinar la Kd). El equilibrio se alcanzó después de 10 minutos, permaneciendo los valores para Kd, pendiente y unión máxima estables a lo largo de 60 minutos. Se determinó un valor de Kd final de 8,07 nM (desviación estándar de 0,53) calculando el promedio de los valores de Kd desde 10 hasta 60 minutos. Basándose en esta información, se eligieron las concentraciones de 25 nM y 50 nM para R3076 (SEQ ID NO: 40) y proteína C5, respectivamente, para su uso en el ensayo de competición. Estas concentraciones representaron el nivel aproximado de proteína necesaria para el 95% de unión de la sonda a la proteína C5. R3023 (SEQ ID NO: 104) es una variante de polipéptido reorganizada al azar de R3002 (SEQ ID NO: 3) y se incluyó en todos los ensayos como control negativo.
Se diluyó proteína C5 humana hasta 200 nM en tampón de ensayo, compuesto por TBS (EMD Millipore, Billerica, MA) Triton-X al 0,005% (Sigma, Saint Louis, MO). Se añadieron 10 |il de tampón de ensayo a todos los pocillos de una placa de ensayo de 384 pocillos, sin unión, negra (Greiner, Monroe, NC), y se añadieron 10 |il de disolución madre de proteína C5 diluida a pocillos de experimento y de control designados.
Se diluyó la sonda R3076 (SEQ ID NO: 40) a 1 con respecto a 10 en DMSO (Life Technologies, Grand Island, NY) y se diluyeron 30 |il de esa disolución madre en 3 ml de tampón de ensayo para proporcionar una disolución madre 100 nM. Después se añadieron 10 |il de esta disolución madre de trabajo a cada pocillo en la placa de ensayo. Se incubó la placa de ensayo a temperatura ambiente, protegida de la luz, durante 20 minutos para permitir que la unión alcanzara el equilibrio.
Posteriormente se diluyeron los artículos de prueba indicados en la tabla 7 en DMSO y después tampón de ensayo, que comprendía 10 diluciones de 2 veces, y después se añadieron a la placa de ensayo por triplicado, rápidamente. Después se incubó la placa de ensayo en el lector de placas Paradigm (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) durante 60 minutos a 25°C.
Tras la incubación durante 60 minutos, se leyó la placa usando el protocolo de FP de Paradigm (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) y se importaron valores de polarización sin procesar a Graphpad Prism. Se determinaron K (usando el modelo de ajuste “One Site K Curve”, concentración de sonda = 25 nM, Kd = 8,07 nM, con el nivel inicial restringido al promedio del control de unión al 0%) y CI50 (log de inhibidor frente a respuesta, ajuste de curva de 4 parámetros) en Graphpad.
Resultados
Todos los artículos de prueba fueron capaces de competir con la sonda marcada para la unión a proteína C5 humana (figura 3, tabla 7). R3003 (SEQ ID NO: 4) fue el polipéptido más potente sometido a prueba, con un valor de Ki de 9,54 nM. La unión de R3023 (SEQ ID NO: 104) no se detectó a la concentración más alta sometida a prueba.
Tabla 7. Datos de polarización de fluorescencia de competencia
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Los datos mostrados en la tabla 7 se obtuvieron a partir del análisis de ajuste de curva realizado mediante el software Graphpad Prism tal como se describió anteriormente. Se calculó el promedio de valores por triplicado para proporcionar los puntos de datos presentados en cada experimento. De los polipéptidos sometidos a prueba, R3003 (SEQ ID NO: 4) se identificó originalmente mediante selección por visualización en ARNm. La afinidad de R3003 (SEQ ID NO: 4) por C5 se verificó mediante los resultados del análisis de FP que presentaron unos valores bajos de K, así como CI50. Los inhibidores R3011 (SEQ ID NO: 31) y R3050 (SEQ ID n O: 23) también presentaron una afinidad relativamente fuerte por C5. Un polipéptido de control, R3023 (SEQ ID NO: 104), no presentó ninguna afinidad por C5, mientras que los inhibidores R3014 (SEQ ID NO: 55) y R3043 (SEQ ID NO: 50) presentaron una afinidad débil.
Ejemplo 14. Análisis de estabilidad de compuesto en plasma
Se sometieron a ensayo compuestos para determinar la estabilidad en plasma humano en las siguientes condiciones. Se obtuvo plasma humano plasma de Bioreclamation (Westbury, NY) y se recogió en heparina sódica. Se ajustó el plasma a pH 7,4. Se prepararon disoluciones madre en DMSO a una concentración de 10 mM para los compuestos de prueba. Se dosificaron alícuotas de las disoluciones en DMSO en 1 ml de plasma, que se había calentado previamente hasta 37°C, a una concentración de compuesto de prueba final de 10 |iM. Se mantuvieron los viales en un dispositivo THERMOMIXER® de sobremesa (Eppendorf, Hauppauge, NY) durante la duración del experimento. Se tomaron alícuotas (100 |il) en cada punto de tiempo y se añadieron a una placa de 96 pocillos que se había llenado previamente con 300 |il de una disolución en acetonitrilo que contenía una mezcla de los patrones internos (metoprolol, propranolol y warfarina, cada uno a 500 ng/ml). Se almacenaron las muestras a 4°C hasta el final del experimento. Tras tomarse la muestra del punto de tiempo final, se mezcló la placa y después se centrifugó a 3.000 rpm durante 10 minutos. Se extrajeron alícuotas de sobrenadante y se analizaron mediante LC-HRAMS. Los ajustes de cromatografía de líquidos se indican en la tabla 8 y los ajustes de espectrometría de masas se indican en la tabla 9.
Tabla 8. Ajustes de cromatografía de líquidos
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Tabla 9. Ajustes de espectrometría de masas
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Se determinó la concentración del compuesto de prueba R3050 (SEQ ID NO: 23) mediante comparación con una curva de calibración previamente determinada (tabla 1 0 ).
Tabla 10. Perfil de estabilidad
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En estas condiciones, se mostró que R3050 (SEQ ID NO: 23) era altamente estable.
Ejemplo 15. Variantes de polipéptidos que comprenden análogos de triptófano
En algunos casos, los polipéptidos de la presente divulgación comprenden 7-azatriptófano. Para determinar la importancia de este residuo en la inhibición de C5, se llevó a cabo un análisis de sustitución de aminoácidos en el que se remplazó 7-azatriptófano por triptófano natural así como diversos otros análogos de triptófano incluyendo 5-fluorotriptófano [(5-F)W], 1-metil-triptófano [(1-Me)W], D-triptófano y 5-metil-O-triptófano [(5-MeO)W]. También se analizaron polipéptidos similares con sustituciones distintas de triptófano.
Se sintetizaron variantes de polipéptidos de R3002 (SEQ ID NO: 3) y R3008 (SEQ ID NO: 9), y se sometieron a prueba para determinar su capacidad para inhibir la lisis de glóbulos rojos tal como se describió en el ejemplo 10 (véanse las tablas 11 y 12). De las variantes sometidas a prueba, todas aquellas con sustitución del residuo 7-azatriptófano demostraron una capacidad reducida para inhibir la lisis de glóbulos rojos, tal como se indica mediante los valores de CI 50 promedio crecientes (una medición de la concentración inhibidora semimáxima, un valor usado para indicar la cantidad del inhibidor necesaria para reducir una reacción o un proceso dado a la mitad).
Tabla 11. Polipéptidos variantes de 7-azatriptófano de R3002 (SEQ ID NO: 3) analizados mediante ensayo de hemólisis en humanos
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Tabla 12. Polipéptidos variantes de 7-azatriptófano de R3008 (SEQ ID NO: 9) analizados mediante ensayo de hemólisis en humanos
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Ejemplo 16. Efecto de truncamiento de polipéptidos y deleción de aminoácidos analizados mediante ensayo de hemólisis en humanos
Se sintetizaron variantes de polipéptidos truncadas en el extremo C-terminal de R3021 (SEQ ID NO: 11) y se sometieron a ensayo mediante el ensayo de hemólisis en humanos descrito en el ejemplo 10 para determinar su capacidad para inhibir la lisis de glóbulos rojos dependiente de C5. En la tabla 13 se indican valores de CI50 promedio (una medida de la concentración inhibidora semimáxima, un valor usado para indicar la cantidad del inhibidor necesaria para reducir una reacción o un proceso dado a la mitad) para cada polipéptido sometido a prueba. Los polipéptidos truncados demostraron una capacidad reducida (tal como se indica mediante un aumento del valor de CI50) para inhibir la lisis de glóbulos rojos, teniendo las variantes que carecen de triptófano los valores de CI50 más grandes.
Adicionalmente, se sintetizaron variantes de polipéptidos de R3021 (SEQ ID NO: 11) con deleciones de aminoácidos internas y se sometieron a ensayo (véase la tabla 14) para determinar su capacidad para inhibir la lisis de glóbulos rojos dependiente de C5 según el método descrito en el ejemplo 10. Adicionalmente, se sustituyó la metionina N-terminal en estas variantes por un grupo acetilo. En la tabla 14 se indican valores de CI50 promedio para cada polipéptido sometido a prueba. De manera interesante, la sustitución del grupo acetilo de la metionina N-terminal sola [R3048 (SEQ ID NO: 19)] aumentó la capacidad del polipéptido para inhibir la lisis de glóbulos rojos. La eliminación del residuo D interno [R3124 (SEQ ID NO: 130)] o los residuos DVY internos [R3125 (SEQ ID NO: 131), correspondientes a los residuos 8, 9 y 10 de R3021 (SEQ ID NO: 11)], condujo a una disminución de la capacidad del polipéptido para inhibir la lisis de glóbulos rojos.
Tabla 13. Variantes de polipéptidos truncadas en el extremo C-terminal de R3021 (SEQ ID NO: 11) analizadas mediante ensayo de hemólisis en humanos
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Tabla 14. Variantes de polipéptidos de R3021 (SEQ ID NO: 11) con deleciones de aminoácidos internas analizadas mediante ensayo de hemólisis en humanos
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Ejemplo 17. Incorporación de polipéptidos de unión a albúmina
Se conjugan polipéptidos con uno o más polipéptidos que modulan la unión a proteínas en plasma. Estos polipéptidos, denominados en el presente documento “polipéptidos de unión a albúmina”, se indican en la tabla 15.
Tabla 15. Polipéptidos de unión a albúmina
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Se ciclan polipéptidos de unión a albúmina mediante la formación de enlaces disulfuro en residuos de cisteína. En algunos casos, se conjugan polipéptidos de unión a albúmina mediante sus extremos o bien N o bien C-terminales, teniendo por tanto estructuras ligeramente diferentes (por ejemplo, sin grupos acetilo).
Ejemplo 18. Incorporación de polipéptidos de penetración celular
Se conjugan polipéptidos con un polipéptido que tiene propiedades de penetración celular. Estos polipéptidos se indican en la tabla 16 y se describen en Milletti, F., Cell-penetrating polypeptides: classes, origin, and current landscape. Drug Discov Today. agosto de 2012; 17(15-16):850-60.
Tabla 16. Polipéptidos de penetración celular
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Ejemplo 19. Análisis de mezclas de polipéptidos que comprenden estereoisómeros de aminoácidos
Se sintetizaron los polipéptidos R3136 (SEQ ID NO: 137) y R3137 (SEQ ID NO: 138) según las secuencias de aminoácidos de R3085 (Se Q ID NO: 90) y R3082 (SEQ ID NO: 116), respectivamente, con la excepción de la sustitución de Phg en cada uno por D-Phg (véase la tabla 17). Se analizaron composiciones que comprendían o bien R3136 (SEQ ID NO: 137) y R3085 (SEQ ID NO: 90) o bien R3137 (SEQ ID NO: 138) y R3082 (SEQ ID NO: 116) para determinar su capacidad para inhibir la lisis de glóbulos rojos según el ensayo de hemólisis en humanos descrito en el ejemplo 10. La composición que comprendía R3136 (SEQ ID NO: 137) y R3085 (SEQ ID NO: 90) proporcionó una CI50 promedio (nM) de >50.000, mientras que la composición que comprendía R3137 (SEQ ID NO: 138) y R3082 (SEQ ID NO: 116) proporcionó una CI50 promedio (nM) de >100.000.
Tabla 17. Compuestos usados en mezclas de polipéptidos de estereoisómeros de aminoácidos
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Ejemplo 20. Estudios farmacocinéticos en primates no humanos
Se llevaron a cabo estudios farmacocinéticos en primates no humanos usando los compuestos indicados en la tabla 18. En la tabla, “comp.” se refiere a compuesto y “prom.” se refiere a promedio.
Tabla 18. Compuestos sometidos a prueba en estudios in vivo
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| R3201_______| [mXilil(1,6)]Ac-C-V-E-R-F-C-D-Tbg-Y-azaTrp-E-Y-P-Chg-Nvl
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| 7,7______ |J211_________ |
Se determinó la concentración en plasma del polipéptido R3152 (SEQ ID NO: 153) en macacos cangrejeros tras una única dosis intravenosa (i.v.). Tres animales macho recibieron polipéptido 3 mg/kg y se determinaron las concentraciones en plasma de polipéptido usando CL/EM-EM tras precipitación con acetonitrilo y extracción en una placa de precipitación de proteínas Sirocco (Waters Corporation, Milford, MA). Se calcularon los parámetros farmacocinéticos (PK) a partir del transcurso temporal (véase la figura 4) de las concentraciones en plasma combinadas de R3152 (SEQ ID NO: 153), determinadas inmediatamente tras la dosis hasta 48 h tras la dosis. Los niveles de fármaco en plasma disminuyeron rápidamente durante una fase de distribución inicial (<1 hora) y después presentaron una meseta y fueron detectables durante hasta 48 horas. R3152 (SEQ ID NO: 153) tenía una semivida terminal media de 10,9 ± 0,8 horas. La tasa de aclaramiento media fue de 0,129 ± 0,0122 l/h/kg, que es aproximadamente el 5% del flujo de sangre en el hígado de un mono típico (2,6 l/h/kg). El volumen medio de distribución fue de 1,49 ± 0,152 l/kg, que es aproximadamente el doble del agua corporal total para un mono típico (0,7 l/kg). El AUC- promedio fue de 23319 ± 2120 h*ng/ml.
R3152 (SEQ ID NO: 153) se une con alta afinidad a proteína C5 de primate y bloquea la ruta del complemento evitando la generación de los productos C5a y C5b y la producción de un complejo de ataque a membrana (MAC) multimérico. La inhibición de la formación de MAC mediada por complemento en muestras de plasma a partir del estudio de PK anterior se examinó usando un ensayo ex vivo establecido (véase el ensayo de hemólisis en humanos descrito en el ejemplo 10), en el que se diluyó plasma 1:100 y se incubó con glóbulos rojos de oveja activados (Complement Technology, Tyler, TX). En cada punto de tiempo, se determinó la actividad hemolítica como indicador de complemento en suero activo (véase la figura 4). En plasma que contenía R3152 >200 ng/ml (SEQ ID NO: 153) había una clara inhibición de hemólisis mediada por complemento, indicando un bloqueo de formación de MAC. R3152 exógeno (SEQ ID NO: 153) añadido a plasma de macaco cangrejero normal tiene una CI50 = 2-20 ng/ml. La actividad hemolítica volvió a niveles normales 48 horas tras la dosificación dado que los niveles en plasma de R3152 (SEQ ID NO: 153) disminuyeron por debajo de 100 ng/ml.
Ejemplo 21. Estudios farmacocinéticos en rata
Se administró R3152 (SEQ ID NO: 153) como dosis intravenosa (i.v.) o subcutánea (s.c.) a ratas macho a 2 y 30 mg/kg, respectivamente. Tras la dosificación i.v., se monitorizó R3152 (SEQ ID NO: 153) usando CL/EM-EM tras precipitación con acetonitrilo y extracción en una placa de precipitación de proteínas Sirocco (Waters Corporation, Milford, MA) tal como se describió anteriormente. Se calcularon parámetros farmacocinéticos (PK) a partir del transcurso temporal de las concentraciones en plasma combinadas de R3152 (SEQ ID NO: 153) y su metabolito desaminado en el extremo C-terminal equipotente, R3201 (SEQ ID NO: 211). Los resultados se presentan en la figura 5. En la figura, los círculos representan concentraciones obtenidas después de una dosis s.c. y los cuadrados representan concentraciones obtenidas después de una dosis i.v.
R3152 (SEQ ID NO: 153) / R3201 (SEQ ID NO: 211) mostró una fase de distribución rápida, seguida por una eliminación lenta con un ty2 = 5,3 h. Se observó una tasa de eliminación similar tras la dosificación s.c. de 30 mg/kg, con una biodisponibilidad de dosis de aproximadamente el 65%, basándose en el AUC. El Tmáx de 4 h y la exposición a fármaco prolongada observada en dosis s.c. permitió la cobertura extendida de la concentración terapéutica en plasma. Dado que R3152 (SEQ ID NO: 153) y R3201 (SEQ ID NO: 211) no se unen a C5 de rata, se observó muy poca actividad inhibidora en ensayos de hemólisis ex vivo.
Se evaluaron compuestos lipidados y no lipidados, R3183 (SEQ ID NO: 184) y R3176 (SEQ ID NO: 177), respectivamente, para determinar propiedades farmacocinéticas en ratas Sprague-Dawley macho tras la administración intravenosa o subcutánea. Las figuras 6A y 6B muestran los resultados. La figura 6A muestra ratas Sprague-Dawley macho (n=3) a las que se les inyectó por vía intravenosa una única dosis de 2 mg/kg. Se extrajeron muestras de sangre en puntos de tiempo indicados, se procesaron para dar plasma y se analizaron para detectar el compuesto indicado mediante CL-EM. Círculos negros: R3176 (SEQ ID NO: 177) (compuesto no lipidado); círculos blancos: R3183 (SEQ ID NO: 184) (compuesto lipidado en C16). La figura 6B muestra ratas Sprague-Dawley macho (n=3) a las que se les inyectó por vía subcutánea una única dosis de 15 mg/kg. Se extrajeron muestras de sangre en puntos de tiempo indicados, se procesaron para dar plasma y se analizaron para detectar el compuesto indicado mediante CL-EM. Círculos negros: R3176 (s Eq ID NO: 177) (compuesto no lipidado); círculos blancos: R3183 (SEQ ID NO: 184) (compuesto lipidado en C16). La lipidación dio como resultado un aumento de la exposición tal como se evaluó mediante la determinación del área bajo la curva (AUC) de 2,1 veces por la vía intravenosa y de 2,7 veces por la vía subcutánea.
Ejemplo 22. Inhibición de la hemólisis en la ruta del complemento inducida por trombina
La trombina puede inducir actividad del complemento escindiendo C5 para dar C5t, que después se escindirá para dar C5a y C5bT. C5bT, al igual que C5b, se asociará con C6 y los componentes terminales restantes de la ruta del complemento, C7, C8 y C9, que conducirá a la formación del complejo de ataque a membrana (MAC) provocando la lisis de glóbulos rojos (Krisinger, et al., (2014). Blood. 120(8):1717-1725). Por tanto, se sometieron a prueba R3183 y un anticuerpo monoclonal anti-C5 similar a ECULIZUMAB® para determinar su capacidad para inhibir la hemólisis mediante la ruta del complemento inducida por trombina.
Para evaluar la actividad inhibidora, se añadió C5 (Complement Technology, Tyler, TX) para lograr una concentración de 400 nM, y se incubó la muestra con C6 a una concentración final de 600 nM (Complement Technology, Tyler, TX) y trombina a una concentración de 50 nM (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN) a 37°C durante 30 minutos, en presencia o bien de R3183 o bien del anticuerpo monoclonal anti-C5 similar a ECULIZUMAB®, o ningún inhibidor. Se detuvo la reacción con la adición de hirudina hasta 150 nM (Cell Sciences, Canton, MA) en el tampón GVB+EDTA (Complement Technology, Tyler, TX) y se incubó durante 5 minutos a temperatura ambiente. Se mezclaron estas muestras diluidas con eritrocitos de oveja sensibilizados por anticuerpos (Complement Technology, Tyler, TX) en una placa de microtitulación de 96 pocillos (USA Scientific, Ocala, FL) y se incubaron a 37°C durante 5 minutos. Después se añadió C7 (Complement Technology, Tyler, TX) a los pocillos para lograr una concentración de 15 nM y se devolvió la placa hasta 37°C durante 15 minutos. Después se añadió un complejo de C8 (10 nM; Complement Technology, Tyler, TX) y C9 (25 nM; Complement Technology, Tyler, TX) a la mezcla de ensayo y se incubaron las muestras durante 30 minutos a 37°C. Tras la incubación, se centrifugó la placa a 1000 x g y se transfirieron 100 |il de sobrenadante a una nueva placa de microtitulación y se leyó la absorbancia a 412 nm. Los datos resultantes se muestran en la figura 7. Se encontró que R3183 inhibía la hemólisis mediante la ruta del complemento inducida por trombina a concentraciones superiores a 6 ng/ml, mientras que el anticuerpo monoclonal anti-C5 no la inhibía.
Ejemplo 23. Análisis por resonancia de plasmón superficial de la unión de R3183
Se llevaron a cabo experimentos de resonancia de plasmón superficial (SPR) a 25°C usando el sistema ProteOn XPR36 de BioRad Laboratories, Inc. (Hercules, CA). Se inmovilizó la proteína C5 [o control de albúmina sérica humana (HSA)] mediante acoplamiento directo de amina en un chip sensor ProteOn GLH diseñado para la capacidad de unión máxima usando tampón acetato pH 5. Se realizó la caracterización cinética de la unión de R3183 en tampón de unión que contenía HEPe S 10 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, MgCh 0,5 mM, CaCh 0,15 mM, Tween-20 al 0,005% y DMSO al 1% para determinar kon, k f y Kd. Se realizó el análisis de datos usando el software ProteOn Manager de BioRad. Se ajustaron los sensogramas al modelo de ligando heterogéneo (véase la figura 8). Las concentraciones de R3183 evaluadas en este experimento fueron 3,3, 1,1, 0,37 y 0,12 pM tal como se indica en la figura.
Se halló que R3183 tenía una ka (1/Ms) de 1,18 x 105 para C5, así como una kd (1/s) de 3,04 x 10-4 y una Kd (M) de 2,58 x 10-9. Los valores para la unión de HSA fueron: ka (1/Ms) de 3,01 x 104, kd (1/s) de 1,76 x 10-1 y una Kd (m ) de 5,86 x 10-6
Ejemplo 24. Estudios estructurales
Se llevaron a cabo estudios de cristalografía para comparar los sitios de unión a C5 entre un análogo químico cerrado de R3183 y ECULIZUMAB® (Alexion Pharmaceuticals, Cheshire, CT). Un modelo de ajuste inducido reveló que el análogo se une a un sitio distinto del notificado para ECULIZUMAB®.
Ejemplo 25. Análisis mediante inmunoensayo de la actividad inhibidora de R3183
Se evaluó la actividad inhibidora de C5 para R3183 mediante inmunoensayo enzimático (EIA). Se midieron la inhibición de la producción de C5a y del complejo de ataque a membrana (MAC) mediante los kits de EIA MicroVue (Quidel Corporation, San Diego, CA).
Se diluyó 1:50 el sobrenadante a partir del ensayo de hemólisis de glóbulos rojos (RBC) humanos de R3183 y se sometió a ensayo mediante EIA de C5a (figura 9). R3183 inhibió la formación de C5a con una CI50 de 11 nM.
Se realizó el EIA de MAC con R3183 en el mismo sobrenadante, diluido 1:5 (véase la figura 10). Se demostró que este compuesto inhibía la formación de MAC con una CI50 de 6,9 nM. También se analizaron muestras de suero que contenían diferentes concentraciones de R3183 para determinar la inhibición de la ruta alternativa de activación del complemento usando el kit de examen del sistema del complemento WIESLAB® (Euro Diagnostica, Malmo, Suecia). Los resultados indicaron una CI50 de 12,5 nM para R3183.
Ejemplo 26. Ensayo de hemólisis en humanos
Se comparó la actividad inhibidora de R3183 con un anticuerpo similar a ECULIZUMAB® (AcM-C5) usando un ensayo de hemólisis de glóbulos rojos. Se construyó un vector de expresión de ADN para un anticuerpo monoclonal IgG-inhibidor de C5 (AcM-C5) a partir de la secuencia publicada para las secuencias de cadenas pesadas y ligeras variables de h5G1.1, h5G1.1VHC+F y h5G1.1VLC+F, respectivamente (Thomas et al. 1996. Molecular Immunology.
33(17-18):1389-401). Se usaron las secuencias de cadena pesada constante de IgG2 y de cadena ligera kappa constante humana para las regiones constantes del anticuerpo. Se expresó este anticuerpo a partir de células renales embrionarias humanas (HEK293) y se purificó mediante cromatografía de afinidad de proteínas A. Se sembraron en placa eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpo (Complement Technology, Tyler, TX) a 2,5 x 107 células/pocillo con sueros humanos completos (Complement Technology, Tyler TX) con o sin inhibidores para determinar el efecto inhibidor de los compuestos sobre la lisis de glóbulos rojos. Se centrifugaron las células durante 3 minutos a 2.090 x gravedad y se resuspendieron en tampón GVB++ nuevo (Complement Technology, Tyler TX). Se descongelaron rápidamente sueros humanos a 37°C y luego se almacenaron en hielo hasta su dilución en GVB++. Se realizaron diez diluciones en serie de 6 veces de cada compuesto (madre 10 mM, DMSO) en DMSO y luego se añadieron al tampón. Se combinaron 50 |il de cada dilución de compuesto con sueros y 100 |il de células en pocillos individuales de una placa de microtitulación transparente de 96 pocillos tratada con cultivo tisular (USA Scientific, Ocala, FL) y se resuspendieron mediante pipeteo. Se incubaron las muestras a 37°C durante una hora. Tras la incubación, se centrifugaron las placas a 2,090 x gravedad durante 2 minutos. Se transfirieron 100 |il de sobrenadante a una nueva placa y se leyó la absorbancia a 412 nm. Se ajustaron los datos con una fórmula log-logit produciendo una curva dosisrespuesta y una CI50 (véase la figura 11A). La CI50 para R3183 fue de 8,1 nM en comparación con 0,2 nM para AcM-C5. Curiosamente, el peso molecular para R3183 es de 2 kDa, mientras que el peso molecular para AcM-C5 es de 140 kDa, lo que indica una cantidad global mucho menor necesaria para aplicaciones terapéuticas.
Estudios similares indicaron que R3183 también es activo en suero de macacos cangrejeros y cerdos, pero menos activo en suero de roedores y perros. Cuando se comparó suero humano al 1% con suero de macaco cangrejero al 1% en el ensayo, R3183 tuvo una CI50 de 1,9 nM y una CI90 de 5,2 nM con suero humano en comparación con una CI 50 de 4,2 nM y una CI90 de 13,2 nM con suero de macaco cangrejero (véase la figura 11B).
Ejemplo 27. Estudios farmacodinámicos y farmacocinéticos
Se llevaron a cabo estudios en primates no humanos para determinar la dosis y la pauta de R3183 necesarias para lograr una inhibición sostenida del complemento, así como para determinar el perfil farmacocinético de R3183 durante el periodo de administración y a lo largo del tiempo después de la administración de la dosis final. Un grupo de dosis baja (dosis A) de tres animales macho recibieron 0,3 mg/kg de R3183 diariamente durante siete días, y se monitorizaron durante 10 días después de eso. Un segundo grupo de dosis alta de tres animales macho recibieron una única dosis baja (dosis A; 0,3 mg/kg) de R3183 el día 1 y recibieron dosis diarias más altas (dosis B; 3,0 mg/kg) de R3183 durante 6 días después de eso. También se monitorizó este grupo durante 10 días después de recibir la dosis final. Se obtuvieron muestras de plasma antes de cada dosis, inmediatamente después de la dosis y dos veces después de eso cada día hasta que se completó la administración de dosis diarias. Se tomaron muestras periódicamente después de eso durante 10 días. Se determinaron las concentraciones de R3183 en cada muestra de plasma usando CL/EM-EM tras la precipitación en acetonitrilo y extracción en placas de precipitación de proteínas Sirocco (Waters Corporation, Milford, m A).
R3183 se une con alta afinidad a la proteína C5 de primate y bloquea la ruta del complemento evitando la generación de los productos C5a y C5b y la producción de un complejo de ataque a membrana (MAC) multimérico. Se examinó la inhibición de la formación de MAC mediada por el complemento en las mismas muestras de plasma usando un ensayo ex vivo establecido en el que se diluyó 1:100 el plasma y se incubó con glóbulos rojos de oveja activados (Complement Technology, Tyler, TX). En cada punto de tiempo, se determinó la actividad hemolítica como indicador de complemento sérico activo (véanse las figuras 12A y 12B). En el grupo de dosis baja, se observó una inhibición del 90% con algunas concentraciones en plasma de R3183 entre 2000 y 4000 ng/ml, con una inhibición de más del 90% con la mayoría de las concentraciones superiores a 4000 ng/ml (figura 12A). Se detectó la inhibición por parte de R3183 de la actividad hemolítica se detectó hasta 10 días después del tratamientos final. En la figura 13 se presenta una representación gráfica combinada de los datos a partir de los grupos de dosis baja y alta.
Ejemplo 28. Inhibición de la lisis con la adición de componentes terminales
Se incubó C5 con C6 y trombina a 37°C durante 30 minutos con y sin R3183. Se detuvo la reacción con la adición de hirudina. Se mezclaron las muestras diluidas con eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpo y luego se incubaron durante 5 minutos a 37°C. Se añadió C7 purificado y se incubó durante 15 minutos a 37°C. Luego se añadió un complejo de C8 y C9 purificados y se incubó la mezcla durante 30 minutos a 37°C. Se centrifugó la placa, y se transfirió el sobrenadante y se leyó a 412 nm. Los resultados demuestran una fuerte inhibición en presencia de R3183 (véase la figura 14).
Ejemplo 29. Análisis de la hemólisis en muestras de pacientes con PNH
Se monitorizó la activación e inhibición de la ruta alternativa del complemento en células sanguíneas obtenidas a partir de pacientes con hemoglobinuria paroxística nocturna (PNH) en presencia o ausencia de inhibidores del complemento mediante citometría de flujo tal como se describe en Risitano et al., 2012. Blood. 119(6): 6307-16. La activación del complemento puede aumentarse cuando el suero está acidificado. En este caso, se incubaron en suero glóbulos rojos a partir de pacientes con PNH en presencia o ausencia de R3144 (SEQ ID NO: 145) o ECULIZUMAB®. Se usó suero inactivado por calor como control negativo (es decir, no tiene lugar la lisis de sangre roja). Se redujo el pH en las muestras mediante la adición de ácido clorhídrico (dilución 1:20 de HCl 0,1 N) para iniciar la activación del complemento. Se incubaron las muestras durante 24 horas a 37°C antes de su análisis. Se sedimentaron los glóbulos rojos, y se resuspendió 1 |il en 1 ml de solución salina. Luego se incubaron las muestras con anticuerpos anti-CD59 con etiquetas de ficoeritrina así como con anticuerpos anti-C3 etiquetados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) durante 1 hora antes del análisis por clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Los resultados indicaron niveles de inhibición similares superiores a los niveles iniciales tanto para R3144 como para ECULIZUMAB®.

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Polipéptido que consiste en SEQ ID NO: 194 o SEQ ID NO: 184 para su uso en un método de tratamiento de un trastorno relacionado con el complemento C5, comprendiendo el método administrar el polipéptido a una dosis de desde aproximadamente 0,1 mg/kg hasta aproximadamente 10 mg/kg, en el que la hemólisis en el sujeto se reduce en al menos el 50% en relación con los niveles de hemólisis previamente observados en dicho sujeto.
2. Polipéptido para su uso según la reivindicación 1, en el que dicho polipéptido se administra a dicho sujeto a una dosis de desde aproximadamente 0,3 mg/kg hasta aproximadamente 3 mg/kg.
3. Polipéptido para su uso según la reivindicación 2, en el que dicho polipéptido se administra a dicho sujeto a una dosis de aproximadamente 0,3 mg/kg.
4. Polipéptido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que dicha administración se lleva a cabo diariamente.
5. Polipéptido para su uso según la reivindicación 4, en el que dicha administración se lleva a cabo durante siete días.
Polipéptido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el trastorno relacionado con el complemento C5 es hemoglobinuria paroxística nocturna.
Polipéptido para su uso según la reivindicación 6, en el que dicho sujeto se ha tratado previamente con ECULIZUMAB.
8. Polipéptido para su uso según la reivindicación 6, en el que dicho sujeto también está recibiendo tratamiento con ECULIZUMAB.
9. Polipéptido para su uso según la reivindicación 7 u 8, en el que el tratamiento con ECULIZUMAB es ineficaz.
10. Polipéptido para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, en el que la hemólisis en el sujeto se reduce en al menos el 90% en relación con los niveles de hemólisis previamente observados en dicho sujeto.
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