JPH06245775A - 蛋白質ｎ−ミリストイル化方法 - Google Patents
蛋白質ｎ−ミリストイル化方法Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/1025—Acyltransferases (2.3)
- C12N9/1029—Acyltransferases (2.3) transferring groups other than amino-acyl groups (2.3.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 大腸菌内においてＮ−ミリストイルトランス
フェラーゼとそのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ
に対する蛋白質基質を共発現させる方法において、
（Ａ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
誘導性ｔａｃプロモーター、ｇ１０−Ｌリボソーム結合
部位、ＮＭＴ遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子および
ｐ１５Ａ複製起源の作動可能な配列、ならびに（Ｂ）ｒ
ｅｃＡプロモーター、ｇ１０−Ｌリボソーム結合部位、
哺乳動物遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子およびＣｏ
ｌＥ１複製起源の作動可能な配列から構成される二相性
プラスミド系を大腸菌に導入する方法。 【構成】 哺乳動物Ｎ−ミリストイル化蛋白質またはミ
リステート類縁体が共有結合して含有させる物理化学的
性質を変化させた蛋白質の製造が可能になる。
フェラーゼとそのＮ−ミリストイルトランスフェラーゼ
に対する蛋白質基質を共発現させる方法において、
（Ａ）イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
誘導性ｔａｃプロモーター、ｇ１０−Ｌリボソーム結合
部位、ＮＭＴ遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子および
ｐ１５Ａ複製起源の作動可能な配列、ならびに（Ｂ）ｒ
ｅｃＡプロモーター、ｇ１０−Ｌリボソーム結合部位、
哺乳動物遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子およびＣｏ
ｌＥ１複製起源の作動可能な配列から構成される二相性
プラスミド系を大腸菌に導入する方法。 【構成】 哺乳動物Ｎ−ミリストイル化蛋白質またはミ
リステート類縁体が共有結合して含有させる物理化学的
性質を変化させた蛋白質の製造が可能になる。
Description
【０００１】発明の背景 本発明は、Ｎ−ミリストイル化蛋白質の製造方法に関
し、さらに詳しくはＮ−ミリストイルトランスフェラー
ゼ（ＮＭＴ）およびその蛋白質基質の大腸菌内における
共発現に関する。
し、さらに詳しくはＮ−ミリストイルトランスフェラー
ゼ（ＮＭＴ）およびその蛋白質基質の大腸菌内における
共発現に関する。
【０００２】特定の真核生物蛋白質の脂肪酸アシル化は
確立された過程であり、便宜上２種類に分けることがで
きる。一方において、パルミテート（ｃ１６：０）が翻
訳後にエステルまたはチオエステル結合を介して膜蛋白
質に結合される。
確立された過程であり、便宜上２種類に分けることがで
きる。一方において、パルミテート（ｃ１６：０）が翻
訳後にエステルまたはチオエステル結合を介して膜蛋白
質に結合される。
【０００３】他方では、ミリステート（ｃ１４：０）は
アミド結合を介して可溶性膜蛋白質に共有結合する。こ
れは翻訳と同時に起こる現象と考えられる。Ｎ−ミリス
トイル化蛋白質においては、アミノ末端グリシン残基が
アシル化部位であることが知られている。ミリストイル
ＣｏＡ：プロテインＮ−ミリストイルトランスフェラー
ゼ（ＮＭＴ，Ｅ．Ｃ．２．３．１．９７）は、この翻訳
時修飾を触媒する。ＮＭＴ構造遺伝子（ＮＭＴ１）は最
近、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）からクローン化された（Ｄｕｒｏｎ
ｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：７９６〜８００，１９
８９参照）。この遺伝子は４５５個のアミノ酸のポリペ
プチド（Ｍｒ＝５２，８３７）をコードしている。
アミド結合を介して可溶性膜蛋白質に共有結合する。こ
れは翻訳と同時に起こる現象と考えられる。Ｎ−ミリス
トイル化蛋白質においては、アミノ末端グリシン残基が
アシル化部位であることが知られている。ミリストイル
ＣｏＡ：プロテインＮ−ミリストイルトランスフェラー
ゼ（ＮＭＴ，Ｅ．Ｃ．２．３．１．９７）は、この翻訳
時修飾を触媒する。ＮＭＴ構造遺伝子（ＮＭＴ１）は最
近、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）からクローン化された（Ｄｕｒｏｎ
ｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：７９６〜８００，１９
８９参照）。この遺伝子は４５５個のアミノ酸のポリペ
プチド（Ｍｒ＝５２，８３７）をコードしている。
【０００４】多様なウイルスおよび細胞蛋白質が、その
アミノ端末におけるグリシンへのアミド結合を介して結
合したミリステートの共有結合的付着によって修飾され
ていることが明らかにされている。このような修飾は、
ある種のＮ−ミリストイル化蛋白質の生物学的機能の完
全な発現に必須である。最も徹底的に研究されているミ
リストイル化蛋白質の例にはラウス肉腫ウイルスの形質
転換蛋白質、ｐ６０V- src がある。そのＮ−末端グリシ
ンにミリステートの共有結合による付着がなければ、そ
のチロシンキナーゼ活性は正常に維持されているもの
の、その蛋白質には細胞の形質転換能はない。
アミノ端末におけるグリシンへのアミド結合を介して結
合したミリステートの共有結合的付着によって修飾され
ていることが明らかにされている。このような修飾は、
ある種のＮ−ミリストイル化蛋白質の生物学的機能の完
全な発現に必須である。最も徹底的に研究されているミ
リストイル化蛋白質の例にはラウス肉腫ウイルスの形質
転換蛋白質、ｐ６０V- src がある。そのＮ−末端グリシ
ンにミリステートの共有結合による付着がなければ、そ
のチロシンキナーゼ活性は正常に維持されているもの
の、その蛋白質には細胞の形質転換能はない。
【０００５】
【０００６】上述の蛋白質脂肪酸アシル化に関するその
他の背景情報については、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ大学医
学部の関連研究者による以下の一連の論文が参考にな
る。 Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２５：８７８〜８８４（１９８６）； Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２８１２〜２８
１６（１９８６）； Ｔｏｗｌｅｒ ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２（１９８
７）； Ｔｏｗｌｅｒ ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：
１０３０〜１０３６（１９８７）； Ｔｏｗｌｅｒ ら：Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．
５７：６９〜９９（１９８８）； Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８７９５〜８７９９（１
９８８）；および Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ：Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５２６２
〜５２６６（１９８９）
他の背景情報については、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ大学医
学部の関連研究者による以下の一連の論文が参考にな
る。 Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２５：８７８〜８８４（１９８６）； Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２８１２〜２８
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ｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２（１９８
７）； Ｔｏｗｌｅｒ ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：
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５７：６９〜９９（１９８８）； Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８７９５〜８７９９（１
９８８）；および Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ：Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５２６２
〜５２６６（１９８９）
【０００７】ミリストイル化酵素の基質として有用な、
比較的短いアミノ酸配列を有する独特な合成ペプチド
が、米国特許第４，７４０，５８８号および第４，７７
８，８７８号に記載されている。このようなペプチドの
例には、
比較的短いアミノ酸配列を有する独特な合成ペプチド
が、米国特許第４，７４０，５８８号および第４，７７
８，８７８号に記載されている。このようなペプチドの
例には、
【化１】Gly-Asn-Ala-Ala-Ala-Ala-Arg-Arg および Gly-Asn-Ala-Ala-Ser-Tyr-Arg-Arg がある。
【０００８】ある種の他の独特な合成ペプチドは、米国
特許第４，７０９，０１２号および第４，７７８，８７
７号に記載にされているようなミリストイル化酵素のイ
ンヒビターである。Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら（前出）；
Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆Ｇｏｒｄｏｎ（前出）；Ｂｒ
ｙａｎｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：８６５５〜８６５９，１９８９）；およ
びＭｕｍｂｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７：７２８〜７３２，１９９０）は、抗
ウイルス剤、抗カビ剤および抗新生物剤として使用でき
る可能性がある。ミリストイル化酵素の新規な脂肪酸類
縁体基質を報告している。これらの基質化合物は、モノ
およびジヘテロ原子置換脂肪酸類縁体であって、ヘテロ
原子、酸素および／または硫黄がＣ13〜Ｃ14脂肪酸の脂
肪酸鎖における炭素位置４〜１３のメチレン（−ＣＨ2
−）基を置換している。このような脂肪酸類縁体の例に
は、１１−オキサミリスチン酸および１３−オキサミリ
スチン酸がある。これらの脂肪酸類縁体のＣｏＡエステ
ルは、ＮＭＴの基質であって、選択的に細胞またはウイ
ルスＮ−ミリストイル蛋白質のサブセットに転移され、
そこで蛋白質機能を変化させることができる。
特許第４，７０９，０１２号および第４，７７８，８７
７号に記載にされているようなミリストイル化酵素のイ
ンヒビターである。Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら（前出）；
Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆Ｇｏｒｄｏｎ（前出）；Ｂｒ
ｙａｎｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：８６５５〜８６５９，１９８９）；およ
びＭｕｍｂｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７：７２８〜７３２，１９９０）は、抗
ウイルス剤、抗カビ剤および抗新生物剤として使用でき
る可能性がある。ミリストイル化酵素の新規な脂肪酸類
縁体基質を報告している。これらの基質化合物は、モノ
およびジヘテロ原子置換脂肪酸類縁体であって、ヘテロ
原子、酸素および／または硫黄がＣ13〜Ｃ14脂肪酸の脂
肪酸鎖における炭素位置４〜１３のメチレン（−ＣＨ2
−）基を置換している。このような脂肪酸類縁体の例に
は、１１−オキサミリスチン酸および１３−オキサミリ
スチン酸がある。これらの脂肪酸類縁体のＣｏＡエステ
ルは、ＮＭＴの基質であって、選択的に細胞またはウイ
ルスＮ−ミリストイル蛋白質のサブセットに転移され、
そこで蛋白質機能を変化させることができる。
【０００９】
【発明の簡単な説明】本発明によれば、Ｎ−ミリストイ
ル−トランスフェラーゼ（ＮＭＴ，Ｅ．Ｃ．２．３．
１．９７）とその蛋白質基質を大腸菌内で共発現させる
新規な方法が提供される。二相性プラスミド系を使用し
て、ＮＭＴ遺伝子と哺乳動物蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａを同時に発現させることにより、哺乳動物蛋白質のミ
リストイル化を大腸菌内で再構成することができる。
ル−トランスフェラーゼ（ＮＭＴ，Ｅ．Ｃ．２．３．
１．９７）とその蛋白質基質を大腸菌内で共発現させる
新規な方法が提供される。二相性プラスミド系を使用し
て、ＮＭＴ遺伝子と哺乳動物蛋白質をコードするｃＤＮ
Ａを同時に発現させることにより、哺乳動物蛋白質のミ
リストイル化を大腸菌内で再構成することができる。
【００１０】本発明の新規な方法は、蛋白質Ｎ−ミリス
トイル化の基質要求性および生物学的作用、ならびにＮ
ＭＴの構造活性相関の研究のために新しいシステムを提
供する。本発明を例示すれば、内因性ＮＭＴ活性をもた
ない細菌である大腸菌内での酵母ＮＭＴ１遺伝子の発現
は、完全な５３ｋＤａのＮＭＴポリペプチドと同時にそ
のＮＨ2 末端３９アミノ酸の蛋白分解除去に由来する截
頭ポリペプチドの産生を生じる。それぞれの大腸菌合成
ＮＭＴ種は、酵素活性のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで判
定して、ビール酵母菌から回収されたＮＭＴの場合と識
別できない脂肪酸およびペプチド基質特異性を有し、こ
れはこの酵素のＮＨ2 −末端ドメインはその触媒活性に
は必要でないことを示唆している。二相性プラスミド系
を用いて、酵母ＮＭＴ１遺伝子と、ｃＡＭＰ依存性プロ
テインキナーゼ（ＰＫ−Ａ）の触媒性（ｃ）サブユニッ
トとコードするマウスｃＤＮＡを同時に発現させること
により、大腸菌内で哺乳動物蛋白質のＮ−ミリストイル
化が再構築された。代謝標識試験では、この系にＮ−メ
リストイル化の脂肪酸特異性が保存されていることを示
した。〔3 Ｈ〕ミリスチン酸はＣ−サブユニットのＧｌ
ｙ1 残基に効率的に結合したが、〔3 Ｈ〕パルミテート
は結合しなかった。
トイル化の基質要求性および生物学的作用、ならびにＮ
ＭＴの構造活性相関の研究のために新しいシステムを提
供する。本発明を例示すれば、内因性ＮＭＴ活性をもた
ない細菌である大腸菌内での酵母ＮＭＴ１遺伝子の発現
は、完全な５３ｋＤａのＮＭＴポリペプチドと同時にそ
のＮＨ2 末端３９アミノ酸の蛋白分解除去に由来する截
頭ポリペプチドの産生を生じる。それぞれの大腸菌合成
ＮＭＴ種は、酵素活性のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで判
定して、ビール酵母菌から回収されたＮＭＴの場合と識
別できない脂肪酸およびペプチド基質特異性を有し、こ
れはこの酵素のＮＨ2 −末端ドメインはその触媒活性に
は必要でないことを示唆している。二相性プラスミド系
を用いて、酵母ＮＭＴ１遺伝子と、ｃＡＭＰ依存性プロ
テインキナーゼ（ＰＫ−Ａ）の触媒性（ｃ）サブユニッ
トとコードするマウスｃＤＮＡを同時に発現させること
により、大腸菌内で哺乳動物蛋白質のＮ−ミリストイル
化が再構築された。代謝標識試験では、この系にＮ−メ
リストイル化の脂肪酸特異性が保存されていることを示
した。〔3 Ｈ〕ミリスチン酸はＣ−サブユニットのＧｌ
ｙ1 残基に効率的に結合したが、〔3 Ｈ〕パルミテート
は結合しなかった。
【００１１】本発明によればまた、疎水性は低下したが
同じ鎖長を有するヘテロ原子含有ミリスチン酸類縁体、
〔3 Ｈ〕１０−（プロポキシ）デカン酸は、ＰＫ−Ａの
Ｃ−サブユニットに取り込まれるＮＭＴの有効な代替基
質であることが見出された。
同じ鎖長を有するヘテロ原子含有ミリスチン酸類縁体、
〔3 Ｈ〕１０−（プロポキシ）デカン酸は、ＰＫ−Ａの
Ｃ−サブユニットに取り込まれるＮＭＴの有効な代替基
質であることが見出された。
【００１２】このようなミリスチン酸のヘテロ原子含有
類縁体は最近、Ｂｒｙａｎｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８６５５〜８６５
９，１９８９）により、ある種のレトロウイルスの複製
を阻害することが示された。これらのウイルスはそのｇ
ａｇポリ蛋白質前駆体（たとえば、ヒト免疫不全ウイル
ス１；ＨＩＶ−１のＰｒ５５gag ）へのミリストイル基
の結合に依存しているのである。
類縁体は最近、Ｂｒｙａｎｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８６５５〜８６５
９，１９８９）により、ある種のレトロウイルスの複製
を阻害することが示された。これらのウイルスはそのｇ
ａｇポリ蛋白質前駆体（たとえば、ヒト免疫不全ウイル
ス１；ＨＩＶ−１のＰｒ５５gag ）へのミリストイル基
の結合に依存しているのである。
【００１３】本明細書に定義される細菌系が真核細胞系
に優る大きな利点は、内因性ＮＭＴおよび基質の不存在
下に、与えられた蛋白質のミリストイル化、類縁体置
換、および非ミリストイル化型を、それらの構造および
機能的性質の比較のために製造するさらに簡単な方法を
提供することにある。本方法は、酵素インヒビターなら
びにヘテロ原子含有類縁体のようなＮＭＴ代替基質につ
いて、特定の標的蛋白質にそれらが取り込まれる能力の
スクリーニングを容易にする。最後に、本方法はまた、
他の真核細胞蛋白質の大腸菌内での修飾の再現に有用で
あって、酵素およびそれらの基質の修飾の構造／活性相
関をより容易に評価できる。
に優る大きな利点は、内因性ＮＭＴおよび基質の不存在
下に、与えられた蛋白質のミリストイル化、類縁体置
換、および非ミリストイル化型を、それらの構造および
機能的性質の比較のために製造するさらに簡単な方法を
提供することにある。本方法は、酵素インヒビターなら
びにヘテロ原子含有類縁体のようなＮＭＴ代替基質につ
いて、特定の標的蛋白質にそれらが取り込まれる能力の
スクリーニングを容易にする。最後に、本方法はまた、
他の真核細胞蛋白質の大腸菌内での修飾の再現に有用で
あって、酵素およびそれらの基質の修飾の構造／活性相
関をより容易に評価できる。
【００１４】大腸菌内での酵母ＮＭＴ１の産生には、Ｎ
ＭＴ１遺伝子を適当なプラスミド発現ベクター、たとえ
ばｐＭＯＮ５８４０中にクローン化できる。このプラス
ミドは、無関係な配列のほかに、ｒｅｃＡプロモーター
（ＰｒｅｃＡ）およびバクテリオファーヂＴ７ファージ
遺伝子１０リーダーＲＮＡ由来のリボソーム結合部位
（ｇ１０−ＬＲＢＳ）を含有するｐＭＯＮ５５１５の変
異体であって、さらにＯｌｉｎｓら（Ｇｅｎｅ ７３：
２２７〜２３５，１９８８，Ｏｌｉｎｓ ＆ Ｒａｎｇ
ｗａｌａ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９７
３〜１６９７６，１９８９）によって記載されているよ
うに、大腸菌内での外来性遺伝子の強力な発現に適して
いる。ｐＭＯＮー５８４０中のｒｅｃＡプロモーターは
ＨｐａIIフラグメントとして誘導され、Ｈｏｒｉｉら
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
７：３１３〜３１７，１９８０）によって報告された配
列のヌクレオチド６３〜２１０に相当する。酵母ＮＭＴ
１遺伝子は親ベクター中にリゲートして、慣用の手順に
よりＮＭＴの発現に使用できる。
ＭＴ１遺伝子を適当なプラスミド発現ベクター、たとえ
ばｐＭＯＮ５８４０中にクローン化できる。このプラス
ミドは、無関係な配列のほかに、ｒｅｃＡプロモーター
（ＰｒｅｃＡ）およびバクテリオファーヂＴ７ファージ
遺伝子１０リーダーＲＮＡ由来のリボソーム結合部位
（ｇ１０−ＬＲＢＳ）を含有するｐＭＯＮ５５１５の変
異体であって、さらにＯｌｉｎｓら（Ｇｅｎｅ ７３：
２２７〜２３５，１９８８，Ｏｌｉｎｓ ＆ Ｒａｎｇ
ｗａｌａ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９７
３〜１６９７６，１９８９）によって記載されているよ
うに、大腸菌内での外来性遺伝子の強力な発現に適して
いる。ｐＭＯＮー５８４０中のｒｅｃＡプロモーターは
ＨｐａIIフラグメントとして誘導され、Ｈｏｒｉｉら
（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７
７：３１３〜３１７，１９８０）によって報告された配
列のヌクレオチド６３〜２１０に相当する。酵母ＮＭＴ
１遺伝子は親ベクター中にリゲートして、慣用の手順に
よりＮＭＴの発現に使用できる。
【００１５】とくに、酵母ＮＭＴ１遺伝子は、そのイニ
シエーターＭｅｔコドンにおけるＮｃｏ１部位を操作
し、そのＤＮＡをｐＭＯＮ５８４０中にサブクローニン
グすることにより、ｇ１０−Ｌの下流に配置される。こ
の場合、ＮＭＴの転写は、ｐＭＯＮ５８４０中ｇ１０−
Ｌ配列の上流に位置する大腸菌ｒｅｃＡプロモーターの
制御下に置かれる。この組変えプラスミドをもつ大腸菌
ＪＭ１０１細胞を中対数期まで増殖させ、ついでナジル
キシン酸で処理してｒｅｃＡプロモーターを誘導する。
シエーターＭｅｔコドンにおけるＮｃｏ１部位を操作
し、そのＤＮＡをｐＭＯＮ５８４０中にサブクローニン
グすることにより、ｇ１０−Ｌの下流に配置される。こ
の場合、ＮＭＴの転写は、ｐＭＯＮ５８４０中ｇ１０−
Ｌ配列の上流に位置する大腸菌ｒｅｃＡプロモーターの
制御下に置かれる。この組変えプラスミドをもつ大腸菌
ＪＭ１０１細胞を中対数期まで増殖させ、ついでナジル
キシン酸で処理してｒｅｃＡプロモーターを誘導する。
【００１６】上述のプラスミド系を用い、ついでＮＭＴ
を、細胞溶解質の連続的硫酸アンモニウム沈殿、ＤＥＡ
Ｅ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅTMＣＬ−６ＢおよびＣｏＡ−ア
ガロースアフィニティークロマトグラフィーによって約
７５０倍に精製した。ＮＭＴ活性に対する結合ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏアッセイ（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
３：２８１２〜２８１６，１９８６）を用いることによ
り、部分精製大腸菌由来ＮＭＴは、様々なペプチド基質
に対して、酵母からの部分精製ＮＭＴプレパレーション
の場合とほぼ同一のKmおよびＶｍａｘ値を示すことが明
らかにされた。
を、細胞溶解質の連続的硫酸アンモニウム沈殿、ＤＥＡ
Ｅ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅTMＣＬ−６ＢおよびＣｏＡ−ア
ガロースアフィニティークロマトグラフィーによって約
７５０倍に精製した。ＮＭＴ活性に対する結合ｉｎ ｖ
ｉｔｒｏアッセイ（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
３：２８１２〜２８１６，１９８６）を用いることによ
り、部分精製大腸菌由来ＮＭＴは、様々なペプチド基質
に対して、酵母からの部分精製ＮＭＴプレパレーション
の場合とほぼ同一のKmおよびＶｍａｘ値を示すことが明
らかにされた。
【００１７】大腸菌内で酵母ＮＭＴ１遺伝子と、Ｕｈｌ
ｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３：１３００〜１３０４，１９８６）によって記
載されたｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫ−
Ａ）のマウスＣα触媒サブユニットをコードするｃＤＮ
Ａ（Ｃα）を共発現するために、二相性プラスミド系が
使用された。ひとつのプラスミドは、カナマイシン抵抗
性遺伝子およびｐ１５Ａ複製起源を含有するｐＡＣＹ１
７７の誘導体であるｐＭＯＮ５８３９中に１．９ｋｂ
ＮｃｏＩ〜ＨｉｎｄIII ＮＭＴ１フラグメントをクロー
ニングすることによって構築された。もうひとつのプラ
スミドは、アンピシリン対抗性遺伝子およびＣｏｌＥ１
複製起源を含有するｐＭＯＮ２６７０中に１．８ｋｂ
ＮｄｅＩ−ＫｐｎＩＣα ｃＤＮＡをクローニングすく
ことによって構築された。
ｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３：１３００〜１３０４，１９８６）によって記
載されたｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫ−
Ａ）のマウスＣα触媒サブユニットをコードするｃＤＮ
Ａ（Ｃα）を共発現するために、二相性プラスミド系が
使用された。ひとつのプラスミドは、カナマイシン抵抗
性遺伝子およびｐ１５Ａ複製起源を含有するｐＡＣＹ１
７７の誘導体であるｐＭＯＮ５８３９中に１．９ｋｂ
ＮｃｏＩ〜ＨｉｎｄIII ＮＭＴ１フラグメントをクロー
ニングすることによって構築された。もうひとつのプラ
スミドは、アンピシリン対抗性遺伝子およびＣｏｌＥ１
複製起源を含有するｐＭＯＮ２６７０中に１．８ｋｂ
ＮｄｅＩ−ＫｐｎＩＣα ｃＤＮＡをクローニングすく
ことによって構築された。
【００１８】ＮＭＴとその蛋白質基質の大腸菌内での共
発現はしたがって、ＮＭＴ構造／活性相関の解析を容易
にし、Ｎ−ミリストイル化に必要なその蛋白質基質の構
造的特徴の同定を助け、各Ｎ−ミリストイル蛋白質の機
能におけるミリストイル残基の役割についての洞察を提
供する。特定のＮ−ミリストイル蛋白質をミリステート
のヘテロ原子含有類縁体で修飾することによる効果は、
大腸菌合成非アシル化、ミリストイル化、および類縁体
置換種の比較試験による直接評価が可能になる。脂肪酸
の代謝欠損大腸菌変異株（Ｓｉｌｂｅｒｔ：Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：３１５〜３３９，１９７
５；Ｎｕｎｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１
６７〜１７１，１９８６）はとくに、外因性脂肪酸およ
びそれらの類縁体のアシル化装置への送達能を改善する
ことにより、これらの試験に有用である。最後に、ＮＭ
Ｔへのアシル−ＣｏＡの結合は各種のペプチド基質に対
する酵素の親和性に影響するとの観察（Ｈｅｕｃｋｅｒ
ｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８５：８７９５〜８７９９，１９８８）を考慮す
ると、大腸菌内におけるＮＭＴとその蛋白質基質の共発
現は、与えられた標的蛋白質への様々な類縁体の取り込
みの相対的な効率のスクリーニングに良好な機能的検定
を提供できる。この意味で、ここに定義されるＮ−ミリ
スチル化系は、有用な抗腫瘍または抗ウイルス剤の同定
の助けになる。
発現はしたがって、ＮＭＴ構造／活性相関の解析を容易
にし、Ｎ−ミリストイル化に必要なその蛋白質基質の構
造的特徴の同定を助け、各Ｎ−ミリストイル蛋白質の機
能におけるミリストイル残基の役割についての洞察を提
供する。特定のＮ−ミリストイル蛋白質をミリステート
のヘテロ原子含有類縁体で修飾することによる効果は、
大腸菌合成非アシル化、ミリストイル化、および類縁体
置換種の比較試験による直接評価が可能になる。脂肪酸
の代謝欠損大腸菌変異株（Ｓｉｌｂｅｒｔ：Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：３１５〜３３９，１９７
５；Ｎｕｎｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１
６７〜１７１，１９８６）はとくに、外因性脂肪酸およ
びそれらの類縁体のアシル化装置への送達能を改善する
ことにより、これらの試験に有用である。最後に、ＮＭ
Ｔへのアシル−ＣｏＡの結合は各種のペプチド基質に対
する酵素の親和性に影響するとの観察（Ｈｅｕｃｋｅｒ
ｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８５：８７９５〜８７９９，１９８８）を考慮す
ると、大腸菌内におけるＮＭＴとその蛋白質基質の共発
現は、与えられた標的蛋白質への様々な類縁体の取り込
みの相対的な効率のスクリーニングに良好な機能的検定
を提供できる。この意味で、ここに定義されるＮ−ミリ
スチル化系は、有用な抗腫瘍または抗ウイルス剤の同定
の助けになる。
【００１９】上述の親プラスミドベクター、ｐＭＯＮ２
６７０およびｐＭＯＮ５８４０は大腸菌ＪＭ１０１中に
それぞれ保持させて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに、それぞれ受入番号ＡＴＣＣ
６８２１８およびＡＴＣＣ６８２２０として寄託されて
いる。
６７０およびｐＭＯＮ５８４０は大腸菌ＪＭ１０１中に
それぞれ保持させて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに、それぞれ受入番号ＡＴＣＣ
６８２１８およびＡＴＣＣ６８２２０として寄託されて
いる。
【００２０】 〔発明の詳細な説明〕本明細諸は、本発明を形成すると
みなされる主題を、特定的に指摘し、明確に請求した特
許請求の範囲をその結論とするが、本発明は添付された
図面との関連で以下に詳細に述べられる本発明の好まし
い態様の説明によってよりよく理解されるものと確信す
る。
みなされる主題を、特定的に指摘し、明確に請求した特
許請求の範囲をその結論とするが、本発明は添付された
図面との関連で以下に詳細に述べられる本発明の好まし
い態様の説明によってよりよく理解されるものと確信す
る。
【００２１】図１は、本発明の例示的実施態様におい
て、大腸菌内で合成されたマウスｃＡＭＰ依存性プロテ
インキナーゼ触媒（ｃ）サブユニットのミリストイル化
を５つのパネル、Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥに示す。
て、大腸菌内で合成されたマウスｃＡＭＰ依存性プロテ
インキナーゼ触媒（ｃ）サブユニットのミリストイル化
を５つのパネル、Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥに示す。
【００２２】図１Ａ（パネルＡ）は、大腸菌内でのＮＭ
Ｔ１およびＣαＤＮＡの発現に用いられたプラスミド構
築体を模式的に示す図である。
Ｔ１およびＣαＤＮＡの発現に用いられたプラスミド構
築体を模式的に示す図である。
【００２３】図１Ｂ，１Ｃおよび１Ｄ（パネルＢ，Ｃお
よびＤ）は、外因的に添加した〔3Ｈ〕ミリステート
（パネルＢ），〔3 Ｈ〕パルミテート（パネルＣ）およ
び〔3Ｈ〕１０−（プロポキシ）デカノエート（パネル
Ｄ）で標識後、様々な組合せのプラスミドを含む大腸菌
形質転換体から調整された溶解質のゲルパターンを示し
ている。ついで、〔3 Ｈ〕溶解質蛋白質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびフルオログラフィーに付した。矢印は精製さ
れたマウスＣ−サブユニットの移動位置を示す。パネル
ＢおよびＣに示したゲルのフルオログラフィーの露出時
間は４日、一方、パネルＤに示したゲルは１５日間暴露
した。レーン１：大腸菌ＪＭ１０１株、プラスミドな
し；レーン２：ＪＭ１０１プラス親ベクター；レーン
３：ＪＭ１０１プラス組換えＮＭＴ１−およびＣα含有
プラスミド、誘導せず；レーン４：ＪＭ１０１プラスＮ
ＭＴ１およびＣαプラスミド、誘導後；レーン５：ＪＭ
１０１プラスＮＭＴ１および変異体Ａｌａ 2 Ｃαプラス
ミド、誘導後；レーン６；ＪＭ１０１プラスＮＭＴ１お
よびＣα挿入体を欠く親ベクター、誘導後；レーン７：
ＪＭ１０１プラスＣαおよびＮＭＴ１挿入体を欠く親ベ
クター、誘導後。
よびＤ）は、外因的に添加した〔3Ｈ〕ミリステート
（パネルＢ），〔3 Ｈ〕パルミテート（パネルＣ）およ
び〔3Ｈ〕１０−（プロポキシ）デカノエート（パネル
Ｄ）で標識後、様々な組合せのプラスミドを含む大腸菌
形質転換体から調整された溶解質のゲルパターンを示し
ている。ついで、〔3 Ｈ〕溶解質蛋白質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびフルオログラフィーに付した。矢印は精製さ
れたマウスＣ−サブユニットの移動位置を示す。パネル
ＢおよびＣに示したゲルのフルオログラフィーの露出時
間は４日、一方、パネルＤに示したゲルは１５日間暴露
した。レーン１：大腸菌ＪＭ１０１株、プラスミドな
し；レーン２：ＪＭ１０１プラス親ベクター；レーン
３：ＪＭ１０１プラス組換えＮＭＴ１−およびＣα含有
プラスミド、誘導せず；レーン４：ＪＭ１０１プラスＮ
ＭＴ１およびＣαプラスミド、誘導後；レーン５：ＪＭ
１０１プラスＮＭＴ１および変異体Ａｌａ 2 Ｃαプラス
ミド、誘導後；レーン６；ＪＭ１０１プラスＮＭＴ１お
よびＣα挿入体を欠く親ベクター、誘導後；レーン７：
ＪＭ１０１プラスＣαおよびＮＭＴ１挿入体を欠く親ベ
クター、誘導後。
【００２４】図１Ｅ（パネルＥ）は、野性型Ｇｌｙ2 −
Ｃ−サブユニットまたは変異体Ａｌａ2 −Ｃ−サブユニ
ットを含有をする大腸菌溶解質のウエスタンブロット解
析を示す。
Ｃ−サブユニットまたは変異体Ａｌａ2 −Ｃ−サブユニ
ットを含有をする大腸菌溶解質のウエスタンブロット解
析を示す。
【００２５】図２は、図１に記載されたＮＭＴ１および
Ｃα遺伝子の発現プラスミドの構築に用いられた親プラ
スミドベクター，ｐＭＯＮ５８４０、ｐＭＯＮ２６７０
およびｐＭＯＮ５８３９を模式的に示す図である。
Ｃα遺伝子の発現プラスミドの構築に用いられた親プラ
スミドベクター，ｐＭＯＮ５８４０、ｐＭＯＮ２６７０
およびｐＭＯＮ５８３９を模式的に示す図である。
【００２６】本発明をさらに詳細に例示するために、以
下の例示的な実験室的調整実験を実施した。
下の例示的な実験室的調整実験を実施した。
【００２７】例 材料および方法 大腸菌内でのＮＭＴ−１およびＣαの産生に使用した親
発現ベクター ：この例では、ＣｏｌＥ１複製起源を有す
る２種のプラスミド、すなわち図２に模式的に例示した
ｐＭＯＮ２６７０およびｐＭＯＮ５８４０を使用した。
これらのプラスミドを係留する大腸菌ＪＭ１０１株はＡ
ＴＣＣに寄託され，それぞれ受入番号ＡＴＣＣ６８２１
８およびＡＴＣＣ６８２２０として利用できる。略述す
れば、これらのプラスミドはＯｌｉｎｓら（Ｇｅｎｅ
７３：２２７〜２３５，１９８８）によって記載された
プラスミドｐＭＯＮ５５１５に基づくもので、アンピシ
リン抵抗性マーカー（ＡＭＰr ）およびＣｏｌＥ１レプ
リコン（ｏｒｉ−ＣｏｌＥ１）、ナリジキシン酸誘導性
大腸菌ｒｅｃＡプロモーターならびにｇ１０−Ｌリボソ
ーム結合部位から構成される。さらに、ｐＭＯＮ２６７
０はＴ７転写ターミネーター（Ｔ７ｔｅｒ）を有し、一
方、ｐＭＯＮ５８４０はＦ１ファージからの一本鎖複製
起源（ｏｒｉ−Ｆ１）（Ｄｅｎｔｅ：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．１１：１６４５，１９８３）を含有し、こ
れはまた転写ターミネーターとしても働く。この２種の
プラスミドはまた、無関係なコード領域を（ｐＭＯＮ２
６７０ではヒトｐｒｏＡＮＦ遺伝子、ｐｒｏＡＮＦの部
分、ｐＭＯＮ５８４０ではヒトインターロイキン−１遺
伝子、ｈＩＬ−１の部分）Ｇ１０−１リボソーム結合部
位の下流に含有する。唯一のＮｃｏＩ，ＮｄｅＩおよび
ＨｉｎｄIII 制限部位がこの無関係なコード領域の単純
な除去を可能にした。
発現ベクター ：この例では、ＣｏｌＥ１複製起源を有す
る２種のプラスミド、すなわち図２に模式的に例示した
ｐＭＯＮ２６７０およびｐＭＯＮ５８４０を使用した。
これらのプラスミドを係留する大腸菌ＪＭ１０１株はＡ
ＴＣＣに寄託され，それぞれ受入番号ＡＴＣＣ６８２１
８およびＡＴＣＣ６８２２０として利用できる。略述す
れば、これらのプラスミドはＯｌｉｎｓら（Ｇｅｎｅ
７３：２２７〜２３５，１９８８）によって記載された
プラスミドｐＭＯＮ５５１５に基づくもので、アンピシ
リン抵抗性マーカー（ＡＭＰr ）およびＣｏｌＥ１レプ
リコン（ｏｒｉ−ＣｏｌＥ１）、ナリジキシン酸誘導性
大腸菌ｒｅｃＡプロモーターならびにｇ１０−Ｌリボソ
ーム結合部位から構成される。さらに、ｐＭＯＮ２６７
０はＴ７転写ターミネーター（Ｔ７ｔｅｒ）を有し、一
方、ｐＭＯＮ５８４０はＦ１ファージからの一本鎖複製
起源（ｏｒｉ−Ｆ１）（Ｄｅｎｔｅ：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．１１：１６４５，１９８３）を含有し、こ
れはまた転写ターミネーターとしても働く。この２種の
プラスミドはまた、無関係なコード領域を（ｐＭＯＮ２
６７０ではヒトｐｒｏＡＮＦ遺伝子、ｐｒｏＡＮＦの部
分、ｐＭＯＮ５８４０ではヒトインターロイキン−１遺
伝子、ｈＩＬ−１の部分）Ｇ１０−１リボソーム結合部
位の下流に含有する。唯一のＮｃｏＩ，ＮｄｅＩおよび
ＨｉｎｄIII 制限部位がこの無関係なコード領域の単純
な除去を可能にした。
【００２８】大腸菌内でのＮＭＴ１の二相性プラスミド
発現には、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ ＆ Ｃｏｈ
ｅｎ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１〜１
１５６，１９７８）に基づくプラスミドベクターを、図
２に模式的に例示したように使用した。このプラスミ
ド、ｐＭＯＮ５８３９を係留する大腸菌ＪＭ１０１株
は、ｐ１５複製起源（ｏｒｉｐ１５Ａ）と選択マーカー
としてカナマイシン抵抗性遺伝子（ＫＡＮr ）を含有す
る。このプラスミドは誘導可能なｔａｃプロモーター
（Ｐｔａｃ）（ＤｅＢｏｅｒら：ＤＮＡ２：２１３〜２
３５，１９８８）およびファージｐ２２配列由来の転写
ターミネーター（Ｐ２２ｔｅｒ）を含有する。このプラ
スミドはまた、ｇ１０−Ｌリボソーム結合部位の下流に
無関係なコード領域（細菌クロラムファニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子，ｃａｔ）を含有するが、
これはＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIII による切断で簡単に
除去できる。
発現には、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ ＆ Ｃｏｈ
ｅｎ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１〜１
１５６，１９７８）に基づくプラスミドベクターを、図
２に模式的に例示したように使用した。このプラスミ
ド、ｐＭＯＮ５８３９を係留する大腸菌ＪＭ１０１株
は、ｐ１５複製起源（ｏｒｉｐ１５Ａ）と選択マーカー
としてカナマイシン抵抗性遺伝子（ＫＡＮr ）を含有す
る。このプラスミドは誘導可能なｔａｃプロモーター
（Ｐｔａｃ）（ＤｅＢｏｅｒら：ＤＮＡ２：２１３〜２
３５，１９８８）およびファージｐ２２配列由来の転写
ターミネーター（Ｐ２２ｔｅｒ）を含有する。このプラ
スミドはまた、ｇ１０−Ｌリボソーム結合部位の下流に
無関係なコード領域（細菌クロラムファニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ遺伝子，ｃａｔ）を含有するが、
これはＮｃｏＩおよびＨｉｎｄIII による切断で簡単に
除去できる。
【００２９】大腸菌内でのビール酵母菌ＮＭＴの発現：
２．１キロベース（ｋｂ）ＢａｍＨ１−ＨｉｎｄIII ビ
ール酵母菌ゲノムＮＭＴ１フラグメントの７８０塩基対
領域（ヌクレオチド２１３〜９９３）（Ｄｕｒｏｎｉｏ
ら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９６〜８００，１９８
９）を、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉら：Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３９：４８７〜４９１，１９８８）と変異
体オリゴヌクレオチド（５´ＣＧＧＴＡＧＴＡＡＡＣＧ
ＧＡ−ＴＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡ
ＴＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＴ３´）を用いて増幅し
た。これにより、ＮＭＴ１のイニシェーターＡＴＧコド
ンにＮｃｏＩ制限酵素部位の導入が機能になった。新し
いＮｃｏＩ部位はまた、２つのＮＭＴ１のコドンをセリ
ンからアラニンに変化させた。増幅生成物をｐＢＢ１０
５に再びサブクローニングして（Ｄｕｒｏｎｉｏら：前
出）、変化したＮＭＴ１対立遺伝子を発生させた。Ｎｃ
ｏＩ部位は、ＮＭＴ１遺伝子の、大腸菌ｒｅｃＡプロモ
ーター（Ｈｏｒｉｉら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３１３〜３１７，１９８
０）およびファージＴ７（図１Ａのｇ１０−Ｌ）から得
られる翻訳エンハンサー要素への連絡を可能にした。こ
れは、新たに生成された１．９ｋｂ ＮｃｏＩ−Ｈｉｎ
ｄIII フラグメントを前述のようにＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄ
III 消化ｐＭＯＮ５８４０にリゲーションして行われ
た。得られたプラスミド（ｐＢＢ１２５）を用いて大腸
菌ＪＭ１０１株を形質転換した（Ｍｅｓｓｉｎｇ：Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ，Ｂｕｌｌ．
２：４５〜４８，１９７９）。形質転換体を、ＬＢ培地
＋１００μｇ／mlアンピシリン中、３７℃で、ＯＤ600
が１．０になるまで振盪した。ナリジキシン酸を最終濃
度５０μｇ／mlになるように添加してｒｅｃＡプロモー
ターを誘導した（Ｆｅｉｎ−Ｓｔｅｉｎら：Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２９２７〜２９４１，１９
８３）。３７℃で１５〜２０分間インキュベートしたの
ち、細胞を遠心分離によって収穫し、Ｐｏｗｅｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏ．）で加圧して（２０００ポン
ド／平方インチ）破壊した。ＮＭＴ種は以下に述べるよ
うにして精製した。
２．１キロベース（ｋｂ）ＢａｍＨ１−ＨｉｎｄIII ビ
ール酵母菌ゲノムＮＭＴ１フラグメントの７８０塩基対
領域（ヌクレオチド２１３〜９９３）（Ｄｕｒｏｎｉｏ
ら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９６〜８００，１９８
９）を、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉら：Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ ２３９：４８７〜４９１，１９８８）と変異
体オリゴヌクレオチド（５´ＣＧＧＴＡＧＴＡＡＡＣＧ
ＧＡ−ＴＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＡ
ＴＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＴ３´）を用いて増幅し
た。これにより、ＮＭＴ１のイニシェーターＡＴＧコド
ンにＮｃｏＩ制限酵素部位の導入が機能になった。新し
いＮｃｏＩ部位はまた、２つのＮＭＴ１のコドンをセリ
ンからアラニンに変化させた。増幅生成物をｐＢＢ１０
５に再びサブクローニングして（Ｄｕｒｏｎｉｏら：前
出）、変化したＮＭＴ１対立遺伝子を発生させた。Ｎｃ
ｏＩ部位は、ＮＭＴ１遺伝子の、大腸菌ｒｅｃＡプロモ
ーター（Ｈｏｒｉｉら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３１３〜３１７，１９８
０）およびファージＴ７（図１Ａのｇ１０−Ｌ）から得
られる翻訳エンハンサー要素への連絡を可能にした。こ
れは、新たに生成された１．９ｋｂ ＮｃｏＩ−Ｈｉｎ
ｄIII フラグメントを前述のようにＮｃｏＩ−Ｈｉｎｄ
III 消化ｐＭＯＮ５８４０にリゲーションして行われ
た。得られたプラスミド（ｐＢＢ１２５）を用いて大腸
菌ＪＭ１０１株を形質転換した（Ｍｅｓｓｉｎｇ：Ｒｅ
ｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ，Ｂｕｌｌ．
２：４５〜４８，１９７９）。形質転換体を、ＬＢ培地
＋１００μｇ／mlアンピシリン中、３７℃で、ＯＤ600
が１．０になるまで振盪した。ナリジキシン酸を最終濃
度５０μｇ／mlになるように添加してｒｅｃＡプロモー
ターを誘導した（Ｆｅｉｎ−Ｓｔｅｉｎら：Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２９２７〜２９４１，１９
８３）。３７℃で１５〜２０分間インキュベートしたの
ち、細胞を遠心分離によって収穫し、Ｐｏｗｅｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔＣｏ．）で加圧して（２０００ポン
ド／平方インチ）破壊した。ＮＭＴ種は以下に述べるよ
うにして精製した。
【００３０】大腸菌内でのＮＭＴ１およびＣαの発現の
ためのプラスミド：ｐＢＢ１３１は、１．９ｋｂ Ｎｃ
ｏＩ−ＨｉｎｄIII ＮＭＴ１フラグメントを、ｐＡＣＹ
Ｃ１７７（Ｃｈａｎｇ ＆ Ｃｏｈｅｎ：Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．１３４：１１４１〜１１５６，１９７８）の誘導
体、ｐＭＯＮ５８３９中にクローニングして構築され
た。ＰＫ−Ａの触媒性サブユニットをコードするＣαｃ
ＤＮＡ（Ｕｈｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：１３００〜１３０４，１９
８６）は、上述するように、またＬｉら（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３７７３〜１３７７９、１９
８７）の記載のようにして、ｐＭＯＮ２６７０中に、
１．８ｋｂ ＮｄｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントとしてク
ローニングした。ｐＢＢ１３２は野性型ＣαｃＤＮＡを
含有し（Ｇ．ＳｔａｎｌｅｙＭｃＫｎｉｇｈｔより）、
これはその一次翻訳生成物の位置２のＧｌｙを特定する
（位置１はイニシェーターＭｅｔで占められている）。
位置２がＡｌａの変異体ＣαｃＤＮＡはＺｏｌｌｅｒ
＆ Ｓｍｉｔｈの改良操作（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１０：６４８７〜６５００，１９８２）を用いた
オリゴヌクレオチド特定部位の突然変異誘発によって作
成した。ウラシル含有一本鎖鋳型はＲＺ１０３２細胞
中、ファージミドｐＵＣ１１９／Ｃαから調整し（Ｋｕ
ｎｋｅｌ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ３２：４８８〜４９２，１９８５）、Ｇｌｙ2 →
Ａｌａ2 突然変異誘発はオリゴマー、５´−ＣＡＴＡＴ
ＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣ−３´によって実施した。
突然変異はジデオキシヌクレオチド配列決定法（Ｓａｎ
ｇｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７４：５４６３〜５４６７，１９８７）によって
確認した。大腸菌ＪＭ１０１株の形質転換ｐＢＢ１３１
（ＮＭＴ１）およびｐＢＢ１３２（Ｇｌｙ2−Ｃα）ま
たはｐＢＢ１３３（Ａｌａ2 −Ｃα）を用いた。プラス
ミドＤＮＡの制限解析により、アンピシリン／カナマイ
シン抵抗性大腸菌二重形質転換体内の構築体の同一性が
確認された。
ためのプラスミド：ｐＢＢ１３１は、１．９ｋｂ Ｎｃ
ｏＩ−ＨｉｎｄIII ＮＭＴ１フラグメントを、ｐＡＣＹ
Ｃ１７７（Ｃｈａｎｇ ＆ Ｃｏｈｅｎ：Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．１３４：１１４１〜１１５６，１９７８）の誘導
体、ｐＭＯＮ５８３９中にクローニングして構築され
た。ＰＫ−Ａの触媒性サブユニットをコードするＣαｃ
ＤＮＡ（Ｕｈｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：１３００〜１３０４，１９
８６）は、上述するように、またＬｉら（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３７７３〜１３７７９、１９
８７）の記載のようにして、ｐＭＯＮ２６７０中に、
１．８ｋｂ ＮｄｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントとしてク
ローニングした。ｐＢＢ１３２は野性型ＣαｃＤＮＡを
含有し（Ｇ．ＳｔａｎｌｅｙＭｃＫｎｉｇｈｔより）、
これはその一次翻訳生成物の位置２のＧｌｙを特定する
（位置１はイニシェーターＭｅｔで占められている）。
位置２がＡｌａの変異体ＣαｃＤＮＡはＺｏｌｌｅｒ
＆ Ｓｍｉｔｈの改良操作（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒ
ｅｓ．１０：６４８７〜６５００，１９８２）を用いた
オリゴヌクレオチド特定部位の突然変異誘発によって作
成した。ウラシル含有一本鎖鋳型はＲＺ１０３２細胞
中、ファージミドｐＵＣ１１９／Ｃαから調整し（Ｋｕ
ｎｋｅｌ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ３２：４８８〜４９２，１９８５）、Ｇｌｙ2 →
Ａｌａ2 突然変異誘発はオリゴマー、５´−ＣＡＴＡＴ
ＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣ−３´によって実施した。
突然変異はジデオキシヌクレオチド配列決定法（Ｓａｎ
ｇｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ７４：５４６３〜５４６７，１９８７）によって
確認した。大腸菌ＪＭ１０１株の形質転換ｐＢＢ１３１
（ＮＭＴ１）およびｐＢＢ１３２（Ｇｌｙ2−Ｃα）ま
たはｐＢＢ１３３（Ａｌａ2 −Ｃα）を用いた。プラス
ミドＤＮＡの制限解析により、アンピシリン／カナマイ
シン抵抗性大腸菌二重形質転換体内の構築体の同一性が
確認された。
【００３１】大腸菌内で産生されたＰＫ−Ａ Ｃ−サブ
ユニットの〔3 Ｈ〕脂肪酸標識：二重形質転換体の培養
液４mlを、ＬＢ培地＋１００μｇ／mlアンピシリンおよ
び１００μｇ／ml硫酸カナマイシン中３７℃でＯＤ600
が０．５に達するまで振盪した。ついでイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃
度１ｍＭ添加して、ＮＭＴ産生を誘導した（以下の結果
の項参照）。培養液のＯＤ600 が１．０に達したとき
（約４０分後）、ナリジキシン酸を最終濃度５０μｇ／
ml添加してＣ−サブユニットの産生を誘導した（以下の
結果の項参照）。〔3 Ｈ〕ミリステート（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；３９．３Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ、培養液１mlあたり１１３μＣｉ添加）、〔3 Ｈ〕パ
ルミテート（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ；３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１４３μＣｉ／ml）、または
〔3 Ｈ〕１０−（プロボキシ）デカノエート（Ｈｅｕｃ
ｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５２６２〜５２
６６，１９８９）（３１．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ，８００μ
Ｃｉ／ml）をナリジキシン酸と同時に加えた。培養液を
さらに２０分間３７°で振盪し、細胞を遠心分離によっ
て収穫した。溶解質は、ペレット中に含まれる大腸菌
を、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，４％ＳＤＳ，
２０％グリセロール，１０％メルカプトエタノールおよ
び０．２Ｍジチオスレイトールの溶液４０μｌ中で１０
分間煮沸して調整した。細胞屑を遠心分離によって除去
し、上清の一部１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ：Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０〜６８５，１９
７０）に付し、ついでＥＮ3 ＨＡＮＣＥ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）オートラジオグラフィー・
エンハンサーを用いてフルオログラフィーに付した。ウ
エスタンブロット解析には、非標識大腸菌産生Ｇｌｙ2
−Ｃ−サブユニットまたはＡｌａ2 −Ｃ−サブユニット
から調整した還元、変性溶解質蛋白質５０μｇをＳＤＳ
／ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース上に電気ブロッ
トし（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１１２：１９５〜２３０，１９８１）、濾紙を、精製マ
ウスＣ−サブユニットに対するポリクローナル、単一特
異性ウサギ抗血清によって試験した。抗原−抗体複合体
は 125Ｉ−プロテインＡで可視化した（Ｂｕｒｎｅｔｔ
ｅ：前出）。
ユニットの〔3 Ｈ〕脂肪酸標識：二重形質転換体の培養
液４mlを、ＬＢ培地＋１００μｇ／mlアンピシリンおよ
び１００μｇ／ml硫酸カナマイシン中３７℃でＯＤ600
が０．５に達するまで振盪した。ついでイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃
度１ｍＭ添加して、ＮＭＴ産生を誘導した（以下の結果
の項参照）。培養液のＯＤ600 が１．０に達したとき
（約４０分後）、ナリジキシン酸を最終濃度５０μｇ／
ml添加してＣ−サブユニットの産生を誘導した（以下の
結果の項参照）。〔3 Ｈ〕ミリステート（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；３９．３Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ、培養液１mlあたり１１３μＣｉ添加）、〔3 Ｈ〕パ
ルミテート（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａ
ｒ；３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１４３μＣｉ／ml）、または
〔3 Ｈ〕１０−（プロボキシ）デカノエート（Ｈｅｕｃ
ｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５２６２〜５２
６６，１９８９）（３１．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ，８００μ
Ｃｉ／ml）をナリジキシン酸と同時に加えた。培養液を
さらに２０分間３７°で振盪し、細胞を遠心分離によっ
て収穫した。溶解質は、ペレット中に含まれる大腸菌
を、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，４％ＳＤＳ，
２０％グリセロール，１０％メルカプトエタノールおよ
び０．２Ｍジチオスレイトールの溶液４０μｌ中で１０
分間煮沸して調整した。細胞屑を遠心分離によって除去
し、上清の一部１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ｌａｅｍ
ｍｌｉ：Ｎａｔｕｒｅ ２２７：６８０〜６８５，１９
７０）に付し、ついでＥＮ3 ＨＡＮＣＥ（Ｎｅｗ Ｅｎ
ｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ）オートラジオグラフィー・
エンハンサーを用いてフルオログラフィーに付した。ウ
エスタンブロット解析には、非標識大腸菌産生Ｇｌｙ2
−Ｃ−サブユニットまたはＡｌａ2 −Ｃ−サブユニット
から調整した還元、変性溶解質蛋白質５０μｇをＳＤＳ
／ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース上に電気ブロッ
トし（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ：Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．
１１２：１９５〜２３０，１９８１）、濾紙を、精製マ
ウスＣ−サブユニットに対するポリクローナル、単一特
異性ウサギ抗血清によって試験した。抗原−抗体複合体
は 125Ｉ−プロテインＡで可視化した（Ｂｕｒｎｅｔｔ
ｅ：前出）。
【００３２】ＮＭＴ活性のｉｎ ｖｉｔｒｏ検定システ
ム：大腸菌誘導ビール酵母菌ＮＭＴのペプチドおよびア
シル−ＣｏＡ基質特異性を評価するためには、結合ｉｎ
ｖｉｔｒｏ検定システム（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａ
ｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３：２８１２〜２８１６，１９８６）に粗溶解質
または部分精製酵素プレパレーションを添加した。この
検定の第一工程は、シュードモナスアシル−ＣｏＡリガ
ーゼによる放射標識脂肪酸のそれらのＣｏＡチオエステ
ルへの変換を包含する。このリガーゼは、脂肪酸基質に
対して大部分、非特異的である（Ｓｈｉｍｉｚｕら：Ａ
ｎａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１９３〜１９８，１
９８０）。オクタペプチド基質およびＮＭＴを次に加え
てアシルペプチドを生成させた。アシルペプチドをトリ
クロロ酢酸／メタノール沈殿および水中アセトニトリル
の直線勾配を用いたＣ18逆相ＨＰＬＣによって反応混合
物から精製した（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：
２８１２〜２８１６，１９８６）。
ム：大腸菌誘導ビール酵母菌ＮＭＴのペプチドおよびア
シル−ＣｏＡ基質特異性を評価するためには、結合ｉｎ
ｖｉｔｒｏ検定システム（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａ
ｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３：２８１２〜２８１６，１９８６）に粗溶解質
または部分精製酵素プレパレーションを添加した。この
検定の第一工程は、シュードモナスアシル−ＣｏＡリガ
ーゼによる放射標識脂肪酸のそれらのＣｏＡチオエステ
ルへの変換を包含する。このリガーゼは、脂肪酸基質に
対して大部分、非特異的である（Ｓｈｉｍｉｚｕら：Ａ
ｎａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１９３〜１９８，１
９８０）。オクタペプチド基質およびＮＭＴを次に加え
てアシルペプチドを生成させた。アシルペプチドをトリ
クロロ酢酸／メタノール沈殿および水中アセトニトリル
の直線勾配を用いたＣ18逆相ＨＰＬＣによって反応混合
物から精製した（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：
２８１２〜２８１６，１９８６）。
【００３３】結果 大腸菌内で産生されたビール酵母菌ＮＭＴは、酵母酵素
標品と同一の基質特異性を有する ：ビール酵母菌ＮＭＴ
１遺伝子は、４５５個のアミノ酸を有し、計算Ｍｒ５
２，８３７で、栄養細胞増殖に必須な蛋白質をコードす
る（Ｄｕｒｏｎｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９
６〜８００，１９８９）。このポリペプチドは、現在利
用可能なデータベースに登録された蛋白質と、同一とみ
なし得る有意な一次配列ホモロジーをもたない（Ｄｕｒ
ｏｎｉｏら：同誌）。この酵母からの酵素の明らかに均
一なプレパレーションを得るには、４種の異なるクロマ
トグラフィーマトリックスを使用する６工程、１１，０
００倍の精製が必要であった（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７
０８〜２７１２，１９８７）。大腸菌溶解質は、この酵
素の感度のよいｉｎ ｖｉｔｒｏ検定（Ｔｏｗｌｅｒ
＆Ｇｌａｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８３：２８１２〜２８１６，１９８６）で
調べて、検地可能なＮＭＴ活性を含んでいない。すなわ
ち、この原核生物中での酵母ＮＭＴの発現は、その活性
を内因性ミリストイルトランスェラーゼの不存在下に測
定できる、大量の野性型（または変異性）蛋白質を得る
機会を提供する。
標品と同一の基質特異性を有する ：ビール酵母菌ＮＭＴ
１遺伝子は、４５５個のアミノ酸を有し、計算Ｍｒ５
２，８３７で、栄養細胞増殖に必須な蛋白質をコードす
る（Ｄｕｒｏｎｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９
６〜８００，１９８９）。このポリペプチドは、現在利
用可能なデータベースに登録された蛋白質と、同一とみ
なし得る有意な一次配列ホモロジーをもたない（Ｄｕｒ
ｏｎｉｏら：同誌）。この酵母からの酵素の明らかに均
一なプレパレーションを得るには、４種の異なるクロマ
トグラフィーマトリックスを使用する６工程、１１，０
００倍の精製が必要であった（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７
０８〜２７１２，１９８７）。大腸菌溶解質は、この酵
素の感度のよいｉｎ ｖｉｔｒｏ検定（Ｔｏｗｌｅｒ
＆Ｇｌａｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８３：２８１２〜２８１６，１９８６）で
調べて、検地可能なＮＭＴ活性を含んでいない。すなわ
ち、この原核生物中での酵母ＮＭＴの発現は、その活性
を内因性ミリストイルトランスェラーゼの不存在下に測
定できる、大量の野性型（または変異性）蛋白質を得る
機会を提供する。
【００３４】大腸菌内でのビール酵母菌ＮＭＴの発現は
ｐＭＯＮプラスミドベクターを用いて達成された。これ
らのベクターは、バクテリオファージＴ７のｇ１０リー
ダー領域（ｇ１０−Ｌ）に由来する翻訳「エンハンサ
ー」（Ｏｌｉｎｓら：Ｇｅｎｅ７３：２２７〜２３５，
１９８８）に融合した誘導可能なプロモーターを含有す
る。酵母ＮＭＴ１遺伝子は、そのイニシェーターＭｅｔ
コドンにおけるＮｃｏＩ部位を操作し、そのＤＮＡをｐ
ＭＯＮ５８４０中にサブクローニングすることによって
ｇ１０−Ｌの下流に直接接続して配置された。したがっ
て、ＮＭＴ１の転写は、ｐＭＯＮ５８４０中のｇ１０−
Ｌの上流に位置する大腸菌ｒｅｃＡプロモーター（Ｈｏ
ｒｉｉら：前出；Ｏｌｉｎｓら：前出）の制御下に置か
れた。この組換えプラスミドをもつ大腸菌ＪＭ１０１株
を中対数期まで増殖させ、ついでナリジキシン酸で処理
してｒｅｃＡプロモーターを誘導した（Ｆｅｉｎｓｔｅ
ｉｎら：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２９２
７〜２９４１，１９８３）。ＮＭＴを次に、誘導細胞溶
解液の一連の硫酸アンモニウム分画、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、およびＣｏＡ−アガロース
アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって約７
５０に精製した（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７
１２，１９８７）。上述のＮＭＴ活性の結合ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ検定を用いて、部分精製大腸菌誘導酵母ＮＭＴ
が、様々なオクタペプチド基質に対して、ビール酵母菌
からの部分精製ＮＭＴプレパレーションで測定した場合
とほぼ同じＫｍおよびＶｍａｘ値を示すことが明らかに
された（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１９
８７）（以下の表１参照）。たとえば、ＰＫ−ＡのＣ−
サブユニットのＮ−末端配列から得られた「親」オクタ
ペプチドＧＮＡＡＡＡＲＲ−ＮＨ2 の５位置へのセリン
残基の導入は、両ＮＭＴプレパレーションに対するその
見掛けのＫｍ値を１００倍以上低下させた。ＮＨ 2 末端
のＧｌｙは絶対的に要求される。Ｇｌｙ1 残基のＡｌａ
2 による置換はこのペプチドを不活性基質に変換した
（表１）。ＮＨ2 末端Ｍｅｔ残基の付加も不活性ペプチ
ドを発生し、これは大腸菌から部分的に精製された酵母
ＮＭＴが、ビール酵母菌から単離されたＮＭＴ（Ｔｏｗ
ｌｅｒら：同誌）と同様、メチオニルアミンペプチダー
ゼ活性を伴わないことを示した。
ｐＭＯＮプラスミドベクターを用いて達成された。これ
らのベクターは、バクテリオファージＴ７のｇ１０リー
ダー領域（ｇ１０−Ｌ）に由来する翻訳「エンハンサ
ー」（Ｏｌｉｎｓら：Ｇｅｎｅ７３：２２７〜２３５，
１９８８）に融合した誘導可能なプロモーターを含有す
る。酵母ＮＭＴ１遺伝子は、そのイニシェーターＭｅｔ
コドンにおけるＮｃｏＩ部位を操作し、そのＤＮＡをｐ
ＭＯＮ５８４０中にサブクローニングすることによって
ｇ１０−Ｌの下流に直接接続して配置された。したがっ
て、ＮＭＴ１の転写は、ｐＭＯＮ５８４０中のｇ１０−
Ｌの上流に位置する大腸菌ｒｅｃＡプロモーター（Ｈｏ
ｒｉｉら：前出；Ｏｌｉｎｓら：前出）の制御下に置か
れた。この組換えプラスミドをもつ大腸菌ＪＭ１０１株
を中対数期まで増殖させ、ついでナリジキシン酸で処理
してｒｅｃＡプロモーターを誘導した（Ｆｅｉｎｓｔｅ
ｉｎら：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２９２
７〜２９４１，１９８３）。ＮＭＴを次に、誘導細胞溶
解液の一連の硫酸アンモニウム分画、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、およびＣｏＡ−アガロース
アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって約７
５０に精製した（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７
１２，１９８７）。上述のＮＭＴ活性の結合ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ検定を用いて、部分精製大腸菌誘導酵母ＮＭＴ
が、様々なオクタペプチド基質に対して、ビール酵母菌
からの部分精製ＮＭＴプレパレーションで測定した場合
とほぼ同じＫｍおよびＶｍａｘ値を示すことが明らかに
された（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１９
８７）（以下の表１参照）。たとえば、ＰＫ−ＡのＣ−
サブユニットのＮ−末端配列から得られた「親」オクタ
ペプチドＧＮＡＡＡＡＲＲ−ＮＨ2 の５位置へのセリン
残基の導入は、両ＮＭＴプレパレーションに対するその
見掛けのＫｍ値を１００倍以上低下させた。ＮＨ 2 末端
のＧｌｙは絶対的に要求される。Ｇｌｙ1 残基のＡｌａ
2 による置換はこのペプチドを不活性基質に変換した
（表１）。ＮＨ2 末端Ｍｅｔ残基の付加も不活性ペプチ
ドを発生し、これは大腸菌から部分的に精製された酵母
ＮＭＴが、ビール酵母菌から単離されたＮＭＴ（Ｔｏｗ
ｌｅｒら：同誌）と同様、メチオニルアミンペプチダー
ゼ活性を伴わないことを示した。
【００３５】大腸菌が完全な酵母ＮＭＴを産生している
ことを確証するため、ＣｏＡ−アガロースカラムから１
００ｍＭＫＣｌで溶出した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）に移した。４５５残基酵母ＮＭＴ
の質量に相当する約５３ｋＤａ ポリペプチド（Ｄｕｒ
ｏｎｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９６〜８０
０，１９８９）をこの膜から切り出し、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａ型気相シクエンサー
を用い、エドマン分解に付した。ＮＨ2 末端配列は５３
ｋＤａポリペプチドが完全な酵母ＮＭＴに相当すること
を示した。
ことを確証するため、ＣｏＡ−アガロースカラムから１
００ｍＭＫＣｌで溶出した蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで
分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）に移した。４５５残基酵母ＮＭＴ
の質量に相当する約５３ｋＤａ ポリペプチド（Ｄｕｒ
ｏｎｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９６〜８０
０，１９８９）をこの膜から切り出し、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａ型気相シクエンサー
を用い、エドマン分解に付した。ＮＨ2 末端配列は５３
ｋＤａポリペプチドが完全な酵母ＮＭＴに相当すること
を示した。
【００３６】この酵素の均一なプレパレーションを得る
ために、大腸菌産生ＮＭＴをＭｏｎｏＳ高速蛋白質液体
クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によってさらに精製し
た。ＭｏｎｏＳカラムの２５０ｍＭＮａＣｌ溶出液のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマッシー青染色（Ｔｏｗｌｅ
ｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：２７０８〜２７１２，１９８７）によって、Ｎ
ＭＴ触媒活性と共溶出した約４５ｋＤａの付加的バンド
がさらに明らかにされた。この４５ｋＤａポリペプチド
のエドマン分解により、それはＮＭＴのＮＨ2 末端３９
残基が失われていることがわかり、Ｌｙｓ39−Ｐｈｅ40
結合のようなポリペプチド鎖の部分が蛋白分解を受けや
すく、精製時または大腸菌内での合成直後に、急速に失
われることが示唆された。
ために、大腸菌産生ＮＭＴをＭｏｎｏＳ高速蛋白質液体
クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によってさらに精製し
た。ＭｏｎｏＳカラムの２５０ｍＭＮａＣｌ溶出液のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマッシー青染色（Ｔｏｗｌｅ
ｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：２７０８〜２７１２，１９８７）によって、Ｎ
ＭＴ触媒活性と共溶出した約４５ｋＤａの付加的バンド
がさらに明らかにされた。この４５ｋＤａポリペプチド
のエドマン分解により、それはＮＭＴのＮＨ2 末端３９
残基が失われていることがわかり、Ｌｙｓ39−Ｐｈｅ40
結合のようなポリペプチド鎖の部分が蛋白分解を受けや
すく、精製時または大腸菌内での合成直後に、急速に失
われることが示唆された。
【００３７】ＭｏｎｏＳ精製４５ｋＤａＮＭＴ種は、ミ
リストイル−ＣｏＡとパルミトイル−ＣｏＡを容易に識
別子する能力を保持し、Ｓｅｒ5 置換ＧＮＡＡＡＡ−Ｒ
Ｒ−ＮＨ2 に対する見掛けのＫｍの１００倍低下を示し
た（表１）。４５ｋＤａ蛋白分解フラグメントはコア触
媒ドメインを維持するものと思われる。失われた３９個
のアミノ酸の役割は不明であるが、ＮＭＴの酵母内での
補助的な因子との（必須の）相互作用またはその適当な
細胞内標識化に必要なのかもしれない。遺伝子操作され
た４５ｋＤａＮＭＴがビール酵母菌の生存不能のＮｍｔ
- 表現型（Ｄｕｒｏｎｉｏら：前出）を救済できるかど
うかの決定がこれらの質問に解決を与える糸口になろ
う。大腸菌誘導ＮＭＴは酵母誘導ＮＭＴにきわめて近似
した速度論的性質を有することから、酵素のペプチドお
よび脂肪酸アシル−ＣｏＡ基質特異な性は、真核細胞蛋
白質修飾または補助的な酵母特異的因子のいずれにも依
存しないことも結論できる。
リストイル−ＣｏＡとパルミトイル−ＣｏＡを容易に識
別子する能力を保持し、Ｓｅｒ5 置換ＧＮＡＡＡＡ−Ｒ
Ｒ−ＮＨ2 に対する見掛けのＫｍの１００倍低下を示し
た（表１）。４５ｋＤａ蛋白分解フラグメントはコア触
媒ドメインを維持するものと思われる。失われた３９個
のアミノ酸の役割は不明であるが、ＮＭＴの酵母内での
補助的な因子との（必須の）相互作用またはその適当な
細胞内標識化に必要なのかもしれない。遺伝子操作され
た４５ｋＤａＮＭＴがビール酵母菌の生存不能のＮｍｔ
- 表現型（Ｄｕｒｏｎｉｏら：前出）を救済できるかど
うかの決定がこれらの質問に解決を与える糸口になろ
う。大腸菌誘導ＮＭＴは酵母誘導ＮＭＴにきわめて近似
した速度論的性質を有することから、酵素のペプチドお
よび脂肪酸アシル−ＣｏＡ基質特異な性は、真核細胞蛋
白質修飾または補助的な酵母特異的因子のいずれにも依
存しないことも結論できる。
【００３８】大腸菌内における蛋白質Ｎ−ミリストイル
化の再構築：表１に記載したデータは、大腸菌内での酵
母ＮＭＴの発現が、その基質特異性のビール酵母菌から
単離されたＮＭＴの場合と大部分区別できない点で、適
当にフォールディングされた酵素を生成したことを示し
ている。大腸菌内には内因性のＮＭＴ活性はないので、
この結果は、酵母ＮＭＴと真核細胞蛋白質基質の大腸菌
内での共発現が、明らかにもっぱら真核細胞のものであ
る蛋白質修飾の再生を、原核細胞内で可能にする可能性
を提起した。
化の再構築：表１に記載したデータは、大腸菌内での酵
母ＮＭＴの発現が、その基質特異性のビール酵母菌から
単離されたＮＭＴの場合と大部分区別できない点で、適
当にフォールディングされた酵素を生成したことを示し
ている。大腸菌内には内因性のＮＭＴ活性はないので、
この結果は、酵母ＮＭＴと真核細胞蛋白質基質の大腸菌
内での共発現が、明らかにもっぱら真核細胞のものであ
る蛋白質修飾の再生を、原核細胞内で可能にする可能性
を提起した。
【００３９】ＣＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫ
−Ａ）は最も早期に発見されたプロテインキナーゼの１
種であり、また最もよく生化学的に理解されたものの１
種でもある（Ｔａｙｌｏｒ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６４：８４４５〜８４４６，１９８９）。キナーゼは
細胞増殖および代謝の調節に関与し、その触媒（ｃ）サ
ブユニットはＮ−ミリスチル化されることが示された最
初の蛋白質でもあった（Ｃａｒｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６１２８〜６１
３１，１９８２）。マウスＣ−サブユニットをコードす
るｃＤＮＡ（Ｃα）（Ｕｈｌｅｒら：前出）の大腸菌内
での発現は、ＮＨ2 末端Ｇｌｙにミリステートを欠くこ
の蛋白質の可溶性、活性型の単離を招いた（Ｓｌｉｃｅ
＆ Ｔａｙｌｏｒ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
４：２０９４０〜２０９４６，１９８９）。マウスＣ−
サブユニットのＮＨ2 末端から誘導されたオクタペプチ
ドが正常な（また截頭された）大腸菌誘導酵母ＮＭＴに
対しｉｎ ｖｉｔｒｏで良好な基質であった（表１）こ
とから、ｉｎ ｖｉｖｏ再構築試験のための典型的蛋白
質としてＣ−サブユニットを使用することに決定した。
図１Ａに概略を示した二相性プラスミド系を酵母ＮＭＴ
１遺伝子とＣαｃＤＮＡの共発現に使用した。ベクター
は、それぞれが（ｉ）安定なエピゾームプラスミドとし
て同時に維持でき、（ii）それらの異種ＤＮＡ配列の転
写の独立した誘導を支持できるように設計された。ＮＭ
Ｔ１の発現は、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｍｅｓｓｉｎｇ，前
出）に基づくプラスミド中に含有されるイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性の
ｔａｃ（ＤｅＢｏｅｒら：ＤＮＡ ２：２３１〜２３
５，１９８５）プロモーターおよびｇ１０−Ｌリボソー
ム結合部位（Ｏｌｉｎｓら：Ｇｅｎｅ ７３：２２７〜
２３５，１９８８）の制御下に置かれた。このプラスミ
ドはｐ１５Ａ複製起源およびカナマイシン抵抗性遺伝子
を包含する。２種のＣαｃＤＮＡの発現は、アンピシリ
ン抵抗性遺伝子とＣｏｌＥ１複製起源を含有するプラス
ミド中に存在するｒｅｃＡプロモーター（Ｈｏｒｉｉ
ら：前出）とｇ１０−Ｌの制御下に置かれた。これらの
ｃＤＮＡの一方はＰＫ−Ａの野性型４０ｋＤａＣ−サブ
ユニット（Ｇｌｙ2 ）をコードし、他方はＧｌｙ2 の代
わりにＡｌａ2 置換された変異体を産生した。この変異
体Ｃ−サブユニットはＮＭＴの基質とはならない（表
１）。
−Ａ）は最も早期に発見されたプロテインキナーゼの１
種であり、また最もよく生化学的に理解されたものの１
種でもある（Ｔａｙｌｏｒ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６４：８４４５〜８４４６，１９８９）。キナーゼは
細胞増殖および代謝の調節に関与し、その触媒（ｃ）サ
ブユニットはＮ−ミリスチル化されることが示された最
初の蛋白質でもあった（Ｃａｒｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６１２８〜６１
３１，１９８２）。マウスＣ−サブユニットをコードす
るｃＤＮＡ（Ｃα）（Ｕｈｌｅｒら：前出）の大腸菌内
での発現は、ＮＨ2 末端Ｇｌｙにミリステートを欠くこ
の蛋白質の可溶性、活性型の単離を招いた（Ｓｌｉｃｅ
＆ Ｔａｙｌｏｒ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
４：２０９４０〜２０９４６，１９８９）。マウスＣ−
サブユニットのＮＨ2 末端から誘導されたオクタペプチ
ドが正常な（また截頭された）大腸菌誘導酵母ＮＭＴに
対しｉｎ ｖｉｔｒｏで良好な基質であった（表１）こ
とから、ｉｎ ｖｉｖｏ再構築試験のための典型的蛋白
質としてＣ−サブユニットを使用することに決定した。
図１Ａに概略を示した二相性プラスミド系を酵母ＮＭＴ
１遺伝子とＣαｃＤＮＡの共発現に使用した。ベクター
は、それぞれが（ｉ）安定なエピゾームプラスミドとし
て同時に維持でき、（ii）それらの異種ＤＮＡ配列の転
写の独立した誘導を支持できるように設計された。ＮＭ
Ｔ１の発現は、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｍｅｓｓｉｎｇ，前
出）に基づくプラスミド中に含有されるイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性の
ｔａｃ（ＤｅＢｏｅｒら：ＤＮＡ ２：２３１〜２３
５，１９８５）プロモーターおよびｇ１０−Ｌリボソー
ム結合部位（Ｏｌｉｎｓら：Ｇｅｎｅ ７３：２２７〜
２３５，１９８８）の制御下に置かれた。このプラスミ
ドはｐ１５Ａ複製起源およびカナマイシン抵抗性遺伝子
を包含する。２種のＣαｃＤＮＡの発現は、アンピシリ
ン抵抗性遺伝子とＣｏｌＥ１複製起源を含有するプラス
ミド中に存在するｒｅｃＡプロモーター（Ｈｏｒｉｉ
ら：前出）とｇ１０−Ｌの制御下に置かれた。これらの
ｃＤＮＡの一方はＰＫ−Ａの野性型４０ｋＤａＣ−サブ
ユニット（Ｇｌｙ2 ）をコードし、他方はＧｌｙ2 の代
わりにＡｌａ2 置換された変異体を産生した。この変異
体Ｃ−サブユニットはＮＭＴの基質とはならない（表
１）。
【００４０】親ベクターとそれらのＮＭＴ１およびＣα
含有組換え誘導体の対合組合せを大腸菌ＪＭ１０１株に
トランスフェクションし、それらをアンピシリンおよび
カナマイシン選択によって維持した。対数的に増殖して
いる細胞の培養液を標識するために、酵母ＮＭＴ１つい
でＣαの連続的発現時に〔3 Ｈ〕ミリステートを使用し
た。この培養液から調整した溶菌液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
およびフルオログラフィーに付し、蛋白質中への放射標
識脂肪酸の取り込みを調べた。ＮＭＴ１および野性型Ｃ
α配列を大腸菌内で共発現させたところ、４０ｋＤａ蛋
白質は培養培地に〔3 Ｈ〕ミリスチン酸の添加後に代謝
的に標識された（図１Ｂのレーン４）。この蛋白質は、
精製Ｃ−サブユニット標準と共移動した。４０ｋＤａ蛋
白質の標識化はＮＭＴ１および野性型Ｃα両者の存在に
絶対的に依存した。ＮＭＴ１を発現したがＣαを欠く大
腸菌およびＮＭＴ１を欠くがＣαを発現した大腸菌は、
いずれも４０ｋＤａ蛋白質の〔3 Ｈ〕脂肪酸による標識
は生じなかった（それぞれパネルＢのレーン６および
７）。さらに、４０ｋＤａ蛋白質は、ＮＭＴ１およびＡ
ｌａ2 置換Ｃ−サブユニットをコードする変異体Ｃαｃ
ＤＮＡを発現した細胞内では標識されなかった（パネル
Ｂのレーン５）。マウスＰＫ−ＡのＣ−サブユニットに
対するウサギポリクローナル抗血清を用いたウエスタン
ブロット解析により、野性型および変異体Ｃα組換えプ
ラスミドをそれぞれ含有する大腸菌ＪＭ１０１株から調
整された溶解質中に当量のＧｌｙ2 −およびＡｌａ2 −
４０ｋＤａ蛋白質の存在が確認された（図１Ｅ）。２種
のＣ−サブユニットの産生レベルは、ウエスタンブロッ
トに含有された精製Ｃ−サブユニット標品のシグナル強
度に基づいて総大腸菌蛋白質の０．１％と評価された。
ＮＭＴは誘導後、大腸菌蛋白質の約０．２％を示した。
この値は粗溶解質中のＮＭＴ活性および精製酵母ＮＭＴ
の比活性（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１
９８７）から計算した。ＮＭＴ１とＣαの共発現は、誘
導期における大腸菌の増殖速度に悪影響を与えることは
なかった。
含有組換え誘導体の対合組合せを大腸菌ＪＭ１０１株に
トランスフェクションし、それらをアンピシリンおよび
カナマイシン選択によって維持した。対数的に増殖して
いる細胞の培養液を標識するために、酵母ＮＭＴ１つい
でＣαの連続的発現時に〔3 Ｈ〕ミリステートを使用し
た。この培養液から調整した溶菌液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
およびフルオログラフィーに付し、蛋白質中への放射標
識脂肪酸の取り込みを調べた。ＮＭＴ１および野性型Ｃ
α配列を大腸菌内で共発現させたところ、４０ｋＤａ蛋
白質は培養培地に〔3 Ｈ〕ミリスチン酸の添加後に代謝
的に標識された（図１Ｂのレーン４）。この蛋白質は、
精製Ｃ−サブユニット標準と共移動した。４０ｋＤａ蛋
白質の標識化はＮＭＴ１および野性型Ｃα両者の存在に
絶対的に依存した。ＮＭＴ１を発現したがＣαを欠く大
腸菌およびＮＭＴ１を欠くがＣαを発現した大腸菌は、
いずれも４０ｋＤａ蛋白質の〔3 Ｈ〕脂肪酸による標識
は生じなかった（それぞれパネルＢのレーン６および
７）。さらに、４０ｋＤａ蛋白質は、ＮＭＴ１およびＡ
ｌａ2 置換Ｃ−サブユニットをコードする変異体Ｃαｃ
ＤＮＡを発現した細胞内では標識されなかった（パネル
Ｂのレーン５）。マウスＰＫ−ＡのＣ−サブユニットに
対するウサギポリクローナル抗血清を用いたウエスタン
ブロット解析により、野性型および変異体Ｃα組換えプ
ラスミドをそれぞれ含有する大腸菌ＪＭ１０１株から調
整された溶解質中に当量のＧｌｙ2 −およびＡｌａ2 −
４０ｋＤａ蛋白質の存在が確認された（図１Ｅ）。２種
のＣ−サブユニットの産生レベルは、ウエスタンブロッ
トに含有された精製Ｃ−サブユニット標品のシグナル強
度に基づいて総大腸菌蛋白質の０．１％と評価された。
ＮＭＴは誘導後、大腸菌蛋白質の約０．２％を示した。
この値は粗溶解質中のＮＭＴ活性および精製酵母ＮＭＴ
の比活性（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１
９８７）から計算した。ＮＭＴ１とＣαの共発現は、誘
導期における大腸菌の増殖速度に悪影響を与えることは
なかった。
【００４１】〔3 Ｈ〕ミリステート標識４０ｋＤａ蛋白
質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し、Ｐ
ｒｏｎａｓｅＥで消化して脂肪酸アシル−蛋白質結合の
性質を検討した。Ｃ18逆相高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄｏ
ｎ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
６：５２６２〜５２６６，１９８９）上で化学的に合成
した〔3 Ｈ〕ミリストイルグリシン標品（Ｔｏｗｌｅｒ
＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２
５：８７８〜８８４，１９８６）と共移動する標識生成
物が生成した。これらのデータを考え合わせると、
（ｉ）ＰＫ−ＡのＣ−サブユニットは、酵母ＮＭＴを産
生する大腸菌細胞中でのみＧｌｙ2 依存製の様式でミリ
ストイル化される、および（ii）大腸菌の内因製メチオ
ニルアミノペプチダーゼ活性（Ｓｈｅｒｍａｎら：Ｂｉ
ｏＥｓｓａｙｓ ３：２７〜３１，１９８５）はＣ−サ
ブユニットのイニシェータ−Ｍｅｔを除去することがで
きて、ミリステートのＮＭＴ触媒転移に対してそのＧｌ
ｙ2 残基を暴露させるとの結論が支持された。この後者
の結果は、大腸菌内で合成されたＣ−サブユニットのＮ
Ｈ2 末端配列をＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ…とし
て同定した以前の結果（Ｓｌｉｃｅ ＆ Ｔｏｙｌｏ
ｒ：前出）を確認するものである。
質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し、Ｐ
ｒｏｎａｓｅＥで消化して脂肪酸アシル−蛋白質結合の
性質を検討した。Ｃ18逆相高速液体クロマトグラフィー
（ＨＰＬＣ）（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄｏ
ｎ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８
６：５２６２〜５２６６，１９８９）上で化学的に合成
した〔3 Ｈ〕ミリストイルグリシン標品（Ｔｏｗｌｅｒ
＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２
５：８７８〜８８４，１９８６）と共移動する標識生成
物が生成した。これらのデータを考え合わせると、
（ｉ）ＰＫ−ＡのＣ−サブユニットは、酵母ＮＭＴを産
生する大腸菌細胞中でのみＧｌｙ2 依存製の様式でミリ
ストイル化される、および（ii）大腸菌の内因製メチオ
ニルアミノペプチダーゼ活性（Ｓｈｅｒｍａｎら：Ｂｉ
ｏＥｓｓａｙｓ ３：２７〜３１，１９８５）はＣ−サ
ブユニットのイニシェータ−Ｍｅｔを除去することがで
きて、ミリステートのＮＭＴ触媒転移に対してそのＧｌ
ｙ2 残基を暴露させるとの結論が支持された。この後者
の結果は、大腸菌内で合成されたＣ−サブユニットのＮ
Ｈ2 末端配列をＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ…とし
て同定した以前の結果（Ｓｌｉｃｅ ＆ Ｔｏｙｌｏ
ｒ：前出）を確認するものである。
【００４２】大腸菌内でのＣ−サブユニットに対するミ
リストイル基のＮＭＴ触媒結合の総効率は、以下の３種
のパラメーター、すなわち、（１）ウェスタンブロット
・ハイブリダイゼーション解析からの大腸菌溶解質中の
Ｃ−サブユニット濃度；（２）既知量の大腸菌溶解質蛋
白質を含有する、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから
のバンドを切り出したのち、蛋白質中に取り込まれる〔
3 Ｈ〕ミリステートの量；および（３）標識後大腸菌2
中の〔3 Ｈ〕ミリスチン酸の最終比活性（１３μｍＣｉ
／ｎｍｏｌ）（Ｓｉｌｂｅｒｔら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ １２：１６４〜１７１，１９７３）の測定によ
り、事実上１００％と評価された。
リストイル基のＮＭＴ触媒結合の総効率は、以下の３種
のパラメーター、すなわち、（１）ウェスタンブロット
・ハイブリダイゼーション解析からの大腸菌溶解質中の
Ｃ−サブユニット濃度；（２）既知量の大腸菌溶解質蛋
白質を含有する、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから
のバンドを切り出したのち、蛋白質中に取り込まれる〔
3 Ｈ〕ミリステートの量；および（３）標識後大腸菌2
中の〔3 Ｈ〕ミリスチン酸の最終比活性（１３μｍＣｉ
／ｎｍｏｌ）（Ｓｉｌｂｅｒｔら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ １２：１６４〜１７１，１９７３）の測定によ
り、事実上１００％と評価された。
【００４３】大腸菌内での蛋白質Ｎ−ミリストイル化の
再構築は１４炭素脂肪酸に特異的である：１０−（プロ
ポキシ）デカン酸（１１−オキサミリスチン酸）は、類
似の鎖長を有するが、炭化水素鎖の１１位のメチレン基
が酸素原子で置換されたことにより疎水性が低下してい
る（デカン酸に匹敵する）ミリスチン酸の類縁体である
（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９５〜８７９９，１９
８８）。１１−オキサミリステートをｉｎｖｉｖｏにお
いてｐ６０v-src に取り込ませると、膜から細胞質分画
への蛋白質の有意な再分布を生じる。（Ｈｅｕｃｋｅｒ
ｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８６：５２６２〜５２６６，１９８９）。上述し
たのと類似の〔3 Ｈ〕ミリスチン酸による代謝標識試験
では、ＮＭＴ産生大腸菌細胞に外因性〔3 Ｈ〕１１−オ
キサミリステートまたは〔3 Ｈ〕パルミテートを加えた
場合も、Ｃ−サブユニットは同様にＧｌｙ2 依存性様式
で標識されることが示された（それぞれ図１のパネルＤ
およびＣ）。以前の研究では、パルミテートは代謝的に
ミリステートに変換されたのち、Ｎ−ミリストイル蛋白
質に取り込まれるに違いないことが示唆されている（Ｈ
ｅｕｃｋｅｒｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８７９５〜８７９９，１９
８８；Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２５：８７８−８８４，１９８０；Ｏｌ
ｓｏｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７８４
〜３７９０，１９８４）。〔3 Ｈ〕パルミテート標識Ｃ
−サブユニットをＰｒｏｎａｓｅＥで消化すると、Ｃ18
逆相ＨＰＬＣで〔3 Ｈ〕ミリストイルグリシンと共移動
する生成物が得られた。すなわち、ビール酵母菌や哺乳
動物細胞で観察される脂肪酸アシル−ＣｏＡ鎖長に対す
る顕著な特異性が、大腸菌における両者同時の発現によ
って再現される。
再構築は１４炭素脂肪酸に特異的である：１０−（プロ
ポキシ）デカン酸（１１−オキサミリスチン酸）は、類
似の鎖長を有するが、炭化水素鎖の１１位のメチレン基
が酸素原子で置換されたことにより疎水性が低下してい
る（デカン酸に匹敵する）ミリスチン酸の類縁体である
（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９５〜８７９９，１９
８８）。１１−オキサミリステートをｉｎｖｉｖｏにお
いてｐ６０v-src に取り込ませると、膜から細胞質分画
への蛋白質の有意な再分布を生じる。（Ｈｅｕｃｋｅｒ
ｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ ８６：５２６２〜５２６６，１９８９）。上述し
たのと類似の〔3 Ｈ〕ミリスチン酸による代謝標識試験
では、ＮＭＴ産生大腸菌細胞に外因性〔3 Ｈ〕１１−オ
キサミリステートまたは〔3 Ｈ〕パルミテートを加えた
場合も、Ｃ−サブユニットは同様にＧｌｙ2 依存性様式
で標識されることが示された（それぞれ図１のパネルＤ
およびＣ）。以前の研究では、パルミテートは代謝的に
ミリステートに変換されたのち、Ｎ−ミリストイル蛋白
質に取り込まれるに違いないことが示唆されている（Ｈ
ｅｕｃｋｅｒｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８７９５〜８７９９，１９
８８；Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ２５：８７８−８８４，１９８０；Ｏｌ
ｓｏｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７８４
〜３７９０，１９８４）。〔3 Ｈ〕パルミテート標識Ｃ
−サブユニットをＰｒｏｎａｓｅＥで消化すると、Ｃ18
逆相ＨＰＬＣで〔3 Ｈ〕ミリストイルグリシンと共移動
する生成物が得られた。すなわち、ビール酵母菌や哺乳
動物細胞で観察される脂肪酸アシル−ＣｏＡ鎖長に対す
る顕著な特異性が、大腸菌における両者同時の発現によ
って再現される。
【００４４】約４５および５５ｋＤａの少なくとも２種
の蛋白質が、酵母ＮＭＴを発現する大腸菌株中で外因性
に添加された３種のすべての〔3 Ｈ〕脂肪酸を取り込ん
だ（図１のパネルＢ〜Ｄにおけるレーン３〜６）。プラ
スミドをもたない細胞（レーン１）またはＮＭＴ１を欠
く親ベクターを有する細胞（レーン２）は、これらの蛋
白質に標識を取り込まなかった。これらの蛋白質の見掛
けのＭｒは大腸菌内で産生さたＮＭＴの２種の型と著し
く類似しているので、蛋白質−〔3 Ｈ〕脂肪酸結合の性
質が検討された。〔3 Ｈ〕ミリステートまたは〔3 Ｈ〕
パルミテートのいずれかで標識されたこれらの蛋白質の
ＰｒｏｎａｓｅＥ消化で、Ｃ18逆相ＨＰＬＣ上〔3 Ｈ〕
ミリストイルグリシンと共移動する生成物が生成した。
ミリストイルグリシンが検出されたという事実は、完全
な酵母ＮＭＴもその蛋白分解処理４５ｋＤａ型もそのＮ
Ｈ2 末端にはＧｌｙを含まないとい所見とともに、これ
らの〔3 Ｈ〕蛋白質はＮＭＴ自体のＮ−ミリストイル化
によって生じたものではなく、内因性の大腸菌蛋白質の
ミリストイル化によって生成したとの結論を支持するも
のであった。しかしながら、一部のバンドの強度が〔3
Ｈ〕脂肪酸とＮＭＴ種の緊密な非共有結合的結合によっ
て生じたとの可能性は否定できない。ＭｅｔＧｌｙ…で
始まり、したがってＮＭＴによってアシル化される可能
性のある大腸菌蛋白質配列をＮＢＲＦ蛋白質データベー
ス（レリーズ１９．０）について検索したが（Ｔｏｗｌ
ｅｒら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６３：１７８４〜
１７９０，１９８８；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら：Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５，１９８
４）、適当な分子量のものは見出せなかった。これらの
２種の「内因性」蛋白質基質があっても、細菌系が真核
細胞系に優る大きな利点は、内因性ＮＭＴ活性および基
質の両者が存在しないことである。ＮＭＴに付する代替
基質たとえばヘテロ原子含有類縁体の試験は、真核細胞
中におけるよりもはるかに簡易化される。
の蛋白質が、酵母ＮＭＴを発現する大腸菌株中で外因性
に添加された３種のすべての〔3 Ｈ〕脂肪酸を取り込ん
だ（図１のパネルＢ〜Ｄにおけるレーン３〜６）。プラ
スミドをもたない細胞（レーン１）またはＮＭＴ１を欠
く親ベクターを有する細胞（レーン２）は、これらの蛋
白質に標識を取り込まなかった。これらの蛋白質の見掛
けのＭｒは大腸菌内で産生さたＮＭＴの２種の型と著し
く類似しているので、蛋白質−〔3 Ｈ〕脂肪酸結合の性
質が検討された。〔3 Ｈ〕ミリステートまたは〔3 Ｈ〕
パルミテートのいずれかで標識されたこれらの蛋白質の
ＰｒｏｎａｓｅＥ消化で、Ｃ18逆相ＨＰＬＣ上〔3 Ｈ〕
ミリストイルグリシンと共移動する生成物が生成した。
ミリストイルグリシンが検出されたという事実は、完全
な酵母ＮＭＴもその蛋白分解処理４５ｋＤａ型もそのＮ
Ｈ2 末端にはＧｌｙを含まないとい所見とともに、これ
らの〔3 Ｈ〕蛋白質はＮＭＴ自体のＮ−ミリストイル化
によって生じたものではなく、内因性の大腸菌蛋白質の
ミリストイル化によって生成したとの結論を支持するも
のであった。しかしながら、一部のバンドの強度が〔3
Ｈ〕脂肪酸とＮＭＴ種の緊密な非共有結合的結合によっ
て生じたとの可能性は否定できない。ＭｅｔＧｌｙ…で
始まり、したがってＮＭＴによってアシル化される可能
性のある大腸菌蛋白質配列をＮＢＲＦ蛋白質データベー
ス（レリーズ１９．０）について検索したが（Ｔｏｗｌ
ｅｒら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６３：１７８４〜
１７９０，１９８８；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら：Ｎｕｃｌ．
Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５，１９８
４）、適当な分子量のものは見出せなかった。これらの
２種の「内因性」蛋白質基質があっても、細菌系が真核
細胞系に優る大きな利点は、内因性ＮＭＴ活性および基
質の両者が存在しないことである。ＮＭＴに付する代替
基質たとえばヘテロ原子含有類縁体の試験は、真核細胞
中におけるよりもはるかに簡易化される。
【００４５】
【表１】 表１．大腸菌誘導ビール酵母菌ＮＭＴのペプチドおよび
アシル−ＣｏＡ基質特異性
アシル−ＣｏＡ基質特異性
【００４６】上記表１に示したペプチドＫｍおよびＶｍ
ａｘ値は４または５点ラインウィーバー・バークのプロ
ットから得られた平均である。これらのプロットは少な
くとも３回の独立のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで得られ
たデータを用いて作成された。ペプチドの濃度を変動さ
せ、１５μＭのミリステートを用いて検定を行い、ペプ
チドのＫｍおよびＶｍａｘ値を求めた。脂肪酸アシル−
ＣｏＡ ＫｍおよびＶｍａｘ値は、脂肪酸の濃度を変動
させ６０μＭ ＧＮＡＡＡＡＲＲ（すなわちそのＫｍ濃
度でのペプチド）を用いたほかは同様にして得られた。
酵母ＮＭＴは５７０倍精製プレパレーションである（Ｔ
ｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１９８７）。
合成ペプチド基質は慣用の一文字アミノ酸記号で示す。
Ｖｍａｘ値は、ペプチドおよびアシル−ＣｏＡ基質とし
てそれぞれＧＮＡＡＡＡＲＲおよびミリストイル−Ｃｏ
Ａを用いた場合の値の百分率として表す。（−−）は、
正確にＫｍを決定するのに必要な酵素の量が禁制的に大
きいことを示す。「基質でない」と表示されたペプチド
はＶｍａｘが＜１％であった。ＮＤは測定していないこ
とを意味する。以上の開示を読んだ後には、本技術分野
の熟練者には本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく様々な他の例が明らかであろう。このような他の例
はすべて、特許請求の範囲に包含されるものである。
ａｘ値は４または５点ラインウィーバー・バークのプロ
ットから得られた平均である。これらのプロットは少な
くとも３回の独立のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで得られ
たデータを用いて作成された。ペプチドの濃度を変動さ
せ、１５μＭのミリステートを用いて検定を行い、ペプ
チドのＫｍおよびＶｍａｘ値を求めた。脂肪酸アシル−
ＣｏＡ ＫｍおよびＶｍａｘ値は、脂肪酸の濃度を変動
させ６０μＭ ＧＮＡＡＡＡＲＲ（すなわちそのＫｍ濃
度でのペプチド）を用いたほかは同様にして得られた。
酵母ＮＭＴは５７０倍精製プレパレーションである（Ｔ
ｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１９８７）。
合成ペプチド基質は慣用の一文字アミノ酸記号で示す。
Ｖｍａｘ値は、ペプチドおよびアシル−ＣｏＡ基質とし
てそれぞれＧＮＡＡＡＡＲＲおよびミリストイル−Ｃｏ
Ａを用いた場合の値の百分率として表す。（−−）は、
正確にＫｍを決定するのに必要な酵素の量が禁制的に大
きいことを示す。「基質でない」と表示されたペプチド
はＶｍａｘが＜１％であった。ＮＤは測定していないこ
とを意味する。以上の開示を読んだ後には、本技術分野
の熟練者には本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく様々な他の例が明らかであろう。このような他の例
はすべて、特許請求の範囲に包含されるものである。
【図１】図１は、ＦＩＧ．１Ａであり、本発明による大
腸菌内でのＮＭＴ１およびＣαＤＮＡの発現に用いられ
るプラスミド構築体を示す。
腸菌内でのＮＭＴ１およびＣαＤＮＡの発現に用いられ
るプラスミド構築体を示す。
【図２】図２は、ＦＩＧ．１Ｂ〜１Ｄであって、様々な
プラスミドを含む大腸菌形質転換体からの溶解質蛋白質
のゲルパターンを示す図であり、Ｂ１，１Ｃおよび１Ｄ
はそれぞれ、外因的に〔3 Ｈ〕ミリステート、〔3 Ｈ〕
パルミテートおよび〔3Ｈ〕１０−（プロポキシ）デカ
ノエートが添加されている。
プラスミドを含む大腸菌形質転換体からの溶解質蛋白質
のゲルパターンを示す図であり、Ｂ１，１Ｃおよび１Ｄ
はそれぞれ、外因的に〔3 Ｈ〕ミリステート、〔3 Ｈ〕
パルミテートおよび〔3Ｈ〕１０−（プロポキシ）デカ
ノエートが添加されている。
【図３】図３は、ＦＩＧ．１Ｅであり、野性型Ｇｌｙ2
−Ｃ−サブユニットまたは変異体Ａｌａ2 −Ｃ−サブユ
ニットを含有する大腸菌の溶解質のウェスタンブロット
を示す。
−Ｃ−サブユニットまたは変異体Ａｌａ2 −Ｃ−サブユ
ニットを含有する大腸菌の溶解質のウェスタンブロット
を示す。
【図４】図４は、ＦＩＧ．２であり、ＦＩＧ．１Ａに記
載された発現プラスミドの構築に用いられた親プラスミ
ドを示す。
載された発現プラスミドの構築に用いられた親プラスミ
ドを示す。
【手続補正書】
【提出日】平成６年３月２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の詳細な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の詳細な説明】
【０００１】発明の背景 本発明は、Ｎ−ミリストイル化蛋白質の製造方法に関
し、さらに詳しくはＮ−ミリストイルトランスフェラー
ゼ（ＮＭＴ）およびその蛋白質基質の大腸菌内における
共発現に関する。
し、さらに詳しくはＮ−ミリストイルトランスフェラー
ゼ（ＮＭＴ）およびその蛋白質基質の大腸菌内における
共発現に関する。
【０００２】特定の真核生物蛋白質の脂肪酸アシル化は
確立された過程であり、便宜上２種類に分けることがで
きる。一方において、パルミテート（ｃ１６：０）が翻
訳後にエステルまたはチオエステル結合を介して膜蛋白
質に結合される。
確立された過程であり、便宜上２種類に分けることがで
きる。一方において、パルミテート（ｃ１６：０）が翻
訳後にエステルまたはチオエステル結合を介して膜蛋白
質に結合される。
【０００３】他方では、ミリステート（ｃ１４：０）は
アミド結合を介して可溶性膜蛋白質に共有結合する。こ
れは翻訳と同時に起こる現象と考えられる。Ｎ−ミリス
トイル化蛋白質においては、アミノ末端グリシン残基が
アシル化部位であることが知られている。ミリストイル
ＣｏＡ：プロテインＮ−ミリストイルトランスフェラー
ゼ（ＮＭＴ，Ｅ．Ｃ．２．３．１．９７）は、この翻訳
時修飾を触媒する。ＮＭＴ構造遺伝子（ＮＭＴ１）は最
近、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）からクローン化された（Ｄｕｒｏｎ
ｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：７９６〜８００，１９
８９参照）。この遺伝子は４５５個のアミノ酸のポリペ
プチド（Ｍｒ＝５２，８３７）をコードしている。
アミド結合を介して可溶性膜蛋白質に共有結合する。こ
れは翻訳と同時に起こる現象と考えられる。Ｎ−ミリス
トイル化蛋白質においては、アミノ末端グリシン残基が
アシル化部位であることが知られている。ミリストイル
ＣｏＡ：プロテインＮ−ミリストイルトランスフェラー
ゼ（ＮＭＴ，Ｅ．Ｃ．２．３．１．９７）は、この翻訳
時修飾を触媒する。ＮＭＴ構造遺伝子（ＮＭＴ１）は最
近、ビール酵母菌（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅ
ｒｅｖｉｓｉａｅ）からクローン化された（Ｄｕｒｏｎ
ｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ２４３：７９６〜８００，１９
８９参照）。この遺伝子は４５５個のアミノ酸のポリペ
プチド（Ｍｒ＝５２，８３７）をコードしている。
【０００４】多様なウイルスおよび細胞蛋白質が、その
アミノ端末におけるグリシンへのアミド結合を介して結
合したミリステートの共有結合的付着によって修飾され
ていることが明らかにされている。このような修飾は、
ある種のＮ−ミリストイル化蛋白質の生物学的機能の完
全な発現に必須である。最も徹底的に研究されているミ
リストイル化蛋白質の例にはラウス肉腫ウイルスの形質
転換蛋白質、ｐ６０ｖ−ｓｒｃがある。そのＮ−末端グ
リシンにミリステートの共有結合による付着がなけれ
ば、そのチロシンキナーゼ活性は正常に維持されている
ものの、その蛋白質には細胞の形質転換能はない。
アミノ端末におけるグリシンへのアミド結合を介して結
合したミリステートの共有結合的付着によって修飾され
ていることが明らかにされている。このような修飾は、
ある種のＮ−ミリストイル化蛋白質の生物学的機能の完
全な発現に必須である。最も徹底的に研究されているミ
リストイル化蛋白質の例にはラウス肉腫ウイルスの形質
転換蛋白質、ｐ６０ｖ−ｓｒｃがある。そのＮ−末端グ
リシンにミリステートの共有結合による付着がなけれ
ば、そのチロシンキナーゼ活性は正常に維持されている
ものの、その蛋白質には細胞の形質転換能はない。
【０００５】
【０００６】上述の蛋白質脂肪酸アシル化に関するその
他の背景情報については、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ大学医
学部の関連研究者による以下の一連の論文が参考にな
る。 Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２５：８７８〜８８４（１９８６）； Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２８１２〜２８
１６（１９８６）； Ｔｏｗｌｅｒ ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２（１９８
７）； Ｔｏｗｌｅｒ ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：
１０３０〜１０３６（１９８７）； Ｔｏｗｌｅｒ ら：Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．
５７：６９〜９９（１９８８）； Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９５〜８７９９（１９
８８）；および Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ：Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５２６２
〜５２６６（１９８９）
他の背景情報については、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ大学医
学部の関連研究者による以下の一連の論文が参考にな
る。 Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ ２５：８７８〜８８４（１９８６）； Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：２８１２〜２８
１６（１９８６）； Ｔｏｗｌｅｒ ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２（１９８
７）； Ｔｏｗｌｅｒ ら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：
１０３０〜１０３６（１９８７）； Ｔｏｗｌｅｒ ら：Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｉｍ．
５７：６９〜９９（１９８８）； Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９５〜８７９９（１９
８８）；および Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ：Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５２６２
〜５２６６（１９８９）
【０００７】ミリストイル化酵素の基質として有用な、
比較的短いアミノ酸配列を有する独特な合成ペプチド
が、米国特許第４，７４０，５８８号および第４，７７
８，８７８号に記載されている。このようなペプチドの
例には、
比較的短いアミノ酸配列を有する独特な合成ペプチド
が、米国特許第４，７４０，５８８号および第４，７７
８，８７８号に記載されている。このようなペプチドの
例には、
【化１】 がある。
【０００８】ある種の他の独特な合成ペプチドは、米国
特許第４，７０９，０１２号および第４，７７８，８７
７号に記載にされているようなミリストイル化酵素のイ
ンヒビターである。Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら（前出）；
Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆Ｇｏｒｄｏｎ（前出）；Ｂｒ
ｙａｎｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：８６５５〜８６５９，１９８９）；およ
びＭｕｍｂｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７：７２８〜７３２，１９９０）は、抗
ウイルス剤、抗カビ剤および抗新生物剤として使用でき
る可能性がある。ミリストイル化酵素の新規な脂肪酸類
縁体基質を報告している。これらの基質化合物は、モノ
およびジヘテロ原子置換脂肪酸類縁体であって、ヘテロ
原子、酸素および／または硫黄がＣ１３〜Ｃ１４脂肪酸
の脂肪酸鎖における炭素位置４〜１３のメチレン（−Ｃ
Ｈ２−）基を置換している。このような脂肪酸類縁体の
例には、１１−オキサミリスチン酸および１３−オキサ
ミリスチン酸がある。これらの脂肪酸類縁体のＣｏＡエ
ステルは、ＮＭＴの基質であって、選択的に細胞または
ウイルスＮ−ミリストイル蛋白質のサブセットに転移さ
れ、そこで蛋白質機能を変化させることができる。
特許第４，７０９，０１２号および第４，７７８，８７
７号に記載にされているようなミリストイル化酵素のイ
ンヒビターである。Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら（前出）；
Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆Ｇｏｒｄｏｎ（前出）；Ｂｒ
ｙａｎｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ ８６：８６５５〜８６５９，１９８９）；およ
びＭｕｍｂｙら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８７：７２８〜７３２，１９９０）は、抗
ウイルス剤、抗カビ剤および抗新生物剤として使用でき
る可能性がある。ミリストイル化酵素の新規な脂肪酸類
縁体基質を報告している。これらの基質化合物は、モノ
およびジヘテロ原子置換脂肪酸類縁体であって、ヘテロ
原子、酸素および／または硫黄がＣ１３〜Ｃ１４脂肪酸
の脂肪酸鎖における炭素位置４〜１３のメチレン（−Ｃ
Ｈ２−）基を置換している。このような脂肪酸類縁体の
例には、１１−オキサミリスチン酸および１３−オキサ
ミリスチン酸がある。これらの脂肪酸類縁体のＣｏＡエ
ステルは、ＮＭＴの基質であって、選択的に細胞または
ウイルスＮ−ミリストイル蛋白質のサブセットに転移さ
れ、そこで蛋白質機能を変化させることができる。
【０００９】本発明によれば、Ｎ−ミリストイル−トラ
ンスフェラーゼ（ＮＭＴ，Ｅ．Ｃ．２．３．１．９７）
とその蛋白質基質を大腸菌内で共発現させる新規な方法
が提供される。二相性プラスミド系を使用して、ＮＭＴ
遣伝子と哺乳動物蛋白質をコードするｃＤＮＡを同時に
発現させることにより、哺乳動物蛋白質のミリストイル
化を大腸菌内で再構成することができる。
ンスフェラーゼ（ＮＭＴ，Ｅ．Ｃ．２．３．１．９７）
とその蛋白質基質を大腸菌内で共発現させる新規な方法
が提供される。二相性プラスミド系を使用して、ＮＭＴ
遣伝子と哺乳動物蛋白質をコードするｃＤＮＡを同時に
発現させることにより、哺乳動物蛋白質のミリストイル
化を大腸菌内で再構成することができる。
【００１０】本発明の新規な方法は、蛋白質Ｎ−ミリス
トイル化の基質要求性および生物学的作用、ならびにＮ
ＭＴの構造活性相関の研究のために新しいシステムを提
供する。本発明を例示すれば、内因性ＮＭＴ活性をもた
ない細菌である大腸菌内での酵母ＮＭＴ１遺伝子の発現
は、完全な５３ｋＤａのＮＭＴポリペプチドと同時にそ
のＮＨ２末端３９アミノ酸の蛋白分解除去に由来する截
頭ポリペプチドの産生を生じる。それぞれの大腸菌合成
ＮＭＴ種は、酵素活性のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで判
定して、ビール酵母菌から回収されたＮＭＴの場合と識
別できない脂肪酸およびペプチド基質特異性を有し、こ
れはこの酵素のＮＨ２−末端ドメインはその触媒活性に
は必要でないことを示唆している。二相性プラスミド系
を用いて、酵母ＮＭＴ１遺伝子と、ｃＡＭＰ依存性プロ
テインキナーゼ（ＰＫ−Ａ）の触媒性（ｃ）サブユニッ
トとコードするマウスｃＤＮＡを同時に発現させること
により、大腸菌内で哺乳動物蛋白質のＮ−ミリストイル
化が再構築された。代謝標識試験では、この系にＮ−メ
リストイル化の脂肪酸特異性が保存されていることを示
した。〔３Ｈ〕ミリスチン酸はＣ−サブユニットのＧ１
ｙ１残基に効率的に結合したが、〔３Ｈ〕パルミテート
は結合しなかった。
トイル化の基質要求性および生物学的作用、ならびにＮ
ＭＴの構造活性相関の研究のために新しいシステムを提
供する。本発明を例示すれば、内因性ＮＭＴ活性をもた
ない細菌である大腸菌内での酵母ＮＭＴ１遺伝子の発現
は、完全な５３ｋＤａのＮＭＴポリペプチドと同時にそ
のＮＨ２末端３９アミノ酸の蛋白分解除去に由来する截
頭ポリペプチドの産生を生じる。それぞれの大腸菌合成
ＮＭＴ種は、酵素活性のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで判
定して、ビール酵母菌から回収されたＮＭＴの場合と識
別できない脂肪酸およびペプチド基質特異性を有し、こ
れはこの酵素のＮＨ２−末端ドメインはその触媒活性に
は必要でないことを示唆している。二相性プラスミド系
を用いて、酵母ＮＭＴ１遺伝子と、ｃＡＭＰ依存性プロ
テインキナーゼ（ＰＫ−Ａ）の触媒性（ｃ）サブユニッ
トとコードするマウスｃＤＮＡを同時に発現させること
により、大腸菌内で哺乳動物蛋白質のＮ−ミリストイル
化が再構築された。代謝標識試験では、この系にＮ−メ
リストイル化の脂肪酸特異性が保存されていることを示
した。〔３Ｈ〕ミリスチン酸はＣ−サブユニットのＧ１
ｙ１残基に効率的に結合したが、〔３Ｈ〕パルミテート
は結合しなかった。
【００１１】本発明によればまた、疎水性は低下したが
同じ鎖長を有するヘテロ原子含有ミリスチン酸類縁体、
〔３Ｈ〕１０−（プロポキシ）デカン酸は、ＰＫ−Ａの
Ｃ−サブユニットに取り込まれるＮＭＴの有効な代替基
質であることが見出された。
同じ鎖長を有するヘテロ原子含有ミリスチン酸類縁体、
〔３Ｈ〕１０−（プロポキシ）デカン酸は、ＰＫ−Ａの
Ｃ−サブユニットに取り込まれるＮＭＴの有効な代替基
質であることが見出された。
【００１２】このようなミリスチン酸のヘテロ原子含有
類縁体は最近、Ｂｒｙａｎｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８６５５〜８６５
９，１９８９）により、ある種のレトロウイルスの複製
を阻害することが示された。これらのウイルスはそのｇ
ａｇポリ蛋白質前駆体（たとえば、ヒト免疫不全ウイル
ス１；ＨＩＶ−１のＰｒ５５ｇａｇ）へのミリストイル
基の結合に依存しているのである。
類縁体は最近、Ｂｒｙａｎｔら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８６５５〜８６５
９，１９８９）により、ある種のレトロウイルスの複製
を阻害することが示された。これらのウイルスはそのｇ
ａｇポリ蛋白質前駆体（たとえば、ヒト免疫不全ウイル
ス１；ＨＩＶ−１のＰｒ５５ｇａｇ）へのミリストイル
基の結合に依存しているのである。
【００１３】本明細書に定義される細菌系が真核細胞系
に優る大きな利点は、内因性ＮＭＴおよび基質の不存在
下に、与えられた蛋白質のミリストイル化、類縁体置
換、および非ミリストイル化型を、それらの構造および
機能的性質の比較のために製造するさらに簡単な方法を
提供することにある。本方法は、酵素インヒビターなら
びにヘテロ原子含有類縁体のようなＮＭＴ代替基質につ
いて、特定の標的蛋白質にそれらが取り込まれる能力の
スクリーニングを容易にする。最後に、本方法はまた、
他の真核細胞蛋白質の大腸菌内での修飾の再現に有用で
あって、酵素およびそれらの基質の修飾の構造／活性相
関をより容易に評価できる。
に優る大きな利点は、内因性ＮＭＴおよび基質の不存在
下に、与えられた蛋白質のミリストイル化、類縁体置
換、および非ミリストイル化型を、それらの構造および
機能的性質の比較のために製造するさらに簡単な方法を
提供することにある。本方法は、酵素インヒビターなら
びにヘテロ原子含有類縁体のようなＮＭＴ代替基質につ
いて、特定の標的蛋白質にそれらが取り込まれる能力の
スクリーニングを容易にする。最後に、本方法はまた、
他の真核細胞蛋白質の大腸菌内での修飾の再現に有用で
あって、酵素およびそれらの基質の修飾の構造／活性相
関をより容易に評価できる。
【００１４】大腸菌内での酵母ＮＭＴ１の産生には、Ｎ
ＭＴ１遺伝子を適当なプラスミド発現ベクター、たとえ
ばｐＭＯＮ５８４０中にクローン化できる。このプラス
ミドは、無関係な配列のほかに、ｒｅｃＡプロモーター
（ＰｒｅｃＡ）およびバクテリオファーヂＴ７ファージ
遺伝子１０リーダーＲＮＡ由来のリボソーム結合部位
（ｇ１０−ＬＲＢＳ）を含有するｐＭＯＮ５５１５の変
異体であって、さらにＯｌｉｎｓら（Ｇｅｎｅ ７３：
２２７〜２３５，１９８８，Ｏｌｉｎｓ ＆ Ｒａｎｇ
ｗａｌａ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９７
３〜１６９７６，１９８９）によって記載されているよ
うに、大腸菌内での外来性遺伝子の強力な発現に適して
いる。ｐＭＯＮ−５８４０中のｒｅｃＡプロモーターは
ＨｐａＩＩフラグメントとして誘導され、Ｈｏｒｉｉら
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７
７：３１３〜３１７，１９８０）によって報告された配
列のヌクレオチド６３〜２１０に相当する。酵母ＮＭＴ
１遺伝子は親ベクター中にリゲートして、慣用の手順に
よりＮＭＴの発現に使用できる。
ＭＴ１遺伝子を適当なプラスミド発現ベクター、たとえ
ばｐＭＯＮ５８４０中にクローン化できる。このプラス
ミドは、無関係な配列のほかに、ｒｅｃＡプロモーター
（ＰｒｅｃＡ）およびバクテリオファーヂＴ７ファージ
遺伝子１０リーダーＲＮＡ由来のリボソーム結合部位
（ｇ１０−ＬＲＢＳ）を含有するｐＭＯＮ５５１５の変
異体であって、さらにＯｌｉｎｓら（Ｇｅｎｅ ７３：
２２７〜２３５，１９８８，Ｏｌｉｎｓ ＆ Ｒａｎｇ
ｗａｌａ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９７
３〜１６９７６，１９８９）によって記載されているよ
うに、大腸菌内での外来性遺伝子の強力な発現に適して
いる。ｐＭＯＮ−５８４０中のｒｅｃＡプロモーターは
ＨｐａＩＩフラグメントとして誘導され、Ｈｏｒｉｉら
（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７
７：３１３〜３１７，１９８０）によって報告された配
列のヌクレオチド６３〜２１０に相当する。酵母ＮＭＴ
１遺伝子は親ベクター中にリゲートして、慣用の手順に
よりＮＭＴの発現に使用できる。
【００１５】とくに、酵母ＮＭＴ１遺伝子は、そのイニ
シエーターＭｅｔコドンにおけるＮｃｏｌ部位を操作
し、そのＤＮＡをｐＭＯＮ５８４０中にサブクローニン
グすることにより、ｇ１０−Ｌの下流に配置される。こ
の場合、ＮＭＴの転写は、ｐＭＯＮ５８４０中ｇ１０−
Ｌ配列の上流に位置する大腸菌ｒｅｃＡプロモーターの
制御下に置かれる。この組変えプラスミドをもつ大腸菌
ＪＭ１０１細胞を中対数期まで増殖させ、ついでナジル
キシン酸で処理してｒｅｃＡプロモーターを誘導する。
シエーターＭｅｔコドンにおけるＮｃｏｌ部位を操作
し、そのＤＮＡをｐＭＯＮ５８４０中にサブクローニン
グすることにより、ｇ１０−Ｌの下流に配置される。こ
の場合、ＮＭＴの転写は、ｐＭＯＮ５８４０中ｇ１０−
Ｌ配列の上流に位置する大腸菌ｒｅｃＡプロモーターの
制御下に置かれる。この組変えプラスミドをもつ大腸菌
ＪＭ１０１細胞を中対数期まで増殖させ、ついでナジル
キシン酸で処理してｒｅｃＡプロモーターを誘導する。
【００１６】上述のプラスミド系を用い、ついでＮＭＴ
を、細胞溶解質の連続的硫酸アンモニウム沈殿、ＤＥＡ
Ｅ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＣＬ−６ＢおよびＣｏＡ−
アガロースアフィニティークロマトグラフィーによって
約７５０倍に精製した。ＮＭＴ活性に対する結合ｉｎ
ｖｉｔｒｏアッセイ（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅ
ｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８３：２８１２〜２８１６，１９８６）を用いることに
より、部分精製大腸菌由来ＮＭＴは、様々なペプチド基
質に対して、酵母からの部分精製ＮＭＴプレパレーショ
ンの場合とほぼ同一のＫｍおよびＶｍａｘ値を示すこと
が明らかにされた。
を、細胞溶解質の連続的硫酸アンモニウム沈殿、ＤＥＡ
Ｅ−ＳｅｐｈａｒｏｓｅＴＭＣＬ−６ＢおよびＣｏＡ−
アガロースアフィニティークロマトグラフィーによって
約７５０倍に精製した。ＮＭＴ活性に対する結合ｉｎ
ｖｉｔｒｏアッセイ（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅ
ｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８３：２８１２〜２８１６，１９８６）を用いることに
より、部分精製大腸菌由来ＮＭＴは、様々なペプチド基
質に対して、酵母からの部分精製ＮＭＴプレパレーショ
ンの場合とほぼ同一のＫｍおよびＶｍａｘ値を示すこと
が明らかにされた。
【００１７】大腸菌内で酵母ＮＭＴ１遺伝子と、Ｕｈｌ
ｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３：１３００〜１３０４，１９８６）によって記
載されたｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫ−
Ａ）のマウスＣα触媒サブユニットをコードするｃＤＮ
Ａ（Ｃα）を共発現するために、二相性プラスミド系が
使用された。ひとつのプラスミドは、カナマイシン抵抗
性遺伝子およびｐ１５Ａ複製起源を含有するｐＡＣＹ１
７７の誘導体であるｐＭＯＮ５８３９中に１．９ｋｂ
ＮｃｏＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩＮＭＴ１フラグメントをクロ
ーニングすることによって構築された。もうひとつのプ
ラスミドは、アンピシリン対抗性遺伝子およひＣｏｌＥ
１複製起源を含有するｐＭＯＮ２６７０中に１．８ｋｂ
ＮｄｅＩ−ＫｐｎＩＣα ｃＤＮＡをクローニングす
くことによって構築された。
ｅｒら（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３：１３００〜１３０４，１９８６）によって記
載されたｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫ−
Ａ）のマウスＣα触媒サブユニットをコードするｃＤＮ
Ａ（Ｃα）を共発現するために、二相性プラスミド系が
使用された。ひとつのプラスミドは、カナマイシン抵抗
性遺伝子およびｐ１５Ａ複製起源を含有するｐＡＣＹ１
７７の誘導体であるｐＭＯＮ５８３９中に１．９ｋｂ
ＮｃｏＩ〜ＨｉｎｄＩＩＩＮＭＴ１フラグメントをクロ
ーニングすることによって構築された。もうひとつのプ
ラスミドは、アンピシリン対抗性遺伝子およひＣｏｌＥ
１複製起源を含有するｐＭＯＮ２６７０中に１．８ｋｂ
ＮｄｅＩ−ＫｐｎＩＣα ｃＤＮＡをクローニングす
くことによって構築された。
【００１８】ＮＭＴとその蛋白質基質の大腸菌内での共
発現はしたがって、ＮＭＴ構造／活性相関の解析を容易
にし、Ｎ−ミリストイル化に必要なその蛋白質基質の構
造的特徴の同定を助け、各Ｎ−ミリストイル蛋白質の機
能におけるミリストイル残基の役割についての洞察を提
供する。特定のＮ−ミリストイル蛋白質をミリステート
のヘテロ原子含有類縁体で修飾することによる効果は、
大腸菌合成非アシル化、ミリストイル化、および類縁体
置換種の比較試験による直接評価が可能になる。脂肪酸
の代謝欠損大腸菌変異株（Ｓｉｌｂｅｒｔ：Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：３１５〜３３９，１９７
５；Ｎｕｎｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１
６７〜１７１，１９８６）はとくに、外因性脂肪酸およ
びそれらの類縁体のアシル化装置への送達能を改善する
ことにより、これらの試験に有用である。最後に、ＮＭ
Ｔへのアシル−ＣｏＡの結合は各種のペプチド基質に対
する酵素の親和性に影響するとの観察（Ｈｅｕｃｋｅｒ
ｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８５：８７９５〜８７９９，１９８８）を考慮す
ると、大腸菌内におけるＮＭＴとその蛋白質基質の共発
現は、与えられた標的蛋白質への様々な類縁体の取り込
みの相対的な効率のスクリーニングに良好な機能的検定
を提供できる。この意味で、ここに定義されるＮ−ミリ
スチル化系は、有用な抗腫瘍または抗ウイルス剤の同定
の助けになる。
発現はしたがって、ＮＭＴ構造／活性相関の解析を容易
にし、Ｎ−ミリストイル化に必要なその蛋白質基質の構
造的特徴の同定を助け、各Ｎ−ミリストイル蛋白質の機
能におけるミリストイル残基の役割についての洞察を提
供する。特定のＮ−ミリストイル蛋白質をミリステート
のヘテロ原子含有類縁体で修飾することによる効果は、
大腸菌合成非アシル化、ミリストイル化、および類縁体
置換種の比較試験による直接評価が可能になる。脂肪酸
の代謝欠損大腸菌変異株（Ｓｉｌｂｅｒｔ：Ａｎｎ．Ｒ
ｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４４：３１５〜３３９，１９７
５；Ｎｕｎｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：１
６７〜１７１，１９８６）はとくに、外因性脂肪酸およ
びそれらの類縁体のアシル化装置への送達能を改善する
ことにより、これらの試験に有用である。最後に、ＮＭ
Ｔへのアシル−ＣｏＡの結合は各種のペプチド基質に対
する酵素の親和性に影響するとの観察（Ｈｅｕｃｋｅｒ
ｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ，８５：８７９５〜８７９９，１９８８）を考慮す
ると、大腸菌内におけるＮＭＴとその蛋白質基質の共発
現は、与えられた標的蛋白質への様々な類縁体の取り込
みの相対的な効率のスクリーニングに良好な機能的検定
を提供できる。この意味で、ここに定義されるＮ−ミリ
スチル化系は、有用な抗腫瘍または抗ウイルス剤の同定
の助けになる。
【００１９】上述の親プラスミドベクター、ｐＭＯＮ２
６７０およびｐＭＯＮ５８４０は大腸菌ＪＭ１０１中に
それぞれ保持させて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに、それぞれ受入番号ＡＴＣＣ
６８２１８およびＡＴＣＣ６８２２０として寄託されて
いる。
６７０およびｐＭＯＮ５８４０は大腸菌ＪＭ１０１中に
それぞれ保持させて、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃ
ｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌ
ｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄに、それぞれ受入番号ＡＴＣＣ
６８２１８およびＡＴＣＣ６８２２０として寄託されて
いる。
【００２０】本明細諸は、本発明を形成するとみなされ
る主題を、特定的に指摘し、明確に請求した特許請求の
範囲をその結論とするが、本発明は添付された図面との
関連で以下に詳細に述べられる本発明の好ましい態様の
説明によってよりよく理解されるものと確信する。
る主題を、特定的に指摘し、明確に請求した特許請求の
範囲をその結論とするが、本発明は添付された図面との
関連で以下に詳細に述べられる本発明の好ましい態様の
説明によってよりよく理解されるものと確信する。
【００２１】図１は、木発明の例示的実施態様におい
て、大腸菌内で合成されたマウスｃＡＭＰ依存性プロテ
インキナーゼ触媒（ｃ）サブユニットのミリストイル化
を５つのパネル、Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥに示す。
て、大腸菌内で合成されたマウスｃＡＭＰ依存性プロテ
インキナーゼ触媒（ｃ）サブユニットのミリストイル化
を５つのパネル、Ａ，Ｂ，Ｃ，ＤおよびＥに示す。
【００２２】図１Ａ（パネルＡ）は、大腸菌内でのＮＭ
Ｔ１およびＣαＤＮＡの発現に用いられたプラスミド構
築体を模式的に示す図である。
Ｔ１およびＣαＤＮＡの発現に用いられたプラスミド構
築体を模式的に示す図である。
【００２３】図１Ｂ，１Ｃおよび１Ｄ（パネルＢ，Ｃお
よびＤ）は、外因的に添加した〔３Ｈ〕ミリステート
（パネルＢ），〔３Ｈ〕パルミテート（パネルＣ）およ
び〔３Ｈ〕１０−（プロポキシ）デカノエート（パネル
Ｄ）で標識後、様々な組合せのプラスミドを含む大腸菌
形質転換体から調整された溶解質のゲルパターンを示し
ている。ついで、〔３Ｈ〕溶解質蛋白質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびフルオログラフィーに付した。矢印は精製さ
れたマウスＣ−サブユニットの移動位置を示す。パネル
ＢおよびＣに示したゲルのフルオログラフィーの露出時
間は４日、一方、パネルＤに示したゲルは１５日間暴露
した。レーン１：大腸菌ＪＭ１０１株、プラスミドな
し；レーン２：ＪＭ１０１プラス親ベクター；レーン
３：ＪＭ１０１プラス組換えＮＭＴ１−およびＣα含有
プラスミド、誘導せず；レーン４：ＪＭ１０１プラスＮ
ＭＴ１およびＣαプラスミド、誘導後；レーン５：ＪＭ
１０１プラスＮＭＴ１および変異体Ａｌａ ２Ｃαプラス
ミド、誘導後；レーン６；ＪＭ１０１プラスＮＭＴ１お
よびＣα挿入体を欠く親ベクター、誘導後；レーン７：
ＪＭ１０１プラスＣαおよびＮＭＴ１挿入体を欠く親ベ
クター、誘導後。
よびＤ）は、外因的に添加した〔３Ｈ〕ミリステート
（パネルＢ），〔３Ｈ〕パルミテート（パネルＣ）およ
び〔３Ｈ〕１０−（プロポキシ）デカノエート（パネル
Ｄ）で標識後、様々な組合せのプラスミドを含む大腸菌
形質転換体から調整された溶解質のゲルパターンを示し
ている。ついで、〔３Ｈ〕溶解質蛋白質をＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥおよびフルオログラフィーに付した。矢印は精製さ
れたマウスＣ−サブユニットの移動位置を示す。パネル
ＢおよびＣに示したゲルのフルオログラフィーの露出時
間は４日、一方、パネルＤに示したゲルは１５日間暴露
した。レーン１：大腸菌ＪＭ１０１株、プラスミドな
し；レーン２：ＪＭ１０１プラス親ベクター；レーン
３：ＪＭ１０１プラス組換えＮＭＴ１−およびＣα含有
プラスミド、誘導せず；レーン４：ＪＭ１０１プラスＮ
ＭＴ１およびＣαプラスミド、誘導後；レーン５：ＪＭ
１０１プラスＮＭＴ１および変異体Ａｌａ ２Ｃαプラス
ミド、誘導後；レーン６；ＪＭ１０１プラスＮＭＴ１お
よびＣα挿入体を欠く親ベクター、誘導後；レーン７：
ＪＭ１０１プラスＣαおよびＮＭＴ１挿入体を欠く親ベ
クター、誘導後。
【００２４】図１Ｅ（パネルＥ）は、野性型Ｇｌｙ２−
Ｃ−サブユニットまたは変異体Ａｌａ２−Ｃ−サブユニ
ットを含有をする大腸菌溶解質のウエスタンブロット解
析を示す。
Ｃ−サブユニットまたは変異体Ａｌａ２−Ｃ−サブユニ
ットを含有をする大腸菌溶解質のウエスタンブロット解
析を示す。
【００２５】図２は、図１に記載されたＮＭＴ１および
Ｃα遺伝子の発現プラスミドの構築に用いられた親プラ
スミドベクター，ｐＭＯＮ５８４０、ｐＭＯＮ２６７０
およびｐＭＯＮ５８３９を模式的に示す図である。
Ｃα遺伝子の発現プラスミドの構築に用いられた親プラ
スミドベクター，ｐＭＯＮ５８４０、ｐＭＯＮ２６７０
およびｐＭＯＮ５８３９を模式的に示す図である。
【００２６】本発明をさらに詳細に例示するために、以
下の例示的な実験室的調整実験を実施した。
下の例示的な実験室的調整実験を実施した。
【００２７】例 材料および方法 大腸菌内でのＮＭＴ−１およびＣαの産生に使用した親
発現ベクター ：この例では、ＣｏｌＥ１複製起源を有す
る２種のプラスミド、すなわち図２に模式的に例示した
ｐＭＯＮ２６７０およびｐＭＯＮ５８４０を使用した。
これらのプラスミドを係留する大腸菌ＪＭ１０１株はＡ
ＴＣＣに寄託され，それぞれ受入番号ＡＴＣＣ６８２１
８およびＡＴＣＣ６８２２０として利用できる。略述す
れば、これらのプラスミドはＯｌｉｎｓら（Ｇｅｎｅ
７３：２２７〜２３５，１９８８）によって記載された
プラスミドｐＭＯＮ５５１５に基づくもので、アンピシ
リン抵抗性マーカー（ＡＭＰｒ）およびＣｏｌＥ１レプ
リコン（ｏｒｉ−ＣｏｌＥ１）、ナリジキシン酸誘導姓
大腸菌ｒｅｃＡプロモーターならびにｇ１０−Ｌリボソ
ーム結合部位から構成される。さらに、ｐＭＯＮ２６７
０はＴ７転写ターミネーター（Ｔ７ｔｅｒ）を有し、一
方、ｐＭＯＮ５８４０はＦ１ファージからの一本鎖複製
起源（ｏｒｉ−Ｆ１）（Ｄｅｎｔｅ：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．１１：１６４５，１９８３）を含有し、こ
れはまた転写ターミネーターとしても働く。この２種の
プラスミドはまた、無関係なコード領域を（ｐＭＯＮ２
６７０ではヒトｐｒｏＡＮＦ遺伝子、ｐｒｏＡＮＦの部
分、ｐＭＯＮ５８４０ではヒトインターロイキン−１遺
伝子、ｈＩＬ−１の部分）Ｇ１０−１リボソーム結合部
位の下流に含有する。唯一のＮＣｏＩ，ＮｄｅＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位がこの無関係なコード領域の単
純な除去を可能にした。
発現ベクター ：この例では、ＣｏｌＥ１複製起源を有す
る２種のプラスミド、すなわち図２に模式的に例示した
ｐＭＯＮ２６７０およびｐＭＯＮ５８４０を使用した。
これらのプラスミドを係留する大腸菌ＪＭ１０１株はＡ
ＴＣＣに寄託され，それぞれ受入番号ＡＴＣＣ６８２１
８およびＡＴＣＣ６８２２０として利用できる。略述す
れば、これらのプラスミドはＯｌｉｎｓら（Ｇｅｎｅ
７３：２２７〜２３５，１９８８）によって記載された
プラスミドｐＭＯＮ５５１５に基づくもので、アンピシ
リン抵抗性マーカー（ＡＭＰｒ）およびＣｏｌＥ１レプ
リコン（ｏｒｉ−ＣｏｌＥ１）、ナリジキシン酸誘導姓
大腸菌ｒｅｃＡプロモーターならびにｇ１０−Ｌリボソ
ーム結合部位から構成される。さらに、ｐＭＯＮ２６７
０はＴ７転写ターミネーター（Ｔ７ｔｅｒ）を有し、一
方、ｐＭＯＮ５８４０はＦ１ファージからの一本鎖複製
起源（ｏｒｉ−Ｆ１）（Ｄｅｎｔｅ：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉ
ｄｓＲｅｓ．１１：１６４５，１９８３）を含有し、こ
れはまた転写ターミネーターとしても働く。この２種の
プラスミドはまた、無関係なコード領域を（ｐＭＯＮ２
６７０ではヒトｐｒｏＡＮＦ遺伝子、ｐｒｏＡＮＦの部
分、ｐＭＯＮ５８４０ではヒトインターロイキン−１遺
伝子、ｈＩＬ−１の部分）Ｇ１０−１リボソーム結合部
位の下流に含有する。唯一のＮＣｏＩ，ＮｄｅＩおよび
ＨｉｎｄＩＩＩ制限部位がこの無関係なコード領域の単
純な除去を可能にした。
【００２８】大腸菌内でのＮＭＴ１の二相性プラスミド
発現には、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ ＆ Ｃｏｈ
ｅｎ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１〜１
１５６，１９７８）に基づくプラスミドベクターを、図
２に模式的に例示したように使用した。このプラスミ
ド、ｐＭＯＮ５８３９を係留する大腸菌ＪＭ１０１株
は、ｐ１５複製起源（ｏｒｉｐ１５Ａ）と選択マーカー
としてカナマイシン抵抗性遺伝子（ＫＡＮｒ）を含有す
る。このプラスミドは誘導可能なｔａｃプロモーター
（Ｐｔａｃ）（ＤｅＢｏｅｒら：ＤＮＡ２：２１３〜２
３５，１９８８）およびファージｐ２２配列由来の転写
ターミネーター（Ｐ２２ｔｅｒ）を含有する。このプラ
スミドはまた、ｇ１０−Ｌリボソーム結合部位の下流に
無関係なコード領域（細菌クロラムファニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ遣伝子，ｃａｔ）を含有するが、
これはＮＣｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断で簡単
に除去できる。
発現には、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ ＆ Ｃｏｈ
ｅｎ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１３４：１１４１〜１
１５６，１９７８）に基づくプラスミドベクターを、図
２に模式的に例示したように使用した。このプラスミ
ド、ｐＭＯＮ５８３９を係留する大腸菌ＪＭ１０１株
は、ｐ１５複製起源（ｏｒｉｐ１５Ａ）と選択マーカー
としてカナマイシン抵抗性遺伝子（ＫＡＮｒ）を含有す
る。このプラスミドは誘導可能なｔａｃプロモーター
（Ｐｔａｃ）（ＤｅＢｏｅｒら：ＤＮＡ２：２１３〜２
３５，１９８８）およびファージｐ２２配列由来の転写
ターミネーター（Ｐ２２ｔｅｒ）を含有する。このプラ
スミドはまた、ｇ１０−Ｌリボソーム結合部位の下流に
無関係なコード領域（細菌クロラムファニコールアセチ
ルトランスフェラーゼ遣伝子，ｃａｔ）を含有するが、
これはＮＣｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによる切断で簡単
に除去できる。
【００２９】大腸菌内でのビール酵母菌ＮＭＴの発現：
２，１キロベース（ｋｂ）ＢａｍＨｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ
ビール酵母菌ゲノムＮＭＴ１フラグメントの７８０塩基
対領域（ヌクレオチド２１３〜９９３）（Ｄｕｒｏｎｉ
ｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９６〜８００，１９
８９）を、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉら：Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３９：４８７〜４９１，１９８８）と変
異体オリゴヌクレオチド（５′ＣＧＧＴＡＧＴＡＡＡＣ
ＧＧＡ−ＴＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧ
ＡＴＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＴ３′）を用いて増幅し
た。これにより、ＮＭＴ１のイニシェーターＡＴＧコド
ンにＮｃｏＩ制限酵素部位の導入が機能になった。新し
いＮｃｏＩ部位はまた、２つのＮＭＴ１のコドンをセリ
ンからアラニンに変化させた。増幅生成物をｐＢＢ１０
５に再ひサブクローニングして（Ｄｕｒｏｎｉｏら：前
出）、変化したＮＭＴ１対立遺伝子を発生させた。Ｎｃ
ｏＩ部位は、ＮＭＴ１遺伝子の、大腸菌ｒｅｃＡプロモ
ーター（Ｈｏｒｉｉら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１，Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３１３〜３１７，１９８
０）およびファージＴ７（図１Ａのｇ１０−Ｌ）から得
られる翻訳エンハンサー要素への連絡を可能にした。こ
れは、新たに生成された１．９ｋｂ ＮｃｏＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントを前述のようにＮｃｏＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ消化ｐＭＯＮ５８４０にリゲーションして行わ
れた。得られたプラスミド（ｐＢＢ１２５）を用いて大
腸菌ＪＭ１０１株を形質転換した（Ｍｅｓｓｉｎｇ：Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ，Ｂｕｌｌ．
２：４５〜４８，１９７９）。形質転換体を、ＬＢ培地
＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン中、３７℃で、ＯＤ
６００が１．０になるまで振盪した。ナリジキシン酸を
最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように添加してｒｅｃＡ
プロモーターを誘導した（Ｆｅｉｎ−Ｓｔｅｉｎら：Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２９２７〜２９４
１，１９８３）。３７℃で１５〜２０分間インキュベー
トしたのち、細胞を遠心分離によって収穫し、Ｐｏｗｅ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）で加圧して（２
０００ポンド／平方インチ）破壊した。ＮＭＴ種は以下
に述べるようにして精製した。
２，１キロベース（ｋｂ）ＢａｍＨｌ−ＨｉｎｄＩＩＩ
ビール酵母菌ゲノムＮＭＴ１フラグメントの７８０塩基
対領域（ヌクレオチド２１３〜９９３）（Ｄｕｒｏｎｉ
ｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９６〜８００，１９
８９）を、ポリメラーゼ連鎖反応（Ｓａｉｋｉら：Ｓｃ
ｉｅｎｃｅ ２３９：４８７〜４９１，１９８８）と変
異体オリゴヌクレオチド（５′ＣＧＧＴＡＧＴＡＡＡＣ
ＧＧＡ−ＴＣＣＡＴＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧ
ＡＴＡＡＡＧＣＧＡＡＡＡＡＡＴ３′）を用いて増幅し
た。これにより、ＮＭＴ１のイニシェーターＡＴＧコド
ンにＮｃｏＩ制限酵素部位の導入が機能になった。新し
いＮｃｏＩ部位はまた、２つのＮＭＴ１のコドンをセリ
ンからアラニンに変化させた。増幅生成物をｐＢＢ１０
５に再ひサブクローニングして（Ｄｕｒｏｎｉｏら：前
出）、変化したＮＭＴ１対立遺伝子を発生させた。Ｎｃ
ｏＩ部位は、ＮＭＴ１遺伝子の、大腸菌ｒｅｃＡプロモ
ーター（Ｈｏｒｉｉら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ１，Ａｃａ
ｄ． Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３１３〜３１７，１９８
０）およびファージＴ７（図１Ａのｇ１０−Ｌ）から得
られる翻訳エンハンサー要素への連絡を可能にした。こ
れは、新たに生成された１．９ｋｂ ＮｃｏＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩフラグメントを前述のようにＮｃｏＩ−Ｈｉｎ
ｄＩＩＩ消化ｐＭＯＮ５８４０にリゲーションして行わ
れた。得られたプラスミド（ｐＢＢ１２５）を用いて大
腸菌ＪＭ１０１株を形質転換した（Ｍｅｓｓｉｎｇ：Ｒ
ｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｔｅｃｈ，Ｂｕｌｌ．
２：４５〜４８，１９７９）。形質転換体を、ＬＢ培地
＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン中、３７℃で、ＯＤ
６００が１．０になるまで振盪した。ナリジキシン酸を
最終濃度５０μｇ／ｍｌになるように添加してｒｅｃＡ
プロモーターを誘導した（Ｆｅｉｎ−Ｓｔｅｉｎら：Ｎ
ｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２９２７〜２９４
１，１９８３）。３７℃で１５〜２０分間インキュベー
トしたのち、細胞を遠心分離によって収穫し、Ｐｏｗｅ
ｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（Ａｍｅｒｉｃ
ａｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．）で加圧して（２
０００ポンド／平方インチ）破壊した。ＮＭＴ種は以下
に述べるようにして精製した。
【００３０】大腸菌内でのＮＭＴ１およびＣαの発現の
ためのプラスミド：ｐＢＢ１３１は、１．９ｋｂ ＮＣ
ｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＮＭＴ１フラグメントを、ｐＡＣ
ＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ ＆ Ｃｏｈｅｎ：Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．１３４：１１４１〜１１５６，１９７８）の誘導
体、ｐＭＯＮ５８３９中にクローニングして構築され
た。ＰＫ−Ａの触媒性サブユニットをコードするＣαＣ
ＤＮＡ（Ｕｈｌｅｒら：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ・ＵＳＡ ８３：１３００〜１３０４，１９
８６）は、上述するように、またＬｉら（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３７７３〜１３７７９、１９
８７）の記載のようにして、ｐＭＯＮ２６７０中に、
１．８ｋｂ ＮｄｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントとしてク
ローニングした。ｐＢＢ１３２は野性型ＣαｃＤＮＡを
含有し（Ｇ．Ｓｔａｎｌｅｙ ＭｃＫｎｉｇｈｔよ
り）、これはその一次翻訳生成物の位置２のＧｌｙを特
定する（位置１はイニシェーターＭｅｔで占められてい
る）。位置２がＡｌａの変異体ＣαｃＤＮＡはＺｏｌｌ
ｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈの改良操作（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００，１９８２）を
用いたオリゴヌクレオチド特定部位の突然変異誘発によ
って作成した。ウラシル含有一本鎖鋳型はＲＺ１０３２
細胞中、ファージミドｐＵＣ１１９／Ｃαから調整し
（Ｋｕｎｋｅｌ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ３２：４８８〜４９２，１９８５）、Ｇｌ
ｙ２→Ａｌａ２突然変異誘発はオリゴマー、５′−ＣＡ
ＴＡＴＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣ−３′によって実施
した。突然変異はジデオキシヌクレオチド配列決定法
（Ｓａｎｇｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３〜５４６７，１９８７）
によって確認した。大腸菌ＪＭ１０１株の形質転換ｐＢ
Ｂ１３１（ＮＭＴ１）およびｐＢＢ１３２（Ｇｌｙ２−
Ｃα）またはｐＢＢ１３３（Ａｌａ２−Ｃα）を用い
た。プラスミドＤＮＡの制限解析により、アンピシリン
／カナマイシン抵抗性大腸菌二重形質転換体内の構築体
の同一性が確認された。
ためのプラスミド：ｐＢＢ１３１は、１．９ｋｂ ＮＣ
ｏＩ−ＨｉｎｄＩＩＩＮＭＴ１フラグメントを、ｐＡＣ
ＹＣ１７７（Ｃｈａｎｇ ＆ Ｃｏｈｅｎ：Ｊ．Ｂａｃ
ｔ．１３４：１１４１〜１１５６，１９７８）の誘導
体、ｐＭＯＮ５８３９中にクローニングして構築され
た。ＰＫ−Ａの触媒性サブユニットをコードするＣαＣ
ＤＮＡ（Ｕｈｌｅｒら：Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ・ＵＳＡ ８３：１３００〜１３０４，１９
８６）は、上述するように、またＬｉら（Ｊ．Ｂｉｏ
ｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１３７７３〜１３７７９、１９
８７）の記載のようにして、ｐＭＯＮ２６７０中に、
１．８ｋｂ ＮｄｅＩ−ＫｐｎＩフラグメントとしてク
ローニングした。ｐＢＢ１３２は野性型ＣαｃＤＮＡを
含有し（Ｇ．Ｓｔａｎｌｅｙ ＭｃＫｎｉｇｈｔよ
り）、これはその一次翻訳生成物の位置２のＧｌｙを特
定する（位置１はイニシェーターＭｅｔで占められてい
る）。位置２がＡｌａの変異体ＣαｃＤＮＡはＺｏｌｌ
ｅｒ ＆ Ｓｍｉｔｈの改良操作（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
ｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７〜６５００，１９８２）を
用いたオリゴヌクレオチド特定部位の突然変異誘発によ
って作成した。ウラシル含有一本鎖鋳型はＲＺ１０３２
細胞中、ファージミドｐＵＣ１１９／Ｃαから調整し
（Ｋｕｎｋｅｌ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ３２：４８８〜４９２，１９８５）、Ｇｌ
ｙ２→Ａｌａ２突然変異誘発はオリゴマー、５′−ＣＡ
ＴＡＴＧＧＣＣＡＡＣＧＣＣＧＣＣ−３′によって実施
した。突然変異はジデオキシヌクレオチド配列決定法
（Ｓａｎｇｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ ７４：５４６３〜５４６７，１９８７）
によって確認した。大腸菌ＪＭ１０１株の形質転換ｐＢ
Ｂ１３１（ＮＭＴ１）およびｐＢＢ１３２（Ｇｌｙ２−
Ｃα）またはｐＢＢ１３３（Ａｌａ２−Ｃα）を用い
た。プラスミドＤＮＡの制限解析により、アンピシリン
／カナマイシン抵抗性大腸菌二重形質転換体内の構築体
の同一性が確認された。
【００３１】大腸菌内で産生されたＰＫ−Ａ Ｃ−サブ
ユニットの〔３Ｈ〕脂肪酸標識：二重形質転換体の培養
液４ｍｌを、ＬＢ倍地＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン
および１００μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシン中３７℃でＯ
Ｄ６００が０．５に達するまで振盪した。ついでイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
を最終濃度１ｍＭ添加して、ＮＭＴ産生を誘導した（以
下の結果の項参照）。培養液のＯＤ６００が１．０に達
したとき（約４０分後）、ナリジキシン酸を最終濃度５
０μｇ／ｍｌ添加してＣ−サブユニットの産生を誘導し
た（以下の結果の項参照）。〔３Ｈ〕ミリステート（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；３９．３Ｃｉ
／ｍｍｏｌ、培養液１ｍｌあたり１１３μＣｉ添加）、
〔３Ｈ〕パルミテート（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕ
ｃｌｅａｒ；３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１４３μＣｉ／ｍ
ｌ）、または〔３Ｈ〕１０−（プロボキシ）デカノエー
ト（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５２
６２〜５２６６，１９８９）（３１．７Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ，８００μＣｉ／ｍｌ）をナリジキシン酸と同時に加
えた。培養液をさらに２０分間３７°で振盪し、細胞を
遠心分離によって収穫した。溶解質は、ペレット中に含
まれる大腸菌を、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，
４％ＳＤＳ，２０％グリセロール，１０％メルカプトエ
タノールおよび０．２Ｍジチオスレイトールの溶液４０
μｌ中で１０分間煮沸して調整した。細胞屑を遠心分離
によって除去し、上清の一部１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（Ｌａｅｍｍｌｉ：Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０〜６
８５，１９７０）に付し、ついでＥＮ３ＨＡＮＣＥ（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）オートラジオ
グラフィー・エンハンサーを用いてフルオログラフィー
に付した。ウエスタンブロット解析には、非標識大腸菌
産生Ｇｌｙ２−Ｃ−サブユニットまたはＡｌａ２−Ｃ−
サブユニットから調整した還元、変性溶解質蛋白質５０
μｇをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース上
に電気ブロットし（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ：Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１１２：１９５〜２３０，１９８１）、濾
紙を、精製マウスＣ−サブユニットに対するポリクロー
ナル、単一特異性ウサギ抗血清によって試験した。抗原
−抗体複合体は１２５Ｉ−プロテインＡで可視化した
（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ：前出）。
ユニットの〔３Ｈ〕脂肪酸標識：二重形質転換体の培養
液４ｍｌを、ＬＢ倍地＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン
および１００μｇ／ｍｌ硫酸カナマイシン中３７℃でＯ
Ｄ６００が０．５に達するまで振盪した。ついでイソプ
ロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）
を最終濃度１ｍＭ添加して、ＮＭＴ産生を誘導した（以
下の結果の項参照）。培養液のＯＤ６００が１．０に達
したとき（約４０分後）、ナリジキシン酸を最終濃度５
０μｇ／ｍｌ添加してＣ−サブユニットの産生を誘導し
た（以下の結果の項参照）。〔３Ｈ〕ミリステート（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ；３９．３Ｃｉ
／ｍｍｏｌ、培養液１ｍｌあたり１１３μＣｉ添加）、
〔３Ｈ〕パルミテート（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕ
ｃｌｅａｒ；３０Ｃｉ／ｍｍｏｌ；１４３μＣｉ／ｍ
ｌ）、または〔３Ｈ〕１０−（プロボキシ）デカノエー
ト（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄｏｎ：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５２
６２〜５２６６，１９８９）（３１．７Ｃｉ／ｍｍｏ
ｌ，８００μＣｉ／ｍｌ）をナリジキシン酸と同時に加
えた。培養液をさらに２０分間３７°で振盪し、細胞を
遠心分離によって収穫した。溶解質は、ペレット中に含
まれる大腸菌を、１２５ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．０，
４％ＳＤＳ，２０％グリセロール，１０％メルカプトエ
タノールおよび０．２Ｍジチオスレイトールの溶液４０
μｌ中で１０分間煮沸して調整した。細胞屑を遠心分離
によって除去し、上清の一部１５μｌをＳＤＳ−ＰＡＧ
Ｅ（Ｌａｅｍｍｌｉ：Ｎａｔｕｒｅ２２７：６８０〜６
８５，１９７０）に付し、ついでＥＮ３ＨＡＮＣＥ（Ｎ
ｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）オートラジオ
グラフィー・エンハンサーを用いてフルオログラフィー
に付した。ウエスタンブロット解析には、非標識大腸菌
産生Ｇｌｙ２−Ｃ−サブユニットまたはＡｌａ２−Ｃ−
サブユニットから調整した還元、変性溶解質蛋白質５０
μｇをＳＤＳ／ＰＡＧＥで分離し、ニトロセルロース上
に電気ブロットし（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ：Ａｎａｌ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．１１２：１９５〜２３０，１９８１）、濾
紙を、精製マウスＣ−サブユニットに対するポリクロー
ナル、単一特異性ウサギ抗血清によって試験した。抗原
−抗体複合体は１２５Ｉ−プロテインＡで可視化した
（Ｂｕｒｎｅｔｔｅ：前出）。
【００３２】ＮＭＴ性けのｉｎ ｖｉｔｒｏ検定システ
ム：大腸菌誘導ビール酵母菌ＮＭＴのペプチドおよびア
シル−ＣｏＡ基質特異性を評価するためには、結合ｉｎ
ｖｉｔｒｏ検定システム（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａ
ｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３：２８１２〜２８１６，１９８６）に粗溶解質
または部分精製酵素プレパレーションを添加した。この
検定の第一工程は、シュードモナスアシル−ＣｏＡリガ
ーゼによる放射標識脂肪酸のそれらのＣｏＡチオエステ
ルへの変換を包含する。このリガーゼは、脂肪酸基質に
対して大部分、非特異的である（Ｓｈｉｍｉｚｕら：Ａ
ｎａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１９３〜１９８，１
９８０）。オクタペプチド基質およびＮＭＴを次に加え
てアシルペプチドを生成させた。アシルペプチドをトリ
クロロ酢酸／メタノール沈殿および水中アセトニトリル
の直線勾配を用いたＣ１８逆相ＨＰＬＣによって反応混
合物から精製した（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
３：２８１２〜２８１６，１９８６）。
ム：大腸菌誘導ビール酵母菌ＮＭＴのペプチドおよびア
シル−ＣｏＡ基質特異性を評価するためには、結合ｉｎ
ｖｉｔｒｏ検定システム（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａ
ｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳ
Ａ ８３：２８１２〜２８１６，１９８６）に粗溶解質
または部分精製酵素プレパレーションを添加した。この
検定の第一工程は、シュードモナスアシル−ＣｏＡリガ
ーゼによる放射標識脂肪酸のそれらのＣｏＡチオエステ
ルへの変換を包含する。このリガーゼは、脂肪酸基質に
対して大部分、非特異的である（Ｓｈｉｍｉｚｕら：Ａ
ｎａｌ：Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：１９３〜１９８，１
９８０）。オクタペプチド基質およびＮＭＴを次に加え
てアシルペプチドを生成させた。アシルペプチドをトリ
クロロ酢酸／メタノール沈殿および水中アセトニトリル
の直線勾配を用いたＣ１８逆相ＨＰＬＣによって反応混
合物から精製した（Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８
３：２８１２〜２８１６，１９８６）。
【００３３】結果 大腸菌内で産生されたビール酵母菌ＮＭＴは、酵母酵素
標品と同一の基質特異性を有する ：ビール酵母菌ＮＭＴ
１遺伝子は、４５５個のアミノ酸を有し、計算Ｍｒ５
２，８３７で、栄養細胞増殖に必須な蛋白質をコードす
る（Ｄｕｒｏｎｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９
６〜８００，１９８９）。このポリペプチドは、現在利
用可能なデータベースに登録された蛋白質と、同一とみ
なし得る有意な一次配列ホモロジーをもたない（Ｄｕｒ
ｏｎｉｏら：同誌）。この酵母からの酵素の明らかに均
一なプレパレーションを得るには、４種の異なるクロマ
トグラフィーマトリックスを使用する６工程、１１，０
００倍の精製が必要であった（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７
０８〜２７１２，１９８７）。大腸菌溶解質は、この酵
素の感度のよいｉｎ ｖｉｔｒｏ検定（Ｔｏｗｌｅｒ
＆Ｇｌａｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８３：２８１２〜２８１６，１９８６）で
調べて、検地可能なＮＭＴ活性を含んでいない。すなわ
ち、この原核生物中での酵母ＮＭＴの発現は、その活性
を内因性ミリストイルトランスェラーゼの不存在下に測
定できる、大量の野性型（または変異性）蛋白質を得る
機会を提供する。
標品と同一の基質特異性を有する ：ビール酵母菌ＮＭＴ
１遺伝子は、４５５個のアミノ酸を有し、計算Ｍｒ５
２，８３７で、栄養細胞増殖に必須な蛋白質をコードす
る（Ｄｕｒｏｎｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９
６〜８００，１９８９）。このポリペプチドは、現在利
用可能なデータベースに登録された蛋白質と、同一とみ
なし得る有意な一次配列ホモロジーをもたない（Ｄｕｒ
ｏｎｉｏら：同誌）。この酵母からの酵素の明らかに均
一なプレパレーションを得るには、４種の異なるクロマ
トグラフィーマトリックスを使用する６工程、１１，０
００倍の精製が必要であった（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７
０８〜２７１２，１９８７）。大腸菌溶解質は、この酵
素の感度のよいｉｎ ｖｉｔｒｏ検定（Ｔｏｗｌｅｒ
＆Ｇｌａｓｅｒ：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８３：２８１２〜２８１６，１９８６）で
調べて、検地可能なＮＭＴ活性を含んでいない。すなわ
ち、この原核生物中での酵母ＮＭＴの発現は、その活性
を内因性ミリストイルトランスェラーゼの不存在下に測
定できる、大量の野性型（または変異性）蛋白質を得る
機会を提供する。
【００３４】大腸菌内でのビール酵母菌ＮＭＴの発現は
ｐＭＯＮプラスミドベクターを用いて達成された。これ
らのベクターは、バクテリオファージＴ７のｇ１０リー
ダー領域（ｇ１０−Ｌ）に由来する翻訳「エンハンサ
ー」（Ｏｌｉｎｓら：Ｇｅｎｅ７３：２２７〜２３５，
１９８８）に融合した誘導可能なプロモーターを含有す
る。酵母ＮＭＴ１遺伝子は、そのイニシェーターＭｅｔ
コドンにおけるＮｃｏＩ部位を操作し、そのＤＮＡをｐ
ＭＯＮ５８４０中にサブクローニングすることによって
ｇ１０−Ｌの下流に直接接続して配置された。したがっ
て、ＮＭＴ１の転写は、ｐＭＯＮ５８４０中のｇ１０−
Ｌの上流に位置する大腸菌ｒｅｃＡプロモーター（Ｈｏ
ｒｉｉら：前出；Ｏｌｉｎｓら：前出）の制御下に置か
れた。この組換えプラスミドをもつ大腸菌ＪＭ１０１株
を中対数期まで増殖させ、ついでナリジキシン酸で処理
してｒｅｃＡプロモーターを誘導した（Ｆｅｉｎｓｔｅ
ｉｎら：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２９２
７〜２９４１，１９８３）。ＮＭＴを次に、誘導細胞溶
解液の一連の硫酸アンモニウム分画、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、およびＣｏＡ−アガロース
アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって約７
５０に精製した（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７
１２，１９８７）。上述のＮＭＴ活性の結合ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ検定を用いて、部分精製大腸菌誘導酵母ＮＭＴ
が、様々なオクタペプチド基質に対して、ビール酵母菌
からの部分精製ＮＭＴプレパレーションで測定した場合
とほぼ同じＫｍおよびＶｍａｘ値を示すことが明らかに
された（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１９
８７）（以下の表１参照）。たとえば、ＰＫ−ＡのＣ−
サブユニットのＮ−末端配列から得られた「親」オクタ
ペプチドＧＮＡＡＡＡＲＲ−ＮＨ２の５位置へのセリン
残基の導入は、両ＮＭＴプレパレーションに対するその
見掛けのＫｍ値を１００倍以上低下させた。ＮＨ２末端
のＧｌｙは絶対的に要求される。Ｇｌｙ１残基のＡｌａ
２による置換はこのペプチドを不活性基質に変換した
（表１）。ＮＨ２末端Ｍｅｔ残基の付加も不活性ペプチ
ドを発生し、これは大腸菌から部分的に精製された酵母
ＮＭＴが、ビール酵母菌から単離されたＮＭＴ（Ｔｏｗ
ｌｅｒら：同誌）と同様、メチオニルアミンペプチダー
ゼ活性を伴わないことを示した。
ｐＭＯＮプラスミドベクターを用いて達成された。これ
らのベクターは、バクテリオファージＴ７のｇ１０リー
ダー領域（ｇ１０−Ｌ）に由来する翻訳「エンハンサ
ー」（Ｏｌｉｎｓら：Ｇｅｎｅ７３：２２７〜２３５，
１９８８）に融合した誘導可能なプロモーターを含有す
る。酵母ＮＭＴ１遺伝子は、そのイニシェーターＭｅｔ
コドンにおけるＮｃｏＩ部位を操作し、そのＤＮＡをｐ
ＭＯＮ５８４０中にサブクローニングすることによって
ｇ１０−Ｌの下流に直接接続して配置された。したがっ
て、ＮＭＴ１の転写は、ｐＭＯＮ５８４０中のｇ１０−
Ｌの上流に位置する大腸菌ｒｅｃＡプロモーター（Ｈｏ
ｒｉｉら：前出；Ｏｌｉｎｓら：前出）の制御下に置か
れた。この組換えプラスミドをもつ大腸菌ＪＭ１０１株
を中対数期まで増殖させ、ついでナリジキシン酸で処理
してｒｅｃＡプロモーターを誘導した（Ｆｅｉｎｓｔｅ
ｉｎら：Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１１：２９２
７〜２９４１，１９８３）。ＮＭＴを次に、誘導細胞溶
解液の一連の硫酸アンモニウム分画、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐ
ｈａｒｏｓｅ ＣＬ−６Ｂ、およびＣｏＡ−アガロース
アフィニティーカラムクロマトグラフィーによって約７
５０に精製した（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７
１２，１９８７）。上述のＮＭＴ活性の結合ｉｎ ｖｉ
ｔｒｏ検定を用いて、部分精製大腸菌誘導酵母ＮＭＴ
が、様々なオクタペプチド基質に対して、ビール酵母菌
からの部分精製ＮＭＴプレパレーションで測定した場合
とほぼ同じＫｍおよびＶｍａｘ値を示すことが明らかに
された（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１９
８７）（以下の表１参照）。たとえば、ＰＫ−ＡのＣ−
サブユニットのＮ−末端配列から得られた「親」オクタ
ペプチドＧＮＡＡＡＡＲＲ−ＮＨ２の５位置へのセリン
残基の導入は、両ＮＭＴプレパレーションに対するその
見掛けのＫｍ値を１００倍以上低下させた。ＮＨ２末端
のＧｌｙは絶対的に要求される。Ｇｌｙ１残基のＡｌａ
２による置換はこのペプチドを不活性基質に変換した
（表１）。ＮＨ２末端Ｍｅｔ残基の付加も不活性ペプチ
ドを発生し、これは大腸菌から部分的に精製された酵母
ＮＭＴが、ビール酵母菌から単離されたＮＭＴ（Ｔｏｗ
ｌｅｒら：同誌）と同様、メチオニルアミンペプチダー
ゼ活性を伴わないことを示した。
【００３５】大腸菌が完全な酵母ＮＭＴを産生している
ことを確証するため、ＣｏＡ−アガロースカラムから１
００ｍＭＫＣｌで溶出した蛋白質をｓＤｓ−ＰＡＧＥで
分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）に移した。４５５残基酵母ＮＭＴ
の質量に相当する約５３ｋＤａ ポリペプチド（Ｄｕｒ
ｏｎｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９６〜８０
０，１９８９）をこの膜から切り出し、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａ型気相シクエンサー
を用い、エドマン分解に付した。ＮＨ２末端配列は５３
ｋＤａポリペプチドが完全な酵母ＮＭＴに相当すること
を示した。
ことを確証するため、ＣｏＡ−アガロースカラムから１
００ｍＭＫＣｌで溶出した蛋白質をｓＤｓ−ＰＡＧＥで
分離し、ポリビニリデンジフルオリド膜（Ｍｉｌｌｉｐ
ｏｒｅ Ｃｏｒｐ．）に移した。４５５残基酵母ＮＭＴ
の質量に相当する約５３ｋＤａ ポリペプチド（Ｄｕｒ
ｏｎｉｏら：Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４５：７９６〜８０
０，１９８９）をこの膜から切り出し、Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４７０Ａ型気相シクエンサー
を用い、エドマン分解に付した。ＮＨ２末端配列は５３
ｋＤａポリペプチドが完全な酵母ＮＭＴに相当すること
を示した。
【００３６】この酵素の均一なプレパレーションを得る
ために、大腸菌産生ＮＭＴをＭｏｎｏＳ高速蛋白質液体
クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によってさらに精製し
た。ＭｏｎｏＳカラムの２５０ｍＭＮａＣｌ溶出液のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマッシー青染色（Ｔｏｗｌｅ
ｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：２７０８〜２７１２，１９８７）によって、Ｎ
ＭＴ触媒活性と共溶出した約４５ｋＤａの付加的バンド
がさらに明らかにされた。この４５ｋＤａポリペプチド
のエドマン分解により、それはＮＭＴのＮＨ２末端３９
残基が失われていることがわかり、Ｌｙｓ３９−Ｐｈｅ
４０結合のようなポリペプチド鎖の部分が蛋白分解を受
けやすく、精製時または大腸菌内での合成直後に、急速
に失われることが示唆された。
ために、大腸菌産生ＮＭＴをＭｏｎｏＳ高速蛋白質液体
クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）によってさらに精製し
た。ＭｏｎｏＳカラムの２５０ｍＭＮａＣｌ溶出液のＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマッシー青染色（Ｔｏｗｌｅ
ｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８４：２７０８〜２７１２，１９８７）によって、Ｎ
ＭＴ触媒活性と共溶出した約４５ｋＤａの付加的バンド
がさらに明らかにされた。この４５ｋＤａポリペプチド
のエドマン分解により、それはＮＭＴのＮＨ２末端３９
残基が失われていることがわかり、Ｌｙｓ３９−Ｐｈｅ
４０結合のようなポリペプチド鎖の部分が蛋白分解を受
けやすく、精製時または大腸菌内での合成直後に、急速
に失われることが示唆された。
【００３７】ＭｏｎｏＳ精製４５ｋＤａＮＭＴ種は、ミ
リストイルーＣｏＡとパルミトイル−ＣｏＡを容易に識
別子する能力を保持し、Ｓｅｒ５置換ＧＮＡＡＡＡ−Ｒ
Ｒ−ＮＨ２に対する見掛けのＫｍの１００倍低下を示し
た（表１）。４５ｋＤａ蛋白分解フラグメントはコア触
媒ドメインを維持するものと思われる。失われた３９個
のアミノ酸の役割は不明であるが、ＮＭＴの酵母内での
補助的な因子との（必須の）相互作用またはその適当な
細胞内標識化に必要なのかもしれない。遺伝子操作され
た４５ｋＤａＮＭＴがビール酵母菌の生存不能のＮｍｔ
−表現型（Ｄｕｒｏｎｉｏら：前出）を救済できるかど
うかの決定がこれらの質問に解決を与える糸口になろ
う。大腸菌誘導ＮＭＴは酵母誘導ＮＭＴにきわめて近似
した速度論的性質を有することから、酵素のペプチドお
よび脂肪酸アシル−ＣｏＡ基質特異な性は、真核細胞蛋
白質修飾または補助的な酵母特異的因子のいずれにも依
存しないことも結論できる。
リストイルーＣｏＡとパルミトイル−ＣｏＡを容易に識
別子する能力を保持し、Ｓｅｒ５置換ＧＮＡＡＡＡ−Ｒ
Ｒ−ＮＨ２に対する見掛けのＫｍの１００倍低下を示し
た（表１）。４５ｋＤａ蛋白分解フラグメントはコア触
媒ドメインを維持するものと思われる。失われた３９個
のアミノ酸の役割は不明であるが、ＮＭＴの酵母内での
補助的な因子との（必須の）相互作用またはその適当な
細胞内標識化に必要なのかもしれない。遺伝子操作され
た４５ｋＤａＮＭＴがビール酵母菌の生存不能のＮｍｔ
−表現型（Ｄｕｒｏｎｉｏら：前出）を救済できるかど
うかの決定がこれらの質問に解決を与える糸口になろ
う。大腸菌誘導ＮＭＴは酵母誘導ＮＭＴにきわめて近似
した速度論的性質を有することから、酵素のペプチドお
よび脂肪酸アシル−ＣｏＡ基質特異な性は、真核細胞蛋
白質修飾または補助的な酵母特異的因子のいずれにも依
存しないことも結論できる。
【００３８】大腸菌内における蛋白質Ｎ−ミリストイル
化の再構築：表１に記載したデータは、大腸菌内での酵
母ＮＭＴの発現が、その基質特異性のビール酵母菌から
単離されたＮＭＴの場合と大部分区別できない点で、適
当にフォールディングされた酵素を生成したことを示し
ている。大腸菌内には内因性のＮＭＴ活性はないので、
この結果は、酵母ＮＭＴと真核細胞蛋白質基質の大腸菌
内での共発現が、明らかにもっぱら真核細胞のものであ
る蛋白質修飾の再生を、原核細胞内で可能にする可能性
を提起した。
化の再構築：表１に記載したデータは、大腸菌内での酵
母ＮＭＴの発現が、その基質特異性のビール酵母菌から
単離されたＮＭＴの場合と大部分区別できない点で、適
当にフォールディングされた酵素を生成したことを示し
ている。大腸菌内には内因性のＮＭＴ活性はないので、
この結果は、酵母ＮＭＴと真核細胞蛋白質基質の大腸菌
内での共発現が、明らかにもっぱら真核細胞のものであ
る蛋白質修飾の再生を、原核細胞内で可能にする可能性
を提起した。
【００３９】ＣＡＭＰ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫ
−Ａ）は最も早期に発見されたプロテインキナーゼの１
種であり、また最もよく生化学的に理解されたものの１
種でもある（Ｔａｙｌｏｒ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６４：８４４５〜８４４６，１９８９）。キナーゼは
細胞増殖および代謝の調節に関与し、その触媒（ｃ）サ
ブユニットはＮ−ミリスチル化されることが示された最
初の蛋白質でもあった（Ｃａｒｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６１２８〜６１
３１，１９８２）。マウスＣ−サブユニットをコードす
るｃＤＮＡ（Ｃα）（Ｕｈｌｅｒら：前出）の大腸菌内
での発現は、ＮＨ２末端Ｇｌｙにミリステートを欠くこ
の蛋白質の可溶性、活性型の単離を招いた（Ｓｌｉｃｅ
＆Ｔａｙｌｏｒ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：
２０９４０〜２０９４６，１９８９）。マウスＣ−サブ
ユニットのＮＨ２末端から誘導されたオクタペプチドが
正常な（また截頭された）大腸菌誘導酵母ＮＭＴに対し
ｉｎ ｖｉｔｒｏで良好な基質であった（表１）ことか
ら、ｉｎ ｖｉｖｏ再構築試験のための典型的蛋白質と
してＣ−サブユニットを使用することに決定した。図１
Ａに概略を示した二相性プラスミド系を酵母ＮＭＴ１遺
伝子とＣαｃＤＮＡの共発現に使用した。ベクターは、
それぞれが（ｉ）安定なエピゾームプラスミドとして同
時に維持でき、（ｉｉ）それらの異種ＤＮＡ配列の転写
の独立した誘導を支持できるように設計された。ＮＭＴ
１の発現は、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｍｅｓｓｉｎｇ，前
出）に基づくプラスミド中に含有されるイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性の
ｔａｃ（ＤｅＢｏｅｒら：ＤＮＡ ２：２３１〜２３
５，１９８５）プロモーターおよびｇ１０−Ｌリボソー
ム結合部位（Ｏｌｉｎｓら：Ｇｅｎｅ ７３：２２７〜
２３５，１９８８）の制御下に置かれた。このプラスミ
ドはｐ１５Ａ複製起源およびカナマイシン抵抗性遺伝子
を包含する。２種のＣαｃＤＮＡの発現は、アンピシリ
ン抵抗性遺伝子とＣｏｌＥ１複製起源を含有するプラス
ミド中に存在するｒｅｃＡプロモーター（Ｈｏｒｉｉ
ら：前出）とｇ１０−Ｌの制御下に置かれた。これらの
ｃＤＮＡの一方はＰＫ−Ａの野性型４０ｋＤａＣ−サブ
ユニット（Ｇｌｙ２）をコードし、他方はＧｌｙ２の代
わりにＡｌａ２置換された変異体を産生した。この変異
体Ｃ−サブユニットはＮＭＴの基質とはならない（表
１）。
−Ａ）は最も早期に発見されたプロテインキナーゼの１
種であり、また最もよく生化学的に理解されたものの１
種でもある（Ｔａｙｌｏｒ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．
２６４：８４４５〜８４４６，１９８９）。キナーゼは
細胞増殖および代謝の調節に関与し、その触媒（ｃ）サ
ブユニットはＮ−ミリスチル化されることが示された最
初の蛋白質でもあった（Ｃａｒｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７９：６１２８〜６１
３１，１９８２）。マウスＣ−サブユニットをコードす
るｃＤＮＡ（Ｃα）（Ｕｈｌｅｒら：前出）の大腸菌内
での発現は、ＮＨ２末端Ｇｌｙにミリステートを欠くこ
の蛋白質の可溶性、活性型の単離を招いた（Ｓｌｉｃｅ
＆Ｔａｙｌｏｒ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：
２０９４０〜２０９４６，１９８９）。マウスＣ−サブ
ユニットのＮＨ２末端から誘導されたオクタペプチドが
正常な（また截頭された）大腸菌誘導酵母ＮＭＴに対し
ｉｎ ｖｉｔｒｏで良好な基質であった（表１）ことか
ら、ｉｎ ｖｉｖｏ再構築試験のための典型的蛋白質と
してＣ−サブユニットを使用することに決定した。図１
Ａに概略を示した二相性プラスミド系を酵母ＮＭＴ１遺
伝子とＣαｃＤＮＡの共発現に使用した。ベクターは、
それぞれが（ｉ）安定なエピゾームプラスミドとして同
時に維持でき、（ｉｉ）それらの異種ＤＮＡ配列の転写
の独立した誘導を支持できるように設計された。ＮＭＴ
１の発現は、ｐＡＣＹＣ１７７（Ｍｅｓｓｉｎｇ，前
出）に基づくプラスミド中に含有されるイソプロピル−
β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導性の
ｔａｃ（ＤｅＢｏｅｒら：ＤＮＡ ２：２３１〜２３
５，１９８５）プロモーターおよびｇ１０−Ｌリボソー
ム結合部位（Ｏｌｉｎｓら：Ｇｅｎｅ ７３：２２７〜
２３５，１９８８）の制御下に置かれた。このプラスミ
ドはｐ１５Ａ複製起源およびカナマイシン抵抗性遺伝子
を包含する。２種のＣαｃＤＮＡの発現は、アンピシリ
ン抵抗性遺伝子とＣｏｌＥ１複製起源を含有するプラス
ミド中に存在するｒｅｃＡプロモーター（Ｈｏｒｉｉ
ら：前出）とｇ１０−Ｌの制御下に置かれた。これらの
ｃＤＮＡの一方はＰＫ−Ａの野性型４０ｋＤａＣ−サブ
ユニット（Ｇｌｙ２）をコードし、他方はＧｌｙ２の代
わりにＡｌａ２置換された変異体を産生した。この変異
体Ｃ−サブユニットはＮＭＴの基質とはならない（表
１）。
【００４０】親ベクターとそれらのＮＭＴ１およびＣα
含有組換え誘導体の対合組合せを大腸菌ＪＭ１０１株に
トランスフェクションし、それらをアンピシリンおよび
カナマイシン選択によって維持した。対数的に増殖して
いる細胞の培養液を標識するために、酵母ＮＭＴ１つい
でＣαの連続的発現時に〔３Ｈ〕ミリステートを使用し
た。この培養液から調整した溶菌液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
およびフルオログラフィーに付し、蛋白質中への放射標
識脂肪酸の取り込みを調べた。ＮＭＴ１および野性型Ｃ
α配列を大腸菌内で共発現させたところ、４０ｋＤａ蛋
白質は培養培地に〔３Ｈ〕ミリスチン酸の添加後に代謝
的に標識された（図１Ｂのレーン４）。この蛋白質は、
精製Ｃ−サブユニット標準と共移動した。４０ｋＤａ蛋
白質の標識化はＮＭＴ１および野性型Ｃα両者の存在に
絶対的に依存した。ＮＭＴ１を発現したがＣαを欠く大
腸菌およびＮＭＴ１を欠くがＣαを発現した大腸菌は、
いずれも４０ｋＤａ蛋白質の〔３Ｈ〕脂肪酸による標識
は生じなかった（それぞれパネルＢのレーン６および
７）。さらに、４０ｋＤａ蛋白質は、ＮＭＴ１およびＡ
ｌａ２置換Ｃ−サブユニットをコードする変異体ＣαＣ
ＤＮＡを発現した細胞内では標識されなかった（パネル
Ｂのレーン５）。マウスＰＫ−ＡのＣ−サブユニットに
対するウサギポリクローナル抗血清を用いたウエスタン
ブロット解析により、野性型および変異体Ｃα組換えプ
ラスミドをそれぞれ含有する大腸菌ＪＭ１０１株から調
整された溶解質中に当量のＧｌｙ２−およびＡｌａ２−
４０ｋＤａ蛋白質の存在が確認された（図１Ｅ）。２種
のＣ−サブユニットの産生レベルは、ウエスタンブロッ
トに含有された精製Ｃ−サブユニット標品のシグナル強
度に基づいて総大腸菌蛋白質の０．１％と評価された。
ＮＭＴは誘導後、大腸菌蛋白質の約０．２％を示した。
この値は粗溶解質中のＮＭＴ活性および精製酵母ＮＭＴ
の比活性（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１
９８７）から計算した。ＮＭＴ１とＣαの共発現は、誘
導期における大腸菌の増殖速度に悪影響を与えることは
なかった。
含有組換え誘導体の対合組合せを大腸菌ＪＭ１０１株に
トランスフェクションし、それらをアンピシリンおよび
カナマイシン選択によって維持した。対数的に増殖して
いる細胞の培養液を標識するために、酵母ＮＭＴ１つい
でＣαの連続的発現時に〔３Ｈ〕ミリステートを使用し
た。この培養液から調整した溶菌液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ
およびフルオログラフィーに付し、蛋白質中への放射標
識脂肪酸の取り込みを調べた。ＮＭＴ１および野性型Ｃ
α配列を大腸菌内で共発現させたところ、４０ｋＤａ蛋
白質は培養培地に〔３Ｈ〕ミリスチン酸の添加後に代謝
的に標識された（図１Ｂのレーン４）。この蛋白質は、
精製Ｃ−サブユニット標準と共移動した。４０ｋＤａ蛋
白質の標識化はＮＭＴ１および野性型Ｃα両者の存在に
絶対的に依存した。ＮＭＴ１を発現したがＣαを欠く大
腸菌およびＮＭＴ１を欠くがＣαを発現した大腸菌は、
いずれも４０ｋＤａ蛋白質の〔３Ｈ〕脂肪酸による標識
は生じなかった（それぞれパネルＢのレーン６および
７）。さらに、４０ｋＤａ蛋白質は、ＮＭＴ１およびＡ
ｌａ２置換Ｃ−サブユニットをコードする変異体ＣαＣ
ＤＮＡを発現した細胞内では標識されなかった（パネル
Ｂのレーン５）。マウスＰＫ−ＡのＣ−サブユニットに
対するウサギポリクローナル抗血清を用いたウエスタン
ブロット解析により、野性型および変異体Ｃα組換えプ
ラスミドをそれぞれ含有する大腸菌ＪＭ１０１株から調
整された溶解質中に当量のＧｌｙ２−およびＡｌａ２−
４０ｋＤａ蛋白質の存在が確認された（図１Ｅ）。２種
のＣ−サブユニットの産生レベルは、ウエスタンブロッ
トに含有された精製Ｃ−サブユニット標品のシグナル強
度に基づいて総大腸菌蛋白質の０．１％と評価された。
ＮＭＴは誘導後、大腸菌蛋白質の約０．２％を示した。
この値は粗溶解質中のＮＭＴ活性および精製酵母ＮＭＴ
の比活性（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１
９８７）から計算した。ＮＭＴ１とＣαの共発現は、誘
導期における大腸菌の増殖速度に悪影響を与えることは
なかった。
【００４１】〔３Ｈ〕ミリステート標識４０ｋＤａ蛋白
質をｓＤｓ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し、Ｐ
ｒｏｎａｓｅＥで消化して脂肪酸アシル−蛋白質結合の
性質を検討した。Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄ
ｏｎ：Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：５２６２〜５２６６，１９８９）上で化学的に
合成した〔３Ｈ〕ミリストイルグリシン標品（Ｔｏｗｌ
ｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２５：８７８〜８８４，１９８６）と共移動する標識生
成物が生成した。これらのデータを考え合わせると、
（ｉ）ＰＫ−ＡのＣ−サブユニットは、酵母ＮＭＴを産
生する大腸菌細胞中でのみＧｌｙ２依存製の様式でミリ
ストイル化される、および（ｉｉ）大腸菌の内因製メチ
オニルアミノペプチダーゼ活性（Ｓｈｅｒｍａｎら：Ｂ
ｉｏＥｓｓａｙｓ ３：２７〜３１，１９８５）はＣ−
サブユニットのイニシェータ−Ｍｅｔを除去することが
できて、ミリステートのＮＭＴ触媒転移に対してそのＧ
ｌｙ２残基を暴露させるとの結論が支持された。この後
者の結果は、大腸菌内で合成されたＣ−サブユニットの
ＮＨ２末端配列をＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ…と
して同定した以前の結果（Ｓｌｉｃｅ ＆ Ｔｏｙｌｏ
ｒ：前出）を確認するものである。
質をｓＤｓ−ポリアクリルアミドゲルから切り出し、Ｐ
ｒｏｎａｓｅＥで消化して脂肪酸アシル−蛋白質結合の
性質を検討した。Ｃ１８逆相高速液体クロマトグラフィ
ー（ＨＰＬＣ）（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈ ＆ Ｇｏｒｄ
ｏｎ：Ｐｒｏｃ，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ
８６：５２６２〜５２６６，１９８９）上で化学的に
合成した〔３Ｈ〕ミリストイルグリシン標品（Ｔｏｗｌ
ｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ
２５：８７８〜８８４，１９８６）と共移動する標識生
成物が生成した。これらのデータを考え合わせると、
（ｉ）ＰＫ−ＡのＣ−サブユニットは、酵母ＮＭＴを産
生する大腸菌細胞中でのみＧｌｙ２依存製の様式でミリ
ストイル化される、および（ｉｉ）大腸菌の内因製メチ
オニルアミノペプチダーゼ活性（Ｓｈｅｒｍａｎら：Ｂ
ｉｏＥｓｓａｙｓ ３：２７〜３１，１９８５）はＣ−
サブユニットのイニシェータ−Ｍｅｔを除去することが
できて、ミリステートのＮＭＴ触媒転移に対してそのＧ
ｌｙ２残基を暴露させるとの結論が支持された。この後
者の結果は、大腸菌内で合成されたＣ−サブユニットの
ＮＨ２末端配列をＧｌｙ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｌａ…と
して同定した以前の結果（Ｓｌｉｃｅ ＆ Ｔｏｙｌｏ
ｒ：前出）を確認するものである。
【００４２】大腸菌内でのＣ−サブユニットに対するミ
リストイル基のＮＭＴ触媒結合の総効率は、以下の３種
のパラメーター、すなわち、（１）ウェスタンブロット
・ハイブリダイゼーション解析からの大腸菌溶解質中の
Ｃ−サブユニット濃度；（２）既知量の大腸菌溶解質蛋
白質を含有する、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから
のバンドを切り出したのち、蛋白質中に取り込まれる〔
３Ｈ〕ミリステートの量；および（３）標識後大腸菌２
中の〔３Ｈ〕ミリスチン酸の最終比活性（１３μｍＣｉ
／ｎｍｏｌ）（Ｓｉｌｂｅｒｔら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ １２：１６４〜１７１，１９７３）の測定によ
り、事実上１００％と評価された。
リストイル基のＮＭＴ触媒結合の総効率は、以下の３種
のパラメーター、すなわち、（１）ウェスタンブロット
・ハイブリダイゼーション解析からの大腸菌溶解質中の
Ｃ−サブユニット濃度；（２）既知量の大腸菌溶解質蛋
白質を含有する、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルから
のバンドを切り出したのち、蛋白質中に取り込まれる〔
３Ｈ〕ミリステートの量；および（３）標識後大腸菌２
中の〔３Ｈ〕ミリスチン酸の最終比活性（１３μｍＣｉ
／ｎｍｏｌ）（Ｓｉｌｂｅｒｔら：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓ
ｔｒｙ １２：１６４〜１７１，１９７３）の測定によ
り、事実上１００％と評価された。
【００４３】大腸菌内での蛋白質Ｎ−ミリストイル化の
再構築は１４炭素脂肪酸に特異的である：１０−（プロ
ポキシ）デカン酸（１１−オキサミリスチン酸）は、類
似の鎖長を有するが、炭化水素鎖の１１位のメチレン基
が酸素原子で置換されたことにより疎水性が低下してい
る（デカン酸に匹敵する）ミリスチン酸の類縁体である
（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９５〜８７９９，１９
８８）。１１−オキサミリステートをｉｎｖｉｖｏにお
いてｐ６０ｖ−ｓｒｃに取り込ませると、膜から細胞質
分画への蛋白質の有意な再分布を生じる。（Ｈｅｕｃｋ
ｅｒｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８６：５２６２〜５２６６，１９８９）。
上述したのと類似の〔３Ｈ〕ミリスチン酸による代謝標
識試験では、ＮＭＴ産生大腸菌細胞に外因性〔３Ｈ〕１
１−オキサミリステートまたは〔３Ｈ〕パルミテートを
加えた場合も、Ｃ−サブユニットは同様にＧｌｙ２依存
性様式で標識されることが示された（それぞれ図１のパ
ネルＤおよびＣ）。以前の研究では、パルミテートは代
謝的にミリステートに変換されたのち、Ｎ−ミリストイ
ル蛋白質に取り込まれるに違いないことが示唆されてい
る（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８７９５〜８７９９，
１９８８；Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：８７８−８８４，１９８０；
Ｏｌｓｏｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７
８４〜３７９０，１９８４）。〔３Ｈ〕パルミテート標
識Ｃ−サブユニットをＰｒｏｎａｓｅＥで消化すると、
Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで〔３Ｈ〕ミリストイルグリシンと
共移動する生成物が得られた。すなわち、ビール酵母菌
や哺乳動物細胞で観察される脂肪酸アシル−ＣｏＡ鎖長
に対する顕著な特異性が、大腸菌における両者同時の発
現によって再現される。
再構築は１４炭素脂肪酸に特異的である：１０−（プロ
ポキシ）デカン酸（１１−オキサミリスチン酸）は、類
似の鎖長を有するが、炭化水素鎖の１１位のメチレン基
が酸素原子で置換されたことにより疎水性が低下してい
る（デカン酸に匹敵する）ミリスチン酸の類縁体である
（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃ
ａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８７９５〜８７９９，１９
８８）。１１−オキサミリステートをｉｎｖｉｖｏにお
いてｐ６０ｖ−ｓｒｃに取り込ませると、膜から細胞質
分画への蛋白質の有意な再分布を生じる。（Ｈｅｕｃｋ
ｅｒｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８６：５２６２〜５２６６，１９８９）。
上述したのと類似の〔３Ｈ〕ミリスチン酸による代謝標
識試験では、ＮＭＴ産生大腸菌細胞に外因性〔３Ｈ〕１
１−オキサミリステートまたは〔３Ｈ〕パルミテートを
加えた場合も、Ｃ−サブユニットは同様にＧｌｙ２依存
性様式で標識されることが示された（それぞれ図１のパ
ネルＤおよびＣ）。以前の研究では、パルミテートは代
謝的にミリステートに変換されたのち、Ｎ−ミリストイ
ル蛋白質に取り込まれるに違いないことが示唆されてい
る（Ｈｅｕｃｋｅｒｏｔｈら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａ
ｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：８７９５〜８７９９，
１９８８；Ｔｏｗｌｅｒ ＆ Ｇｌａｓｅｒ：Ｂｉｏｃ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ ２５：８７８−８８４，１９８０；
Ｏｌｓｏｎら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：３７
８４〜３７９０，１９８４）。〔３Ｈ〕パルミテート標
識Ｃ−サブユニットをＰｒｏｎａｓｅＥで消化すると、
Ｃ１８逆相ＨＰＬＣで〔３Ｈ〕ミリストイルグリシンと
共移動する生成物が得られた。すなわち、ビール酵母菌
や哺乳動物細胞で観察される脂肪酸アシル−ＣｏＡ鎖長
に対する顕著な特異性が、大腸菌における両者同時の発
現によって再現される。
【００４４】約４５および５５ｋＤａの少なくとも２種
の蛋白質が、酵母ＮＭＴを発現する大腸菌株中で外因性
に添加された３種のすべての〔３Ｈ〕脂肪酸を取り込ん
だ（図１のパネルＢ〜Ｄにおけるレーン３〜６）。プラ
スミドをもたない細胞（レーン１）またはＮＭＴ１を欠
く親ベクターを有する細胞（レーン２）は、これらの蛋
白質に標識を取り込まなかった。これらの蛋白質の見掛
けのＭｒは大腸菌内で産生さたＮＭＴの２種の型と著し
く類似しているので、蛋白質−〔３Ｈ〕脂肪酸結合の性
質が検討された。〔３Ｈ〕ミリステートまたは〔３Ｈ〕
パルミテートのいずれかで標識されたこれらの蛋白質の
ＰｒｏｎａｓｅＥ消化で、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ上
〔３Ｈ〕ミリストイルグリシンと共移動する生成物が生
成した。ミリストイルグリシンが検出されたという事実
は、完全な酵母ＮＭＴもその蛋白分解処理４５ｋＤａ型
もそのＮＨ２末端にはＧｌｙを含まないとい所見ととも
に、これらの〔３Ｈ〕蛋白質はＮＭＴ自体のＮ−ミリス
トイル化によって生じたものではなく、内因性の大腸菌
蛋白質のミリストイル化によって生成したとの結論を支
持するものであった。しかしながら、一部のバンドの強
度が〔３Ｈ〕脂肪酸とＮＭＴ種の緊密な非共有結合的結
合によって生じたとの可能性は否定できない。ＭｅｔＧ
ｌｙ…で始まり、したがってＮＭＴによってアシル化さ
れる可能性のある大腸菌蛋白質配列をＮＢＲＦ蛋白質デ
ータベース（レリーズ１９．０）について検索したが
（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６３：
１７８４〜１７９０，１９８８；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら：
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９
５，１９８４）、適当な分子量のものは見出せなかっ
た。これらの２種の「内因性」蛋白質基質があっても、
細菌系が真核細胞系に優る大きな利点は、内因性ＮＭＴ
活性および基質の両者が存在しないことである。ＮＭＴ
に付する代替基質たとえばヘテロ原子含有類縁体の試験
は、真核細胞中におけるよりもはるかに簡易化される。
の蛋白質が、酵母ＮＭＴを発現する大腸菌株中で外因性
に添加された３種のすべての〔３Ｈ〕脂肪酸を取り込ん
だ（図１のパネルＢ〜Ｄにおけるレーン３〜６）。プラ
スミドをもたない細胞（レーン１）またはＮＭＴ１を欠
く親ベクターを有する細胞（レーン２）は、これらの蛋
白質に標識を取り込まなかった。これらの蛋白質の見掛
けのＭｒは大腸菌内で産生さたＮＭＴの２種の型と著し
く類似しているので、蛋白質−〔３Ｈ〕脂肪酸結合の性
質が検討された。〔３Ｈ〕ミリステートまたは〔３Ｈ〕
パルミテートのいずれかで標識されたこれらの蛋白質の
ＰｒｏｎａｓｅＥ消化で、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣ上
〔３Ｈ〕ミリストイルグリシンと共移動する生成物が生
成した。ミリストイルグリシンが検出されたという事実
は、完全な酵母ＮＭＴもその蛋白分解処理４５ｋＤａ型
もそのＮＨ２末端にはＧｌｙを含まないとい所見ととも
に、これらの〔３Ｈ〕蛋白質はＮＭＴ自体のＮ−ミリス
トイル化によって生じたものではなく、内因性の大腸菌
蛋白質のミリストイル化によって生成したとの結論を支
持するものであった。しかしながら、一部のバンドの強
度が〔３Ｈ〕脂肪酸とＮＭＴ種の緊密な非共有結合的結
合によって生じたとの可能性は否定できない。ＭｅｔＧ
ｌｙ…で始まり、したがってＮＭＴによってアシル化さ
れる可能性のある大腸菌蛋白質配列をＮＢＲＦ蛋白質デ
ータベース（レリーズ１９．０）について検索したが
（Ｔｏｗｌｅｒら：Ｊ．Ｂｉｏｌ．ｃｈｅｍ．２６３：
１７８４〜１７９０，１９８８；Ｄｅｖｅｒｅｕｘら：
Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９
５，１９８４）、適当な分子量のものは見出せなかっ
た。これらの２種の「内因性」蛋白質基質があっても、
細菌系が真核細胞系に優る大きな利点は、内因性ＮＭＴ
活性および基質の両者が存在しないことである。ＮＭＴ
に付する代替基質たとえばヘテロ原子含有類縁体の試験
は、真核細胞中におけるよりもはるかに簡易化される。
【００４５】
【表１】
【００４６】上記表１に示したペプチドＫｍおよびＶｍ
ａｘ値は４または５点ラインウィーバー・バークのプロ
ットから得られた平均である。これらのプロットは少な
くとも３回の独立のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで得られ
たデータを用いて作成された。ペプチドの濃度を変動さ
せ、１５μＭのミリステートを用いて検定を行い、ペプ
チドのＫｍおよびＶｍａｘ値を求めた。脂肪酸アシル−
ＣｏＡ ＫｍおよびＶｍａｘ値は、脂肪酸の濃度を変動
させ６０μＭ ＧＮＡＡＡＡＲＲ（すなわちそのＫｍ濃
度でのペプチド）を用いたほかは同様にして得られた。
酵母ＮＭＴは５７０倍精製プレパレーションである（Ｔ
ｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１９８７）。
合成ペプチド基質は慣用の一文字アミノ酸記号で示す。
Ｖｍａｘ値は、ペプチドおよびアシル−ＣｏＡ基質とし
てそれぞれＧＮＡＡＡＡＲＲおよびミリストイル−Ｃｏ
Ａを用いた場合の値の百分率として表す。（−−）は、
正確にＫｍを決定するのに必要な酵素の量が禁制的に大
きいことを示す。「基質でない」と表示されたペプチド
はＶｍａｘが＜１％であった。ＮＤは測定していないこ
とを意味する。以上の開示を読んだ後には、本技術分野
の熟練者には本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく様々な他の例が明らかであろう。このような他の例
はすべて、特許請求の範囲に包含されるものである。
ａｘ値は４または５点ラインウィーバー・バークのプロ
ットから得られた平均である。これらのプロットは少な
くとも３回の独立のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイで得られ
たデータを用いて作成された。ペプチドの濃度を変動さ
せ、１５μＭのミリステートを用いて検定を行い、ペプ
チドのＫｍおよびＶｍａｘ値を求めた。脂肪酸アシル−
ＣｏＡ ＫｍおよびＶｍａｘ値は、脂肪酸の濃度を変動
させ６０μＭ ＧＮＡＡＡＡＲＲ（すなわちそのＫｍ濃
度でのペプチド）を用いたほかは同様にして得られた。
酵母ＮＭＴは５７０倍精製プレパレーションである（Ｔ
ｏｗｌｅｒら：Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ ８４：２７０８〜２７１２，１９８７）。
合成ペプチド基質は慣用の一文字アミノ酸記号で示す。
Ｖｍａｘ値は、ペプチドおよびアシル−ＣｏＡ基質とし
てそれぞれＧＮＡＡＡＡＲＲおよびミリストイル−Ｃｏ
Ａを用いた場合の値の百分率として表す。（−−）は、
正確にＫｍを決定するのに必要な酵素の量が禁制的に大
きいことを示す。「基質でない」と表示されたペプチド
はＶｍａｘが＜１％であった。ＮＤは測定していないこ
とを意味する。以上の開示を読んだ後には、本技術分野
の熟練者には本発明の精神および範囲から逸脱すること
なく様々な他の例が明らかであろう。このような他の例
はすべて、特許請求の範囲に包含されるものである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図面の簡単な説明
【補正方法】変更
【補正内容】
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、本発明による大腸菌内でのＮＭＴ１お
よびＣαＤＮＡの発現に用いられるプラスミド構築体を
示す。
よびＣαＤＮＡの発現に用いられるプラスミド構築体を
示す。
【図２】図２は、様々なプラスミドを含む大腸菌形質転
換体からの溶解質蛋白質のゲルパターンを示す図であ
り、Ｂ，ＣおよびＤはそれぞれ、外因的に〔３Ｈ〕ミリ
ステート、〔３Ｈ〕パルミテートおよび〔３Ｈ〕１０−
（プロポキシ）デカノエートが添加されている。
換体からの溶解質蛋白質のゲルパターンを示す図であ
り、Ｂ，ＣおよびＤはそれぞれ、外因的に〔３Ｈ〕ミリ
ステート、〔３Ｈ〕パルミテートおよび〔３Ｈ〕１０−
（プロポキシ）デカノエートが添加されている。
【図３】図３は、野性型Ｇｌｙ２−Ｃ−サブユニットま
たは変異体Ａｌａ２−Ｃ−サブユニットを含有する大腸
菌の溶解質のウェスタンブロットを示す。
たは変異体Ａｌａ２−Ｃ−サブユニットを含有する大腸
菌の溶解質のウェスタンブロットを示す。
【図４】図４は、図１に記載された発現プラスミドの構
築に用いられた親プラスミドを示す。
築に用いられた親プラスミドを示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図３】
【図４】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ 8214−4Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ジェフレイ イバン ゴードン アメリカ合衆国ミズリー州オリベット，ス テイシィ ドライブ 12
Claims (8)
- 【請求項１】 大腸菌内においてＮ−ミリストイルトラ
ンスフェラーゼとそのＮ−ミリストイルトランスフェラ
ーゼに対する蛋白質基質を共発現させる方法において、
（Ａ）インプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド
誘導性ｔａｃプロモーター、ｇ１０−Ｌリボソーム結合
部位、ＮＭＴ遺伝子、カナマイシン抵抗性遺伝子および
ｐ１５Ａ複製起源の作動可能な配列、ならびに（Ｂ）ｒ
ｅｃＡプロモーター、ｇ１０−Ｌリボソーム結合部位、
哺乳動物遺伝子、アンピシリン抵抗性遺伝子およびＣｏ
ｌ Ｅ１複製起源の作動可能な配列から構成される二相
性プラスミド系を大腸菌内に導入する方法。 - 【請求項２】 ＮＭＴ遺伝子は酵母ＮＭＴ１ゲノムＤＮ
Ａである「請求項１」記載の方法 - 【請求項３】 哺乳動物遺伝子はｃＡＭＰ依存性プロテ
インキナーゼの野性型４０ｋＤａ触媒性サブユニットを
コードするＣαｃＤＮＡである「請求項１」記載の方法 - 【請求項４】 ＮＭＴ遺伝子は酵母ＮＭＴ１ゲノムＤＮ
Ａであり、哺乳動物遺伝子はｃＡＭＰ依存性プロテイン
キナーゼの野生型４０ｋＤａ触媒性サブユニットをコー
ドするＣαｃＤＮＡである「請求項１」記載の方法。 - 【請求項５】 プラスミドｐＢＢ１３１。
- 【請求項６】 プラスミドｐＢＢ１３２。
- 【請求項７】 プラスミドｐＢＢ１３３。
- 【請求項８】 プラスミドｐＢＢ１３５。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US48510390A | 1990-02-26 | 1990-02-26 | |
| US485103 | 1995-06-01 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06245775A true JPH06245775A (ja) | 1994-09-06 |
Family
ID=23926912
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP3030426A Pending JPH06245775A (ja) | 1990-02-26 | 1991-02-25 | 蛋白質ｎ−ミリストイル化方法 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5436138A (ja) |
| EP (1) | EP0445097B1 (ja) |
| JP (1) | JPH06245775A (ja) |
| AT (1) | ATE141644T1 (ja) |
| CA (1) | CA2036965A1 (ja) |
| DE (1) | DE69121435T2 (ja) |
| DK (1) | DK0445097T3 (ja) |
| ES (1) | ES2091903T3 (ja) |
| GR (1) | GR3021484T3 (ja) |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1996027017A1 (en) * | 1995-02-27 | 1996-09-06 | Abbott Laboratories | A method for expressing modified recombinant proteins in a bacterial system |
| US5807702A (en) * | 1995-02-27 | 1998-09-15 | Abbott Laboratories | Method for expressing phosphorylated recombinant human β-casein in a bacterial system |
| WO1996027018A1 (en) * | 1995-02-27 | 1996-09-06 | Abbott Laboratories | A plasmid for expressing modified recombinant proteins in a bacterial system |
| US5710044A (en) * | 1995-02-27 | 1998-01-20 | Abbott Laboratories | Plasmid for expressing phosphorylated recombinant proteins in a bacterial system |
| US5942254A (en) * | 1995-02-27 | 1999-08-24 | Abbott Laboratories | Phosphorylated recombinant human β-casein expressed in a bacterial system |
| US5807700A (en) * | 1995-11-27 | 1998-09-15 | Washington University | Method of screening anti-amebic agents with an E. coli mutant having a deleted adhE gene complemented by the E. histolytica EhADH2 gene |
| AU7364098A (en) * | 1997-04-30 | 1998-11-24 | Trustees Of The University Of Pennsylvania, The | Bacterial interaction screening system |
| BRPI0721630A2 (pt) | 2007-05-02 | 2013-10-15 | Merial Ltd | Plasmídeo de dna tendo expressão e estabilidade aperfeiçoadas |
| ES2755104T3 (es) | 2012-05-17 | 2020-04-21 | Ra Pharmaceuticals Inc | Inhibidores peptídicos y peptidomiméticos |
| US11180739B2 (en) | 2017-02-27 | 2021-11-23 | Duke University | In vivo protein N-acylation |
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|---|---|---|---|---|
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| US4778877A (en) * | 1986-08-07 | 1988-10-18 | Washington University | Novel inhibitor peptides II |
| US4778878A (en) * | 1986-08-07 | 1988-10-18 | Washington University | Novel inhibitor peptides I |
| US4740588A (en) * | 1986-08-07 | 1988-04-26 | Washington University | Novel substrate peptides |
| US4709012A (en) * | 1986-08-07 | 1987-11-24 | Washington University | Novel inhibitor peptides |
| US4942130A (en) * | 1987-01-14 | 1990-07-17 | President & Fellows Of Harvard College | T7 DNA polymerase |
| US5082967A (en) * | 1988-06-16 | 1992-01-21 | Washington University | Novel fatty acid analog enzyme substrates |
| US5073571A (en) * | 1988-06-16 | 1991-12-17 | Washington University | Method of inhibiting virus |
| US5108919A (en) * | 1988-06-24 | 1992-04-28 | Genentech, Inc. | Dna sequences encoding yeast ubiquitin hydrolase |
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- 1991-02-25 CA CA002036965A patent/CA2036965A1/en not_active Abandoned
- 1991-02-25 JP JP3030426A patent/JPH06245775A/ja active Pending
- 1991-02-25 DK DK91870031.1T patent/DK0445097T3/da active
- 1991-02-25 AT AT91870031T patent/ATE141644T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-02-25 ES ES91870031T patent/ES2091903T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-02-25 DE DE69121435T patent/DE69121435T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-02-25 EP EP91870031A patent/EP0445097B1/en not_active Expired - Lifetime
-
1993
- 1993-07-12 US US08/090,383 patent/US5436138A/en not_active Expired - Fee Related
-
1994
- 1994-07-13 US US08/274,606 patent/US5504008A/en not_active Expired - Fee Related
-
1996
- 1996-10-25 GR GR960402843T patent/GR3021484T3/el unknown
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| DK0445097T3 (da) | 1996-09-16 |
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| EP0445097A2 (en) | 1991-09-04 |
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