JPS61264000A - 標識ペプチドによるタンパク質の合成 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野１ 本発明は組換えＤ　Ｎ　Ａ技術によるタンパク質分子の
製法、狛にｆ（意のタンパク質及び抗原性ペプチドから
成るハイブリッド分子の発現により（■意のタンパク質
を製造し、親和力によりハイブリッド分子を精製し、タ
ンパク質分子から抗原性ペプチドを分裂させる７５法に
係わる。

１従来の技術］ 酵素、小ル尤ン、貯載タンパク質、結合タンパク質、輸
送タンパク質のようなタンパクｗは組換えＤ　Ｎ　Ａ法
によって製ｉｆ！ｉ　’Ｊることかできる。例えば、４
１　Ｍのタンパク質を二］−ドする（−）Ｎ△断片をプ
ロを一ター及（ｆリポソーム結合部位に対応する適当な
ｌ）　Ｎ　Ａ配列とＪｔにプラスミドベクターと結合さ
せる。プラスミドを′４６↑の原核または貞核細胞内に
沖入り゛る。転換された宿」−細胞を識別し、’Ｊｌｌ
ｌｌｌＩシ、培ＩＩ−ＪることにＪ、つ【タンパク貿分
子を発現させる。

次い（・所要のタンパク質を培地から分離し、個別にま
／、、：　ｉＪ　？に金的に採用される種々の方？人に
よってｌＡ製づる。この精製には分子リイスにＭづいて
所要のタンパク質をψ離する１ｊ法を含むことがある。

この精製手順には透析、密度勾配遠心法及びゲル・）Ｊ
ラムクロマ１〜グウフイ〜か含まれる。ただし、透析及
び密度勾配遠心法だけで高ｔｉｔにＩＩ！ｉ製されたタ
ンパク質を冑られるものではない。ゲル・カラムク０マ
トグクフイーを利用りることによってより高度の精製が
達成されるが、精製過程中に所要のタンパク質分子の多
くが失われ、収率が低下する。

可溶度外に基づく方法によっても混合物からタンパク質
分子を分１１１ｆｌηることができる。例えば、等電沈
澱はタンパク貿可溶度変化をｐＨの関数として利用し、
溶剤分別法はタンパク質の可溶度が媒質の誘電率に応じ
て変化するという事実を利用するものである。硫酸アン
モニウムのような中性塩を利用することにより、塩の高
イオン強度に基づ（タンパク質可溶度低下の結束として
タンパク質を沈澱させる。溶剤分別法の重大な欠点は溶
剤がタンパク質を変質させるおイれがあるという白であ
る。等電沈澱も塩沈澱もタンパク質を中程度以］ニに精
製できない。ただし、塩沈澱法の利白の１つは多くの場
合１００％近い収率をｉｉｌ能にすることであり、した
がってこの方法は他のｆ順との併用において初期の段階
として採用されることが多い。

タンパク！　４．１また、例えば種々の電気泳動または
イオン交換りロマ１〜グラフィーにより、イオン性に基
づいてψＭすることができる。電気泳動法の多く（よ分
析手段どして利用され、絹産には不向きである。イオン
交換クロマ１−グラフィーは高度に精製されたタンパク
質を提供するが、収率レベルは多くの場合極めて低く、
タンパク質分子の多くが溶出液とバに失われるか、また
はカラム・マトリクスに結合したままとなる。

イオン交換クロマトグラフィー及びゲル・カラムクロマ
トグラフィーを含む一ト配精製手段の欠点を回避するた
め、親和力クロマトグラフィーを採用することが少なく
ない。親和力クロマトグラフィーはタンパク質が特定的
に且つ非共有的にリガンドと結合できる能力に基づく。

単独に利用すればタンパク質を極めて複雑な混合物から
！ＩＩ！ＩＩできイオン交換及びゲル・カラムクロマト
グラフィーを順次行なう場合よりも高度の精製が可能な
だけでな（、活性が著しく失われることもない。この点
にライてはＲｏｓｅｎｂｅｒｒｖ　ｅｔ　ａｌ、、　　
”　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　　Ａ　ｃｅｔｙ
ｌｃｈｏｌｉｎｅｓｔｅｒａｓｅ　ｂｙ　　Ａ　Ｈｉｎ
ｉｔｙＣｈｒｏｍａｔｏａｒａｐｈｖ　ａｎｄ　　Ｏｅ
ｔｅｒｍｉｎａＮｏｎ　ｏｆ　Ａ　ｃｔｉｖｅ　５ｉｔ
ｅ　Ｓｔｏｉｃｈｉｏｍｅｔｒｙ、　”　　Ｊｏｕｒｎ
ａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ、　　２４７．５５５−１５６５（１９７２）を参照
されたい。親和力クロマトグラフィーは高度のタンパク
質精製を可能にするが、この方法は単離すべきタンパク
質分子に対応する多晶のリガンド（例えば、抗原に対す
る抗体または酵素の基質）が必要である。従って、マウ
スなどの動物に問題のタンパク質分子を精製された形で
接種し、次いでこのタンパク質分子に対一応する特定リ
ガンドを識別するという時間と労力のかかる作業を行な
う必要がある。次いで、例えばハイブリドーマ法によっ
てリガンドを増殖させ、親和力力ラムマトリクスに対す
る共有結合分離のため精製しなければならない。

ある種のタンパク質分子では特定リガンドの単離が極め
て困難であることは明らかである。また、あらゆるタイ
プのタンパク質分子、例えばある種の酵素には特定のり
ガントが存在しない。従って、あらゆるタンパク質分子
について、汎用の単離及び精製技術として親和力クロマ
トグラフィーは利用されていない。

［発明が解決しようとする問題点］ そこで本発明の一般的な目的は、所要のタンパク質を経
済的に製造し、タンパク質を効率的に精製するために組
換えＤＮＡ法を利用することにある。

特に、本発明の目的は、抗原性であるか否かに関係なく
、形質転換された宿主細胞により発現するほとんどすべ
てのタンパク質分子の分離及び精製を単一のリガンドを
利用することで達成できる親和力精製法を提供し、組換
えＤＮＡ法によって製造されるほとんどすべてのタンパ
ク質分子の精製に小規模な研究レベルでも商業的な量産
規模でも利用できる標準的な、効率の高い方法を提供す
ることを目的とする。

本発明のさらに他の具体的な目的は組換えＤＮＡ法によ
り製造されるほとんどすべてのタンパク質分子を甲−の
親和力クロマトグラフィ一段階で、ただし高収率を犠牲
にすることなく高レベルに精製できる方法を提供するこ
とにある。

［発明の概要］ 本発明では、任意の構成成分としてのタンパク質と、標
識ペプチドまたはマーカーペプチド（ｉｄｅｎｔｉｆｉ
ｃａｔｉｏｎ　ｏｒ　ＩＲａｒｋｅｒ　ｐｅｐｔｉｄｅ
）とから成るハイブリッド分子を相換えＤＮＡ法によっ
て製造する。標識ペプチドは２つの主要成分、即ち、高
抗原性Ｎ末端部と、４１Ｉ識ペプチドを上記タンパク質
と結合する結合部とを含む。標識ペプチドの結合部は配
列特異性のタンパク質分解剤により上記タンパク質分子
の近傍の特定アミノ酸残基において分裂させることがで
きるのが特徴である。標識ペプチドのこの特殊な構造に
より、形質転換宿主細胞から発現する標識ペプチド／タ
ンパク質分子のハイブリッドを親和力クロマトグラフィ
ー法で単離させることができる。このためには標識ペプ
チドの抗原性部分に固有の固定リガンドで親和力力ラム
を構成し、この固定リガンドに発現標識ペプチド／′タ
ンパク質分子ハイブリッドを結合させればよい。結合さ
せた標識ペプチド／′タンパク質分子をカラムから解放
し、適当なタンパク質分解剤でタンパク質分子から標識
ペプチドを分裂させ、所要の高純度タンパク質分子を遊
離させることができる。

本発明の他の特徴として、標識ペプチドの抗原性部分は
単数または複数の親水性アミノ酸及び／または芳香族側
鎖を有するアミノ酸から成る。いずれのタイプのアミノ
酸も高い抗原性を有することが知られている。さらにこ
の抗原性部分はホルモンのような自然発生的なタンパク
質分子の抗原性部分からなるようにしてもよい。抗原性
部分の正確な組成は問題ではなく、要はモノクローナル
抗体がそれに対して産生されているか、或いは直ぐに産
生させることができることが重要である。

標識ペプチドの結合部分はタンパク質分子近傍の場所で
結合部分を分裂させる配列特異性のタンパク質分解剤に
よって検知されるアミノ酸から成る。

結合部分のアミノ酸配列が特殊であり、タンパク質分解
剤がタンパク質分子を分裂させる可能性が極めて少ない
ことが望ましい。本発明では、タンパク質分子は形質転
換した宿主細胞から発現できるいかなるタンパク質であ
ってもよい。

本発明は標識ペプチドをコードする化学合成りＮＡ断片
から成る組換えクローンベクターにも係わる。ベクター
はまた所要のタンパク質分子をコードするＤＮＡ断片を
も含む。このＤＮＡ断片は適当な制限エンドヌクレアー
ゼ及びリガーゼを使用することによってプラスミドのよ
うなりローンベクターに挿入する。形質転換された宿主
細胞を識別し、単離するため、プラスミドが表現型標識
遺伝子を有することが好ましい。また、プラスミドとし
ては、宿主細胞中に標識ペプチド７′タンパク質分子ハ
イブリッドの高レベル発現が得られるために天然または
合成プロモーターを含むものを選択することが好ましい
。プラスミドの複製及びｅｌ！！３Ｍペプチド／タンパ
ク質分子ハイブリッドの発現のため、絹換えプラスミド
を利用して適合する原核または真核宿主細胞を形質転換
する。

本発明は任意のタンパク質分子を親和力力ラムクロマト
グラフイー精製するための、標識ペプチドの抗原性部分
に対するリガンド（抗体）の製造をも含む。リガンドは
公知の方法で化学合成された標識ペプチドでマウス、ラ
ビットなどを免疫処置することによって発生させる。抗
体の製造を容易にするためには、合成された標識ペプチ
ドをキーホール・リムペット・ヘモシアニン、ウシまた
はヒツジの血清アルブミン、ヒツジの赤血球などのよう
なタンパク担体と化学結合させればよい。

担体の分子または細胞が大きければ接種動物の免疫系に
よる巽種標識ペプチドを見分は易い。抗体製造を容易に
する別の方法としては、脂肪酸誘導アミノ酸を標識ペプ
チドの抗原性部分と反対側の結合部分に結合させるか、
またはペプチドの抗原性部分に直接結合させればよい。

脂肪酸の作用で標識ペプチドが凝集してミセルを形成し
、脂肪酸はミセルの中心を構成し、この中心からペプチ
ドの抗原性部分が外方に広がり、接種動物の免疫系に対
して理想的な形となる。こうして形成した抗体細胞を適
当な骨髄瞳細胞と結合させることによってモノクローナ
ル抗体を発生させる細胞ハイブリッドを形成することが
できる。

本発明の親和力精製では、上記手順によって得た抗体を
親和力クロマトグラフィー・カラムに結合して標識ペプ
チド／タンパク質分子ハイブリッドのための固定化リガ
ンドを形成する。ハイブリッド分子を培地、細胞残渣、
その他のタンパク質などと共にカラムを通過させる。抗
体と結合するハイブリッド分子は化学的手段または遊離
の、即ち、脂肪酸誘導アミノ酸が結合していない標識ペ
プチドからの競合によりカラムから溶出させる。

次いで標識ペプチドの結合部分のアミノ酸配列に固有の
タンパク質分解剤によってタンパク質分子から標識ペプ
チドを分裂させる。さらに標識ペプチド及びタンパク質
分解剤からタンパク質分子を分離することにより高純度
のタンパク質分子が得られる。

本発明では単一の抗体によって、組換えＤＮＡ法で製造
されたすべてのタンパク質分子を精製することができる
。さらに、本発明を応用すれば、親和力クロマトグラフ
ィー法に不適なものも含めて、組換えＤＮＡ法によって
製造されたすべてのタンパク質分子を高度に精製するこ
とができる。

ある種のタンパク質生成物は標識ペプチドが結合したま
まの状態でも所要の酵素活性または生物学的活性を具え
る。このような＊＊ペプチド／タンパク質分子はそのま
まの状態で使用できるから、タンパク質分裂過程または
それ以後の過程を必要とせずに、抗体カラムからの溶出
後に精製が完了する。

［詳細な説明］ 以下、本発明の代表的実施例を添付図面を参照して詳細
に説明する。

本発明では標識ペプチド及び所要のタンパク質から成る
ハイブリッド・ポリペプチド分子を組換えＤＮＡ法で生
成させてから共通リガンドを利用する親和カフ［１７［
・グラーフィー法によってハイブリッド分子を精製する
。このため、標識ぺ一／′ｆド及び所要の機能性タンパ
ク質を−１−ドするＤＮＡ断片を含むｎＮＡ発Ｉ蛯ベク
ターを形成する。標識ペプチドは８抗原性Ｎ末端部ど、
ｅＭ識ベプブドをタンパク質分子のＮ末端に連結りるＣ
末端部とから成る。標識ペプチドの結合部は、配列特巽
性のタンパク質分解酵素ま／ｊは化学的タンパク質分解
剤を使用することによって、所要のタンパク貿分子に近
い位置の特定アミノ酸残基において分裂させることがで
きる。り［１−ンベクターが複製され、ベクターによっ
て形質転換された原核ま／、：ＬＪ貞核細胞中でハイブ
リッド・ポリペプチドか発現される。形質転換した細胞
が１４！離されｌこ接、例えば培養まＩこは発酵プ［１
ｔ？スで増殖される。

次いで、親和カフ日７１ヘゲラフイーによってハイブリ
ッド・ポリペプチドを穿＾製する。Ｉ識ペプチドの抗原
性部分に固有のりがンドを生成させて連球カラムまたは
その他の７１へりクスに結合させる。培養ま１．：ｔ、
４　ｆｌ酊から４８！ご宿主細胞の抽出物を力）１１に
加え、カラムと結合づるポリペプチドを溶出させる。次
いで適当なタンパク質分解酵素または化学的タンパク貿
分解剤でタンパク質分子から標識ペプＪ１〜を分裂さ「
ることにより、高ｌ１ｌｆ度、高ｖｉ牲状態の所期の成
熟しｌこタンパク質分子が轡られる。

標１「（ＩＪ」シ 本発明の標識ペプチドは該当タンパク質のＮ末端に結合
した線形配列アミノ酸の形態を取る。この線形配クリは
抗原性Ｎ末端の“ヘッド′°部分と、標識ペプチドを任
慧のタンパク質分子との結合部である゛ｊ−ル°°部分
どの２つの基本部分から成る。づでに−Ｌ、　ｉｄｉ　
シ、詳しくは後述づるように、標識ペプチドの抗原性部
分は形質転換された宿主細胞によって生産されるハイブ
リッド・ポリペプチドのｌ１ｌＩｌｌｌと精製を容易に
する。抗原性部分はクロマ１〜グフノイー・）カラムま
たはその他の一ントリクスに固定化された特定リガンド
（抗体）と結合する。

親和力クロマＩ・グラフィー・カラムに使用するため標
識ペプチドの抗原ｔｑ部分に苅りる抗体の分離を容易に
４るには、標識ペプチドＮ末端か高払除竹であることが
望ましい。このことは甲数またＧ、ｌ複数の親水性アミ
ノ酸で抗原性部分を構成Ｊることで達成できる。このＪ
：うなアミノ酸どしては、△ｒＱ、Δｓｐ、　Ｇ　ｌｕ
、　ｌ−ｙｓなどがある。標識ペプチドのＮ末端部分は
数種類の親水↑リアミノ酸で構成覆るか、または同一親
水↑’ｌ　７ミノ酸鎖だけで構成することができる。

親水性アミノ酸のほかに、またはこれに代わるアミノ酸
として、芳香族側鎖を有４る）ｌミノ酸を使用してもよ
い。このアミノ酸も抗原性の高いことが知られている。

このアミノ酸としてはＴｙｒ。

Ｐｈｅ、　１ｌｉｓ、　Ｔｒｐなどが挙げられる。本光
明右らの所見によれば、標識ペプチドのＮ末端部分の抗
原性を理想の状態にするためには親水性及び芳香族性の
両方のアミノ酸を使用することが望ましい。

また、抗原性部分を構成するアミノ酸の数は１〜６１１
ＩｉＩが好ましい。しかし、この個数は本発明の趣旨ま
たは節回を逸脱することなく増やずことができる。

また、上記の親水性アミノ酸よＩこは芳香族アミノ酸以
外の７７ミノ酸も疎水性アミノ酸まＩこは芳香族７７ミ
ノ酸ど」鼾に用いることができる。このような追加アミ
ノ酸の例としては非荷電アミノ酸であるＧｌｙ、　Ｐｒ
ｏ、　Ｓｅｒが挙げられるがこれに眼定されるものでは
ない。さらに、標識ペプチドの抗原性部分ｌＪ１これに
対４る抗体が分離されているかまたは分離し得る自然発
生タンパク質、好ましくはその抗原性部分から構成づる
こともできる。このようなタンパク質の例としては、リ
ンツＡカイン、凝析因子、インターフェロン、免疫グロ
ブリンチトクローノ１等が挙げられる。標識ペプチドの
ヘッド部分の構造に関して主に考慮すべきことは、それ
が合成されたものかまたは自然の構造であるかにかかわ
りなく、抗体、好ましくはモノクロ−プール抗体が、分
離、産生されるに充分イ【だ（）抗原性であるというこ
とである。

本発明で番ま標識ペプチドの結合８１ｉ分が標識ペプチ
ドを該当タンパク質に連結する役割を宋すが、標識ペプ
チド及び所期のタンパク質から成るハイブリッド・ポリ
ペプチドを培地抽出物から精製すると、標識ペプチドは
タンパク質から分裂される。

即ち、標識ペプチドの結合部分は特定アミノ酸残基、好
ましくはタンパク質分子のＮ末端に近い残基において分
裂可能でなければならない。このように、結合部分は配
列特巽性のタンパク質分解酵素または化学的タンパク質
分解剤により所期の残基において分裂可能な好ましくは
４〜６個のアミノ酸から成る。しかし、結合部分を構成
する残基数が理想の個数と異なっても本発明の範囲から
逸脱するものではない。

結合部分は他のアミノ酸配列に続（、Ｌ’ｙｓ＋　Ａｒ
Ｑ、　ＭｅｔまたはＡＳｎで終るアミノ酸配列で構成す
ることができる。この配列を式で表わすと、Ｘ、〜。−
Ｒ・・・・・・・・・（Ａ）（ただし、ＲはＬＶｓ、　
Ａｒｏ、　ＭｅｔまたはＡ　ｓｎ。

×１．＞１はＲを除く他のアミノ酸配列）もし結合部分
のＣ末端アミノ酸としてＡｒｃまたはＬｙｓを使用すれ
ば、Ａｒ（］またはＬＶ８残基の後で分裂するタンパク
質分解酵素を利用してタンパク質分子からＩＩＪ識ペプ
チドを除くことができる。Ｃ末端アミノ酸としてＭｅｔ
またはＡＳｎを使用すれば、このアミノ酸の後で分裂す
る適当な化学的タンパク質分解剤を利用してタンパク質
分子から標識ペプチドを切り離すことができる。例えば
、Ｍｅｔ残基後の分裂に臭化シアンを利用することがで
きる。

Ｌｙｓ、　Ａｒｏ、　ＭｅｔまたはＡＳｎは結合部分の
Ｃ末端アミノ酸として使用できるが、タンパク質分子も
同じアミノ酸を含有するなら、タンパク質分子の分裂も
これらの残基において起こるから、好ましくない。この
問題を解消する１つの方法として、広く天然の形で瑛わ
れないアミノ酸配列から結合部分を構成する。例えばＡ
　Ｓ＋１−　Ａ　ｓＤ−Ａ　Ｓ＋１−　Ａ　５ｒｌ−Ｌ
ＶＦｔから成る配列がその１つである。このようなアミ
ノ酸配列が天然に現われるのはウシのエンテロキナーゼ
の天然基質であるタンパク質トリブシノゲンの場合に限
られる。この独特の配列を利用して標識ペプチドの結合
部分を形成すれば、ウシのエンテロキナーゼを使用する
ことによって標識ベプチドからタンパク質分子を解放す
ることができ、この酵素がタンパク質自体の一部を分裂
させる可能性はほとんどない。

その他の特有のアミノ酸配列を利用しても本発明の趣旨
または範囲から逸脱することはない。例えば、一部を一
対の基礎アミノ酸、即ち、Ｌｙｓ。

ＡｒｇまたはＨｉｓで構成することができ、この配列は
腺酵素カリクレインによって分裂させられる。

また、結合部分はその一部をＡｒｇ−ＧＩＶで構成する
ことができる。なぜなら、公知のように、酵素トロンビ
ンはもしＧｌｖが後続するならＡｒＯの後で分裂するか
らである。

所与の組成を有する標識ペプチドについては、この標識
ペプチドのアミノ酸をコードするＤＮＡオリゴマーを、
当業者には公知の市販の自動ＤＮＡ合成装置によって合
成することができる。ＤＮＡを合成する方法及び装置は
公知であるから、ここでは言及しない。後述のように、
合成りＮＡオリゴマーを所要タンパク質をコードするＤ
ＮＡ配列に結合してから、この結合ＤＮＡ断片を適当な
発現ベクターと結合すれば、適当な宿主細胞に形質転換
するためのクローンベクターを形成することができる。

タンパク質分子 本発明はベクターによって形質転換宿主細胞中に発現さ
せることのできるほとんどいがなる原核性または真核性
の、単純または複合タンパク質の生産にも有効に利用す
ることができる。これらのタンパク質としては、オキシ
ドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、
リアーゼ、インメラーゼ、リガーゼなどの酵素を挙げる
ことができる。

本発明はフェリチンまたはオバルブミンのような貯蔵タ
ンパク質や、ヘモグロビン、面清アルブミン、セルロプ
ラスミンのような輸送タンパク質の生産をも可能にする
。さらに、例えばアクチンやミオシンのように収縮及び
運動系において機能するようなタンパク質もこれに含ま
れる。

本発明はまた、血液タンパク・トロンビンやフィブリノ
ゲンのような保護または防衛機能を有するタンパク質の
生産をも可能にする。その他の保護タンパク質としては
、抗原と結合してこれを無力化する抗体や免疫グロブリ
ンのような結合タンパク質も含まれる。

本発明によって生産されるタンパク質は各種のホルモン
、例えばヒト成長ホルモン、ソマトスタチン、プロラク
チン、■ストローネ、プロゲステロン、メラニン形成細
胞、甲状腺刺戟ホルモン、カルシトニン、性腺刺戟ホル
モン、インシュリンをも含む。同様のホルモンとしては
ほかに、免疫系に関連すると認められているホルモン、
例えばインターロイキン１、インターロイキン２、コロ
ニー刺戟因子、マクロファージ活性化因子、インターフ
ェロンなども含まれる。

本発明はヒマの梯子から得られるリシンや亜麻の種子か
ら得られるグロッシービンのような毒性タンパク質の生
産にも応用できる。

構造素子として作用するタンパク質も本発明によって生
産でき、このようなタンパク質としては繊組性タンパク
質であるコラーゲン、■ラスチン及びα−ケラチンがあ
る。その他の構造性タンパク質として糖タンパク、ウィ
ールス・タンパク及びムコ・タンパクがある。

上記天然タンパクのほかに、本発明は天然には生成しな
い、一般的にはアミノ酸配列として定義される合成タン
パク質の生産にも応用できる。

上記した各種タンパク質分子をコードする遺伝子は動植
物の細胞やバクテリア細胞のような各種の原核性または
真核性細胞から得られる。これらの遺伝子は標準的な公
知技術を駆使することにより上記細胞の染色体物質から
、または原核細胞のプラスミドから単離することができ
る。多くの異なるタンパク質分子をコードする遺伝子を
有する多様な天然及び合成プラスミドが梗々の供給元か
ら市販されている。所要のＤＮＡも逆転写酵素によりｌ
ｌＲＮＡから製造することができる。この酵素はＲＮＡ
鋳型からのＤＮＡ合成を可能にする。

ＤＮＡ発　ベクターの譬周製 本発明では、所期のタンパク質分子をコードする遺伝子
が単離、合成またはその他の形で得られたら、これを標
識ペプチドをコードする合成りＮＡ断片と接合する。す
でに述べたように、標識ペプチド遺伝子は公知の方法に
よって合成することができる。この公知の方法はここで
改めて説明しない。タンパク質分子遺伝子及びＩｓ識ペ
プチド遺伝子のほかに、必要ならば、ハイブリッドＤＮ
Ａ断片は、宿主細胞における高レベルのタンパク質翻訳
のためのリポソーム結合部位、翻訳開始コドン（ＡＴＧ
）及びプロモーターを含むことができる。

タンパク質分子及び標識ペプチドをコードする遺伝子を
適当な制限酵素で処理するか、または他の方法で操作す
ることにより、相互に、且つプラスミドまたはその他の
クローンベクターと結合し易い付着末端を形成する。ク
ローンベクターに、好ましくは異種遺伝子との結合前に
異種遺伝子に相補的付着末端を形成させるための処理に
使用される同じ制限エンドヌクレアーゼを作用させる。

こうして得たクローンベクターを利用して宿主微生物を
形質転換する。形質転換体を単離し、異種遺伝子の存在
及びベクター内での遺伝子の正しい配位に関して分析す
る。次いで形質転換体を培地中で増倍させることにより
ベクターを複製すると共に、求めるハイブリッド・ペプ
チドを高レベルで発現させる。さらに、クローンベクタ
ーを利用することにより、ハイブリッド異積構造ポリペ
プチドを量産できるように、選んだ宿主またはその他の
宿主の他の株を形質転換することができる。

組換えベクターの調製、ベクターによる宿主細胞の形質
転換、ベクターの複製、及びポリペプチドとタンパク質
の発現に必要な種々の手順と材料はＱｌｄ　ａｎｄ　　
ｐｒｉｎ＋ｒｏｓｅ、　　ｐｒｉｎｃｉ　ａｌｓ　　ｏ
ｆ　ＧｅｎｅＭａｎｉ　＋１ｌａｔｉｏ＋１．　　（２
ｄ　Ｅｄ　、　１９８１）に２軟されている。

本発明を実施するには種々のクローンベクターを利用す
ることができる。プラスミドが好ましいが、ベクターと
してバクテリオファージまたはコスミドを使用してもよ
い。クローニングが補性類または植物細胞内で行なわれ
るなら、ベクターとしてウィールスを使用できる。プラ
スミドを使用するなら、天然でも人工合成でもよい。特
定のプラスミドを選ぶとすれば、大賜菌（Ｅ、　Ｃｏ１
１　）、酵母のようなバクテリアであろうと、その他の
単細胞微生物であろうと、宿主としての特定細胞と適合
するものでなければならない。プラスミドは選択した特
定の宿主細胞に対応する適正な複製（レプリコン）起源
を持つものでなければならない。また、プラスミドの大
きさは関連のタンパク質分子及び標識ペプチドをコード
するハイブリッド遺伝子を収納できる大きさでなければ
ならないが、その分子量はできるだけ低くなければなら
ない。分子量の低いプラスミドは剪断による損傷に対す
る耐性にすぐれ、宿主細胞から単離し易い。

天然のものであれば、多重コピーとして存在するのが普
通であり、従って単離が容易である。低分子編プラスミ
ドが制限エンドヌクレアーゼのための多重基質部位を持
つ可能性は少ない。

プラスミド・クローンベクターの他の条件は、挿入され
る異種遺伝子の末端と相補的な適当な結合末端を提供す
る一方でレプリコンを不活性化することなく、異種遺伝
子と結合するためにプラスミドを分裂させる制限酵素が
存在することである。

このためには、プラスミドが多数の制限エンドヌクレア
ーゼのための単一基質部位を持つことが好ましい。

さらに、プラスミドは形質転換宿主細胞を容易に識別し
、形質転換していない細胞から分離することを可能にす
る表現型でなければならない。このような表現型選択遺
伝子は例えば抗生物質のような成長抑制物質に対する耐
性を提供する遺伝子を含むことができる。プラスミドは
テトラサイクリン、ストレプトマイシン、サルファ剤、
ペニシリン、アンピシリンなどのような種々の抗生物質
に対して耐性を有する遺伝子を含むものが広く開発され
ている。これらの抗生物質の１つを含有する培地で宿主
細胞を培養すると、適当な耐抗生物質遺伝子を有する形
質転換体だけが生き残る。

形質転換宿主細胞を他と区別するために成長抑制物質に
対して耐性を有する遺伝子を利用するのではなく、表現
型選択遺伝子として成長因子を提供する遺伝子を利用し
てもよく、この成長因子の作用下に形質転換細胞は宿主
細胞のための必要な成長因子を欠く培地中でも増殖する
ことができる。

例えば、酵母の生長栄養素ではこのような成長因子とし
てトリプトファンやロイシンが含まれる。

宿主細胞として旦−、Ｃｏ１１を使用する場合、本発明
を実施するのに好ましいプラスミドはＩＩＹＥＪ　００
１　（Ｐ　Ｌ　　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ　）であ
る。このプラスミドはアンピシリンに対してもテトラサ
イクリンに対しても耐性を有する遺伝子コードを有する
。このプラスミドはｌ：、ＱＯ１ｉ中で増殖する複製起
源をも含み、ｈ、ｃｏ＋＋中で異種遺伝子を高レベルで
発坦させるためのラクトースオペロン及び合成プロモー
タ一部位を有する。このプラスミドの部分制限エンドヌ
クレアーゼ分裂の様相を第１図に示す。

ｈ、ｃｏ＋ｉ中での高レベル発現に好適な他のプラスミ
ドとして　１）ＢＲ３２２がある。このプラスミドはＢ
ｏｌｉｖａｒ　　ｅｔａｌ、、　　２　　Ｇｅｎｅ９５
−　１１３（１９１７）に記載されており、５ｕｔｃｌ
ｉｆｆｅ、　４３Ｃｏｌｄ　Ｓ）ｒｉｎ　　Ｈａｒｂ、
Ｓ　　ｍ　　、　　ｕａｎｔ、Ｂｉｏｌ、　　　（１）
７７−９０　（１９７９）によってその特徴などが詳し
く解明されている。

形質転換体として酵母細胞を使用する場合、プラスミド
としてｐ２１９が好ましい。このプラスミドのサンプル
は受託番号第３９５５０号で　ＡｍｅｒｔｃａｎＴｙｐ
ｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　　（
Ａ　Ｔ　ＣＣ）、１２３６１　　Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄ
ｒｉｖｅ、　ＲｏｃｋｖＮｌｅ、　Ｍａｒｙｌａｎｄ　
２０８５２に保管されている。第２図及び第４図に示す
ように、このシャトルベクターとして知られているプラ
スミドは酵母中でも、ξ−，Ｃ０ＩＩ中でもプラスミド
が増殖できるように酵母プロモーター配列を有する。さ
らに、Ｅ、Ｃｏ１１中でプラスミドを選択するための選
択マーカーであるアンピシリン耐性遺伝子（Ａ…ＩＩＲ
）と、酵母ｔｒｐ−栄養素要求株中で選択するための酵
母ｔｒｐ　１遺伝子をも含む。

他の好ましいシャトルベクターとしては受託番号第３９
９６７号でＡＴＣＣに保管されているρＹＡＤ　Ｈが挙
げられる。このシャトルベクターはまた旦、Ｃｏ１１及
び酵母ｔｒｐ−栄養素要求株中で選択するためのＡ　１
１１１）Ｒ遺伝子とＴｒｐ１ｉ１仏子を有している。さ
らに、このシャトルベクターは２μの複写開始部位及び
アルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ）から誘導
された転写開始のためのプロモーターを有している。旦
−、ｃｏｌ＋または酵母宿主細胞の形質転換に特異的な
プラスミドは甲に好適な例であって、上述した如く、他
のプラスミドまたは他の発現型ベクターも本発明の趣旨
及び範囲を逸脱しない範囲で用いることができる。

プラスミドの代りにバクテリオファージを使用する場合
、このファージはプラスミド選択に利用される上記特性
とほぼ同じ特性を具えねばならない。このファージは表
現型マーカー遺伝子と、標識ペプチド及び関連タンパク
質分子をコードする異種ハイブリッド遺伝子に結合する
結合末端とを含む。

結合用のプラスミドを調整するには、制限エンドメクレ
アーゼを作用させることにより、２個のＤＮＡ紐が互い
に接近した部位において分裂して５−−リン酸塩及び３
′−水酸基を帯びる付着末端（粘着端）を形成し、異種
遺伝子との結合を容易にする線形断片を生成させること
が好ましい。

上記プラスミドに対して、制限エンドヌクレアーゼＨｉ
ｎｄｌｌｌ及び［：ｃｏＲＩがこのような結果を生む。

第１図、第２図及び第４図の制限エンドヌクレアーゼマ
ツプから明らかなように、その他の制限エンドヌクレア
ーゼを利用して他の目標部位においてプラスミドを分裂
させてもよい。また、プラスミドを２つの異なる制限エ
ンドヌクレアーゼで順次処理することにより、互いに異
なる末端構造を形成して異種ＤＮＡ断片の正しい配位で
の結合を容易にすることができる。

ある樟の制限酵素（ＰＶｕｎ、Ｂａ１ｌ）は凹凸末端（
ｂｌｕｎｔ　ｅｎｄ　）を形成する。プラスミドの凹凸
末端は適当なりガーゼで異種遺伝子に接合することがで
きる。５′及び／または３′端部に核酸を添加すること
により１１例えばリンカ−分子を利用して付着末端を形
成してもよい。さらには、適当な酵素でフラッシュ端か
ら塩基を除去することによって付着末端を形成すること
も可能である。その方法及び材料は公知である。上記０
ｌｄａｎｄＰｒｉｉ＋ｒｏｓｅを参照されたい。

好ましくは、線形化されたプラスミドベクターをアルカ
リ性ホスファターゼで処理することにより５′−末端リ
ン酸塩基を除く。これによってプラスミドの再環化が防
止され、異種ＤＮＡの各端にプラスミドから分離したま
まの切れ目が１つずつ残る。ただし、宿主細胞の形質転
換後、細胞修復機構が切れ目を修復する。

選択されたプラスミドに制限エンドヌクレアーゼを作用
させると、２個以上の線形ＤＮＡ断片が形成される。ク
ローンベクターの形成に使用する断片、即ち、表現型標
識遺伝子、レプリコン及びその他の必要成分を有する断
片は例えばゲル電気泳動のような公知技術によって識別
することができる。

選択したクローンベクターと接合する前に、標識ペプチ
ド及び関連タンパク質をコードする異種遺伝子を先ず互
いに接合しなければならない。好ましくけ、タンパク質
分子をコードする遺伝子を、遺伝子の該当末端がプラス
ミドの対応末端と適合するようにプラスミドベクターの
分裂に利用するのと同じ制限エンドメクレアーゼで処理
する。この遺伝子を第２の別種制限エンドメクレアーゼ
で処理することにより、標識ペプチド遺伝子と結合する
反対末端を形成することも可能である。

標識ペプチドをコードする遺伝子は化学合成によって形
成されるから、タンパク質分子遺伝子及びこれと対応す
るプラスミド末端との結合を容易にする適当な末端構造
で構成することができる。

リポソーム結合部位をコードするオリゴマー及び翻訳開
始コドン（ＡＴＧ）も合成することができる。標識ペプ
チド、リポソーム結合部位及び翻訳開始コドンに対応す
る合成りＮＡオリゴマーを公知の方法により、適当なり
ＮＡリガーゼを介して生体外（ｔｒｉ　ＶｉｔｒＯ）で
タンパク質分子遺伝子と接合する。

結合反応において、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、ニ
コチンアミドアデニンジメクレオチド（ＮＡＤ＋）また
はその他の適当な共役因子をＤＮＡリガーゼと併用する
。また、還元剤としてジチオトレイトールを、ＤＮＡ安
定剤としてスペルミジンをそれぞれ使用することができ
る。ウシの自涜アルブミン（ＢＳＡ）のようなタンパク
質源を利用すれば変質を防止することができる。好まし
くは、タンパク質分子をコードする遺伝子と合成オリゴ
マーとのモル比を約１〜５：５〜１とする。結合後、例
えばゲル電気泳動によりＤＮＡ紐を分析して、タンパク
質分子をコードするＤＮＡ断片から成るＤＮＡ紐が合成
オリゴマーと正しく一体化しているかどうかを確認する
。

次に一体化した遺伝子を、リガーゼＭＷｔｉ液及び適当
なりＮＡリガーゼを含有する溶液中で線形プラスミド断
片に結合させる。好ましくはプラスミドと一体化遺伝子
とのモル比を約１〜５：５〜１に設定する。先に述べた
タンパク質分子遺伝子と標識ペプチド遺伝子の結合の場
合と同様に、この結合もＡＴＰまたはＮＡＤ＋のような
補酵素を必要とし、好ましくはタンパク質源、）！元剤
及びＤＮＡ安定剤を利用する。培養後、一体化遺伝子の
移動面を有する再環化プラスミドを、例えばゲル電気泳
動のような標準的な方法によって確認する。

組換えＤＮＡプラスミドによる形質転換上述のように調
製された組換えＤＮＡプラスミドを利用して宿主細胞を
形質転換する。宿主細胞は適当な原核または真核細胞で
あればよいが、例えばＣ，ＣＯ＋＋や酵母のような実体
の明確なバクテリアであることが好ましい。このような
宿主はいずれも形質転換され易く、発酵培地中で急速に
増殖できる。［、Ｃｏ１１の代りに他の単細胞微生物、
例えば真菌や藻類を使用してもよい。ほかに、サルモネ
ラや肺炎球菌のようなバクテリアをり。

ＧＯＩ＋の代りに利用することもできる。どのような宿
主を選ぶにしても、組換えプラスミドを分裂させるよう
な制限酵素を含有せず、表現型発現に必要な生化学的経
路及びハイブリッド・ポリペプチドを正しく発現させる
ために必要なその他の機能を有する宿主でなければなら
ない。

、［−、ｃｏ＋＋を選ぶ場合、好ましい菌株としてＲＲ
１及びＨＢ　ｉｏｉがあり、いずれも広く市販されてい
る。酵母中での形質転換には、サツカロミセス　セレビ
シｘ　（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の菌株として
一般的なりＢ７４６、ＤＢＫ７４７、及び２０Ｂ　−１
２が菌株として好ましい。これらの菌株もまた入手可能
である。例えば、［）Ｂ７４６及びＤＢ７４７は菌株第
４４７７３号及び第４４７７４号としてＡＴＣＣから入
手でき、２０Ｂ　−１２は、カリフォルニア大学生物物
理医物理学部酵母遺伝子保管センター（アメリカ合衆国
、９４７２０カリフオルニア州、バークレイ）から入手
できる。

Ｅ、Ｃｏ１１中での組換えプラスミドの形質転換法は公
知である。その代表的な方法は米国特許第４．３３２，
９００号に開示されている。組換えプラスミドによる酵
母細胞の形質転換手順も公知である。

５ｅａｏｓ、　Ｎａｔｔｌｒｅ！　、ニア５１０４〜１
０９（１９７８）を参照されたい。

形質転換の際には、細胞によるプラスミド取込みに限噴
があるから、宿主細胞のごく一部だけが実際に形質転換
される。そこで、形質転換体を単離する前に、形質転換
に利用する宿主細胞を適当な培地中で増殖させる。実際
に形質転換された細胞は、例えば抗生物質のような表現
型標識を含有する適当な培養媒体を含有する寒天プレー
トに最初の培地を置くことによって識別することができ
る。適切な耐性遺伝子を有する細胞だけが生き残る。生
き残りコロニーからの細胞を溶解させ、溶解産物からプ
ラスミドを単離すればよい。こうして単離したプラスミ
ドの特に重要な特徴は、制限エンドヌクレアーゼを作用
させてからゲル電気泳動試験を行なうなどの標準的な方
法により、一体化遺伝子が正しい配位で結合しているか
どうかを識別する手がかりとなることである。

形質転換した細胞を識別したら、これらの細胞を発酵な
どの公知方法によって増殖させる。また、回収されたク
ローン組換えプラスミドは、ハイブリッド・ポリペプチ
ドが高レベルで複製され、発現するように他のバクテリ
ア菌株またはその他の宿主細胞を形質転換するのに利用
することができる。

ハ　ブリッＪ・ハリベプチ゛の 形質転換された宿主細胞によって弁用させられたハイブ
リッド・ポリペプチド分子を培地、その他の細胞物質な
どから、好ましくは親和力クロマトグラフィー法によっ
て分離する。このため、ハイブリッド・ポリペプチドの
標識ペプチド部分に対する抗体をカラム・マトリクスに
使用するために作らなければならない。このような抗体
を生産するため、標識ペプチドを先ず合成してから、こ
れを利用して適当な動物に免疫処置を施すことによって
標識ペプチドに対する抗体を生産する。この抗体は酵素
結合免疫吸収体分析（ＥＬ、ＩＳＡ＞またはその他の適
当な分析によって識別することができる。次いでハイブ
リドーマ法によってモノクローナル抗体を生産すること
ができる。精製後、このモノクローナル抗体をカラム・
マトリクスと結合させ、次いで形質転換宿主細胞からの
抽出物をハイブリッド・ポリペプチドを単離するために
このカラムに通す。ハイブリッド・ポリペプチドは、例
えば遊離の標識ペプチドとの競合によってカラムから溶
出される。標識ペプチドをタンパク質分子から分裂させ
てから、タンパク質分子を標識ペプチドから分離して精
製タンパク質が得られる。

゛ペプチドの合 標識ペプチドは種々の形態で化学合成される。

その１つはペプチドに対する抗体を発生させる際に利用
するための形態で、もう１つは親和力力ラムからハイブ
リッド・ポリペプチドを解放する競合因子として使用す
るための形態である。いずれの形態においても、合成標
識ペプチドはペプチドの結合部分を形成する近接の残基
と結合する抗原性Ｎ末端部分を形成するアミノ酸残基を
含む。標識ポリペプチドのこの２つの部分に使用される
特定のアミノ酸残基はすでに詳細に述べた。

抗体を形成するのに使用される標識ペプチドの形態にお
いては、脂肪酸で誘導される追加アミノ酸をペプチドの
抗原性Ｎ末端部分とは反対側の結合部端に付加すること
により、標識ペプチドが水溶液中にミセルを形成するよ
うにする。疎水性脂肪酸分子がミセルの中心を構成し、
標識ペプチドの抗原性Ｎ末端部分が球形ミセルの中心か
ら放射状に延びる。本発明者らの所見によれば、このミ
セル形成は動物の免疫系に対して標識ペプチドを提供す
る理想的な方法である。

本発明の好ましい実施態様ではｅｌｌｔ識ペプチドの結
合部分と脂肪酸誘導アミノ酸の間に多数のスペーサ・ア
ミノ酸を介在させることにより、標識ペプチドの抗原性
部分がミセル中心から放射状に広がることが可能となる
。スペーサ・アミノ酸は中性で、親水性でも疎水性でも
ないことが好ましい。

本発明の脂肪酸誘導標識ペプチドは下記式で表ねすこと
ができる。

Ｒ＋　−Ｒ２−Ｒ３−Ｒ４・・・・・・・・・（Ｂ）Ｆ
Ａ ただし、Ｒ＋　＝標識ペプチドの抗原性Ｎ末端部分を形
成するアミノ酸で、該アミノ 酸は主に親水性アミノ！Ｉ（Ａｒ！＋。

ＡＳｐ、　Ｇｌｕ、　Ｌｙｓ）及ヒ／　；ｌ’　ｔｃ　
Ｇ、を芳香族側鎖を有するアミノ酸（Ｔ −４４＝ Ｖｒ、　Ｐｈｅ、　Ｈｉｓ、　Ｔｒｌｌ＞　、またはモ
ノクローナル抗体が産生されて いる自然発生タンパク質の抗原部 分を形成するアミノ酸から構成さ れる。

Ｒ２−配列特異性のタンパク質分解酵素または化学的タ
ンパク質分解剤に よって特定残基において分裂させ ることのできる結合アミノ酸。

Ｒ３＝ＧＩＬ　Ｐｒｏ、またはＳｅｒから選択された（
好ましくは１〜６個の） スペーサ・アミノ酸。

Ｒ４＝ＬＶ８またはオルニチンから選択されたく好まし
くは１〜６個の）ジ アミノ酸。

ＦＡ−脂肪酸。

Ｒ１及びＲ２アミノ酸の組成はすでに述べた。

スペーサ・アミノ酸Ｒ３は１〜６個の非荷電アミノ酸（
３１ｙ、ｐｒＯまたは３ｅｒから成ることが好ましい。

しかし、この個数が異なっても本発明の趣旨または範囲
から逸脱するものではない。中性であるということによ
り、スペーサ・アミノ酸はＲ１及びＲ２アミノ酸残基と
誘導アミノ酸残基の間に非荷電性リンクを形成し、個々
のペプチド間の吸引作用や反発作用を回避して、互いに
干渉せずにミセル中心から半径方向にほぼ線形に延びる
ことを可能にする。

Ｒ４アミノ酸残基はｔ−ｖｓのような１〜６個のジアミ
ノ酸、またはオルニチンのような非タンパク質アミノ酸
から成ることが好ましい。その他のジアミノ酸を使用し
てもよい。また、利用する残基数がこの好ましい数より
多くても本発明の範囲から逸脱することはない。

水の存在下にミセルを形成するなら、はとんどどんな脂
肪酸でも利用できる。本発明者らの所見によれば、バル
ミチン酸、オレイン酸またはステアリン酸がこのような
特性を具える。

誘導された８Ｎ識ペプチドは公知の方法で化学合成すれ
ばよい。手操作で、または市販の自動合成装置により、
カルボキシル末端アミノ酸からアミノ末端アミノ酸まで
残基ごとにペプチドを形成することのできる、Ｒ、Ｂ　
、　Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ　ニよッテ開発された固相法
が好ましい。

この合成法は濾過によって液相から分離できる程崖のサ
イズを有する市販の固体樹脂粒子、例えばビーズを利用
する。この粒子はすてにＧｌｙのようなアミノ酸が初め
から結合している状態で市販されている。また、初めか
ら結合されているアミノ酸は多くの場合、その端部及び
側部の鎖が保護されているＮ−α−ブチロキシカルボニ
ル＜Ｎ−α−ＢＯＣ）として提供されている。この保護
されたアミノ酸は残基を希酸で処理してＮ−α−ＢＯＣ
基を除くことによってＲ４ジアミノ酸と結合できる状態
となる。保護解除は樹脂の小サンプルで標準ニンヒドリ
ン試験を行なうことによって確認される。樹脂が保護解
除されていないなら、上記手順を繰返すが、樹脂が保護
解除されたら、アミノ酸を例えばジイソプロピルエチル
アミンのような立体障害塩基で中和して最初のジアミノ
酸と反応できる状態にする。

使用するジアミノ酸Ｒ４を例えばＮ−α−ｔｅｒｔ−ブ
チロキシカルボニル−ε−フルオレニルメチロキシカル
ボニル（Ｎ−α−ＢＯＣ−ＦＭＯＣ）誘導体の形で分画
保護する。この特定誘導体により、ジアミノ酸を脂肪酸
またはその他の親油性ミセル形成物質と結合できるよう
にε−アミノ基の保護を解くことができる。次いで通常
の酸処理によってα−ＢＯＣ基を除き、次のアミノ酸残
基を加える。ジアミノ酸を残基と結合させるため、カル
ボジイミド縮合剤で活性化し、樹脂と混合する。

次いで、ニンヒドリン試験を実施して結合が行なわれた
かどうかを確かめる。結合が完了すれば、ジアミノ酸残
基はその側鎖に脂肪酸を付加できる状態にある。結合が
起こらなければ、上記手順を繰返す。樹脂はジアミノ酸
に脂肪酸を付加できる状態となる。

はぼ上述したのと同じ手順を繰返すことにより、ジアミ
ノ酸Ｒ４を脂肪酸ＦＡで誘導し、樹脂マトリクスと共有
結合している初めのアミノ酸にジアミノ酸を結合させる
。ε−アミノ基の保護を解くにはピペリジンのような塩
基を利用する。

先行残基のＮ末端にジアミノ酸を結合し、ジアミノ酸の
ε−アミノ基に脂肪酸を結合させるための上記手順を、
所要数の誘導アミノ酸が残基鎖と結合するまで繰返す。

次いで、スペーサ残基Ｒ３、結合残基Ｒ２及び抗原性残
基Ｒ１を構成する残りのアミノ酸残基を上記手順を利用
して樹脂に添加する。ジアミノ酸Ｒ４の代りに適当なア
ミノ酸を使用することはいうまでもない。

ペプチド抗原性部分の最後の残基を樹脂と結合させたら
、そのＮ末端を希酸で保護解除する。次いで残基のサイ
ドブロック基を保護解除し、標準的な酸処理によって樹
脂からペプチドを分裂させる。最後に樹脂からペプチド
を単離する。

上記標識ペプチドは結合残基なしでも構成できる。即ち
、上記方法によって調製された抗原性残基を、ペプチド
で免疫処置された動物中に抗体を発生させるペプチドの
能力に悪影響を与えずにスペーサ残基と直接結合させる
ことができる。このような形態の標識ペプチドは下記式
で表わすことができる。

Ｒ＋　−Ｒ３−Ｒ４・・・・・・・・・（Ｃ）Ａ ただし、Ｒ＋　、Ｒ３、Ｒ４及びＦＡは上記式（Ｂ）に
関連して述べた通りである。

これに代わる構成として、標識ペプチド自体のＲ１部分
を、またはこれをＲ２残基と共に、公知の方法によりは
るかに大きいキャリア・タンパク質分子または細胞と化
学的に結合させることも可能である。キャリア分子／細
胞は免疫処置された動物の免疫系による標識ペプチドの
検出を容易にする。このようなタンパク質分子の例とし
ては、キーホール・リンペット・ヘモシアニン、ヒツジ
の赤血球、ウシまたはヒツジの血清アルブミンが挙げら
れる。

第２形態の合成ａｍペプチドは親和力クロマトグラフィ
ーにおける競合分子として利用される。

これにより、詳しくは後述するように、抗体親和力力ラ
ムからハイブリッド・ポリペプチドが解放される。この
ようにペプチドはフリーな形で、即ち、誘導ジアミノ酸
Ｒ４またはスペーサ残基Ｒ３を伴なわずに、あるいはＲ
４、ＲａまたはＲ２残基を伴なわずに合成される。この
相違点を除けば、このフリーな形態の標識ペプチドは誘
導された標識ペプチドの調製に採用されるのと同じ手順
で調製される。

以上固相樹脂で化学合成される場合について標識ペプチ
ドを説明したが、樹脂の存在しない溶液中で合成を行な
うこともできる。この場合、反応及び最終生成物は上記
のものと本質的に同じである。

化学合成された脂肪酸誘導１ｍペプチドを利用すること
により、上記組換えＤＮＡ法で発現させたＳ識ペプチド
／・′タンパク質分子ハイブリッドの親和力精製に使用
するペプチドに対するポリクローナル抗体を発生させる
。ポリクローナル抗体は標準的な公知の方法により動物
、例えばラビットの体内に発生させる。要約すれば、若
いラビットの背中に脂肪酸誘導標識ペプチドを皮下及び
陵内注射する。この免疫処置を周期的に、且つ量を変え
ながら行ない、誘導標識ペプチドに対する抗体を生体内
に（ｉｎ　　ｖｉｖｏ）発生させるのである。この免疫
処置は最初１００〜５００μｇ、以後は１００μＱの投
与量で毎週性なうのが好ましい。誘導標識ペプチドだけ
を使用するのではなく、７０インドの完全アジュバント
または不完全アジュバントと混合して使用してもよい。

好ましくは初めの免疫処置に７Ｏインド完全アジユバン
トを使用し、以後の免疫処置ではフロイント不完全アジ
ュバントで誘導標識ペプチドを乳化させたものを使用す
る。

また、１回分の誘導標識ペプチドを１つの部位に注射す
るのではなく、ラビットの背中に皮下、皮肉と分けて注
射する方が好ましい。

第４回目の免疫処置の直前にラビットから採血し、Ｅ　
Ｌ、　Ｉ　Ｓ　Ａ分析で血清サンプルの抗標識ペプチド
応答をテストする。ラビット血清の滴定量が１　：　１
０００以上に希釈した標識ペプチドと反応するほど高け
れば、採血後、高速遠心で血液を凝固さ−５２＝ せ、血清を作成する。次いで血清から得た免疫グロブリ
ンＧ（ＩｏＧ）画分を標準的な方法、例えばプロティン
Ａ親和力クロマトグラフィーによって、または固定化さ
れたペプチド・カラムを利用することによって精製する
。精製１（ＩＧ画分は標識ペプチド／タンパク質分子ハ
イブリッドを親和力精製する際の抗体供給源として利用
することができる。

誘導標識ペプチドに対するモノクローナル抗体の」１ 化学合成脂肪酸誘導標識ペプチドも、標識ペプチド／タ
ンパク質分子精製のための親和力クロマトグラフィーに
使用するモノクローナル抗標識ペプチド抗体を発生させ
るのに利用できる。モノクローナル抗標識ペプチド抗体
の好ましい形成方法は米国特許第４，４１１，９９３＠
に開示されている。この方法では、ＢＡＬＢ／ｃマウス
を場合に応じて７〜１４日の間隔で化学合成脂肪酸誘導
標識ペプチドによって免疫処置する。１回の注射に種々
の量の、好ましくは１０〜１００μ０の標識ペプチドを
使用する。最初の注射では７０インド完全アジユバント
で標識ペプチドを乳化し、次の注射ではフロイント不完
全アジュバントで標識ペプチドを乳化することが好まし
い。標識ペプチド全容を同一部位に注射せず、マウスの
体の種々の部位、例えば後肢にその都度複数注射するこ
とが好ましい。

免疫処置中にＥＬＩＳＡ分析によりマウス自消サンプル
の抗標識ペプチド反応をテストする。抗体適定量が検知
されたら、食塩水と混合した標識ペプチドを静脈注射す
る。数日後、動物を処分し、その牌臓を摘出する。牌細
胞からの単一細胞懸濁液を各種添加物を補足した組織培
養液中で培養することにより抗体産生細胞の数を増やす
。抗体産生細胞を培地から単離し、次に骨髄腫（ミエロ
ーマ）細胞と融合させるため標準的な方法で精製する。

融合プロセスにおいて、精製された抗体産生細胞をネズ
ミの骨髄腫細胞と混合してから、この混合物をベレット
化する。次いで、細胞ベレットに融合剤を添加して遠心
処理による２種類の異なる細胞の融合を容易にする。融
合剤としては酸化エチレンと水どの各種縮合ポリマー、
例えばポリエチレングリコール（以下、ＰＥＧという＞
　１５００がある。その他の融合剤としては、ＤＮＡ形
質転換ウィつルス、例えばセンダイウイールスまたはこ
れから得られる融合タンパク質がある。好ましい融合効
果を得るには、融合剤の崩及び濃度を制御しなければな
らない。例えば、もしＰ　Ｅ　Ｇ　１５００を使用する
なら、この融合剤が約４０％（重量／容積）を占めねば
ならない。しかし、ｐ　Ｅ　Ｇ　１５００の容積は０．
５〜３ｍ　ｌ！　、ＰＥＧ１５００の濃度は培地の３５
％〜６０％（重鏝／′容積）の範囲内であればよい。

次いで細胞を各種添加物及び任意の抑制剤を補足した組
織培養液中に再懸濁させることにより、未融合骨髄腫細
胞、二重骨髄腫ハイブリッド、未融合牌細胞及び二重牌
細胞ハイブリッドの増殖を抑制して抗標識ペプチド抗体
産生モノクローナル細胞を解放する。このような成長抑
制剤としては、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミ
ジン（以下、ｌ−Ｉ　Ａ　Ｔという）などがある。

また、組織培養液に充填細胞を添加することにより、ハ
イブリッド抗体産生細胞を増殖させる。

明確ではないが、充填細胞は少数のハイブリッド細胞が
より急速に増殖できるように好ましい細胞密度を提供す
るものと考えられる。また、充填細胞がハイブリッド細
胞に増殖に必要な栄養を提供するとも考えられる。充填
細胞としては、ＢＡＬＢ／ｃマウスから採取した胸腺細
胞など種々の充填細胞を利用できる。ほかに、ネズミの
牌細胞、ネズミの照射処理された腹膜滲出細胞、ネズミ
のマクロファージなどがある。培地に添加する充填細胞
の濃度は一律ではないが、ＨＡＴを含有する培地に対し
ては０．５〜５ｘ１０Ｂ細胞／ｍＱの濃度が好ましく、
好ましい密度は約３Ｘ１０８細胞／Ｉｌｌρである。

単式培養ではなく、培地、充填細胞及び適当な抑制剤と
共に再懸濁させた細胞を多重マイクロタイタープレート
に植える。数日間の培養後、発生したハイブリドーマ細
胞をＥＬＩＳＡ分析でスクリーニングして抗標識ペプチ
ド反応をチェックする。

ＥＬＩＳＡ分析において陽性反応を示したハイブリッド
細胞を回収し、米国特許第４，４１１，９９３号に詳述
されている制限希釈法によってクローニングする。制限
希釈法では、充填細胞、及び未融合の牌細胞と骨髄腫細
胞の増殖を抑制する適当な抑制剤を含有する生体外（ｉ
ｎ　　ｖｉｔｒｏ　）の培地中で抗標識ペプチド抗体産
生ハイブリッド細胞を個別に培養する。ハイブリッド細
胞を増殖させるクローニング培地をＥＬＩＳＡ分析でス
クリーニングして標識ペプチドに対する反応性をチェッ
クする。

標識ペプチドと反応する抗体含有上澄を生成するクロー
ン・ハイブリドーマを回収し、量産のため大鏝に生体外
（ｉｎ　　ｖｉｔｒｏ　）培養する。あるいはクローン
・ハイブリドーマ細胞をマウスの腹膜腔に注射した後、
高濃度の抗標識ペプチド抗体を含有する脚本を採取する
ことにより抗標識ペプチド抗体を生体内（ｉｎ　　ｖｉ
ｖｏ）で増殖させてもよい。

本発明者らの所見によれば、採取された腹水は３１１１
（＋／ＩＩＩ　Ｑ以上の濃度でモノクローナル抗標識ベ
プチド抗体を含んでいる。膨水中に含まれる抗体を公知
の方法、例えば硫酸アンモニウム分別沈澱法に続くゲル
・ｈラムクロマトグラフィーによって単離、濃縮するこ
とができる。必要とあれば、イオン交換クロマトグラフ
ィー及び／′または１国防１ｏｃｏｃｃｕｓ　ａｕｒｅ
ａｓからのプロティンＡと抗体が結合できるという事実
に基づく親和力クロマトグラフィー及び／または固定化
標識ペプチド・カラムによる親和力クロマトグラフィー
によって抗体をさらに精製することができる。

ＥＬｒＳＡ分析 上述したように、ポリクローナル抗体、ハイブリドーマ
上澄及びモノクローナル抗体の抗標識ペプチド反応を、
Ｅｎｇｖａｌｌ　　ｅｔ　ａｌ　、、　”Ｅｎｚｙｍｅ
　−Ｉｉｎｋｅｄ　１ｓｓｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓ
ａｙ　　（Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ　）　：　Ｑｕａｎｔｉ
ｔａｔｉｖｅ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　１ｍｉｕｎｏｇｌ
ｏｂｕｌｉｎ、”　Ｉ　Ｉｌ１ｍｕｎ幻ロ猛！±Σロ２
．　８，８７１−８７４（１９７１）に記載されている
ＥＬＩＳＡ分析でテストした。この種の分析は公知であ
るから、ここではその概要を説明するにとどめる。

化学合成された標識ペプ牙ドを、リン酸塩緩衝食塩水（
ＰＢＳ）中で約１〜１０μｇ／ｍＱノ濃度に希釈する。

この溶液的２５μｅを複数のマイクロタイタープレート
四部に注入する。溶液中の液体を培養中に蒸発させて合
成ペプチドをプラスチック四部壁に非特定的に付着させ
る。各四部を約１００μｅのＰＢＳで洗浄した後、１纜
量％のＢＳＡを含有する追加のＰＢＳを各凹部に添加し
てプレートを３１℃でさらに１時間培養し、プラスチッ
ク凹部の底に標識ペプチドが付着していない箇処が残ら
ないようにする。こうしてＢＳＡは関連の抗体が四部に
非特定的に付着するのを防止する。この追加培養の後、
ＰＢＳ溶液をデカントする。

次に、テストすべきサンプル（ポリクローナル抗体、モ
ノクローナル抗体またはバイプリドーマ上澄を含有する
動物血清）を凹部に注入し、３７℃で約９０分間培養す
る。培養後、抗体溶液を除去し、各四部をＰＢＳで、ま
たは水道水による水洗いで繰返し洗浄する。次いで約５
０μｇの酵素標識抗免疫グロブリン抗体、例えばアルカ
リ性ホスファタ一ゼ結合２次抗体を各四部に添加する。

抗標識ペプチド反応を示すハイブリドーマ上澄を検出す
る目的の分析ならば、アルカリ性ホスフ１ターゼ結合試
薬としてヤギの抗マウスＩ（ＩＧ抗体（Ｓ　ｉｏｍａＣ
ｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、ミズーリ州セントルイス〉を
、約１％のＢＳＡを含有するＰＢＳに１　：　　７００
希釈したものを使用する。例えばラビットから得た標識
ペプチドに対するポリクローナル抗体を検出する目的の
分析ならば、アルカリ性ホスファターゼ結合試薬として
ヤギの抗ラビットＩ（ＩＧ抗体（Ｓｉｕａｃｈｅｍｉｃ
ａｌ　Ｃｏ、、ミズーリ州セントルイス）を、約１％の
ＢＳＡを含有するＰＢＳに約１＝２００希釈したものを
使用する。

適当なアルカリ性ホスファターゼ結合抗体と反応させた
後、各凹部を生理的食塩水（約０．９％重量／容積）で
、または水道水に浸漬して繰返し洗浄する。次に約１０
０μρの無色アルカリ性ホスファターゼ基質を各凹部に
添加する。このような基質の一例がバラニトロフェニル
リン酸塩（Ｓ　ｉｇｒｔｒａＣｈｅｍｔｃａｌ　Ｃｏ、
、ミズーリ州セントルイス）テア−６〇− る。この基質は約０．１Ｍのグリシン（１ｌＨ１０，４
）、１１１Ｍの塩化亜鉛、及び１ｍＭの塩化マグネシウ
ムと共に約１ｍｇ／ｌ１ｌｅの強さに調合する。プレー
トに塗布されている標識ペプチドに抗標識ペプチド抗体
が結合すると、着色生成物が形成される。

色の光学密度はその色に応じた適当な波長における吸収
を測定することによって求めることができる。測定され
た光学密度値は凹部内のサンプル中に含まれる抗標識ペ
プチド抗体の量に正比例する。

標識ペプチドに対する親和力が特に低いポリクローナル
またはモノクローナル抗体を選び、これを利用して標識
ペプチド／タンパク質分子ハイブリッドを精製する。こ
れらの抗体は、ＥＬＩＳＡ分析（上述）において標識ペ
プチドを塗布したマイクロタイタープレートの凹部に抗
体が結合するのを抑制する遊離状態の標識ペプチドまた
は適当濃度の塩（例えば１ＭのＮａＣ１の能力によって
、または、適当濃度の塩による標識ペプチド親和カカラ
ムからの溶出によって識別される。カラム溶出には標識
ペプチドに対する親和力の低い抗体が有用である。なぜ
なら、ペプチドを損うおそれのある強力な溶出剤を使用
しなくても標識ペプチドを解放できるからである。

上記のように識別され、且つ精製された低親和力抗標識
ペプチド抗体をカラム・ゲルと結合させる。この際、グ
リシンエチルエステルのようなブロッキング剤を使用し
てゲルの未反応部位をブロッキングする。ホウ酸塩緩衝
食塩水＜ＢＢＳ）またはリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）
のような緩衝液で抗体結合ゲルを充分に洗浄する。次に
、標識ペプチド／′タンパク質分子ハイブリッドをカラ
ムに加え、再び緩衝液でカラムを洗浄する。高モル濃度
遊離状態標識ペプチドまたは適当濃度の塩、例えば１Ｍ
のＮａＣｅとの競合によってカラムからｍｉペプチド／
′タンパク質分子ハイブリッドを特定的に溶離させる。

遊離の標識ペプチドは標識ペプチド／タンパク質分子ハ
イブリッドと競合して抗体をゲルに結合させ、１ＭのＮ
ａＣＱは抗体とＦ識ペプチド、／タンパク質分子との間
の相互イオン作用を断つ。その結果、高い収率で＾純度
の標識ペプチド、／タンパク質分子ハイブリッドが得ら
れる。

上記親和力クロマトグラフィー法によって精製したハイ
ブリッド分子は成熟タンパク質分子から標識ペプチドを
分裂できる状態にある。この分裂を達成するため、先ず
ｌ１ｌｔｌＥペプチド／タンパク質分子ハイブリッドを
緩衝液に分散させ、次いで標識ペプチドの結合部分を構
成するアミノ酸残基に特異的なタンパク質分解酵素また
はその他の化学的タンパク質分解剤を懸濁液に添加する
。酵素をゲル・マトリクスと結合させることにより、生
成物溶液が酵素で汚染されるのを防ぐことができる。

上述したように、タンパク質分解酵素または化学的タン
パク質分解剤はハイブリッド・ポリペプチドを、標識ペ
プチド結合部分の隣接アミノ酸残基とタンパク質分子と
の間で分裂させる。同じく上述したように、１つの実施
態様例として、結合アミノ酸をＡ　５ｌ）−Ａ　５ｌ）
−Ａ　ＳＤ−Ａ　５ＩＪ−Ｌ　ＶＳ配列で構成してもよ
い。この特定アミノ酸配列はウシ粘膜エンテロキナーゼ
の基質であるタンパク質トリプシノゲン中に天然に見ら
れるものである。従って、この特定アミノ酸配列を使用
すれば、標識ペプチド／タンパク質分子ハイブリッドの
酵素分裂がタンパク質分子そのものの分裂をも誘発する
おそれは極めて少ない。

培養後、所期タンパク質を次のように精製する。

タンパク質分解剤がゲル・マトリクスに組込まれた酵素
である場合、懸濁液を遠心処理し、酵素・ゲル結合体を
含むベレットを捨てる。上澄は緩衝塩のほかに、タンパ
ク質生成物、分裂した標識ペプチド及び少量の未分裂ペ
プチド／タンパク質分子だけを含んでいる。化学的タン
パク質分解剤の場合にはゲル遠心分離の工程はなく、溶
液はタンパク質生成物、標識ペプチド及び少量の未分裂
ペプチド／タンパク質分子のほかに、化学的タンパク質
分解剤の残留分及びその副生成物を含む。

上記不純物質の多くはタンパク質生成物よりも少なく、
ゲルの濾過または透析など簡単な手段で有効に除去でき
る。このような工程を経た後でも未分裂標識ペプチド／
タンパク質分子だけはタンパク質生成物に混入したまま
である。タンパク質生成物からペプチド／タンパク質分
子を除去するため、混合物を第２蜆和カカラムに通す。

この第２カラムには、最初の生産媒体からペプチド／タ
ンパク質分子を除去するのに使用したのと同じ標識ペプ
チドに特異的な抗体が組込まれている。この抗体が不要
のペプチド／タンパク質分子と結合し、カラムからの溶
出物は不純物質を全く含まない所要のタンパク質生成物
だけを含む。

タンパク質分解に可溶性酵素を使用する場合には、タン
パク質生成物が少量の酵素を含有することもあるが、酵
素に対する固定化基質を含有する親和力力ラムに溶液を
通すことによりこの酵素を除去することができる。即ち
、酵素がカラムと結合し、所期のタンパク質分子だけが
通過する。

上述のように、標識ペプチドが結合したままでも必要な
酵素作用を行なうことのできるタンパク質生成物がある
。従って、この場合には標識ペプチドをタンパク質分子
から分裂させる必要はなく、上記分裂工程及びこれに続
く精製工程が不要となる。

標識ペプチドがタンパク質分子と結合したままとなる状
況では標識ペプチドの結合部分は不要であり、抗原性残
基だけで構成できる。この場合、上述したＤＮＡ発現ベ
クターの構成及びその製法は適当に変更することができ
る。

スＡ」幻装置ｌ− 表１に示す４種のＤＮＡオリゴマーを例えば、（１）　
　Ｌｅｔｓｉｎｏｅｒ　ａｔ　ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ
　ｏｆ　ＡｌｌｌｅＡｌｌｌｅｒｉｃａｎＣｈｅ　５ｏ
ｃｉｅｔ　、　９７．３２７８　（１９７５）　、（２
）　　ＭａｔｔｅｔｌｃＯｉ　ｅｔ　ａｌ、、Ｔｅｔｒ
ａｈ８ｄｒＯｎ　　１ｅｔｔ。２１．　７１９　（１９
８０）　、及び（３）　　Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ　ａｔ　
ａｌ、、Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｃ
ｈｅｍｉｃａｌ　５ｏｃｉｅｔ　、　１０３．３１８５
　　（１９８１）に記載されているように化学合成する
。

表　　　　１ ＡＧＣＴＧＧＣＧＧ’ｌ”ＧＡＴＡＡＴＧＧＴＴＧＣＡ
ＴＧＴＡＣＴＡＡＧＧＡＧＧＴＣＣＧＣＣ八ＣＴ　Ａ　
Ｔ　Ｔ　／１．　ＣＣＡ　Ａ　ＣＧテＡ　Ｃへ　Ｔ　Ｇ
　ＡＴ　’ｆ’　ＣＣＴ　ＣＣΔＧＴＡＴＡＴＧＧＡＣ
ＴΔＣＡＡＡＧＡＣＧΔＴＧＡＣＧＡＣＡｉへＡＧＣＡ
ＣＡＴ八’ｊ”　ＡへＣＣＴ　Ｇ　Ａ　Ｔ　Ｇ　Ｔ　Ｔ
　Ｔ　ＣＴ　Ｇ　ＣＴ　ｊ＼ＣＴＧＣ’ｒＧＴＴＴＣＧ
Ｔこれら４種のオリゴマーが組合わされて翻訳開始コド
ン（Ａ　Ｔ　Ｇ　＞　、アミノ酸配列から成るリポソー
ム結合部位をコードする塩基、及びアミノ酸配列（ＡＳ
Ｉ）−Ｔｌ゛−ＬＶｌｉ−ＡＳＩ）−ＡＳＩ１−　Ａｓ
ｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ）によって表わされる標識ペプチド
のコドンを構成する。標識ペプチドにおいて、配列ＡＳ
１１−７ｙｒ−ＬＶＳはペプチドの抗原性部分を構成し
、配列Ａ　５ｌｌ−Ａ　５ｌ）−Ａ　５ｌ）−Ａ　５ｌ
）−Ｌ　ＶＳは標識ペプチドのプロテアーゼ分裂結合部
分を構成する。表１から明らかなように、４種のオリゴ
マーを組合わせると、ＨｉｎｄｎＴ制限エンドヌクレア
ーゼ分裂部位と適合する末端を規定する。合成断片の他
の末６７一 端は＠ａｅ■制限エンドヌクレアーゼ分裂部位に対応す
る。

形質転換宿主細胞中に発現させるため、人の免疫系の調
整ホルモンであるタンパク質、インターロイキン２（ｒ
Ｌ−２）をコードするＤＮＡをＴａｎｉｇｕｃｈｉ　ｅ
ｔ　ａｌ。“Ｓ　ｔｒｕｃｔｕｒｅ　ａｎｄ　　Ｅ　Ｘ
ｐｒ８ＳＳｉＯｎ　ｏｆ　ａ　　Ｃ１ｏｎｅｄ　　ｃＤ
　Ｎ　Ａ　　ｆｏｒ　ｈｕｍａｎ　Ｔ　ｎｔｅｒｌｅｕ
ｋｉｎ　２．　”　Ｎａｔｕｒｅ　　、　３０２　、３
０５　（Ｍａｒｃｈ　２４．１９８３）に開示されてい
る方法で調製する。成熟ＩＬ−２ＤＮＡ断片の５′端を
リンカ−分子で処理するなどして凹凸末端部分を形成す
る。ＤＮＡ断片の反対端を適当に処理してＨｉｎｄＩ［
１分裂部位と適合させる。１ｍ−２をコードするＤＮＡ
は公知の化学合成法で製造できる。

４ａｌの合成りＮＡオ！Ｊゴｖ−をＩ　Ｌ　−２ＤＮＡ
と結合して、４個の合成りＮＡオリゴマーを１μｅずツ
（ツレツレ２００ｇ）とＩ　Ｌ　−２ＤＮＡ断片５μＱ
　（２００ｎｏ）から成る２０μｅの反応容積中に約７
３０１１ｉ基対（ｂｐ）の一体化断片を形成する。さら
に２ｕＱ（ＤＴ４−ＤＮＡすｉ−ゼ及び２ｕ（１（１）
１０×リガーゼ緩衝液（０，６６Ｍトリス緩衝液［ｒ）
Ｈ７，５］　、５０　ｍＭ塩化マグネシウム）を添加す
る。

さらに、２μｇの１５　ｉ＋Ｍスペルミジン、２μｅの
５０１１１Ｍジチオトレイトル、２ｕｙの１ｍＭ　ｍｅ
ＢＳＡ及び１μｅの２０１１Ｍアデノシン三リン酸（Ａ
ＴＰ）を添加する。−晩、４℃で培養することにより反
応させる。

室温、１００Ｖで１．２％アガロース・ゲルにおいてリ
ガーゼ混合物を電気泳動させる。７３０ｂｌｌＤ　ＮＡ
断片を含有するゲル領域を刺戟してゲルから電気溶出さ
せる。ＤＮＡをフェノール、クロロホルム、イソアミル
アルコール（２５：２５：１の容積比）で−麿抽出する
。水相に２．５容の１００％エタノールを添加してＤＮ
Ａを沈澱させる。この溶液を一晩の間、−２０℃で保管
した後、室温において１０，０００×９で５分間遠心処
理し、所要のＤＮＡ生成物のベレットを得る。

この７３０ｂｐ断片はクローニングベクタープラスミド
において）ｌｉｎｄ１１１部位と結合する相補端を有す
る。

第１図に示す（Ｐ　、　　Ｌ　、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓから得られる）プラスミドｒｌＹＥＪＯＯ１を
調製し、ＤＮＡ１μａにつき１ユニツト（Ｕ）のｌ−１
ｉｎｄＩｆｆ制限エンドヌクレアーゼを使用してプラス
ミドにＨ１ｎｄｌｌ制限エンドヌクレアーゼを作用させ
ることにより、上記７３０ｂｒｌ断片と結合させる。こ
の反応には４５０１１　Ｑの１ｘｌ−１ｉｎｄｌｌｌ緩
衝液（７０ｍＭ　ｉ−リス緩衝液［ＩＩＨ７，４］　、
７０１ｎ　Ｍ塩化マグネシウム、０．６Ｍ　　ＮａＣ１
が関与する。この混合物を１時間にｍす３７℃で培養す
る。）ｌｉｎｄｌｌによるプラスミド１ｌＹＥＪＯＯ１
の消化によって、３２７３ｂｐと７８７ｂｐの２個のＤ
ＮＡ断片″ベクター断片″が生成する。大きい方の断片
は第１図に示すように、テトラサイクリン及びアンピシ
リン表現型マーカーをコードする配列、ラクトースオペ
レーター及び合成オペレーターを含む。

Ｈｉｎｄｌｌに消化されたＤＮＡは、次いで４５μＱの
ＩＯＸ　ＣＩ　Ｐ緩衝液（０，５Ｍｌ−リス緩衝液［ｐ
Ｈ９，０）、１０１１１Ｍ塩化マグネシウム、１　１１
１Ｍ塩化亜鉛、１０１１Ｍスペルミジン）及び１μｅの
子ウシの腸ホスフ１ターゼ（３０Ｌｌ）でホスファーゼ
処理することにより自己結合を防止する。混合物を３７
℃で３０分間培養してから上記フェノール、クロロホル
ム、イソアミルアルコール（２５：２５：１の容積比）
で一度抽出する。水相に、（水相に対して）２．５容の
１００％エタノールを添加し、この混合物を一晩、−２
０℃で保管する。次いで混合物を２２℃で５分間、１０
，０００ｘ　ｇで遠心処理してペレットを得る。ペレッ
ト状ＤＮＡを２２℃で２時間、０．７％アガロース・ゲ
ルで１００ｖの電圧下に電気泳動させる。

比較的大きい″“ベクター断片″を電気溶出によって単
離し、フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコー
ル（２５：２５：１の容積比）で一度抽出する。水相に
２．５容の１００％エタノールを添加してから、溶液を
一晩、−２０℃で保管する。次いで混合物を２２℃で５
分間、ｉｏ、ｏｏｏｘ　ｏで遠心処理し、所期生成物を
ペレット状にする。

すでに結合している標識ペプチドオリゴマー７・′ＩＬ
−２断片を、２μρの１）ＹＥＪＯＯｌの３２７３ｂｌ
ｌｌ〜　７１− 断片（１００１１０＞を、２μｅの１０×リガーゼ緩衝
液（０，６６Ｍ１−リス緩衝液［１）Ｈ７，５］　、５
０　ｍＭ塩化マグネシウム）、２μｇの５０　ｍＭジチ
オトレイトール、２ｕＱの５０１１１Ｍスペルミジン、
２ｕＱの　１ｍＯ／　ｍＱ　ＢＳＡ、１　ｕＱの２０１
１１Ｍ７Ｔ’／　シ：／三リン酸（ＡＴＰ）、３ｕＱの
Ｈ２０及び１ｔｔＱ（１）Ｔ４−　ＤＮＡリガーゼと共
に上記複合標識ペプチド／ＴＬ−２断片（ａｅｏｂｐ＞
　　（１０１００ｎと組合わせることにより上記１）Ｙ
ＥＪＯＯ１プラスミドの単１１！１３，２７３ｂｐ断片
と結合させる。この混合物を一晩、１５℃で培養する。

こうして得られた組換えプラスミドｐ１ｍｃｆ　　００
１でＭａｎｉａＮｓ　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌ
ａｒ　　ＣＩｏｎｉｎ　　：Δ−Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｍａｎｕａｌ　Ｃｏ１ｄ　５ｐｒｉｎｏ　Ｈａｂｏ
ｒＬ　ａｂｏｒａｔｏｒｖ　　（１９８２）に開示され
ているような標準的な形質転換法を利用して旦−、Ｃ０
１ｉ菌株ＲＲ１を形質転換する。宿主細胞を培地中で増
殖させてから溶解させる。形質転換した宿主細胞からの
プラスミドについて、プラスミド内の異種遺伝子（一体
化標識ペプチドオリゴマー／ＩＬ−２断片）の配位が正
しいかどうかをチェックする。

実施例１で述べたようにしてＩＬ−２をコードするＤＮ
Ａ断片＜　６６０ｂｐ）を調製する。表２に示すような
３４及び３０個の塩基を有する２種類の合成りＮＡオリ
ゴマーを、標準的な方法を利用して化学合成する。表２
に示すように、合成りＮＡオリゴマーの１つの末端は酵
母プラスミドと次に結合するＥ（ＯＲＩ分裂部位に対応
し、二重オリゴマーの反対端は次にＩＬ−２ＤＮＡ断片
と結合する凹凸末端部を形成する。表２に示すように二
重化された状態で合成オリゴマーは実施例１の場合と同
じ、ただしプロモータ一部位やリポソーム結合部位を欠
く標識ペプチドを表わす。

表　　　　２ Ａ　Ａ　Ｔ　Ｔ　ＣＡ　Ｔ　Ｇ　Ｇ　Ａ　ＣＴ　Ａ　Ｃ
Ａ　Ａ　Ｇ　Ｇ　Ａ　ＣＧ　Ａ　ＣＧ　Ａ　ＣＧ　Ａ　
ＣＡ　Ａ　Ｇ　Ｇ　ＣＣ’Ｔ’ＡＣＣ’ｉ”ＧＡ’ｆ’
ＧＴＴＣＣＴＧＣ’ｉｌ’ＧＣＴＧＣＴＧ’ｉ’ＴＣＣ
ＧＧ本発明において酵母宿主細胞を形質転換するプラス
ミドの製法を第２図に示した。５０μｅのプラスミド（
５０μｏ　）を４５０ｕ　Ｑの１ｘＨ＋ｒｔｃｔｍ緩衝
液及び１０μｅのＥＣ０ＲＩ制限エンドヌクレアーゼと
混合することにより、クローンベクターであるプラスミ
ドｐ２１９を制限エンドヌクレアーゼ［Ｃ０Ｒ１で完全
に処理する。この混合物を３７℃で２時間培養してから
、１０分間に口って６５℃に熱してＥＣＯＲ■酵素を不
活性化する。次いで酵素制限条件下にプラスミドに）ｌ
ｉｎｄｕｌを作用させる。このため、上記混合物に２μ
ｅのＨｉｎｄＩｌｌ制限エンドヌクレアーゼ（１０Ｕ　
／μｅ）を添加し、これを３７℃で２０分間培養する。

次いで混合物を１０分間６５℃に加熱する。ｐ２１９プ
ラスミドを制限エンドヌクレアーゼで２度処理すること
により得られる所期の７．４ｋｂ断片を実施例１で述べ
たアガロース・ゲルからの電気泳動によって単離する。

第２図に示すように、それぞれ１μｅの２種類の合成り
ＮＡオリゴマー（それぞれ２０ｎｏ　）と１μｇの１１
−２断片（ａｅｏｂｐ＞　　（２００ｒｔｇ）と１μｅ
（４０ｎＯ）の７，４ｋｂのｐ２１９プラスミドから成
る反応混合物中で、１単位のＴ４−ＤＮＡリガーゼ及び
２μｅの１０×リガーゼ緩衝液（０，６６Ｍトリスｌｌ
衝液［１）Ｈ７，５］　、５０　＋＋＋Ｍ塩化マグネシ
ウム）の存在において、合成りＮＡオリゴマー、ＩＬ−
２ＤＮＡ断片及び所要の線形化ｐ２１９ベクター断片を
結合させる。さらに、２μρの１５　ｍＭスペルミジン
、２μｅの５０１１１Ｍジチオトレイトール、２μＱの
１ｍＭｍ１！ＢＳＡ、１μｍ！（７）２０１１１Ｍ　　
ＡＴＰ及び６μＱのＨ２０を添加して反応容積を２０μ
ｅどする。１４℃で一晩培養することによって反応させ
る。

このように構成された混合物をそのまま利用してＥ、Ｃ
ｏ１１　　ＲＲｌを形質転換する。形質転換プロセス後
、組換えＤＮＡ、即ち、＋１１　ｍｙｒ　　１００をｌ
、ＧＯ１＋宿主から単離し、数種類の制限エンドヌクレ
アーゼを別々に作用させるとともに、正しいプラスミド
が構成されたことを確認する。

相換えＤＮＡプラスミドであるｐ　ｌ　ｌｌ１ｙｆ　　
ｉｏｏを用いて常法によりサツカロミセス・セレビシェ
（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ　　Ｃｅｒｅｖｉｓｉａ
ｅ　）　ＤＢ　　７４６菌株で形質転換する。形質転換
に先立ってＤＢ７４６菌株をＹＰ−グ／Ｌ、：ｌ−ス（
２００１１１９）培地Ｔ−２Ｘ　１０”細胞／ｉ１９．
が培養されるまで増殖させる。２２℃で５分間１，０Ｏ
ＯＸ（＋で遠心処理することによって細胞を採取する。

ペレットを殺菌蒸留水で洗浄する。

次いで２０ｗ＋ＱのＳＥＤ　（１Ｍソルビトール、２５
ｔｌ１Ｍ　　ＥＤＴＡ　［ＤＨ８，０コ、及び５０　ｍ
Ｍジチオトレイトール）中に再分散させて酵母細胞を濃
縮し、３０℃で１０分間培養する。次いで細胞緩衝混合
液を３００Ｘ　Ｑで５分間遠心処理する。２０ｍ１！の
１Ｍソルビトールでペレットを１回洗浄し、再び細胞を
２０ＩＲＱのＳＣＥ（１Ｍソルビトール、０．１Ｍクエ
ン酸ナトリウム［ｐ）−１５，８１，０，０１ＭのＥＤ
ＴＡ）に懸濁させる。細胞壁を破壊するため、０．２　
ｍＱのグルスラーゼを溶液に添加し、静かに攪拌して３
０分間、３０℃で培養する。

１０ＩＩＩＱの酵母細胞を顕微鏡スライド上の５％（重
量／容積）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の１滴中
に希釈し、４ＯＯＸ位相コントラストにおける“ゴース
ト″を観察することによってスフェロプラストの存在を
検出する。

次いで細胞混合物を３分間、３００ｘ　ｇで遠心処理す
る。得られたペレットを２０ｔｌの１Ｍソルビトールで
２回洗浄してからＳＴＣ（１Ｍソルビトール、１０ｍＭ
　　ＣａＣＱ、１０ｍＭＬ−リス填酸緩衝液［ｐＨ７，
５コ）で１回洗浄する。

ここで酵母スフェロプラストを上記Ｂ　ｅａａｓの方法
で調製したプラスミドベクターにより形質転換する。ペ
レット状プロトプラストを１．Ｏｍ（ｌのＳＴＣ中に懸
濁させ、１０　ｍＱ使い捨て試験管（ｌｅａｆＣｏｎ　
＃２０５９）に収納された１００μＱ部分サンプルに分
割する。次いで各部分サンプル（０，５〜５μｇ）に１
〜１０μｅのＤＮＡプラスミドを添加する。

混合物を室温で１０分間培養してから、各部分サンプＪ
Ｌｉニ１　　ｍｇ（７）ＰＥＧ　（２０％ＰＥＧ４００
０．１０１１１ＭＣａ　Ｃ１！２．１０　ｍＭトリス塩
酸緩衝液［１）８７．４］）を添加してＤＮＡ取込みを
促進する。室温で１０分間放置した後、混合物を５分間
３５０ｘ　ｇで遠心処理する。得られたペレットを１５
０μｅのＳ０８（１０１ＩＩＱの２Ｍソルビトール、６
．ＩＩＩＩＱのＹＥＰ　（１％ｗｔ／ｖｏｌ酵母抽出物
、２％Ｗｔ／ｖｏｌペプトン、２％ｗｔ　／　ｖｏ　ｌ
グルコース）、０．１３ｍＮの１Ｍ　　Ｃａ　Ｃｏ２．
２７μＱの１％リシン及ヒ３．７ｍｅの水）中に再懸濁
させる。この混合物を３０℃で２０分間培養する。次い
で細胞をプレート培養するか、または数日間に日って４
℃に維持する。

プロトプラスト／ＤＮＡ混合物のプレート培養に先立っ
て、選択プレートをあらかじめ３７℃で培養する。１８
．２　ｍＱのソルビトール、２ｇの寒天、０．６ｇのＤ
Ｈｃｏ酵母窒素ベース（アミノ酸を含まず）、２ｇのグ
ルコース、ｏ、ｉ　ｍｙの１％アデニン、０．４Ｉｌｌ
ｌ！の１％ウラシル及びアミノ酸から必要に応じて構成
される６［ｌｌＱの麦芽ＴＯＰ寒天を選択プレート上で
、形質転換細胞及び注入された試験管内容物の各部分サ
ンプルに対して加える。

プレートを２〜４日間３０℃で培養する。Ｔｒｌｌマイ
ナス媒体中に発生するコロニーはＴｒｐ１遺伝子を有す
るプラスミド、即ち、形質転換されたプラスミドを含む
。

犬１」１Ｌ 固相化学合成法を利用して下記組成を有するシバルミチ
ル誘導された標識ペプチドを調製する。

Ｈ２Ｎ　−Ａｓｐ−Ｔｙｓ−ｃｙｓ−ＡＳｒ）−ＡＳＤ
−ＡＳＥＩ−ＡＳｌｌ−Ｌｙｓ−Ｇ　１１　Ｐｒ０−　
ＬＶＳ−ＬＶＳ−Ｇ　ＩＶ−ｐａ　　ｐａ ＯＯＨ 標識ペプチドの合成はカルボキシ末端（Ｃｏ。

Ｈ）残基から始まる。この合成プロセスにおいて、０．
５ｇのＮ−α−ブチロキシカルボニル（α−ＢＱＣ）Ｇ
ＩＶ樹脂（ｐ　ｅｎｉｎｓｕｌａ　　Ｌ　ａｂｓ　）を
１０ＩＩＩＱの溶剤塩化メチレン（ＣＨ２Ｃｏ２．　Ｂ
ａｋｅｒ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒ＋ｅｓ　）で２回洗浄
する。次いでｉｏ　ｒｒｔの３０％（Ｖ／Ｖ）ｔ−リフ
ルオロ酢酸（ＴＦＡ　　、Ｐｉｅｒｃｅ　１３　ｉｏｃ
ｈｅｍｉｃａｌｓ　）のＣＨ２Ｃｏ２溶液で樹脂を１回
洗浄する。

樹脂を１０ＩＩＩＱの３０％（Ｖ／’Ｖ）ＴＦＡのＣＨ
２Ｃｏ２溶液と反応させることによってＧｌｙからα−
ＢＯＣ基を除去する。次いで１０ＩｌＩＱのＣＨ２ＣＣ
２で樹脂を３回洗浄する。

樹脂の保護解除は少量の樹脂サンプルに対するニンヒド
リン（邑）テスｉ・によって確認する。１１１ｇの樹脂
を１０Ｘ　７５ｍｍガラス試験管に注入し、これにエタ
ノール希釈８０％（Ｖ／Ｖ）フェノール３滴、ピリジン
３滴、及びエタノール希釈５％（Ｗ／Ｖ）ニンヒドリン
３滴を添加する。混合物を５分間煮沸する。樹脂は濃青
色になれば゛′保護解除″されたことを意味し、もし濃
青色にならなければ上記手順を繰返す。

次にＣＨ２Ｃ１！２に希釈した５％（Ｖ／Ｖ　）ジイソ
プロピルエチルアミン（再蒸留ＤｒＥＡ、Ａｌｄｒｉｃ
ｈ　　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から成る１０　ｔｎＱの立
体障害塩基を添加することによって樹脂を中和し、室温
で５分間シェーキングする。液をデカントし、この工程
を繰返す。再度、１０　ｍＱのＣＨ２Ｃｏ２中で３回樹
脂を洗浄する。

誘導体α−ブチロキシカルボニル＝ε−フルオルエチル
メチロキシカルボニル −ＦＭＯＣ）の形態を取るジアミノ酸Ｌｙｓを、次にブ
ロッキングを解かれたＧＩＶ樹脂と結合させるため、２
　ＩＲＭのＬＶｌｉ誘導体を１０　ｍＱ　ＣＨ２　０　
９２に溶かした１　　ｍＭのカルボジイミド縮合剤ジシ
クロへキシルカルボジイミド（ＤＣＣ，Ｓｉｇ＋＋＋ａ
）と混合することによって活性化する。この混合物を１
０分間に亘り氷上で反応させてから濾過する。活性化α
−ＢＯＣ−ε−ＦＭＯＣ−Ｌｙｓから成る濾液を樹脂に
添加し、室温で２分間シェーキングする。次いで樹脂を
１０ＩＩＩＱのＣＨ２　Ｃｏ２中で２回洗浄する。

ここで上記ニンヒドリン・テストを繰返して結合が起こ
ったかどうか、即ち、樹脂が黄色のままであるかどうか
をチェックする。もし樹脂が素度して反応が不完全であ
ることを示す場合には、ＤＴＥＡによる樹脂の中和から
始まる上記結合プロセスを変更形式で繰返す。即ち、Ｃ
Ｈ２　０ｇ２にｔｌかＬ７．＝１０１１１１１（７）５
％（Ｖ／Ｖ）ＤＩＥＡを樹脂に添加し、混合物を室温で
５分間シェーキングする。樹脂を１０　ｍρのＣＨ２　
Ｃｏ２で３回洗浄する。

次に　１．２６１１１ＭのＤＣＣ，２１１Ｍのヒト０キ
シベンシトリアゾール＜１−＋０ＢＴ、　Ａｌｄｒｉｃ
ｈ）　　（上記ＤＣＣの使用に代わるものとして）、及
び１．２７＋１１Ｍα−ＢＯＣ−ε−ＦＭＯＣ−ＬＶＳ
を１０ＩＩｌｅノシメチルホルムアミド（ＤＭＦ、　ｐ
ｉｅｒｃｅ　）　　（ＣＨ２０Ｑ２に代わる溶剤として
）に溶かし、０℃において１０分間反応させる。活性ア
ミノ酸）−１０ＢＴエステルを含有するこの混合物を保
護解除された樹脂に添加し、室温で４時間シェーキング
することにより結合反応を完結させる。樹脂を１０　ｍ
ＱのＤＭＦで２回洗浄し、さらに１０ｍ１！のＣＨ２０
Ｑ２で２回洗浄する。ニンヒドリン・テストを繰返す。

樹脂が黄色のまま（陰性）なら、パルミチン酸と結合で
きる状態にある。

ＧＩＶ結合樹脂と結合しているしｙｓ残基にパルミチン
酸を添加するため、上記手順を変更した形で繰返す。即
ち、ＣＨ２Ｃ（１２による最初の樹脂洗浄に続いて、（
ＴＦＡの代わりに）ＣＨ２０Ｑ２に溶かした５０％（Ｖ
／Ｖ）ピペリジン１０　ｍｌで洗浄する。次に、（ＣＨ
２ＣＱ２で希釈Ｌり）１０ｍｅの５０％ピペリジンを添
加することによってＦＭＱＣ−Ｌｖｓのε−アミノ基を
保護解除し、室温で３０分間シェーキングする。次いで
この混合物を１０ＩＩＩＱＣＨ２ＣＱ２で３回洗浄する
。

α−ＢＯＣ−ε−ＦＭＯＣ−Ｌｙｓの結合に利用したの
と同じ方法で１０　ｍＭのパルミチン酸をε−アミノ基
と反応させる。この方法により、先行アミノ酸（樹脂と
結合しているＧ　ｌｙ）と結合したパルミチル誘導アミ
ノ酸を生成させて免疫処置のためのミセル形成を容易に
する。

標識ペプチド合成の次の段階として、上記手順を繰返す
ことによって第２パルミチル誘導アミノ酸残基（１４８
）を添加する。次に、誘導ペプチドを構成する残りのア
ミノ酸残基を、上Ｆｉ［！Ｌｙｓ残基を適当なアミノ酸
で置換することにより添加し、必要な長さの標識ペプチ
ドを得る。最終Ａｓｐ残基の結合後、この残基のＮ末端
を、ＣＨ２Ｃβ２で樹脂を２回、さらに１０１１１１！
１７）３０％ＴＦＡ　（ＣＨ２ＣＱ２中Ｖ／Ｖ　）で１
回洗浄することによって保護解除する。さらにｉｏ　ｍ
ｒｔの３０％ＴＦＡ　（ＣＨ２Ｃ９，２中Ｖ／Ｖ　）を
樹脂に添加し、この混合物を室温で３０分間シェーキン
グする。次いで樹脂をＣＨ２０１！２中で３回洗浄する
。

上記結合手順完了後、パルミチル銹導ペプチド分子全体
を樹脂から分裂させ、弗化水素（ＨＦ）を利用して残基
の側方ブロッキング基を保護解除することによって、２
個のパルミチン酸誘導リシン残基を有するアミノ酸配列
を生成させる。側方基の保護解除及び分裂は乾式攪拌棒
材きの反応フラスコにペプチド分子を入れて行なう。Ｔ
ｖｒ残基を保護するためフラスコに　１．０ＩＩｌｅの
アニソール（Ａ　Ｉｄｒｉｃｈ）を添加し、ドライアイ
ス７／メタノール上でフラスコを１０分間冷却する。吸
気装置により混合物を数分間に日って３４０１１１１１
Ｈ（］の減圧下に置く。次いで弗化水素（ＨＦ）源をフ
ラスコに接続することにより樹脂ビーズから前記完成さ
れたペプチドを分裂させると同時に、ペプチドから側鎖
保護基を除去する。ＨＦは反応フラスコ内へ１０ｍ１マ
ークまで圧入される。

フラスコ中の混合物を、標準メリフィールド樹脂なら３
０分間、ベンツヒドリルアミン樹脂なら６０−８４　＝ 分間、感応性アミノ酸が存在するなら４５分間、それぞ
れ氷水浴中で攪拌する。氷水浴中で攪拌を続けながら、
フラスコをゆっくり減圧状態にする。

樹脂が完全に乾燥するまでフラスコを減辻下に維持する
。

１０ＩＩＩＱの石油エーテルで樹脂を２回洗浄する。

１０　Ｉｌｌρの氷酢酸（ＨＡｃ　）を添加して攪拌し
、１０分間放置する。次いで樹脂を５５℃で２分間加熱
する。次に５０ｍ＋！フィルターフラスコ上に配置した
１５　ｍＱの粗フリット製ブッフナー漏斗に樹脂／ＨＡ
Ｃを注入する。樹脂を１０１１１ＱＨＡＣで洗浄する。

ＨＡＯｉ１１液をｓｏｍＱポリプロピレン遠心管に移し
、−晩に亘って凍結乾燥する。得られる生成物はシバル
ミチル誘導ＩＩ！識ペプチドであり、ペプチド抗原性部
分に対する抗体を生成するのに利用できる。

このような利用に先立って、分子量カットオフが６００
０〜８０００ダルトンとなるように水またはＰＢＳに対
してＩＪｉＪペプチドを透析する。

ＢＡＬＢ／ｃマウスを先ず例えば上記実施例３で１ｑら
れるシバルミチル誘導標識ペプチド１００μｇを左右後
肢に皮下注射して免疫処置した。免疫処置に先立ち、二
度蒸留した殺菌水２　ｍＱに４ｍ。

の標識ペプチドを混合し、２　ｖａＱの７０インド完全
アジユバント（Ｄ　１ｆｃｏ　　ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ　、ミシガン州デトロイト）を添加することによ
り標識ペプチドをエマルジョンとして調製した。最初の
免疫処置後、７０イント不完全アジユバントに混入した
１００１１１！＋のシバルミチル誘導標識ペプチドで２
ケ月ごとに処置した。

２回目の免疫処置及びこれに続く各免疫処置の後に、殺
菌ピペットにより動物の眼窩後部から裸面した。採取し
た血液を室温で３０分間凝固させ、１０分間４５０ｘ　
ｇで凝固血液を遠心処理することによって血清を調製し
た。この血清の抗標識ペプチド抗体反応を上述のＥＬＩ
ＳＡ分析でテストした。

以後の免疫処置ごとに、マウスが標識ペプチドに対して
充分な血清量を生成したことが判明するまでＥＬＩＳＡ
分析を繰返した。高い血清量が検知されたら、食塩水に
溶かしたシバルミチル誘導標識ペプチドを静脈注射した
。

３〜４日後、類推転位によって動物を処分し、動物から
牌臓を摘出し、この牌臓から単一細胞懸濁液を調製した
。牌臓細胞をクリック培地（Ａｆｔｉｃｋ　Ａｓ５ｏｃ
ｔａｔｅｓ　、ウィスコンシン州ハドソン）中で培養し
た。培地には１０％（Ｖ／Ｖ）の加熱不活性化したウシ
胎児血清（Ｆｅ２）、３００Ｍｇ／ｍＱの新鮮なし一グ
ルタミン、５０μＬＪ／ｍＱのゲンタミシン、５０Ｕ／
’　ｍＱのペニシリン、５０μｇ／ＩＩＩＱのストレプ
トマイシン、２５１１１Ｍのへベス緩衝液及び１６１１
１ＭナトリウムＮａＨＣＯ３（クリック完全培地）を補
足した。

約２０Ｘ１０６牌細胞を１５　ｒｎＱ円錐形遠心管内で
約１０ｘ　ＩＱ６Ｎ　Ｓ　１ネズミ骨髄腫細胞と混合す
ることにより融合を達成した。１０分間、２５０ｘ　ｇ
で遠心処理して細胞混合物をペレット化し、上澄を捨て
た。クリック完全培地で希釈したＰＥＧの４０％（重量
／容積）溶液１　　ｍＱをこのペレットに滴下添加した
。次いで２分間遠心管に１０ｍＱのクリソり完全培地を
添加し、細胞ベレットをゆっくり再懸濁させた。次に、
この混合物を５分間、２５０×９で遠心処理し、上澄を
捨てて融合プロセスを完結した。

得られた細胞ベレットを４０　ｍＱのクリック完全培地
中に再懸濁させることによって融合細胞７Ｃ８から抗標
識ペプチド抗体を誘導した。培地に約１．３６　ｔａｇ
／　！ｌＩＱのヒボキサンチン、０．００１７６ｍＱ／
Ｉｌｅのアミノプテリン及び０．３８８ｒｎＱ／　ｌｌ
１ｇのチミジン（クリックＨＡＴ完全培地）を添加する
ことにより、未融合骨髄腫細胞（ＮＳ１＞、二重ＮＳ１
ハイブリツド、未融合稗細胞及び二重牌細胞ハイブリッ
ドの増殖を防止した。約１２０Ｘ　１０”　３　Ａ１Ｂ
／ｃのマウス・チミジン細胞を充填細胞として添加した
。次いで細胞懸濁液全体を平底マイクロタイタープレー
ト（Ｎｏ、３５９６　　Ｃｏ５ｔａｒ　Ｉｎｃ、。

マンチェスター州ケンブリッジ）内で２００ｍＱ部分サ
ンプルに分割した。培地はいずれも空気中に７％ＣＯ２
を含有する湿潤雰囲気中で約３７℃に維持した。７〜１
０日培養した後、成熟ハイブリッド細胞を含有する凹部
から得た上澄をＦＬＩＳＡ分析でテス］−シ、抗標識ペ
プチド抗体の存在をチェックした。

７０８細胞系列が標識ペプチドに対して親和力の低い抗
体を生成することが判明し、従って上述したように標識
ペプチド／タンパク質分子ハイブリッドの精製に使用し
て有用であると考えられる。

この細胞系列のサンプルは受託番号１−１３８４６５で
ＡＴＣＣに寄託されている。

実施例５ ＢＡＬＢ／ｃマウスに約２Ｘ１０Ｇハイブリドーマ細胞
を腹膜内注射することによって抗標識ペプチド抗体を生
体内（伍丘ハ」−）で高濃度に生成させた。ハイブリド
ーマ細胞注射の１週間前に、炎症を誘発する腹水として
１．ＯｍｅのブリスタンをＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　Ｃマウ
スに腹膜内注射した。ハイブリドーマ注射から８〜１４
日後に腹水を採取し、１０分間１０００ｘ　ｇの遠心処
理によりハイブリドーマ細胞をベレット化した。こうし
て得られた上澄は３μＱ／ｍＱ以上の１１１度でモノク
ローナル抗標識ペプチド抗体を含有することが判明した
。

ＥＬＩＳＡ分析において標識ペプチドを塗布されている
マイクロタイタープレートの凹部に抗体が付着するのを
抑制する遊離標識ペプチドの能力を利用する親和力精製
に使用するため、（上述のように製造された）モノクロ
ーナル抗標識ペプチド抗体を選択した。標識ペプチドと
の親和力が低い抗体を親和カマトリクス・カラム用に選
んだ。

親和力クロマトグラフィー法においては、精製抗体を１
０００容の８８８（５０ｍＭホウ酸塩、１５０　　ＩＩ
Ｍ　　Ｎａ　Ｃｅ　［ｐＨ８，５１）　ニ対して透析シ
テから、Ａｆｆｉ　Ｇｅｔの指示書に従って４℃で一晩
培養することによりＡｆｆｉ　Ｇｅｔ　　１０＜Ｂｉｏ
ｒａｄ　Ｌ　ａｂｏｒａｔＯｒｉｆｉｓ　）と結合した
。次いでＡｆｆｉ　ｃｅ＋の未反応部位を１０〜１００
　ｓＭグリシンエチルエステルを添加することによって
ブロッキングする。ゲルに対して約２１１１（１／＋１
１９の抗体を含有する抗体結合ゲルをＩＮ　　ＰＢＳで
充分に洗浄した。

次いでゲル・カラムに４℃において　１．０　ｍＱ　／
１ｎの速濱で標識ペプチド／タンパク質分子ハイブリッ
ドを加えた。カラムをＰＢＳで洗浄した。

次いでカラムへの流れを反転させ、０．５Ｍの合成遊離
Ｉ！！識ペプチドを含有するＩＮ　　ＰＢＳ溶液を送入
してハイブリッド分子をカラムから追出すことによって
標識ペプチド／タンパク質分子ハイブリッドを特定的に
溶出させる。

実施例７ 上記実施例６で得られた親和力クロマトグラフィー精製
したハイブリッド・ペプチド・タンパク質をタンパク質
ｍｉが０．１〜５１１Ｌ／′ｍＱ　ｋｍなるように１〜
ｉｏｏｍＱのトリス緩衝液［１）Ｈ８，０］中に懸濁さ
せる。ウシ粘膜エンテロキナーゼを懸濁液に添加するこ
とにより、最終濃度１００〜５０，０００Ｕ／ｍｌのプ
ロテアーゼ活性度を得る（この単位はＬ　１ｅｐｎｉｃ
ｋｓ　ａｎｄ　　Ｌ　ｉｇｈｔ、　Ｇｅｎｅｒａｌ　　
　ｉｏｃｈｅｍ比匡り、扶４　．１６７７（１９７９）
によって定義されている）。次いで、懸濁液を室温で８
〜７２時間培養する。

培養後、懸濁液を、ｌ）Ｈを８．０に相持したまま１〜
１００Ｉｅの０，５Ｍ　　Ｎａ１ｌ！を添加してイオン
強度を高める処理によって純粋なタンパク質生成物を得
る。この調整に続いて、ウシ粘膜エンテロキナーゼの天
然基質である固定化された膵臓トリプシノゲンを含有す
る親和力力ラムに懸濁液を通す。その結果、エンテロキ
ナーゼがカラムと結合し、所要のタンパク質生成物がカ
ラムを通過する。

カラムを通過した流れを、固定化された抗標識ペプチド
抗体を含有する親和力力ラムに通す。分裂した標識ペプ
チドが未分裂のままの標識ペプチド／タンパク質分子ハ
イブリッドと共にカラムに結合する。カラムからの溶出
物は純粋な成熟タンパク質生成物だけを含有する。

ｒＬ−２をコードするＣＤ　Ｎ　Ａを、Ｔａｎｉｇｕｃ
ｈｉらの方法（前掲）に基づいて実施例１と同様にして
調製した。本発明に供するための調製にあたって、ＩＬ
−２０ＤＮＡを制限酵素Ｈｏ１ＡＩ及びＨｉｎｄ　ｍで
消化した。ＨｏｌＡｌ部位は成熟Ｉ［−２タンパク質の
アミノ末端を表わす位置に生じ、Ｈｉｎｄ　Ｉ１１部位
はＣＤ　Ｎ　Ａの３′非翻訳領域に生ずる。

第３図に示すように、ＨＯｉＡＩによる作用の後に、非
結合性鎖の３′末端から形成された単一鎖の張出部分は
、Ｔ４−　ＤＮＡポリメラーゼの３′エクソヌクレアー
ゼ活性により凹凸末端とした。得られたＩＬ−２０ＤＮ
Ａ断片の５′末端はヌクレオチド配列ＯＣＴから始まり
、これは成熟ＩＬ−２タンパク質の第２番目のアミノ酸
であるプロリンに対応している。１ｍ−２タンパク質の
第１番目のアミノ酸であるアラニンのＤＮＡコードは、
以下に・述べるように合成オリゴヌクレオチドの部分と
して加えた。

第３図に示す６８ｂｐと６４ｂｐの合成りＮＡオリゴマ
ーを、実施例１で引用した文献に詳述されている常法を
用いて化学的に合成した。これら２個のオリゴマーを合
成するのに用いられるトリエステル法の詳細は、３００
ｄ　ｅｔ、、“Ｎ　ｕｃｌ、Ａ　ｃｉｄ、Ｒｅｓ、　”
４．２５５７　（１９７７）及びＨｉｒＯ３ｅｅｔ　ａ
ｌ、　”　Ｔｅｔ、Ｌｅｔｅ、”胆、　２４４９　（１
９７８）に記載されている。第３図に示すように、合成
りＮＡオリゴマーの５′末端は、複製時に、後でシャト
ルベクターに結合するためのＥＣ０ＲＩの付着端に対応
しているのに対し、複製オリゴマーの反対端は、後でＩ
Ｌ−２０Ｄ　Ｎ　Ａ断片に結合するための凹凸末端とな
っている。開始コドンＡＴＧは複製オリゴマーの５′末
端のＥＣ０ＲＩに隣接して位置する。次の１９コドンは
、アミノ酸配列：　Ａ　Ｉａ−５ｅｒ−１ｌｅ−５ｅｒ
−Ｇｌｖ−Ａｒ（］−ＡＳＩＩ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒ
１１ｌ−ＬＶＳ−Ｔｈｒ−ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＡＳＩＩ−
ＡＳＩ）−ＡＳｒｌ−ＡＳｒｌ−Ｌｙｓからなる１Ｐ−
３として示されている標識ペプチドをコードする。ＩＰ
−３の構成において、Ａｌａ−５ｅｒ−Ｉ　　Ｉｅ−３
ｅｒ−Ｇ　ｌｉ　Ａｒ０−　Ａ１１ｌ）−Ｔｈｒ−Ｈｉ
Ｓ−Ａｒ０−　Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−ＬＶＳ−Ｔｈｒは、該
ペプチドの抗原部分を構成し、Ａ　Ｓ＋１−　Ａ　Ｓｉ
　Ａ　５ｌｌ−Ａｓｐ−ＬｖＳは、該ペプチドのプロテ
アーゼによる切断結合部位を構成している。複製オリゴ
ヌクレオチドの３′末端部分のコドンはアミノ酸Ａｌａ
をコードしており、これは上記の如く、成熟ＩＬ−２タ
ンパク質の５′末端部分の第１番目のアミノ酸を構成し
ている。

上記方法で調製されたＩＬ−２０ＤＮＡ及び合成オリゴ
マーを、実施例２及び第４図に示すように、ｐ２１９か
ら誘導されたシャトルベクター断片に結合して、１）Ｙ
ＡＤＨｆ　Ｉ　Ｌ　−２で表わされるシャトルベクター
を形成した。ｐ２１９シャトルベクターを合成オリゴヌ
クレオチド及びＩＬ−２ＣＤＮＡに結合するために、実
施例２で述べたのと同様に、制限エンドヌクレアーゼ［
ｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを該ベクターに作用させた
。そして、この結果ｐ２１９プラスミドから得られた所
要の大きい方の断片を、２２℃で５時間、０．８％寒天
ゲルで１２５Ｖの電圧下に電気泳動させて分離した。

第４図に示すように、合成りＮＡオリゴマー、ＩＬ−２
０ＤＮＡ断片、及び所要のｐ２１９ベクター断片を、ｉ
ｏｏｎｇのｐ２１９プラスミド断片（１：ｃ。

ＲＩ　−Ｈｉｎｄ　Ｉ’ＩＩ）　、４０ｎｇのＩＬ−２
０ＤＮＡ断片（凹凸末端−Ｈｌｎｄ　ＩＩＩ）　、５ｎ
ｏの合成オリゴメクレオチド（ＥｃｏＲＩ−凹凸末端）
、１中位のＴ４ＤＮＡリガーゼ、２μ１７）１０ｘＴ４
１Ｊカ−セ緩衝液、及び水を加えて２０μｅの反応容積
とした反応混合液内で一緒に結合した。Ｔ４リガーゼ緩
衝液は、０．１ＭトリスＭ衝液（ｐＨ７，４＞、０．１
Ｍ　　ＭＱＣＱ２．０．１Ｍジチオトレイトール、１１
０ｌ１１スペルミジン、１ｏ　ＩＩＩＭＡＴＰ、　１ｕ
ｏ／　ｒａＱＢＳＡからなる。上記反応は１５℃で１５
時間、培養することにより行なった。

得られた組換えベクターｐｙＡｏｔ−＋ｒ　Ｉ　Ｌ　−
２を、３ｏｌｉｖａｒ　ｅｔ　ａｔ、　　（前掲）及び
ｐｅａｃＯｃｋ　ｅｔａｔ、“３１ｏｃｈｅＩ１１．　
Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、　Ａ　ｃａｔ、”　　６５５，２４
３（１９８１）に記載された常法による形質転換法を用
いて［：、ｃｏｌｉ菌株ＲＲ１に入れてこれを形質転換
した。宿主細胞を培養してｐＹＡＤＨｆ　Ｉ　Ｌ　−２
プラスミドを増殖し、この増殖プラスミドを、例えば、
Ｍａｎｉａｔｕｓ　ｅｔ　ａｔ、　（前掲の３６８頁）
及びｌ５ｈ−１−１ｏ１−１ｏｒｏ　ａｎｄ　（３ｕｒ
ｋｅ、　　“Ｎ　ｕｃｌ、Ａ　ｃｉｄｓ　　Ｒｅ　ｓ　
、　＋＋ユ、２９８９　　（１９８１）に記載されてい
る常法のアルカリ法を用いて宿主菌から採取した。Ｍ　
ａｎｉａｔｅｌｓ　ｅｔ　ａｌ、　（前掲の９３頁）に
記載されている塩化セシウム−臭化エチジウム密度勾配
遠心法により、上記プラスミドＤＮＡを精製した。ｌ、
ｃｏｉｌから増殖プラスミドＤＮＡを抽出及び濃縮する
他の方法も、本発明の趣旨及び範囲から逸脱しない限り
用いることができる。

上記方法で作製増殖したｐＹＡＤ）−１ｆ　ｒ　Ｌ　−
２プラスミドを用いて次に常法によりサツカロミセを形
質転換した。形質転換に先立ち、２０Ｂ　−１２菌株を
ＹＰ−グルコース培地（２００１１ｔ）で培養して約２
Ｘ１０７細胞／　ＩＩＱに増殖した。２２℃において１
１０００Ｘで５分間遠心処理して細胞を採取し、得られ
たベレットを殺菌した蒸溜水で洗浄した。

この酵母細胞を、２０ａ＋ｌ！のＳＥＤに再懸濁させ３
０℃で１０分間培養して濃縮した。細胞／！１衝液の混
合物を次に３００ｘ　ｇで５分間遠心処理した。得られ
たベレットを２０ｓＱの１Ｍソルビトールで一度洗浄し
、細胞を２０ＦｎＱのＳＣＥに再懸濁した。

細胞壁を破壊するために、０．２ＩＩＩＱのグルスラー
ゼを溶液に添加し、時々静かに振とうしながら３０℃で
３０分間培養した。１０ＩｌＩＱの酵母細胞を顕微鏡ス
ライド上の５％（重量／容積）ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）の１滴中に希釈し、４００ｘ位相コントラス
トにおける゛′ゴースト″を観察することによってスフ
ェロプラストの存在を検出した。

次いで細胞混合物を３分間、３００ｘ　ｇで遠心処理し
た。得られたベレットを２０ｓＱの１Ｍソルビトールで
２回洗浄し、細胞ベレットを再度ＳＴＣで洗浄した。

次いでこの酵母スフェロプラストを実施例２で用いた方
法を用い、既に調製した上記プラスミドベクターで形質
転換した。実施例２で詳述したように、得られた形質転
換酵母細胞をＴｒｐマイナス培地でプレート培養し、形
質転換体、すなわちＴｒｐ１遺伝子を含むもののみ生き
残るようにした。

形質転換された酵母細胞による１ｍ−２活性の発現を、
米国特許第４，４０１，７５６号に詳述された生物学的
活性分析によりモニターした。

実施例９ のジパノ々　ノ　゛　　べ　　゛の　　　ム」 実施例３で用いた固相化学合成法を利用して下記構造を
有する第２のシバルミチル誘導標識ペプチドを調製した
。

Ｈ２Ｎ　−Ａｌａ−５ｅｒ−Ｉ　ｌｅ−５ｅｒ−Ｇｌｙ
−Ａｒ（Ｊ−ＡＳＤ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ−Ａｒａ−Ｌｙｓ
−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−上記鎖のうち、最初の１４個のアミ
ノ酸は第３図に示す合成オリゴマーにより］−ドされた
ペプチドＩＰ−３の抗原性部分に対応している。最後の
アミノ酸残基であるＧ　Ｉｙ−Ｌ　ｙｓ−Ｌ　ｙｓ−Ｇ
　ｌｙは、２個のＬＶＳにそのε−アミノ基に実施例３
で述べた方法を用いてパルミチン酸を結合させた疎水性
部分を有している。

実施例３で詳述した弗化水素を利用する方法により樹脂
から合成ペプチドを分裂させた後、該ペプチドを９５％
酢酸、５％水で３ｉｏ−Ｇθ１ｐ１０（３１０ｒａｄ　
Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｌｅｓ　）を用いてゲル濾過する
ことにより部分的に精製した。カラムから溶出したトリ
ニトロベンゼン硫酸（ＴＮＢＳ）反応性のペプチド物質
を集めて凍結真空乾燥した。得られた白色粉末形状のペ
プチドを、ペプチドの抗原性部分に対する抗体を生じさ
せてマウスを免疫化し、またＥＬＩＳＡ分析でプレート
塗布するのに用いるために食塩水に懸濁した。

ＢＡＬＢ／ｃマウスに、例えば上記実施例９で得られる
シバルミチル誘導標識ペプチド２５μｇを１４日間毎日
皮下注射して免疫処置した。免疫処置に先立ち、二度蒸
留した殺菌水１１１ＩＱ及びフロイント完全アジエバン
ト（Ｄ　１ｆｃｏ　　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　。

ミシガン州デトロイト）１１１１Ｑ中に標識ペプチド２
５０μｇを混合したエマルジョンとして上記標識ペプチ
ドを調製した。

２回目の免疫処置及びこれに続く免疫処置の後に、マウ
スから血清を採取し、これを前述したＥＬＩＳＡ分析を
用いて抗標識ペプチド抗体反応をテストした。標識ペプ
チドに対して充分な抗体の血清量（１：２５００以上）
が生成されたら皮下注射を終了してこのマウスを処分し
、牌繊を摘出した。

この牌臓から単一細胞懸濁液を調製し、この牌臓細胞を
、実施例４で述べたように、ＮＳ［ネズミ骨髄腫細胞と
融合させた。７〜１０日間培養した後、成熟ハイブリッ
ト細胞を含有する上澄を前述したＥＬＩＳＡ分析により
テストし、抗標識ペプチド抗体の存在をチェックした。

前述したＥＬＩＳＡ分析を変更して、この場合は、希釈
標識ペプチド（ＰＢＳ中ニＩｓ識へ７チト５　ｕＱ　／
　ｗ＋Ｑ　）　５０ｕ　（１をそり曲ったマイクロタイ
タープレートの凹部に入れた。また、ヤギの抗マウスＩ
ＧＧ抗体をＰａＳ中にｌ　：　　７００希釈したものの
代りに、１：　　５００希釈したものを使用した。さら
に、基質溶液（ｐＨ９，０、０，２ＭＮ３２　ＧＯ３、
０，３ＭＮａ　ＨＣＯ３、１０−３ＭＭ０　ＣＱ　２中
にフォスファターゼ基質１１１１（＋／　ＩＲＱ）”Ｉ
Ｏ，９ｍ９．の代りに、これを５０ＩＩ１１！各凹部に
添加した。プレートに塗布されている標識ペプチドに結
合した抗体量を、マルチスキャンＥＬＩＳＡ７Ｌ／−ト
１．Ｊ−’ｔ　−（Ｔｉｔｅｒｔｅｋ　、　Ｆｌｏｗ　
Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ製）で４０５ｎｌ１１の吸収率を
測定することによって定量した。

上記方法により、６Ａ５−ＩＨ７細胞系列は第。

２の標識ペプチドに対する最適な親和力を有する抗体を
産生ずることが判明し、これにより、抗体に結合させた
第２の標識ペプチドの抗原部分を、標識ペプチドに付加
したタンパク質分子の活性を何ら損うことなく抗体から
分離させることができた。

この細胞系列のサンプルは受託第１−１３８７３１号で
ＡＴＣＣに寄託されている。

実施例１１ 第２のモノクローナル　　　ペプチζ抗　を産生実施例
１０で分離した抗標識ペプチド抗体６Ａ５−１Ｈ７を、
ＢＡＬＢ／Ｃマウスへの各皮下注射を３Ｘ１０６ハイブ
リドーマ細胞用いたことを除いて実施例５で詳ｊホした
のと同様の方法で腹膜内処置して生体内で高濃度に生成
させた。

上記実施例１１で調製したモノクローナル抗体６Ａ５−
ＩＨ７をプロティンＡ−セファロ−□ス”を用いた親和
力クロマトグラフィーにより精製した。

親和力クロマトグラフィーにおいては、モノクロ外。

一ナル抗体を含有する腹水液を、予め０．１Ｍへペス緩
衝液（１）Ｈ７，４）で平衡化させであるプロティンＡ
−セファロースカラム（２Ｉｌ１１りに注いだ。

流して未結合の抗体を除去した。そして、プロアインＡ
に結合したモノクローナル抗体を０．１Ｍクエン酸塩緩
衝液（ｐＨ３，５）で溶出させた。

次いで、実施例６と同様に、０．１Ｍへベス緩衝液（１
）８７．５）中の精製抗体をＡＨｉ　Ｇｅｌ　　１０（
３１ｏｒａｄ　ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）と結合
した。次に、例えば実施例８で得た標識ペプチド／タン
パク質分子ハイブリッドをこのカラムに４℃、１　ｍｌ
／１ｎの割合で加えた。未結合タンパク質を除去するた
めにカラムをＰＢＳで洗浄した。結合したタンパク質を
０．１Ｍグリシン（ｐＨ３，０）を用いてカラムから溶
出させた。それから、標識ペプチドを、前記実施例７と
同様にウシ粘勝エンテロキナーゼを用いて成熟タンパク
質生成物から分裂させ、純粋な成熟タンパク質生成物を
得た。

本発明に関連する当業者には明らかなように、本発明は
本発明の趣旨または重要な特徴から逸脱することなく以
上に開示した具体例とは異なる態様で実施することがで
きる。従って、上に述べた具体的実施例はあくまでも説
明のための例であり本発明を制約するものではない。本
発明の範囲は以上に挙げた例Ｉ′ニー制限されず・頭書
０特許ｇｌ求の　　　、：５：；− 範囲で限定される。　　　　　　　　　　　　　　　　
、・・。

１Ｘオー

【図面の簡単な説明】

・係団 第１図はプラスミドｐ　Ｉ　ｍａｒ　００１の調製にお
番プる構成を示す略図、第２図はプラスミドｌｌＩｍＶ
ｆ１００の調製における構成を示す略図、第３図は標識
ペプチドＩＰ−３をコードするオリゴヌクレオチドの構
造を示す図、第４図はプラスミドｐＹＡＤＨｆｌＬ−２
の調製における構成を示す略図である。 特許出願人　イミ］ネツクス　コーポレイション・ｔ′
４

Claims (18)

【特許請求の範囲】
1. （１）Ｎ末端抗原性部分と、該抗原性部分に結合された
   第２部分とから成り、該抗原性部分が、モノクローナル
   抗体が産生されている、自然発生タンパク質及び／また
   は合成タンパク質の抗原性部分に対応するアミノ酸配列
   から成り、該第２部分が配列特異性のタンパク質分解剤
   によって特定アミノ酸残基において分裂可能であること
   を特徴とする標識ペプチド。
2. （２）前記第２部分が該標識ペプチドを用いて精製され
   るタンパク質分子に結合可能である特許請求の範囲第（
   １）項に記載の標識ペプチド。
3. （３）前記抗原性部分がさらに、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇｌ
   ｕ、Ｌｙｓから成る群の少なくとも１種の親水性アミノ
   酸と、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐから成る群の少
   なくとも１種の芳香族アミノ酸と、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｓ
   ｅｒから成る群の少なくとも１種またはそれ以上の実質
   的に親水性の自然アミノ酸とから選択されるアミノ酸の
   １個または複数を含んでいる特許請求の範囲第（１）項
   または第（２）項に記載の標識ペプチド。
4. （４）前記第２部分がアミノ酸配列 Ｘ＿ｌ＿〜＿ｎ−Ｒ （ただし、ＲはＬｙｓ、Ａｒｇ、ＭｅｔまたはＡｓｎ、
   Ｘ＿ｌ＿〜＿ｎはＲを除く他のアミノ酸配列）から成る
   特許請求の範囲第（１）項乃至第（３）項のいずれかに
   記載の標識ペプチド。
5. （５）抗原性部分に対する抗体を発生させるため動物の
   免疫系に対するペプチド抗原性部分の提供を促進する分
   子及び／または細胞から成る第３部分をも含む特許請求
   の範囲第（１）項乃至第（４）項のいずれかに記載の標
   識ペプチド。
6. （６）前記第２部分と前記第３部分との間にさらに、少
   なくとも１個のアミノ酸から成るスペーサ部分を含む特
   許請求の範囲第（５）項に記載の標識ペプチド。
7. （７）前記スペーサ部分が少なくとも１個の実質的に親
   水性の自然アミノ酸を含む特許請求の範囲第（６）項に
   記載の標識ペプチド。
8. （８）特許請求の範囲第（１）項乃至第（７）項のいず
   れかに記載の標識ペプチドを製造する方法であってａ）
   ペプチドを、該ペプチドの抗原性末端 部及び該ペプチドの分裂可能な第２部分をコードするＤ
   ＮＡ断片から成るクローニングベクターで形質転換させ
   た宿主細胞株によって発現させるか、または ｂ）化学的にペプチドを合成すること により上記標識ペプチドを製造する標識ペプチドの製法
   。
9. （９）動物を特許請求の範囲第（１）項乃至第（７）項
   のいずれかに記載のペプチドで免疫処置して該ペプチド
   の抗原性部分に対する抗体を動物の血清から精製するこ
   とにより製造した抗体であって、ａ）動物を上記ペプチ
   ドで免疫処置し、 ｂ）該ペプチドの抗原性部分に対する抗体 を産生する能力のある動物からの活性化動物細胞を骨髄
   腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を形成し、 ｃ）該ハイブリドーマ細胞を培養し、 ｄ）該ハイブリドーマ細胞により産生され た、ペプチドの抗原付部分に対する抗体を採取する、 ことにより製造した上記ペプチドの抗原性部分に対する
   抗体。
10. （１０）特許請求の範囲第（１）項乃至第（７）項のい
    ずれかに記載のペプチドの抗原性部分に対する抗体を産
    生することのできるハイブリッド細胞であって、ａ）上
    記ペプチドで動物に免疫処置を施し、ｂ）活性化した動
    物細胞を免疫処置によっ て骨髄腫細胞と融合させる、 ことによって形成されるハイブリッド細胞。
11. （１１）形質転換した宿主細胞中に異種構造ポリペプチ
    ドを発現させることのできるＤＮＡ発現ベクターであっ
    て、上記ポリペプチドが構成ポリペプチド及びこれに結
    合した標識ペプチドから成り、該標識ペプチドが特許請
    求の範囲第（１）項乃至第（７）項のいずれかにより特
    徴づけられるＤＮＡ発現ベクター。
12. （１２）タンパク質分子の製法において、 ａ）タンパク質分子、及び該タンパク貿と結合する抗原
    性部分を有する標識ペプチドから成るハイブリッド・ポ
    リペプチドであって、上記抗原性部分が、モノクローナ
    ル抗体が産生されている自然発生タンパク質及び／また
    は合成ペプチドの抗原性部分に対応するアミノ酸配列か
    ら成るものであるハイブリッド・ポリペプチドを形質転
    換宿主細胞中に発現させることのできるＤＮＡ発現ベク
    ターを形成し、 ｂ）該発現ベクターで宿主細胞を形質転換し、ｃ）形質
    転換した該細胞から上記ポリペプチドを採取し、採取し
    たポリペプチドを標識ペプチドのリガンド親和性を利用
    して精製することによって上記タンパク質を単離する、 段階から成るタンパク質分子の製法。
13. （１３）ＤＮＡ発現ベクターを形成する段階が、形質転
    換した宿主細胞中に、前記抗原性部分と前記のタンパク
    質の間に介在するプロテアーゼ分裂または化学分裂可能
    な結合部分をも含む標識ペプチドから成るハイブリッド
    ・ポリペプチドを発現させることのできるＤＮＡ発現ベ
    クターの形成を含む特許請求の範囲第（１２）項に記載
    の製法。
14. （１４）前記標識ペプチドの結合部分が前記タンパク質
    分子中に存在しないアミノ酸配列を含む特許請求の範囲
    第（１３）項に記載の製法。
15. （１５）前記タンパク質をその標識ペプチドから分裂さ
    せる段階をも含む特許請求の範囲第（１３）項または第
    （１４）項に記載の製法。
16. （１６）前記抗原性部分がさらに、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｇ
    ｌｕ、Ｌｙｓから成る群の少なくとも１種の親水性アミ
    ノ酸と、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐから成る群の
    少なくとも１種の芳香族アミノ酸と、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、
    Ｓｅｒから成る群の少なくとも１種またはそれ以上の親
    水性の自然アミノ酸とから選択されるアミノ酸の１個ま
    たは複数とを含んでいる特許請求の範囲第（１２）項乃
    至第（１５）項のいずれかに記載の製法。
17. （１７）動物を特許請求の範囲第（１）項乃至第（７）
    項のいずれかに記載のペプチドで免疫処置して該ペプチ
    ドの抗原性部分に対する抗体を動物の血清から精製する
    ことにより製造した抗体であって、ａ）動物を上記ペプ
    チドで免疫処置し、 ｂ）該ペプチドの抗原性部分に対する抗体を産生する能
    力のある動物からの活性化動物細胞を骨髄腫細胞と融合
    してハイブリドーマ細胞を形成し、 ｃ）該ハイブリドーマ細胞を培養し、 ｄ）該ハイブリドーマ細胞により産生された、ペプチド
    の抗原性部分に対する抗体を採取する、上記ペプチドの
    抗原性部分に対する抗体の製法。
18. （１８）前記標識ペプチドをコードするＤＮＡ断片を化
    学的に合成し、該合成ＤＮＡ断片を構成ポリペプチドを
    コードする遺伝子と結合させ、得られた複合ＤＮＡ断片
    をＤＮＡ発現ベクターに組込むことを含む特許請求の範
    囲第（１１）項に記載のＤＮＡ発現ベクターの製法。