KR930007579B1 - 선택된 유전자를 박테리아의 염색체상에 통합시키는 방법 및 그 방법에 따라 얻어진 박테리아 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

선택된 유전자를 박테리아의 염색체상에 통합시키는 방법 및 그 방법에 따라 얻어진 박테리아
제1도는 넓은 숙주범위를 갖는 MudII 1734 트란스포존(transposon)의 제한지도를 나타내는 도면.
제2도는 PBR 322(MudII 1681) 및 pPR 30 플라스미드의 조립 및 제한지도를 나타내는 도면.
제3도는 하기 DNA의 전기영동에 뒤이은 블롯교잡에 관한 결과를 나타내는 도면.
ㆍ트란스포존의 복사물수가 증식되어진 균주로부터 얻은 DNA(레인 f).
ㆍ170세대후 분리된 다섯 균주로부터 얻은 DNA(레인 a 내지 e)(탐침은 pCE : 1134 : DNA는 EcoRI에 의해 소화시킴).
제4도는 pCE 1134 플라스미드의 조립 및 제한지도를 나타내는 도면.
제5도는 pAM9 플라스미드의 조립 및 제한지도를 나타내는 도면.
제6도는 각각 레인 A 내지 D에 해당하는, 균주 AJ 11332, EL 1001, EL 1002 및 EL 1003의 DNA의 전기영동에 뒤이은 블롯교잡의 결과를 나타내는 도면(탐침은 pAM 9의 작은 EcoRI단편 ; 균주의 DNA는 EcoRI에 의해 소화시켰다).
제7도는 PEV11, pMC1 및 pMC23의 조립을 나타내는 도면.
제8도는 균주 AJ 11332, EL 1008 및 EL1009내에서 서딘 DNA-DNA교잡기술에 의한 Mud AM 9전위의 분석을 나타내는 도면.
제9도는 각각 레인 A 내지 G에 해당하는, 균주 AJ 11332, EL 1001, EL 1004, EL 1006, EL 1003, EL 1005 및 EL 1007의 DNA의 전기영동에 뒤이온 블롯 교잡의 결과를 나타내는 도면(탐침은 HindIII에 의해 소화시킨 pRC 100 플라스미드).
제10도는 각각 레인 A, B 및 C에 해당하는, 균주 E. 크리산테미 384551, EL 3003 및 EL 3007의 DNA의 전기영동에 뒤이은 블롯교잡의 결과를 나타내는 도면(사용된 탐침은 pAM 9플라스미드의 Eco RI-Hind III단편).
제11도는 각각 레인 A-C에 해당하는, 균주 E. 크리산테미 384551, EL 3004 및 EL 3008의 DNA의 전기영동에 뒤이은 블롯 교잡의 결과를 나타내는 도면(사용된 탐침은 pAH9플라스미드의 Sal-BamHI 단편).
제12도는 asd 유전자와 트레오닌 오페론을 함유하는 pAM11플라스미드의 조립을 보여주는 도면.
제13-16도는 각각 레인 A 내지 C에 해당하는, 균주 EL 1016, EL 1012 및 EL 1013의 DNA의 전기영동에 뒤이은 블롯교잡의 결과를 나타내는 도면(제13도에서, 염색체 DNA를 SalI에 의해 소화시키고, 탐침으로서 pAM 9의 유전자 nptII, thrA, thrB 및 thrC'를 함유하는 EcoRI-HindIII 단편과 교잡시킴 ; 제14도에서는, 염색체 DNA를 Eco RI에 의해 소화시키고, 탐침으로서 pAM9의 유전자 nptII, thrA, thrB 및 thrC'를 함유하는 단편의 Eco RI-HindIII단편과 교잡시킴 ; 제15도에서는, 염색체 DNA를 SalI에 의해 소화시키고, 탐침으로서 pAM 11의 asd 유전자를 함유하는 BamHI단편과 교잡시킴 ; 제16도에서는 염색체 DNA를 EcoRI에 의해 소화시키고, 탐침으로서 pAM 11의 asd 유전자를 함유하는 BamHI 단편과 교잡시킴)
제17도는 aspA 유전자의 결함 파아지내 클로닝을 나타내는 도면
제18도는 각각 레인 A 내지 C에 해당하는, 균주 MC 4100, EL 1010 및 EL 10111의 DNA의 전기영동에 뒤이은 블롯교잡의 결과를 나태는 도면 : (탐침은 aspA 유전자를 함유하는 플라스미드 ; DNA를 SalI에 의해 소화시킴)
제19도는 각각 레인 A 내지 C에 해당하는, 균주 EL 1016, EL 1014, EL 1015의 DNA의 전기영동에 뒤이은 블롯교잡의 결과를 나타내는 도면 (탐침은 pAM 9 플라스미드의 트레오닌 오페론을 함유하는 SalI-BamHI단편 ; DNA를 HindIII효소에 의해 소화시킴).
제20도는 각각 레인 A 내지 F에 해당하는, 균주 EL 1016, EL 1017, EL 1017-a, EL-1017-b의 DNA의 전기영동에 뒤이은 블롯교잡의 결과를 나타내는 도면(탐침은 pAM9 플라스미드의 유전자 nptII, thrA, thrB 및 thrC'를 함유하는 EcoRI-HindIII 단편).
본 발명은 미생물내에서 선택된 유전자의 복사물(copy) 수를 증식 및 안정화시키는 신규한 방법에 관한 것이다.
본 발명은 효소 베타-갈락토시다제를 암호화하는 서열 및 L-트레오닌의 생합성에 관련된 세효소를 암호화하는 유전자를 미생물의 염색체 내부에 옮기는 하기의 예에 의하여 예증된다.
이들 유전자는 염색체속에 안정하게 고정된다고 밝혀졌다. 그러므로, 생성된 균주는 모(母) 균주보다, 먼저, 상응되는 효소, 또는 둘째로, L-트레오닌 아미노산의 우수한 생산체이다.
박테리아는 효소 및 아미노산같은 유용한 활성성분을 생합성할 수 있다. 발효에 의한 생산은 다수의 유전자와 생성물에 의해 조절되는 복잡한 생화학적 과정을 포함한다. 발효 생성물은 비교적 작은 양으로 얻어진다. 발효에 의한 생산을 개선시키기 위해서는, 관련된 유전자의 복사물의 수가 미생물의 염색체 또는 에피솜 속에서 조절 및 안정화될 수 있는 방식으로 그 수를 증가시키는 것이 유용할 것이다.
특히 환형 플라스미드 벡터에 의하여 미생물 내에서 유전자의 복사물 수를 증식시킬 수 있는 몇가지 방법들이 과학 문헌에 기재되어 있다. 하지만 이들 방법에 의하여 얻어진 복사물의 수는 극히 일정치 않으며 특정 벡터, 선택된 유전자의 길이 및 미생물의 특정한 생리적 조건에 따라 좌우된다. 이들 방법중 그 어느것도, 복사물의 불필요한 과다현상을 피하고 이들 복사물을 염색체내에 안정하게 고정시키면서, 유전자를 선택된 수준으로까지 증식시키는 방법에 관한 것은 아니다.
여러가지 문헌, 특히 하기의 것들은 박테리아 또는 그 외의 다른 유기체내에서 트란스포존을 벡터로 사용하도록 제안하고 있다 :
US-A-4, 670, 388, EP-A-0, 200, 708, EP-A-0, 091, 723, 유전자, 제42권(1986), 185-192페이지, 디 엠보 져널, 제4권 제4호, 1985, 891-898페이지, 생명공학, 제4권 제5호, 1986, 5월 446-449페이지, 뉴욕, US.
그러나 이들 문헌중에서, 특정 DNA서열을 규정된 복사물 수로 안정하게 통합시킬 수 있도록 하는 방법을 기술한 것은 없었다.
본 발명의 한가지 목적은 미생물내에서 선택된 유전자의 복사물을, 이전까지 가능했던 것보다 더 많은 유연성과 신뢰성을 가지고 증식 및 안정하게 고정화시키는 방법을 기술하는 것이다.
본 발명의 이러한 목적 및 다른 목적들은, 예컨대 트란스포즈아제(transposase)의 유전자가 발현될 수 없거나 삭제되어 있으며, Mu파아지로부터 유래되고 넓은 숙주범위를 갖는 전이 요소를 가진 에쉐리히아 콜리 박테리아를 제공함으로써 성취되었다. 그러한 트란스포존은 결함이 있는 트란스포존이다. 동일한 속(genus) 또는 다른 속의 유기체의 경우 재생이 쉬운 특정한 가역적 유전 조건하에서, 이러한 트란스포존 및 유전공학 기술에 의해 이 속으로 도입될 수 있는 유전자를 미생물의 염색체속에서 증가시킬 수 있다. 특정한 유전조건이 제거될 경우엔 트란스포존의 여러가지 복사물이 염색체속에서 안정한 방식으로 고정된채 남는다.
본 발명은 선택된 유전자 또는 특정 DNA서열을 (박테리아 속에서) 염색체 또는 에피솜같은 DNA서열속에 통합시키는 방법에 관한 것으로서, 이때 a) 상기 선택된 유전자 또는 선택된 DNA서열은 트란스포존의 필수적 부분 밖에서 결함 트란스포존 안쪽에 클로닝시키고, b) 상기 트란스포존을 박테리아 인의 DNA서열속에 통합시킨다.
보다더 특별하게는, 본 발명에 따른 공정이 특정수의 복사물을 얻기 위하여 선택된 복사물 수의 유전자를 증식시키는데 사용된다. 이 경우 본 발명에 따른 공정은 선택된 유전자 또는 특정 DNA서열을 박테리아의 염색체 또는 에피솜같은 DNA서열속에 통합시키되, a) 상기 선택된 유전자 또는 선택된 DNA서열은 트란스포존의 필수적 부분, 밖에서 트란스포존 안쪽에 클로닝시키고(상기 트란스포존은 결함 트란스포존), b) 상기 트란스포존을 상기 박테리아의 염색체 또는 에피솜같은 DNA서열속에 통합시키고, c) 상기 결함 트란스포존은 몇회의 전위를 할 수 있게끔 보완하고, 특정수의 전위 이후에는 보완을 정지시키는 공정이다.
본 발명에 따라, 박테리아 DNA내 어떤 장소 안쪽에서 전위하는 트란스포존이라도 사용할 수 있다.
본 명세서에서 "트란스포존"이라는 용어는 "진짜 트란스포존" 및 전위 능력을 갖는 파아지 둘다 의미하는 것이다.
바람직한 트란스포존은 Tn 3, Tn 5, Tn 7, Tn 10, Tn 903, TnHoHo, IS 1, IS 10, IS 50 및 MudI 및 MudII 파아지이다. Mud I 및 Mud II 파아지가 특히 바람직하다.
혼자 힘으로는 전위될 수 없는 트란스포존인 결함 트란스포존의 사용은 안정한 통합이 이루어지도록 해준다. 그 같은 사용에 있어, 사용된 트란스포존은 트란스포즈아제를 위한 유전자를 갖지 않거나 이들 유전자가 상기 박테리아내에서 활성이 없다. 트란스포즈아제를 암호화하는 유전자가 결여되어 있는 트란스포존이 특히 바람직하지만, 교차 작용 전위가 억제되거나 정상적 조건하에서 불활성인 트란스포존의 사용도 가능하다.
본 발명에 따라서, 그속에서 전술한 트란스포존이 전위될 수 있는 어떠한 박테리아라도 사용할 수 있다.
바람직한 박테리아는 엔테로박테리아세에 과의 일원, 예컨대 에쉐리히아 콜리, 시트로박터 시트로박터, 프로인디이, 에르위니아 헤르비콜라 또는 E. 크리산테미, 살모넬라 티피뮤리움, 쉬겔라 손네이, 엔테로박터 클로아세, 세라티아마르셋센스 또는 리조비아세에 과의 일원, 예컨대 아그로박테리움 투메패시엔스 또는 슈도모나스과의 일원, 예컨대 슈도모나스 푸티다이다.
선택된 유전자라는 용어는, 상기 트란스포존속에 평소엔 존재하지 않는, 혹은 숙주 박테리아 속에 존재하지 않는 유전자를 뜻한다.
선택된 유전자로서, 클로닝된 유전자 또는 잡종 유전자, 유전자 단편 또는 합성 유전자를 사용할 수 있다. 이 유전자는 숙주 박테리아 속에서 발현될 수 있으며 동물이나 식물 또는 미생물에서 유리된 것일 수 있다. 몇가지 유전자를 트란스포존속에 삽입할수 있다.
선택된 유전자는, 그 자체가 트란스포존의 안쪽에 있고 상기 박테리아내에서 상기 유전자의 발현을 보장하는 프로모터의 조절하에 있을 수 있다.
클로닝된 유전자는 공지된 유전 공학 기술에 의거하거나 이후에 기재된 공정에 따라 삽입된다.
편의상, 결함 트란스포존을 함유하는 플라스미드로부터 출발하는 것이 더 간단한다. 트란스포존은 삭제 또는 변이에 의하여 결함이 있도록 만든다.
트란스포존이 함유된 플라스미드를 박테리아로부터 분리하여 적절한 제한 효소로 절개한다. 또한, 선택된 유전자를 그들의 숙주로부터 추출시킨 다음 제한 효소에 의해 절개한 후 정제한다. 삽입된 유전자와 동시에 항생제-내성 유전자(예컨대 npt) 또는 기타 "리포터" 유전자(예컨대 lac z)같은 마아커 유전자의 클로닝은 전위화의 선택을 위하여 바람직하다. 전위화의 수는 마아커 유전자의 발현을 측정함으로써 평가된다. 마아커 유전자의 발현은 마아커 유전자가 항생제-내성 유전자인 경우 항생제에 대한 내성에 의해 측정될 수 있다. 또한 마아커 유전자의 발현은 마아커 유전자가 비색분석에 의해 평가될 수 있는 효소 활성을 암호화할 경우 대체물의 착색에 의해 측정될 수도 있다. 여러 단편들을 시험관내에서 연결(ligation)에 의하여 재조합 한다. 형질 전환체들을 선택한 후 분석하여, 그 구조가 적합한 것이라는 사실을 입증한다. 생성된 합성결합 트란스포존은 형질전환 또는 형질도입에 의하여 다른 균주속에 집어 넣을 수 있다. 통상적인 유전공학 방법이 "분자 클로닝, 실험실 편람"(매니아티스일행, 콜드스프링하버 연구소, 뉴욕 1986)에 기재되어 있다.
또한 본 발명의 공정이 선택된 유전자 복사물의 수를 증식시키기 위해 사용되는 경우에는 결함 트란스포존을 사용하여 전술한 공정을 수행하는 동안 특정수의 상기 선택된 유전자의 복사물을 통합시키고, 통합이후, 전위능력이 없는 상기 트란스포존을 몇회 전위될 수 있도록 보완시키고 특정수의 전위후에는 이같은 보완을 정지시킨다.
상기한 보완은 여러가지 방법으로 실시될 수 있다. 만일 트란스포존이 진짜로 결함이 있다면, 즉 이것이 어떠한 트란스포즈아제도 갖지 않는다면, 상기 트란스포즈아제를 암호화하는 플라스미드 또는 파아지에 의하여 트란스포즈아제를 숙주세포속으로 도입할 수 있다.
트란스포즈아제의 발현이 억제된다면, 리프레서를 불활성화시킬 수 있다. 열에 민감한 리프레서의 경우, 온도를 증가시키면 트란스포즈아제가 발현될 것이다.
수령 DNA속에 일단 삽입되면, 생산된 트란스포존은 트란스포즈아제의 유전자를 발현시키는 리프레서 불활성화에 의하여 게놈상에 전위됨으로써 증식될 수 있다.
트란스포즈아제 유전자가 결여되어 있는 트란스포존은 교차 작용 트란스포즈아제 유전자를 갖고 있는 플라스미드 또는 파아지의 도입으로 말미암아 증식될 수 있다.
상기 보완이 플라스미드나 파아지같은 염색체외 인자의 도입에 의해서 수행된다면 이 보완은 통합단계와 동시에 수행될 수 있다.
증식된 트란스포존은 항상 배양조건하에 박테리아 DNA속에서 안정한 방식으로 유지된다. 선택된 유전자를 안정화시키기 위하여 결함 트란스포존을 사용함이 바람직하다. 염색체 또는 안정한 플라스미드 같이 박테리아 세포속에서 안정한 방식으로 유지되는 DNA가 특히 바람직하다.
본 발명의 바람직한 실시형태에 따라, 사용된 결함 트란스포존은 이미 Mucts 돌연변이 파아지에 대해 용원성인 E.콜리 균주내의 결함 프로파아지(PO II 1734)로서 존재하는 Mud II 1734(카스틸로오 일행, J. Bact., 158, 488, 1984)이다. 저온하에 배양된 이 균주를 간단히 가열하고, 생성된 용해질은 적절한 수령 균주로 형질도입시키는데 사용한다. 적합한 항생제에 대한 내성이 있고 어떠한 Mucts 파아지도 생산치 못하는 박테리아는 그의 염색체속에 트란스포존을 함유할 뿐이다.
Mud II 1734를 플라스미드상에 삽입하고, Mud의 내부는 적절히 개조시킬 수 있다.
개조된 Mud를 함유하는 프라스미드는 Mucts에 대해 용원성인 균주내에서 형질전환시킨다. 온도를 상승시킨후에 파아지 용해질을 얻는다. 이러한 파아지 용해질을 사용하여 특정 박테리아의 염색체상에서 개조된 Mud를 형질도입시킨다.
개조된 Mud를 증식시키기 위하여, 그의 염색체상에 결함 트란스포존을 갖는 균주를 두개의 트란스포즈아제 유전자, 즉 유전자 A와 B를 갖는 플라스미드로써 형질전환시키거나 Mu파아지로써 감염시킨다.
플라스미드에 의한 증식의 경우, A 및 B 유전자를 갖는 플라스미드는 (항생제 내성) 선택을 이용함으로써 박테리아 속에 유지시킨다. 이러한 항생제의 존재하에 발육하고, 동시에 트란스포존내에 위치한 유전자의 생성물을 다량으로 합성하는 박테리아를 선택한다. 이들 두 표현형을 발현시키는 박테리아는 그의 염색체상에 트란스포존의 복사물을 몇개 더 함유할 수 있다.
플라스미드를 잃었고 파아지에 대해 용원성을 갖는 박테리아가 자연히 얻어진다.
트란스포존 복사물 수의 측정은 트란스포존내 마아커 유전자의 발현 수준에 따라 전술한 박테리아의 선택에 의해서 실시될 수 있다.
항생제 내성 유전자를 갖는 트란스포존의 복사물 수는 항생제에 대한 박테리아의 내성에 따라 평가할 수 있다.
lac 오페론을 포함하는 트란스포존의 복사물 수는 X-갈(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-베타-D-갈락토시드) 같은 기질을 분해시킨 후 박테리아 콜로니의 착색 강도에 따라 평가할 수 있다.
트란스포존의 복사물 수는 적절한 탐침을 가지고서 서딘 블로팅 및 DNA-DNA 교잡기술을 사용함으로써 측정될 수 있다.
트란스포존에 의하여 증식시킨 선택된 유전자는 트란스포즈아제 유전자가 존재하지 않거나 박테리아 균주내에서 불활성인 한, 안정한 상태로 있게 된다.
이러한 목적을 위하여, 증식후, 숙주 박테리아 속으로 DNA중합효소 1 또는 5'-3' 엑소누클리아제 돌연변이물 또는 HU 결핍 돌연변이물을 도입한다.
본 발명의 중요한 특색은, 얻어진 균주가 매우 안정하다는 것이다. 결함 트란스포존은 더 전위될 수도 없거니와 어떠한 효율적 기작에 의해서도 삭제될 수 없다. 선택적 압력 없이 많은 세대동안 배양을 한 후에 결합 트란스 포존은 여전히 염색체내의 같은 위치에 존재한다.
더우기 공생배양 실험에서 결함 트란스포존의 이동은 검출되지 않는다.
또한 본 발명은 본 발명에 따라 얻어질 수 있는 상기 박테리아에 관한 것이기도 하고, 적절한 배양기속에서 본 발명에 따라 박테리아를 배양하는 것으로 이루어진 이종 유전자 생산물의 제조방법 및 그 생산물의 회수방법에 관한 것이기도 하다.
선택된 유전자가 치료 또는 산업적 용도를 갖는 팹티드나 단백질을 암호화할 수는 있으나, 공정의 실시중 하나는 대사물질의 생합성을 위한 한개, 몇개 또는 모든 유전자가 함유된 결함 트란스포존을 사용하여 전술한 방법에 따라 얻어진 박테리아를 사용함으로써 대사물질을 제조하는 것에 관계된다.
산업상의 의미가 있는 유전자중에서는 아미노산, 특히 트레오닌, 또는 비타민, 예컨대 비오틴의 생합성을 암호화하는 유전자를 손꼽을 수 있다. 그러나 특정 효소의 발현 증식 또는 특정 대사물질의 전체적인 초(super)-발현을 허용해 줄수 있는데, 실시예에서는 asd 유전자와 aspA 유전자의 초-발현을 보여주고 있다.
본 발명에 따른 공정은 매우 다양하며 어떤 유형의 DNA서열을 증식하는 때라도 사용될 수 있다.
이로써 얻어진, 한개 또는 몇개의 효소 혹은 한개 또는 몇개의 아미노산 혹은 소요의 생성물 생산능력을 갖는 박테리아는 통상의 방법과 동일하게 배양할 수 있다. 탄소원, 질소원, 무기이온 및 필요에 따라서는 유기 미소 영양분, 예컨대 아미노산 및 비타민을 함유하는 통상의 배양기가 사용될 수 있다. 적합한 탄소원으로는 글루코오스, 수크로오스, 락토오스, 이들 당을 함유하는 전분 가수분해물, 유장 및 당밀이 포함된다.
바람직한 질소원으로는 암모니아 가스, 암모니아수 및 암모늄염을 들수 있다. 배양은 세포가 원하는 생성물의 생산을 실질적으로 그칠때까지, 조절된 pH 및 온도에서 호기적 조건하에 실시할 수 있다.
아미노산이나 단백질의 생산과 같은 경우에는, 원하는 생성물을 이미 생산한 균주를 숙주 균주로서 사용하는 것이 좋다.
실시예 1
발효에 의한 베타-갈락토시다제 생산에 책임이 있는 암호화 지역의 증식에 의해, 베타-갈락토시다제 활성을 갖는 효소를 생산하는 과정.
결함 트란스포존 안쪽에 클로닝된 추가의 베타-갈락토시다제 복사물 하나를 그의 염색체 내에 함유하는 균주의 제조.
Mud II 1734(제1도)(카스틸로오 일행, J.Bacteriol., 158, 488, 1984)를 함유하는 E.콜리균주 POII 1734 : F-, ara D 139, ara::(Mucts 3, Δ(lac×74), galV, galk, rpsL(SmR)(MudII 7134)를 2ml의 LB배지속에서 30℃ 하에 2시간동안 배양하고, 뒤이어 45℃하에 15분간 열쇼크를 받게한 후 37℃하에 2시간 동안 배양함으로써 파아지 용해질을 생성시킨다. 파아지 용액을 얻기 위하여 이 용해질을 몇방울의 클로로포름과 혼합한 후 원심분리시킨다. 상청액은 박테리아 균주를 감염시키기 위한 파아지 용액으로서 사용한다.
카스틸로오 일행(1984)에 의해 기술된 바와 같은 E.콜리 균주 MC4100 : F-a-ra D 139, Δ(argF-lac), U169, psL150, relAl, flb5301, ptsF25, deo C1(카사바단, 1975)을 LB배지속에서 하룻밤 배양한다. 뒤이어 CaC12및 MgSO4를 첨가하여 최종농도가 각기 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다.
전술한 파아지 용액과 이 배양물 200ul을 혼합하고 15분간 실온에 놓아둔다. 2ml의 LB배지를 첨가하고 30℃하에 2시간동안 배양한 후, 이 세포현탁액을 20㎍/ml의 카나마이신(Km)과 10mM의 X-gal이 함유된 LB배지의 다쉬상에 펴바르고, 뒤이어 30℃하에 24시간동안 배양하여 형질 도입체(transductant)를 선택한다.
Mu에 대해 감수성이 있는 E.콜리의 층 위에 레플리카를 펴바름으로써 체크를 한 후에 Mucts를 생산하지 못하는 콜로니를 동정하고 균주 MC 4100(MudII 1734)를 보류시킨다.
이 균주는 X-gal(이 물질은 베타-갈락토시다제로 가수분해될때 무색에서 청색으로 변한다)이 보충된 LB배지의 디쉬상에서 콜로니가 백색이라는 것에 의해 입증되듯이, 베타-갈락토시다제를 생산하지 못한다.
DNA를 추출시켜 EcoRI 제한효소로 절단하고, 얻어진 단편을 겔위에서 분리하고 니트로셀룰로오스상에 블롯팅시킨다. 표지붙은 트란스포존의 DNA와 교잡시킨 후의 방사선 사진상에는 밴드 두개가 나타나는데, 이는 균주내에 트란스포존의 복사물이 존재함을 지적해 준다.
다수 복사물 플라스미드상의 Mu파아지의 A 및 B 트란스포즈아제 유전자의 클로닝
결함 파아지 Mud II 1681을 갖는 플라스미드 pAB 8155로부터 추출시킨 DNA를 EcoRI 및 EcoRV 제한 효소로 자른다. A 및 B 트란스포즈아제 유전자가 들어있는 8.8kb단편을 겔 전기영동에 의하여 정제하고 SmaI 및 EcoRI로 인해 선형화된 환형 벡터 pUC 19속에 클로닝시킨다. 재조립된 플라스미드를 적절한 수령 박테리아속에 형질전환시킨다. 항생제에 대한 내성이 있는 콜로니를 선택하는데, 이것은 pPR 30 플라스미드를 함유하는 것으로 밝혀졌다(제2도).
MC 4100(Mud II 1734)을 pPR 30으로써 형질전환시킨다. (세포를 염화칼슘으로 처리한 후)(만델 및 히가, J.Mol. Biol., 53, 159, 1970). LB배지속에서 30℃하에 2시간이 지난 후 20㎍/ml의 Km, 25㎍/ml의 암피실린(Ap) 및 10㎍/ml의 X-gal이 함유된 다쉬위에 세포를 펴바른다. 30℃하에 48시간 동안 배양하면 다양한 강도의 푸른색을 띤 콜로니가 나타난다. 이들 콜로니를 동일한 배지상에서 정제하고 선택한다.
전체 DNA를 독립적 콜로니로부터 추출시키고 EcoRI으로 소화시킨 후 전기영동시키고 나일론 막으로 옮긴다. 방사선 표지가 붙은 트란스포존의 DNA와 교잡시킨 후 몇몇 밴드를 방사선사진상에서 검출하면 트란스포존의 증식이 확인된다. Ap없이 LB배지상에 몇회 연속적으로 옮김으로써 이들 균주로부터 pPR 30 플라스미드를 제거한다.
AM1균주를, 특히, 다음과 같은 식으로 연구한다 : DNA를 분리하고 EcoRI에 의해 소화시키고 전기 영동한 후 DNA단편을 나일론 막으로 옮긴다. 사용된 탐침이 방사선 표지붙은 pCE 1134일 경우 4개의 교잡밴드를 제3도에서 볼 수 있다(레인 f). 이들 4교잡밴드는 Mud II 1734의 두 삽입물에 해당된다.
Mud II 1734 복사물 수의 안정성
그의 염색체상에 Mud II 1734의 두 복사물을 갖는 균주 AM1 : MC 4100(Mud II 1734)를 Km없이 LB액체 배지속에서 170 세대동안 배양한다. 염색체상의 Mud II 1734의 복사물 수를 DNA-DNA교잡에 의해 측정한다(제3도, 레인 a 내지 e). 이 균주 내에서의 복사물 수는 안정하게 유자되며 제한 효소 작용 패턴속에서 어떠한 변화도 검출할 수 없었는데, 이는 삽입이 매우 안정하였음을 지적해 준다.
베타-갈락토시다제의 생산
그로써 얻어진 균주는 베타-갈락토시다제를 생산할 수 있다. 균주 MC 4100(Mud II 1734) 및 AM1은 베타-갈락토시다제 활성을 갖는 단백질을 각기 7.10-1및 10n몰/mn/mg씩 생산한다.
실시예 2
발효에 의한 L-트레오닌 생산에 책임이 있는 유전자의 증식에 의해 L-트레오닌을 생산하는 과정, PCE 1134의 조립.
세포를 염화칼슘으로 처리한 후 균주 POII 1734(카스틸로오 일행, J. Bacteriol., 158, 488, 1984)를 PCE 100(2.1kb, CmR, 제4도)로 형질절환시킨다(만델 A 및 히가 M., J. Mol. VBiol., 53, (1970)).
30℃하에 24시간 배양한 후, 형질전환체를 25㎍/ml의 클로르암페니콜(Cm)이 함유된 LB배지의 디쉬상에서 선택한다. 형질전환체 PO II 1734/pCE 100을 LB 배지 3ml속에서 30℃하에 2시간 동안 배양하고, 뒤이어 45℃하에 15분간 열쇼크를 받게한 후 37℃하에 2시간동안 배양함으로써 파아지 용해질을 얻는다. 파아지 용액을 얻기 위해서 이 용해질을 몇방울의 클로로포름과 혼합한 후 원심분리시킨다. 상청액을 파아지 용액I이라고 지칭한다.
E.콜리 M 8820(Mu)(카르틸로오 일행, J.Bacteriol., 158, 488, 1984)을 LB배지 속에서 하룻밤 배양하고, 여기에다 염화칼슘 및 황산마그네슘을 첨가하여 최종농도가 각기 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다. 이 배양물 및 파아지 용액 I 200μl을 혼합하고 실온하에 15분간 놓아둔다. 2ml의 LB 배지를 처가하고 30℃에서 2시간동안 배양한 후 세포 현탁액을 20㎍/ml의 Km과 25㎍/ml의 cm이 함유된 LB 배지의 디쉬위에 펴바른 다음 30℃에서 24시간 동안 배양한다. 디쉬위에 나타난 20개의 콜로니를 거두어들이고, 미니-제조방법에 의해 플라스미드 추출을 실시한다(버른보임 및 돌리, 핵산 Res., 7., 1513, 1979). 제한지도의 분석에 의하면, 모든 콜로니는 Mud II 1734가 삽입되어진 플라스미드를 나타낸다는 것을 알 수 있다. 이들중 하나를 pCE 1134라 지칭한다(제4도).
Thr 오페론을 포함하는 MudAM9의 조립
pCE 1134를 Bam HI 및 Sal I 제한효소에 의하여 완전히 절개한다. lac 오페론이 결여되어 있는 DNA단편을 아가로스 겔 전기영동에 의하여 분리하고 이 겔로부터 추출시킨다.
pAT 294 플라스미드(마이와 일행, Agric. Biol. Chem., 47, 2329, 1983)를 BamHI 및 Sal I 제한효소에 의해 완전히 절개한다. 아가로스 겔 전기영동을 한후, thr 오펜론이 들어있는 DNA 단편을 겔로부터 추출시킨다. 두 DNA단편을 혼합하고, T4-DNA연결효소, ATP 및 디티오트레이톨을 사용하여 10℃에서 16시간동안 연결작업을 실시한다. thrB 변이 균주를 연결혼합물로써 형질전환시킨후, 25μb/ml의 Cm이 들어있고 트레오닌은 없는 최소배지상에서 형질전환체를 선택한다. 형질전환체중의 하나로부터 플라스미드를 추출해보면, npt 유전자와 thr오페론이 있는 Mud를 함유한다는 것이 밝혀진다(pAM9, 제5도).
염색체 DNA상에 Mud AM9의 전위
E.콜리 균주 JM 109(야니시-페론일행, 유전자, 33, 103-119(1985))(Mucts)을 염화칼륨으로 처리한 후 pAM 9를 가지고 형질전환시킨다. 30ㅁ하에 24시간동안 배양한후, 20㎍/ml의 Km 및 25㎍/ml의 Cm이 함유된 LB배지의 디쉬위에서 형질전환체를 선택한다. 플라스미드를 20개의 독립된 콜로니로부터 추출시키고, pAM 9임을 확인한다.
JM109 (Mucts)/pAM9를 45℃하에 15분간 열쇼크받게한 후 30℃에서 2시간동안 배양한다. 배양물을 37℃에서 2시간동안 유지시킨다. 배양물을 몇방울의 클로로포름과 혼합하고 실온하에 15분간 놓아둔다. 5,000rpm하에 10분간 원심분리시켜 파아지용액 II를 얻는다.
LB배지속에서 30℃하에 하룻밤 놓아둔 JM 109(Mucts)의 배양물에다 CaC12및 MgSO4를 첨가하여 최종 농도가 각기 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다. 이 용액 및 파아지 용액 II 200μl을 혼합하고 실온하에 15분간 놓아둔다. 2ml의 LB배지를 침가한후 30℃하에 2시간동안 배양하고, 이 세포 현탁액을 20㎍/ml의 Km이 들어있는 LB배지의 다쉬위에 펴바른다. 30℃하에 24시간동안 배양한 후, 100개의 콜로니를 거두어들이고, 그들의 Cm 감수성을 검사한다. 그들중 95%는 Cm에 대해 감수성이 있으며 JM 109(Mucts)(Mud AM9)로 확인된다.
LB배지속에서 30℃하에 2시간동안 JM 109(Mucts)(Mud AM9)를 배양한 후 45℃하에 15분간 열쇼크처리를 실시한 다음 37℃하에 2시간동안 배양한다. 그런 다음 몇방울의 클로로포름을 첨가하고, 5,000rpm하에 10분동안 원심분리시킨다. 얻어진 상청액은 파아지용액 III이다.
하룻밤 배양한 E.콜리 균주 AJ 11332(쉬이오 일행, Agric. Biol. Chem., 33, 1152, 1969)에다 CaCo2및 MgSO4를 첨가하여, 최종농도가 각기 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다. 이 용액 및 파아지 용액 III 200μl을 혼합하고 실온하에 15분간 놓아둔다. 2ml이 LB배지를 첨가한 후 30℃하에 2시간동안 계속 배양한다. 세포 현탁액을 20㎍/ml의 Km이 함유된 LB배지의 디쉬위에 펴바른 후 30℃하에 24시간동안 배양한다. 100개의 콜로니를 거두어들이고 그들의 45℃에서의 용해성 및 Mu파아지에 대한 감수성을 검사한다. 이들 균주중 하나를 EL 1001이라 지칭한다.
염색체 DNA상에서의 Mud AM9의 증식 및 복사물 수의 선택
(i) pPR 30에 의한 Mud AM9의 증식 : 균주 EL 1001을 pPR 30을 가지고 형질전환시킨다. 25㎍/ml의 Ap 및 다양한 양의 Km 및/또는 네오마이신(Nm)이 함유된 LB 배지의 디쉬상에서 형질전환체를 선택한다.
(ii) Mucts의 용해질에 의한 증식 : 전술했던 것과 같은 Mucts의 용해질에 의해 균주 EL 1001을 감염시킨후, 다양한 양의 Km이 함유된 LB배지의 다쉬위에 펴바른다.
Mud AM9의 복사물을 안정한 수만큼 제공하기 위하여, (i)의 경우 pPR 30으로부터 얻은 콜로니 또는 (ii)의 경우 Mu로부터 얻은 콜로니를 선택한다.
30℃하에 48시간동안 배양한후 콜로니를 거두어들이고 염색체 DNA상에서의 Mud AM9의 수를 전술한 교잡 방법에 의하여 측정한다.
균주 EL 1002 및 EL 1003은 보다 상세히 연구될 것이다.
균주 AJ 11332, EL 1001, EL 1002 및 EL 1003으로부터 DNA를 추출시킨다. Eoc RI제한효소에 의해 소화시킨후, DNA를 전기영동시키고 나일론 막으로 옮긴다. 그런다음, DNA를 Eco RI에 의해 소화시킨 작은 방사선 표지 pAM9 단편과 교잡시킨다. 그 결과는 제6도에 나와있다. 밴드 A, B, C 및 D는 각기 균주 AJ 11332, EL1001, EL1002 및 EL 1003에 해당된다. a라는 글자는 야생형 thr오페론에 해당되고, b라는 글자는 레인 B, C 및 D에 나와있는, 미확인 밴드에 해당된다. 숫자는 Mud AM9-특이적 밴드에 해당된다. 이들 결과에 따르면, 균주 EL 1001, EL 1002 및 EL 1003이 Mud AM9의 복사물을 1, 4 및 10개(최소한) 갖는다.
균주내 Mud AM9의 복사물 수와 균주가 내성을 갖는 항생제의 농도 사이의 관계를 표 1에 놓았다 :
[표 1]
Figure kpo00001
L-트레오닌의 생산
증식된 Mud AM9을 갖는 균주를 30℃하에 24시간동안 LB배지의 디쉬상에 새로이 공급하고 아래에 기술되는 생산배지 20ml속에 접종시킨다.
생산배지의 조성
글루코오스 : 30g/
Figure kpo00002
, (NH4)2SO4: 10g/
Figure kpo00003
, KH4PO4: 1g/
Figure kpo00004
, MgSO47H2O : 1g/
Figure kpo00005
, FeSO47H20 : 10mg/
Figure kpo00006
, MnSO44-6H2O : 10mg/
Figure kpo00007
, L-Met : 0.1g/
Figure kpo00008
, L-Ile : 0.1g/
Figure kpo00009
, L-Pro : 0.45g/RNA : 2g/
Figure kpo00011
, 지아민 HCI : 1mg/
Figure kpo00012
및 CaCO3: 40g/
Figure kpo00013
(pH : 7.0).
배양물은 30℃하에 72시간동안 배양한다. 아미노산 분석기를 사용하여 배지내의 트레오닌 양을 측정한다. 그 결과가 표 2에 나와있다 :
[표 2]
Figure kpo00014
안정성 및 L-트레오닌 생산성
Mud AM9의 복사물 4개를 함유한 균주 EL 1002를, 몇번 잇달아서, 항생물질이 없는 LB 배지의 디쉬상에 옮기고, 옮긴후에는 매회마다 전술한 방법을 이용하여 L-트레오닌 생산성을 시험한다. 그 결과가 표3에 나와있다 :
[표 3]
Figure kpo00015
표 4는 Mud AM9를 함유하는 균주의 L-Thr 생합성 효소의 특이적 활성을 보여준다 :
[표 4]
Figure kpo00016
(*) 특이적 활성은 μ몰/분/단백질의 mg수로 나타낸다.
실시예 3
열유도성(thermoinductible) 트란스포즈아제를 함유하는 플라스미드를 이용하는 mud이 증식.
열유도전성 트란스포즈아제를 함유하는 플라스미드의 조립
박테리아를 CaCl2로 처리한후에 균주 PO II 1681 : M 8820(Mucts)(Mud II 1681)(카스틸로오일행, J. Bacteriol, 158, 488(1984))을 pEV11 플라스미드로 형질전환시킨다(제7도). 30℃에서 24시간 배양한후, 20㎍/ml의 Ap와 20㎍/ml의 Km이 함유된 LB 배지의 디쉬 위에서 형질전환체를 선택한다. 형질전환체 PO II 1681/pEV 11을 3ml의 LB속에서 30℃하에 2시간동안 배양한다. 그런다음, 배양물을 45℃하에 15분간 열쇼크 처리한후 37℃하에 2시간동안 배양한다. 몇방울의 클로로포름을 첨가하고, 5,000rpm에서 10분간 원심분리시킨 후에 파아지 용액을 얻는다. 균주 E.콜리 : M 8820(Mu)(카스틸로오일행, J.Bacteriol)., 158, 488(1984))를 LB 배지속에서 하룻밤 배양하고, CaCl2및 MgSO4를 첨가하여, 최종 농도가 각각 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다. 이 배양물 200μl에다, 50μl의 파아지 용액을 첨가하고, 이 현탁액을 15분간 실온하에 놓아둔다.
2ml의 LB를 첨가하고 2시간동안 30℃하에 휘저어섞은 후, 박테리아 현탁액을 20㎍/ml의 Ap와 20㎍/ml의 Km이 형성된 LB 배지의 디쉬 위에 펴바르고 30℃하에 24시간 동안 배양한다. 20개 콜로니를 얻고, 그들의 플라스미드 DNA를 미니-제조방법에 의하여 추출시킨다(버른보임 및 돌리, 핵산연구, 7, 1513(1979)). 제한지도를 분석한 후, 클론은, pEV11 플라스미드속에 Mud II 1681을 함유하는 것으로 밝혀졌다. 이들 팔라스미스중 하나가 pMC1이다(제7도).
pMC1 플라스미드를 BamHI 및 Bgl II제한 효소에 의해 소화시킨후 Bam HI에 의해 잘려진 pRC 100(실시예 2참조)을 가지고 연결시킨다. 균주 MC 1060은 연결혼합물에 의해 형질전환시킨다. 25㎍/ml의 Cm과 20㎍/ml의 Ap가 함유된 LB 배지의 디쉬 위에서 형질전환체를 선택한다. 형질전환체 30개의 플라스미드를 추출 및 분석하고 그들중 하나를 pMC 23이라 지칭한다(제7도).
pMC 23 플라스미드를 사용한 결합 Mud AM9 파아지의 증식
CaCl2로 처리한 후(실시예 2 참조) 결함 Mud AM9 파아지(실시예 2)가 함유된 균주 EL 1001을 pMC23 플라스미드에 의해 형질전환시킨다. 24시간동안 30℃하에 배양한 후 20㎍/ml의 Ap와 25㎍/ml의 Cm이 함유된 LB 배지의 디쉬상에서 형질전환체들을 선택한다.
형질전환제 EL 1001/pMC 23을 20㎍/ml의 Ap와 25㎍/ml의 Cm이 함유된 LB 배지 속에서 30℃하에 2시간동안 배양한다. 이 배양물 1ml을 45℃하에 15분간 일쇼크 처리한 후 1ml의 LB를 첨가하고 30℃하에 2시간동안 배양한다.
400㎍/ml의 Nm 및 Km이 함유된 LB배지의 디쉬상에 박테리아 현탁액을 펴바른다. 배양은 30℃하에 48시간동안 실시한다. 이때 50개의 클론이 나타나는데, 그들의 Cm에 대한 감수성 및 L-Thr생산성을 시험한다(실시예 2). 이들중 50%는 Cm-감수성이며 60%는 숙주 균주보다 더 많은 L-트레오닌을 생산한다.
몇개의 클론을 선택하고, Mud AM9의 복사물 수를 DNA-DNA 교잡 기술에 의해 측정한다(서던, 1975, J.Mol.Biol., 98, 503) 염색체 DNA를 Hind III 제한효소에 의해 소화시킨다. 전기영동후, DNA를 나일론 막 위에 흡수시킨후, 탐침으로서, 트레오닌 오페론을 함유하는 pMA9 플라스미드의 Sal I-Bam HI 단면(설폰화에 의해 표지된 것)과 교잡시킨다.
Mud AM9의 복사물 수 및 L-트레오닌의 생산과 관련된 결과는 표 5와 제8도에 나와있다. 레인 A, B 및 C는 각각 균주 AJ 11332, EL 1008 및 EL 1009에 상응된다.
A레인에는 트레오닌 오페론에 상응되는 "0"밴드가 나와있다. 레인 B에는 최소한 6개의 밴드가 나와 있다 : 밴드 "0" 및 1-5의 번호가 매겨있고 Mud AM9의 5개의 (최소한) 복사물에 상응되는 5개의 밴드, 레인c에는 "0"밴드 이외에, 1-3의 번호가 매겨져 있고 Mud AM9의 최소한 3개의 복사물에 상응되는 3개의 밴드가 나와았다.
[표 5]
Figure kpo00017
실시예 4
균주의 염색체 DNA상에서의 두가지 각기 다른 결함 파아지의 증식
Mud II PR13을 함유하는 용해질의 제조
균주 MC 4100(Mucts)(Mud II-PR13)(P. 라테트일행, 유전자, 63, 41-52, 1988)을 LB 배지속에서 30℃하에 2시간동안 배양한 후 45℃하에 15분간 열쇼크를 받게하고, 뒤이어 37℃하에 2시간동안 배양한다. 몇방울의 클로로포름을 첨가한 후 5,000rpm에서 10분간 원심분리 시킨다. 이로써 파아지 용해질 VI을 얻는다.
염색체 DNA상에서 Mud II PR13의 전위
균주 EL 1001을 하룻밤 배양한 배양물 속에 CaCl2및 MgSO4를 첨가하여 최종 농도가 각기 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다. 50μl의 파아지 용액 VI를 200μl의 EL 1001 배양물 속에 첨가한 후, 현탁액을 15분간 실온하에 놓아둔다. 2ml의 LB를 첨가한 후, 현탁액을 30℃에서 2시간동안 휘저어 섞는다. 그런다음 25㎍/ml의 Cm과 20의 Km이 함유된 LB 배지상에 박테리아를 펴바른다. 30℃하에 24시간동안 배양한후, 50개의 콜로니를 계대배양하고, 그들의 45℃하에서의 용해성 및 Mu 파아지에 대한 감수성을 시험한다. 시험된 콜로니중 80%는 Mu에 대해 감수성을 가지며 45℃에서 용해되지 않는다. 균주 EL 1001(Mud II PR13)을 EL 1004라고 지칭한다.
균주 EL 1003을 같은 방식으로 처리한다.
EL 1003(Mud II PR13) 균주를 EL 1005라고 지칭한다.
EL 1004 및 EL 1005 균주내에서의 Mud II PR13의 증식
실시예 2에 기재된 방법에 의하여 JM 109-(Mucts)로부터 제조된 Mucts 용해질에 의해 EL 1004 균주를 감염시킨다. 박테리아 현탁액을 20㎍/ml의 Km 및 400mg/ml의 Cm이 함유된 LB 배지의 디쉬상에 펴바른다. 30℃하에48시간동안 배양한 후 50개의 콜로니를 분리하고 그들의 45℃에서의 용해성과 Mu 파아지에 대한 감수성을 시험한다. 콜로나중 84%는 Mu에 대해 감수성이 있으며 45℃하에 용해되지 않는다. 이들 콜로니중 하나를 EL 1006이라 지칭한다.
EL 1005 균주를 같은 방식으로 처리하고 EL 1007 클론을 얻는다.
염색체 DNA를 균주 AJ 11332, EL 1001, EL 1003, EL 1004, EL 1005, EL 1006 및 EL 1007로부터 추출시킨다.
염색체 DNA를 Eco RI 제한효소에 의해 소화시킨 후, 서던방법에 의하여 DNA-DNA 교잡을 실시한다(실시예 3). 탐침은 Hind III에 의해 소화시키고 실온화에 의해 표지가 붙여진 pRC 100 플라스미드에 상응된다. 제9도에서 레인 A, B, C, D, E, F 및 G는 각기 균주 AJ 11332, EL 1001, EL 1004, EL 1006, EL 1003, EL 1005 및 EL 1007에 해당된다.
레인 A, B 및 E에서 얻어진 밴드는 균주의 염색체 DNA와 pRC 100 탐침간의 교잡에 해당된다. 이들 밴드는 다른 모든 레인속에 존재하고, 따라서 Mud II PR13에 특이적인 것이 아니다. 레인 C, D, F 및 G에서 1-4의 번호는 Mud II PR13과의 교잡에 대해 특이성을 갖는 밴드를 표시하며, 각 밴드는 Mud II PR13의 삽입물에 해당된다. 이와 동일한 레인에서 "0"밴드는 Mud II PR13의 내부 밴드에 해당된다. 이들 결과에 따라 균주 EL 1004와 EL1005는 Mud II PR13의 삽입물 한개를 함유하고 균주 EL 1006과 EL 1007은 최소한 Mud II PR13의 삽입물을 각각 4개 및 3개 함유한다.
실시예 5
에르위니아 크리산테미 균주내에서의 결함 파아지의 통합 및 증식
Mud II 1734와 Mud AM9의 용해질의 제조
Mud II 1734와 Mud AM9가 함유된 파아지 용해질 두개를 균주 POII 1734(카스틸로오 일행, J. Bacteriol., 158, 488 (1984)) 및 JM 109(Mucts)(Mud AM9)(실시예 2)로부터 실시예 2의 방법에 따라서 제조한다.
에르위니아 크리산테미의 염색체 DNA상에서의 Mud 파아지의 전위
E. 크리사나테미 균주 384551(M. 시뽀 CNRS. 마흐셀)을 수령 균주로서 사용한다. 2개의 용해질(실시예 2)을 사용하여 형질도입(실시예 2)을 실시한다. 20㎍/ml의 Km이 함유된 배지상에서 자랄수 있는 콜로니를 분리한 후 그들의 45℃하에서의 용해성 및 Mu 파아지에 대한 감수성을 시험한다. Mud II 1734 및 Mud AM9 용해질에 의해 감염시킨후 얻은 형질 도입체 각각 70% 및 80%는 Mu 파아지에 대해 감수성이 있고 45℃에서 용해되지 않는다. 각 형질도입으로부터 클론 한개씩을 선택한다 :
EL 3003 : E. 크리산테미(Mud II 1734)
EL 3044 : E. 크리산테미(Mud AM9)
균주 EL 3003 및 EL 3004내에서의 Mud 파아지의 증식은 실시예 2에 기재된 바와 같이 균주 JM109(Mucts)의 용해질을 사용하여 실시한다. 증식된 Mud를 함유한 균주의 선택은 400mg/ml의 Km과 Nm을 함유한 LB 배지속에 실시한다.
50개의 내성 콜로니를 계대 배양한 후 그들의 Mu 파아지-가마수성을 시험한다. 이로써, Mu 파아지에 대한 감수성이 있는 균주 EL 3007과 EL 3008이 얻어진다.
두 균주의 염색체 DNA상의 Mud의 복사물 수
사르코실대신 SDS로 처리한다는 것 외에는, E.콜리에 대한 동일 기술(실시예 1)에 의해 염색체 DNA를 추출시킨다. 이들 DNA의 분자 분석은 서던방법에 의해 실시한다(실시예 3). DNA를 Eco RI 제한효소에 의하여 소화시킨다. 사용된 탐침은 결함 파아지에 대해 특이성이 있으며 실온화에 의해 표지된다 :
Mud II 1734의 경우 : 결함 파아지의 왼쪽 경계에 해당하는 pAM9 플라스미드의 EcoRI-Hind II 단면.
Mud AM9의 경우 : E.콜리의 트레오닌 오페론에 해당하는 pAM9 플라스미드의 Sal I-BamHI 단면 결과는 표 6과 제10, 11도에 나와있다.
제10도에서 레인 A, B 및 C는 각기 균주 : E.크라산테미 384551, EL 3003 및 EL 3007에 해당된다.
레인 B와 C에서 1-3 밴드는 Mud II 1734와의 교잡 특이성에 해당된다. 이들 결과에 따라 균주 EL 3003과 EL 3007은 각기 Mud II 1734의 1개 및 3개의 삽입물(최소한)을 갖는다.
제11도에서, 레인 A, B 및 C는 각기 균주 : E.크라산테미 384551, EL 3004 및 EL 3008에 해당된다.
레인 A에서 "b" 단면은 384551균주의 염색체 DNA와 탐침간의 교잡에 해당된다.
레인 B와 C에서 숫자는 Mud AM9와의 교잡 특이성을 갖는 밴드에 해당된다. 두 밴드는 Mud AM9의 삽입을 하나애 해당된다.
이들 결과에 따라 균주 EL 3004과 EL 3008은 각기 Mud AM9의 삽입물을 최소한 1개 및 4개씩 갖는다.
[표 6]
Figure kpo00018
실시예 6
더 큰 크기의 결함 파아지의 증식
트레오닌 오페론과 sad 유전자를 포함하는 Mud AM11의 조립
결합 Mud AM9 파아지를 함유하는 pAM9 프라스미드(실시예 2 참조)를 BamHI 제한효소(단일 자리)에 의해 완전히 절단함으로써 pAM9를 선형화시킨다.
pAD 20 프라스미드(하지자 일행, EMBO, J., 1982, 3, 379-384)를 BamHI 제한효소에 의해 완전히 절단한다. 전기영동후, asd 유전자가 함유된 단면을 겔로부터 추출시킨다.
두 DNA 단면을 혼합하고 T4-DNA 연결효소, ATP 및 디티오트레이톨을 사용하여 22℃에서 1시간동안 연결작업을 실시한다. 변이균주 Asd-: JCP 203(C.PRINTZ, 퍼스날 코뮤니케이션)을 연결 혼합물로 형질전환 시킨후, 25mg/ml의 Cm과 20mg/ml의 Km이 함유된 완전배지속에서 형질전환체를 선택한다. 형질전환체로부터 추출된 플라스미드는 nptII 유전자, 트레오닌 오페론 및 asd유전자가 들어있는 결함 Mud AM11 파아지를 갖는 것으로 밝혀졌다. pAM11이라 지칭된 플라스미드가 제12도에 나와있다.
염색체 DNA상에서 Mud AM11의 전위
pAM11 플라스미드에 의하여 E.콜리 JM 109(Mucts)를 형질전환시킴으로써 균주 JM 109(Mucts)/pAM11을 얻는다(실시예 2 참조).
균주 JM109(Mucts)/pAM11을 30℃하에 2시간동안 배양한다. 45℃에서 15분간 열쇼크를 받게 한 후 이 배양물을 37℃하에 2시간동안 유지시킨다. 및 방울의 클로로포름을 이 배양물속에 첨가하고 이를 실온하에 15분간 놓아둔다. 5,000rpm에서 10분간 원심분리시킨후 파아지 용액 II-AM11을 얻는다.
30℃하에 LB 배지속에서 하룻밤 놓아둔 JM109(Mucts)의 배양물속에 CaCl2및 MgSO4를 첨가하여, 최종 농도가 각기 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다. 50μl의 파아지 용액 II-AM11을 이 배양물 200μl과 혼합하고 15분간 실온하에 놓아둔다. 2ml의 LB배지를 첨가한후, 혼합물을 309℃하에 2시간동안 휘저어 섞고 박테리아 현탁액을 20mg/ml의 Km이 함유된 LB 배지의 디쉬위에 펴바른다. 30℃하에 24시간동안 배양한후, 100개의 콜로니를 거두어 들이고 그들의 Cm에 대한 감수성을 시험한다. 이들중 85%는 그러한 감수성을 가지는데, 이중 한 콜로니를 JM 109(Mucts)(Mud AM11)이라 지칭한다.
균주 JM 109(Mucts)(Mud AM11)을 2시간동안 30℃하에 LB 배지속에서 배양한후, 45℃하에 15분간 열쇼크처리를 실시한다. 37℃하에 2시간동안 배양한후 몇방울의 클로로포름을 첨가하고 5,000rpm하에 10분간 원심분리한다.
얻어진 현탁액은 파아지 용액 III-AM11이다.
균주 AJ 11332(λ+, Pro-)는 Pro+균주속에서 배양한 P1 파아지에 의해 형질도입시킨다. 균주 AJ 11332(λ+, Pro+)를 선택한다. 이 균주속에 들어있는 λ파아지를 제거한다(C.MOREL, 퍼스널 코뮤니케이션), 이로써 얻어진 균주 AJ 11332(λ+, Pro-)를 EL 1016이라 지칭한다.
LB 속에서 37℃하에 하룻밤 배양한 E.콜리 EL 1016의 균주에다 CaCl2및 MgSO4를 첨가하여, 최종 농도가 각기 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다. 50μl의 파아지용액 III-AM11을 이 배양물 200μl과 혼합하고 15분간 실온하에 놓아둔다. 2ml의 LB를 첨가한후, 30℃하에 2시간동안 휘저어 섞는다. 박테리아 현탁액을 20mg/ml의 Km이 함유된 LB 배지의 디쉬위에 펴바른후 30℃에서 24시간동안 배양한다. Mu-감수성 클론을 선택한다 : EL 1012.
염색체 DNA 상에서의 Mud AM11의 증식 및 복사물 수의 선택
증식은 진술한 바와같이 얻어진 Mucts 파아지 용해질에 의해 EL 1012 균주를 감염시킴으로써 실시된다. 박테리아를 250-1200 ug/ml에 이르는 다양한 양의 Km과 Nm이 함유된 LB 배지의 디쉬상에 펴바른다.
선택된 형질도입체는 안정한 수의 Mud AM11 복사물을 함유한다.
균주 EL 1013은 보다 특별히 연구하였다.
염색체 DNA상에서의 Mud AM11 수는 실시예 3에 기재된 서던 DNA-DNA 교잡법에 의해 평가한다.
염색체 DNA를 각기 EL 1016, EL 1012 및 EL 1013으로부터 추출시킨다. Sal I 또는 EcoRI 제한효소에 의해 소화시킨후 이들 DNA를 진기영동시킨후 나일론 막위에 흡수시킨다(실시예3 참조). 그런다음, 이들을 탐침으로서 표지된(설포화에 의함) DNA 단면, 각기 균주 EL 1016, EL 1012 및 EL 1013에 해당하는 레인 A, B 및 C와 교잡시킨다.
"a"라는 글자는 야생형의 트레오닌 오페론 또는 asd 유전자에 해당된다. "P"라는 글자는 DNA의 부분소화를 가리킨다. 숫자는 Mud AM11과의 교잡 특이성을 표시하는 밴드를 가리킨다.
제13도에서, 염색체 DNA를 Sal I로 소화시키고 탐침으로서 pAM9의 npt II, thrA, thrB 및 thrC' 유전자가 들어있는 EcoRI-HindIII 단면과 교잡시킨다.
이 경우 두개의 밴드은 Mud AM11의 삽입물 하나에 해당된다.
레이 A에는 원래의 트레오닌 오페론에 해당되는 "a"밴드만이 나와있다.
레인 B에는 3개의 밴드, 즉 "a"밴드 및 Mud AM11의 삽입물 하나에 해당되는 "1" 및 "2"밴드가 나와있다.
레인 C에는 9개의 밴드, 즉 "a"밴드 및 4개의(최소한) Mud AM11의 삽입물에 해당되는 "1-8"밴드가 나와있다.
제14도에서, 염색체 DNA를 EcoRI에 의해 소화시키고 탐침으로서 pAM9의 npt Ⅱ, thrA, thrB 및 thrC' 유전자가 들어있는 EcoRI-HindIII 단면과 교잡시킨다. 밴드 하나는 Mud AM11 삽입물 하나를 가리킨다.
레인 A에는 트레오닌 오페론에 해당되는 "a"밴드만이 나와있다.
"P"밴드는 부분 소화에 해당된다. 레인 B에는 두 밴드, 즉 "a" 및 Mud AM11의 삽입물 하나에 해당되는 "1"밴드가 나와있다.
"P"밴드는 부분소화에 해당된다.
레인 C에는 여섯개의 밴드, 즉 "a" 및 Mud AM11의 5개 삽입물(최소한)에 해당되는 "1" 내지 "5"밴드가 나와있다.
제15도에서는 염색체 DNA를 Sal I에 의해 소화시키고, 탐침으로서 pAM11의 asd 유전자를 함유하는 BamH I 단면과 교잡시킨다.
이로써 나온 밴드 하나는 Mud AM11의 삽입물 하나에 해당된다.
레인 A에는 asd 유전자에 상응되는 "a"밴드만이 나와있다.
레인 B에는 밴드 두개, 즉 "a"와 "1"이 나와있는데, 이는 Mud AM11의 삽입물 하나에 해당된다.
레인 C에는 다섯개의 밴드, 즉 "a" 및 "1" 내지 "4"가 나와있는데, 이는 Mud AM11의 삽입물 4개(최소한)에 해당된다.
제16도에서는 염색체 DNA를 EcoRI에 의해 소화시키고, 탐침으로서 pAM11의 sad 유전자를 갖는 BamH I 단편과 교잡시킨다.
밴드 하나는 Mud AM11의 삽입물 하나에 해당된다.
레인 A에는 asd 유전자에 상응되는 "a"밴드만이 나와있다.
레인 B에는 두개의 밴드, "a" 및 "1"이 나와있는데, 이는 Mud AM11의 삽입물 하나에 해당된다.
레인 C에는 여섯개의 밴드, 즉 "a" 및 "1" 내지 "5"가 나와있는데, 이는 Mud AM11의 삽입물 5개(최소한)에 해당된다.
이들 결과에 따라, 균주 EL 1012 및 EL 1013는 각각 한개 및 다섯개의(최소한) Mud AM11 복사물을 갖는다.
[표 7]
Figure kpo00019
증식된 Mud AM11을 갖는 균주를 30℃하에 24시간동안 LB 배지의 디쉬위에서 계대배양하고 생산배지 20ml 속에 접종시킨다(실시예2). 30℃하에 72시간동안 배양을 한다. 아미노산 분석기를 사용하여 배지내 L-트레오닌의 양을 측정한다.
[표 8]
Figure kpo00020
아스파르토키나제-I(AK-I) 활성을 트러파-바치, P., 코헨 G-N., 효소학 방법, 1970, 17, 694-702의 방법에 의해 분석한다.
아스파르테이트 세미알데히드 탈수소효소(ASA) 활성은 헤게만, G-D., 코헨, G-N., 마르간, R., 효소학 방법, 1970, 17, 708-713의 기술을 사용하여 측정한다.
[표 9]
Figure kpo00021
실시예 7
L-아스파르테이트 암모니아-리아제를 생산할 목적으로 한 E. 콜리의 aspA 유전자의 증식.
E. 콜리의 L-아스파르케이트 암모니아-리아제를 암호화하는 aspA 유전자를 포함하는 Mud AB9의 조립.
aspA의 유전자를 갖는 pGS 94 플라스미드(게스트 일행, J. Gen. Microbiol.(1984), 130, 1271-1278)를 Cla I 및 Sal I 제한효소에 의해 완전히 절단한다. 3.4 kb의 단편이 aspA 유전자를 함유한다.
결함 Mud PC3 파아지를 갖는 pPC3 플라스미드(pPR 3 플라스미드의 Pst I 단편을 전위시킴으로써 생성됨)을 Cla I 및 Sal I 제한효소에 의하여 완전히 절단한다. 5.3kb의 단편은, aspA 유전자를 클로닝 시키는 것이 바람직한 결함 파아지를 함유한다.
절단된 플라스미드 두개를 혼합하고, T4-DNA 연결효소 ATP 및 디티오트레이톨을 사용하여 22℃하에 1시간동안 연결작업을 실시한다. MC 1060 균주를 연결혼합물로써 형질전환시킨후(실시예2), 20 ug/ml의 Ap와 25 ug/ml의 Cm을 함유하는 LB 배지상에서 형질전환체를 선택한다.
20 ug/ml의 Km이 함유된 LB 배지상에서 27개의 형질전환체를 계대 배양한다. 이때, 이 항생제에 대한 감수성이 있는 17개의 클론이 체류된다.
L-아스파르케이트 암모니아-리아제의 활성은 스펜서 일행의 방법(J.Gen. Microviol. (1976), 97, 73-82)에 따라 이들 클론의 배양물의 세포 추출물를 사용하여 분석한다. 클론 9만이 MC 1060 균주의 염색체 유전자에 의해 부여된 활성보다 더 높은 aspA 활성을 가졌다.
이 클론의 플라스미드 DNA를 버른보임과 돌리의 기술에 따라 추출시킨 후 EcoRI 및 HindIII 제한효소에 의해 절단된다. 병행하여, 두 모(母 플라스미드의 DNA를 동일한 제한효소로 절단한다. 제한효소 작용 방식을 분석해 보면, 클론 9가 결함 Mud PC3 파아지속에 aspA 유전자를 갖는 단편의 클로닝에 해당된다는 것을 알 수 있다. 새로운 결함 파아지를 Mud AB9라 지칭하고, 이를 함유하는 플라스키드를 pAB9이라 지칭한다(제17도).
염색체 DNA 상에서의 Mud AB9의 전위
균주 E. 콜리 JM 109(Mucts)(실시예2)를 플라스미드 pAB9에 의해 형질전환시킴으로써 균주 JM 109(Mucts)/pAB9을 얻는다.
균주 JM 109(Mucts)/pAB9을 30℃하에 2시간동안 배양한다. 45℃에서 15분간 열쇼크를 받게한 후 배양물을 2시간동안 37℃에서 유지시킨다. 그런다음 몇방울의 클로로포름을 첨가하고, 5,000rpm하에 10분간 원심분리시킨후 파아지 용해질 II-AB9을 얻는다.
균주 JM 109(Mucts)을 LB 배지속에서 30℃하에 하룻밤 배양한다. 그런다음 CaC12및 MgSO4를 첨가하여 최종농도가 각기 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다. 이 배양물 200 ul에다 50μl의 파아지 용해질 II-AB9를 첨가한다. 실온하에 15분간 흡착시킨후, 2ml의 LB를 첨가하고, 시험관을 30℃하에 2시간동안 휘저어 섞는다. 그런다음 이 현탁액을 25ug/ml의 Cm이 함유된 LB 배지의 디쉬위에 펴바른다.
디쉬를 30℃하에 24시간동안 오븐속에 놓아둔다. 콜로니 100개를 선택하여 그들의 암피실린 감수성을 체크한다. 이로써 균주 JM 109(Mucts)(Mud AB9)이 얻어진다. 이 균주로 부터 전술한 바와같이 파아지 용해질 III-AB9이 얻어진다.
37℃하에 LB 배지속에서 하룻밤 배양한 균주 E. 콜리 MC 41000에다 CaC12및 MgSO4를 첨가하여 농도가 각기 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다. 파아지 용액 III-AB9을 이 배양물 200μl과 혼합하고 실온하에 15분간 놓아둔다. 2 ml의 LB를 첨가한후 30℃하에 2시간동안 계속 배양한다. 세포 현탁액을 25mg/ml의 Cm이 함유된 LB 배지의 디쉬위에 펴바른다. 그런다음 이 디쉬를 30℃하에 24시간동안 오븐속에 놓아둔다.
Mu-감수성 클론을 선택한다 : EL 1010
염색체 DNA 상에서의 Mud AB9의 증식
복사물 수의 측정
전술한 바에 따라 얻어진 Mucts 용해질에 의해 EL 1010 균주를 감염시킴으로써 증식을 실시한다. 박테리아를 500mg/ml의 Cm이 함유된 LB 배지의 디쉬위에 펴바른다.
선택된 형질도입체는 안정한 수의 Mud AB9를 함유한다.
30℃하에 48시간동안 배양한 후 내성 콜로니를 선택하고 결함 Mud AB9의 복사물 수를 서던 DNA-교잡방법에 의해 측정한다(실시예3).
균주 EL 1010과 EL 1011에 대하여 특별하게 연구하였다.
균주 MC 4100, EL 1010 및 EL 1011로 부터 DNA를 추출한다. Sal I 제한효소에 의해 소화시킨후 DNA를 전기영동시킨 다음 나일론 막에 흡수시킨다. DNA를, aspA 유전자를 가지며 설폰화에 의해 포지된 프라스미드와 교잡시킨다.
제18도에 레인 A, B 및 C는 각기 균주 MC 4100, El 1010 및 EL 1011에 해당된다.
"a"라는 글자는 야생형의 aspA 유전자에 해당된다.
레인 A에서는 aspA 유전자에 상응되는 "a"밴드만이 나와있다.
레인 B에는 두개의 밴드가 나와있는데, 여기서 "a"는 aspA 유전자에 해당되고, "1"은 Mud AB9의 삽입물 하나에 해당된다.
레인 C에는 5개의 밴드(최소한), 즉 "a"밴드 및 Mud AB9의 삽입물 4개(최소한)에 해당되는 "1" 내지 "4"밴드가 나와있다.
[표 10]
Figure kpo00022
실시예 8
용원화 단계에서의 몇개의 삽입물
실시예 2에 기재된 바에 따라 균주 JM 109(Mucts)(Mud AM9)로부터 파아지 용해질을 얻는다.
균주 E. 콜리 : EL 1016을 하룻밤 배양한 배양물에다(실시예6) CaC12및 MgSO4를 첨가하여 최종 농도가 각기 1mM 및 2.5mM이 되도록 한다. 이 배양물 200μl에다 파아지용액 III-AM9 50μl을 첨가하고(실시예2) 이 현탁액을 실온하에 15분간 놓아둔다.
2ml의 LB를 첨가한후 30℃하에 2시간동안 계속 배양을 한다. 박테리아 현탁액을 250μl의 Km과 Nm이 함유된 LB 배지의 디쉬위에 펴바르고 24시간동안 30℃하에 배양한다. 콜로니 두개가 나타나면 그들의 45℃에서의 용해성 및 Mu 파아지에 대한 감수성을 검사한다. 이들 두 클론은 용해되지 않고 Mu에 대한 감수성이 있는데, EL 1014 및 EL 1015라고 지침한다.
실시예 2에 기재된 바에 따라 L-트레오닌 생산시험을 실시한다. Mud AM9의 복사물 수를 서던 DNA-DNA 교잡방법에 의해 측정한다(실시예3). 염색체 DNA를 HindIII 제한효소에 의해 소화시킨다. 진기영동후 DNA를 나일론 막에 의해 흡수시킨후 트레오닌 오페론을 함유하는 pAM9 플라스미드의 Sal I-BamHI 단편(설폰화에 의해 표지됨)과 교잡시킨다. L-트레오닌 생산 및 Mud AM9의 복사물 수에 관한 결과가 표 XI과 제19도에 나와있다.
제19도에서 레인 A, B 및 C는 각기 균주 EL 1016, EL 1014 및 EL 1015에 해당된다. "0"라는 글자는 야생형의 트레오닌 오페론에 해당된다. 다른 밴드는 각각 Mud AM9의 삽입물 하나에 해당된다.
레인 A에는 트레오닌 오페론에 해당되는 "0"밴드만이 나와있다. 레인 B에서 1 내지 3의 번호가 매겨져 있고 적어도 3개의 Mud AM9 삽입물에 해당되는 추가의 세밴드가 나와있다. 레인 C에서 두개의 추가 밴드는 최소한 Mud AM9의 삽입물 두개에 해당된다.
[표 11]
Figure kpo00023
실시예 9
발효도중 결함 파아지의 수와 국재(localization)의 안정성
균주 EL 1003(λ+, Pro-)는 Pro+균주상에서 배양한 P1 파아지에 의해 형질도입 시킨다. 균주 EL 1003(λ+, Pro+)를 선택한다. 그런다음, 이 균주속에 들어있는 λ파아지를 제거한다(C. 모렐, 퍼스날 코뮤니케이션). 이로써 얻어진 균주 EL 1003(λ-, Pro+)를 EL 1017이라 지칭한다.
Mud AM9의 복사물 10개(최소한)를 함유하는 EL 1017 균주를 발효 전후에 시험하여 이 단계중 Mud AM9의 안정성을 측정한다.
1.51의 발효배지(실시예2 : 배지의 성분)가 들어있는 발효조에 EL 1017 균주를 넣고 배양한다. 발효는 적절한 온도하에 48시간동안 일어난다. 발효후에 클론을 분리하고 4개의 클론을 특별히 연구하였다 : EL 1017-a, EL 1017-b, EL 1017-c 및 EL 1017-d.
모(母)균주 EL 1017 및 클론 EL 1017-a, EL 1017-b, EL 1017-c 및 EL 1017-d를 서던 DNA-DNA 교잡기술(실시예3)에 의해 분석하는데, 이 기술에 의하면 시험한 클론내 결함 파아지의 수와 국제화를 규정할 수 있게 된다.
균주 EL 1016(실시예6). EL 1017, EL 1017-a, EL 1017-b, EL 1017-c 및 EL 1017-d의 염색체 DNA를 추출시킨 후 HindIII 제한효소에 소화시킨다.
전기영동후 이들을 나일론 막위에 흡수시키고, pAM9 플라스미드의 표지된(설폰화에 의해)Eco RI-HindIII 단편(유전자 npt II, thrA, thrB, 및 thrC')과 교잡시킨다(제1도). DNA-DNA 교잡의 결과가 제20도에 나와있다.
레인 A, B, C, D, E 및 F는 각기 균주 EL 1016, EL 1017, EL 1017-a, EL 1017-b, EL 1017-c 및 EL 1017-d에 해당된다.
글자 "a"는 야생형의 트레오닌 오페론에 해당된다.
숫자는 Mud AM9과의 교잡 특이성을 표시하는 밴드에 해당된다.
레인 A : 트레오닌 오페론에 해당되는 "a"밴드만이 나와있다.
레인 B, C, D, E 및 F : 10개의 밴드(최소한)가, 즉 "a"밴드 및 Mud AM9의 9개의 삽입물(최소한)에 해당되는 "1" 내지 "9"의 다른 밴드가 나와있다.
이들 결과에 따르면, 모균주 및 발효로 인에 얻어진 클론의 교잡 양식이 유사하다. 이는, 발효에 사용된 박테리아의 염색체내에 삽입된 결합 파아지의 안정성을 입증해 준다.
하기 균주들은 1988. 1. 25일자로 국립 미생물 뱅양균 수집소, 파스퇴르 연구소(파리 독또르-루 25 번가)에 기탁되 있다 :
- 에쉐리히아 콜리 K12 PO II 1681 No. I-727
- 에쉐리히아 콜리 K12 PO II 1734 No. I-728
- 에쉐리히아 콜리 K12 EL 1001 No. I-729
- 에쉐리히아 콜리 K12 EL 1002 No. I-730
- 에쉐리히아 콜리 K12 EL 1003 No. I-731

Claims (19)

  1. 박테리아, 바람직하게는 에쉐리히아 콜리, 시트로박터 프로인디이, 에르위니아 헤르비콜라 또는 에르위니아 크리산테미, 살모넬라 티피뮤리움, 쉬겔라 손네이, 엔테로박터 클로아세, 세라티아 마르셋센스와 같은 엔테로박테리아세에과의 DNA 서열속에 선택된 유전자 또는 특정 DNA 서열의 복사물의 특정수 만큼 통합시키는 방법에 있어서, a) 상기 선택된 유전자 또는 DNA 서열을 결함 트란스포존이며 따라서 트란스포즈아제가 없거나 트란스포스아제의 발현이 억제되어 전위 능력이 없고 Mud I 및 Mud II 파아지로부터 선택되는 프란스포존의 필수적 부분밖에서 트란스포존 속에 클로닝시키고, b) 상기 트란스포존을 상기 박테리아의 DNA 서열속에 통합시키고, c) 상기 결함 트란스포존을 보완하고, d) 특정수의 전위후에 보완을 정지시킨 박테리아를 트란스포존내에 있는 마아커 유전자를 검출하기에 적절한 배지에서 배양함으로 얻을 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 트란스포존이 그의 트란스포즈아제를 암호화하는 유전자를 갖지 않는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 특정수의 전위를 이루기 위해 보완되는 또다른 선택된 유전자 또는 특정 DNA 서열이 클로닝되어 있는 또다른 결함 트란스포존이 통합되는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 트란스포즈아제를 발현하는 플라스미드로 상기 박테리아를 형질전환시키거나 상기 파아지로 형질도입시킴으로써 트란스포존을 보완하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 트란스포즈아제의 유전자가 발현되도록 해주는 리프레서 불활성화 이후 트란스포존이 활성화되는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 트란스포존이 선택가능한 유전자를 암호화하기도 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 선택가능한 유전자가 상기 박테리아 속에서 발현된 항생제-내성 유전자인 방법.
  8. 제6항에 있어서, 선택가능한 유전자의 발현을 측정함으로써 전위수를 분석하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 선택가능한 유전자가 항생체-내성 유전자일때 항생제에 대한 내성에 의해 마아커 유전자의 발현을 측정하는 방법.
  10. 제8항에 있어서, 선택가능한 유전자(lac 오페론 같은)가 그 생성물을 착색 마아커에 의해 시각화할 수 있는 유전자일때 치환분의 착색에 의하여 선택가능한 유전자의 발현을 측정하는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 상기 숙주 박테리아내에서 상기 선택된 유전자 및 그의 활성 프로모터를 트란스포존의 비필수 부분속에서, 트란스포즈아제에 대한 유전자를 갖지 않는 Mud I 또는 Mud II 파아지속에 클로닝시키고, 상기 트란스포존을 양립성 숙주 박테리아의 염색체 속에 통합시키고, 트란스포즈아제를 암호화하는 플라스미드로 숙주를 형질전환시키거나 Mu 파아지에 의해 감염시킴으로써 상기 트란스포존을 보완하고, 특정수의 전위 이후에는 자연히 복원된 균주(플라스미드 또는 Mu 파아지가 없는)를 선택하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 선택된 유전자가 L-트레오닌 생합성 경로로부터의 한개 혹은 몇개의 유전자인 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 선택된 유전자가 펩티드 또는 단백질을 암호화하는 방법.
  14. 제1항의 방법을 수행하는 것을 포함하는 신규한 박테리아 균주 제조방법.
  15. 제14항에 있어서, 제조된 박테리아 균주가 트레오닌을 다량 생산할 수 있으며, L-트레오닌의 생합성 경로로부터의 모든 혹은 몇몇 유전자를 그의 안쪽에 갖고 있는 트란스포존 복사물 몇개를 염색체속에 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 제조된 박테리아 균주가 E. 콜리 균주인 방법.
  17. 제14항, 제15항 또는 제16항의 방법에 의해 제조된 박테리아를 적절한 배지에서 배양하고 그 생성물을 회수하는 것으로 구성되는 선택된 유전자의 발현 생성물 제조방법.
  18. 제17항에 있어서, 발현 생성물이 펩티드 또는 단백질인 방법.
  19. 제1항에 있어서, 상기 유전자 또는 DNA 서열이 염색체 또는 에피솜인 방법.
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