JPH08510325A

JPH08510325A - 生物学的に活性なペプチド配列の選択方法

Info

Publication number: JPH08510325A
Application number: JP6524710A
Authority: JP
Inventors: ブイ．ドイル，マイケル
Original assignee: カイロンコーポレイション
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-19
Publication date: 1996-10-29
Also published as: US5750344A; WO1994028424A1; CA2163620A1; AU684510B2; AU6835894A; EP0700522A1

Abstract

(57)【要約】類似の化合物の混合物、特にファージペプチドライブラリーから結合している化合物を決定する改良された方法が提供される。この方法は、候補化合物の混合物を２つまたはそれより多くの異なる基質上に存在する標的分子と接触させる工程を包含する。

Description

【発明の詳細な説明】生物学的に活性なペプチド配列の選択方法技術分野本発明は、分子生物学および薬剤の発見の分野に関する。より詳細には、本発明は、可溶性または表面結合性のいずれかである標的（例えば、レセプターまたはリガンド）に対する化合物のライブラリーのスクリーニング方法に関する。発明の背景薬剤発見の第１の目標は、実用的で臨床的な有用性を有する生物学的に活性な分子を同定することである。分子生物学者により採用される一般的なアプローチは、最初に目的の生物学的活性を同定し、次いでその活性を均一になるまで精製する。次に、その分子がタンパク質であると仮定し、そのタンパク質の配列を決定し、そしてその配列情報を用いて、目的のタンパク質をコードする可能なコドンの組み合わせを示す合成DNAオリゴヌクレオチドを生成する。次いでこのオリゴヌクレオチドを用いて、タンパク質を産生する生物学的供給源に由来するメッセンジャーRNA由来のcDNAライブラリーをプローブする。そのようにして同定されたcDNA配列は、操作され得、適切な発現系において発現され得る。第２の、より最近のアプローチは、発現クローニングといわれ、目的のタンパク質の精製および配列決定の工程、ならびにcDNAライブラリーをスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドプローブの生成の工程を省く。むしろこの手順は、初めに生物学的活性分子の存在を確認する工程、メッセンジャーRNAからcDNAを生成する工程、およびcDNAを適切な発現ベクター内に直接クローニングする工程からなる。このベクターは、代表的には、タンパク質の発現を実現するために適切な宿主細胞にトランスフェクトされるかまたはマイクロインジェクションされる発現プラスミドである。プラスミドのプールは、生物活性に関してアッセイされ、そして活性を示すプールのサイズを狭めることにより、最終的には目的のタンパク質を発現する単一のクローンが単離される。上記のアプローチの他に、タンパク質以外の生物活性分子が定常的に単離され、そして当業者に公知の従来のスクリーニングレジメを用いて、多数スクリーニングされていることが知られている。さらに、薬剤が同定され、その化学的構造が解明された後に、合理的な薬剤設計または医薬品化学的アプローチによって薬剤のより活性な変型を合成する試みがなされる。以前に、繊維状ファージベクター中にランダムペプチドをコードする合成DNA のクローニングによって、「エピトープライブラリー」が作製され得るということが示唆された。ParmleyおよびSmith、Gene（1988）73:305。合成DNAをコートタンパク質遺伝子IIIにクローニングすることが提案された。それは予想されるコードされたペプチドがpIIIの機能を著しく妨害せずにpIIIの部分になるためである。pIIIのアミノ末端側の半分が、ファージの E.coliへの感染の間にF線毛に結合することは公知である。そのようなファージは、それらの細胞表面上にpIIIの一部としてランダムペプチドを有して発現し、抗体、特にライブラリー由来のファージの精製に影響を及ぼす抗体によって認識されるエピトープの同定方法を提供し得ることが示唆された。ParmleyおよびSmi th、Gene（1988）73:305。Devlin、PCT WO91/18980（本明細書中で参考として援用する）は、繊維状ファージ上に存在するランダムペプチド配列からなるライブラリーの生成方法を記載した。このライブラリーは、特定の生物活性を有するペプチドの同定および選択を含む多くの目的のために用いられ得る。リガンド結合分子の例は、可溶性または不溶性の細胞性レセプター（すなわち膜結合レセプター）であり得るが、所望の（sought-after）結合活性を有するいかなる分子（酵素を含む）にも実質的に拡張し得る。同様のライブラリーに関する記載は、Dowe rら、WO91/19818に見出される。本発明は、生物活性ペプチドまたは化合物を決定するためのそのようなライブラリー（およびその他のペプチドのライブラリー）のスクリーニング方法を提供する。Kangら、WO92/18619は、pVIII遺伝子に導入することにより調製されたファージライブラリーを開示した。以前の研究者らは、外膜タンパク質であるE.coliのLamBが遺伝的挿入によって改変されて、約60までのアミノ酸残基の挿入物を有するハイブリッドタンパク質を産生し得るようになることを示した。A.Charbitら、Gene（1988）70:181。この著者らは、このような構築物が生きた細菌性ワクチンを産生するために用いられ得ることを示唆する。A.Charbitら、EMBOJ、（1986）5（11）:3029；およびA.Charbitら、J Immun ol （1987）139（5）:1658もまた参照のこと。タンパク質の生物活性分子、および低分子量の分子を同定するために本発明で用いられる手順は、このようなプロジェクトの進行をしばしば制限する方策（re source）の顕著な関与を必要とする。従って、生物活性分子の同定を容易にする他の方法が熱心に求められており、そしてそれは非常に実用的な有用性を有する医薬の同定に幅広く応用され得る。発明の開示本発明の１つの局面は、生物活性ペプチドを同定するためにランダムペプチドのライブラリーをスクリーニングする方法である。この方法は、第１の基質上の標的に対するライブラリーをスクリーニングする工程、第１の基質とは異なる第２の基質上の上記標的に関して第１のスクリーニングで得られたものをスクリーニングする工程、および（所望ならば）さらに１回以上そのスクリーニングサイクルを繰り返す工程を包含する。上記標的は、第１および第２の基質上に固定され得るか、または可溶性の形態でスクリーニングされて、その後基質に固定され得る。第３の基質上の上記標的に対してさらなるスクリーニングも行い得、そして２以上の類似の標的を用いて共通に結合する化合物を同定し得る。発明の実施の態様Ａ．定義用語「類似化合物の混合物」は、類似の特性を有する異なる化合物の混合物をいい、そこから所望の結合特性を有する化合物が選択され得る。この混合物中の化合物間の類似性は、好ましくは構造に関する。例えば、異なるオクタペプチドの混合物は、この定義の範囲内の類似の化合物の混合物を構成する。例えば、側鎖の長さ、ハロゲン置換基の数および位置が異なる１つの溶液中の一連のジアゼピン類（diazepins）もまた、この定義の範囲内の「類似の化合物の混合物」を構成する。一般に、この混合物は、少なくとも10個の異なる化合物を含み、そして10¹⁰またはそれより多くを含み得る。本発明で好ましい混合物は、ランダムペプチドおよび／またはペプトイドライブラリーである。用語「ランダムペプチドライブラリー」は、ペプチドの混合物をいい、そこから候補となる結合ペプチドが選択され得る。このランダムペプチドは、２量体〜 100量体またはそれより多い長さの範囲であり得るが、好ましくは少なくとも約５アミノ酸の長さであり、より好ましくは少なくとも約７アミノ酸の長さであり、そして最も好ましくは、少なくとも約15アミノ酸の長さである。このランダムペプチドは、好ましくは約50アミノ酸より少ない長さであり、より好ましくは40 アミノ酸より少ない長さであり、そして最も好ましくは約30アミノ酸より少ない長さである。このペプチドは、どのような長さであれ、キャリアタンパク質と一緒に発現される融合タンパク質またはペプチドとして（例えば、M13のpIIIタンパク質の末端部分として）提供され得る。このランダムペプチドはまた、上記のキャリアタンパク質に融合されているタンパク質内の１つまたはそれより多くの位置で固定され得る。用語「ランダム」は、ライブラリーの最も代表的な調製物のみを指すのであって、その組成物が公知であり得ないということを必要としない：従って、所望ならば、正確に知られている組成物の混合物を調製し得、そして本発明の方法を、並行するスクリーニング手順としてのみ用い得る。生物学的ランダムペプチドの例は、例えば、Devlin、WO91/18980、Dowerら、WO91/19818、およびKangら、WO92/18619（これら全てを本明細書中で参考として援用する）によって記載されたファージディスプレイライブラリーを含むが、限定されない。他の適切な生物学的ランダムペプチドライブラリーは、トランスフェクトされた宿主細胞からペプチドを輸出させるシグナルペプチドをコードしているDNAに融合されたランダムDNAを発現することにより調製され得る。次いでこのペプチドは、培養物上清から回収される。所望ならば、このペプチドは、膜「アンカー」（および任意にスペーサーペプチド）と一緒に提供され得、従って、宿主細胞表面上のディスプレイのために提供される。あるいは、ランダムDNAまたはRNAは、無細胞系（cell-free system）内で、例えばミクロゾームに基づいて、翻訳され得る。用語「標的」は分子をいい、その分子に対して結合ペプチド、ペプトイド、またはその分子に結合し得る他の化合物が所望される。適切な標的は、細胞表面レセプター、細胞表面抗原、酵素、および他のエフェクター分子を含むが、限定されない。本発明の方法は、その標的が宿主細胞の表面上で発現され得る場合に最も有用である。多くの適切な標的が細胞膜または細胞壁に取り込まれ、そして活性な形態で単離することが困難または不可能である。しかし、本発明の方法は、この標的を本来の形態（またはそれに類似の形態）で発現させ、そして標的に結合する化合物の検出を妨げるかまたはマスクするバックグラウンドの結合を排除しつつ結合をスクリーニングすることを可能にする。また、スクリーニングを容易にするために、宿主細胞表面上で細胞内標的（例えば、細胞質レセプター、Ｇ −タンパク質など）を発現させ得る。本発明の方法は、例えば非特異的結合化合物から分離するために、一時的に固定され得る可溶性標的に適用し得る。例えば、可溶性レセプターに対しては、そのレセプターに特異的な固定された抗体を用いることにより結合後にそのレセプターを捕獲してスクリーニングし得る。この工程は、別の方法によって（例えば、ビオチン−アビジンまたは磁気相互作用を用いて）固定された可溶性レセプターに対するスクリーニングによって、または固定されたレセプター（例えば、完全な（i ntact）細胞表面レセプター）に対するスクリーニングによって、交替され得る。本明細書中で用いられる用語「基質」は、類似化合物の混合物が接触する前または後のいずれかに標的が付着または組み込まれる表面をいう。この基質は、好ましくは、標的を正常に発現するか、または標的を発現するように形質転換された宿主細胞を含む。しかし、この基質はまた（または、あるいは）、例えば樹脂カラム支持体のような固体支持体上に固定された標的を含み得る。あるいはこの基質は、標的を固定し、続いて化合物の混合物を接触させる手段を有する支持体（例えば、標的に特異的な抗体で誘導化したカラム、または標的に結合する抗体に特異的な抗体で誘導化したカラム）を含み得る。本発明で好ましい基質は、哺乳動物細胞（COS細胞、CHO細胞、および293ヒト腎臓上皮細胞など）、昆虫細胞、酵母、および細菌（特に、E.coli）である。Ｂ．一般的方法化合物の混合物のスクリーニング方法、特に、結合化合物をランダムペプチド配列からなるライブラリーから同定するに有用な方法が本明細書に記載される。この方法は、化合物の「パンニング（panning）」と称し得る。従来のパンニング方法は、単一の基質に対する親和性によって、例えば、１箇所以上の標的との接触によって、化合物を単離することを試みる。この従来の方法は、標的が純粋な物質であるか、またはいかなるバックグラウンド化合物の親和性よりも高い親和性によって結合する場合に十分であり得る。しかし、標的を単離または精製することはしばしば可能ではない（例えば、多くの貫膜レセプターの場合、その精製には完全な変性および不可逆的な不活性化が必要である）。全ての細胞に対するパンニングは、最も高い濃度で存在している結合部分（moiety）に対して親和性を有する化合物（例えば、他の表面レセプター、炭水化物など）が選択される傾向にあるので、問題がある。さらに、いくつかの部分は、元来他の部分より高い親和性によってペプチドに結合し得るようである（例えば、いくつかのレセプターは、ペプチドとの相互作用を最大にする深い裂け目を有し得る）。本発明の方法は、たとえ標的の正確な性質が知られていなくても、全ての細胞に対するパンニングに用いられ得る。一般に、この方法は、所望の標的を含む（または標的を結合し得る）第１の基質に対して類似化合物の混合物をパンニングし、次いで、結合している化合物を分離し、そしてそれらを別の基質（これもまた所望の標的を含む）に対してパンニングする。第１の基質と第２の基質との不均衡を最大にすることによって、バックグラウンド結合による妨害を最少にし得、従って、主に標的でないものに結合している化合物を排除し得る。従って、本発明は、たとえ高濃度で存在する非標的の存在下でも、特定の標的に親和性を有する化合物のスクリーニングを可能にする。本発明の実施において、まず初めに試験される化合物の混合物を提供する。ペプチドのライブラリーは、好ましくは、例えば、ファージディスプレイライブラリー（例えば、Devlin、WO91/18980）として、生物学的方法によって調製される。正確な形態のライブラリーの選択は、本明細書中で請求されるパンニング手順によるより、標的システムによって行われる。次いで基質が選択される。この基質は、好ましくは、表面上で容易に接近し得る形態で、標的を提供し得るべきである。理想的には、２つの基質はできるだけ異なる基質が選択される。このことにより、両基質に共通の非標的に結合する化合物の選択の可能性が最少になる。例えば、第１の基質に哺乳動物細胞株を選択し得、そして第２の基質には固相樹脂上に標的を固定し得る。標的は、スクリーニングされるべき化合物との接触の前または後に固定され得る（例えば、標的をビオチンで標識し、そしてアビジンカラムに固定することにより、または標的に特異的な抗体を用いることによる）。標的が容易に精製されないか、または固定されない場合には、哺乳動物細胞：昆虫細胞、哺乳動物細胞：酵母、酵母：細菌などのような組み合わせ対を選択し得る。本発明の好ましい方法では、哺乳動物細胞（例えば、COS細胞）およびバキュロウイルス感染Sf9昆虫細胞を２つの基質として利用する。基質は好ましくは洗浄を容易にするために固体表面に接着される。適切な表面は、マイクロウェルプレート、培養皿などである。あるいは、洗浄工程の間に基質細胞を保持し得るフィルターまたは他の手段と組み合わせた非接着性基質（例えば酵母および細菌）を用い得る。遠心分離による洗浄が本発明では好ましい。天然に標的を有する基質を用い得るか、または、標的を発現するように形質転換された基質を用い得る。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に適した標準的技術を用いて形質転換が行われる。好ましい方法は、W.J.Dowerら、Nuc Acids Res（1988）16:6 127によって記載されたように低伝導性溶液中でのエレクトロポレーションである。市販のエレクトロポレーション機（例えば、BTX社製など）が利用され得る。しかし他の方法も用いられ得る。例えば、S.N.Cohenら、Proc Natl Acad Sci （USA）（1972）69:2110によって記載されたような塩化カルシウムを用いたカルシウム処理、およびD.Hanahan、J Mol Biol（1983）166:557-580によって記載されたような改変は、原核生物または実質的な細胞壁バリアを含む他の細胞に対して用いられる。いくつかのトランスフェクション技術は、そのような細胞壁を持たない哺乳動物細胞に対して利用し得る。GrahamおよびVan Der Eb、Virology（ 1978）52:546のリン酸カルシウム沈降法は、１つの方法である。トランスフェクションは、リン酸カルシウム共沈降技術の改変（Wangら、Science（1985）228:1 49）を用いて行われ得る。別のトランスフェクション技術は、DEAEデキストランの使用（L.M.Sompayracら、Proc Natl Acad Sci USA（1981）78:7 575-7578）を含む。あるいは、プラスミドDNAを宿主細胞に輸送するために脂質マトリックスを用いて、リポフェクションによって細胞をトランスフェクトし得る（P.L.Felgnerら、Proc Natｌ Acad Sci（USA）（1987）84:7413）。この脂質マトリッ結合化合物が融合タンパク質、好ましくは繊維状ウイルス表面タンパク質、の一部であるならば、ランダムペプチド配列の存在は、選択された標的分子へのウイルスの結合、および結合したウイルスと結合しないウイルスとの分離によって示され得る。この方法においては、目的のランダムペプチドを含むウイルスは単離され得、そして続いて適切な宿主細胞の感染により増幅され得る。このウイルスがランダム配列、および予想されるアミノ酸配列をコードしていることの確認は、ポリメラーゼ連鎖反応、およびDNA配列決定をそれぞれ含む標準的技術を用いて得られ得る。上記の精製技術のそれぞれは、目的のランダムペプチドをコードするウイルスを富化するために複数回繰り返され得る。Ｃ．実施例以下に示す実施例は、当該分野の従業者に対するさらなる指針を提供するものであって、いかなる場合においても本発明を限定すると解釈されるべきではない。実施例１（ランダムペプチドをコードするオリゴヌクレオチド）以下の構造を有するオリゴヌクレオチドを合成し、そして当業者に公知の方法を用いて精製した：（NNS）₁₅の合成の間、等量のデオキシヌクレオチドＡ、Ｃ、およびＴ、ならびにそれよりさらに約30％多いＧからなる混合物をＮに用い、そしてＣおよびＧの等量の混合物をＳに用いた。デオキシイノシン（i）は、４つの塩基Ａ、Ｇ、Ｃ、およびＴのそれぞれと塩基対を形成し得るので、用いた。J.F.Reidhaar-Ols onら、Science（1988）24:53。あるいは、J.Habeneｒら、Proc Natl Acad Sci U SA （1988）85:1735によって記載されたように他の塩基アナログを用い得る。ランダムペプチド配列をコードするこのヌクレオチド配列のすぐ後に続くのは、アラニンおよびグルタミン酸残基をコードするヌクレオチド配列である。これらのアミノ酸を含んだのは、それらがM13の野生型成熟遺伝子IIIタンパク質のアミノ末端の最初の２つの残基に相当するためであり、従って、下記のように産生される融合タンパク質の産生を容易にし得る。ランダムペプチド配列のすぐ後に続くのは、６個のプロリン残基をコードするヌクレオチド配列である。従って、このオリゴヌクレオチドは、以下のアミノ酸配列をコードする： Xaaは、ランダムDNA配列によってコードされるアミノ酸を示す。下記のように、このオリゴヌクレオチドをM13の誘導体中にクローニングし、上記のアミノ酸配列を有する成熟融合タンパク質を産生し、そしてプロリン残基を後に続けて、完全な野生型成熟遺伝子IIIを産生した。実施例２（プラスミドM13LP67の構築）プラスミドM13LP67を用いてランダムペプチド／遺伝子III融合タンパク質構築物を発現させた。M13LP67は、Devlin、PCT91/18980（本明細書中で全てを参考として援用する）に記載されたように、M13mp19から誘導した。簡単にいうと、M13mp19を２つの方法によって改変した。第１の改変は、マーカー遺伝子であるβ-ラクタマーゼをビリオンのポリリンカー領域に挿入することからなった。これは、プラスミドpAc5からPCR増幅によって遺伝子を得ることからなった。pAc5テンプレートにアニールしたオリゴヌクレオチドプライマーは、以下の配列を有する： β-ラクタマーゼ遺伝子の増幅コピーを制限酵素BgIIIおよびEcoRIを用いて切断し、そして改変したM13mp19の複製形態をBamHIおよびEcoRIを用いて切断した。所望のフラグメントをゲル電気泳動によって精製し、連結して、E.coli DH5α株（BRL）に形質転換した。挿入物を有するファージによって形質転換されたE.coliを、アンピシリンプレート上で選択した。そのようにして産生したファージをJD32と命名した。プラスミド形態のファージ、pJD32（M13mp19Amp^r）を変異させ、２つの制限部位EagIおよびKpnIがこの領域でコードされているアミノ酸を変えずに遺伝子III に導入されるようにした。この制限部位を、M．Innisら、”PCR Protocols--A G uide to Methods and Applications”（1990）、Academic Press，Inc．によって記載されたように、標準PCRインビトロ変異誘発技術を用いて導入した。 KpnI部位を、1611位のTGTTCCをGGTACCに転換することにより構築した。変異誘発をもたらすために用いた２つのオリゴヌクレオチドは、以下の配列を有する： EagI制限部位を構築するために、以下の２つのオリゴヌクレオチドを用いてpJ D32の1631位の配列CCGCTGをCGGCCGに変えた。より詳細には、プライマーLP159、LP162、ならびにLPl60、およびLP161を用いて得たPCR産物を、BspHIおよびKpnI、ならびにKpnIおよびAlw NIをそれぞれ用いてを用いて切断した。これらを、既にBspHIおよびAlwNIを用いて切断しているM13mp19にT4リガーゼを用いて連結し、M13mpLP66を得た。このベクターは、所望のEagIおよびKpnI制限部位を含むが、アンピシリン耐性遺伝子β -ラクタマーゼを欠いている。従って、ベクターM13mpLP67は、EagIおよびKpnI制限部位を含み、このベクターをXbaIおよびEcoRIを用いて切断することによりpJD 32からβ-ラクタマーゼ配列を取り出すことによってβ-ラクタマーゼを産生させた。次いで、β-ラクタマーゼ遺伝子を、既にXbaIおよびEcoRIによって切断しているM13mpLP66のポリリンカー領域に挿入した。T4リガーゼを用いて引き続いて連結し、M13mpLP67を産生し、それを、ランダムペプチドライブラリーを生成するために用いた。実施例３（ランダムペプチドをコードするファージの産生）ランダムペプチド配列をコードするDNA配列を有するファージを産生するために、EagIおよびKpnIを用いてM13LP67を切断し、そして上記実施例１に記載したように産生したオリゴヌクレオチドに連結した。連結混合物は、45ng/μLの切断されたM13LP67 DNA、５倍モル過剰のオリゴヌクレオチド、3.6U/μLのT4リガーゼ（New England Biolabs）、25mMのTris、pH7.8、10mMのMgCl₂、2mMのDTT、0.4 mMのATP、および0.1mg/mLの BSAからなった。連結混合物に添加する前に、個々のオリゴヌクレオチドを合わせて、95℃まで５分間加熱し、次いで、15μLのアリコートを室温まで冷却した。次に、連結混合物を室温で４時間インキュベートし、引き続き15℃で一晩インキュべートした。次いで、この混合物を以下のようにE.coliにエレクトロポレーションした。 M13LP67 DNAを、本質的にW.Dowerら、Nuc Acids Res（1988）16:6127に記載のように調製したH249細胞にエレクトロポレーションした。H249細胞は、MM294のr ecA,sup°,F’,kan^R誘導体である。簡潔にいうと、４×10⁹個のH249細胞および１μｇのM13LP67 DNAを1mM HEPESからなる85μLの低伝導性溶液中で混合した。細胞／M13LP67DNA混合物を、BTXエレクトロポレーション装置（BTX Corp.）の0. 56mmの冷却したギャップ電極に置き、そして560ボルトの５ミリ秒パルスを与えた。エレクトロポレーションの直後に、細胞を電極アセンブリから取り出して新鮮なH249菌叢（lawn）細胞と混合し、そして400cm²プレート当たり約２×10⁵プラークの密度で播いた。次の日、各プレートのファージを30mLの新鮮な培地で溶出してPEGで沈降させ、そして20％グリセロールに再懸濁して-70℃で凍結保存した。約2.8×10⁷プラークを採取し、数百個を分析してランダムペプチド配列を有するおよその数を測定した。ランダムペプチド配列をコードする領域中のDNAを増幅するためにポリメラーゼ連鎖反応を用いて、約50〜90％のファージが遺伝子II Iの５’末端に69塩基対の挿入物を含むことを測定した。このことにより、ランダムペプチド配列をコードするオリゴヌクレオチドの存在を確証した。PCR反応を標準技術および以下のオリゴヌクレオチドを用いて行った：反応を40サイクル行い、その後２％アガロースゲル中で電気泳動することにより産物を解析した。これらの結果を基にして、2.8×10⁷プラークのファージが約２×10⁷個の異なるランダムアミノ酸配列をコードすることを計算した。実施例４（エンドセリンＢレセプターのパンニング） Sf9昆虫細胞（10⁶）個（感染後１日目で、１細胞当たり10⁵エンドセリンタイプＢレセプターを有する）を、１％ウシ血清アルブミンを含むGraceの昆虫培地（1mL）中で10¹¹ランダムペプチドライブラリーファージと混合した。細胞を室温で（または４℃で）30分間緩やかに回転させた。細胞を遠心分離により５回洗浄した。結合したファージを６Ｍ尿素、pH2.2で溶出した。溶出物を2M Tris-HCl（pH10 ）を用いて中性pHにし、そして固相寒天プレート上でプラークとして生育させることによりファージを増幅した。次いで、このファージをTris緩衝生理食塩水で溶出し、そしてポリエチレングリコール（PEG）沈澱により濃縮した。第２ラウンドでは、COS細胞（10⁶）は、トランスフェクション後第１日目に、１細胞当たり10⁵（またはそれより多くの）エンドセリンタイプＢレセプターを発現し、第１ラウンドの10¹¹ファージと共に１％BSAおよび10m M HEPESを含む最少必須培地中で30〜60分間室温でインキュベートした。上記のように細胞を洗浄してファージを溶出し、増幅し、そして濃縮した。第３ラウンドを、第１ラウンドについての上記のように、ETR_B発現Sf9細胞上で行った。次いで、ファージの収率を測定し、パンニングの追加ラウンドを合計６回行った。結果：６ラウンドの選択後、ファージ収率の著しい増加は観察されなかった。これは、ファージがこの手順により富化されないことを示す。陽性の結果は得られなかったが、偽陽性はいずれも得られなかった。すなわち、この手順は、無関係な（非）標的に特異的ないかなるペプチドも選択しなかった。これは、ある理由のため、結合リガンドがスクリーニングしたライブラリー中に存在しない場合、多くの時間を節約する。実施例５（uPARのパンニング）ウロキナーゼプラスミノーゲンアクチベーターレセプター（uPAR）に親和性を有するペプチドを以下のように同定した：１.）上記のように調製した15マーのファージ（2.5×10¹⁰）を、全長uPARを発現している10⁶Sf9細胞（「fluPAR」、感染後２日目）と室温で60分間、２％脱脂乳を含むGrace培地中で同時インキュベートすることにより選択した。結合しているファージを６Ｍ尿素（pH 2.2）で溶出し、pHを2M Tris-HClによって中和してアッセイした。結合したファージの収率は、0.0013%（3.3×10⁵pfu）であった。このファージを固体寒天プレート上でプラークとして増幅し、Tris緩衝生理食塩水によって溶出し、そしてポリエチレングリコールで沈澱した。２.）第１ラウンドで得られたファージを、２％脱脂乳および10mM HEPESを含むDMEM中で２×10⁵のCOS細胞に対し3.1×10¹¹のファージを用いて、感染後第２日目にfluPARでトランスフェクトしたCOS細胞上で再選択した。第１ラウンドに記載したように、ファージを結合し、溶出し、アッセイし、そして増幅した。結合しているファージの収率は0.039％（1.2×10⁸pfu）であった。３.）第２ラウンドで選択したファージを、第１ラウンドに関して記載したように（10⁶Sf9細胞に対し2.8×10¹⁰ファージ）、fluPARを発現しているSf9細胞（感染後第２日目）上で再選択した。このラウンドで結合しているファージの収率は、5.40%（1.5×10⁹pfu）であり、結合しているファージの実質的な富化を示す。尿素溶出したファージをクローン化し、そしてそのDNAを単離して配列決定した。個々のファージクローンによる結合を、fluPARを発現しているSf9細胞、およびサブスタンスＰレセプターを発現しているSf9細胞（コントロールとして）に対してアッセイした。結果は以下の通りである：本発明は、特定の実施態様に関して記載されている。しかし、本出願は、添付された請求の範囲の意図および範囲から逸脱することなく当業者により行われ得る改変および置換にも及ぶことを意図する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩＣ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ 8310−2ＪＧ０１Ｎ 33/68 Ｇ０１Ｎ 33/554 9162−4ＢＣ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/68 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．選択された標的に対して結合親和性を有する所望の化合物を同定する方法であって、ここで、該所望の化合物が類似の化合物の混合物中に存在し、該方法が：（a）該化合物の混合物を第１の基質と接触させる工程であって、ここで、該第１の基質が該標的を含有する、工程；（b）該第１の基質に結合する化合物を、該第１の基質に結合しない類似の化合物から分離する工程；（c）該第１の基質に結合した該化合物を第２の基質と接触させる工程であって、ここで、該第２の基質が該第１の基質とは異なり、かつ該標的を含有する、工程；（d）該第２の基質に結合する化合物を該第２の基質に結合しない類似の化合物から分離する工程、を包含する、方法。２．以下の工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法：（e）前記第２の基質に結合した前記化合物を前記第１の基質に接触させる工程；および（f）該第１の基質に結合する化合物を該第１の基質に結合しない類似の化合物から分離する工程。３．工程（c）〜（f）が繰り返される、請求項２に記載の方法。４．以下の工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法：（e）前記第２の基質に結合した前記化合物を第３の基質に接触させる工程であって、ここで、該第３の基質が前記第１および第２の基質とは異なり、かつ前記標的を含有する、工程；および（f）該第３の基質に結合する化合物を、該第３の基質に結合しない類似の化合物から分離する、工程。５．工程（c）〜（f）を繰り返すことをさらに包含する、請求項４に記載の方法。６．前記標的が細胞表面レセプターを含む、請求項１に記載の方法。７．前記類似の化合物の混合物が生物学的ランダムペプチドライブラリーを含む、請求項１に記載の方法。８．請求項１に記載の方法であって、前記第１および第２の基質の一方が哺乳動物細胞を含み；そして、該第１および第２の基質のもう一方が、組換え昆虫細胞、組換え酵母、および組換え細菌からなる群より選択される、方法。９．請求項８に記載の方法であって、前記第１および第２の基質の一方が、COS細胞、CHO細胞、および293細胞からなる群より選択され、そして該第１および第２の基質のもう一方が、バキュロウイルス感染Sf9細胞、Sacch aromyces cerevisae、およびE.coliからなる群より選択され、ここで、該第１および第２の基質の両方が前記標的を発現している、方法。１０．請求項１に記載の方法であって、前記第１および第２の基質の一方が、哺乳動物細胞を含み；そして該第１および第２の基質のもう一方が、標的の結合した不活性な支持体を含む、方法。１１．請求項１に記載の方法であって、前記第１および第２の基質の一方が、組換え昆虫細胞、組換え酵母、および組換え細菌からなる群より選択され；そして、前記第１および第２の基質のもう一方が、標的の結合した不活性な支持体を含む、方法。１２．標的に対して結合親和性を有する所望の化合物を同定する方法であって、ここで、該所望の化合物が類似の化合物の混合物中に存在し、該方法が：（a）該化合物の混合物を第１の標的に接触させる工程；（b）該標的を第１の基質上に固定する工程；（c）該第１の標的に結合する化合物を、該第１の標的に結合しない類似の化合物から分離する工程；（d）該第１の基質に結合した該化合物を第２の基質と接触させる工程であって、ここで、該第２の基質は該第１の基質とは異なり、かつ該標的を含んでいる、工程；（e）該第２の基質に結合する化合物を、該第２の基質に結合しない類似の化合物から分離する工程、を包含する、方法。１３．標的に結合親和性を有する所望の化合物を同定する方法であって、ここで、該所望の化合物が類似の化合物の混合物中に存在し、該方法が：（a）該化合物の混合物を第１の基質と接触させる工程であって、ここで、該第１の基質が該標的を含む、工程；（b）該第１の基質に結合した化合物を該第１の基質に結合しなかった類似の化合物から分離する工程；（c）該結合している化合物を該標的と接触させる工程；（d）該標的を第２の基質に固定する工程；（e）該第２の基質に結合した化合物を、該第２の基質に結合しなかった類似の化合物から分離する工程、を包含する、方法。１４．標的に結合親和性を有する所望の化合物を同定する方法であって、ここで、該所望の化合物が類似の化合物の混合物中に存在し、該方法が：（a）該化合物の混合物を第１の標的と接触させる工程；（b）該標的を第１の基質に固定する工程；（c）該第１の基質に結合した化合物を、該第１の基質に結合しなかった類似の化合物から分離する工程；（d）該結合している化合物を、該標的と接触させる工程；（e）該標的を第２の基質に固定する工程；（f）該第２の基質に結合した化合物を、該第２の基質に結合しなかった類似の化合物から分離する工程、を包含する、方法。