ES2755104T3 - Inhibidores peptídicos y peptidomiméticos - Google Patents

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Kristopher Josephson
Paul Anderson
Michelle Arata
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Nathan Nims
Eberhard Schneider
Gregor Schurmann
Peter Wagner
Douglas Treco
Hong Zheng
Daniel Elbaum
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Abstract

Inhibidor peptídico o peptidomimético de calicreína plasmática, en el que dicho inhibidor peptídico o peptidomimético tiene actividad inhibidora de calicreína con una CI50 de menos de 100 nM y comprende la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 4-6, 8-10, 12-14, 18-20, 23-25, 30, 36, 39, 41, 46, 47, 50-52, 55-58, 61, 64, 65, 67, 68, 72, 73, 75-79, 82, 85, 89, 91, 93-95, 97-100, 102, 148, 150, 155, 164, 165, 167-170, 176- 178, 180-182, 184, 188-191, 196, 197, 199, 201, 202, 216 y 218.

Description

DESCRIPCIÓN
Inhibidores peptídicos y peptidomiméticos
Campo de la invención
La presente invención se refiere a péptidos. Se proporcionan específicamente péptidos y peptidomiméticos, ya sean cíclicos o lineales, que tienen características mejoradas y beneficiosas como compuestos terapéuticos.
Antecedentes de la invención
La calicreína plasmática (EC.3.4.21.34) es una serina proteasa que se sintetiza normalmente en el hígado y circula en el plasma al unirse al quininógeno de alto peso molecular (HMWK) o como precalicreína, un precursor inactivo (zimógeno) de la calicreína. Se activa mediante escisión proteolítica por el factor XIIa y contiene una actividad endopeptidasa para escindir enlaces peptídicos después de residuos de Arg o Lys.
La calicreína plasmática desempeña un papel importante en una variedad de procesos fisiológicos incluyendo, pero sin limitarse a, la regulación de la tensión arterial, la ruta de activación por contacto de la coagulación sanguínea, la fibrinólisis, la inflamación y el dolor.
El principal regulador fisiológico de la calicreína es el inhibidor de esterasa C1, o INH C1. El INH C1 es un potente inhibidor del factor XIIa y, en condiciones normales, la inhibición del factor XIIa impide la conversión de precalicreína en calicreína y la posterior generación de bradiquinina a partir de HMWK por calicreína activada. Cabe destacar que los pacientes con mutaciones que reducen la actividad de INH C1 tienen una actividad de calicreína plasmática inadecuadamente alta que conduce a niveles elevados de bradiquinina, un potente vasodilatador y mediador del dolor. Por tanto, la deficiencia de INH C1 heredada es la causa del angioedema hereditario (AEH), un estado debilitante y potencialmente mortal caracterizado por intensa hinchazón, edema y dolor.
La bradiquinina se degrada normalmente por la enzima convertidora de angiotensina (ECA), y los pacientes tratados con inhibidores de la ECA para la reducción de la tensión arterial pueden mostrar niveles elevados de bradiquinina y padecer un síndrome denominado angioedema adquirido.
Si bien el AEH puede controlarse eficazmente mediante la administración de INH C1 purificado o recombinante, se ha demostrado que tanto los inhibidores de calicreína plasmática como los antagonistas de los receptores de bradiquinina también son eficaces en el tratamiento de AEH.
Los niveles elevados de bradiquinina también se asocian con dolor, inflamación, reclutamiento de neutrófilos, hipotensión y choque séptico. Además, la inhibición del sistema calicreína-bradiquinina puede ser útil en una variedad de situaciones clínicas incluyendo, pero sin limitarse a, edemas (incluyendo edema macular diabético, edema cerebral y edema inducido por radiación), retinopatía diabética, oclusión venosa retiniana, hemorragia intracerebral, accidente cerebrovascular, lupus sistémico, rinitis alérgica, control de escapes vasculares y pérdida de sangre durante la cirugía, coagulación intravascular diseminada, enfermedad inflamatoria del intestino, inflamación que resulta de circulación extracorporal, lesión por isquemia-reperfusión y artritis inflamatoria o reumatoide.
Dadas los múltiples papeles que desempeña la calicreína, sigue existiendo la necesidad de inhibidores de calicreína que tengan propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas adecuadas para la aplicación terapéutica. Las propiedades incluyen, pero no se limitan a, alta potencia, alta especificidad por la calicreína plasmática en comparación con la proteasa relacionada, estabilidad química y física, facilidad de formulación, estabilidad metabólica, farmacocinética apropiada, baja toxicidad y buena absorción desde el tubo digestivo (es decir, biodisponibilidad oral). Heinis et al., 2009. Nat Chem Biol, 5(7):502-7 divulgan una estrategia de fagos para la selección de ligandos basada en péptidos bicíclicos o lineales unidos covalentemente a un núcleo orgánico.
Baeriswyl et al., 2012. ChemMedChem. 7(7):1173-6 divulgan péptidos bicíclicos con actividades inhibidoras bajas a subnanomolares hacia la serina proteasa, calicreína plasmática.
Lehmann, 2008. Expert Opin Biol Ther. 8(8):1187-99 proporciona una opinión experta sobre escalantida (DX-88), un inhibidor de calicreína plasmática.
Baeriswyl & Heinis, 2012. Protein Eng Des Sel. 26(1):81-9 divulgan experimentos en los que una biblioteca de fagos de péptidos bicíclicos pequeños se expuso a un extracto pancreático de proteasas antes de la selección por afinidad para enriquecer agentes de unión con mayor estabilidad en el entorno intestinal.
El documento WO 2013/050615 A1 se refiere a polipéptidos que se complejan con andamiajes moleculares de modo que se establecen dos o más bucles peptídicos entre puntos de unión al andamiaje.
El documento WO 2004/077062 A1 divulga un método para proporcionar un compuesto que se compone de al menos una molécula unida mediante al menos dos uniones a un andamiaje molecular.
El documento US 6.720.472 B2 se refiere a genes y proteínas HMGI y a métodos de uso de los mismos.
El documento US 2008/313749 A1 proporciona medios y métodos para producir compuestos adecuados para someter a prueba la presencia y/o identificación de un compuesto inmunogénico y/o un compuesto de unión de interés.
El documento US 5.436.138 A divulga un método para proporcionar la coexpresión de N-miristoiltransferasa y un sustrato proteico para dicha N-miristoiltransferasa en E. coli.
Ripka et al., 1998. Bioorg Med Chem Lett. 8(4):357-60 divulgan la síntesis de bishomoalilglicina y su uso para formar inhibidores de tripéptidos cíclicos P3-P1 a través de un método de metátesis de olefinas de Grubbs.
Zuraw, 2008. N Engl. J Med. 359(10):1027-36 describen el angioedema hereditario.
El documento US 2012/101253 A1 se refiere a un ligando peptídico que comprende un polipéptido unido a un andamiaje molecular en dos o más puntos de unión.
El documento US 2010/183625 A1 proporciona métodos, kits y composiciones que incluyen un inhibidor de calicreína aislado para el tratamiento de la mucositis.
El documento US 2011/172126 A1 se refiere a conjugados peptídicos que incluyen al menos un inductor de giros en el que el inductor de giros comprende un anillo heterocíclico que contiene nitrógeno saturado o insaturado de 5-7 miembros y a métodos para producir los péptidos.
El documento US 2011/092437 A1 se refiere a depsipéptidos cíclicos y a sus usos como inhibidores de calicreína 7.
El documento US 2003/233675 A1 proporciona constructos recombinantes y métodos útiles para la mejora de plantas.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona un inhibidor peptídico o peptidomimético de calicreína plasmática, en el que dicho inhibidor peptídico o peptidomimético tiene actividad inhibidora de calicreína con una CI50 de menos de 100 nM y comprende la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 4-6, 8-10, 12-14, 18-20, 23-25, 30, 36, 39, 41, 46, 47, 50-52, 55-58, 61, 64, 65, 67, 68, 72, 73, 75-79, 82, 85, 89, 91, 93-95, 97-100, 102, 148, 150, 155, 164, 165, 167-170, 176­ 178, 180-182, 184, 188-191, 196, 197, 199, 201, 202, 216 y 218.
Además, la presente invención proporciona un inhibidor de calicreína plasmática según la presente invención para su uso en un método para el tratamiento o la prevención de padecer angioedema hereditario en un sujeto que lo necesita, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho inhibidor.
La presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido o peptidomimético según la presente invención y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
Se definen aspectos adicionales de la invención en las reivindicaciones. La divulgación en la siguiente descripción proporciona tanto información relacionada con el contenido cubierto por la definición de las reivindicaciones como información adicional relacionada con contenido que no está cubierto por las reivindicaciones. En la siguiente divulgación, en la que se hace referencia a realizaciones, tales realizaciones deben entenderse como realizaciones de la divulgación en general, mientras que el alcance de la invención se define en las reivindicaciones. La descripción de cualquier contenido no cubierto por las reclamaciones se proporciona sólo a título informativo.
En algunas realizaciones, la presente divulgación describe un péptido o peptidomimético de fórmula R1-Xaa0-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-R2, en la que: R1 se selecciona del grupo que consiste en H, grupos acilo que contienen una cadena hidrocarbonada saturada o insaturada, lineal o ramificada de 1 a 20 átomos de carbono, amidas, carbamatos, ureas, PEG, hidroxialquilalmidón, polipéptidos o proteínas; Xaa0 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, norvalina, Ala, Gly, Ser, Val, terc-butilglicina, Leu, fenilglicina, Ile, Pro, Trp, 7-azatriptófano, Phe, 4-fluorofenilalanina, Thr, Tyr, Val, Lys, N-metil-metionina, N-metilvalina, N-metil-alanina, sarcosina, N-metil-terc-butilglicina, N-metil-leucina, N-metil-fenilglicina, N-metil-isoleucina, N-metil-triptófano, N-metil-7-azatriptófano, N-metil-fenilalanina, N-metil-4-fluorofenilalanina, N-metil-treonina, N-metiltirosina, N-metil-valina y N-metil-lisina; Xaa1 se selecciona del grupo que consiste en Cys, penicilamina, des-amino-Cys, D-Cys, homocisteína y Tyr; Xaa2 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, D-Ala, N-metil-alanina, Glu, N-metil-glutamato, D-Glu, Gly, sarcosina, norleucina, Lys, D-Lys, Asn, D-Asn, D-Glu, Arg, D-Arg, Phe, D-Phe, N-metil-fenilalanina, Gln, D-Gln, Asp, D-Asp, Ser, D-Ser, N-metil-serina, Thr, D-Thr, N-metiltreonina, Pro, D-Pro, Leu, D-Leu, N-metil-leucina, Ile, D-Ile, N-metil-isoleucina, Val, D-Val, N-metil-valina, tercbutilglicina, D-terc-butilglicina, N-metil-terc-butilglicina, Trp, D-Trp, N-metil-triptófano, Tyr, D-Tyr, N-metil-tirosina, ácido 1- aminociclopropanocarboxílico, ácido l-aminociclobutanocarboxílico, ácido l-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclohexanocarboxílico, ácido 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-carboxflico, ácido aminoisobutírico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico, Glu, Gly, N-metil-glutamato, ácido 2-aminopentanoico, ácido 2-aminohexanoico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminooctanoico, ácido 2-aminononanoico, 2-aminodecanoico, ácido 2-aminoundecanoico, ácido 2-aminododecanoico, octilglicina, ácido tranexámico, ácido aminovalérico y ácido 2-(2-aminoetoxi)acético; Xaa3 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, N-metilalanina, Gly, sarcosina, Ser, N-metil-serina, Pro, Thr, N-metil-treonina, Val, N-metil-valina, Ile, N-metil-isoleucina, Phe, N-metil-fenilalanina, 4-fluorofenilalanina, N-metil-4-fluorofenilalanina, N-metil-norleucina, ácido pipecólico y 2-carboxiazetidina; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Phe, Ile, N-metil-isoleucina, Asn, Val, ciclopentilglicina, ciclohexilglicina, ciclopropilglicina, fenilglicina, D-fenilglicina, terc-butilglicina, hexafluoroleucina, 3-fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3-fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metil-fenilglicina, 4-etil-fenilglicina y 4-isopropil-fenilglicina; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Cys, D-Cys, homocisteína y penicilamina; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, ^-ra-metil-arginina, Lys, homolisina, ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2- amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propanoico, 7-azatriptófano, ácido (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[cf]oxazol-5-il)butanoico, un compuesto de fórmula I;
Figure imgf000004_0001
en la que n = 1 ó 2; Ri es un hidrógeno, un grupo protector de hidroxilo o de amina, por
ejemplo alcoxicarbonilo Ci-6, y un compuesto de fórmula II;
Figure imgf000004_0002
grupo metilo y R2 es un hidrógeno o un
grupo protector de amina, por ejemplo alcoxicarbonilo C1-6;
Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Ile, N-metilisoleucina, ciclohexilglicina, ciclopentilglicina, Glu, Phe, Val, N-metil-valina, terc-butilglicina, hexafluoroleucina, 3-fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3-fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-tercleucinol, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina y (S)-N,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amina; Xaa8 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Asn, Pro, Sar, N-metil-alanina y N-metil-leucina; Xaa9 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Cys, D-Cys, penicilamina, Phe, 4-clorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, Tyr, Pro, Arg, ^-ra-metilarginina, Lys, homolisina, ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propanoico, 7-azatriptófano, ácido (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, un compuesto de fórmula I en el que n = 1 ó 2; R1 es un hidrógeno, un grupo protector de hidroxilo o de amina, por ejemplo alcoxicarbonilo C1-6, un compuesto de fórmula II en el que n = 1 ó 2, R1 es un hidrógeno o un grupo metilo y R2 es un hidrógeno o un grupo protector de amina, por ejemplo alcoxicarbonilo C1-6; Xaa10 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Phe, 4-clorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, Tyr, Cys, D-Cys, penicilamina; Xaa11 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Cys, D-Cys, homocisteína, penicilamina; Xaa12 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Glu, Cys, D-Cys, penicilamina; y R2 está ausente o se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -N(CH3)2, -N-piperidina, -N-pirrolidina, -N,N’-alquilpiperazina.
En algunas realizaciones, la presente divulgación describe un péptido o peptidomimético de fórmula R1-Xaa0-Xaa1-Xaa2-Xaa3-Xaa4-Xaa5-Xaa6-Xaa7-Xaa8-Xaa9-Xaa10-Xaa11-Xaa12-R2, en la que: R1 se selecciona del grupo que consiste en H, grupos acilo que contienen una cadena hidrocarbonada saturada o insaturada, lineal o ramificada de 1 a 20 átomos de carbono, amidas, carbamatos, ureas, PEG, hidroxialquilalmidón, polipéptidos o proteínas; Xaa0 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, norvalina, Ala, Gly, Ser, Val, terc-butilglicina, Leu, fenilglicina, Ile, Pro, Trp, 7-azatriptófano, Phe, 4-fluorofenilalanina, Thr, Tyr, Lys y los derivados N-metilados de estos aminoácidos; Xaa1 se selecciona del grupo que consiste en Cys, penicilamina, des-amino-Cys, D-Cys y homocisteína; Xaa2 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, D-Ala, N-metilalanina, Glu, N-metil-glutamato, D-Glu, Gly, sarcosina, norleucina, Lys, D-Lys, Asn, D-Asn, D-Glu, Arg, D-Arg, Phe, D-Phe, N-metil-fenilalanina, Gln, D-Gln, Asp, D-Asp, Ser, D-Ser, N-metil-serina, Thr, D-Thr, N-metil-treonina, Pro, D-Pro, Leu, D-Leu, N-metil-leucina, Ile, D-Ile, N-metil-isoleucina, Val, D-Val, N-metil-valina, terc-butilglicina, D-terc-butilglicina, N-metil-terc-butilglicina, Trp, D-Trp, N-metil-triptófano, Tyr, D-Tyr, N-metil-tirosina, ácido 1-aminociclopropanocarboxílico, ácido 1-aminociclobutanocarboxílico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1aminociclohexanocarboxílico, ácido 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-carboxílico, ácido aminoisobutírico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico, Glu, Gly, N-metil-glutamato, ácido 2-aminopentanoico, ácido 2-aminohexanoico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminooctanoico, ácido 2-aminononanoico, ácido 2-aminodecanoico, ácido 2-aminoundecanoico, ácido 2-aminododecanoico, octilglicina, ácido tranexámico, ácido aminovalérico y ácido 2-(2-aminoetoxi)acético; Xaa3 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, N-metilalanina, Gly, sarcosina, Ser, N-metil-serina, Pro, Thr, N-metil-treonina, Val, N-metil-valina, Ile, N-metil-isoleucina, Phe, N-metil-fenilalanina, 4-fluorofenilalanina, N-metil-4-fluorofenilalanina, N-metil-norleucina, ácido pipecólico y 2-carboxiazetidina; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Phe, Ile, N-metil-isoleucina, Asn, Val, ciclopentilglicina, ciclohexilglicina, ciclopropilglicina, fenilglicina, D-fenilglicina, terc-butilglicina, hexafluoroleucina, 3-fluoro-valina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3-fluoroisoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metil-fenilglicina, 4-etil-fenilglicina y 4-isopropil-fenilglicina; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Cys, D-Cys, homocisteína y penicilamina; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Arg, ^-ra-metil-arginina, Lys, homolisina, ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propanoico, 7-azatriptófano, ácido (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[cf]oxazol-5-il)butanoico, un compuesto de fórmula I;
Figure imgf000005_0001
en la que n = 1 ó 2; Ri es un hidrógeno, un grupo protector de hidroxilo o de amina, por
ejemplo alcoxicarbonilo Ci-6, y un compuesto de fórmula II;
Figure imgf000005_0002
^ en la que n = 1 ó 2, Ri es un hidrógeno o un grupo metilo y R2 es un hidrógeno o un
grupo protector de amina, por ejemplo alcoxicarbonilo C1-6;
Xaa7 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, Ile, N-metil-isoleucina, ciclohexilglicina, ciclopentilglicina, Glu, Phe, Val, N-metil-valina, terc-butilglicina, hexafluoroleucina, 3-fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3-fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-tercleucinol, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina y (S)-N,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amina; Xaa8 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Leu, Asn, Pro, Sar, N-metil-alanina y N-metil-leucina; Xaa9 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Cys, D-Cys, penicilamina, Phe, 4-clorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, Tyr, Pro, Arg, ^-ra-metilarginina, Lys, homolisina, ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propanoico, 7-azatriptófano, ácido (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, un compuesto de fórmula I en el que n = 1 ó 2; Ri es un hidrógeno, un grupo protector de hidroxilo o de amina, por ejemplo alcoxicarbonilo C1-6, un compuesto de fórmula II en el que n = 1 ó 2, R1 es un hidrógeno o un grupo metilo y R2 es un hidrógeno o un grupo protector de amina, por ejemplo alcoxicarbonilo C1-6; Xaa10 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Phe, 4-clorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, Tyr, Cys, D-Cys, penicilamina; Xaa11 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser, Cys, D-Cys, homocisteína, penicilamina; Xaa12 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asp, Glu, Cys, D-Cys, penicilamina; y R2 está ausente o se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -N(CH3)2, -N-piperidina, -N-pirrolidina, -N,N’-alquilpiperazina.
En algunas realizaciones, los péptidos o peptidomiméticos de la presente divulgación se ciclan mediante una reacción de los residuos Xaa1 y Xaa5 con un reactivo. En algunas realizaciones, se ciclan péptidos cíclicos o peptidomiméticos cíclicos con un reactivo seleccionado del grupo que consiste en: 1,2-bis(bromometil)benceno, 1,3-bis(bromometil)benceno, 1,4-bis(bromometil)benceno, 2,6-bis(bromometil)piridina y (£)-1,4-dibromobut-2-eno, 1,2-bis(bromometil)-4-alquilbenceno, en el que el grupo alquilo contiene entre 1 y 22 átomos de carbono. En algunas realizaciones, los péptidos o peptidomiméticos de la presente divulgación se ciclan mediante una reacción de los residuos Xaa1, Xaa5 y o bien Xaa9 o bien Xaa11 o bien Xaa12 con tris(bromometil)benceno.
En algunas realizaciones, los péptidos o peptidomiméticos de la presente divulgación comprenden la secuencia de aminoácidos: R1 Xaa0 Xaa1 Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 R2 en la que: R1 se selecciona del grupo que consiste en H, grupos acilo que contienen una cadena hidrocarbonada saturada o insaturada, lineal o ramificada de 1 a 20 átomos de carbono, amidas, carbamatos, ureas, PEG, hidroxialquilalmidón, polipéptidos o proteínas; Xaa0 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, norvalina, Ala, Gly, Ser, Val, terc-butilglicina, Leu, fenilglicina, Ile, Pro, Trp, 7-azatriptófano, Phe, 4-fluorofenilalanina, Thr, Tyr, Val, Lys, Nmetil-metionina, N-metil-norvalina, N-metil-alanina, sarcosina, N-metil-terc-butilglicina, N-metil-leucina, N-metilfenilglicina, N-metil-isoleucina, N-metil-triptófano, -metil-7-azatriptófano, N-metil-fenilalanina, N-metil-4-fluorofenilalanina, N-metil-treonina, N-metil-tirosina, N-metil-valina y N-metil-lisina; Xaa1 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en sarcosina, Ala, D-Ala, N-metil-alanina, Cys, D-Cys, N-metilcisteína, homocisteína, norvalina, D-norvalina, N-metil-norvalina, Ser, D-Ser, N-metil-serina y penicilamina; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn, N-metil-asparagina, Gln, N-metil-glutamina, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, 4-fluorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, Tyr y Lys; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Phe, N-metil-fenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, Tyr, N-metil-tirosina y Ala; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, N-metil-alanina, Trp, N-metil-triptófano, 7-azatriptófano, 5-fluoro-triptófano, 5-clorotriptófano, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico y ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propanoico; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser, N-metil-serina, Thr, N-metil-treonina y Ala; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N-metil-alanina, sarcosina, N-metil-serina, Pro, N-metil-treonina, N-metil-valina, N-metil-isoleucina, N-metil-leucina, N-metil-fenilalanina, N-metil-4-fluorofenilalanina, N-metil-tirosina, Leu y Ala; Xaa7 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Trp, N-metil-triptófano, 7-azatriptófano, 5-fluorotriptófano, 5-clorotriptófano, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propanoico, 4-fluorofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, Tyr, N-metil-tirosina y Ala; Xaa8 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Thr, N-metil-treonina, terc-butilglicina, Ser, N-metil-serina, Asn, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico y ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico; Xaa9 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, D-Ala, N-metil-alanina, Glu, N-metil-glutamato, D-Glu, Gly, sarcosina, norleucina, Lys, D-Lys, Asn, D-Asn, Arg, D-Arg, Phe, D-Phe, N-metil-fenilalanina, Gln, D-Gln, Asp, D-Asp, Ser, D-Ser, N-metil-serina, Thr, D-Thr, N-metil-treonina, Pro, D-Pro, Leu, D-Leu, N-metil-leucina, Ile, D-Ile, N-metil-isoleucina, Val, D-Val, N-metil-valina, tercbutilglicina, D-terc-butilglicina, N-metil-terc-butilglicina, Trp, D-Trp, N-metil-triptófano, Tyr, D-Tyr, N-metil-tirosina, Cys, D-Cys, N-metilcisteína, penicilamina y homocisteína; Xaa10 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, D-Ala, N-metil-alanina, Glu, N-metil-glutamato, D-Glu, Gly, sarcosina, norleucina, Lys, D-Lys, Asn, D-Asn, Arg, D-Arg, Phe, D-Phe, N-metil-fenilalanina, Gln, D-Gln, Asp, D-Asp, Ser, D-Ser, N-metil-serina, Thr, D-Thr, N-metil-treonina, Pro, D-Pro, Leu, D-Leu, N-metil-leucina, Ile, D-Ile, N-metil-isoleucina, Val, D-Val, N-metil-valina, tercbutilglicina, D-terc-butilglicina, N-metil-terc-butilglicina, Trp, D-Trp, N-metil-triptófano, Tyr, D-Tyr y N-metil-tirosina; Xaa11 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, D-Ala, N-metil-alanina, Glu, N-metil-glutamato, D-Glu, Gly, sarcosina, norleucina, Lys, D-Lys, Asn, D-Asn, Arg, D-Arg, Phe, D-Phe, N-metilfenilalanina, Gln, D-Gln, Asp, D-Asp, Ser, D-Ser, N-metil-serina, Thr, D-Thr, N-metil-treonina, Pro, D-Pro, Leu, D-Leu, N-metil-leucina, Ile, D-Ile, N-metil-isoleucina, Val, D-Val, N-metil-valina, terc-butilglicina, D-terc-butilglicina, N-metilterc-butilglicina, Trp, D-Trp, N-metil-triptófano, Tyr, D-Tyr, N-metil-tirosina, fenilglicina y ciclohexilglicina; Xaa12 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Cys, D-Cys, N-metil-cisteína, homocisteína, penicilamina, Arg y Ala; y R2 está ausente o se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -NR1 (en el que R1 es cualquier grupo alquilo cíclico o cualquier grupo alquilo lineal), PEG, hidroxialquilalmidón, polipéptidos y proteínas.
En algunas realizaciones, los péptidos o peptidomiméticos de la presente divulgación comprenden la secuencia de aminoácidos R1 Xaa0 Cys Xaa2 Xaa3 Xaa4 Xaa5 Xaa6 Xaa7 Xaa8 Xaa9 Xaa10 Xaa11 Xaa12 R2 en la que, R1 se selecciona del grupo que consiste en H, grupos acilo que contienen una cadena hidrocarbonada saturada o insaturada, lineal o ramificada de 1 a 20 átomos de carbono, amidas, carbamatos, ureas, PEG, hidroxialquilalmidón, polipéptidos o proteínas; Xaa0 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Met, norvalina Ala, Gly, Ser, Val, terc-butilglicina, Leu, fenilglicina, Ile, Pro, Trp, 7-azatriptófano, Phe, 4-fluorofenilalanina, Thr, Tyr, Val, Lys, N-metil-metionina, N-metil-norvalina, N-metil-alanina, sarcosina, N-metil-terc-butilglicina, N-metil-leucina, N-metilfenilglicina, N-metil-isoleucina, N-metil-triptófano, N-metil-7-azatriptófano, N-metil-fenilalanina, N-metil-4-fluorofenilalanina, N-metil-treonina, N-metil-tirosina, N-metil-valina y N-metil-lisina; Xaa1 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en sarcosina, Ala, D-Ala, N-metil-alanina, Cys, D-Cys, N-metilcisteína, penicilamina, homocisteína, norvalina, D-norvalina, N-metil-norvalina, Ser, D-Ser y N-metil-serina; Xaa2 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Asn, N-metil-asparagina, Gln, N-metil-glutamina, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, 4-fluorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, Tyr y Lys; Xaa3 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Phe, N-metil-fenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-fluorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, Tyr, N-metil-tirosina y Ala; Xaa4 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, N-metil-alanina, Trp, N-metil-triptófano, 7-azatriptófano, 5-fluoro-triptófano, 5-clorotriptófano, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico y ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propanoico; Xaa5 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ser, N-metil-serina, Thr, N-metil-treonina y Ala; Xaa6 es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en N-metil-alanina, sarcosina, N-metil-serina, Pro, N-metil-treonina, N-metil-valina, N-metil-isoleucina, N-metil-leucina, N-metil-fenilalanina, N-metil-4-fluorofenilalanina, N-metil-tirosina, Leu y Ala; Xaa7 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Trp, N-metil-triptófano, 7-azatriptófano, 5-fluorotriptófano, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propanoico, 4-fluorofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, 5-clorotriptófano, Tyr, N-metil-tirosina y Ala; Xaa8 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo de Cys, D-Cys, N-metil-cisteína, penicilamina, homocisteína, Thr, N-metil-treonina, D-Thr, terc-butilglicina, Ser, Asn, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-N)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico; Xaa9 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, D-Ala, N-metil-alanina, Glu, N-metil-glutamato, D-Glu, Gly, sarcosina, norleucina, Lys, D-Lys, Asn, D-Asn, Arg, D-Arg, Phe, D-Phe, N-metil-fenilalanina, Gln, D-Gln, Asp, D-Asp, Ser, D-Ser, N-metil-serina, Thr, D-Thr, N-metil-treonina, Pro, D-Pro, Leu, D-Leu, N-metil-leucina, Ile, D-Ile, N-metilisoleucina, Val, D-Val, N-metil-valina, terc-butilglicina, D-terc-butilglicina, N-metil-terc-butilglicina, Trp, D-Trp, N-metiltriptófano, Tyr, D-Tyr, N-metil-tirosina, Cys, D-Cys, N-metilcisteína, penicilamina y homocisteína; Xaa10 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, D-Ala, N-metil-alanina, Glu, N-metil-glutamato, D-Glu, Gly, sarcosina, norleucina, Lys, D-Lys, Asn, D-Asn, Arg, D-Arg, Phe, D-Phe, N-metil-fenilalanina, Gln, D-Gln, Asp, D-Asp, Ser, D-Ser, N-metil-serina, Thr, D-Thr, N-metil-treonina, Pro, D-Pro, Leu, D-Leu, N-metil-leucina, Ile, D-Ile, N-metil-isoleucina, Val, D-Val, N-metil-valina, terc-butilglicina, D-terc-butilglicina, N-metil-terc-butilglicina, Trp, D-Trp, N-metil-triptófano, Tyr, D-Tyr y N-metil-tirosina, Cys, D-Cys, N-metilcisteína, penicilamina y homocisteína; Xaa11 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo que consiste en Ala, D-Ala, N-metil-alanina, Glu, N-metilglutamato, D-Glu, Gly, sarcosina, norleucina, Lys, D-Lys, Asn, D-Asn, Arg, D-Arg, Phe, D-Phe, N-metil-fenilalanina, Gln, D-Gln, Asp, D-Asp, Ser, D-Ser, N-metil-serina, Thr, D-Thr, N-metil-treonina, Pro, D-Pro, Leu, D-Leu, N-metilleucina, Ile, D-Ile, N-metil-isoleucina, Val, D-Val, N-metil-valina, terc-butilglicina, D-terc-butilglicina, N-metil-tercbutilglicina, Trp, D-Trp, N-metil-triptófano, Tyr, D-Tyr, N-metil-tirosina, fenilglicina y ciclohexilglicina, Cys, D-Cys, N-metil-cisteína, penicilamina y homocisteína; Xaa12 está ausente o es un aminoácido seleccionado del grupo de Cys, D-Cys, N-metil-cisteína, penicilamina, homocisteína, Arg y Ala; y R2 está ausente o se selecciona del grupo que consiste en -NH2, -NRi (en el que Ri es cualquier grupo alquilo cíclico o cualquier grupo alquilo lineal), PEG, hidroxialquilalmidón, polipéptidos y proteínas.
En una realización, los péptidos y/o peptidomiméticos descritos en el presente documento pueden ser inhibidores de serina proteasa. En una realización, la serina proteasa es calicreína plasmática.
En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos en los que uno de los residuos en las posiciones Xaa8, Xaa9, XaaiO, X a a ii o Xaa12 se selecciona del grupo que consiste en Cys, D-Cys, N-metil-cisteína, penicilamina y homocisteína. En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos en los que el residuo en la posición Xaai se selecciona del grupo que consiste en Cys, D-Cys, N-metil-cisteína, penicilamina y homocisteína. En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos en los que el péptido o peptidomimético se cicla mediante una reacción con un reactivo que reacciona de tiol. En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos en los que el reactivo se selecciona del grupo que consiste en: 1,2-bis(bromometil)benceno, 1,3-bis(bromometil)benceno, 1,4-bis(bromometil)benceno, 2,6-bis(bromometil)piridina, bis(bromometil)bencenos sustituidos y (£)-1,4-dibromobut-2-eno. En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos en los que el reactivo es 1,3-bis(bromometil)benceno.
En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos en los que se forma un bucle entre dos residuos de cisteína. En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos en los que el bucle comprende un resto de formación de puente seleccionado del grupo que consiste en:
Figure imgf000007_0001
En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos que comprenden un bucle cíclico formado según un método que comprende una o más reacciones químicas seleccionadas del grupo que consiste en una reacción de Heck, una reacción de Buchwald y una metátesis de olefinas.
En algunas realizaciones, se proporciona un método para el tratamiento o la prevención de padecer angioedema hereditario en un sujeto que comprende la administración a dicho sujeto que lo necesita de una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más inhibidores de serina proteasa. En algunas realizaciones, dichos métodos se caracterizan porque la serina proteasa es calicreína plasmática y el uno o más inhibidores de serina proteasa son péptidos o peptidomiméticos de la presente divulgación. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos en los que la administración se selecciona del grupo que consiste en oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica e intravítrea. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos en los que el inhibidor de calicreína plasmática se conjuga con un polímero soluble en agua. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos en los que el polímero soluble en agua es un polímero hidrófilo. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos en los que el polímero hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en homopolímeros de poli(óxido de alquileno), polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, y copolímeros de los mismos. En algunas realizaciones, se proporcionan métodos en los que el polímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG).
En algunas realizaciones, la presente divulgación describe una composición farmacéutica que comprende uno o más de los péptidos o peptidomiméticos de la presente divulgación y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable. En algunas realizaciones, la presente divulgación describe un kit para el diagnóstico, pronóstico, la profilaxis o el tratamiento de angioedema hereditario en un mamífero, caracterizado porque dicho kit comprende uno o más inhibidores de calicreína plasmática, opcionalmente con reactivos y/o instrucciones de uso, en el que dichos uno o más inhibidores de calicreína plasmática comprenden; una secuencia de al menos 8 aminoácidos contiguos de cualquiera de los péptidos o peptidomiméticos de la presente divulgación. En algunas realizaciones, se proporcionan kits en los que el uno o más inhibidores de calicreína plasmática comprenden un marcador detectable o pueden unirse a un marcador detectable para formar un complejo detectable.
En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos que tienen actividad inhibidora de calicreína menor de CI50 de 100 nM, CI50 de 50 nM, CI50 de 20 nM, CI50 de 10 nM, CI50 de 5 nM y/o CI50 de 1 nM. En algunas realizaciones, tales péptidos o peptidomiméticos son cíclicos. En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos que tienen una CI50 de menos de 50 nM y/o menos de 10 nM contra la calicreína humana. En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos que tienen una CI50 de menos de 50 nM y/o 12 nM contra calicreína tanto humana como de ratón.
En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos, que comprenden al menos un bucle formado entre dos residuos de cisteína. En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos en los que el al menos un bucle tiene una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6 ó 7 aminoácidos. En algunas realizaciones, se proporcionan péptidos o peptidomiméticos que comprenden la secuencia consenso Cys-(X-iX2X3-)Cys-Arg-Val-R, en la que dos cisteínas se unen entre sí mediante un resto de formación de puente para formar un bucle y -(X1X2X3-) representan una región de cualquier aminoácido natural o no natural independientemente y en la que R representa cero, uno o más aminoácidos. En algunas realizaciones, se proporcionan inhibidores peptídicos o peptidomiméticos de calicreína plasmática, que comprenden una secuencia de al menos 6 aminoácidos contiguos de cualquiera de las secuencias citadas en el presente documento y que tienen al menos un reemplazo de enlace peptídico, siendo dicho al menos un reemplazo de enlace peptídico por un resto no peptídico. En algunas realizaciones, se proporcionan tales inhibidores peptídicos o peptidomiméticos, en los que el resto no peptídico se selecciona del grupo que consiste en tioamida, sulfonamida, sulfonato, fosfonamida, fosfonato fosfotioato, fosfinato, alcano, 1 ó 2-hidroxietileno, dihidroxiletileno, enlace sencillo C-C (alcano), doble enlace CC (alqueno), triple enlace CC (alquino), enlace C-O (metilenoxilo), enlace O-N o N-O, (metilenamino), triazol, hidrazida, urea, cetona, enlace uretano, (di)haloalqueno, metilenmercapto, metilenamino, trifluoroetilamino, hidrazida y amidoxilo.
Descripción detallada
La presente divulgación se refiere al descubrimiento de nuevos péptidos, específicamente péptidos y peptidomiméticos cíclicos que son útiles en el diagnóstico y/o tratamiento de enfermedades en las que es deseable la inhibición de calicreína plasmática.
Tal como se usa en el presente documento, un “mimético” se refiere a una molécula que presenta algunas de las propiedades o características de otra molécula. Un “peptidomimético” (también denominado mimético de péptido) es un mimético en el que la molécula contiene elementos estructurales no peptídicos que son capaces de imitar o antagonizar la(s) acción/acciones biológica(s) de un péptido natural. Un peptidomimético puede tener muchas similitudes con los péptidos naturales, tales como: cadenas laterales de aminoácido que no se encuentran entre los 20 aminoácidos proteinógenos conocidos, grupos de unión no basados en péptidos usados para efectuar la ciclación entre los extremos o partes internas de la molécula, sustituciones del resto de hidrógeno de enlace amida por grupos metilo (N-metilación) u otros grupos alquilo, reemplazo de un enlace peptídico por un enlace o grupo químico que es resistente a tratamientos químicos o enzimáticos, modificaciones N y C-terminales y conjugación con una extensión no peptídica (tal como polietilenglicol, lípidos, hidratos de carbono, nucleósidos, nucleótidos, bases nucleosídicas, diversas moléculas pequeñas, o grupos fosfato o sulfato). Tal como se usa en el presente documento, el término “peptidomimético cíclico” o “polipeptidomimético cíclico” se refiere a un peptidomimético que tiene como parte de su estructura una o más características cíclicas tales como un bucle, un resto de formación de puente y/o una unión interna. Tal como se usa en el presente documento, el término “resto de formación de puente” se refiere a uno o más componentes de un puente formado entre dos aminoácidos adyacentes o no adyacentes en un polipéptido. El resto de formación de puente puede ser de cualquier tamaño o composición. En algunas realizaciones, un resto de formación de puente comprende uno o más enlaces químicos entre dos aminoácidos adyacentes o no adyacentes. En algunas realizaciones, tales enlaces químicos pueden ser entre uno o más grupos funcionales en aminoácidos adyacentes o no adyacentes. En algunas realizaciones, el resto de formación de puente comprende una o más características incluyendo, pero sin limitarse a, enlaces disulfuro, enlaces tioéter y anillos cíclicos. En algunas realizaciones, el resto de formación de puente comprende un enlace disulfuro formado entre dos residuos de cisteína. En algunas realizaciones, el resto de formación de puente comprende uno o más enlaces tioéter. En algunas realizaciones, los restos de formación de puente comprenden restos no basados en proteínas ni en péptidos incluyendo, pero sin limitarse a, anillos cíclicos [incluyendo, pero sin limitarse a, estructuras de anillos aromáticos (por ejemplo, xililos)]. Tales restos de formación de puente pueden introducirse mediante reacción con reactivos que contienen múltiples haluros reactivos, incluyendo, pero sin limitarse a poli(bromometil)bencenos, poli(bromometil)piridinas, poli(bromometil)alquilbencenos y/o (£)-1,4-dibromobut-2-eno. En algunas realizaciones, los restos de formación de puente de la presente divulgación incluyen, pero no se limitan a las siguientes estructuras:
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en las que cada X es independientemente N o CH, de modo que ningún anillo contiene más de 2 N; cada Z es independientemente un enlace, NR, O, S, CH2, C(O)NR, NRC(O), S(O)vNR, NRS(O)v; cada m se selecciona independientemente de 0, 1, 2 y 3; cada v se selecciona independientemente de 1 y 2; cada R se selecciona independientemente de H y Ci-C6; y cada resto de formación de puente se conecta al péptido por espaciadores C0-C6 seleccionados independientemente
A menos que se definan de otro modo, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que entiende comúnmente un experto en la técnica a la que pertenece esta divulgación. Aunque pueden usarse métodos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de los péptidos cíclicos y los métodos presentados en la divulgación, a continuación se describen métodos y materiales adecuados.
Péptidos como fármacos
En virtud de su tamaño y complejidad, los péptidos son capaces de formar numerosos contactos altamente específicos con sus dianas biológicas y pueden mostrar un alto nivel de selectividad por la diana correcta o deseada en comparación con una diana estrechamente relacionada dentro de la misma familia. En el caso de la calicreína plasmática, varias serina proteasas (tales como, pero sin limitarse a, factor XIa, factor XIIa, plasmina y similares) muestran una estrecha similitud con la calicreína plasmática y a menudo las inhiben los mismos inhibidores de molécula pequeña. Aunque una molécula pequeña identificada como un potente inhibidor de calicreína plasmática puede inhibir el factor XIa de manera menos potente, el nivel de inhibición puede ser inadecuado para impedir la inactivación del factorXIa, con efectos no deseados sobre la cascada de coagulación sanguínea normal. Tales “efectos fuera de la diana” o “efectos secundarios” a menudo provocan que medicamentos altamente eficaces no obtengan la aprobación regulatoria debido a preocupaciones de seguridad.
Numerosos péptidos se han desarrollado para dar fármacos eficaces. Estos incluyen, pero no se limitan a, insulina, péptido similar al glucagón 1 (GLP-1), somatostatina, vasopresina, ciclosporina A, y similares. En un caso como la insulina, el péptido terapéutico puede ser idéntico a la molécula que se produce de manera natural (es decir, la que circula en humanos y se considera “de tipo natural” en la población humana). En muchos otros casos, el péptido no es adecuado o es subóptimo para su uso terapéutico debido a una corta semivida en circulación que se debe a menudo a la inestabilidad metabólica en el cuerpo. En estos casos, se usa una forma modificada o una variante del péptido (peptidomimético) que da como resultado un comportamiento farmacocinético y farmacodinámico mejorado. En otros casos, un péptido derivado de una fuente natural tiene un mecanismo de acción equivalente pero un perfil farmacéutico preferido y puede usarse como terapia. Por ejemplo, la exenatida, una versión sintética de la exedina-4, tiene propiedades biológicas similares al péptido similar al glucagón 1 (GLP-1) humano y se ha aprobado por la FDA para el tratamiento de la diabetes mellitus tipo 2. Como otro ejemplo, la calcitonina de salmón, calcitonina extraída de las glándulas ultimobranquiales de salmón, se asemeja a la calcitonina humana pero es más activa que la calcitonina humana y puede usarse para tratar osteoporosis posmenopáusica, hipercalcemia, enfermedad de Paget, metástasis óseas y dolor de miembro amputado.
Los péptidos se limitan normalmente a vías de administración no orales. En casi todos los casos, los péptidos y peptidomiméticos deben administrarse mediante inyección, ya que incluso los péptidos muy cortos (por ejemplo, péptidos con 4-10 residuos de aminoácido) son incapaces o poco capaces de atravesar las membranas celulares que revisten el tubo digestivo. Para una disponibilidad oral eficaz, normalmente es necesario que los fármacos atraviesen las membranas tanto luminal como basolateral de las células epiteliales intestinales para entrar en la circulación sistémica. La escasa permeabilidad de la membrana y la falta de biodisponibilidad oral de los péptidos limita significativamente su uso terapéutico.
La eficacia de un péptido como fármaco puede verse influenciada por su estabilidad proteolítica. Dentro del cuerpo, los péptidos pueden modificarse o degradarse por enzimas, lo que puede limitar su eficacia para interaccionar con una diana deseada. Mantener un nivel dado de un péptido terapéutico dentro del cuerpo o el torrente sanguíneo puede ser difícil debido al flujo de salida. La tasa de flujo de salida de un péptido del cuerpo puede variar y debe monitorizarse cuando se considera la administración de péptidos terapéuticos.
La estabilidad metabólica de los péptidos es importante ya que está relacionada con su flexibilidad global, fluctuaciones intramoleculares, diversos procesos dinámicos internos, así como muchas funciones biológicas. La estabilidad metabólica de los péptidos puede ser crítica en el desarrollo de productos farmacéuticos, puede afectar a parámetros tales como, pero sin limitarse a, aclaramiento, semivida y biodisponibilidad de los fármacos.
En general, las propiedades de los péptidos naturales no son adecuadas generalmente para su uso como agentes terapéuticos para humanos. Es improbable que los inhibidores de calicreína plasmática que se compongan exclusivamente de aminoácidos naturales muestren la estabilidad proteolítica y metabólica necesaria para su uso como agentes terapéuticos para humanos. Sigue existiendo una importante necesidad médica de inhibidores de calicreína plasmática altamente potentes y altamente específicos y formulaciones de inhibidores de calicreína plasmática con propiedades sistemáticas.
Descubrimiento de peptidomiméticos
Pueden identificarse peptidomiméticos mediante una variedad de medios. En algunos casos, se usa un péptido natural o una secuencia que se encuentra en una proteína natural como punto de partida. En estos casos, la secuencia de péptido de partida se ha elegido porque se sabe que interacciona físicamente con una molécula diana deseada. Puede elegirse un péptido natural porque es un agonista o antagonista de un receptor, inhibe una enzima o modula un canal. Puede elegirse una secuencia que se encuentra en una proteína natural porque comprende un dominio que participa en una interacción con otra proteína o alguna otra molécula en un humano o animal. En muchos casos, pueden obtenerse datos estructurales sobre las proteínas que interaccionan de bases de datos públicas (por ejemplo, el Banco de datos de proteínas de RCSB; H.M. Berman, J. Westbrook, Z. Feng, G. Gilliland, T.N. Bhat, H. Weissig, I.N. Shindyalov, P.E. Bourne (2000) The Protein Data Bank Nucleic Acids Research, 28: 235-242) y puede identificarse la región específica de una proteína que interacciona con la diana deseada a partir de datos cristalográficos sobre el complejo proteico. En otros casos, pueden prepararse péptidos correspondientes a diversas partes de una proteína y someterse a prueba para la unión a una diana de interés. Una vez identificadas, se introducen modificaciones químicas para mejorar su estabilidad y potencia, con el peptidomimético resultante que tiene parámetros farmacocinéticos o farmacodinámicos mejorados.
En otros casos, se aísla un péptido mediante uno de varios métodos para aislar secuencias peptídicas de bibliotecas de péptidos basándose en sus afinidades por proteínas diana, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidos o células completas específicos. Tales métodos incluyen presentación en fagos, presentación en ARNm, presentación en ribosomas, presentación en ADN, ensamblaje codificado por ADN y cribado de doble híbrido, así como sus modificaciones (véanse, por ejemplo, Takashashi, T.T et al. (2003) Trends in Biochem. Sci. 28(3):159-165; Kay, B.K. et al. (2001) Methods 24:240-246; He, M y Taussig, M (2002). Briefins in Functional Genomics and Proteomics. 1(2): 204-212; Rothe, A. et al. (2006) The FASEB Journal. 20(10):1599-1610.)
Los polipéptidos pueden adoptar estructuras tridimensionales que son capaces de unirse a otras moléculas biológicas con ciertos grados de afinidad y especificidad. Algunos se unirán con afinidad y especificidad muy altas. Una biblioteca de secuencias polipeptídicas aleatorias estará poblada por moléculas con una amplia variedad de estructuras tridimensionales. Para aislar un polipéptido con una conformación que interaccione con una proteína diana específica, pueden prepararse secuencias individuales de la biblioteca y someterse a prueba o cribarse por su afinidad con la diana. Sin embargo, para bibliotecas muy grandes (> 106 miembros), el cribado de secuencias individuales por la afinidad de unión no es factible. Para superar esta limitación, se han desarrollado varias técnicas para seleccionar nuevos polipéptidos de mezclas complejas extremadamente grandes en virtud de su afinidad de unión a una diana. Dado que se predice que los polipéptidos de unión de alta afinidad están presentes a una frecuencia muy baja dentro de la población, estos métodos de selección se basan en mantener un enlace físico entre el polipéptido y el material genético (generalmente un ácido nucleico tal como ADN o ARN) que codifica para el polipéptido de modo que la selección del polipéptido incluye automáticamente la selección de un ácido nucleico que codifica para el mismo. El ácido nucleico que codifica para el polipéptido seleccionado puede amplificarse y secuenciarse para revelar la secuencia tanto del ácido nucleico como del polipéptido. En un enfoque, presentación en fagos (véanse Cwirla, S.E. et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 87:6378-6382; Dower, W.J. and Cwirla, S.E. patentes estadounidenses n.os 5.427.908 y 5.580.717), cada miembro de polipéptido aleatorio de la biblioteca se presenta en la superficie de una partícula de bacteriófago como parte de una proteína de fusión entre el polipéptido y una de las proteínas de la cubierta de fago. La partícula de fago proporciona el enlace entre el polipéptido y el ADN codificante localizándolos conjuntamente dentro de la misma entidad física, y el ADN codificante puede amplificarse posteriormente infectando bacterias con el fago seleccionado. En otro enfoque, presentación en ribosomas (véanse Kawasaki, G.H. patentes estadounidenses n.os 5.658.754 y 5.643.768), se traduce una mezcla de moléculas de ARN mensajero (ARNm) in vitro de una manera que produce, para cada ARNm en la mezcla, un complejo estabilizado de ribosoma, ARNm y polipéptido recién sintetizado que sobresale del ribosoma. La estabilización del complejo permite que se mantenga unido mientras se criban los polipéptidos para determinar la unión a una diana de interés. Los ARNm que codifican para los polipéptidos seleccionados pueden amplificarse usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), y luego caracterizarse, por ejemplo, mediante secuenciación.
En aún otro enfoque, la presentación en ARNm (véase Szostak, J. W. y Roberts, R.W., patente estadounidense n.° 6.258.558), cada molécula de ARNm en la biblioteca se modifica mediante la adición covalente de un resto similar a la puromicina en su extremo terminal 3'. El resto similar a la puromicina es un análogo del tallo aceptor de aminoacil-ARNt que funciona como aceptor de peptidilo, y puede añadirse a una cadena de polipéptido en crecimiento mediante la actividad peptidil transferasa de un ribosoma que traduce el ARNm. Durante la traducción in vitro, el ARNm y el polipéptido codificado se unen covalentemente a través del resto similar a la puromicina, creando una fusión a RN-polipéptido. Después de seleccionar una molécula de fusión mediante la unión de su componente de polipéptido a una diana, el componente de ARN de la molécula de fusión seleccionada puede amplificarse usando PCR y luego caracterizarse. Se han desarrollado varios otros métodos para producir un enlace físico entre un polipéptido y su ácido nucleico codificante para facilitar la selección y amplificación (véanse Yanagawa, H., Nemoto, N., Miyamoto, E., y Husimi, Y., patente estadounidense n.° 6.361.943; Nemoto, H., Miyamoto-Sato, E., Husimi, H. y Yanagawa, H. (1997). FEBS Lett. 414:405-408; Gold, L., Tuerk, C., Pribnow, D., y Smith, J.D., patentes estadounidenses n.os 5.843.701 y 6.194.550; Williams, R.B., patente estadounidense n.° 6.962.781; Baskerville, S. y Bartel, D.P (2002). Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 99:9154-9159; Baskerville, D.S. y Bartel, D.P., patente estadounidense n.° 6.716.973; Sergeeva, A. et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58:1622-1654).
La presentación en ARNm es un método particularmente útil para crear grandes bibliotecas de péptidos. Por consiguiente, se proporcionan en el presente documento métodos de selección de un polipéptido (o un ARNm que codifica para un polipéptido) que interacciona con la calicreína plasmática. Una biblioteca contendrá generalmente al menos 102 miembros, más preferiblemente al menos 106 miembros, y más preferiblemente al menos 109 miembros (por ejemplo, cualquiera de los complejos ARNm-polipéptido). En algunas realizaciones, la biblioteca incluirá al menos 1012 miembros o al menos 1014 miembros. En general, los miembros diferirán unos de otros; sin embargo, se espera que haya algún grado de redundancia en cualquier biblioteca. La biblioteca puede existir como una mezcla única de todos los miembros, o puede dividirse en varias combinaciones que se mantienen en recipientes o pocillos independientes, cada uno con un subconjunto de la biblioteca, o la biblioteca puede ser una colección de recipientes o pocillos en una placa, conteniendo cada recipiente o pocillo solamente uno o algunos miembros de la biblioteca.
Cada ARNm en la biblioteca comprende preferiblemente una secuencia de iniciación de la traducción, un codón de iniciación y una región codificante de polipéptido variable (por ejemplo, proteína o péptido corto) que se genera, por ejemplo, mediante un ensamblaje aleatorio o semialeatorio de nucleótidos, y varía de un ARNm a otro en la biblioteca (aunque probablemente habrá algún grado de redundancia dentro de la biblioteca). La secuencia de iniciación de la traducción, el codón de iniciación y la región codificante de polipéptido variable pueden estar flanqueados por secuencias fijas conocidas que pueden usarse para la amplificación por PCR del ARNm, por ejemplo, después de la selección. Otras secuencias fijas que pueden estar presentes incluyen aquellas que corresponden a secuencias que codifican para aminoácidos que pueden participar en reacciones de reticulación químicas o enzimáticas, de tal manera que el polipéptido producido puede modificarse o derivatizarse después de la traducción, o que codifican para una extensión C-terminal fija tal como una etiqueta de polipéptido que puede facilitar la purificación de las fusiones péptido-ARNm.
Una vez que se genera una biblioteca de ARNm derivatizado con puromicina, la biblioteca puede traducirse. Los polipéptidos resultantes (por ejemplo, polipéptidos presentados) se unirán a sus ARNm correspondientes tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, como complejo ARNm-polipéptido).
Se han descrito en la bibliografía numerosos sistemas de traducción in vitro. Los sistemas más comunes utilizan lisados de reticulocitos de conejo, extractos de germen de trigo o extractos de E. coli, que están disponibles a partir de varias fuentes comerciales en forma de kit (por ejemplo, Ambion, Austin, TX; Promega, Madison, WI; Novagen/EMD Chemicals, Gibbstown, NJ; Qiagen, Valencia, CA).
A diferencia de la presentación en fagos u otros sistemas que dependen de la traducción dentro de células, la presentación de ARNm se adapta fácilmente para producir directamente bibliotecas de peptidomiméticos en lugar de péptidos realizando la traducción in vitro con aminoácidos no naturales o no convencionales. Los 20 aminoácidos proteinógenos naturales se identifican mediante las designaciones o bien de una letra o bien de tres letras de la siguiente manera: ácido aspártico (Asp:D), isoleucina (Ile:I), treonina (Thr:T), leucina (Leu:L), serina (Ser:S), tirosina (Tyr:Y), ácido glutámico (Glu:E), fenilalanina (Phe:F), prolina (Pro:P), histidina (His:H), glicina (Gly:G), lisina (Lys:K), alanina (Ala:A), arginina (Arg:R), cisteína (Cys:C), triptófano (Trp:W), valina (Val:V), glutamina (Gln:Q), metionina (Met:M), asparagina (Asn:N). Los aminoácidos que se producen de manera natural incluyen solamente sus formas estereoisoméricas levógiras (L).
Los aminoácidos no naturales tienen cadenas laterales u otras estructuras que no están presentes en los 20 aminoácidos naturales enumerados anteriormente e incluyen, pero no se limitan a: N-metil-aminoácidos, N-alquilaminoácidos, alfa,alfa-aminoácidos sustituidos, beta-aminoácidos, alfa-hidroxi-aminoácidos, D-aminoácidos y otros aminoácidos no naturales conocidos en la técnica (véanse, por ejemplo, Josephson et al., (2005) J. Am. Chem Soc.
127: 11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 100: 6353-6357; Subtelny et al., (2008) J. Am. Chem Soc. 130: 6131-6136; Hartman, M.C.T. et al. (2007) PLoS ONE 2:e972; y Hartman et al., (2006) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 103:4356-4361).
Esencialmente, puede usarse cualquier aminoácido que, cuando se une a un ARNt apropiado, puede ensamblarse para dar un polímero por ribosomas naturales o mutantes (véanse Sando, S. et al., (2007) J. Am. Chem Soc. 129:6180-6186; Dedkova, L. et al. (2003) J. Am. Chem Soc. 125: 6616-6617; Josephson, K., Hartman, M.C.T. y Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem Soc. 127:11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 100:6353-6357; Subtelny, A.O., Hartman, M.C.T. y Szostak, J.W. (2008) J. Am. Chem Soc. 130:6131-6136; y Hartman, M.C.T. et al. (2007) PLoS ONE 2:e972).
Cuando se desean aminoácidos no naturales, puede ser ventajoso usar un sistema de traducción purificado que carece de ARNt aminoacilados endógenos (Shimizu, Y. et al. (2001) Nat. Biotech. 19:751-755; Josephson, K., Hartman, M.C.T. y Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem Soc. 127: 11727-11735; Forster, A.C. et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 100: 6353-6357). Si se usan aminoácidos no naturales con un sistema de traducción in vitro basado en un lisado o extracto, puede ser deseable agotar el extracto de ARNt endógenos, tal como se describió previamente (véase Jackson, R.J., Napthine, S. y Brierley, I. (2001) RNA 7:765-773). Un sistema basado en factores de traducción de E. coli purificados está disponible comercialmente (PURExpress™; New England Biolabs, Ipswich, MA). Estos sistemas son particularmente útiles para la traducción con aminoácidos no naturales para producir peptidomiméticos.
Cuando se usan aminoácidos naturales con un sistema de traducción in vitro basado en un lisado o extracto, la traducción depende de la carga enzimática de aminoácidos en los ARNt por las ARNt sintetasas, todos los cuales son componentes de los extractos. Alternativamente, los sistemas de traducción in vitro que usan ribosomas y factores de traducción purificados, o extractos agotados en ARNt, requieren que se proporcionen ARNt aminoacilados. En estos casos, pueden cargarse ARNt purificados o sintetizados in vitro con aminoácidos usando procedimientos químicos (véase Frankel, A., Millward, S.W. y Roberts, R.W. (2003) Chem. Biol. 10:1043-1050) o enzimáticos (Josephson, K., Hartman, M.C.T. y Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem Soc. 127: 11727-11735; Murakami, H. et al. (2006) Nat. Methods 3:357-359).
Numerosas publicaciones describen la recuperación de polipéptidos presentados en ARNm a partir de complejos de traducción, y estos son adecuados para su uso con los métodos descritos en el presente documento (Liu, R. et al. (2000) Methods Enzymol. 318:268-293; Baggio, R. et al. (2002) J. Mol. Recognit. 15:126-134; patente estadounidense n.° 6.261.804). La recuperación de los polipéptidos presentados en ARNm puede facilitarse mediante el uso de diversas “etiquetas” que se incluyen en el polipéptido mediante la traducción de secuencias fijas de la secuencia codificante del polipéptido y que se unen a moléculas o sustratos específicos. Numerosos reactivos para capturar tales etiquetas están disponibles comercialmente, incluidos los reactivos para capturar la cola de His, etiqueta FLAG, etiqueta de glutatión-S-transferasa (GST), etiqueta strep, etiqueta de VHS, etiqueta de T7, etiqueta S, etiqueta DsbA, etiqueta DsbC, etiqueta Nus, etiqueta myc, etiqueta de hemaglutinina (HA) o etiqueta Trx (Novagen, Gibbstown, NJ; Pierce, Rockford, IL). Los péptidos presentados en ARNm también pueden aislarse uniendo una cola de poliA en el ARNm a la resina de polidT, o una combinación de una cola de poliA y una cola de His.
Después de realizarse la reacción de traducción in vitro, y antes de la etapa de selección, la parte de ARNm del ARN funcionalizado se somete normalmente a transcripción inversa para producir una molécula híbrida de ARN-ADN (por ejemplo, un ADNc). Esto sirve para proteger al ARN frente a la degradación y también impide que el ARN se pliegue en una estructura secundaria que podría unirse a la diana de selección, lo que conduciría a la selección de productos inapropiados (por ejemplo, la selección de aptámeros de ARN en lugar de aptámeros de polipéptido).
Después de la traducción in vitro y el aislamiento de fusiones péptido-ARNm, el resto peptídico puede modificarse mediante reticulación intramolecular o intermolecular, conjugación química, escisión enzimática, truncamiento o extensión con monómeros de aminoácido adicionales. Una forma de lograr esto es mediante la incorporación de aminoácidos no naturales con cadenas laterales reactivas en los polipéptidos que componen la biblioteca. Después de la traducción, los polipéptidos recién formados pueden reaccionar con moléculas que reaccionan específicamente con la cadena lateral reactiva del aminoácido incorporado. Por ejemplo, un aminoácido con una cadena lateral de alquino terminal puede incorporarse en la biblioteca de polipéptidos y posteriormente hacerse reaccionar con un azidoazúcar, creando una biblioteca de polipéptidos presentados con azúcares unidos en las posiciones de las cadenas laterales de alquinilo (Josephson, K., Hartman, M.C.T. y Szostak, J.W. (2005) J. Am. Chem Soc. 127: 11727-11735). Puede usarse una variedad de cadenas laterales reactivas para tal conjugación postraduccional, incluidas aminas, grupos carboxilo, azidas, alquinos terminales, alquenos y tioles.
Una modificación particularmente útil se basa en la reticulación de aminoácidos para producir estructuras cíclicas. Las regiones cíclicas en una proteína contienen un dominio rígido, lo que reduce la flexibilidad conformacional y los grados de libertad de rotación, lo que conduce a una unión de afinidad muy alta a proteínas diana. Normalmente, la reactividad química de cadenas laterales de aminoácido específicas y/o los extremos carboxilo o amino-terminales del polipéptido se aprovechan para reticular dos sitios del polipéptido para producir una molécula cíclica. En un método, los grupos tiol de dos residuos de cisteína se reticulan mediante reacción con dibromoxileno (véase Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem 6:821-824). Pueden usarse tri y tetrabromoxileno para producir polipéptidos con dos y tres bucles, respectivamente.
En otro método a modo de ejemplo, un grupo amino de cadena lateral y un grupo amino terminal se reticulan con glutarato de disuccinimidilo (véase Millward, S.W. et al., J. Am. Chem Soc. 127:14142-14143, 2005). En otros enfoques, la ciclación se logra produciendo un grupo de formación de puente de tioéter entre dos sitios en el polipéptido (véase Timmerman, P. et al., (2005) ChemBioChem 6:821-824). Un método químico se basa en la incorporación de un aminoácido modificado con N-cloroacetilo en el extremo N-terminal del polipéptido, seguido de una reacción espontánea con la cadena lateral de tiol de un residuo de cisteína interno (véase Goto, Y. et al. (2008) ACS Chem. Biol. 3:120-129). Un método enzimático se basa en la reacción entre (1) una cisteína y (2) un grupo deshidroalanina o deshidrobutirina, catalizada por una sintetasa lantibiótica, para crear el grupo de formación de puente de tioéter (véase Levengood, M.R. y Van der Donk, W.A., Bioorg y Med. Chem Lett. 18:3025-3028, 2008). El grupo funcional deshidro también puede generarse químicamente mediante la oxidación de cadenas laterales de aminoácido que contienen selenio incorporadas durante la traducción (véase Seebeck, F.P. y Szostak, J.W. J. Am. Chem Soc. 2006).
Una biblioteca de fusiones ARNm-polipéptido (también denominada en el presente documento biblioteca de presentación en ARNm) generada usando los métodos descritos anteriormente, y que puede haberse sometido o no a una modificación postraduccional (tal como ciclación del polipéptido, tal como se describió anteriormente), puede someterse a una etapa de selección discontinua para aislar aquellos complejos que presentan polipéptidos deseables. Cuando se usa calicreína plasmática, en la etapa de selección se aísla normalmente mediante purificación de una fuente biológica natural o de un sistema de expresión de ADN recombinante. Si es deseable, la calicreína plasmática aislada de cualquier fuente puede activarse en primer lugar mediante tratamiento con factor XIIa.
Normalmente, la calicreína plasmática activada se conjuga con un sustrato sólido, tal como una perla de agarosa o de polímero sintético. Existen numerosos métodos disponibles para inmovilizar la calicreína plasmática en un soporte sólido. En un método particularmente útil, la calicreína plasmática se conjuga con biotina y se usan perlas de estreptavidina para inmovilizar la enzima. Las perlas que comprenden la calicreína plasmática inmovilizada se mezclan con la biblioteca de presentación en ARNm y se incuban en condiciones (por ejemplo, temperatura, fuerza iónica, cationes divalentes y moléculas de unión competidoras) que permiten que miembros específicos de la biblioteca se unan a la diana. Alternativamente, la enzima puede estar libre en disolución y, después de unirse a un polipéptido apropiado, las fusiones ARNm-polipéptido unidas a la calicreína plasmática se capturan mediante perlas modificadas apropiadamente.
Las condiciones de unión pueden variarse para cambiar la rigurosidad de la selección. Por ejemplo, pueden añadirse bajas concentraciones de un agente de unión competitivo para garantizar que los polipéptidos seleccionados tengan una afinidad relativamente mayor. Alternativamente, el periodo de incubación puede elegirse para que sea muy breve, de tal manera que sólo se aislarán los polipéptidos con altas velocidades de kon. De esta manera, las condiciones de incubación desempeñan un papel importante en la determinación de las propiedades de los polipéptidos seleccionados. También pueden emplearse selecciones negativas. En este caso, se lleva a cabo una selección para retirar polipéptidos con afinidad por el sustrato al que se une la diana (por ejemplo, Sepharose) aplicando la biblioteca presentada a perlas de sustrato que carecen de la proteína diana. Esta etapa puede retirar los ARNm y sus polipéptidos codificados que no son específicos para la proteína diana. Están disponibles numerosas referencias que describen cómo realizar experimentos de selección. (Véanse, por ejemplo, la patente estadounidense n.° 6.258.558; Smith, G.P. y Petrenko, V.A., (1997) Chem. Rev. 97:391-410; Keefe, A.D. y Szostak, J.W. (2001) Nature 15:715-718; Baggio, R. et al. (2002) J. Mol. Recog. 15:126-134; Sergeeva, A. et al. (2006) Adv. Drug Deliv. Rev. 58:1622-1654).
Se espera que la frecuencia a la que las moléculas de unión están presentes en una biblioteca de secuencias aleatorias sea muy baja. Por tanto, en la etapa de selección inicial, deben recuperarse muy pocos polipéptidos que cumplan los criterios de selección (y sus ARNm asociados). Normalmente, la selección se repite con los ARNm seleccionados de la primera tanda de selección. Esto se logra mediante el uso de PCR para amplificar los ARNm o los ADNc correspondientes seleccionados en la primera tanda, seguido de transcripción in vitro para producir una nueva biblioteca de ARNm. Se usan cebadores de PCR correspondientes a los extremos 5' y 3' de los ARNm en la biblioteca. Normalmente, el cebador 5' se extenderá en el sentido de 5' más allá del extremo del ARNm para que se añada un promotor bacteriano, tal como un promotor de T7, al extremo 5' de cada molécula amplificada. Una vez amplificado, el ADN bicatenario puede usarse en una reacción de transcripción in vitro para generar el ARNm para una tanda de selección posterior.
El proceso de selección implica normalmente una serie de tandas o ciclos, en los que la reserva de moléculas seleccionadas se enriquece gradualmente en un conjunto específico de secuencias al final de cada tanda. Las condiciones de selección pueden ser las mismas para cada tanda, o las condiciones pueden cambiar, por ejemplo, para aumentar la rigurosidad de la selección en tandas posteriores. El progreso de la selección puede monitorizarse mediante el uso de aminoácidos marcados isotópicamente, tales como 35S-metionina. Se mide la cantidad de polipéptido radiomarcado unido a la diana en cada tanda, y un aumento progresivo del radiomarcador recuperado es indicativo de un enriquecimiento progresivo en moléculas de ARN que codifican para polipéptidos con afinidad de unión por la diana. Después de cualquier tanda, los productos de PCR pueden clonarse y secuenciarse. En general, la clonación y la secuenciación se realizan después de una tanda en la que se recuperan cantidades apreciables (por ejemplo, > 2% sobre el fondo con respecto a perlas que carecen de calicreína plasmática inmovilizada) de polipéptido radiomarcado en la reserva unida a la diana. Las secuencias que se encuentran en múltiples aislados son candidatos para codificar para polipéptidos que se unen específicamente a la diana. Alternativamente, la secuenciación de alto rendimiento de miles de clones puede realizarse después de la primera tanda o tandas posteriores. Las secuencias que aumentan en frecuencia entre las tandas tercera y cuarta son candidatos para codificar para polipéptidos que se unen específicamente a la diana. El polipéptido codificado por cualquier secuencia puede traducirse o sintetizarse y someterse a prueba para determinar la afinidad de unión por la proteína diana original usada en la selección.
Las bibliotecas y los métodos de la presente divulgación pueden usarse para optimizar la función o propiedades de un polipéptido. En un enfoque, se usa PCR mutagénica (Keefe, A.D. y Szostak, J.W. (2001) Nature 15:715-718) para introducir variación de secuencia en la biblioteca una vez que la población se enriquece en polipéptidos con un cierto nivel de afinidad de unión. Alternativamente, puede replicarse una única secuencia de ARN que codifica para un polipéptido con propiedades de unión definidas pero con un nivel definido de mutaciones, o puede realizarse una PCR mutagénica para producir una reserva de moléculas mutantes. Tras la traducción in vitro, se espera que la mezcla resultante de moléculas de ARNm producidas a partir de tal reserva codifique para polipéptidos con un rango de afinidades mejoradas, similares o reducidas en comparación con la secuencia de partida, y puede esperarse que una selección realizada con ARNm de tal reserva identifique polipéptidos con afinidad mejorada si se usa un régimen de restricción apropiado durante la selección.
En un segundo enfoque, la optimización se realiza de manera dirigida. Una secuencia que codifica para un polipéptido con propiedades de unión o funcionales establecidas se somete a mutagénesis dirigida al sitio, mediante lo cual se produce una serie de secuencias, teniendo cada secuencia un codón reemplazado, por ejemplo, por un codón de alanina. El número de secuencias en el conjunto es igual al número de residuos de aminoácido que van a mutarse. Después de la traducción in vitro, el producto de polipéptido de cada mutante de “barrido de alanina” se somete a prueba para determinar las propiedades de unión o funcionales. Los sitios en los que una sustitución de alanina afecta a la unión o la función del polipéptido se consideran residuos críticos. De manera similar, puede realizarse un barrido de N-metilo, de tal manera que cada residuo se reemplace por el derivado de N-metilo, y pueden identificarse las posiciones en la estructura principal del péptido que pueden tolerar las sustituciones de N-metilo.
Alternativamente, las secuencias pueden formar una reserva, someterse a una o más tandas de una selección de alta rigurosidad, y se aísla una reserva de secuencias que representan polipéptidos de unión de alta afinidad. Los residuos críticos se identifican después de la secuenciación de ADN del ADN recuperado como aquellos que no pueden sustituirse por un residuo de alanina sin pérdida de actividad. Una vez que se identifican los residuos críticos, se produce una reserva de moléculas de ARNm que codifican para una amplia variedad de aminoácidos naturales (o no naturales) en cada posición crítica. La reserva resultante se somete a una o más tandas de una selección de alta rigurosidad (con la mezcla apropiada de ARNt cargados con aminoácidos naturales o no naturales), y las secuencias que representan polipéptidos de unión de alta afinidad se aíslan después de traducción in vitro. De esta manera, puede identificarse un polipéptido óptimo. Dado que la secuencia óptima puede no identificarse necesariamente combinando residuos óptimos en sitios individuales, es útil someter a prueba las mutaciones en múltiples sitios en combinación.
Tanto el barrido de alanina como de N-metilo también pueden realizarse usando enfoques de síntesis química, tales como la síntesis peptídica en fase sólida (véase, por ejemplo, Coin, I et al. (2007) Nature Protocols 2(12):3247-56), para producir péptidos.
Una vez que se identifica una reserva, población o subconjunto de péptidos, pueden evaluarse para aplicaciones terapéuticas o de diagnóstico, incluyendo propiedades farmacocinéticas y/o farmacodinámicas mejoradas.
En una realización, se evalúan los péptidos para determinar uno o más de afinidad de unión a la diana, actividad en ensayos bioquímicos o basados en células, resistencia a proteasas, permeabilidad in vitro o in vivo, presencia de propiedades de tipo farmacológico tales como la unión a proteínas plasmáticas, metabolismo (en microsomas, hepatocitos o plasma) y la inhibición de PGP/CYP. Los péptidos de la presente divulgación también pueden someterse a prueba para determinar la biodisponibilidad oral, toxicidad, actividad hERG, semivida en circulación, otros parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos, y eficacia en modelos animales de enfermedad.
Péptidos cíclicos y peptidomiméticos cíclicos de la divulgación.
Según la presente divulgación, una vez que se identifica un único péptido o una reserva de moléculas de péptidos candidatos, pueden someterse a una o más tandas de optimización de la relación estructura-actividad (SAR, por sus siglas en inglés) usando técnicas de síntesis química y peptídica convencionales. Tal optimización puede incluir consideraciones tales como evitar las cadenas laterales polares cargadas (Asp, Glu, Arg, Lys) que pueden inhibir la penetración celular, evitar las cadenas laterales que representen cargas metabólicas (Tyr, Met, Trp, Cys), mejorar la solubilidad, evitar un peso molecular innecesario, evitar enlaces rotables y lipofilicidad.
En una realización, es un objetivo de la presente divulgación proporcionar peptidomiméticos cíclicos diseñados para ser metabólicamente estables y permeables a las células.
Tal como se usa en el presente documento, el término “aminoácido” incluye los residuos de los aminoácidos naturales, así como los aminoácidos no naturales. El término también incluye aminoácidos que portan un grupo protector de amino convencional (por ejemplo, acetilo o benciloxicarbonilo), así como aminoácidos naturales y no naturales protegidos en el extremo carboxilo-terminal (por ejemplo, como una amida o un éster alquílico (Ci-Ca), fenílico o bencílico; o como una alfa-metilbencilamida). Los expertos en la técnica conocen otros grupos protectores de amino y carboxilo adecuados (véanse, por ejemplo, Greene, T. W.; Wutz, P. G. M., Protecting Groups In Organic Synthesis; segunda edición, 1991, Nueva York, John Wiley & sons, Inc, y los documentos citados en ese documento). Las composiciones de péptido de la presente divulgación también pueden incluir aminoácidos modificados.
Los aminoácidos no naturales útiles para la optimización de péptidos inhibidores de calicreína incluyen, pero no se limitan a, homolisina, homoarginina, homoserina, ácido 2-aminoadípico, ácido 3-aminoadípico, beta-alanina, ácido aminopropiónico, ácido 2-aminobutírico, 4-aminobutírico ácido, ácido 6-aminocaproico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminoisobutírico, ácido 3-aminoisbutírico, ácido 2-aminopimélico, ácido 2,4-diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2'-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, N-etilglicina, N-etilasparagina, homoprolina, hidroxilisina, alohidroxilisina, 3-hidroxiprolina, 4-hidroxiprolina, isodesmosina, alo-isoleucina, N-metilpentilglicina, naftilalanina, ornitina, pentilglicina, tioprolina, norvalina, terc-butilglicina, fenilglicina, 7-azatriptófano, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, sarcosina, homocisteína, ácido 1-aminociclopropanocarboxílico, ácido 1-aminociclobutanocarboxílico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclohexanocarboxílico, ácido 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-carboxílico, ácido aminoisobutérico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico, ciclopentilglicina, ciclohexilglicina, ciclopropilglicina, ^-ro-metil-arginina, 4-clorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, 5-fluorotriptófano, 5-clorotriptófano, 4-cloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4-aminometil-fenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, octilglicina, norleucina, ácido tranexámico, ácido 2-aminopentanoico, ácido 2-aminohexanoico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminooctanoico, ácido 2-aminononanoico, ácido 2-aminodecanoico, ácido 2-aminoundecanoico, ácido 2-aminododecanoico, ácido aminovalérico y ácido 2-(2-aminoetoxi)acético, ácido pipecólico, 2-carboxi-azetidina, hexafluoroleucina, 3-fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3-fluoro-isoleucina, 4- fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metil-fenilglicina, 4-etil-fenilglicina, 4-isopropil-fenilglicina, ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-terc-leucinol, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina y (S)-A/,2-dimetiM-(piridin-2-il)propan-1-amina, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico y ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propanoico y los estereoisómeros D y L de los mismos.
Los residuos de aminoácido modificados útiles para la optimización de péptidos inhibidores de calicreína incluyen, pero no se limitan a aquellos que se bloquean químicamente, de manera reversible o irreversible, o modificados químicamente en su grupo amino N-terminal o sus grupos de cadena lateral, como por ejemplo, D y L-aminoácidos o residuos naturales o no naturales N-metilados en los que se modifican químicamente los grupos funcionales de cadena lateral a otro grupo funcional. Por ejemplo, los aminoácidos modificados incluyen, sin limitación, sulfóxido de metionina; sulfona de metionina; (éster beta-metílico) de ácido aspártico, un aminoácido modificado de ácido aspártico; Netilglicina, un aminoácido modificado de glicina; o carboxamida de alanina, y un aminoácido modificado de alanina. Los aminoácidos no naturales pueden adquirirse de Sigma Aldrich u otro proveedor. Los aminoácidos no naturales pueden incluir además cualquiera de los enumerados en la tabla 2 de la publicación de patente estadounidense US 2011/0172126.
Las secuencias de aminoácidos de los péptidos de la divulgación pueden comprender sólo aminoácidos que se producen de manera natural y, como tales, pueden considerarse que son péptidos, polipéptidos o fragmentos de los mismos. Alternativamente, los péptidos pueden comprender aminoácidos que se producen de manera tanto natural como no natural o modificados, o componerse exclusivamente de aminoácidos que se producen de manera no natural. Según la presente divulgación, las composiciones identificadas pueden ser “peptidomiméticos”, “miméticos de péptidos”, “péptidos”, “polipéptidos” o “proteínas”. Aunque se sabe en la técnica que estos términos implican un tamaño relativo, estos términos, tal como se usan en el presente documento, no deben considerarse limitativos con respecto al tamaño de las diversas moléculas basadas en polipéptidos a las que se hace referencia en el presente documento y que están abarcadas en esta divulgación, a menos que se indique de otro modo.
Según la presente divulgación, cualquier molécula basada en aminoácidos puede denominarse un “polipéptido” y este término abarca tanto “péptidos” como “proteínas”. Los péptidos también son una categoría de proteínas y tradicionalmente se considera que varían en tamaño desde aproximadamente 4 hasta aproximadamente 50 aminoácidos. Los dipéptidos, aquellos que tienen dos residuos de aminoácido, son una categoría de péptidos al igual que los tripéptidos (3 aminoácidos). Los polipéptidos que tienen más de aproximadamente 50 aminoácidos se denominan generalmente “proteínas”. Las secuencias de péptidos, polipéptidos y/o proteínas pueden ser lineales o cíclicas. Por ejemplo, puede prepararse un péptido cíclico o puede resultar de la formación de puentes disulfuro entre dos residuos de cisteína en una secuencia. Puede unirse un péptido a través del extremo carboxilo-terminal, el extremo amino-terminal o a través de cualquier otro punto de unión conveniente tal como, por ejemplo, a través del azufre de una cisteína o cualquier cadena lateral de un residuo de aminoácido u otra unión incluyendo, pero sin limitarse a, una unión maleimida, una unión amida, una unión éster, una unión éter, una unión tiol éter, una unión hidrazona o una unión acetamida.
El término “variante de secuencia de aminoácidos” se refiere a moléculas con algunas diferencias en sus secuencias de aminoácidos en comparación con una secuencia nativa. Las variantes de secuencia de aminoácidos pueden tener sustituciones, deleciones y/o inserciones en determinadas posiciones dentro de la secuencia de aminoácidos. Habitualmente, las variantes tendrán una homología de al menos aproximadamente el 70% con una secuencia nativa o de partida, y preferiblemente, tendrán una homología de al menos aproximadamente el 80%, más preferiblemente al menos aproximadamente el 90% con una secuencia nativa o de partida.
La “homología”, tal como se aplica a las secuencias de aminoácidos, se define como el porcentaje de residuos en la secuencia de aminoácidos candidata que son idénticos a los residuos en la secuencia de aminoácidos de una segunda secuencia después de alinear las secuencias e introducir huecos, si es necesario, para lograr el máximo porcentaje de homología. Los métodos y programas informáticos para la alineación se conocen bien en la técnica. Se entiende que la homología depende de un cálculo del porcentaje de identidad pero puede diferir en su valor debido a los huecos y las penalizaciones introducidos en el cálculo.
Por “homólogos”, tal como se aplica a las secuencias de aminoácidos, se entiende la secuencia correspondiente de otra especie que tiene identidad sustancial con una segunda secuencia de una segunda especie.
“Análogos” pretende incluir variantes de polipéptido que difieren en una o más alteraciones de aminoácidos, por ejemplo, sustituciones, adiciones o deleciones de residuos de aminoácido que todavía mantienen una o más de las propiedades del polipéptido original o de partida.
La presente divulgación contempla varios tipos de composición que se basan en aminoácidos, incluidas variantes y derivados. Estos incluyen variantes y derivados de sustitución, de inserción, de deleción y covalentes. El término “derivado” se usa como sinónimo del término “variante” y se refiere a una molécula que se ha modificado o cambiado de alguna manera en relación con una molécula de referencia o molécula de partida.
Como tal, se incluyen dentro de esta divulgación las moléculas basadas en polipéptidos que contienen sustituciones, inserciones y/o adiciones, deleciones y modificaciones covalentes. Por ejemplo, pueden añadirse etiquetas de secuencia o aminoácidos, tales como una o más lisinas, a las secuencias peptídicas de la divulgación (por ejemplo, en los extremos N-terminal o C-terminal). Las etiquetas de secuencia pueden usarse para la purificación o localización de péptidos. Pueden usarse lisinas para aumentar la solubilidad del péptido o para permitir modificaciones específicas del sitio, tales como, pero sin limitarse a, biotinilación o pegilación. Alternativamente, los residuos de aminoácido ubicados en las regiones carboxilo y amino-terminales de la secuencia de aminoácidos de un péptido o una proteína pueden delecionarse opcionalmente proporcionando secuencias truncadas. Ciertos aminoácidos (por ejemplo, residuos C-terminales o N-terminales) pueden delecionarse alternativamente dependiendo del uso de la secuencia, como por ejemplo, la expresión de la secuencia como parte de una secuencia más grande, que es soluble o está unida a un soporte sólido.
Las “variantes de sustitución” cuando hacen referencia a polipéptidos son aquellas que tienen al menos un residuo de aminoácido en una secuencia nativa o de partida eliminada y un aminoácido diferente insertado en su lugar en la misma posición. Las sustituciones pueden ser únicas, en las que sólo se ha sustituido un aminoácido en la molécula, o pueden ser múltiples, en las que se han sustituido dos o más aminoácidos en la misma molécula.
Tal como se usa en el presente documento, el término “sustitución de aminoácidos conservativa” se refiere a la sustitución de un aminoácido que está presente normalmente en la secuencia por un aminoácido diferente de tamaño, carga o polaridad similares. Los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo apolar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina y leucina por otro residuo apolar. Del mismo modo, los ejemplos de sustituciones conservativas incluyen la sustitución de un residuo polar (hidrófilo) por otro, tal como entre arginina y lisina, entre glutamina y asparagina, y entre glicina y serina. Además, la sustitución de un residuo básico tal como lisina, arginina o histidina por otro, o la sustitución de un residuo ácido tal como ácido aspártico o ácido glutámico por otro residuo ácido son ejemplos adicionales de sustituciones conservativas. Los ejemplos de sustituciones no conservativas incluyen la sustitución de un residuo de aminoácido apolar (hidrófobo) tal como isoleucina, valina, leucina, alanina, metionina por un residuo polar (hidrófilo) tal como cisteína, glutamina, ácido glutámico o lisina y/o un residuo polar por un residuo apolar.
Los “isósteros” son una de dos o más moléculas que muestran cierta similitud de propiedades biológicas como resultado de tener el mismo número de electrones totales o de valencia en la misma disposición y que consisten en átomos diferentes, no necesariamente el mismo número de átomos. Hay dos clases de isósteros, clásico y no clásico. Los isósteros clásicos tienen el mismo número de átomos y/o el mismo número de electrones de valencia, mientras que los isósteros no clásicos son moléculas que producen un efecto biológico similar in vivo pero no tienen el mismo número de átomos y/o electrones de valencia.
Según la presente divulgación, los “isósteros de péptidos” se definen como isósteros que tienen propiedades que se asemejan a los péptidos. Los isósteros de péptidos pueden ser de un tipo lineal que comprende al menos un reemplazo de enlace peptídico o pueden ser cíclicos y comprender una función amina y una ácido carboxílico. Tal reemplazo puede ser por cualquier resto que mejore las propiedades fisicoquímicas, estructurales o funcionales de la molécula. El reemplazo de enlace peptídico puede aumentar la estabilidad metabólica de los péptidos y reducir la flexibilidad. Los isósteros de péptidos descritos en el presente documento pueden ser isósteros de mono, di, tri, tetra, penta, sexta, septa, octa, nona, decapéptido, lo que significa que pueden reemplazarse al menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10 enlaces peptídicos. Los ejemplos no limitativos de isósteros de dipéptidos lineales para enlaces amida (peptídicos) incluyen tioamida, sulfonamida, sulfonato, fosfonamida, fosfonato, fosfotioato, fosfinato, alcano, 1 ó 2-hidroxietileno, dihidroxietileno, enlace sencillo C-C (alcano), doble enlace C-C (alqueno), triple enlace CC (alquino), enlace C-O (metilenoxilo), enlace O-N o N-O, (metilenamino), triazol, hidrazida, urea, cetona, enlace uretano, (di)haloalqueno, metilenmercapto, metilenamino, trifluoroetilamino, hidrazida, amidoxilo, y otros conocidos por los expertos en la técnica.
Los isósteros de péptidos también pueden ser moléculas cíclicas que están decoradas con una función amina y una ácido carboxílico. Los ejemplos no limitativos de isósteros de péptidos cíclicos con tamaños de anillo variables incluyen carbaciclos, azaciclos y oxaciclos. Los azaciclos pueden basarse en un núcleo de alcaloide que forma un isóstero de estructura bicíclica. Un ejemplo de un isóstero azacíclico incluye un isóstero basado en un anillo de triazol formado por una cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre. Los isósteros de péptidos cíclicos descritos en el presente documento pueden ser isósteros cíclicos de péptidos bi, tri, tetra, penta, sexta, septa, octa, nona, decapéptidos.
Las “variantes de inserción” cuando hacen referencia a polipéptidos son aquellas con uno o más aminoácidos insertados inmediatamente adyacentes a un aminoácido en una posición particular en una secuencia nativa o de partida. “Inmediatamente adyacente” a un aminoácido significa conectado o bien al grupo funcional alfa-carboxilo o bien al alfa-amino del aminoácido.
Las “variantes de deleción” cuando hacen referencia a polipéptidos son aquellas con uno o más aminoácidos eliminados en la secuencia de aminoácidos nativa o de partida. Normalmente, las variantes de deleción tendrán uno o más aminoácidos delecionados en una región particular de la molécula.
Las “características” cuando hacen referencia a polipéptidos se definen como componentes de una molécula basados en secuencias de aminoácidos distintos. Las características del polipéptido de la presente divulgación incluyen manifestaciones de superficie, forma conformacional local, pliegues, bucles, semibucles, dominios, semidominios, sitios, extremos terminales o cualquier combinación de los mismos.
Tal como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a polipéptidos, el término “sitio” en lo que se refiere a realizaciones basadas en aminoácidos, se usa como sinónimo de “residuo de aminoácido” y “cadena lateral de aminoácido”. Un sitio representa una posición dentro de un péptido o polipéptido que puede modificarse, manipularse, alterarse, derivatizarse o variarse dentro de las moléculas basadas en polipéptidos de la presente divulgación.
Según la presente divulgación, los polipéptidos pueden comprender una secuencia consenso, que se descubre a través de tandas de selección. Tal como se usa en el presente documento, una secuencia “consenso” es una única secuencia que representa una población colectiva de secuencias que permite la variabilidad en uno o más sitios. Compuestos inhibidores obtenidos por procedimientos de ciclación alternativos
Los inhibidores de calicreína plasmática pueden sintetizarse según una o más de las reacciones químicas descritas en las secciones A, B y C de esta sección.
A. Reacción de Heck
Tal como se usa en el presente documento, el término “reacción de Heck” se refiere a una reacción química en la que un haluro insaturado (incluyendo, pero sin limitarse a un bromuro) reacciona con un grupo alqueno así como una base en presencia de un catalizador que comprende paladio, lo que da como resultado la formación de un alqueno sustituido (Mizoroki, T. et al., Arylation of olefin with aryl iodide catalyzed by palladium. Bulletin of the Chemical Society of Japan.
1971.44(2):p581). Para la síntesis de peptidomiméticos mediante la reacción de Heck, puede tratarse una resina que contiene péptido con un tampón de reacción que puede comprender DMF/H2O/Et3N, Pd(OAc)2, PPh3, (nBu)4NCl en una porción. La suspensión resultante puede agitarse durante la noche a 37°C. Después de este tiempo, la resina puede lavarse. Tal lavado puede realizarse secuencialmente con DMF, MeOH, DCM y secarse bajo un flujo de gas nitrógeno. Los péptidos resultantes pueden escindirse de la resina con TFA/H2O (97:3) y purificarse mediante métodos conocidos en la técnica (incluyendo, pero sin limitarse a, HPLC de fase inversa). Un ejemplo de una de tales reacciones se presenta en el esquema 1.
Esquema 1
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En algunas realizaciones, el doble enlace formado en la reacción está en la formación estereoquímica S. En algunas realizaciones, el doble enlace formado en la reacción está en la formación estereoquímica R.
B. Reacción de Buchwald
Tal como se usa en el presente documento, el término “reacción de Buchwald” se refiere a una reacción química llevada a cabo durante la noche a una temperatura seleccionada entre 50°C y 150°C en la que un haluro (incluyendo, pero sin limitarse a, un bromuro) se hace reaccionar con un grupo químico que comprende oxígeno en presencia de tolueno y un catalizador que comprende paladio. Un ejemplo de una de tales reacciones se presenta en el esquema 2.
Esquema 2
Figure imgf000018_0002
C. Metátesis de olefinas
Tal como se usa en el presente documento, el término “metátesis de olefinas” se refiere a una reacción química que comprende la redistribución de alquenos a través de la ruptura y nueva formación de dobles enlaces carbono-carbono. Un ejemplo de una de tales reacciones se presenta en el esquema 3.
Esquema 3
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En algunas realizaciones, el doble enlace formado en la reacción está en la formación estereoquímica S. En algunas realizaciones, el doble enlace formado en la reacción está en la formación estereoquímica R.
Conjugados y combinaciones
Según la presente divulgación, los polipéptidos pueden modificarse mediante la adición de uno o más grupos conjugados. Los péptidos también pueden administrarse en combinación con una o más moléculas adicionales.
Tal como se usa en el presente documento, un “conjugado” se refiere a cualquier molécula o resto unido a otra molécula. En la presente divulgación, los conjugados pueden estar basados en proteínas (aminoácidos) o no. Los conjugados pueden comprender lípidos, moléculas pequeñas, ARN, ADN, proteínas, polímeros, o combinaciones de los mismos. Funcionalmente, los conjugados pueden servir como moléculas de selección como diana o pueden servir como carga útil para administrarse a una célula, un órgano o tejido. Los conjugados son normalmente modificaciones covalentes introducidas haciendo reaccionar residuos de aminoácido específicos o los extremos terminales del polipéptido con un agente de derivatización orgánico que es capaz de reaccionar con cadenas laterales o residuos terminales seleccionados. Tales modificaciones están dentro de la experiencia habitual en la técnica y se realizan sin experimentación indebida.
Las modificaciones covalentes incluyen específicamente moléculas en las que las proteínas, los péptidos o polipéptidos de la divulgación se unen a un polímero no proteínico. El polímero no proteínico habitualmente es un polímero sintético hidrófilo, es decir, un polímero que no se encuentra de otro modo en la naturaleza. Sin embargo, los polímeros que existen en la naturaleza y se producen mediante métodos recombinantes o in vitro son útiles, como lo son los polímeros que se aíslan de la naturaleza. Los polímeros de polivinilo hidrófilos se encuentran dentro de esta divulgación, por ejemplo, poli(alcohol vinílico) y polivinilpirrolidona. Las proteínas, los péptidos o polipéptidos pueden unirse a diversos polímeros no proteínicos, tales como polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las patentes estadounidenses n.os 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 ó 4.179.337.
Tal como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a polipéptidos, el término “sitio” en lo que se refiere a realizaciones basadas en aminoácidos se usa como sinónimo de “residuo de aminoácido” y “cadena lateral de aminoácido”. Un sitio representa una posición dentro de un péptido o polipéptido que puede modificarse, manipularse, alterarse, derivatizarse o variarse dentro de las moléculas basadas en polipéptidos de la presente divulgación.
Tal como se usa en el presente documento cuando se hace referencia a polipéptidos, el término “bucle” se refiere a una característica estructural de un polipéptido que puede servir para invertir el sentido de la estructura principal de un péptido o polipéptido. Cuando el bucle se encuentra en un polipéptido y sólo altera el sentido de la estructura principal, puede comprender cuatro o más residuos de aminoácido. Oliva et al. han identificado al menos 5 clases de bucles de proteína (J. Mol Biol 266 (4):814-830; 1997). Los bucles pueden ser abiertos o cerrados. Los bucles cerrados o bucles “cíclicos” pueden comprender 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 aminoácidos o más entre los restos de formación de puente. Tales restos de formación de puente pueden comprender un puente cisteína-cisteína (Cys-Cys) típico en polipéptidos que tienen puentes disulfuro o, alternativamente, los restos de formación de puente pueden no estar basados en proteína, tales como los agentes de dibromoxililo usados en el presente documento.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “extremos terminales o extremo terminal” cuando hacen referencia a polipéptidos se refieren a una extremidad de un péptido o polipéptido. Tal extremidad no se limita sólo al primer o último sitio del péptido o polipéptido, sino que puede incluir aminoácidos adicionales en las regiones terminales. Las moléculas basadas en polipéptidos de la presente divulgación pueden caracterizarse por tener un extremo N-terminal (terminado por un aminoácido con un grupo amino libre (NH2)) y un extremo C-terminal (terminado por un aminoácido con un grupo carboxilo libre (COOH)). Las proteínas de la divulgación están compuestas en algunos casos por múltiples cadenas de polipéptido unidas por enlaces disulfuro o por fuerzas no covalentes (multímeros, oligómeros). Estas clases de proteínas tendrán múltiples extremos N y C-terminales. Alternativamente, los extremos terminales de los polipéptidos pueden modificarse de tal manera que comiencen o terminen, según sea el caso, con un resto no basado en polipéptidos tal como un conjugado orgánico.
En una realización, las moléculas basadas en polipéptidos de la presente divulgación pueden incluir una región terminal. Tal como se usa en el presente documento, “región terminal” es una región terminal de aminoácidos que puede incluir una cisteína. La región terminal puede ser una región N y/o C-terminal. La región terminal puede conectarse al polipéptido original usando un grupo de unión. Tal como se usa en el presente documento, “polipéptido original” se refiere al polipéptido que no incluye la región terminal. La región terminal puede estar separada del polipéptido original por 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 residuos o más. Los residuos añadidos pueden seleccionarse de, pero sin limitarse a, cualquier aminoácido natural o no natural, la forma N-metilada de cualquier aminoácido natural o no natural, el estereoisómero D de cualquier aminoácido natural o no natural, norvalina, terc-butilglicina, fenilglicina, 7-azatriptófano, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, sarcosina, homocisteína, ácido 1-aminociclopropanocarboxílico, ácido 1-aminociclobutanocarboxílico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclohexanocarboxílico, ácido 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-carboxílico, ácido aminoisobutérico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico, ciclopentilglicina, ciclohexilglicina, ciclopropilglicina, ^-ro-metil-arginina, 4-clorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, 5-fluorotriptófano, 5-clorotriptófano, citrulina, 4-cloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4-aminometil-fenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, octilglicina, norleucina, ácido tranexámico, ácido 2-aminopentanoico, ácido 2-aminohexanoico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminooctanoico, ácido 2-aminononanoico, ácido 2-aminodecanoico, ácido 2-aminoundecanoico, ácido 2-aminododecanoico, ácido aminovalérico y ácido 2-(2-aminoetoxi)acético, ácido pipecólico, 2-carboxi-azetidina, hexafluoroleucina, 3-fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3-fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metilfenilglicina, 4-etil-fenilglicina, 4-isopropil-fenilglicina, ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-terc-leucinol, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina y (S)-W,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amina, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1 H-indazol-3-il)propanoico y ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propanoico.
En una realización, las moléculas basadas en polipéptidos pueden incluir una modificación terminal. La modificación puede ser en los extremos N y/o C-terminales y puede incluir, pero sin limitarse a, la adición de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 residuos o más en la región terminal. Los residuos añadidos pueden seleccionarse de, pero sin limitarse a, cualquier aminoácido natural o no natural, la forma N-metilada de cualquier aminoácido natural o no natural, el estereoisómero D de cualquier aminoácido natural o no natural, norvalina, terc-butilglicina, fenilglicina, 7-azatriptófano, 4-fluorofenilalanina, penicilamina, sarcosina, homocisteína, ácido 1-aminociclopropanocarboxílico, ácido 1-aminociclobutanocarboxílico, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, ácido 1-aminociclohexanocarboxílico, ácido 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-carboxílico, ácido aminoisobutérico, ácido (S)-2-amino-3-(1H-tetrazol-5-il)propanoico, ciclopentilglicina, ciclohexilglicina, ciclopropilglicina, ^-ro-metil-arginina, 4-clorofenilalanina, 3-clorotirosina, 3-fluorotirosina, 5-fluorotriptófano, 5-clorotriptófano, 4-cloro-homofenilalanina, homofenilalanina, 4-aminometilfenilalanina, 3-aminometil-fenilalanina, octilglicina, norleucina, ácido tranexámico, ácido 2-aminopentanoico, ácido 2-aminohexanoico, ácido 2-aminoheptanoico, ácido 2-aminooctanoico, ácido 2-aminononanoico, ácido 2-aminodecanoico, ácido 2-aminoundecanoico, ácido 2-aminododecanoico, ácido aminovalérico y ácido 2-(2-aminoetoxi)acético, ácido pipecólico, 2-carboxi-azetidina, hexafluoroleucina, 3-fluorovalina, ácido 2-amino-4,4-difluoro-3-metilbutanoico, 3-fluoro-isoleucina, 4-fluoroisoleucina, 5-fluoroisoleucina, 4-metil-fenilglicina, 4-etilfenilglicina, 4-isopropil-fenilglicina, ácido (S)-2-amino-5-(3-metilguanidino)pentanoico, ácido (S)-2-amino-3-(4-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(3-(aminometil)fenil)propanoico, ácido (S)-2-amino-4-(2-aminobenzo[d]oxazol-5-il)butanoico, (S)-leucinol, (S)-valinol, (S)-terc-leucinol, (R)-3-metilbutan-2-amina, (S)-2-metil-1-fenilpropan-1-amina y (S)-W,2-dimetil-1-(piridin-2-il)propan-1-amina, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(oxazol-5-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,3,4-oxadiazol-2-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(1,2,4-oxadiazol-3-il)propanoico, ácido (S)-2-amino-3-(5-fluoro-1H-indazol-3-il)propanoico y ácido (S)-2-amino-3-(1H-indazol-3-il)propanoico.
En una realización, las moléculas basadas en polipéptidos pueden incluir una modificación terminal en los extremos N o C-terminales con la adición de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 residuos o más y una cisteína en la región terminal.
Una vez que se ha identificado o definido cualquiera de las características como componente de una molécula de la divulgación, cualquiera de varias manipulaciones y/o modificaciones de estas características puede realizarse mediante movimiento, intercambio, inversión, deleción, aleatorización o duplicación. Además, se entiende que la manipulación de características puede dar como lugar al mismo resultado que una modificación de las moléculas de la divulgación. Por ejemplo, una manipulación que implicó delecionar un dominio daría como resultado la alteración de la longitud de una molécula tal como lo haría la modificación de un ácido nucleico para codificar para menos que una molécula de longitud completa.
Las modificaciones y manipulaciones pueden lograrse mediante métodos conocidos en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio. Las moléculas modificadas resultantes pueden someterse a prueba entonces para determinar la actividad usando ensayos in vitro o in vivo tales como los descritos en el presente documento o cualquier otro ensayo de cribado adecuado conocido en la técnica.
Según la presente divulgación, los polipéptidos pueden comprender una secuencia consenso que se descubre a través de tandas de selección. En una realización, la secuencia consenso puede comprender Cys-(X-|X2X3-) Cys-Arg-Val-R, en la que las cisteínas se unen entre sí mediante un resto de formación de puente y -(X1X2X 3-) representan una región de bucle de aminoácidos entre las cisteínas y en la que R representa cero, uno o más aminoácidos.
El proceso de conjugación puede implicar pegilación, lipidación, albuminación, la adición de otras colas de proteínas o injerto sobre dominios Fc de anticuerpos, regiones CDR de anticuerpos intactos o dominios de anticuerpos producidos mediante cualquier número de medios. El conjugado puede incluir anclajes incluyendo el resto de oleato de colesterol, el resto de laurato de colesterilo, un resto de a-tocoferol, un resto de fitol, un resto de oleato o un resto de éster de colesterol insaturado o un compuesto lipófilo seleccionado de acetanilidas, anilidas, aminoquinolinas, compuestos de benzhidrilo, benzodiazepinas, benzofuranos, cannabinoides, péptidos cíclicos, dibenzazepinas, glicósidos digitálicos, alcaloides del cornezuelo, flavonoides, imidazoles, quinolinas, macrólidos, naftalenos, opiáceos (tales como, pero no limitados a, morfinanos u otros fármacos psicoactivos), oxazinas, oxazoles, fenilalquilaminas, piperidinas, hidrocarburos aromáticos policíclicos, pirrolidinas, pirrolidinonas, estilbenos, sulfonilureas, sulfonas, triazoles, tropanos y alcaloides de vinca. Los péptidos de la presente divulgación pueden conjugarse con cualquiera de los conjugados peptídicos enseñados, por ejemplo, en las publicaciones de patente estadounidense US20110172126 o US20030040472.
Vías de administración
Las composiciones farmacéuticas de la presente divulgación pueden administrarse por cualquier vía que dé como resultado un resultado terapéuticamente eficaz. Estas incluyen, pero no se limitan a administración enteral, gastroenteral, epidural, oral, peridural, intracerebral (en el cerebro), intratraqueal (en las vías respiratorias para la administración al pulmón), intracerebroventricular (en los ventrículos cerebrales), epicutánea (aplicación sobre la piel), intradérmica (en la propia piel), subcutánea (debajo de la piel), nasal (a través de la nariz), infusión intravenosa (en una vena), intraarterial (en una arteria), intramuscular (en un músculo), intracardiaca (en el corazón), intraósea (en la médula ósea), infusión intratecal (en el conducto raquídeo), intraperitoneal, (infusión o inyección en el peritoneo), intravesical, inyección intravítrea, (en la cámara posterior del ojo), intracavernosa, (en la base del pene), administración intravaginal, administración intrauterina, extraamniótica, transdérmica (difusión a través de la piel intacta para distribución sistémica), transmucosa (difusión a través de una membrana mucosa), insuflación (inhalación), bucal, sublingual, sublabial, enema, colirios (sobre la conjuntiva) o en gotas para los oídos.
Formulación y administración de péptidos cíclicos.
El término “formulación farmacéutica” se refiere a una composición que comprende al menos un principio activo (por ejemplo, un péptido) en una forma y cantidad que permiten que el principio activo sea terapéuticamente eficaz.
Las formulaciones de péptidos de la presente divulgación incluyen formulaciones de liberación duodenal controlada, formulaciones de liberación programada, sistemas de administración de liberación controlada por ósmosis, microemulsiones, microesferas, liposomas, nanopartículas, parches, bombas, depósitos de fármacos, y similares. Se incluyen específicamente en la presente divulgación formas de dosificación oral sólidas, tales como polvos, cápsulas blandas, cápsulas de gelatina, cápsulas, píldoras y comprimidos.
En una realización, el péptido se formula como una disolución acuosa estéril. En una realización, el péptido se formula en una formulación no lipídica. En otra realización, el péptido se formula en una formulación lipídica catiónica o no catiónica. En cualquier realización, la disolución acuosa estéril puede contener componentes activos o inactivos adicionales. Los componentes inactivos (“excipientes”) pueden incluir, pero sin limitarse a, sales, azúcares, agentes de carga, tensioactivos o tampones fisiológicamente compatibles.
Los péptidos o las composiciones de péptido de la presente divulgación pueden comprender o formularse o administrarse junto con uno o más agentes portadores. El agente portador puede ser una sustancia que se produce de manera natural, tal como una proteína (por ejemplo, albúmina sérica humana (HSA), lipoproteína de baja densidad (LDL) o globulina); un hidrato de carbono (por ejemplo, un dextrano, pululano, quitina, quitosano, inulina, ciclodextrina o ácido hialurónico); o lípido. La molécula portadora también puede ser una molécula recombinante o sintética, tal como un polímero sintético, por ejemplo, un poliaminoácido sintético. Los ejemplos de poliaminoácidos incluyen polilisina (PLL), poli(ácido L-aspártico), poli(ácido L-glutámico), copolímero de poli(L-lactida-co-glicolida), polietilenglicol (PEG), poli(alcohol vinílico) (PVA), poli(ácido 2-etilacrílico) y polímeros de N-isopropilacrilamida. Pueden identificarse otras moléculas portadoras útiles mediante métodos de rutina. Los conjugados de PEG pueden variar en tamaño (por ejemplo, 5.000 kD (5K), 10.000 kD (10K), 20.000 kD (20K), 40.000 kD (40K), etc.).
En una realización, la composición farmacéutica comprende el principio activo peptídico junto con etanol, mono-ditriglicéridos de aceite de maíz, aceite de ricino hidrogenado, DL-tocoferol, propilenglicol, gelatina, glicerol, colorantes, aromas y edulcorantes.
En otra realización, la composición farmacéutica comprende el principio activo peptídico junto con un agente de administración tal como ácido 4-(2-hidroxi-4-metoxibenzamido)butanoico (o cualquiera de los agentes de administración descritos en la patente estadounidense número 7.744.910B2), un tampón farmacéuticamente aceptable, un disgregante, hidroxipropilmetilcelulosa, colorantes, aromas y edulcorantes.
En otra realización, la composición farmacéutica comprende una mezcla del principio activo junto con etanol, fosfatidilcolina de soja, diolato de glicerol, que se inyecta en un exceso de solución salina tal como se describe en la solicitud de patente estadounidense 2008/0146490A1.
La administración de uno o más péptidos o péptidos cíclicos a un sujeto que lo necesita puede lograrse de varias maneras diferentes. La administración in vivo puede realizarse directamente administrando una composición que comprende un péptido cíclico a un sujeto. Alternativamente, la administración puede realizarse indirectamente administrando uno o más vectores que codifican y dirigen la expresión del péptido cíclico.
La administración local evita la permeabilidad intestinal y la exposición sistémica. Por ejemplo, los péptidos de la presente divulgación pueden usarse en el ojo como gotas o en la sección posterior del ojo mediante inyección directa. Pueden aplicarse en el intestino para seleccionar como diana enzimas. Pueden usarse de manera tópica en aplicaciones dermatológicas (por ejemplo, cremas, pomadas, parches transdérmicos) o aplicaciones oculares (por ejemplo, colirios).
Los péptidos o las composiciones de péptido de la presente divulgación pueden comprender o formularse con uno o más agentes fusogénicos. Un agente fusogénico de una composición descrita en el presente documento puede ser un agente que responde a, por ejemplo, cambia la carga según el entorno de pH. Al encontrarse con el pH de un endosoma, puede provocar un cambio físico, por ejemplo, un cambio en las propiedades osmóticas que altera o aumenta la permeabilidad de la membrana del endosoma. Preferiblemente, el agente fusogénico cambia la carga, por ejemplo, se protona, a un pH menor que el intervalo fisiológico. Por ejemplo, el agente fusogénico puede protonarse a pH 4,5-6,5. El agente fusogénico puede servir para liberar el polipéptido en el citoplasma de una célula después de que se capta la composición, por ejemplo, a través de endocitosis, por la célula, aumentando de ese modo la concentración celular del péptido en la célula.
En una realización, el agente fusogénico puede tener un resto, por ejemplo un grupo amino, que cuando se expone a un intervalo de pH especificado experimentará un cambio, por ejemplo, en la carga, por ejemplo protonación. El cambio en la carga del agente fusogénico puede desencadenar un cambio, por ejemplo un cambio osmótico, en una vesícula, por ejemplo una vesícula endocítica, por ejemplo un endosoma. Por ejemplo, el agente fusogénico, al exponerse al entorno de pH de un endosoma, provocará un cambio de solubilidad u osmótico lo suficientemente sustancial como para aumentar la porosidad (preferiblemente, hasta la rotura) de la membrana endosómica.
El agente fusogénico puede ser un polímero, preferiblemente una cadena de poliamino, por ejemplo, polietilenimina (PEI). la PEI puede ser lineal, ramificada, sintética o natural. La PEI puede ser, por ejemplo, PEI sustituida con alquilo o PEI sustituida con lípidos.
En otras realizaciones, el agente fusogénico puede ser polihistidina, poliimidazol, polipiridina, polipropilenimina, melitina o una sustancia de poliacetal, por ejemplo, un poliacetal catiónico. En alguna realización, el agente fusogénico puede tener una estructura de hélice alfa. El agente fusogénico puede ser un agente disruptivo de membrana, por ejemplo melitina.
Un experto en la técnica puede someter a prueba e identificar otros agentes fusogénicos adecuados.
Las composiciones de péptido de la presente divulgación pueden comprender o formularse con uno o más agentes de condensación. El agente de condensación de una composición descrita en el presente documento puede interaccionar con (por ejemplo, atrae, retiene o se une a) un péptido y actuar para (a) condensar, por ejemplo, reducir el tamaño o la carga del péptido y/o (b) proteger el péptido, por ejemplo, proteger el péptido frente a la degradación. El agente de condensación puede incluir un resto, por ejemplo, un resto cargado, que puede interaccionar con un péptido mediante interacciones iónicas. El agente de condensación será preferiblemente un polímero cargado, por ejemplo, una cadena policatiónica. El agente de condensación puede ser una polilisina (PLL), espermina, espermidina, poliamina, pseudopéptido-poliamina, poliamina peptidomimética, poliamina dendrímera, arginina, amidina, protamina, lípido catiónico, porfirina catiónica, sal cuaternaria de una poliaptina o un péptido de hélice alfa.
En una realización, las composiciones de péptido de la presente divulgación pueden formularse como péptidos bicíclicos. Como ejemplo no limitativo, los inhibidores de péptidos bicíclicos de calicreína pueden producirse en bibliotecas combinatorias (véase, por ejemplo, Baeriswyl et al., “Bicyclic Peptides with Optimized Ring Size Inhibit Human Plasma Kallikrein and its Orthologues While Sparing Paralogous Proteases”, ChemMedChem, 2012.
http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/cmde.201200071/abstract). Los péptidos bicíclicos pueden tener 2, 3, 4, 5, 6 aminoácidos o más por bucle.
Inhibidores de calicreína
En una realización, los péptidos cíclicos se unen y/o inhiben la actividad de calicreína plasmática. Los inhibidores de calicreína plasmática pueden encontrar utilidad en la eliminación o reducción de diversas isquemias, incluyendo pero sin limitarse a, pérdida de sangre perioperatoria, isquemia cerebral, el inicio de respuesta inflamatoria sistémica (RIS) y/o lesión por reperfusión, por ejemplo, lesión por reperfusión asociada con isquemia cerebral o una isquemia cerebral focal. Determinados inhibidores de calicreína plasmática se conocen en la técnica y se enseñan en las patentes estadounidenses n.os 6.333.402 y 6.057.287.
Los inhibidores de calicreína plasmática también pueden ser útiles en el tratamiento de trastornos seleccionados del grupo que consiste en artritis reumatoide, gota, enfermedad intestinal del intestino, mucositis oral, dolor neuropático, dolor inflamatorio, estenosis espinal, enfermedad degenerativa de la columna vertebral, trombosis arterial o venosa, íleo posoperatorios, aneurisma aórtico, osteoartritis, vasculitis, edemas (incluyendo, pero sin limitarse a, edema macular diabético, edema cerebral, edema intracerebral y edema inducido por radiación), hemorragia, embolia pulmonar, accidente cerebrovascular, coagulación en dispositivos de asistencia ventricular o endoprótesis, traumatismo craneal o edema cerebral peritumoral, sepsis, acontecimiento isquémico (accidente cerebrovascular) agudo de la arteria cerebral media (ACM), reestenosis (por ejemplo, después de angioplastia), nefritis por lupus eritematoso sistémico, lesión por quemaduras, embolia, hemorragia intracerebral (HIC), inflamación, infarto agudo de miocardio (IM), trombosis venosa profunda (TVP), coagulaciones de estados tras tratamiento fibrinolítico (por ejemplo, activador de plasminógeno tisular y estreptocinasa), angioedema de angina, inflamación articular, lesiones en lipopolisacáridos (LPS) diabetes y sus complicaciones, y retinopatía.
Una deficiencia genética en la proteína inhibidora de C1 (INH C1), el principal inhibidor natural de calicreína plasmática, conduce a angioedema hereditario (AEH). Los pacientes con AEH experimentan ataques agudos de edema doloroso a menudo precipitados por desencadenantes desconocidos (Zuraw B. L. et al., N Engl J Med 359, 1027-1036, 2008). Los inhibidores divulgados en el presente documento son particularmente útiles en el tratamiento de AEH o bien agudo o bien crónico.
Otros ejemplos de aplicaciones para los inhibidores de calicreína incluyen cirugía cardiaca pediátrica, trasplante de pulmón, artroplastia total de cadera y trasplante ortotópico de hígado, y para reducir o prevenir el accidente cerebrovascular perioperatorio durante IDAC y la oxigenación por membrana extracorporal (OMEC), y reducir o prevenir accidentes cerebrovasculares (ACV) durante estos procedimientos Los inhibidores de calicreína también pueden usarse para accidente cerebrovascular, por ejemplo, accidente cerebrovascular asociado con embolia, trombos y/o hemorragia y para lesiones por reperfusión asociadas con accidente cerebrovascular.
Permeabilidad vascular y retinopatía diabética
Las enfermedades que se han asociado con un aumento de la permeabilidad vascular (por ejemplo, permeabilidad vascular de la retina) incluyen, pero no se limitan a, diabetes (por ejemplo, diabetes mellitus tipo 1 o tipo 2), hipertensión, resistencia a la insulina, cetoacidosis, traumatismo, infección e hiperglucemia, retinopatía diabética (por ejemplo, retinopatía proliferativa o no proliferativa), edema, angioedema hereditario (AEH), edema en el cerebro, incluyendo, pero sin limitarse a, edema cerebral (por ejemplo, edema de gran altura), hemorragia, hemorragia intracerebral, hemorragia subdural, hemorragia subaracnoidea, accidente cerebrovascular hemorrágico, transformación hemorrágica del accidente cerebrovascular isquémico, permeabilidad vascular asociada con hipertensión o inflamación, aumento de la permeabilidad vascular sistémica, por ejemplo, asociada con choque séptico, escorbuto, anafilaxia, angioedema hereditario o adquirido (habiéndose relacionado ambos con deficiencia de inhibidor de C1), aneurisma cerebral y anomalía arteriovenosa. El edema cerebral es un aumento del volumen cerebral provocado por un aumento absoluto del contenido de líquido del tejido cerebral; el edema cerebral vasogénico surge de un escape transvascular provocado por un fallo mecánico de las uniones estrechas endoteliales de la barrera hematoencefálica (BHE). En algunos casos, el edema cerebral puede estar provocado por una gran altura (por ejemplo, una transición rápida hasta al menos 8.000 pies (2438 m) sobre el nivel del mar).
La calicreína puede usarse como una diana terapéutica para personas con retinopatía diabética, ya que se ha demostrado que la calicreína contribuye a un aumento del escape de los vasos sanguíneos y al engrosamiento de la retina, que es una de las principales causas de retinopatía diabética. La retinopatía diabética se caracteriza por alteraciones progresivas y graduales en la microvasculatura retiniana que conducen a áreas de ausencia de perfusión retiniana, aumento de la permeabilidad vascular y proliferación intraocular patológica de vasos retinianos. Tal como se usa en el presente documento, “permeabilidad vascular” se refiere al paso de sustancias, incluidas moléculas, partículas y células, a través del endotelio vascular. Los trastornos asociados con edema y/o una permeabilidad vascular excesiva en el ojo, por ejemplo, en la retina o el cuerpo vítreo, incluyen, pero no se limitan a, degeneración macular asociada a la edad (DMAE), edema retiniano, hemorragia retiniana, hemorragia vítrea, edema macular (EM), edema macular diabético (EMD), retinopatía diabética proliferativa (RDP) y retinopatía diabética no proliferativa (RD), retinopatía por radiación, telangiectasia, retinopatía serosa central, oclusiones venosas retinianas (por ejemplo, oclusiones venosas de rama o centrales), retinopatía por radiación, retinopatía de células falciformes, retinopatía del prematuro, enfermedad de Von Hipple-Lindau, uveítis posterior, desprendimiento de retina crónico, síndrome de Irvine-Gass, enfermedad de Eals, retinitis y coroiditis.
Los aumentos de la velocidad o cantidad de dicho paso (es decir, aumento de permeabilidad vascular) pueden ser indicativos de los estados patológicos descritos en el presente documento. Las complicaciones asociadas con el aumento de la permeabilidad vascular en la mácula (denominado edema macular) y la neovascularización descontrolada (denominada retinopatía diabética proliferativa) pueden dar como resultado una pérdida visual grave y permanente. La retinopatía diabética avanza de modo predecible a través de estadios claramente definibles. Se divide en dos amplias categorías, la retinopatía diabética no proliferativa (RDNP) y la retinopatía diabética proliferativa (RDP) y se subdivide por nivel de gravedad.
El edema macular diabético (EMD) es una causa importante de pérdida visual moderada y ceguera legal en personas con diabetes tipo 2 (Javitt et al., Diabetes Care. 17:909-917 (1994)). Del 20 al 25% de los al menos 346 millones de diabéticos en todo el mundo desarrollarán EMD. El EMD puede producirse en cualquier nivel de RDNP o RDP. El EMD se desarrolla cuando una ruptura de la barrera hematorretiniana permite que se escapen líquido y otros componentes plasmáticos desde los vasos sanguíneos hacia la retina. La ruptura de la barrera hematorretiniana, que puede detectarse como un aumento de la permeabilidad vascular, puede observarse en la retina de diabéticos antes de que se vean otros cambios retinopáticos. Se ha demostrado que la activación de la precalicreína da como resultado un aumento de la permeabilidad vascular de la retina, en el que cuanto mayor es la permeabilidad vascular de la retina, mayores son las posibilidades de progresión de EMD y, en última instancia, la pérdida de visión.
Los inhibidores de calicreína descritos en el presente documento pueden usarse para disminuir el escape de vasos sanguíneos y adelgazar la retina como método para tratar y/o prevenir la retinopatía diabética. Los inhibidores de calicreína pueden usarse en combinación con los tratamientos y las terapias actuales para EMD tales como, pero sin limitarse a, fotocoagulación con láser, fotocoagulación con láser e inyecciones de Lucentis, agentes anti-VEGF y terapia de implante y/o intravítrea con corticosteroides, implantes de esteroides intravítreos, combinaciones de fotocoagulación con láser con farmacoterapia, colirios que contienen un antagonista de molécula pequeña del receptor de bradiquinina B1, inyección intravítrea única de una composición farmacéutica que contiene un inhibidor de calicreína, y una composición farmacéutica oral que contiene un inhibidor de calicreína plasmática de molécula pequeña.
La administración tópica puede ser particularmente útil para tratar el EMD. En esta realización, el péptido puede inyectarse directamente en la cámara posterior (por vía intravítrea) del ojo. El péptido puede estar en un depósito o incrustado en una micropartícula o nanopartícula de polímero biodegradable. Los péptidos pueden usarse en combinación con terapias aprobadas para EMD y/o degeneración macular asociada a la edad húmeda, tal como Lucentis® (Roche-Genentech-Novartis) o Eylea™ (Regeneron-Bayer) para aumentar la eficacia de los productos aprobados.
En el AEH, la regulación normal de la actividad de calicreína plasmática y la cascada clásica del complemento no están presentes y la actividad no regulada de calicreína plasmática da como resultado una generación excesiva de bradiquinina. Los inhibidores de calicreína de la presente divulgación pueden usarse para aliviar el edema en pacientes con AEH y pueden inhibir adicionalmente la producción de bradiquinina para aliviar el edema en pacientes con AEH. Para el tratamiento de AEH, los inhibidores de calicreína de la presente divulgación pueden administrarse mediante un método tal como, pero sin limitarse a, vía oral, parenteral, de depósito, transdérmica o cualquier otra vía adecuada que logre una exposición sistémica adecuada. Los péptidos pueden usarse con otros medicamentos, por ejemplo, esteroides (danazol, oxandrolona y estanozolol) y medicamentos analgésicos usados frecuentemente para tratar el AEH, y pueden usarse con otros productos aprobados para el tratamiento de AEH [por ejemplo KALBITOR® (Dyax Corp., Burlington MA), FIRAZYR® (Shire, Dublín, Irlanda), Berinert® (CSL Behring, Prussia, PA) o CINRYz E™ (ViroPharma, Exton, PA)] para aumentar la eficacia de los productos aprobados.
Procedimientos quirúrgicos
El tratamiento de una respuesta inflamatoria sistémica inducida por la calicreína con inhibidores de calicreína puede ser especialmente beneficioso, por ejemplo, en pacientes que se someten a procedimientos quirúrgicos tales como, pero sin limitarse a, intervenciones que implican cirugía cardiotorácica, por ejemplo, intervenciones de derivación cardiopulmonar (DCP) e injerto de derivación de arteria coronaria (IDAC). La cirugía cardiotorácica se refiere generalmente a la cirugía del área del tórax tal como, pero sin limitarse a, la cirugía del corazón y los pulmones. Las enfermedades que pueden tratarse mediante cirugía cardiotorácica incluyen, pero no se limitan a, arteriopatía coronaria, tumores y cánceres de pulmón, esófago y pared torácica, anomalías de válvulas y vasos cardiacos, y defectos congénitos que implican al tórax o el corazón. Cuando la cirugía cardiotorácica se usa para tratamiento, existe un riesgo de pérdida de sangre (por ejemplo, isquemia inducida por la cirugía) y un riesgo de aparición de respuesta inflamatoria sistémica (RIS) que puede dar como resultado disfunción orgánica grave (por ejemplo, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica (SRIS)).
El uso de inhibidores de calicreína para tratar y/o prevenir la pérdida de sangre perioperatoria y reducir el flujo sanguíneo cardiaco puede ser útil, ya que se realizan varios procedimientos quirúrgicos altamente invasivos cada día que dan como resultado pérdida de sangre o ponen a los pacientes en un alto riesgo de pérdida de sangre. Los procedimientos quirúrgicos que implican pérdida de sangre incluyen, pero no se limitan a, aquellas que implican métodos de circulación extracorporal tales como la cirugía cardiotorácica, por ejemplo, DCP. En tales métodos, se detiene el corazón de un paciente y se llevan a cabo la circulación, oxigenación y mantenimiento de la volemia usando medios artificiales mediante un circuito extracorporal y un oxigenador de membrana sintética. Adicionalmente, con la cirugía cardiotorácica, por ejemplo, DCP y/o cirugía que implica un traumatismo extenso en el hueso tal como, pero sin limitarse a, los procedimientos de artroplastia de cadera y la hendidura esternal necesaria en IDAC, el contacto de la sangre de un paciente con las superficies cortadas del hueso y/o el equipo de DCP puede ser suficiente para activar una o varias respuestas en cascada no deseadas que pueden dar como resultado una variedad de alteraciones en la sangre y la vasculatura. Tales respuestas incluyen, pero no se limitan a, una respuesta del sistema de activación por contacto (SAC), que puede conducir a una pérdida de sangre perioperatoria extensa que puede requerir una transfusión de sangre inmediata, así como una respuesta inflamatoria sistémica (RIS), que puede dar como resultado, a su vez, daño permanente en los tejidos y órganos de un paciente.
Por ejemplo, los procedimientos de IDAC pueden usarse en el tratamiento de la arteriopatía coronaria (APC) aterosclerótica para unir el vaso sanguíneo ocluido y restaurar la sangre al corazón. La APC por aterosclerosis provoca un estrechamiento de la luz de una o varias de las arterias coronarias, lo que limita el flujo de sangre al miocardio (es decir, el músculo cardiaco) y puede provocar angina, insuficiencia cardiaca e infartos de miocardio. En el estadio terminal de la aterosclerosis de las arterias coronarias, la circulación coronaria puede ocluirse casi por completo, provocando insuficiencia cardiaca o angina potencialmente mortal, con una mortalidad muy alta. Los procedimientos de IDAC se encuentran entre las cirugías más invasivas en las que se implantan una o más venas o arterias sanas para proporcionar una “derivación” (bypass) alrededor del área ocluida del vaso afectado. A pesar de estos resultados muy alentadores, con frecuencia es necesario repetir los procedimientos de IDAC, tal como se indica mediante un aumento del número de pacientes que se someten eventualmente a un segundo e incluso un tercer procedimiento y la morbimortalidad perioperatoria observada en los procedimientos primarios de IDAC aumenta cuando se realiza el procedimiento por segunda y tercera vez.
Casi todos los procedimientos de IDAC realizados para cardiopatía valvular y/o congénita, trasplante de corazón y procedimientos aórticos mayores, todavía se llevan a cabo en pacientes soportados por DCP. En la DCP, se insertan cánulas grandes en los grandes vasos de un paciente para permitir el bombeo mecánico y la oxigenación de la sangre usando un oxigenador de membrana. La sangre se devuelve al paciente sin fluir a través de los pulmones, ya que los pulmones se hipoperfunden durante este procedimiento. La DCP se ha usado extensamente en una variedad de procedimientos realizados durante casi medio siglo con resultados exitosos. La interacción entre las superficies artificiales, las células sanguíneas, las proteínas sanguíneas, el endotelio vascular dañado y los tejidos extravasculares, tal como el hueso, altera la hemostasia y con frecuencia activa el SAC, que, tal como se señaló anteriormente, puede dar como resultado una variedad de alteraciones en la sangre y la vasculatura. Tal alteración conduce a un sangrado perioperatorio excesivo, que puede requerir una transfusión de sangre inmediata. Una consecuencia de la circulación de sangre completa a través de un circuito extracorporal en DCP también puede incluir la activación de la respuesta inflamatoria sistémica (RIS), que se inicia mediante la activación por contacto de los sistemas de coagulación y del complemento.
Gran parte de la morbimortalidad asociada con los procedimientos quirúrgicos de DCP es el resultado de los efectos de activación de la coagulación, fibrinólisis o sistemas del complemento. Tal activación puede dañar el aparato respiratorio, lo que conduce al síndrome de dificultad respiratoria del adulto (SDRA), deterioro de la circulación renal y esplácnica, y la inducción de una coagulopatía generalizada que conduce a la pérdida de sangre y la necesidad de transfusiones. Además, las patologías asociadas con RIS incluyen, pero no se limitan a, déficits neurocognitivos, accidente cerebrovascular, insuficiencia renal, infarto agudo de miocardio y daño al tejido cardiaco puede observarse con la activación de los sistemas de coagulación, fibrinólisis o del complemento.
La administración de transfusiones de sangre eleva el coste de IDAC u otros procedimientos similares que requieren DCP y también presentan un riesgo significativo de infección. En ausencia de cualquier intervención farmacológica, normalmente deben emplearse de tres a siete unidades de sangre en un paciente, incluso con excelentes técnicas quirúrgicas. Por consiguiente, existe un incentivo considerable para el desarrollo de compuestos farmacológicamente nuevos y mejorados para reducir, tratar y/o prevenir la hemorragia perioperatoria y la RIS en pacientes sometidos a procedimientos tales como, pero sin limitarse a, DCP e IDAC. El uso de los inhibidores de calicreína descritos en el presente documento puede mejorar estos diversos procedimientos y también puede conducir a la mejora de los síntomas no deseados que pueden aparecer con estos procedimientos.
Isquemia cerebral y lesión por reperfusión
Los inhibidores de calicreína descritos en el presente documento pueden ser útiles para reducir y/o prevenir la isquemia cerebral, así como la lesión por reperfusión asociada con la isquemia cerebral. Un estado isquémico en el que el riego sanguíneo al cerebro está bloqueado puede conocerse como accidente isquémico cerebral y/o isquemia cerebral. Esta interrupción del riego sanguíneo al cerebro puede ser el resultado de una variedad de causas incluyendo, pero sin limitarse a, un bloqueo o una oclusión intrínsecos del vaso sanguíneo, una fuente de oclusión originada de forma remota, una presión de perfusión disminuida o una viscosidad sanguínea aumentada que da como resultado una disminución del flujo sanguíneo cerebral o ruptura o escape de vasos sanguíneos en el espacio subaracnoideo o tejido intracerebral. La isquemia cerebral puede dar como resultado déficits transitorios o permanentes y la gravedad del daño neurológico en un paciente que ha experimentado isquemia cerebral depende de la intensidad y la duración del acontecimiento de isquemia. Un accidente isquémico transitorio (AIT) es aquel en el que el flujo sanguíneo al cerebro se interrumpe brevemente y provoca déficits neurológicos temporales. Los síntomas de AIT incluyen entumecimiento o debilidad de la cara o las extremidades, pérdida de la capacidad de hablar con claridad y/o comprender el habla de los demás, pérdida de visión u oscurecimiento de la visión y mareos. Los accidentes de isquemia cerebral permanentes, también conocidos como accidentes cerebrovasculares, están provocados por una interrupción más prolongada del flujo sanguíneo al cerebro como resultado de una embolia, un trombo o sangrado en el cerebro (por ejemplo, una hemorragia). Los términos “accidente cerebrovascular tromboembólico” o “tromboembolia” tal como se usan en el presente documento para referirse a un accidente cerebrovascular que ha estado provocado por una trombosis o una embolia. Un accidente cerebrovascular provoca una pérdida de neuronas que puede dar como resultado un déficit neurológico que puede mejorar, pero no se resolverá por completo. Los inhibidores de calicreína descritos en el presente documento pueden ser útiles para prevenir y/o reducir el cambio de un accidente cerebrovascular incluyendo, pero sin limitarse a, accidentes cerebrovasculares embólicos, trombóticos, tromboembólicos y asociados a hemorragia.
Los accidentes cerebrovasculares pueden ser el resultado de una variedad de causas. Una categoría de accidentes cerebrovasculares incluye accidentes cerebrovasculares perioperatorios que pueden estar asociados con la formación de trombos o embolia. En pacientes con accidente cerebrovascular, existe un núcleo del déficit neurológico marcado por isquemia total y/o necrosis tisular. Esta área normalmente está rodeada por tejido isquémico, denominado penumbra isquémica, que recibe circulación colateral. La isquemia en la penumbra no siempre da como resultado daños irreversibles. En algunos casos, la restauración del flujo sanguíneo (reperfusión) en la penumbra puede prevenir la isquemia y necrosis totales en esta área. Sin embargo, la reperfusión también se ha asociado con lesiones en el tejido que rodea el núcleo.
Una vez que se devuelve el flujo sanguíneo, células sanguíneas tales como neutrófilos, atacan el tejido dañado, lo que provoca a su vez inflamación y/o daño adicional. La lesión por reperfusión se asocia con un flujo de entrada de neutrófilos al tejido afectado y la posterior activación de los neutrófilos. Los neutrófilos pueden liberar enzimas líticas que inducen directamente daño al tejido y mediadores proinflamatorios tales como citocinas que amplifican la reacción inflamatoria local. El flujo de entrada de neutrófilos a un sitio de daño isquémico también puede obstruir los capilares y provocar vasoconstricción. Se ha encontrado que la calicreína desempeña un papel en la quimiotaxia de neutrófilos, la activación de neutrófilos y la lesión por reperfusión. Por tanto, los inhibidores de calicreína descritos en el presente documento pueden usarse para prevenir y/o reducir la lesión por reperfusión y pueden detener y/o dificultar la cascada isquémica. Como ejemplo no limitativo, la lesión por reperfusión puede reducirse y/o prevenirse usando inhibidores de calicreína para reducir y/o prevenir uno o más de: infiltración de neutrófilos, activación de neutrófilos, liberación de citocinas, liberación de elastasa, vasodilatación, edema cerebral, volumen de infarto y déficits neurológicos.
En indicaciones quirúrgicas, accidente cerebrovascular y hemorragia intracerebral, la administración local o sistémica de los inhibidores de calicreína descritos en el presente documento puede ser una opción de tratamiento eficaz. Para la administración local, los péptidos pueden incrustarse en esponjas, láminas y películas para optimizar el contacto vascular.
En el presente documento, se describe una variedad de inhibidores de una calicreína, por ejemplo una calicreína plasmática, que pueden ser útiles en el tratamiento de lo anterior.
En una realización, los inhibidores de calicreína descritos en el presente documento pueden incluir una modificación terminal en los extremos N o C-terminal con la adición de 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 residuos o más. En una realización adicional, la modificación terminal en los extremos N o C-terminal puede incluir la adición de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 residuos o más y una cisteína en la región terminal.
En una realización, los inhibidores de calicreína descritos en el presente documento pueden incluir al menos 1, al menos 2 o al menos 3 residuos de cisteína. En una realización adicional, los inhibidores de calicreína pueden contener una modificación terminal en los extremos N o C-terminal y pueden incluir la adición de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 residuos o más y una cisteína en la región terminal. La modificación terminal y/o la adición de una cisteína en la región terminal puede mejorar la actividad farmacológica tal como, pero sin limitarse a, la potencia de los inhibidores de calicreína. Como ejemplo no limitativo, los inhibidores de calicreína descritos en las tablas 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 9 pueden incluir una modificación terminal de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 residuos o más en el extremo N-terminal en la que uno de los residuos adicionales es cisteína para mejorar la potencia.
Métodos para el tratamiento de enfermedades.
La divulgación se refiere, en particular, al uso de péptidos o peptidomiméticos, a menudo cíclicos, y a composiciones que contienen al menos un péptido, para el tratamiento de un trastorno, estado o una enfermedad.
Tal como se usa en el presente documento, los términos “tratar”, “tratamiento” y similares, se refieren al remedio o al alivio de procesos patológicos. En el contexto de la presente divulgación, en la medida en que se refiere a cualquiera de los otros estados enumerados a continuación, los términos “tratar”, “tratamiento” y similares significan remediar o aliviar al menos un síntoma asociado con tal estado, o ralentizar o revertir la progresión o la progresión anticipada de tal estado, tal como ralentizar la progresión de una neoplasia maligna o un cáncer, o aumentar la eliminación de un organismo infeccioso para aliviar/reducir los síntomas provocados por la infección, por ejemplo, hepatitis provocada por infección con un virus de la hepatitis.
Por “disminuir” o “reducir” en el contexto de un marcador de enfermedad o síntoma se entiende una disminución estadísticamente significativa de tal nivel. La disminución puede ser, por ejemplo, de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40% o más, y preferiblemente es menor que un nivel aceptado dentro del intervalo normal para un individuo sin tal trastorno.
Por “aumento” o “elevación” en el contexto de un marcador de enfermedad o síntoma se entiende un aumento estadísticamente significativo de tal nivel. El aumento puede ser, por ejemplo, de al menos el 10%, al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40% o más, y es preferiblemente hasta un nivel aceptado dentro del intervalo normal para un individuo sin tal trastorno.
Tal como se usa en el presente documento, las expresiones “cantidad terapéuticamente eficaz” y “cantidad profilácticamente eficaz” se refieren a una cantidad que proporciona un beneficio terapéutico en el tratamiento, la prevención o el manejo de procesos patológicos o un síntoma manifiesto de uno o más procesos patológicos. La cantidad específica que es terapéuticamente eficaz puede determinarla fácilmente un facultativo médico habitual, y puede variar dependiendo de factores conocidos en la técnica, tales como, por ejemplo, el tipo de procesos patológicos, la historia y edad del paciente, el estadio de los procesos patológicos y la administración de otros agentes que inhiben los procesos patológicos.
Tal como se usa en el presente documento, una “composición farmacéutica” comprende una cantidad farmacológicamente eficaz de un péptido y un portador farmacéuticamente aceptable. Tal como se usa en el presente documento, “cantidad farmacológicamente eficaz”, “cantidad terapéuticamente eficaz” o simplemente “cantidad eficaz” se refiere a aquella cantidad de un péptido eficaz para producir el resultado farmacológico, terapéutico o preventivo pretendido. Por ejemplo, si un tratamiento clínico dado se considera eficaz cuando hay al menos una alteración (aumento o disminución) del 10% en un parámetro medible asociado con una enfermedad o un trastorno, una cantidad terapéuticamente eficaz de un fármaco para el tratamiento de esa enfermedad o ese trastorno es la cantidad necesaria para efectuar una alteración de al menos el 10% en ese parámetro. Por ejemplo, una cantidad terapéuticamente eficaz de un péptido puede ser aquella que altere la unión de una diana a su pareja de unión natural en al menos el 10%.
El término “portador farmacéuticamente aceptable” se refiere a un portador para la administración de un agente terapéutico. Tales portadores incluyen, pero no se limitan a, solución salina, solución salina tamponada, dextrosa, agua, glicerol, etanol, y combinaciones de los mismos. El término excluye específicamente el medio de cultivo celular. Para los fármacos administrados por vía oral, los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, excipientes farmacéuticamente aceptables tales como diluyentes inertes, agentes disgregantes, agentes aglutinantes, agentes lubricantes, agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y conservantes. Los diluyentes inertes adecuados incluyen carbonato de sodio y calcio, fosfato de sodio y calcio y lactosa, mientras que el almidón de maíz y el ácido algínico son agentes disgregantes adecuados. Los agentes aglutinantes pueden incluir almidón y gelatina, mientras que el agente lubricante, si está presente, será generalmente estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Si se desea, los comprimidos pueden recubrirse con un material tal como monoestearato de glicerilo o diestearato de glicerilo, para retrasar la absorción en el tracto gastrointestinal. Los agentes incluidos en las formulaciones farmacológicas se describen adicionalmente a continuación en el presente documento.
La eficacia del tratamiento o la mejora de la enfermedad puede evaluarse, por ejemplo, midiendo la progresión de la enfermedad, la remisión de la enfermedad, la intensidad de los síntomas, la reducción del dolor, la calidad de vida, la dosis de un medicamento requerida para mantener el efecto del tratamiento, el nivel de un marcador de enfermedad o cualquier otro parámetro medible apropiado para una enfermedad dada que esté tratándose o seleccionada como diana para la prevención. Está dentro de la capacidad de un experto en la técnica monitorizarla eficacia del tratamiento o la prevención midiendo uno cualquiera de tales parámetros, o cualquier combinación de parámetros. En relación con la administración de un péptido o una composición farmacéutica del mismo, “eficaz contra” una enfermedad o un trastorno indica que la administración de una manera clínicamente apropiada da como resultado un efecto beneficioso para al menos una fracción estadísticamente significativa de pacientes, tal como una mejora de los síntomas, una cura, una reducción de la carga patológica, reducción de la masa tumoral o del número de células, prolongación de la vida, mejora en la calidad de vida u otro efecto reconocido generalmente como positivo por los médicos familiarizados con el tratamiento del tipo particular de enfermedad o trastorno.
Un efecto preventivo o de tratamiento es evidente cuando hay una mejora estadísticamente significativa en uno o más parámetros del estado patológico, o por una ausencia de empeoramiento o desarrollo de síntomas cuando se anticiparían si no. Como ejemplo, un cambio favorable de al menos el 10% en un parámetro medible de la enfermedad, y preferiblemente al menos el 20%, el 30%, el 40%, el 50% o más puede ser indicativo de un tratamiento eficaz. La eficacia de un fármaco o una formulación de péptido dada de ese fármaco también puede considerarse usando un modelo de animal de experimentación para la enfermedad dada tal como se conoce en la técnica. Cuando se usa un modelo de animal de experimentación, la eficacia del tratamiento se evidencia cuando se observa una reducción estadísticamente significativa de un marcador o síntoma.
El péptido y un agente terapéutico adicional pueden administrarse en combinación en la misma composición, por ejemplo, por vía parenteral, o el agente terapéutico adicional puede administrarse como parte de una composición independiente o mediante otro método descrito en el presente documento.
Dosificación y administración
Para su uso como tratamiento de sujetos humanos, los péptidos pueden formularse como composiciones farmacéuticas. Dependiendo del sujeto que vaya a tratarse, el modo de administración y el tipo de tratamiento deseado (por ejemplo, prevención, profilaxis o terapia), los péptidos se formulan de manera acorde con estos parámetros. Un resumen de tales técnicas se encuentra en Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21a edición, Lippincott Williams & Wilkins, (2005); y Encyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick y J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, Nueva York.
Las composiciones de la presente divulgación se proporcionan preferiblemente en una cantidad terapéuticamente eficaz, que puede ser, por ejemplo, una cantidad diaria de desde 1 mg hasta 1.600 mg, más preferiblemente de 10 mg a 800 mg, e incluso más preferiblemente de 100 mg a 400 mg. En una realización, una composición farmacéutica comprende una cápsula, por ejemplo en forma de dosificación unitaria.
Formas de dosificación unitaria
Los péptidos de la divulgación pueden estar presentes en cantidades que ascienden al 1-95% en peso del peso total de la composición. La composición puede proporcionarse en una forma de dosificación que sea adecuada para administración oral. Por tanto, la composición farmacéutica puede estar en forma de, por ejemplo, cápsulas duras (por ejemplo, cápsulas de gelatina dura o cápsulas de hidroxipropil-metilcelulosa dura), cápsulas de gelatina blanda, comprimidos, comprimidos oblongos, comprimidos con recubrimiento entérico, comprimidos masticables, cápsulas de gelatina dura con recubrimiento entérico, cápsulas de gelatina blanda con recubrimiento entérico, minicapsulas, pastillas para chupar, películas, tiras, cápsulas de gelatina, grageas, disoluciones, emulsiones, suspensiones, jarabes o pulverizaciones.
A los pacientes se les puede administrar una cantidad terapéutica de un péptido, tal como 0,01 mg/kg, 1,0 mg/kg o 15mg/kg. Para la administración a sujetos humanos, la dosificación de péptidos de la presente divulgación es normalmente de 0,01 a 15 mg/kg, más preferiblemente de 3 a 5 mg/kg. Sin embargo, los niveles de dosificación pueden depender en gran medida de la naturaleza del estado, la eficacia del fármaco, el estado del paciente, el criterio del facultativo y la frecuencia y el modo de administración.
En otras realizaciones, los péptidos se administran a una frecuencia de, por ejemplo, cada 4 h, cada 6 h, cada 12 h, cada 18 h, cada 24 h, cada 36 h, cada 72 h, cada 84 h, cada 96 h, cada 5 días, cada 7 días, cada 10 días, cada 14 días, cada 3 semanas o más. Las composiciones pueden administrarse una vez al día o el péptido puede administrarse como dos, tres o más subdosis a intervalos apropiados en todo el día o a través de una formulación de liberación controlada. En ese caso, el péptido contenido en cada subdosis debe ser correspondientemente más pequeño para lograr la dosis diaria total. La unidad de dosificación también puede combinarse para la administración durante varios días, por ejemplo, usando una formulación de liberación sostenida convencional, que proporciona la liberación sostenida del péptido a lo largo de un periodo de varios días.
Las formulaciones de liberación sostenida se conocen bien en la técnica y son particularmente útiles para la administración de agentes a un sitio particular, tal como podría usarse con las composiciones de péptido de la presente divulgación. El efecto de una dosis única puede ser duradero, de tal manera que las dosis posteriores se administran a intervalos de no más de 3, 4 ó 5 días, o a intervalos de no más de 1, 2, 3 ó 4 semanas.
El péptido puede administrarse mediante infusión intravenosa a lo largo de un periodo de tiempo, tal como a lo largo de un periodo de 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos o 25 minutos. La administración puede repetirse, por ejemplo, de forma regular, tal como quincenalmente (es decir, cada dos semanas) durante un mes, dos meses, tres meses, cuatro meses o más. Después de un régimen de tratamiento inicial, los tratamientos pueden administrarse con menos frecuencia. Por ejemplo, después de la administración quincenal durante tres meses, la administración puede repetirse una vez al mes, durante seis meses o un año o más. La administración del péptido o la composición puede reducir, disminuir, aumentar o alterar la unión o cualquier proceso fisiológicamente perjudicial, por ejemplo, en una célula, un tejido, sangre, orina u otro compartimento de un paciente en al menos el 10%, al menos el 15%, al menos el 20%, al menos el 25%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% o más.
Antes de la administración de una dosis completa del péptido o la composición, a los pacientes se les puede administrar una dosis más pequeña, tal como una reacción de infusión al 5%, y monitorizar sus efectos adversos, tal como una reacción alérgica, o niveles elevados de lípidos o tensión arterial elevada. En otro ejemplo, el paciente puede monitorizarse para detectar efectos inmunoestimuladores no deseados, tales como niveles elevados de citocinas (por ejemplo, TNF-alfa o INF-alfa).
La predisposición genética desempeña un papel en el desarrollo de algunas enfermedades o trastornos. Por tanto, un paciente que necesita un péptido o una composición de péptido puede identificarse elaborando una historia familiar o, por ejemplo, examinando una o más variantes o marcadores genéticos. Un proveedor de atención sanitaria, tal como un médico, una enfermera o un miembro de la familia, puede elaborar una historia familiar antes de prescribir o administrar una composición terapéutica de la presente invención. Por ejemplo, una deficiencia genética de la proteína inhibidora de C-1 conduce a y angioedema hereditario. También puede realizarse un análisis de sangre en el paciente para determinar si el paciente tiene deficiencia de inhibidor de C-1 antes de administrar un péptido al paciente.
Kits
Cualquiera de las composiciones descritas en el presente documento puede estar comprendida en un kit. En un ejemplo no limitativo, los péptidos pueden incluirse en un kit para tratar una enfermedad. El kit puede incluir un vial de polvo de péptido seco y estéril, disolución estéril para disolver el polvo secado y una jeringa para equipo de infusión para administrar el péptido.
Cuando los péptidos se proporcionan como un polvo seco, se contempla que se proporcionen entre 10 microgramos y 1000 miligramos, o al menos o como máximo esas cantidades de péptidos en kits de la invención.
El medio de recipiente incluirá generalmente al menos un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa y/u otro medio de recipiente, en el que se colocan las formulaciones de péptido, preferiblemente, asignadas adecuadamente. Los kits también pueden comprender un segundo medio de recipiente para contener un tampón estéril, farmacéuticamente aceptable y/u otro diluyente.
Un kit puede incluir instrucciones para emplear los componentes del kit, así como el uso de cualquier otro reactivo no incluido en el kit. Las instrucciones pueden incluir variaciones que pueden implementarse.
Aunque se han mostrado y descrito en particular diversas realizaciones de la invención, los expertos en la técnica entenderán que pueden realizarse diversos cambios en la forma y los detalles sin apartarse del espíritu y el alcance de la invención tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.
Ejemplos
Ejemplo 1. Activación de precalicreína humana por el factor alfa-XIIa humano
Se activó precalicreína (Enzyme Research Laboratories, HPK 1302) por factor alfa-XIIa humano (Enzyme Research Laboratories, HFXIIa 1212a) a una razón molar de 80:1 en Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM y Tween-20 al 0,02% durante 10 minutos a 37°C. Se extinguió la reacción con NaOAc 0,1 M, se dializó durante una noche a 4°C en NaOAc 10 mM, NaCl 150 mM, pH 5,2 y se almacenó a -80°C.
Ejemplo 2. Aislamiento y activación de calicreína plasmática recombinante
Según la presente divulgación, se purifica en la proforma un fragmento de calicreína plasmática humana expresado de manera recombinante (expresado como fragmento Gly20-Ala638 en la línea celular de mieloma murino derivada de NS0 correspondiente a la proforma sin péptido señal) con una cola de His C-terminal (número de registro Swiss-Prot P03952). La activación (por ejemplo, con termolisina o factor XIIa) se lleva a cabo convirtiendo la proforma en una cadena pesada y una ligera que están unidas por enlaces disulfuro. La posterior biotinilación se lleva a cabo entonces usando sulfo-NHS-LC-biotina.
Ejemplo 3. Biotinilación a gran escala de calicreína plasmática
Se usó calicreína plasmática activada (pKAL) a 3,7 |iM (0,31 mg/ml) en tampón ácido acético pH 5,2 para producir pKAL biotinilada. Se preparó recientemente sulfo-NHS-LC-biotina (Thermo Scientific n.° 21327) según las instrucciones del fabricante. Se usó un exceso molar de diez veces de sulfo-NHS-LC_biotina con respecto a la proteína pKAL basándose en las pruebas piloto.
Las concentraciones finales en la mezcla de reacción fueron pKAL 2,47 |iM y sulfo-NHS-LC-biotina 24,7 |iM en tampón fosfato de sodio 10 mM, pH 8,0. Se añadieron alícuotas de la muestra a 12 tubos de 100 |il y se incubaron a 4°C durante 2 horas. Se detuvo la reacción mediante la adición de Tris-HCl 1 M pH 7,5 a una concentración final de 0,16 M en cada tubo y se incubó en hielo durante 10 minutos. Entonces se dializó la pKAL biotinilada en acetato 10 mM y NaCl 150 mM, pH 5,3 durante la noche a 4°C. Después de la diálisis, se determinó la eficiencia de la biotinilación usando resina Sa Ultralink (Thermo Scientific n.° 53114) para extraer la biotina-pKAL y se estimó la concentración ejecutando cantidades conocidas de pKAL en un gel de Bis-Tris al 4-12% (Invitrogen n.° NP0322BOX). Se tomaron alícuotas de la pKAL biotinilada y se almacenaron a -80°C.
Ejemplo 4. Ensayo de inhibición enzimática
Se hizo reaccionar calicreína plasmática humana activada (Enzyme Research Laboratories, HPKa 1303) con H-Pro-Phe-Arg-7-amido-4-metilcumarina (H-Pro-Pre-Arg-AMC) (un sustrato fluorogénico para calicreína plasmática así como pancreática y urinaria; Bachem I-1295) y péptidos inhibidores candidatos para determinar la CI50 del inhibidor
Se realizaron diez diluciones en serie de péptidos de 8 veces (disoluciones madre en DMSO 10 mM) en DMSO y luego se añadieron a TCNB (Tris-HCl 50 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM, Brij-35 al 0,05%) y se sonicaron. Se añadieron 50 |il de las diluciones de péptidos a placas de microtitulación (96 pocillos, superficie de color negro sin unión, Corning, 3650) y se incubaron durante 5 minutos a temperatura ambiente con calicreína humana activada 4 nM (concentración final después de la adición de sustrato fluorogénico: 1 nM). Se incubaron las muestras durante 1 hora a temperatura ambiente con H-Pro-Phe-Arg-AMC 2 mM (concentración final de 500 |iM). Se midieron las unidades relativas de fluorescencia (URF) en excitación/emisión a 360 nm/460 nm mediante un lector SpectraMax M3.
Ejemplo 5. Actividad de pKAL biotinilada
Se incubaron pKAL biotinilada y no biotinilada con H-Pro-Phe-Arg-7-amido-4-metilcumarina (H-Pro-Pre-Arg-AMC) (Bachem I-1295, disolución madre 200 mM en DMSO). Se incubaron pKAL no biotinilada o biotinilada 1 nM con diferentes concentraciones de H-Pro-Phe-Arg-AMC en TCNB recién preparado (Tris-HCl 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl210 mM y Brij-35 al 0,5%). Se midió la fluorescencia después de 10 minutos a 360 nm y la emisión a 460 nm. Se calcularon Vmáx y CE50 usando el software SoftMax Pro. La comparación de la actividad de pKAL antes y después de la biotinilación reveló que pKAL biotinilada y pKAL no biotinilada tienen actividades comparativas mientras que el sustrato solo no tenía actividad.
Ejemplo 6. Aislamiento de péptidos que se unen a calicreína plasmática
Se identificaron inhibidores de calicreína a través de varias tandas de presentación en ARNm y selección. La presentación en ARNm se realizó generalmente tal como se describe (Roberts, R.W. y Szostak, J.W. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 12297-12302; documento WO2009067191) con las modificaciones que se describen en el presente documento. Se generaron combinaciones de ARN a partir de una mezcla de ocho bibliotecas de ADN. Las bibliotecas codifican para péptidos con un residuo de metionina N-terminal fijo, seguido secuencialmente por un residuo de cisteína fijo, once posiciones para aminoácidos, un ligador de glicina-serina-glicina y una cola de hexahistidina C-terminal. En cada una de las ocho bibliotecas, una de las once posiciones de las posiciones cuatro a once es un residuo de cisteína fijo. Los veinte aminoácidos están permitidos en las diez posiciones restantes en cada una de las ocho bibliotecas. A través de este diseño, cada una de las bibliotecas tiene dos residuos de cisteína que flanquean una región aleatoria que se compone de tres a ocho residuos, seguida de una segunda región aleatoria de dos a siete residuos. A nivel de ADN, las posiciones aleatorias con los veinte aminoácidos se producen de manera combinatoria con unidades de codones de repetición de NNS (N es A, G, C y T; S es G y C) (Devlin, J.J., et. al., (1990). Science 249, 404-406.) Para llevar a cabo la selección, una tanda de enriquecimiento comprendió las siguientes etapas: se tradujeron combinaciones de ARN que contenían un oligonucleótido reticulado con UV 3'-terminal que contiene puromicina con aminoácidos naturales en lisados de reticulocitos de conejo y se ciclaron los péptidos resultantes con dibromoxileno (J. Am. Chem Soc. 127:1 1727 (2005)).
Luego se realizó la selección directa de los péptidos por afinidad con la diana. El ARN correspondiente a los péptidos seleccionados por afinidad se sometió a transcripción inversa y se amplificó por PCR para crear una reserva de ADN bicatenario. Se tradujo in vitro la reserva de a Dn usando ARN polimerasa de T7 para generar ARNm, y el ARNm producido se reticuló como anteriormente en su extremo 3'-terminal con un oligonucleótido que contiene puromicina. Las fusiones ARNm-puromicina se sometieron a traducción in vitro para generar la segunda tanda de la biblioteca, que ahora está enriquecida en péptidos que se unen a calicreína plasmática. Se repitió el ciclo de selección durante seis tandas. Después de la sexta tanda, se clonó y secuenció la reserva de ADN que representa los péptidos seleccionados, y se determinaron las secuencias de aminoácidos de los inhibidores de calicreína candidatos basándose en las secuencias de ADN. Las secuencias de péptidos identificadas se enumeran en la tabla 1.
Tabla 1. Péptidos de unión a calicreína
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R2001 MCNYWSPWTECSR 1
R2002
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MCESICRVLRYSE
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2
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Ejemplo 7. Optimización de los sitios de unión e inhibidores de calicreína
Se prepararon péptidos de unión a la calicreína mediante síntesis en fase sólida, se purificaron mediante RP-HPLC y se caracterizaron por su actividad enzimática (Tabla 2).
Tabla 2. Actividad inhibidora de calicreína de péptidos sintéticos
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Se optimizaron los péptidos realizando una variedad de truncamientos, deleciones y sustituciones. Cada derivado se sintetizó según los métodos de los ejemplos 12 a 14. Cada derivado se sometió a prueba para determinar la inhibición de calicreína plasmática tal como se describe en el ejemplo 4. Se enumeran derivados del péptido R2004 en la tabla 3 con sus valores de CI50 correspondientes. Se enumeran derivados del péptido R2003 en la tabla 4 con sus valores de CI 50 correspondientes.
Tabla 3. Actividad inhibidora de calicreína
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Tabla 4. Actividad inhibidora de calicreína
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Se llevó a cabo una optimización adicional realizando una variedad de truncamientos, deleciones y sustituciones. Cada derivado se sintetizó según los métodos de los ejemplos 12 a 14. Cada derivado se sometió a prueba para determinar la inhibición de calicreína plasmática tal como se describe en el ejemplo 4. Se enumeran derivados adicionales del péptido R2004 en la tabla 5 con sus valores de CI50 correspondientes. Se enumeran derivados adicionales del péptido R2003 en la tabla 6 con sus valores de CI50 correspondientes.
Tabla 5. Derivados optimizados adicionales de R2004
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Tabla 6. Derivados optimizados adicionales de R2003
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Tal como se usa en el presente documento, las abreviaturas tienen el siguiente significado: “Nvl” significa norvalina; “Phg” significa fenilglicina; “Tbg” significa terc-butilglicina; “nMe” indica la forma N-metilada de un aminoácido dado (por ejemplo, nMeS o nMeSer es la forma N-metilada de serina); “Asp (T)” significa ácido (S)-2-amino-3-(2H-tetrazol-5-il)-propanoico; “Phe(4-CH2NH2)” significa 4-aminometil-fenilalanina; “Phe(3-CH2NH2)” significa 3-aminometilfenilalanina; “Cpg” significa ciclopentilglicina; “hLys” significa homolisina; “Pen” significa penicilamina; las abreviaturas de una letra para los aminoácidos que aparecen en minúsculas indican que el isómero D de ese aminoácido está presente (por ejemplo, “a” significa D-alanina); “Chg” significa ciclohexilglicina; “Sar” significa sarcosina; “^-ro-MeR” o “•n-o-Me-Arg” significa la forma metilada eta-omega de arginina; “Cppg” significa ciclopropilglicina; “(D)-Phg” significa D-fenilglicina; “OctG” significa octilglicina; “Nle” significa norleucina; “Aib” significa ácido aminoisobutírico; “azaTrp” significa aza-triptófano; “tranexámico” significa ácido tranexámico; “Acc” significa ácido 1-aminociclopropanocarboxílico; “AcPyr” o “Ac-pyr” significa ácido 4-aminotetrahidro-2H-piran-4-carboxílico; “Acbc” significa ácido 1-aminociclobutanocarboxílico; “(2-OMe)-Phg” significa 2-metoxi-fenilglicina; “(a-Me)-P” significa alfametil-prolina; “(a-Me)-Phg” significa alfa-metil-fenilglicina; “(BODIPY-TMR)” significa ácido 6-((4,4-difluoro-1,3-dimetil-5-(4-metoxifenil)-4-bora-3a, 4a-diaza-s-indaceno-2-propionil)amino)-hexanoico; “2APY” significa ácido 2-amino-4-(2-aminopiridin-4-il)butanoico; “2-SAc” significa ácido 2-tioacético; “3-Cl-Phe” significa 3-clorofenilalanina; “3-Cl-Tyr” significa 3-clorotirosina; “3-F-Tyr” significa 3-fluorotirosina; “4-BZA” significa ácido 2-amino-3-(4-carbamimidoilfenil)propanoico; “4-Cl-Phe” significa 4-clorofenilalanina; “4-F-Phe” significa 4-fluorofenilalanina; “5-Cl-Trp” significa 5-clorotriptófano; “5-F-Trp” significa 5-fluorotriptófano; “ABP” significa ácido 2-amino-3-(5-bromotiofen-2-il)propanoico; “Achc” significa ácido 1-aminociclohexanocarboxílico; “AEA” significa ácido 2-(2-aminoetoxi)acético; “AzaTrp” significa 7-azatriptófano; “azaTrp” significa aza-triptófano; “Aze” significa azetidina; “Cpg” significa ciclopentilglicina; “(ciclo-L)” significa ácido 1-aminociclopentanocarboxílico; “Dab” significa ácido (S)-4-diaminobutírico; “homoCys” significa homocisteína; “Ind” significa ácido (S)-2-amino-2-(2,3-dihidro-1H-inden-2-il)-acético; “Orn” significa ornitina; “PEG40K” significa polietilenglicol de 40.000 kD de tamaño; “des-NH2” representa un grupo de amina amino-terminal faltante; “m-Lutidina” significa meta-lutidina; “Ac” significa acetilo; “NH2” significa amina; “heptanoil” se refiere a una cadena de acilo que se compone de 7 átomos de carbono; “[m-xilil(x,y)] “se refiere al ligador de dibromoxileno entre las cisteínas y los identificadores numéricos, xe y, sitúan la posición de las cisteínas que participan en la ciclación; “o-xilil” significa orto-xililo; “p-xilil” significa para-xililo; y “[ciclo(x,y)] “se refiere al enlace disulfuro entre dos cisteínas (para formar un bucle cíclico) y los identificadores numéricos, x e y sitúan la posición de las cisteínas que participan en la ciclación. Todos los demás símbolos se refieren al código de aminoácidos de una letra convencional.
Ejemplo 8. Especificidad de inhibidores
Para determinar la especificidad de los inhibidores peptídicos, se realizó un ensayo de CI50, tal como se describe en el ejemplo 4, en una variedad de serina proteasas relacionadas con la calicreína plasmática humana. Las enzimas sometidas a prueba incluyen la calicreína plasmática de ratón (R&D Systems, Mineápolis, MN) y las enzimas humanas factor VIIa (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN), factor Xa (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN), factor XIa (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN), factor XIIa (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN), calicreína tisular KLK13 (R&D Systems, Mineápolis, MN), trombina (Enzyme Research Laboratories, South Bend, IN) y plasmina (Enzyme Research Laboratorios, South Bend, IN).
Se sometió a prueba cada enzima con los siguientes sustratos fluorogénicos específicos (disponibles de Bachem; Torrance, CA): calicreína plasmática de ratón (Pro-Phe-Arg-AMC), factor VIIa (Boc-Val-Pro-Arg-AMC), factor Xa (Boc-Gln-Gly-Arg-AMC), factor XIa (Boc-Gln-Gly-Arg-AMC), factor XIIa (Boc-Gln-Gly-Arg-AMC), KLK13 (Boc-Val-Pro-Arg-AMC)), trombina (Boc-Val-Pro-Arg-AMC) y plasmina (Boc-Val-Leu-Lys-AMC). Se sometieron a ensayo los inhibidores peptídicos R2006, R2010, R2012, R2019, R2023, R2030, R2036, R2041, R2047, R2104 y R2051. En comparación con las calicreínas plasmáticas humana y de ratón, para las que los inhibidores mostraron valores de CI50 que oscilan desde 3,4 hasta 191 nM, ninguno de los inhibidores tenía un valor de CI50 por debajo de 4,8 |iM y la mayoría estaba por encima de 100 |iM. Por tanto, se descubrió que todos los inhibidores sometidos a prueba eran altamente selectivos para las calicreínas plasmáticas humana y de ratón (tablas 7 y 8).
Tabla 7. Especificidad de inhibidores
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Tabla 8. Especificidad de inhibidores (continuación)
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Ejemplo 9. Modelo animal de edema en la pata inducido por carragenanos
El modelo de edema en la pata inducido por carragenanos es un modelo animal aceptado en la técnica para el estudio de las composiciones de la presente divulgación. En este modelo, a los animales se les administra carragenanos y se cuantifica la posterior hinchazón en la pata mediante métodos descritos por Morris (2003, Carrageenan-Induced Paw Edema in the Rat and Mouse. Methods in Mol. Biology 225, 115-121). La hinchazón en la pata resultante se compara con la hinchazón después de los efectos de la administración de cualquiera de los inhibidores de calicreína divulgados en el presente documento. Los inhibidores activos de calicreína son aquellos que muestran menos inflamación en la pata que la inducida por carragenanos.
Ejemplo 10. Modelos animales con edema macular diabético
El edema macular diabético (EMD) es el engrosamiento de la retina en el área macular debido a retinopatía diabética (RD). Los pacientes con RD avanzada tienen niveles oculares anómalamente abundantes de proteínas del sistema calicreína-cinina en plasma. A los animales se les administran los inhibidores de calicreína divulgados en las tablas 1­ 6 y 9 para estudiar el efecto de los inhibidores para el tratamiento de EMD. Los modelos animales incluyen animales que tienen diabetes, retinopatía inducida por oxígeno (RIO) y/o ambos trastornos. La diabetes se induce cuando los animales reciben una inyección de estreptozotocina y la RIO se induce al exponer a animales neonatales a hiperoxia tal como se describe (Zhang et al, 2004, Plasminogen kringle 5 reduces vascular leakage in the retina in rat models of oxygen-induced retinopathy and diabetes. Diabetologia 47:124-131; Smith et al, 1994, Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci 35:101-111).
La permeabilidad vascular de la retina y el iris se determina midiendo el escape de albúmina desde los vasos sanguíneos hacia la retina y el iris usando azul de Evans tal como se describe (Zhang et al, 2004, Plasminogen kringle 5 reduces vascular leakage in the retina in rat models of oxygen-induced retinopathy and diabetes. Diabetologia 47:124-131; Gao et al, 2003, Kallikrein-binding protein inhibits retinal neovascularization and decreases vascular leakage, Diabetologia 46:689-698). La dosificación de los inhibidores de calicreína administrados a los animales se hace variar para estudiar los efectos dependientes de la dosis sobre la permeabilidad vascular.
Ejemplo 11. Modelos animales que usan ratones deficientes en INH C1
Se usan ratones en los que el gen INH C1 se seleccionó como diana mediante atrapamiento génico (ratones INH C1 -/-) se usan para estudiar el efecto de los inhibidores de calicreína divulgados en las tablas 1-6 y 9 sobre la permeabilidad vascular. Los ratones pueden tener diabetes inducida por una inyección de estreptozotocina y/o retinopatía inducida por oxígeno (RIO) inducida por exposición de ratones neonatales a hiperoxia. Para determinar los efectos sobre la permeabilidad vascular de la administración de los inhibidores de calicreína descritos en el presente documento, se inyecta colorante azul de Evans en los ratones después de la administración del inhibidor de calicreína. A los ratones se les administra el inhibidor de calicreína en una administración de dosis única o en un estudio de administración dependiente de la dosis. El inhibidor de calicreína se administra por vía intravenosa, por vía subcutánea o por vía intramuscular.
Ejemplo 12. Síntesis peptídica
Se sintetizaron péptidos usando métodos de Fmoc/tBu en fase sólida convencionales. La síntesis se realiza normalmente en un sintetizador de péptidos por microondas automatizado Liberty (CEM, Matthews, NC) usando protocolos convencionales con resina de Rink-amida, aunque también pueden usarse otros sintetizadores automatizados sin capacidad de microondas. Se obtuvieron todos los aminoácidos de fuentes comerciales a menos que se indique de otro modo. El reactivo de acoplamiento usado es hexafluorofosfato de 2-(6-cloro-1-H-benzotriazol-1il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (HCTU) y la base es diisopropiletilamina (DIEA). Se escinden los péptidos de la resina con 95% de TFA, 2,5% de TIS y 2,5% de agua durante 3 horas y se aíslan mediante precipitación con éter. Se purifican los péptidos en bruto en una HPLC preparativa de fase inversa usando una columna C18, con un gradiente de acetonitrilo/agua 0,1% de TFA de desde al 20% hasta al 50% durante 30 minutos. Se recogen y liofilizan las fracciones que contienen el péptido puro y se analizan todos los péptidos mediante CL-EM.
Ejemplo 13. Ciclación con dibromoxileno
Se carga un matraz de 100 ml con acetonitrilo (12 ml) y agua (24 ml) y se desgasifica con argón durante aproximadamente 5 minutos. Se añaden péptido lineal (0,01 mmol) y bicarbonato de amonio 200 mM (6 ml) seguido de al menos un péptido (0,012 mmol) tal como, pero sin limitación, 1,3-bis(bromometil)benceno, 1,2-bis(bromometil)benceno, 1,4-bis(bromometil)benceno, 2,6-bis(bromometil)piridina, (E)-1,4-dibromobut-2-eno. Se agita la mezcla de reacción bajo argón a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas y se monitoriza mediante CL-EM. Después de completarse la reacción, se congela y se liofiliza la disolución de reacción. La purificación mediante HPLC del producto liofilizado en bruto seguido de liofilización de fracciones que contienen péptido puro da como resultado el producto ciclado final como un polvo blanco.
Ejemplo 14. Ciclación de bis(bromometil)bencenos sustituidos
Se carga un matraz de 100 ml con acetonitrilo (12 ml) y agua (24 ml) y se desgasifica con argón durante aproximadamente 5 minutos. Se añaden péptido lineal (0,01 mmol) y bicarbonato de amonio 200 mM (6 ml) seguido de un bis(bromometil)benceno sustituido (0,012 mmol). Se agita la mezcla de reacción bajo argón a temperatura ambiente durante aproximadamente 2 horas y se monitoriza mediante CL-EM. Después de completarse la reacción, se congela y se liofiliza la disolución de reacción. La purificación mediante HPLC del producto liofilizado en bruto seguido de liofilización de fracciones que contienen péptido puro da como resultado el producto ciclado final como un polvo blanco.
Ejemplo 15. Compuestos inhibidores obtenidos mediante procedimientos de ciclación alternativos
Se sintetizaron inhibidores de calicreína plasmática según una o más de las reacciones químicas descritas en las secciones A, B y C del presente ejemplo. Se sometieron a prueba los compuestos inhibidores resultantes para determinar la actividad inhibidora de calicreína plasmática tal como se describe en el ejemplo 4. Estos compuestos se enumeran en la tabla 9 junto con los datos de CI50 correspondientes obtenidos.
A. Reacción de Heck
Tal como se usa en el presente documento, el término “reacción de Heck” se refiere a una reacción química en la que un haluro insaturado (incluyendo, pero sin limitarse a un bromuro) reacciona con un grupo alqueno así como una base en presencia de un catalizador que comprende paladio, lo que da como resultado la formación de un alqueno sustituido (Mizoroki, T. et al., Arylation of olefin with aryl iodide catalyzed by palladium. Bulletin of the Chemical Society of Japan.
1971. 44 (2):p581). Para la síntesis de peptidomiméticos mediante reacción de Heck, se trataron 300 mg de resina que contiene péptido (0,59 mmol/g) con una disolución de DMF/H2O/Et3N (9:1:1; 10 ml), Pd(OAc)2 (40 mg), PPh3 (50 mg), (nBu)4NCl (45 mg) en una porción. Se agitó la suspensión resultante durante la noche a 37°C y después de este tiempo, se lavó la resina secuencialmente con DMF, MeOH, DCM y se secó bajo un flujo de gas nitrógeno. Se escindió el péptido de la resina con TFA/H2O (97:3) y se purificó mediante HPLC de fase inversa. Un ejemplo de una de esas reacciones se presenta en el esquema 4.
Esquema 4
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En algunas realizaciones, el doble enlace formado en la reacción está en la formación estereoquímica S. En algunas realizaciones, el doble enlace formado en la reacción está en la formación estereoquímica R.
B. reacción de Buchwald
Tal como se usa en el presente documento, el término “reacción de Buchwald” se refiere a una reacción química llevada a cabo durante la noche a una temperatura seleccionada entre 50°C y 150°C en la que un haluro (incluyendo, pero sin limitarse a un bromuro) se hace reaccionar con un grupo químico que comprende oxígeno en presencia de tolueno y un catalizador que comprende paladio. Para la síntesis de peptidomiméticos mediante reacción de Buchwald, se trató una resina que contiene péptido (0,6 mmol/g) con una disolución de tolueno (10 ml), Pd (OAc)2 (12 mg), ligando (7,9 mg), Cs2CO3 (32,5 mg) en 10 ml de tolueno en una porción. Se agitó la disolución resultante a 80°C durante 24 h. Se lavó la resina secuencialmente con MeOH y d Cm y se secó bajo un flujo de gas nitrógeno. Se escindió el péptido de la resina con TFA/H2O (97:3) y se purificó mediante HPLC de fase inversa. Un ejemplo de una de esas reacciones se presenta en el esquema 5.
Esquema 5
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Tal como se usa en el presente documento, el término “metátesis de olefinas” se refiere a una reacción química que comprende la redistribución de alquenos a través de la ruptura y nueva formación de dobles enlaces carbono-carbono. Para la síntesis de peptidomiméticos mediante metátesis de olefinas, se añadieron resina que contiene péptido (0,6 mmol/g) y catalizador de Grubbs-Hoveyda de 2° generación (6,2 mg) en un recipiente de reacción y se purgó con flujo de gas nitrógeno durante 30 minutos. Luego se añadió dicloroetano anhidro (1 ml), se selló el recipiente y se agitó la suspensión a 80°C durante 40 h. Se lavó la resina con DCM y se secó bajo flujo de gas nitrógeno. Se escindió el péptido de la resina con TFA/H2O (97:3) y se purificó mediante HPLC de fase inversa. Un ejemplo de una de esas reacciones se presenta en el esquema 6.
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Claims (13)

  1. REIVINDICACIONES
    i . Inhibidor peptídico o peptidomimético de calicreína plasmática, en el que dicho inhibidor peptídico o peptidomimético tiene actividad inhibidora de calicreína con una CI50 de menos de 100 nM y comprende la secuencia de cualquiera de SEQ ID NO: 4-6, 8-10, 12-14, 18-20, 23-25, 30, 36, 39, 41,46, 47, 50-52, 55-58, 61, 64, 65, 67, 68, 72, 73, 75-79, 82, 85, 89, 91, 93-95, 97-100, 102, 148, 150, 155, 164, 165, 167-170, 176­ 178, 180-182, 184, 188-191, 196, 197, 199, 201, 202, 216 y 218.
  2. 2. Péptido o péptidomimético según la reivindicación 1, en el que el péptido o péptidomimético se cicla mediante una reacción con un reactivo seleccionado del grupo que consiste en: 1,2-bis(bromometil)benceno, 1,3-bis(bromometil)benceno 1,4-bis(bromometil)benceno, 2,6-bis(bromometil)piridina y (E)-1,4-dibromobut-2-eno.
  3. 3. Péptido o péptidomimético según las reivindicaciones 1 ó 2, en el que el péptido o péptidomimético se cicla mediante una reacción con tris(bromometil)benceno.
  4. 4. Péptido o péptidomimético según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el péptido o péptidomimético se cicla mediante una reacción con un reactivo que reacciona con tiol.
  5. 5. Péptido cíclico o péptidomimético cíclico según la reivindicación 4, en el que el reactivo es 1,3-bis(bromometil)benceno.
  6. 6. Péptido o péptidomimético según la reivindicación 1, en el que se forma un bucle entre dos residuos de cisteína.
  7. 7. Péptido o péptidomimético según la reivindicación 6, en el que el bucle comprende un resto de formación de puente seleccionado del grupo que consiste en:
    Figure imgf000166_0001
    xvm. xix.
    en las que cada X es independientemente N o CH, de modo que ningún anillo contiene más de 2 N; cada Z es independientemente un enlace, NR, O, S, CH2, C(O)NR, NRC(O), S(O)vNR, NRS(O)v; cada m se selecciona independientemente de 0, 1,2 y 3; cada v se selecciona independientemente de 1 y 2; cada R se selecciona independientemente de H y C1-C6; y cada resto de formación de puente se conecta al péptido por espaciadores C0-C6 seleccionados independientemente.
  8. 8. Inhibidor de la calicreína plasmática según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, para su uso en un método para el tratamiento o la prevención de padecer angioedema hereditario en un sujeto que lo necesite, comprendiendo dicho método administrar a dicho sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de dicho inhibidor, en el que opcionalmente se administra una cantidad terapéuticamente eficaz de más de un inhibidor de serina proteasa.
  9. 9. Inhibidor para su uso según la reivindicación 8, en el que dicho método se caracteriza porque se administra más de un inhibidor de calicreína plasmática según la reivindicación 1.
  10. 10. Inhibidor para su uso según la reivindicación 9, en el que
    (a) la administración se selecciona del grupo que consiste en oral, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, subcutánea, transdérmica e intravítrea;
    (b) el inhibidor de la calicreína plasmática se conjuga con un polímero soluble en agua,
    en el que opcionalmente el polímero soluble en agua es un polímero hidrófilo,
    en el que, opcionalmente, el polímero hidrófilo se selecciona del grupo que consiste en homopolímeros de poli(óxido de alquileno), polipropilenglicoles, polioles polioxietilenados, y copolímeros de los mismos, en el que además opcionalmente el polímero soluble en agua es polietilenglicol (PEG).
  11. 11. Composición farmacéutica que comprende un péptido o péptidomimético según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores y un portador o excipiente farmacéuticamente aceptable.
  12. 12. Péptido o péptidomimético según la reivindicación 1,
    en el que el péptido o péptidomimético comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36, 12, 10, 51, 23, 41, 6, 30 y 47 que tienen una CI50 de menos de 50 nM contra calicreína humana en el que dicho péptido o péptidomimético es cíclico opcionalmente
    (i) teniendo una CI50 de menos de 10 nM contra calicreína humana y comprendiendo una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36, 12 y 10; o
    (ii) teniendo una CI50 de menos de 50 nM contra calicreína humana y de ratón y comprendiendo una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO: 36, 12, 10, 51 y 23.
  13. 13. Péptido o péptidomimético según la reivindicación 1,
    en el que dicho péptido o péptidomimético comprende al menos un reemplazo de enlace peptídico, siendo dicho al menos un reemplazo de enlace peptídico por un resto no peptídico, en el que opcionalmente el resto no peptídico se selecciona del grupo que consiste en tioamida, sulfonamida, sulfonato, fosfonamida, fosfonato fosfotioato, fosfinato, alcano, 1 ó 2 hidroxietileno, dihidroxiletileno, enlace sencillo C-C (alcano), doble enlace C-C (alqueno), triple enlace C-C (alquino), enlace C-O (metilenoxilo), enlace O-N o N-O, triazol, hidrazida, urea, cetona, enlace de uretano, (di)haloalqueno, metilenmercapto, metilenamino, trifluoroetilamino, hidrazida y amidoxilo.
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